WO2006037573A1 - Typ-pept1-protein-assay - Google Patents

Typ-pept1-protein-assay Download PDF

Info

Publication number
WO2006037573A1
WO2006037573A1 PCT/EP2005/010601 EP2005010601W WO2006037573A1 WO 2006037573 A1 WO2006037573 A1 WO 2006037573A1 EP 2005010601 W EP2005010601 W EP 2005010601W WO 2006037573 A1 WO2006037573 A1 WO 2006037573A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
active substance
complex
protein
solution
peptl
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/010601
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006037573B1 (de
Inventor
Natalie Watzke
Maarten Ruitenberg
Wolfgang Dörner
Renate Gauss
Béla KELETY
Joanna Tobien
Original Assignee
Iongate Biosciences Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iongate Biosciences Gmbh filed Critical Iongate Biosciences Gmbh
Priority to US11/664,541 priority Critical patent/US20080248486A1/en
Priority to EP05790083A priority patent/EP1797434A1/de
Publication of WO2006037573A1 publication Critical patent/WO2006037573A1/de
Publication of WO2006037573B1 publication Critical patent/WO2006037573B1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes

Definitions

  • the invention relates to a type-PepT protein assay, and more particularly to a method of identifying a substrate and / or modulators of a type PepTI protein.
  • the invention further relates to an active substance complex which has been identified according to the method according to the invention, to a method for producing a medicament which is a substrate of the type-PepTl protein or by conjugation with a substrate for a type-PepTl protein has been made to such a substrate, a test kit for carrying out the method according to the invention, a screening method and the uses of the method according to the invention, of the test kit according to the invention and of the medicament.
  • Natural transport proteins play in the uptake of various molecules, e.g. from the intestine an important role.
  • Polar or hydrophilic compounds are usually absorbed poorly in the intestine, since their transport via the cell membrane is energetically unfavorable, and requires energy.
  • Amino acids, di- and tripeptides, monosaccharides, vitamins, nucleosides, etc. are polar compounds whose incorporation is, however, essential for the organism. For such substances, there are usually specific transport systems.
  • PepTl In mammals, two peptide transporters PepTl and PepT2 have been detected so far.
  • PepTl is expressed in the small intestine, kidney, bile duct and pancreata
  • PepT2 is expressed in the kidney, the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS), the lung, the mammary gland, the spleen, the colon and the pancreas is expressed (overview in Rubio-Aliaga & Daniel 2002).
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral nervous system
  • the lung the mammary gland
  • the spleen the colon and the pancreas is expressed (overview in Rubio-Aliaga & Daniel 2002).
  • the detection of active uptake of GIyGy into intestinal epithelial cells was successful (Newey & Smyth 1962).
  • the carrier is dependent on an inward H + gradient (Ganapathy & Leibach 1985).
  • PepTl but not PepT2
  • PepT1 is expressed in the gut
  • pharmacological agents that are substrates for PepT1, or that can be modified by PepTl can be detected and transported.
  • electrophysiological methods for example the so-called patch-clamp technique or voltage-clamp technique, in which, for example, cells are accessible in isolation to an electrophysiological examination.
  • patch-clamp technique or voltage-clamp technique
  • native cells are exposed to different conditions and certain electrical activities mediated across the cell membrane by proteins, protein complexes or the like contained therein are measured.
  • the invention is therefore based on the object to provide a type-PepTl-protein assay, in which in a particularly simple and yet reliable manner a rapid drug testing, especially in Massen ⁇ operation, is possible at a reasonable cost.
  • the present invention furthermore relates to an active substance or active substance complex according to claim 20, a method for producing a medicament according to claim 21, a test kit for carrying out the method according to the invention according to claim 22, a screening method according to claim 23, as well as uses of the method, the test kit and the medicament according to claims 24, 25 and 26, respectively.
  • Advantageous further developments are the subject of the respective dependent subclaims.
  • proton (s) together with 1 substrate molecule, naturally in the intestine normally 1 small peptide, in particular 1 di- or tripeptide, are shifted across the membrane.
  • the invention is based inter alia on the idea of the resulting charge shift - ie the ion transport of protons and / or of charged substrates, such as, for example, Di- or tripeptides or even electrically charged substrates - directly by attachment of enzyme preparations on a suitable surface, which is integrated into a flow-through system and / or in which a substrate jump can be carried out, as electrical current or as electrical potential change to measure and / or investigate the influence of different substances on the electrical quantities of current or potential.
  • charged substrates such as, for example, Di- or tripeptides or even electrically charged substrates - directly by attachment of enzyme preparations on a suitable surface, which is integrated into a flow-through system and / or in which a substrate jump can be carried out, as electrical current or as electrical potential change to measure and / or investigate the influence of different substances on the electrical quantities of current or potential.
  • the invention thus relates to a method for identifying potential substrates and / or inhibitors / activators of a type-PepTl protein which contains an enzymatic property and / or the transport behavior of the type-PepTl protein or a part thereof.
  • the method according to the invention comprises the following steps:
  • steps (c), (d) and / or (e) one or more of the following substeps are carried out:
  • a solution with 140 mmol / 1 KCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Mes pH 6.0 or Hepes pH 7.0 and 25 mmol / 1 GIy- one can be used.
  • a solution with 140 mmol / 1 KCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l Mes pH 6.0 or Hepes pH 7.0 and 25 mmol / 1 Gly-Gly can be used as the activating solution.
  • steps (f) and (g) according to the invention are preferably carried out in the predetermined sequence, if necessary with repetitions.
  • step (f) it can be particularly favorable if, before step (f), a step (f) is carried out once, incubating with a conditioning buffer instead of a non-activating solution, the addition buffer corresponding to the non-activating solution, but the compensator not included in the solution.
  • a conditioning buffer instead of a non-activating solution, the addition buffer corresponding to the non-activating solution, but the compensator not included in the solution.
  • the potential drug should only be present in the activating solution, but not in the non-activating solution.
  • the potential active substance can be present in all media.
