WO2006040373A2 - Identificación de adn en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos - Google Patents

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Antonio Puyet Catalina
Susana SCHÖNHUTH MEYER
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    • G01N33/02—Food

Definitions

  • the present invention refers to a system for detecting and identifying the origin of DNA present in homogeneous or heterogeneous, raw or processed foods, and compound feeds by multiple PCR to certify the composition of Such food products.
  • This procedure is based on the specificity of 9 specific oligonucleotide primers that amplify different regions of the DNA when the sample to be analyzed contains vegetable, animal protein and identifies if there is presence of fish, bird or mammal, allowing differential diagnosis by producing amplicons of different sizes .
  • the systems based on the detection of DNA are not subject to the protein degradation of the food with the processing as indicated by Meyer et al, in 1994 for the detection of pork in cooked products ("Detection of pork in heated meta products” by the polymerase chain reaction ", J. Assoc. Off. Anal. Chem. 77) and allow a finer detection in terms of minimum starting quantities and greater specificity in terms of the origin of the sample, as described by Matsunaga et al. , in 1999 for the differentiation between 6 common species of mammals ("A quick and simple method for the identification of meta species and meta products by PCR assay". Meat Sci.
  • Bio-molecular methods can be divided into two general types: systems that differentiate at the level of a few species from each other, which normally need an additional system of subsequent restriction enzymes (PCR-RFLP), so the price of the analysis It is increased, as indicated by Carrera et al. in 1999 for differentiation of salmon and trout ("Salmon and trout analysis by PCR-RFLP for identity authentication", J. Food Science 61) or Asensio et al.
  • PCR-RFLP restriction enzymes
  • the present invention falls within the field of diagnosis and identification of food composition by multiple PCR using specific oligonucleotides. More specifically, the invention relates to a method for the identification of DNA present in homogeneous or heterogeneous, raw or processed foods, and compound feeds by using 9 original oligonucleotide primers (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 9) specifically designed for amplification by multiple PCR and subsequent visualization of different electrophoresis patterns in 2% agarose gels. These oligonucleotides are designed in specific regions of the DNA making specific primers for DNA of plants, animals, fish, birds and mammals.
  • amplification produces a maximum of 3 amplicons differentiating the DNA of plant origin (both leaves, stems, seeds and fruits and tubers) , the DNA of animal origin (the most common species of vertebrates: birds, mammals and fish), and the DNA of fish (Teleosteos).
  • This invention provides the particular characteristic that allows detecting and identifying the presence of both animal and plant DNA and also allows differentiating the origin of the DNA from the three most common groups of vertebrates used in foods such as: birds, mammals and fish. For a complete diagnosis of the sample to be analyzed, it is necessary to use two mixtures of oligonucleotide primers in two independent multiple PCR reactions. Unlike those existing in the market, this invention allows a complete scan of any organic sample by identifying the five provenances described above.
  • kits available only distinguish two provenances (Plant-Vertebrate) in both homogeneous and heterogeneous mixtures by multiple PCR, or allow the differentiation of the most common origins of birds and mammals, but this system is not effective with heterogeneous mixtures as it gives patterns of restriction of difficult interpretation.
  • the present invention has shown high sensitivity and speed, it is more economical because it does not need to use restriction enzymes, in addition to allowing a complete scanning of heterogeneous samples.
  • the method is characterized in that it comprises two combinations of 5 and 4 oligonucleotides respectively, specifically designed, from different regions of the nuclear and mitochondrial genome, for the detection and identification of the components of a heterogeneous food sample.
  • oligonucleotide mixtures allow the amplification of DNA of different origin for detection and identification by multiple PCR.
  • a first multiple PCR reaction mixture of oligos n ° 1
  • three sources are distinguished: Plant-Animal (birds, mammals and fish) -Fish
  • Second multiple PCR reaction mixture of oligos n ° 2
  • the present invention provides the oligonucleotide primers and the method for amplifying plant, animal, fish, bird and mammalian DNA in two independent PCR reactions that make up a rapid identification procedure that does not exist so far in the market.
  • Aquaculture constitutes a relevant field of application of this invention.
  • the development of a complete and balanced organic diet is one of the main goals for feed producers for aquaculture, trying to find replacement for fatty acids and amino acids that until now only came from fish.
  • the oils and flours of plants do not contain the necessary amount of unsaturated fatty acids or provide 100% of the different essential amino acids.
  • the components of different origins are mixed in the feed for aquaculture, and a great concern is based on the risk that adulteration of feed with mammalian or bird tissues or bones can carry. This problem is exacerbated by the fact that there are no reliable and routine techniques to detect this type of adulteration today.
  • the origin of the protein composition is identified in the different diets of feed composed of livestock or aquaculture as well as processed foods, allowing the detection of plants or animals, and differentiating within the three main groups of vertebrate animals: birds, mammals and fish.
  • Multiple PCR produces amplicons of different sizes that are easily identifiable and whose size is detailed below:
  • This invention it will be possible to certify compound food and feed in terms of ensuring its origin, helping to guarantee those feed that is 100% fish (aquaculture) or 100% plant feed (livestock).
  • This invention represents a new added value for their products for feed producers as well as for farmers and fish farmers, and on the other hand it gives consumers more safety and confidence.
  • Figure 1 Shows the visualization on a 2% MS8 agarose gel of different band patterns (plant 400bp / animal 260bp / fish 120bp) after the amplification by multiple PCR of 12 different food samples using oligonucleotides SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5. Samples analyzed they present in their composition tissue of 1, 2 or 3 components (vegetable, animal and / or fish):
  • Figure 2 Shows the visualization on a 2% MS8 agarose gel of the different band patterns (mammal 360bp / bird 260bp) after amplification by
  • the samples analyzed have in their composition 1 or 2 component tissue (mammal and / or bird). Samples were analyzed with oligonucleotides SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9.
