ES2249176A1 - Identificacion de adn en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos. - Google Patents
Identificacion de adn en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos.Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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-
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Abstract
Identificación de ADN en alimentos crudos o procesados y piensos compuestos. La invención consiste en un procedimiento para identificar el origen del ADN presente en los productos alimenticios a analizar. Este procedimiento detecta y diferencia si en la composición se halla presente ADN de origen vegetal, animal, y de pescado. Además, permite diferenciar si el origen de la carne es de mamífero o de ave. Para dicho procedimiento se requieren 9 oligonucleótidos cebadores específicos. Estos oligonucleótidos han sido diseñados de forma que tras la amplificación mediante PCR múltiple se puede diferenciar la procedencia de los alimentos que integran el producto, ya sea elaborado o no, por el tamaño de los fragmentos amplificados. Esta invención permite el correcto etiquetado de los alimentos procesados cuya composición se precise a nivel general, como puede ser la certificación de piensos compuestos para acuicultura (100% pescado), o para rumiantes (100% planta).
Description
Identificación de ADN en alimentos crudos o
procesados y piensos compuestos.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un sistema de
detección e identificación del origen del ADN presente en alimentos
homogéneos o heterogéneos, crudos o procesados, y piensos
compuestos mediante PCR múltiple para certificar la composición de
dichos productos alimentarios. Este procedimiento se basa en la
especificidad de 9 oligonucleótidos cebadores específicos que
amplifican diferentes regiones del ADN cuando la muestra a analizar
contiene material de origen vegetal, animal e identifica si existe
presencia de pescado, ave o mamífero, permitiendo la diagnosis
diferencial al producir amplicones de diferente tamaño.
Ante la creciente inquietud en los consumidores
sobre la calidad y la seguridad de los productos alimenticios se han
producido avances científicos y tecnológicos para saber el origen
de los diferentes tipos de alimentos de los que se compone un
producto elaborado a partir de una mezcla heterogénea. Los primeros
análisis utilizaban estudios de composición mediante métodos
macromoleculares o químicos (Czesny y col., 2000,
"Discrimination of wild and domestic origin of sturgeon ova based
on lipids and fatty acid análisis", Aquaculture 189),
microscópicos o detección por métodos inmunológicos (Berger y
col, 1988, "Detection of poultry and pork in cooked and canned
meat foods by enzyme-linked inmunosorbent
assays", J. Assoc. Off Anal. Chem. 71). Más
recientemente, e impulsado tanto por las nuevas regulaciones de la
Comunidad Europea (2000/766/EC; 2002/248/EC) en cuanto a medidas
preventivas para la expansión de la encefalopatía espongiforme
bovina (BSE), como por los avances en la diagnosis de alimentos
mediante técnicas de biología molecular, en la bibliografía
científica se describen diversos sistemas para detección de especies
en alimentos basados en la amplificación de regiones concretas de
ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
método de microscopía basado en el análisis de fragmentos de huesos
ha sido reconocido como método europeo oficial para la lucha contra
la BSE diferenciando aves, mamíferos y pescado en las muestras. Pero
sólo es útil cuando en la muestra existen estos fragmentos. Por
otro lado, los sistemas basados en la detección de ADN no están
supeditados a la degradación proteica de los alimentos con el
procesado como indican Meyer y col, en 1994 para la detección
de cerdo en productos cocinados ("Detection of pork in heated
meta products by the polymerase chain reaction", J. Assoc.
Off. Anal. Chem. 77) y permiten una detección más fina en
cuanto a cantidades mínimas de partida y una mayor especificidad en
cuanto al origen de la muestra, como describen Matsunaga y
col., en 1999 para la diferenciación entre 6 especies comunes de
mamíferos ("A quick and simple method for the identification of
meta species and meta products by PCR assay". Meat Sci.
51), o posteriormente Lockley y Bardsley en 2000 para
diferenciación entre dos especies de túnidos ("Novel meted for the
discrimination of Tuna (Thunnus thynnus) and Bonito
(Sarda sarda) DNA", J. Agric. Food Chem 48) o
estos mismos autores 2 años después, para diferenciación entre pollo
y pavo ("Intron variability in an actin gene can be used to
discriminate between chicken and turkey DNA", Meat
Science 61).