  • the active site complex or part thereof used is preferably a monomer or an OHomer of a PepTI protein.
  • type-PepT1 protein means that the protein has the typical characteristics of the PepT1 protein, in particular including proteins which, in their transport and substrate recognition properties as well as their sensitivity to inhibitors and activators, belong to the PepT1 Or are similar to the renal isoform PepT 2. Both isoforms can easily be used in the present test system.
  • a site complex or portion thereof will be used which is based on a type-PepTl protein derived from a tissue of a mammal, e.g. from the small intestine, kidney, bile duct or Pankre ⁇ as, or is derived therefrom.
  • the type-PepTl protein is derived from mammalian cell lines and is cloned.
  • the site complex comes from the organism pig, mouse, sheep or human or is derived from these genetically.
  • the expression "enzymatic property" of the type-PepTl protein always means the transport behavior, eg the peptide or proton transport mediated by these proteins, and thus also refers to the influence of the protein discussed at the outset.
  • investigations are included according to the invention which are intended to show whether a the substance of the type-PepTl protein is transported and / or whether a certain substance modifies the transport properties of the type-PepTl protein, ie is an inventive modulator of the type-PepTl protein.
  • Wirkstoff ⁇ complex means either a potential substrate whose transport via the type-PepTl protein is to be investigated, or a so-called modulator which inhibits, for example, the transport of previously determined substrates or activates.
  • the active substance complex or a part thereof can be transported directly into the site of the active site complex by injection or admixing into the measurement solution.
  • a process is particularly simple if the respective measuring solution is simply exchanged, for example in a continuous manner.
  • the active substance is released only by a chemical or physical reaction or reaction in the measurement solution. This can also be done for example by supplying radiation.
  • the qualitative influence and / or the quantitative influence of the potential drug or drug complex is determined according to the invention by detecting an electrical action which is mediated by the site complex or a part thereof and in particular by the type-PepTl protein.
  • this electrical action is determined with and without potential drug, and by comparing both series of measurements it is examined whether the potential drug affects the enzymatic properties of the type-PepTl protein.
  • the primary carriers are brought into contact with the active site complexes on a secondary carrier, namely the biosensor electrode and in particular with its isolation region, and are deposited there in particular.
  • a biosensor electrode is used as a secondary carrier, in which an electrically conductive and festConsequentlyar ⁇ tiger electrode region is provided with at least one electrode which is electrically insulated from the measuring solution and with respect to the primary carriers by providing an isolation region in the form of a solid-supported membrane which is built up in layers from a lower layer of an organic thio compound as the lowest layer and the electrode respectively facing the layer and from an upper layer of an amphiphilic organic compound.
  • a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which a gold electrode is provided in the electrode region with a monolayer of a long-chain alkanethiol as a lower layer thereon and a monolayer of a lipid as a topcoat thereon.
  • the primary carriers which are to contain the site complex and in particular the type-PepTl proteins in the region of their membrane, different possibilities result, wherein the respective objective of the method can be taken into account.
  • the primary carrier is in each case a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, in particular an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or constituents thereof, in particular membrane fragments, or dressings thereof in native form and / or in a modified form, in particular in purified and / or modified form.
  • a vesicle, a liposome or a micellar structure is used as the primary carrier.
  • the membrane fragments can also deposit planar, i. as a non-spherical structure.
  • the method according to the invention is particularly advantageous if the sensor arrangement of biosensor electrode as secondary carrier and primary carriers mounted thereon in a measuring space, measuring area or measuring vessel flows around or flows against the measuring solution.
  • a change in concentration with respect to the active substance complex or a part thereof can be easily achieved by changing the measurement solution.
  • the test conditions according to the invention can advantageously be adjusted in an easy manner and reliably with high time resolution. Also with the aid of an automated pipetting device, the method according to the invention can be advantageously carried out.
  • the method according to the invention is particularly economical and accessible for a statistical evaluation when a plurality of tests are carried out successively, in particular by successive exchanging of the measuring solution, optionally with interposed washing or rinsing of the measuring chamber.
  • the present inventive method it is important to compare the action of the active site complex in the case of the active substance complex present with a situation in which the potential active substance complex is not present. This can be done, for example, by changing between non-activating solution to be activated in the presence or absence of the potential active substance complex and comparing the measured values obtained.
  • Potential modulators to be tested are particularly preferably monoclonal antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies and peptides. However, it is also possible to add other substances which are suspected of having a corresponding effect. These substances are preferably administered in dissolved form. Particularly preferred substances that can be investigated as possible potential substrates and / or modulators in the test system according to the invention are low molecular weight compounds. Such compounds often have little or no side effects when used as an active principle in a pharmaceutical composition. Another advantage of such substances is the possibility of oral administration.
  • cyclic pentapeptides as described by Haubner et. al. , J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 7641-7472.
  • small peptides, amino acids and amino acid analogs, steroids, nucleotides and other organochemical substances having a molecular weight of ⁇ 5000, preferably ⁇ 3000 and more preferably ⁇ 2000, are attributed to the low molecular weight substances.
  • an intermediate step is an incubation of the active site complexes or of the primary carriers carrying them with the active substance complex.
  • a washing step is carried out between steps (f) and (g) by introducing the secondary carrier with the primary carriers into a [washing] solution, which is preferably identical to the holding buffer.
  • aqueous measuring solutions and in particular aqueous electrolyte solutions are used as the measuring solution, which are referred to as addition buffer, non-activating and activating solution.
  • All measurement solutions used contain a pH-stabilizing agent known to those skilled in the art, preferably selected from the list: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES, etc., as published eg in "Buffers, Calbiochem", but also with ease According to the invention, these known agents should have a stabilizing effect in the range from pH 6 to 8, preferably about 7.
  • the choice of the suitable pH range and agent may depend on the substrate (drug complex) and easily determined by the skilled worker by routine experimentation.
  • the attachment buffer comprises at least one cation species, preferably selected from the list consisting of K +, Ca ++, Na +, Li +, Mg ++, choline +, Rb +, Sr ++ in a concentration which is preferably about as high as the Ka ⁇ tion concentration in the non activating and in the activating solution.