  • each group of species plant, animal, fish, mammal and bird
  • a large number of sequences belonging to each group of species were analyzed. For this, a total of 254 sequences of plants and animals were used, both from the sequence database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and own sequences obtained in the laboratory. Once the most representative sequences of each group were selected, they were aligned with the ClustalX program described in Nucleic Acid Research 24 (Thomson et al, 1997). Next, the variable and conserved regions within each group were analyzed and the selection of specific sequences that produced a single amplicon for each group of species and that in turn had different sizes to be identifiable in agarose gels.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the oligonucleotides were selected so that the hybridization temperature was similar for each group of primers that make up the mixture in the multiple PCR.
  • Theoretical analysis of the oligonucleotides selected in a first phase was performed with the Oligo-Analyzer program (Kuulasmaa, 2002).
  • the Tm the Tm (NN), determined by the thermodynamic parameters described by Breslauer et al, 1986 ⁇ Proc. Nati Acad. Sci. USA. 83).
  • oligonucleotides analyzed the most suitable ones were selected and their practical analysis was carried out with different PCR conditions, they were tested with different samples both raw as processed from homogeneous and heterogeneous mixtures. In addition, the PCR conditions were optimized with different concentrations of DNA and with different extraction protocols.
  • oligonucleotide primers of these two groups the nuclear DNA region of the gene encoding the ribosomal 18S was used.
  • 63 plant sequences were aligned together (16 species including: wheat, celery, potato, barley, rice, corn, Arabidopsis and soybeans), 1 yeast, 1 rhodophyte and 45 sequences of both vertebrate animals (24 species of all groups main: birds, mammals, fish, reptiles, amphibians) and invertebrates (21 species: both arthropods and mollusks) for the design of a general oligonucleotide in a region preserved for both animals and plants (characterized by SEQ ID NO: 5) and two specific oligonucleotides.
  • the plant-specific primer (characterized by SEQ ID NO: 1) was designed in a region conserved in plants that in turn is different for animals.
  • SEQ ID NO: 2 For the specific animal primer (characterized by SEQ ID NO: 2) a region conserved in animals was used which in turn is different for plants and produces an amplicon of different size than the plant.
  • oligonucleotide primers For the design of fish-specific oligonucleotide primers (characterized by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) the nuclear DNA region of the gene encoding rhodopsin was used. For this, a region of about 500 bp of the rhodopsin was amplified in 50 species of teleosts with protocols and with oligonucleotides specifically designed for it. Subsequently, the sequencing of the 50 amplicons thus obtained was sequenced. These sequences were aligned with sequences from another 100 different species of condrict and other teleost obtained from NCBI. Two regions conserved in most of the teleosts were searched to produce an amplicon differentiable in size from those produced by the plant and animal oligonucleotides.
  • Sequence selection for vertebrate animal Mammal and Ave.
  • the mitochondrial DNA region of the gene encoding the ribosomal 12S was used for the design of meat-specific oligonucleotide primers.
  • 41 sequences obtained from NCBI of birds (10 species including chicken, duck, turkey, ostrich and dove), mammals (10 species including pig, sheep, goat, cow and horse) and fish (21 species of different orders: both teleost and condrict).
  • Table 1 DNA samples in which the identification system has been tested
  • Feed C Vegetable oil (Flax)
  • Example 1 Determination of Plant-Animal-Fish DNA
  • the procedure is applied to the detection and identification of three types of components in different samples of compound feed for feeding.
  • the mixture of products is prepared for amplification in a reaction of Multiple PCR
  • PCR amplification reactions were carried out in a reaction volume of 25 ⁇ l. First, 14 microliters ( ⁇ l) of double-distilled and autoclaved water are added for each sample to be analyzed, plus one with a negative control.
  • the amplification 2.5 ⁇ l per sample plus the negative control.
  • thermocycler For multiple PCR amplification reactions the thermocycler was programmed with an initial phase of 30 seconds at 95 ° C, followed by 40 cycles with three phases (30 seconds at 94 ° C; 30 seconds at 56 ° C; 10 seconds at 72 ° C), and finally 7 minutes at 72 ° C (set-up in devices of the Eppendorf brand). Finally, for the identification of the components of the problem samples, we will visualize the amplification after an agarose gel electrophoresis (set up for the 2% MS8 agarose of Hispanagar, CONDA SA).
  • Figure 1 illustrates the results obtained in the analysis of 12 samples.
  • the product mixture is prepared for amplification in a multiple PCR reaction.
  • the PCR amplification reactions are carried out in a reaction volume of 25 ⁇ l.
  • the commercial buffer for the enzyme (10X) to be used in the amplification is added: 2.5 ⁇ l per sample plus the negative control.
  • thermocycler For the amplification reactions in multiple PCR the thermocycler was programmed with an initial phase of 30 seconds at 95 ° C; followed by 40 cycles with three phases (30 seconds at 94 ° C; 30 seconds 58 ° C; 10 seconds at 72 ° C), and finally 7 minutes at 72 ° C (set-up in devices of the Eppendorf brand). Finally, for the identification of the components of the problem samples, we will visualize the amplification products after an agarose gel electrophoresis (set up for the 2% MS8 agarose of Hispanagar, CONDA SA). Figure 2 illustrates the results obtained in the analysis of 9 samples.
  • Example 3 Design of a kit The present example refers to a kit for the specific determination of the presence of plant, animal, fish, mammal or bird in food samples or compound feeds using 9 specific primers in two multiple PCR reactions.
  • a kit was assembled for 20 reactions with the following composition: - A package with PCR premix consisting of: dNTPs (2.5 mM each), PCR buffer (10X), mixture of 5 oligonucleotides for amplification of plant DNA , animal and fish (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5) and sterile distilled water.
  • PCR premix consisting of: dNTPs (2.5 mM each), PCR buffer (10X), mixture of 4 oligonucleotide primers for amplification of mammalian and bird DNA (SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9) and sterile distilled water.