Los métodos bio-moleculares
pueden dividirse en dos tipos generales: los sistemas que
diferencian a nivel de unas pocas especies entre sí, que
normalmente necesitan de un sistema adicional de enzimas de
restricción posterior (PCR-RFLP), por lo que el
precio del análisis se ve incrementado, como indican Carrera y
col. en 1999 para diferenciación de salmón y trucha ("Salmon
and trout analysis by PCR-RFLP for identity
authentication", J. Food Science 61) o Asensio y
col. en 2000 para diferenciación de mero, perca y cherna
("Identification of Nile perch (Lates niloticus), grouper
(Epinephelus guaza), and wreck fish (Polyprion
americanus) by polimerasa chain
reaction-restriction fragment length polymorphism of
12S rRNA gene fragment", J. Food Prot. 63); o por otro
lado los sistemas que diferencian a nivel de grandes grupos de
especies mediante PCR múltiple. Los sistemas que diferencian a nivel
de grandes grupos se han centrado en la detección de material
bovino (Tartaglia y col., 1998. "Detection of bovine
mitochondrial DNA in ruminant feeds: a molecular approach to test
for the presence of bovine-derived materials",
J. Food Prot. 61; Wang y col, 2000: "A rapid meted
for PCR detection of bobine materials in animal feedstuffs",
Mol. Cell Probes 14), o más recientemente diferencian bovino, ovino,
porcino y pollo en materia alimenticia (amplificación en duplex:
Krcmar y Rencova, 2003, "Identification of
species-specific DNA in feedstuffs", J. Agric.
Food Chem 51), y diferenciación entre rumiantes, cerdo, pollo
en alimentos para peces (Bellagamba y col, 2003.
"Polimerase chain reaction-based analysis to
detect terrestrial animal protein in fish mear". J. Food
Prot. 66) o en multiplex diferenciando rumiantes, pollo, cerdo
y pescado en alimentos (Dalmaso y col. 2003, "A multiplex
PCR assay for the identification of animal species in
feedstuffs", Mol. Cell. Probes).
Por otro lado, los sistemas que diferencian
varias especies o grupos de especies entre sí mediante PCR múltiple
o con posterior utilización de enzimas de restricción son útiles en
el caso de tener muestras homogéneas, ya que en el caso de muestras
heterogéneas la interpretación de los patrones de restricción o de
amplificación se hace muy difícil o imposible. Así se ha testado
esto con Kits comerciales: diferenciación de las 6 especies más
comunes de vertebrados mamíferos, pero sólo es efectivo con
muestras homogéneas (Kit mixed, Biotools), identificación de las
especies más comunes de mamíferos y aves (PCR y RFLPs), requiere
digestión con enzimas de restricción y es difícil de interpretar
con mezclas de más de 2 especies (Kit identification, Biotools),
identificación de 6 especies diferentes de Bacalao (PCR y RFLPs)
(Kit Cod, Biotools).
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la diagnosis e identificación de la composición de los
alimentos mediante PCR múltiple utilizando oligonucleótidos
específicos. De forma más concreta, la invención se refiere a un
procedimiento para la identificación del ADN presente en alimentos
homogéneos (constituidos por un único componente) o heterogéneos
(compuestos por mezclas de diferentes productos), crudos o
procesados, y piensos compuestos mediante la utilización de 9
oligonucleótidos cebadores originales (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9)
diseñados específicamente para una amplificación mediante PCR
múltiple y posterior visualización de diferentes patrones de
electroforesis en geles de agarosa al 2%. Estos oligonucleótidos
están diseñados en regiones concretas del ADN haciendo de cebadores
específicos para ADN de plantas, animales, pescados, aves y
mamíferos.
En una primera reacción de PCR múltiple,
utilizando los oligonudeótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5, la
amplificación específica produce un máximo de 3 amplicones
diferenciando el ADN de procedencia vegetal (tanto hojas, tallos,
semillas y frutas como tubérculos), el ADN de procedencia animal
(las especies más comunes de vertebrados: aves, mamíferos y peces),
y el ADN de pescado (Teleósteos).
En caso de querer detectar e identificar el
origen de carnes de animal vertebrado, en otra reacción de PCR
múltiple utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO:
9, la amplificación específica produce un máximo de 2 amplicones
diferenciando el ADN procedente de ave o de mamífero.
Esta invención aporta la característica
particular de que permite detectar e identificar la presencia de
ADN tanto animal como vegetal y además permite diferenciar la
procedencia del ADN respecto a los tres grupos de vertebrados más
comunes utilizados en alimentos como son: aves, mamíferos y peces.