  • this concentration can be between 1 ⁇ mol / 1 and 1 mol / 1, preferably between 10 and 200 mmol / l, particularly preferably between 120-160 mmol / l.
  • the non-activating solution likewise contains at least one cation species in a concentration which is preferably approximately as high as the cation concentration in the addition buffer.
  • attachment buffer It is preferably a cation of the list described for the attachment buffer, preferably it corresponds to the cation or the cations of the attachment buffer.
  • non-activating solution may optionally comprise a compensator.
  • This compensator serves to ensure that when switching from non-activating solution to solution to be activated, e.g. By changing the ionic strength, no site-independent, false-positive signal is detected.
  • the compensator is preferably an amino acid, and particularly preferably the amino acid glycine, if the dipeptide Gly-Gly is used as the substrate for inhibition measurements in the activating solution.
  • the type of compensator used depends on the type of substrate used.
  • the compensator used is preferably an amino acid with a pK value which is approximately equal to the p j value of the di- or tripeptide.
  • an acid or a base which has a pK value which corresponds approximately to that of the investigated target molecule is used as the compensator.
  • the concentration of the compensator generally depends on the concentration of the substrate, and is generally between 0 to 100 mmol / l. In principle, the concentration of the compensator is varied until an action site-independent electrical action due to the change from non-activating to activating solution no longer occurs.
  • the activating solution may contain the compensator regardless of whether it is contained in the non-activating solution.
  • the activating solution likewise contains at least one cation species in a concentration which is preferably approximately as high as the cation concentration in the addition buffer.
  • the attachment buffer It is preferably a cation of the list described for the attachment buffer, it preferably corresponds to the cation or the cations of the attachment buffer. Furthermore, it contains a substrate of the type-PepTl protein, preferably a di- or tripeptide, particularly preferably Gly-Gly for inhibition or activation measurements.
  • substrates are, for example, monosaccharides, vitamin nucleosides and also beta-lactam antibiotics and similarly structured compounds.
  • these are peptide-like compounds.
  • the concentration can vary between> 0 and 1 M.
  • the compensator may also be present in the activating solution if such a better signal-to-background ratio, i. that absence of site-independent, false-positive signals when changing from non-activating solution to akti ⁇ fourender solution can be achieved.
  • Cations which are suitable according to the invention are all cations which (a) do not inhibit PepTl and (b) do not trigger any measuring artifacts.
  • Zn and Cu are known to inhibit PepTl.
  • the present invention provides an active substance or an active substance complex which modifies an enzymatic property of a type of a PepTl protein-containing active site complex or a part thereof and which is identified according to the method according to the invention for identifying an active substance complex has been.
  • the present invention provides a method for producing a medicament comprising the steps of:
  • Identification of an active substance and / or an active substance complex which suitably modifies an enzymatic property of an active substance complex, which contains one type of a PepT1 protein, or a part thereof or a plurality of properties, if appropriate with the aid of the method according to the invention .
  • test kit for carrying out the method according to the invention for identifying an active substance complex. This test kit points to:
  • a screening method for identification is also created, namely for identifying: an unknown active substance, active substance complex, a part and / or derivative thereof,
  • the process according to the invention for identifying an active substance complex is used for finding inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of an active site complex which contains a type-PepT1 protein ,
  • test kit according to the invention is used according to the invention for finding modulators, i. Inhibitors or activators, e.g. partial or temporary inhibitors of an active site complex containing one type of PepTI protein.
  • modulators i. Inhibitors or activators, e.g. partial or temporary inhibitors of an active site complex containing one type of PepTI protein.
  • the site complex contains the PepTl protein.
  • the medicament according to the invention is used for the inhibition, partial or temporary inhibition, activation or other modulation of a type-peptide complex containing active ingredient.
  • a z. B. aqueous measuring solution in which the primary carrier and the secondary carrier are arranged.
  • the electrode area is preferably largely electrically isolated from the measuring solution (activating or non-activating solution), the primary carriers and, compared with the biological units.
  • the electrode region has, for example, at least one electrode. On the one hand, this can itself be designed as a mechanically stable material region, in particular as a plate, as a wire and / or the like.
  • the electrode is designed essentially as a material layer deposited on the surface of the carrier. It may be a vapor-deposited or sputtered material layer.
  • the material layer for forming the electrode preferably has a layer thickness of about 10 to 200 nm.
  • the type-PepTl protein may in each case be provided in substantially native form and / or in modified, in particular purified, microbiologically and / or molecularly-modified form.
  • certain native properties can be tested and examined pharmacologically.
  • molecular biological or genetically engineered changes are also suitable for analyzing certain aspects, for example the transport or the pharmacological mode of action of an active substance.
  • primary carriers of a respectively substantially uniform type of primary carriers are provided. This is important in terms of the most unambiguous statement and analysis of a drug test and relates to the geometric, physical, chemical, biological and molecular-biological properties of the primary carriers.
  • Wirkort ⁇ provided in the primary carrier complex and the type-PepTl protein.
  • Wirkortkomplexe and type PepTl protein are provided each of a substantially uniform type, in particular with regard to their geometric, physical, chemi ⁇ 's, biological and molecular biological properties.
  • the biological units should advantageously be approximately uniform with regard to their orientation and / or with regard to their activatability with respect to the respective primary carrier.
  • the invention is inter alia based on the object, the effect of substances on the function of type-PepTl - Proteins of a study to make accessible. Substances which modulate the action of this transport protein are of potential commercial interest as potential neuroprotective agents. Also, substrates of the protein transported by it would possibly be important new molecules.
  • the measurement of the transport activity or the transport properties according to the method proposed according to the invention requires no mediator or labeled substrates. A single measurement takes only a few seconds. The measurement is sensitive to all substrates. If a substance does not irreversibly inhibit the reaction, several measurements can be carried out with a sensor loaded with enzyme. Substrates do not have to be chemically modified since the current response or potential response of the protein is induced by a rapid solution change.