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Abstract

La invención consiste en un procedimiento de identificación del origen del ADN presente en los productos alimenticios a analizar. Mediante este procedimiento se detecta y diferencia si en la composición se halla presente ADN de origen vegetal o animal y si, dentro de este último grupo, existe ADN de mamíferos, aves o peces. Para llevar a cabo el procedimiento, se diseñan 9 oligonucleótidos cebadores específicos. Estos oligonucleótidos han sido diseñados de forma que tras la amplificación mediante PCR múltiple se puede diferenciar la procedencia de los alimentos que integran el producto, mediante el tamaño de los fragmentos amplificados. Esta invención tiene aplicación en el correcto etiquetado de los alimentos procesados cuya composición se precise a nivel general, como puede ser la certificación de piensos compuestos para acuicultura (100% pescado), o para rumiantes (10% vegetal).

Description

Identificación de ADN en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos.
Objeto de Ia invención.
La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un sistema de detección e identificación del origen del ADN presente en alimentos homogéneos o heterogéneos, crudos o procesados, y piensos compuestos mediante PCR múltiple para certificar Ia composición de dichos productos alimentarios. Este procedimiento se basa en Ia especificidad de 9 oligonucleótidos cebadores específicos que amplifican diferentes regiones del ADN cuando Ia muestra a analizar contiene proteína vegetal, animal e identifica si existe presencia de pescado, ave o mamífero, permitiendo Ia diagnosis diferencial al producir amplicones de diferente tamaño.
Antecedentes.
Ante Ia creciente inquietud en los consumidores sobre Ia calidad y Ia seguridad de los productos alimenticios se han producido avances científicos y tecnológicos para saber el origen de los diferentes tipos de alimentos de los que se compone un producto elaborado a partir de una mezcla heterogénea. Los primeros análisis utilizaban estudios de composición mediante métodos macromoleculares o químicos (Czesny y col., 2000, "Discrimination of wild and domestic origin of sturgeon ova based on lipids and fatty acid análisis", Aquaculture 189), microscópicos o detección por métodos inmunológicos (Berger y col, 1988, "Detection of poultry and pork in cooked and canned meat foods by enzyme-linked ínmunosorbent assays", J. Assoc. Off Anal. Chem. 71). Más recientemente, e impulsado tanto por las nuevas regulaciones de Ia Comunidad Europea (2000/766/EC; 2002/248/EC) en cuanto a medidas preventivas para Ia expansión de Ia encefalopatía espongiforme bovina (BSE), como por los avances en Ia diagnosis de alimentos mediante técnicas de biología molecular, en Ia bibliografía científica se describen diversos sistemas para detección de especies en alimentos basados en Ia amplificación de regiones concretas de ADN mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR). El método de microscopía basado en el análisis de fragmentos de huesos ha sido reconocido como método europeo oficial para Ia lucha contra Ia BSE diferenciando aves, mamíferos y pescado en las muestras. Pero sólo es útil cuando en Ia muestra existen estos fragmentos. Por otro lado, los sistemas basados en Ia detección de ADN no están supeditados a Ia degradación proteica de los alimentos con el procesado como indican Meyer y col, en 1994 para Ia detección de cerdo en productos cocinados ("Detection of pork in heated meta products by the polymerase chain reaction", J. Assoc. Off. Anal. Chem. 77) y permiten una detección más fina en cuanto a cantidades mínimas de partida y una mayor especificidad en cuanto al origen de Ia muestra, como describen Matsunaga y col., en 1999 para Ia diferenciación entre 6 especies comunes de mamíferos ("A quick and simple method for the identification of meta species and meta products by PCR assay". Meat Sci. 51), o posteriormente Lockley y Bardsley en 2000 para diferenciación entre dos especies de túnidos ("Novel meted for the discrimination of Tuna {Thunnus thynnus) and Bonito (Sarda sarda) DNA", J. Agrie. Food Chem 48) o estos mismos autores 2 años después, para diferenciación entre pollo y pavo ("Intron variability ¡n an actin gene can be used to discrimínate between chicken and turkey DNA", Meat Science 61).
Los métodos bio-moleculares pueden dividirse en dos tipos generales: los sistemas que diferencian a nivel de unas pocas especies entre sí, que normalmente necesitan de un sistema adicional de enzimas de restricción posterior (PCR-RFLP), por Io que el precio del análisis se ve incrementado, como indican Carrera y col. en 1999 para diferenciación de salmón y trucha ("Salmón and trout analysis by PCR- RFLP for identity authentication", J. Food Science 61) o Asensio y col. en 2000 para diferenciación de mero, perca y chema ("Identification of NiIe perch (Lates niloticus), grouper (Epinephelus guaza), and wreck fish (Polyprion americanus) by polimerasa chain reaction-restriction fragment length polymorphism of 12S rRNA gene fragment", J. Food Prot. 63); o por otro lado los sistemas que diferencian a nivel de grandes grupos de especies mediante PCR múltiple. Los sistemas que diferencian a nivel de grandes grupos se han centrado en Ia detección de material bovino (Tartaglia y col., 1998. "Detection of bovine mitochondrial DNA ¡n ruminant feeds: a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials", J. Food Prot. 61 ; Wang y col, 2000: "A rapid meted for PCR detection of bobine materials in animal feedstuffs", Mol. CeII Probes 14), o más recientemente diferencian bovino, ovino, porcino y pollo en materia alimenticia (amplificación en dúplex: Krcmar y Rencova, 2003, "Identification of species-specific DNA in feedstuffs", J. Agrie. Food Chem 51), y diferenciación entre rumiantes, cerdo, pollo en alimentos para peces (Bellagamba y col, 2003. "Polimerase chain reaction-based analysis to detect terrestrial animal protein in fish meal". J. Food Prot. 66) o en multiplex diferenciando rumiantes, pollo, cerdo y pescado en alimentos (Dalmaso y col. 2003, "A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs", Mol. CeII. Probes).