Para una diagnosis completa de la muestra a analizar es necesaria
la utilización de dos mezclas de oligonudeótidos cebadores en dos
reacciones independientes de PCR múltiple. A diferencia de las
existentes en el mercado, esta invención permite hacer un barrido
completo de cualquier muestra orgánica identificando las cinco
procedencias anteriormente descritas. En cambio otros kits
disponibles solo distinguen dos procedencias
(Planta-Vertebrado) en mezclas tanto homogéneas
como heterogéneas mediante PCR múltiple, o permiten la
diferenciación de los orígenes más comunes de aves y mamíferos, pero
dicho sistema no es eficaz con mezclas heterogéneas pues da
patrones de restricción de difícil interpretación. La presente
invención ha mostrado una alta sensibilidad y rapidez, es más
económica pues no necesita utilizar enzimas de restricción, además
de permitir un barrido completo de muestras heterogéneas.
El procedimiento se caracteriza porque comprende
dos combinaciones de 5 y 4 oligonudeótidos respectivamente,
diseñados específicamente, a partir de diferentes regiones del
genoma nuclear y mitocondrial, para la detección e identificación
de los componentes de una muestra alimenticia heterogénea. Estas
mezclas de oligonudeótidos permiten la amplificación de ADN de
distinto origen para detección e identificación mediante PCR
múltiple.
El procedimiento completo permite la
identificación básica de una muestra diferenciando 5 orígenes del
ADN en dos reacciones de amplificación por PCR múltiple. En la
mezcla Nº1 tenemos 5 oligonucleótidos (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) que diferencian planta,
animal (aves, mamíferos y peces) y pescado. En la mezcla Nº2 tenemos
4 oligonudeótidos (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO: 9) que diferencian entre carne de ave y de mamífero. La
información y las secuencias de los 9 oligonudeótidos cebadores se
muestras al final de esta memoria en la lista de secuencias.
En líneas generales y para conseguir los
objetivos preconizados, a la vez que simplificar el sistema de
diagnosis, y sin utilizar una digestión posterior con enzimas de
restricción que encarece el procedimiento, aumenta el tiempo
requerido para obtener resultados y dificulta la detección de ADN en
muestras heterogéneas, la presente invención proporciona los
oligonudeótidos cebadores y el procedimiento para amplificar ADN de
planta, animal, pescado, ave y mamífero en dos reacciones
independientes de PCR que conforman un procedimiento de
identificación rápido no existente hasta el momento en el
mercado.
La acuicultura constituye un campo relevante de
aplicación de esta invención. El desarrollo de una dieta orgánica,
completa y equilibrada es una de las principales metas para los
productores de piensos para acuicultura, tratando de encontrar
reemplazamiento para los ácidos grasos y aminoácidos que hasta
ahora solo provenían del pescado. Los aceites y harinas de plantas
no contienen la cantidad necesaria de ácidos grasos insaturados ni
provee el 100% de los distintos aminoácidos esenciales. Actualmente
los componentes de diferentes orígenes se mezclan en los piensos
para acuicultura, y una gran preocupación se basa en el riesgo que
puede llevar la adulteración de los piensos con tejidos o huesos de
mamíferos o aves. Este problema se exacerba por el hecho de que no
existen hoy en día técnicas fiables y rutinarias para detectar este
tipo de adulteraciones. Con la invención que se detalla en esta
memoria descriptiva, mediante amplificación por PCR múltiple, se
identifica el origen de la composición proteica en las distintas
dietas ya sea de piensos compuestos de ganado o acuicultura como de
alimentos procesados, permitiendo la detección de plantas o
animales, y diferenciando dentro de los tres grupos principales de
animales vertebrados: aves, mamíferos y peces. La PCR múltiple
produce amplicones de diferente tamaño que son fácilmente
identificables entre sí y cuyo tamaño se detalla a
continuación:
1. longitud de los amplicones tras la PCR
múltiple con la mezcla Nº 1:
- \bullet
- Si se produce amplificación de ADN de procedencia vegetal obtendremos un fragmento de 400 nucleótidos.
- \bullet
- Si se produce amplificación de ADN de procedencia animal (aves, mamíferos o peces) obtendremos un fragmento de 260 nuceótidos.