  • the capacity of the protein-loaded membranes was about 1000 nF cm '2 , the conductivity G 13 at about 10 nS cm ' 2 .
  • Glibenclamide is an inhibitor of PepTl (IC 50 in oocytes about 100 ⁇ M). The inhibition of the current amplitude by glibenclamide proves that the detected signal is actually a specific PepT1 signal. Complete inhibition with glibenclamide is not possible due to the poor solubility of glibenclamide.
  • FIG. 1 shows, in the form of a graph, schematically the transport current I (t) produced by the PepTI protein as electrical action measurable by the biosensor electrode.
  • Fundamental advantages of the present invention are the high mechanical stability of the intended sensor arrangement and, associated therewith, the high operational readiness, the ease of handling and the low susceptibility to interference.
  • the use of the sensor arrangement results in a long service life, high reliability, low susceptibility to interference and, in particular, a significantly increased test throughput compared to conventional methods, whereby corresponding test methods can be worked out and carried out inexpensively.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Typ-PepTi-Protein-Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Substrats und/oder eines Modulators des PepT1-Proteins.

Description

Typ-Pept 1 -Prot ein-Assay
Die Erfindung betrifft einen Typ-PepTl -Protein -Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Substrats und/ oder Modulatoren eines Typ-PepTl-Proteins.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, ein Verfahren zum Herstellen ei¬ nes Arzneimittels, welches ein Substrat des Typ-PepTl -Proteins ist, oder durch Konjugation mit einem Substrat für ein Typ-PepTl -Protein zu einem solchen Substrat gemacht wurde, einen Testkit zum Durchführen des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens, ein Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Testkits sowie des Arzneimittels.
Die rasanten Fortschritte in der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung be¬ wirken ein rasches Ansteigen der Anzahl von potentiell zur Verfügung stehen¬ den therapeutischen Mitteln. Es ist jedoch noch immer sehr häufig ein großes Problem, die entsprechenden Mittel so zu formulieren, dass sie oral gut biover- fügbar sind, d.h. bei oraler Aufnahme vom Körper hinreichend gut aufgenom¬ men werden, um eine optimale Wirksamkeit bzw. Verträglichkeit zu sichern.
Natürliche Transportproteine spielen bei der Aufnahme unterschiedlichster Moleküle z.B. aus dem Darm eine wichtige Rolle.
Polare oder hydrophile Verbindungen werden im Darm meist nur schlecht ab¬ sorbiert, da deren Transport über die Zellmembran energetisch ungünstig ist, und einen Energieaufwand bedingt. Aminosäuren, Di- und Tripeptide, Mono¬ saccharide, Vitamine Nukleoside usw. sind solche polaren Verbindungen, de- ren Aufnahme für den Organismus jedoch essentiell ist. Für solche Substan¬ zen gibt es zumeist spezifische Transportsysteme.
In Säugern wurden bisher zwei Peptidtransporter PepTl und PepT2 nachge¬ wiesen. PepTl wird im Dünndarm, der Niere, dem Gallengang und der Pankre- as exprimiert, während PepT2 in der Niere, dem Zentralnervensystem (ZNS), dem peripheren Nervensystem (PNS), der Lunge, der Brustdrüse, der Milz, dem Dickdarm und der Pankreas exprimiert wird (Übersicht bei Rubio-Aliaga & Daniel 2002). Anfang der 1960er Jahre gelang der Nachweis der aktiven Aufnahme von GIy- GIy in intestinale Epithelzellen (Newey & Smyth 1962), Der Carrier ist von ei¬ nem zelleinwärts gerichteten H+-Gradienten abhängig (Ganapathy & Leibach 1985). Er wird vom Membranpotential stimuliert, ist sättigbar und elektrogen. Durch Expressionsklonierung in Xenopus laeυis Oocyten gelang es Mitte der 1990er Jahre, die Primärstruktur zunächst für den intestinalen Peptidtrans- porter (PepTl ) und kurz darauf für die renale Isoform (PepT2) aufzuklären (Fei et al. 1994; BoIl et al. 1996). Aus der großen Anzahl seiner strukturell diver¬ sen natürlichen Substrate (8400 Di- oder Tripeptide) resultiert, dass die Sub- stratspezifität der Peptidtransporter nicht stark ausgeprägt ist.
So zeigten schon Anfang der 1970er Jahre einige Arbeiten, dass der Transpor¬ ter neben seinen natürlichen Substraten auch - Lactamantibiotika, die eine tripeptidtähnliche Struktur besitzen, erkennt (Quay 1972). Somit wird das Peptidtransportsystem für die pharmazeutische Industrie interessant,, da mit dessen Hilfe die orale Applikation von Peptidpharmaka ermöglicht werden kann.
Aus den bisherigen Untersuchungen über die Substratspezifität des intestina- len H+/ Peptidsymporters konnten wenige und zum Teil auch widersprüchliche Aussagen über die Faktoren für eine optimale Erkennung durch den Transpor¬ ter abgeleitet werden.
Lange Zeit wurde die Peptidbindung und ein freier N- und C-Terminus für eine optimale Interaktion zwischen Substrat und Transporter als notwendig erach¬ tet. Neuere Erkenntnisse geben Anlass zur Revision dieser Ansicht. Beispiels¬ weise konnte gezeigt werden, dass der Peptidtransporter eine Ketomethylen- gruppierung (Döring et al. 1998a) oder eine Esterbindung (Ganapathy, M. E. et al. 1998) anstatt einer Peptidbindung mit ähnlicher Affinität erkennt.
In der Literatur über Inhibitoren des Peptidtransporters wurden bisher entwe¬ der widersprüchliche Ergebnisse publiziert (Taub et al. 1997; Abe et al. 1999; Yang et al. 2002) oder der beschriebene Inhibitor zeigte nur eine geringe Affi¬ nität zum Transporter (4-Aminomethylbenzoesäure: Meredith et al. 1998).