Por otro lado, los sistemas que diferencian varias especies o grupos de especies entre sí mediante PCR múltiple o con posterior utilización de enzimas de restricción son útiles en el caso de tener muestras homogéneas, ya que en el caso de muestras heterogéneas Ia interpretación de los patrones de restricción o de amplificación se hace muy difícil o imposible. Así se ha testado esto con Kits comerciales: diferenciación de las 6 especies más comunes de vertebrados mamíferos, pero sólo es efectivo con muestras homogéneas (Kit mixed, Biotools), identificación de las especies más comunes de mamíferos y aves (PCR y RFLPs), requiere digestión con enzimas de restricción y es difícil de interpretar con mezclas de más de 2 especies (Kit identification, Biotools), identificación de 6 especies diferentes de Bacalao (PCR y RFLPs) (Kit Cod, Biotools).
Explicación de Ia invención
Identificación de ADN en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos.
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia diagnosis e identificación de Ia composición de los alimentos mediante PCR múltiple utilizando oligonucleótidos específicos. De forma más concreta, Ia invención se refiere a un procedimiento para Ia identificación del ADN presente en alimentos homogéneos o heterogéneos, crudos o procesados, y piensos compuestos mediante Ia utilización de 9 oligonucleótidos cebadores originales (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9) diseñados específicamente para una amplificación mediante PCR múltiple y posterior visualización de diferentes patrones de electroforesis en geles de agarosa al 2%. Estos oligonucleótidos están diseñados en regiones concretas del ADN haciendo de cebadores específicos para ADN de plantas, animales, pescados, aves y mamíferos. En una primera reacción de PCR múltiple, utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5, Ia amplificación específica produce un máximo de 3 amplicones diferenciando el ADN de procedencia vegetal (tanto hojas, tallos, semillas y frutas como tubérculos), el ADN de procedencia animal (las especies más comunes de vertebrados: aves, mamíferos y peces), y el ADN de pescado (Teleósteos).
En caso de querer detectar e identificar el origen de carnes de animal vertebrado, en otra reacción de PCR múltiple utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 9, Ia amplificación específica produce un máximo de 2 amplicones diferenciando el ADN procedente de ave o de mamífero.
Esta invención aporta Ia característica particular de que permite detectar e identificar Ia presencia de ADN tanto animal como vegetal y además permite diferenciar Ia procedencia del ADN respecto a los tres grupos de vertebrados más comunes utilizados en alimentos como son: aves, mamíferos y peces. Para una diagnosis completa de Ia muestra a analizar es necesaria Ia utilización de dos mezclas de oligonucleótidos cebadores en dos reacciones independientes de PCR múltiple. A diferencia de las existentes en el mercado, esta invención permite hacer un barrido completo de cualquier muestra orgánica identificando las cinco procedencias anteriormente descritas. En cambio otros kits disponibles solo distinguen dos procedencias (Planta-Vertebrado) en mezclas tanto homogéneas como heterogéneas mediante PCR múltiple, o permiten Ia diferenciación de los orígenes más comunes de aves y mamíferos, pero dicho sistema no es eficaz con mezclas heterogéneas pues da patrones de restricción de difícil interpretación. La presente invención ha mostrado una alta sensibilidad y rapidez, es más económica pues no necesita utilizar enzimas de restricción, además de permitir un barrido completo de muestras heterogéneas.
El procedimiento se caracteriza porque comprende dos combinaciones de 5 y 4 oligonucleótidos respectivamente, diseñados específicamente, a partir de diferentes regiones del genoma nuclear y mitocondrial, para Ia detección e identificación de los componentes de una muestra alimenticia heterogénea. Estas mezclas de oligonucleótidos permiten Ia amplificación de ADN de distinto origen para detección e identificación mediante PCR múltiple. Con este procedimiento, en una primera reacción de PCR múltiple (mezcla de oligos n°1) se diferencian tres procedencias: Planta-Animal (aves, mamíferos y peces)-Pescado, y en una segunda reacción de PCR múltiple (mezcla de oligos n°2) podemos detectar Ia presencia de carne de animal, diferenciando si dicha carne procede de ave o de mamífero. El procedimiento completo permite Ia identificación básica de una muestra diferenciando 5 orígenes del ADN en dos reacciones de amplificación por PCR múltiple.
La identificación completa puede realizarse en dos reacciones de PCR múltiple. En Ia mezcla N°1 tenemos 5 oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) que diferencian planta, animal (aves, mamíferos y peces) y pescado. En Ia mezcla N°2 tenemos 4 oligonucleótidos (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9) que diferencian entre carne de ave y de mamífero. La información y las secuencias de los 9 oligonucleótidos cebadores se muestras al final de esta memoria en Ia lista de secuencias.
En líneas generales y para conseguir los objetivos preconizados, a Ia vez que simplificar el sistema de diagnosis, y sin utilizar una digestión posterior con enzimas de restricción que encarece el procedimiento, aumenta el tiempo requerido para obtener resultados y dificulta Ia detección de ADN en muestras heterogéneas, Ia presente invención proporciona los oligonucleótidos cebadores y el procedimiento para amplificar ADN de planta, animal, pescado, ave y mamífero en dos reacciones independientes de PCR que conforman un procedimiento de identificación rápido no existente hasta el momento en el mercado.