- \bullet
- Si se produce amplificación de ADN procedente de pescado obtendremos un fragmento de 120 nucleótidos.
2. longitud de los amplicones tras la PCR
múltiple con la mezcla Nº 2:
- \bullet
- Si se produce amplificación de ADN de procedencia animal de origen aviar obtendremos un fragmento de 220 nucleótidos.
- \bullet
- Si se produce amplificación de ADN de procedencia de animal mamífero obtendremos un fragmento de 360 nucleótidos.
Con esta invención será posible la certificación
de los alimentos y piensos compuestos en términos de asegurar su
origen, ayudando a garantizar aquellos piensos que sean 100% de
pescado (acuicultura) o piensos 100% planta (ganadería). Esta
invención representa tanto para los productores de piensos como
para los ganaderos y acuicultores un nuevo valor añadido a sus
productos, y por otro lado da más seguridad y confianza a los
consumidores de dichos productos.
Para facilitar la comprensión de la invención y
formando parte de esta memoria descriptiva, se acompañan una serie
de dibujos con carácter ilustrativo.
Figura 1: Muestra la visualización en un gel de
agarosa MS8 al 2% de distintos patrones de banda (planta 400bp/
animal 260bp/ pescado 120bp) tras la amplificación mediante PCR
múltiple de 12 muestras alimenticias diferentes utilizando los
oligonudeótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5. Las muestras
analizadas presentan en su composición tejido de 1, 2 ó 3
componentes (vegetal, animal y/o pescado):
1: Marcador Ladder 100 pb
2: Pienso acuicultura para doradas 1
3: Pienso para gatos
4: Scomber japonicus (Caballa)
5: Pienso acuicultura para doradas 2
6: Galeorhinus sp. (Cazón)
7: Meleagris gallopavo (Pavo)
8: Soja sp. (Soja)
9: Triticum sp. (Trigo)
10: Salmo trutta (Trucha)
11: Salchicha (Pollo+Cerdo)
12: Barritas de cangrejo
13: Codorniz+cebolla
Figura 2: Muestra la visualización en un gel de
agarosa MS8 al 2% de los distintos patrones de banda (mamífero
360bp/ ave 220bp) tras la amplificación mediante PCR múltiple de 9
alimentos cámicos. Las muestras analizadas presentan en su
composición tejido de 1 ó 2 componentes (mamífero y/o ave). Las
muestras se analizaron con los oligonudeótidos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID
NO: 9.
1: Marcador Ladder 100 pb
2: Equus caballus (Caballo)
3: Sus scrofa (Cerdo)
4: Bos taurus (Vaca)
5: Queso
6: Ovis aries (Cordero)
7: Gallus gallus (Pollo)
8: Annas sp. (Pato)
9: Salchicha (Pollo+Cerdo)
10 : Pienso para perros
En la presente memoria se describe el
procedimiento para diseñar y preparar oligonucleótidos de ADN
específicos de planta, animal, pescado, mamífero y ave, así como la
determinación del mejor protocolo de extracción de ADN para los
distintos tipos de muestras a analizar.
Asimismo la invención se ilustra con ejemplos de
realización del procedimiento de detección e identificación del
origen del ADN en alimentos homogéneos, heterogéneos, crudos o
procesados y piensos compuestos, usos de los oligonucleótidos de
ADN, así como la forma de utilización del kit. En la lista de
secuencias adjunta se presentan las secuencias individuales de
oligonudeótidos cebadores descritas en la dirección 5'->3'
convencional.