Darüber hinaus werden vom Transporter zum Teil auch voluminöse Blockie¬ rungsgruppen mit relativ geringer Affinitätserniedrigung toleriert. Neben der Identifizierung von Inhibitoren ergibt sich auch die Möglichkeit, Prodrugs zu entwickeln, in dem z.B. oral nicht verfügbare Medikamente an die Seitenkette des Dipeptids gekoppelt werden.
Da PepTl , nicht aber PepT2 im Darm exprimiert wird, haben sich die heutigen Bemühungen darauf gerichtet, die orale Verfügbarkeit von Arzneimitteln zu verbessern, in dem pharmakologische Mittel gesucht wurden, die Substrate für PepTl sind bzw. so modifiziert werden können, dass sie von PepTl erkannt und transportiert werden können.
Im Stand der Technik sind unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qua¬ litativ analysiert und beschrieben werden können.
Es ist dabei wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirk- ortkomplex zu applizieren, z.B. am PepTl -Protein, an einer Zelle , einem Gewe¬ be oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.
Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.
Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Ein¬ heiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise ei¬ ner Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken be- kannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbei¬ ten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfälligkeit zukommen.
Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich. Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch -Clamp -Technik oder Voltage-Clamp-Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung zu¬ gänglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.
Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektro- physiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/ oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile auf- weisen. Darüberhinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.
Ein besonders günstiges Verfahren zum Messen von elektrochemischen Vor¬ gängen an beispielsweise Membranfragmenten wird in der WO 02/074983 be¬ schrieben, auf die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung vollinhaltlich Bezug genommen wird. Eine Verwendung des dort offenbarten Verfahrens zur Testung an Typ-PepTl -Proteinen wird nicht offenbart.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-PepTl-Protein- Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuver- lässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massen¬ betrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.
Gelöst werden diese und weitere Aufgaben, die sich zwanglos aus dem ein¬ gangs diskutierten Stand der Technik ergeben, durch ein Verfahren zum Iden- tifizieren eines Wirkstoffkomplexes mit allen Merkmalen des Anspruchs 1.
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex gemäß Anspruch 20, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch 21, ein Testkit zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 22, ein Screeningverfahren gemäß Anspruch 23, sowie Verwendungen des Verfahrens, des Testkits sowie des Arzneimittels gemäß den Ansprüchen 24, 25 bzw. 26. Vorteilhafte Weiterbil¬ dungen sind Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche. Im Transportzyklus von PepTl wird (werden) jeweils 1 (nach neuesten Erkent- nissen möglicherweise 2) Proton(en) zusammen mit 1 Substratmolekül, natür¬ licherweise im Darm normalerweise 1 kleinen Peptid, insbesondere 1 Di- oder Tripeptid, über die Membran verschoben.
Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, die entstehende La¬ dungsverschiebung - also den Ionentransport von Protonen und/ oder von ge¬ ladenen Substraten wie z.B. Di- oder Tripeptiden oder auch von elektrisch un¬ geladenen Substraten - direkt durch Anbindung von Enzympräparationen auf einer geeigneten Oberfläche, die in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein Substratsprung durchgeführt werden kann, als elektri¬ schen Strom oder als elektrische Potentialänderung zu messen und/ oder den Einfluss verschiedener Substanzen auf die elektrischen Messgrößen Strom o- der Potenzial zu untersuchen.
Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren von potentiellen Substraten und/ oder Inhibitoren/Aktivatoren eines Typ-PepTl -Proteins, wel¬ che eine enzymatische Eigenschaft und/ oder das Transportverhalten des Typ- PepTl -Proteins oder eines Teils davon enthält, modifiziert. Das erfindungsge- mäße Verfahren weist folgende Schritte auf:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-PepTl Protein umfassen, insbesondere in einer Mehr¬ zahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflä¬ chenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in den Anlagerungspuffer, wobei der Sekundärträger bevorzugt gegenüber dem Anlagerungspuffer und gegenüber den Primär - trägem mittels des Isolationsbereichs elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes ,
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträ¬ ger oder Teilen davon, und (e) Bestimmen des qualitativen und/ oder quantitativen Einflusses des po¬ tenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detek- tieren einer elektrischen Aktion des oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Bio¬ sensorelektrode als Sekundärträger,
wobei in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine zweite nicht-aktivierende Lösung, bevorzugt enthaltend einen Kompensator, und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine dritte o- der aktivierende Lösung und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei die dritte oder akti¬ vierende Lösung der zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-PepTl -Proteins sowie gegebenen¬ falls den Kompensator enthält.
Dabei kann als nicht-aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/1 GIy- ein verwendet werden.
Ferner kann dabei als aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/1 Gly-Gly verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Schritte (f) und (g) werden - ggf. mit Wiederholungen - bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.
Besonders günstig kann es sein, wenn vor Schritt (f) einmal ein Schritt (f ) durchgeführt wird, wobei statt mit nicht-aktivierender Lösung mit einem Anla¬ gerungspuffer inkubiert wird, wobei der Anlagerungspuffer der nicht- aktivierenden Lösung entspricht, wobei jedoch der Kompensator nicht in der Lösung enthalten ist. Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff nur in der aktivierenden Lösung vorhanden sein, nicht jedoch in der nicht-aktivierenden Lösung.
Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ-PepTl -Protein ak¬ tiviert/inhibiert, kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.
Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein OH¬ gomer eines PepTl -Proteins verwendet.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck „Typ-PepTl -Protein", daß das Protein die typischen Charakteristika des PepTl -Proteins aufweist. Insbesondere wer¬ den darunter Proteine verstanden, die in ihren Transport- und Substraterken- nungseigenschaften sowie ihrer Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren und Aktivatoren dem PepTl-Protein oder der renalen Isoform PepT2 ähneln oder entsprechen. Beide Isoformen sind im vorliegenden Testsystem einfach ein¬ setzbar.
Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwen¬ det wird, welcher auf einem Typ-PepTl -Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus Dünndarm, Niere, Gallengang oder Pankre¬ as, oder hieraus abgeleitet ist.
Insbesondere stammt das Typ-PepTl -Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt Moniert vor.