La acuicultura constituye un campo relevante de aplicación de esta invención. El desarrollo de una dieta orgánica, completa y equilibrada es una de las principales metas para los productores de piensos para acuicultura, tratando de encontrar reemplazamiento para los ácidos grasos y aminoácidos que hasta ahora solo provenían del pescado. Los aceites y harinas de plantas no contienen Ia cantidad necesaria de ácidos grasos insaturados ni provee el 100% de los distintos aminoácidos esenciales. Actualmente los componentes de diferentes orígenes se mezclan en los piensos para acuicultura, y una gran preocupación se basa en el riesgo que puede llevar Ia adulteración de los piensos con tejidos o huesos de mamíferos o aves. Este problema se exacerba por el hecho de que no existen hoy en día técnicas fiables y rutinarias para detectar este tipo de adulteraciones. Con Ia invención que se detalla en esta memoria descriptiva, mediante amplificación por PCR múltiple, se identifica el origen de Ia composición proteica en las distintas dietas ya sea de piensos compuestos de ganado o acuicultura como de alimentos procesados, permitiendo Ia detección de plantas o animales, y diferenciando dentro de los tres grupos principales de animales vertebrados: aves, mamíferos y peces. La PCR múltiple produce amplicones de diferente tamaño que son fácilmente identificables entre sí y cuyo tamaño se detalla a continuación:
1. longitud de los amplicones tras Ia PCR múltiple con Ia mezcla N0 1 :
• Si se produce amplificación de ADN de procedencia vegetal obtendremos un fragmento de 400 nucleótidos.
• Si se produce amplificación de ADN de procedencia animal (aves, mamíferos o peces) obtendremos un fragmento de 260 nucleótidos.
• Si se produce amplificación de ADN procedente de pescado obtendremos un fragmento de 120 nucleótidos.
2. longitud de los amplicones tras Ia PCR múltiple con Ia mezcla N0 2:
• Si se produce amplificación de ADN de procedencia animal de origen aviar obtendremos un fragmento de 260 nucleótidos.
• Si se produce amplificación de ADN de procedencia de animal mamífero obtendremos un fragmento de 360 nucleótidos.
Con esta invención será posible Ia certificación de los alimentos y piensos compuestos en términos de asegurar su origen, ayudando a garantizar aquellos piensos que sean 100% de pescado (acuicultura) o piensos 100% planta (ganadería). Esta invención representa tanto para los productores de piensos como para los ganaderos y acuicultores un nuevo valor añadido a sus productos, y por otro lado da más seguridad y confianza a los consumidores de dichos productos.
Descripción de los dibujos
Para facilitar Ia comprensión de Ia invención y formando parte de esta memoria descriptiva, se acompañan una serie de dibujos con carácter ilustrativo.
Figura 1: Muestra Ia visualización en un gel de agarosa MS8 al 2% de distintos patrones de banda (planta 400bp/ animal 260bp/ pescado 120bp) tras Ia amplificación mediante PCR múltiple de 12 muestras alimenticias diferentes utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5. Las muestras analizadas presentan en su composición tejido de 1, 2 ó 3 componentes (vegetal, animal y/o pescado):
1 : Marcador Ladder 100 pb
2: Pienso acuicultura para doradas 1 3: Pienso para gatos
4: Scomber japonicus (Caballa)
5: Pienso acuicultura para doradas 2
6: Galeorhinus sp. (Cazón)
7: Meleagrís gallopavo (Pavo) 8: Soja sp. (Soja)
9: Tríticum sp. (Trigo)
10: Salmo trutta (Trucha)
11: Salchicha (Pollo+Cerdo)
12: Barritas de cangrejo 13: Codorniz+cebolla
Figura 2: Muestra Ia visualización en un gel de agarosa MS8 al 2% de los distintos patrones de banda (mamífero 360bp/ ave 260bp) tras Ia amplificación mediante
PCR múltiple de 9 alimentos cárnicos. Las muestras analizadas presentan en su composición tejido de 1 ó 2 componentes (mamífero y/o ave). Las muestras se analizaron con los oligonucleótidos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 9.
1 : Marcador Ladder 100 pb
2: Equus caballus (Caballo)
3: Sus scrofa (Cerdo) 4: Bos taurus (Vaca)
5: Queso
6: Ovis aríes (Cordero)
7: Gallus gallus (Pollo)
8: Annas sp. (Pato) 9: Salchicha (Pollo+Cerdo)
10 : Pienso para perros
Exposición detallada de Ia invención En Ia presente memoria se describe el procedimiento para diseñar y preparar oligonucleótidos de ADN específicos de planta, animal, pescado, mamífero y ave, así como Ia determinación del mejor protocolo de extracción de ADN para los distintos tipos de muestras a analizar. Asimismo Ia invención se ilustra con ejemplos de realización del procedimiento de detección e identificación del origen del ADN en alimentos homogéneos, heterogéneos, crudos o procesados y piensos compuestos, usos de los oligonucleótidos de ADN, así como Ia forma de utilización del kit. En Ia lista de secuencias adjunta se presentan las secuencias individuales de oligonucleótidos cebadores descritas en Ia dirección 5'->3' convencional.
Diseño de oligonucleótidos cebadores
Para Ia selección de las secuencias específicas de cada grupo de especies (planta, animal, pescado, mamífero y ave) se analizaron gran número de secuencias pertenecientes a cada grupo de especies. Para ello se utilizaron un total de 254 secuencias de plantas y animales, tanto de Ia base de datos de secuencias del National Center for Biotechnology Information (NCBI) como secuencias propias obtenidas en el laboratorio. Una vez seleccionadas las secuencias más representativas de cada grupo, se procedió a su alineamiento mediante el programa ClustalX descrito en Nucleic Acid Research 24 (Thomson y col, 1997). A continuación se analizaron las regiones variables y conservadas dentro de cada grupo y se procedió a Ia selección de secuencias específicas que produjesen un solo amplicón para cada grupo de especies y que a su vez tuvieran diferente tamaño para ser identificables en geles de agarosa. Posteriormente se seleccionaron los oligonucleótidos de manera que Ia temperatura de hibridación fuera similar para cada grupo de cebadores que componen Ia mezcla en Ia PCR múltiple. El análisis teórico de los oligonucleótidos seleccionados en una primera fase (primer-dimer, temperatura de hibridación, hibridación entre oligonucleótidos, etc.) se realizó con el programa Oligo-Analyzer (Kuulasmaa, 2002). Para Ia temperatura de hibridación de los oligonucleótidos se consideró Ia Tm(NN), determinada mediante los parámetros termodinámicos descritos por Breslauer y col, 1986 {Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 83). De los oligonucleótidos analizados se seleccionaron los más adecuados y se procedió a su análisis práctico con diferentes condiciones de PCR, se ensayaron con diferentes muestras tanto crudas como procesadas de mezclas homogéneas y heterogéneas. Además se procedió a Ia optimización de las condiciones de PCR con distintas concentraciones de ADN y con diferentes protocolos de extracción.