Para la selección de las secuencias específicas
de cada grupo de especies (planta, animal, pescado, mamífero y ave)
se analizaron gran número de secuencias pertenecientes a cada grupo
de especies. Para ello se utilizaron un total de 254 secuencias de
plantas y animales, tanto de la base de datos de secuencias del
National Center for Biotechnology lnformation (NCBI) como
secuencias propias obtenidas en el laboratorio. Una vez
seleccionadas las secuencias más representativas de cada grupo, se
procedió a su alineamiento mediante el programa ClustalX
descrito en Nucleic Acid Research 24 (Thomson y col,
1997). A continuación se analizaron las regiones variables y
conservadas dentro de cada grupo y se procedió a la selección de
secuencias específicas que produjesen un solo amplicón para cada
grupo de especies y que a su vez tuvieran diferente tamaño para ser
identificables en geles de agarosa. Posteriormente se seleccionaron
los oligonudeótidos de manera que la temperatura de hibridación
fuera similar para cada grupo de cebadores que componen la mezcla
en la PCR múltiple. El análisis teórico de los oligonudeótidos
seleccionados en una primera fase (primer-dimer,
temperatura de hibridación, hibridación entre oligonudeótidos,
etc.) se realizó con el programa
Oligo-Analyzer (Kuulasmaa, 2002). Para la
temperatura de hibridación de los oligonucleótidos se consideró la
Tm(NN), determinada mediante los parámetros termodinámicos
descritos por Breslauer y col, 1986 (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 83). De los oligonucleótidos analizados se
seleccionaron los más adecuados y se procedió a su análisis
práctico con diferentes condiciones de PCR, se ensayaron con
diferentes muestras tanto crudas como procesadas de mezclas
homogéneas y heterogéneas. Además se procedió a la optimización de
las condiciones de PCR con distintas concentraciones de ADN y con
diferentes protocolos de
extracción.
extracción.
Para el diseño de oligonucleótidos cebadores de
estos dos grupos se utilizó la región de ADN nuclear del gen que
codifica para el 18S ribosomal. Se alinearon conjuntamente
63 secuencias de plantas (16 especies incluyendo: trigo, apio,
patata, cebada, arroz, maíz, Arabidopsis y soja),1 de
levadura, 1 de rodofita y 45 secuencias de animales tanto
vertebrados (24 especies de todos los grupos principales: aves,
mamíferos, peces, reptiles, anfibios) como invertebrados (21
especies: tanto artrópodos como moluscos) para el diseño de un
oligonucleótido general en una región conservada tanto para
animales como para plantas (caracterizado por SEQ ID NO: 5) y dos
oligonucleótidos específicos. El cebador específico de planta
(caracterizado por SEQ ID NO: 1) se diseñó en una región conservada
en las plantas que a su vez es diferente para los animales. Para el
cebador específico de animales (caracterizado por SEQ ID NO: 2) se
utilizó una región conservada en animales que a su vez es diferente
para plantas y que produce un amplicón de tamaño diferente al de
planta.
Para el diseño de oligonucleótidos cebadores
específicos de pescado (caracterizados por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID
NO: 4) se utilizó la región de ADN nuclear del gen que codifica la
rodopsina. Para ello se amplificó una región de unos 500 pb de la
rodopsina en 50 especies de teleósteos con protocolos y con
oligonucleótidos diseñados expresamente para ello. Posteriormente se
procedió a la secuenciación de los 50 amplicones así obtenidos.
Estas secuencias se alinearon con secuencias de otras 100 especies
diferentes de condrictios y otros teleósteos obtenidas de NCBI. Se
buscaron dos regiones conservadas en la mayoría de los teleósteos
para producir un amplicón diferenciable en tamaño de los producidos
por los oligonudeótidos de planta y animal.
Para el diseño de oligonudeótidos cebadores
específicos de carnes se utilizó la región de ADN mitocondrial del
gen que codifica para el 12S ribosomal. Para ello se
alinearon 41 secuencias obtenidas de NCBI de aves (10 especies que
incluyen pollo, pato, pavo, avestruz y paloma), mamíferos (10
especies que incluyen cerdo, oveja, cabra, vaca y caballo) y peces
(21 especies de distintos ordenes: tanto de teleósteos como de
condrictios). Se utilizaron cuatro regiones conservadas, dos
regiones conservadas pero específicas para la mayoría de los
mamíferos (caracterizadas por SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7) y dos
regiones conservadas pero específicas para la mayoría de las aves
(caracterizadas por SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9), teniendo en
cuenta que cada pareja debería producir un amplicón diferenciable
en tamaño entre sí.
Para aplicar el sistema de identificación sobre
distintas muestras se extrajo ADN de alimentos de distintas
procedencias: muestras simples con un solo componente (crudas o
cocinadas) y mezclas heterogéneas (crudas y cocinadas), como se
muestra en la tabla 1. El ADN se extrajo mediante diferentes
protocolos: método de fenol-cloroformo descrito por
Sambrook y col., (1989) "Molecular cloning: A laboratory
manual, 2º ed. Cold Spring Harbor Press. USA"; y método salino
descrito por Salah y Martínez (1997) "Universal and rapid
salt-extraction of high quality genomic DNA for
PCR-based techniques, Nucleic Acids Research
25 (22)". Se ha comprobado que para muestras que solo
contienen tejido vegetal o muestras heterogéneas que presentan
tanto tejido animal como vegetal, el método más apropiado es el de
Salah y Martínez, mientras que si lo que interesa conocer es la
procedencia de la carne o se trata de muestras de origen animal, el
protocolo más adecuado es el que describen Sambrook y col.