In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex (enthaltend das Typ-PepTl -Protein) aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzymati- sche Eigenschaft" des Typ-PepTl -Proteins immer das Transportverhalten, z.B. den durch diese Proteine vermittelten Peptid- bzw. Protonentransport, und nimmt damit auch Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeutet, daß wo von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, Un¬ tersuchungen erfindungsgemäß umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein be- stimmter Stoff vom Typ-PepTl -Protein transportiert wird und/ oder ob ein be¬ stimmter Stoff die Transporteigenschaften des Typ-PepTl -Proteins modifiziert, also ein erfindungsgemäßer Modulator des Typ-PepTl-Proteins ist.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck Wirkstoff¬ komplex entweder ein potentielles Substrat, dessen Transport via dem Typ- PepTl -Protein untersucht werden soll, oder einen sogenannten Modulator, der beispielsweise den Transport vorher bestimmter Substrate inhibiert oder akti¬ viert.
Erfindungsgmäß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/ oder (d), gege¬ benenfalls auch (f), (f')und/ oder (g) mittels
Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
Austauschen oder Zumischen der Messlösung oder eines Teils davon und/ oder chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren der Messlösung oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/ oder einer Vor- stufe davon
durchzuführen.
Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in die Messlösung hinein zum Ort des Wirk¬ ortkomplexes transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich je¬ doch ein derartiger Vorgang, wenn einfach die jeweilige Messlösung ausge¬ tauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikali- sches Umsetzen oder Reagieren in der Messlösung freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von Strahlung erfolgen.
Der qualitative Einfluss und/oder der quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-PepTl -Protein vermittelt wird. Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Meßreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-PepTl-Proteins.
Wie in der WO02/ 074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirk¬ ortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbe¬ sondere angelagert.
Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen vielfältige Möglichkeiten.
Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundär- träger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperar¬ tiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, wel¬ cher gegenüber der Messlösung und gegenüber den Primärträgern elektrisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörpe¬ runterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unter- schicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode je¬ weils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen orga¬ nischen Verbindung.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Im Hinblick auf die Primärträger, welche den Wirkortkomplex und insbesonde¬ re die Typ-PepTl -Proteine im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Ver¬ fahrens Rechnung getragen werden kann.
Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestal¬ tungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an, dass als Primärträger je¬ weils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modi¬ fizierter Form, verwendet wird.
Es ist auch möglich, dass als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom o- der eine mizelläre Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht- sphärische Struktur.
Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß von der Messlösung umströmt oder angeströmt wird. Auf diese Art und Weise lässt sich durch Wechsel der Messlösung zum Beispiel ein Konzent¬ rationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung die erfindungsgemäßen Versuchsbedlngungen einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettiervorrichtung kann das erfindungs¬ gemäße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.
Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich ges¬ taltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinander¬ folgendes Austauschen der Messlösung, ggf. mit zwischengeschaltetem Wa- sehen oder Spülen des Messraums.
Wichtig ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren das Verglei¬ chen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht - aktivierender zu aktivierender Lösung in Gegenwart oder Abwesenheit des po¬ tentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.
Potentielle zu testende Modulatoren sind insbesondere bevorzugt monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper und Peptide. Es kön¬ nen jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, daß sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht. Besonders bevorzugte Substanzen, die als mögliche potentielle Substrate und/ oder Modulatoren in dem erfindungsgemäßen Testsystem untersucht werden können, sind niedermolekulare Verbindungen. Solche Verbindungen haben oft keine oder nur geringe Nebenwirkungen, wenn sie als aktives Prin- zip in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Ein wei¬ terer Vorteil solcher Substanzen ist die Möglichkeit der oralen Verabreichung.
Beispiele hierfür sind cyclische Pentapeptide, wie sie von Haubner et. al. , J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 7641-7472, beschrieben wurden. Erfindungsge- maß werden den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosäureanaloga, Steroide, Nukleotide und weitere organisch- chemische Stoffe mit einem Molekulargewicht von ≤ 5000, bevorzugt ≤ 3000 und beson¬ ders bevorzugt < 2000 zugerechnet.
Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Anlagerungspuffer, in den nicht- aktivierenden als auch in der aktivierenden Messlösung zugesetzt oder dort freigesetzt werden.
Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primärträger mit dem Wirkstoffkomplex denkbar.
Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine [Wasch]Lösung, welche bevorzugt mit dem Anlage- rungspuffer identisch ist.
Erfindungsgemäß werden wässrige Messlösungen und insbesondere wässrige Elektrolytlösungen als Messlösung verwendet, die als Anlagerungspuffer, nicht-aktivierende sowie aktivierende Lösung bezeichnet werden.
Alle verwendeten Messlösungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH- Wert stabilisierendes Mittel, bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HE- PES, MES, Tris, PIPES u.a. , wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbüchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Er¬ findungsgemäß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6 - 8, bevorzugt etwa 7 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex) abhängen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.
Der Anlagerungspuffer umfasst mindestens eine Kationenspezies, bevorzugt ausgewählt aus der Liste bestehend aus K+, Ca++, Na+, Li+, Mg++, Cholin+, Rb+, Sr++ in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Ka¬ tion-Konzentration in der nicht-aktivierenden und in der aktivierenden Lö¬ sung. Beispielsweise kann diese Konzentration zwischen 1 μmol/1 und 1 mol/1 liegen, bevorzugt zwischen 10 und 200 mmol/1, besonders bevorzugt zwischen 120- 160 mmol/1.
Die nicht-aktivierende Lösung enthält ebenfalls mindestens eine Kationenspe¬ zies in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Kationen Konzentration im Anlagerungspuffer.
Es handelt es sich bevorzugt um ein Kation der für den Anlagerungspuffer be¬ schriebenen Liste, bevorzugt entspricht es dem Kation oder den Kationen des Anlagerungspuffer s .