Selección de secuencias para Plantas y Animales.
Para el diseño de oligonucleótidos cebadores de estos dos grupos se utilizó Ia región de ADN nuclear del gen que codifica para el 18S ribosomal. Se alinearon conjuntamente 63 secuencias de plantas (16 especies incluyendo: trigo, apio, patata, cebada, arroz, maíz, Arabidopsis y soja), 1 de levadura, 1 de rodofita y 45 secuencias de animales tanto vertebrados (24 especies de todos los grupos principales: aves, mamíferos, peces, reptiles, anfibios) como invertebrados (21 especies: tanto artrópodos como moluscos) para el diseño de un oligonucleótido general en una región conservada tanto para animales como para plantas (caracterizado por SEQ ID NO: 5) y dos oligonucleótidos específicos. El cebador específico de planta (caracterizado por SEQ ID NO: 1) se diseñó en una región conservada en las plantas que a su vez es diferente para los animales. Para el cebador específico de animales (caracterizado por SEQ ID NO: 2) se utilizó una región conservada en animales que a su vez es diferente para plantas y que produce un amplicón de tamaño diferente al de planta.
Selección de secuencias para Pescado.
Para el diseño de oligonucleótidos cebadores específicos de pescado (caracterizados por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) se utilizó Ia región de ADN nuclear del gen que codifica Ia rodopsina. Para ello se amplificó una región de unos 500 pb de Ia rodopsina en 50 especies de teleósteos con protocolos y con oligonucleótidos diseñados expresamente para ello. Posteriormente se procedió a Ia secuenciación de los 50 amplicones así obtenidos. Estas secuencias se alinearon con secuencias de otras 100 especies diferentes de condrictios y otros teleósteos obtenidas de NCBI. Se buscaron dos regiones conservadas en Ia mayoría de los teleósteos para producir un amplicón diferenciable en tamaño de los producidos por los oligonucleótidos de planta y animal.
Selección de secuencias para animal vertebrado: Mamífero y Ave. Para el diseño de oligonucleótidos cebadores específicos de carnes se utilizó Ia región de ADN mitocondrial del gen que codifica para el 12S ribosomal. Para ello se alinearon 41 secuencias obtenidas de NCBI de aves (10 especies que incluyen pollo, pato, pavo, avestruz y paloma), mamíferos (10 especies que incluyen cerdo, oveja, cabra, vaca y caballo) y peces (21 especies de distintos ordenes: tanto de teleósteos como de condrictios). Se utilizaron cuatro regiones conservadas, dos regiones conservadas pero específicas para Ia mayoría de los mamíferos (caracterizadas por SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7) y dos regiones conservadas pero específicas para Ia mayoría de las aves (caracterizadas por SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9), teniendo en cuenta que cada pareja debería producir un amplicón diferenciable en tamaño entre sí.
Extracción previa de ADN.
Para aplicar el sistema de identificación sobre distintas muestras se extrajo ADN de alimentos de distintas procedencias: muestras simples con un solo componente (crudas o cocinadas) y mezclas heterogéneas (crudas y cocinadas), como se muestra en Ia tabla 1. El ADN se extrajo mediante diferentes protocolos: método de fenol-cloroformo descrito por Sambrook y col., (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual, 2o ed. CoId Spring Harbor Press. USA"; y método salino descrito por Salah y Martínez (1997) "Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques, Nucleic Acids Research 25 (22)". Se ha comprobado que para muestras que solo contienen tejido vegetal o muestras heterogéneas que presentan tanto tejido animal como vegetal, el método más apropiado es el de Salah y Martínez, mientras que si Io que interesa conocer es Ia procedencia de Ia carne o se trata de muestras de origen animal, el protocolo más adecuado es el que describen Sambrook y col. También se ensayaron extracciones de ADN con kits de distintas casas comerciales (Qiagen, MoBIo, TríReagent, Biotools, PrepMan, etc.) y con un robot automatizado para extracción de ADN (6100 Nucleic Acid Prep Station, Aplied Biosystems) siendo Ia mayoría eficaces en caso de muestras homogéneas en cuanto a origen vegetal o animal.
Tabla 1 : Muestras de ADN en las que se ha probado el sistema de identificación
Cereales y hortalizas
Arroz
Figure imgf000013_0001
Pienso C: Aceite vegetal (Lino)
P48: Chile Hoky
SK.1 : Torta de colza
SK.2: Torta de soja
SK.3: Trigo entero extrusionado
SK.4: Altramuz blanco dulce
SK.5: Harina de pescado
SK.6: Concentrado de proteína soluble de pescado
SK.7: Guisantes extrusionados
SK.8: Gluten de Maíz
SK.9: Gluten de trigo
SK.10: 100% dieta de pescado
SK.11 : Harina de Krill
SK.12: Dieta comercial
SK.14: Dieta comercial
SK.15: Dieta comercial
SK.16: Dieta comercial
SK.17: 100% proteína de planta
Piensos de distintas dietas para Dorada
03-2408-1 Dieta A: PDA
03-2402-4 Dieta D: PDD
DA
DB
DC
DD
DE
DF
PP75: pienso con planta
FM: Fish meal
P.R: Proacua
P.Q: Proacua pequeño
Piensos de distintas dietas para Salmón
03-2409-1 Dieta A: PSA
03 2409-2 Dieta B: PSB
Piensos de distintas dietas para Lubina
P. lubina
Piensos para perros
Pienso con salmón: P. salmón
Pienso sin pescado: P. perros
Pienso para gatos
Pienso vegetal
Pienso para ganado V1 Pienso vegetal perros
Pienso para ganado y aves
Pienso para cerdos
Pienso para gallinas Pienso para vacas
Pienso para conejos Pienso para ratones
A continuación se describen unos ejemplos de realización preferida de Ia invención. Ejemplo 1 : Determinación de ADN de Planta-Animal-Pescado En una realización preferida de Ia invención, se aplica el procedimiento a Ia detección e identificación de tres tipos de componentes en distintas muestras de piensos compuestos para alimentación.