También se ensayaron extracciones de ADN con kits de distintas
casas comerciales (Qiagen, MoBio, TriReagent, Bíotools,
PrepMan, etc.) y con un robot automatizado para extracción de
ADN (6100 Nudeic Acid Prep Station, Aplied Biosystems) siendo la
mayoría eficaces en caso de muestras homogéneas en cuanto a origen
vegetal o
animal.
animal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
A continuación se describen unos ejemplos de
realización preferida de la invención.
En una realización preferida de la invención, se
aplica el procedimiento a la detección e identificación de tres
tipos de componentes en distintas muestras de piensos compuestos
para alimentación.
Una vez extraído el ADN de las muestras en
cuestión, a través del método salino o mediante kits comerciales,
según se indica en el apartado anterior (Extracción previa de ADN),
se procede a preparar la mezcla de productos para la amplificación
en una reacción de PCR múltiple.
Las reacciones de amplificación por PCR se
llevaron a cabo en un volumen de reacción de 25 \mul.
En primer lugar se añaden 14 microlitros (\mul)
de agua bidestilada y autoclavada por cada muestra a analizar, más
una de control negativo.
En segundo lugar se añaden el tampón comercial
para la enzima (10X) a utilizar en la amplificación: 2,5 \mul por
muestra más el control negativo.
En tercer lugar se añaden 3 \mul de Cloruro de
Magnesio 25 mM por cada muestra más el control negativo.
En cuarto lugar se añaden 1,6 \mul de la mezcla
de dNTPs (2,5 mM de cada nucleótido) por muestra más el control
negativo.
En quinto lugar se añaden los 5 oligonucleótidos
específicos de los tres tipos de tejido a detectar en el pienso.
Partiendo de una concentración de 10 \muM añadiremos las
siguientes cantidades por cada muestra a analizar más el control
negativo: 0,5 \mul de SEQ ID NO: 1; 0,6 \mul de SEQ ID NO: 2;
0,7 \mul de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y 1,1 \mul de SEQ ID
NO: 5.
Por último, añadiremos 0,16 \mul de la enzima
polimerasa (puesto a punto para TaKaRa Ex Taq, 5 U/\mul)
por cada muestra a analizar más el control negativo.
Se harán alícuotas de 23 \mul de la mezcla para
el mismo número de muestras a analizar, más el control
negativo.
Posteriormente añadiremos 2 \mul de ADN
previamente extraído a cada alícuota (la concentración del ADN
extraído es muy variable, pudiendo oscilar entre 10 y 250
ng/\mul, por lo que en casos de presentar elevada concentración
puede ser necesario su dilución para evitar inhibiciones en la
PCR).
Para las reacciones de amplificación en PCR
múltiple el termociclador se programó con una fase inicial de 30
segundos a 95ºC, seguido de 40 ciclos con tres fases (30 segundos a
94ºC; 30 segundos a 56ºC; 10 segundos a 72ºC), y finalmente 7
minutos a 72ºC (puesto a punto en aparatos de la marca
Eppendorf).
Por último, para la identificación de los
componentes de las muestras problema visualizaremos la
amplificación tras una electroforesis en gel de agarosa (puesto a
punto para la agarosa MS8 al 2% de Hispanagar, CONDA S.A).
La figura 1 ilustra los resultados obtenidos en
el análisis de 12 muestras.
En otra forma de realización preferida de la
invención, se aplica el procedimiento a la detección e
identificación de dos tipos de carnes de vertebrado en distintas
muestras de piensos compuestos para alimentación de mascotas y
alimentos preparados.
Una vez extraído el ADN de las muestras en
cuestión, a través del protocolo convencional de
Fenol-Clorofommo o mediante Kits comerciales, según
se ha indicado previamente, se procede a preparar la mezcla de
productos para la amplificación en una reacción de PCR
múltiple.
Las reacciones de amplificación por PCR se llevan
a cabo en un volumen de reacción de 25 \mul.
En primer lugar se añaden 15 \mul de agua
bidestilada y autoclavada por cada muestra a analizar, más una de
control negativo.