Weiterhin kann die nicht-aktivierende Lösung gegebenenfalls einen Kompensa- tor umfassen. Dieser Kompensator dient dazu, dass beim Wechsel von nicht- aktivierender Lösung zu aktivierender Lösung z.B. durch Änderung der Io¬ nenstärke kein Wirkort-unabhängiges, falsch-positives Signal detektiert wird.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Kompensator um eine Aminosäure, und be¬ sonders bevorzugt um die Aminosäure Glycin, wenn bei Inhibitionsmessungen in der aktivierenden Lösung als Substrat das Dipeptid GIy- GIy verwendet wird.
Insbesondere hängt die Art des verwendeten Kompensators von der Art des verwendeten Substrats ab.
Wird als Substrat ein Di- oder Tripeptid verwendet, so wird als Kompensator bevorzugt eine Aminosäure mit einem pK-Wert verwendet, der in etwa gleich dem pj-Wert des Di- oder Tripeptids ist.
Bei den Untersuchungen zum potentiellen Transport von Zielmolekülen wird als Kompensator eine Säure oder eine Base eingesetzt, die einen pK-Wert auf¬ weist, der in etwa dem des untersuchten Zielmoleküls entspricht. Die Konzentration des Kompensators richtet sich im allgemeinen nach der Konzentration des Substrats, und liegt im allgemeinen zwischen 0 bis 100 mmol/1. Im Prinzip wird die Konzentration des Kompensators so lange variiert, bis eine Wirkort-unabhängige elektrische Aktion infolge des Wechsels von nicht-aktivierender zu aktivierender Lösung nicht mehr auftritt.
Die aktivierende Lösung kann den Kompensator unabhängig davon enthalten, ob dieser in der nicht- aktivierenden Lösung enthalten ist.
Die aktivierende Lösung enthält ebenfalls mindestens eine Kationenspezies in einer Konzentration, die bevorzugt in etwa so hoch ist wie die Kationen Kon¬ zentration im Anlagerungspuffer.
Es handelt es sich bevorzugt um ein Kation der für den Anlagerungspuffer be- schriebenen Liste, bevorzugt entspricht es dem Kation oder den Kationen des Anlagerungspuffers. Desweiteren enthält sie ein Substrat des Typ-PepTl- Proteins, bevorzugt ein Di- oder Tripeptid, besonders bevorzugt GIy- GIy für Inhibitions- oder Aktivierungsmessungen.
Weitere mögliche Substrate sind beispielsweise Monosaccharide, Vitamine Nukleoside sowie beta-Lactam-Antibiotika und ähnlich aufgebaute Verbindun¬ gen. Insbesondere handelt es sich um peptidähnliche Verbindungen. Die Kon¬ zentration kann je nach Anwendung zwischen >0 und 1 M schwanken.
Die entsprechenden Konzentrationen können vom Fachmann leicht ermittelt werden.
Unter einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Kompensa¬ tor auch in der aktivierenden Lösung vorhanden sein, wenn so ein besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis, d.h. dass Ausbleiben Wirkort-unabhängiger, falsch-positiver Signale beim Wechsel von nicht-aktivierender Lösung zu akti¬ vierender Lösung erreicht werden kann.
Erfindungsgemäß geeignete Kationen sind alle Kationen, die (a) PepTl nicht inhibieren und (b) keine Messartefakte auslösen. Unter anderem ist von Zn und Cu bekannt, dass sie PepTl inhibieren. Gemäß eines weiteren Aspekts schafft die vorliegende Erfindung einen Wirk¬ stoff oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzymatische Eigenschaft ei¬ nes Typs eines PepTl -Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird oder wurde.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/ oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine - ggf. bestimmte - enzymatische Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes, welcher einen Typ eines PepTl -Proteins enthält, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, und zwar mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens,
- Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/ oder eines Derivats davon,
- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Deri- vats,
- ggf. Mischen und/ oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/ oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersub¬ stanz.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchfüh¬ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoff¬ komplexes. Dieser Testkit weist auf:
- mindestens einen Primärträger mit dem Typ-PepTl -Protein,
- einen Messbereich,
- gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Anlagerungspuffer, die nicht- aktivierende Lösung sowie die aktivierende Lösung und
- weiterhin gegebenenfalls mindestens einen potenziellen Wirkstoffkomplex.
Erfindungsgemäß wird auch ein Screeningverfahren zum Identifizieren ge¬ schaffen, und zwar zum Identifizieren: - eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/ oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/ oder Derivats davon, - des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/ oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/ oder Derivats davon.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfin¬ dungsgemäße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwen¬ det zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines, Wirkort¬ komplexes, welcher ein Typ-PepTl -Protein enthält.
Des Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit erfindungsgemäß verwendet zum Auffinden von Modulatoren, d.h. Inhibitoren oder Aktivatoren, z.B. partiellen oder temporären Inhibitoren eines einen Typ eines PepTl -Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes.
Bevorzugt enthält der Wirkortkomplex das PepTl -Protein.
Des Weiteren wird das Arzneimittel erfindungsgemäß verwendet zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition, Aktivierung oder sonstige Modulation eines Typ-PepTl -Proteins enthaltenden Wirkstoffkomplexes.
Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehen- den und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten wei¬ ter erläutert:
Darüber hinaus ist eine z. B. wässrige Messlösung vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet werden. Der Elektrodenbe- reich wird gegenüber der Messlösung (aktivierende bzw. nicht-aktivierende Lö¬ sung), den Primärträgern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert. Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/ oder dergleichen.
Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des Trägers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstärke von etwa 10 bis 200 nm.
Das Typ-PepTl-Protein kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/ oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakolo¬ gisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Veränderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.
Besonders vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemi- sehen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträ- ger.
Das Nämliche gilt auch für die in dem Primärträger vorgesehenen Wirkort¬ komplexe und das Typ-PepTl -Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ- PepTl -Protein eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen, physikalischen, chemi¬ schen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sol¬ len die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Ori¬ entierung und/ oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den je- weiligen Primärträger in etwa einheitlich sein.
Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-PepTl - Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulieren, sind als potentielle neuropro- tektive Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch wären Substrate des Pro¬ teins, die von diesem transportiert werden, u.U. wichtige neue Moleküle.