Una vez extraído el ADN de las muestras en cuestión, a través del método salino o mediante kits comerciales, según se indica en el apartado anterior (Extracción previa de ADN), se procede a preparar Ia mezcla de productos para Ia amplificación en una reacción de PCR múltiple.
Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 25 μl. En primer lugar se añaden 14 microlitros (μl) de agua bidestilada y autoclavada por cada muestra a analizar, más una de control negativo.
En segundo lugar se añaden el tampón comercial para Ia enzima (10X) a utilizar en
Ia amplificación: 2,5 μl por muestra más el control negativo.
En tercer lugar se añaden 3 μl de Cloruro de Magnesio 25 mM por cada muestra más el control negativo.
En cuarto lugar se añaden 1 ,6 μl de Ia mezcla de dNTPs (2,5 mM de cada nucleótido) por muestra más el control negativo.
En quinto lugar se añaden los 5 oligonucleótidos específicos de los tres tipos de tejido a detectar en el pienso. Partiendo de una concentración de 10 μM añadiremos las siguientes cantidades por cada muestra a analizar más el control negativo: 0,5 μl de SEQ ID NO: 1; 0,6 μl de SEQ ID NO: 2; 0,7 μl de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y 1 ,1 μl de SEQ ID NO: 5.
Por último, añadiremos 0,16 μl de Ia enzima polimerasa (puesto a punto para
TaKaRa Ex Taq, 5 U/μl) por cada muestra a analizar más el control negativo. Se harán alícuotas de 23 μl de Ia mezcla para el mismo número de muestras a analizar, más el control negativo.
Posteriormente añadiremos 2 μl de ADN previamente extraído a cada alícuota (Ia concentración del ADN extraído es muy variable, pudiendo oscilar entre 10 y 250 ng/μl, por Io que en casos de presentar elevada concentración puede ser necesario su dilución para evitar inhibiciones en Ia PCR).
Para las reacciones de amplificación en PCR múltiple el termociclador se programó con una fase inicial de 30 segundos a 95° C, seguido de 40 ciclos con tres fases (30 segundos a 94° C; 30 segundos a 56° C; 10 segundos a 72° C), y finalmente 7 minutos a 72° C (puesto a punto en aparatos de Ia marca Eppendorf). Por último, para Ia identificación de los componentes de las muestras problema visualizaremos Ia amplificación tras una electroforesis en gel de agarosa (puesto a punto para Ia agarosa MS8 al 2% de Hispanagar, CONDA S.A).
La figura 1 ilustra los resultados obtenidos en el análisis de 12 muestras.
Ejemplo 2: Determinación de ADN de Mamífero-Ave
En otra forma de realización preferida de Ia invención, se aplica el procedimiento a
Ia detección e identificación de dos tipos de carnes de vertebrado en distintas muestras de piensos compuestos para alimentación de mascotas y alimentos preparados.
Una vez extraído el ADN de las muestras en cuestión, a través del protocolo convencional de Fenol-Cloroformo o mediante Kits comerciales, según se ha indicado previamente, se procede a preparar Ia mezcla de productos para Ia amplificación en una reacción de PCR múltiple. Las reacciones de amplificación por PCR se llevan a cabo en un volumen de reacción de 25 μl.
En primer lugar se añaden 15 μl de agua bidestilada y autoclavada por cada muestra a analizar, más una de control negativo.
En segundo lugar se añaden el tampón comercial para Ia enzima (10X) a utilizar en Ia amplificación: 2,5 μl por muestra más el control negativo.
En tercer lugar se añaden 3 μl de Cloruro de Magnesio 25 mM por cada muestra más el control negativo.
En cuarto lugar se añaden 1 ,6 μl de Ia mezcla de dNTPs (2,5 mM de cada nucleótido) por muestra más el control negativo. En quinto lugar añadiremos los 4 oligonucleótidos específicos de los dos tipos de carnes a detectar en el pienso. Partiendo de una concentración de 10 μM añadiremos las siguientes cantidades por cada muestra a analizar más el control negativo: 0,7 μl de SEQ ID NO: 6; 0,7 μl de SEQ ID NO: 7; 0,7 μl de SEQ ID NO: 8 y 0,7 μl de SEQ ID NO: 9. Por último, añadiremos 0,16 μl de Ia enzima polimerasa (puesto a punto para
TaKaRa Ex Taq, 5 U/μl) por cada muestra a analizar más el control negativo.
Se hacen alícuotas de 23 μl de Ia mezcla para el mismo número de muestras a analizar, más el control negativo. Posteriormente se añaden a cada alícuota 2 μl de una dilución 1/2 del ADN previamente extraído (Ia concentración del ADN extraído es muy variable, pudiendo oscilar entre 10 y 250 ng/μl, por Io que en casos de presentar elevada concentración puede ser necesario su dilución para evitar inhibiciones en Ia PCR). Para las reacciones de amplificación en PCR múltiple el termociclador se programó con una fase inicial de 30 segundos a 95° C; seguido de 40 ciclos con tres fases (30 segundos a 94° C; 30 segundos 58° C; 10 segundos a 72° C), y finalmente 7 minutos a 72° C (puesto a punto en aparatos de Ia marca Eppendorf). Por último, para Ia identificación de los componentes de las muestras problema visualizaremos los productos de amplificación tras una electroforesis en gel de agarosa (puesto a punto para Ia agarosa MS8 al 2% de Hispanagar, CONDA S.A). La figura 2 ¡lustra los resultados obtenidos en el análisis de 9 muestras.