En segundo lugar se añaden el tampón comercial
para la enzima (10X) a utilizar en la amplificación: 2,5 \mul por
muestra más el control negativo.
En tercer lugar se añaden 3 \mul de Cloruro de
Magnesio 25 mM por cada muestra más el control negativo.
En cuarto lugar se añaden 1,6 \mul de la mezcla
de dNTPs (2,5 mM de cada nucleótido) por muestra más el control
negativo.
En quinto lugar añadiremos los 4 oligonucleótidos
específicos de los dos tipos de carnes a detectar en el pienso.
Partiendo de una concentración de 10 \muM añadiremos las
siguientes cantidades por cada muestra a analizar más el control
negativo: 0,7 \mul de SEQ ID NO: 6; 0,7 \mul de SEQ ID NO: 7;
0,7 \mul de SEQ ID NO: 8 y 0,7 \mul de SEQ ID
\hbox{NO:
9}.
Por último, añadiremos 0,16 \mul de la enzima
polimerasa (puesto a punto para TaKaRa Ex Taq, 5 U/\mul)
por cada muestra a analizar más el control negativo.
Se hacen alícuotas de 23 \mul de la mezcla para
el mismo número de muestras a analizar, más el control
negativo.
Posteriormente se añaden a cada alícuota 2 \mul
de una dilución 1/2 del ADN previamente extraído (la concentración
del ADN extraído es muy variable, pudiendo oscilar entre 10 y 250
ng/\mul, por lo que en casos de presentar elevada concentración
puede ser necesario su dilución para evitar inhibiciones en la
PCR).
Para las reacciones de amplificación en PCR
múltiple el termociclador se programó con una fase inicial de 30
segundos a 95ºC; seguido de 40 ciclos con tres fases (30 segundos a
94ºC; 30 segundos 58ºC; 10 segundos a 72ºC), y finalmente 7 minutos
a 72ºC (puesto a punto en aparatos de la marca Eppendorf).
Por último, para la identificación de los
componentes de las muestras problema visualizaremos los productos
de amplificación tras una electroforesis en gel de agarosa (puesto
a punto para la agarosa MS8 al 2% de Hispanagar, CONDA S.A).
La figura 2 ilustra los resultados obtenidos en
el análisis de 9 muestras.
El presente ejemplo se refiere a un kit para la
determinación específica de la presencia de planta, animal,
pescado, mamífero o ave en muestras alimentarias o piensos
compuestos utilizando 9 cebadores específicos en dos reacciones de
PCR múltiple.
Se ensambló un kit para 20 reacciones con la
siguiente composición:
- Un envase con premezcla de PCR constituida por.
dNTPs (2,5 mM de cada uno), tampón de PCR (10X), mezcla de 5
oligonucleótidos para amplificación de ADN de planta, animal y
pescado (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5) y agua destilada estéril.
- Un envase con premezcla de PCR constituida por
dNTPs (2,5 mM de cada uno), tampón de PCR (10X), mezcla de 4
oligonucleótidos cebadores para amplificación de ADN de mamífero y
ave (SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:9) y agua destilada estéril.
- Un envase con TaKaRa Ex Taq (5 u/\mul)
- Un envase con marcador de talla (100 bp
Ladder)
- Un envase con MgCI (25 mM).
- Un envase con mezcla de ADN de planta y
pescado.
- Un envase con mezcla de ADN de mamífero y de
ave.
Finalmente se adjuntaron instrucciones de uso,
así como consejos respecto a los protocolos de extracción de ADN
previo a la utilización del kit, e interpretación posterior de los
resultados de amplificación.
<110> Universidad Complutense de Madrid
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<120> Identificación de ADN en alimentos
crudos o procesados y piensos compuestos
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<160> 9
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<210> 1
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
ribosomal 18S de plantas
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipcaagaatttc acctctgact atga
\hfill24
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<210> 2
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
ribosomal 18S de animales
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipctctaatttt ttcaaagtaa acgctt
\hfill26
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<210> 3
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
rodopsina de peces
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipgggtggtctc rgactcctg
\hfill19
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<210> 4
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
rodopsina de peces
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipgagtccttyg tbrtctacat gttc
\hfill24
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<210> 5
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
ribosomal 18S de animales y plantas
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipattggagggc aagtctggt
\hfill19
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<210> 6
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
12S ribosomal de mamíferos
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipatccaagcac actttccagt atg
\hfill23
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<210> 7
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
12S ribosomal de mamíferos
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskiptatataccgc catcttcagc aa
\hfill22
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<210> 8
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
12S ribosomal de aves
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipggctatacct tgacctgtct
\hfill20
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<210> 9
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador para PCR, basado en el gen
12S ribosomal de aves
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskipctgagaacta cgagcacaaa c
\hfill21
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Claims (9)
1. Método para la identificación de ADN de
Planta, Animal, Pescado, Mamífero o Ave en alimentos tanto
homogéneos como heterogéneos, crudos o procesados y piensos
compuestos que se basa en la aplicación de la técnica de la PCR
sobre el ADN aislado de la muestra a analizar, caracterizado
porque se utilizan como cebadores específicos los oligonucleótidos
determinados por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ
ID NO: 9 ó versiones de los mismos que presentan modificaciones de
tamaño y/o secuencia siendo equivalentes a los cebadores originales
en cuanto a su capacidad de hibridación y sus características
funcionales.
2. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según reivindicación 1, caracterizado porque se
determina la presencia de ADN de planta utilizando los cebadores
determinados por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 ó versiones de los
mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia siendo
equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su capacidad de
hibridación y sus características funcionales.
3. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según reivindicación 1, caracterizado porque se
determina la presencia de ADN de animal utilizando los cebadores
determinados por SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 ó versiones de los
mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia siendo
equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su capacidad de
hibridación y sus características funcionales.
4. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según reivindicación 1, caracterizado porque se
determina la presencia de ADN de pescado utilizando los cebadores
determinados por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 ó versiones de los
mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia siendo
equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su capacidad de
hibridación y sus características funcionales.
5. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según reivindicación 1, caracterizado porque se
determina la presencia de ADN de mamífero utilizando los cebadores
determinados por SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 ó versiones de los
mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia siendo
equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su capacidad de
hibridación y sus características funcionales.
6. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según reivindicación 1, caracterizado porque se
determina la presencia de ADN de ave utilizando los cebadores
determinados por SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 ó versiones de los
mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia siendo
equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su capacidad de
hibridación y sus características funcionales.
7. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según la reivindicación 1, caracterizado porque
se determina la presencia de Planta, Animal o Pescado
simultáneamente utilizando una mezcla de 5 cebadores, determinados
por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID
NO: 5 ó versiones de los mismos que presentan modificaciones de
tamaño y/o secuencia siendo equivalentes a los cebadores originales
en cuanto a su capacidad de hibridación y sus características
funcionales.
8. Método para la identificación de ADN en
alimentos, según la reivindicación 1, caracterizado porque
se determina la presencia de animal vertebrado de origen aviar o
mamífero simultáneamente utilizando una mezcla de 4 cebadores,
determinados por SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID
NO: 9 ó versiones de los mismos que presentan modificaciones de
tamaño y/o secuencia siendo equivalentes a los cebadores originales
en cuanto a su capacidad de hibridación y sus características
funcionales.
9. Kit para identificar la presencia de ADN de
origen vegetal, animal y/o pescado, y diferenciar carnes de
mamífero y ave, mediante dos reacciones de PCR múltiple, según las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque contiene
como cebadores los oligonucleótidos de ADN determinados por SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 ó versiones de
los mismos que presentan modificaciones de tamaño y/o secuencia
siendo equivalentes a los cebadores originales en cuanto a su
capacidad de hibridación y sus características funcionales.
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| EP0807690A1 (en) * | 1996-05-13 | 1997-11-19 | Karl-Schmitz-Scholl-Fonds für Umweltrecht und Umweltpolitik e.V. | Method and compositions for identification of species origin of caviar |
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| TELETCHEA F. et al. "Food and Forensic molecular identification: update and challenges". Trends in Biotechnology. Julio 2005. Vol 23, n 7, paginas 359-366. * |
| TELETCHEA F. et al. "Food and Forensic molecular identification: update and challenges". Trends in Biotechnology. Julio 2005. Vol 23, nº 7, páginas 359-366. * |
Also Published As
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| WO2006040373A3 (es) | 2006-08-24 |
| WO2006040373A2 (es) | 2006-04-20 |
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| WO2006040373B1 (es) | 2006-09-21 |
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