Ejemplo 3: Diseño de un kit El presente ejemplo se refiere a un kit para Ia determinación específica de Ia presencia de planta, animal, pescado, mamífero o ave en muestras alimentarias o piensos compuestos utilizando 9 cebadores específicos en dos reacciones de PCR múltiple.
Se ensambló un kit para 20 reacciones con Ia siguiente composición: - Un envase con premezcla de PCR constituida por: dNTPs (2,5 mM de cada uno), tampón de PCR (10X), mezcla de 5 oligonucleótidos para amplificación de ADN de planta, animal y pescado (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5) y agua destilada estéril.
- Un envase con premezcla de PCR constituida por: dNTPs (2,5 mM de cada uno), tampón de PCR (10X), mezcla de 4 oligonucleótidos cebadores para amplificación de ADN de mamífero y ave (SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:9) y agua destilada estéril.
- Un envase con TaKaRa Ex Taq (5 u/μl)
- Un envase con marcador de talla (100 bp Ladder) - Un envase con MgCI (25 mM).
- Un envase con mezcla de ADN de planta y pescado.
- Un envase con mezcla de ADN de mamífero y de ave. Finalmente se adjuntaron instrucciones de uso, así como consejos respecto a los protocolos de extracción de ADN previo a Ia utilización del kit, e interpretación posterior de los resultados de amplificación.

Claims

REIVINDICACIONES:
1. Oligonucleótidos de ADN específicos de plantas, animales y de los distintos grupos de animales vertebrados (peces, aves, mamíferos), caracterizados porque tienen las siguientes secuencias: a. Una secuencia de ADN elegida del grupo constituido por las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 ó b. Una secuencia de ADN que en condiciones rigurosas híbrida con una secuencia según (a) o versiones degeneradas, más cortas o más largas de Ia misma, y que es específica de plantas, animales o de los distintos grupos de animales vertebrados (peces, aves, mamíferos).
2. Un amplicón de ADN de planta, caracterizado porque está constituido por Ia amplificación mediante una combinación de los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos, según reivindicación 1.
3. Un amplicón de ADN de animal caracterizado porque está constituido por Ia amplificación mediante una combinación de los oligonucleótidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos, según reivindicación 1.
4. Un amplicón de ADN de pescado caracterizado porque está constituido por Ia amplificación mediante una combinación del oligonucleótido SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos, según reivindicación 1.
5. Un amplicón de ADN de mamífero caracterizado porque está constituido por
Ia amplificación mediante una combinación de los oligonucleótidos SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos, según reivindicación 1.
6. Un amplicón de ADN de ave caracterizado porque está constituido por Ia amplificación mediante una combinación de los oligonucleótidos SEQ ID
NO: 8 y SEQ ID NO: 9 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos, según reivindicación 1.
7. Un método de detección e identificación del origen del ADN en alimentos tanto homogéneos como heterogéneos, crudos o procesados y piensos compuestos, caracterizado porque se utilizan oligonucleótidos cebadores específicos, según reivindicación 1, en una reacción de PCR sobre el ADN aislado de Ia muestra a analizar, con Io que se determina Ia presencia de Planta, Animal, Pescado, Mamífero o Ave basándose en el tamaño de los productos de ADN formados tras Ia amplificación.
8. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de origen vegetal en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de planta utilizando una mezcla de 2 oligonucleótidos cebadores según Ia reivindicación 2.
9. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de origen animal en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de animal utilizando una mezcla de 2 oligonucleótidos cebadores según Ia reivindicación 3.
10. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de pescado en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de teleósteos utilizando una mezcla de 2 oligonucleótidos cebadores según Ia reivindicación 4.
11. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de animal vertebrado de origen mamífero en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de mamífero utilizando una mezcla de 2 oligonucleótidos cebadores según Ia reivindicación 5.
12. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de animal vertebrado de origen aviar en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de ave utilizando una mezcla de 2 oligonucleótidos cebadores según Ia reivindicación 6.
13. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de diferente origen en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de Planta, Animal o Pescado simultáneamente utilizando una mezcla de 5 oligonucleótidos cebadores, determinados por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO:
5 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos según reivindicación 1.
14. Un método según Ia reivindicación 13 caracterizado porque permite Ia correcta amplificación de un máximo de 3 amplicones diagnósticos de diferente tamaño (120 bp que indica Ia presencia de pescado, 260 bp que indica Ia presencia de animal, y 400 bp que indica Ia presencia de plantas).
15. Un método según Ia reivindicación 7, para Ia detección de ADN de diferente origen en alimentos y piensos compuestos, caracterizado porque se determina Ia presencia de animal vertebrado de origen aviar o mamífero simultáneamente utilizando una mezcla de 4 oligonucleótidos cebadores, determinados por SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos según reivindicación 1.
16. Un método según reivindicación 15 caracterizado porque permite Ia correcta amplificación de un máximo de 2 amplicones diagnósticos de diferente tamaño (220 bp que indica Ia presencia de animal de origen aviar, 360 bp que indica Ia presencia de animal mamífero).
17. El uso de cualquiera de los oligonucleótidos de Ia reivindicación 1 como cebadores para Ia detección del origen e identificación del ADN en Ia composición de cualquier sustancia orgánica.
18. Kit para determinar e identificar Ia presencia de ADN de origen vegetal, animal y/o pescado, y diferenciar carnes de mamífero y ave, mediante dos reacciones de PCR múltiple, según las reivindicaciones 2 a 16, caracterizado porque permite Ia correcta amplificación de un máximo de 3 y
2 amplicones diagnósticos respectivamente de diferente tamaño y diferenciables mediante Ia electroforesis en gel de agarosa, y porque contiene los oligonucleótidos de ADN determinados por SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 ó versiones degeneradas, más cortas o más largas de los mismos según reivindicación 1.
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