Das erfindungsgemäße Vorgehen bietet folgende Vorteile:
Die Messung der Transportaktivität bzw. der Transporteigenschaften gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler o- der markierten Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekun¬ den. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Sub¬ stanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müs¬ sen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potential- antwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich.
BEISPIEL 1 Herstellung des EAACl -Sensorchips
10,αl einer Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 2-3 mg mLml'1) aus einer CHO -Plasmamembranpräparation wurden auf einen vorbehandelten Sen¬ sorchip mit einer runden Goldelektrode (3 mm Durchmesser, erhältlich von IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) inkubiert.
Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 1000 nF cm'2, die Leitfähigkeit G13 bei ca. 10 nS cm'2.
BEISPIEL 2 Aktivitätsmessung ohne Inhibitor
Die Durchflusszelle eines SurfE2R-Systems (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) mit integriertem proteinbeladenem Sensorchip wurde zu- nächst mit Anlagerungspuffer (siehe oben) durchspült. Für die eigentliche Messung wurde mittels elektromechanischem 3 /2- Wegeventil zwischen nicht - aktivierender Lösung (140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH6.0 oder Hepes pH7.0 + 25mmol/l Glycin) und aktivierender Lösung ( 140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH6,0 oder Hepes pH 7,0 + 25 mmol/1 Substrat, z.B. Gly-Gly) umgestellt.
BEISPIEL 3 Aktivitätsmessung mit Glibenclamid
Ergebnis siehe Fig. 1.
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings enthielten beide Lö¬ sungen aktivierende und nicht- aktivierende zusätzlich lOOμM Glibenclamid. Glibenclamid ist ein Inhibitor für PepTl (IC50 in Oozyten ca. lOOμM). Die Inhi¬ bition der Stromamplitude durch Glibenclamid beweist, dass es sich bei dem detektierten Signal tatsächlich um ein spezifisches PepTl -Signal handelt. Eine vollständige Inhibition mit Glibenclamid ist aufgrund der schlechten Löslich¬ keit von Glibenclamid nicht möglich.
Fig. 1 zeigt in Form eines Graphen schematisch den durch das PepTl -Protein hervorgerufenen Transportstrom I(t) als durch die Biosensorelektrode messba¬ re elektrische Aktion.
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechani¬ sche Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Stör¬ anfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zu- verlas sigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzy- matische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines EAAC IPepTl -Proteins enthält, mit den Schritten:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger ( 10), welche den das Typ- PepTl -Protein enthaltenden Wirkortkomplex ( 12), insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran ( 1 1 ) des jeweiligen Primärträgers ( 10) enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger ( 10) am oder im O- berflächenbereich (24c) eines Isolationsbereichs (24) einer als Sekundär¬ träger (20) dienenden Biosensorelektrode in einemeinem MessAnlage- rungspuffermedium (30), wobei der Sekundärträger (20) bevorzugt ge- genüber demm Anlagerungspuffer Messmedium (30) und gegenüber den
Primärträgern ( 10) mittels des Isolationsbereichs (24) mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes (W),
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes (W) mit dem Wirkortkomplex ( 12) der
Primärträger ( 10) oder Teilen davon, und
(e) Bestimmen des qualitativen und/ oder quantitativen Einflusses des po¬ tenziellen Wirkstoffkomplexes (W) oder eines Teils davon auf enzymati- sche Eigenschaften des Wirkortkomplexes ( 12) oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes ( 12) oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion über die
Biosensorelektrode als Sekundärträger (20), wobei in den Verfahrensschritten (c), (d) und/ oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine zweite o- der nicht- aktivierende Lösung gegebenenfalls enthaltend einen Kompen- sator und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine dritte o- der aktivierende Lösung und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e) , wobei die dritte oder akti- vierende Lösung der zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-PepTl -Proteins sowie gegebenen¬ falls einen Kompensator enthält,
wobei als nicht-aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/1 Gly¬ cin verwendet wird und
wobei als aktivierende Lösung eine Lösung mit 140 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6,0 oder Hepes pH 7,0 und 25 mmol/1 Gly-Gly ver¬ wendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörper artiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber der Messlö¬ sung und gegenüber den Primärträgern bevorzugt elektrisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstütz¬ ten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zuge¬ wandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundär träger verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundärträger abde¬ ckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran oder Bilayermembran ausge- bildet wird oder ist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokari- ontische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Be¬ standteile, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter, mikrobio- logisch und/ oder molekularbiologisch geänderter Form, verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizel- läre Struktur verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Typ-PepTl -Protein verwendet wird, welcher auf dem PepTl- Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers, bevorzugt Dünndarm, Niere, Gallengang oder Pankreas, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PepTl -Protein aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PepTl -Protein zumindest zum Teil im Primärträger eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist oder wird.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirkortkom¬ plex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon er¬ zeugtes elektrisches Potenzial, welche jeweils erzeugt werden durch Ladungs¬ oder Stofftransport oder -Verschiebung, Konformationsänderungen, Liganden- bindung, -anlagerung oder -freigäbe, oder einer Kombination davon.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird:
- die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon,
- der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon, - die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder der Messlösung oder eines Teils davon,
- eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder - eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messlösung eine wässriges Messlösung verwendet wird und insbesondere eine wässrige Elektrolytlösung.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durchgeführt werden durch:
- Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon,
- Austauschen der Messlösung oder eines Teils davon und/ oder
- chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren der Messlösung oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträ¬ ger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß von der Messlösung umströmt oder angeströmt wird. '
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinanderfolgendes Austauschen der Messlösung, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums .
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in eine Waschlösung.
17. Verfahren nach einem der der vorstehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (h) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem
(a) der Anlagerungspuffer mindestens - ein geeignetes Kation umfasst, sowie
- einen pH-Wert von 6-8, bevorzugt etwa 7 aufweist,
(b) die nicht-aktivierende Lösung mindestens ein geeignetes Kation und - gegebenenfalls einen Kompensator umfasst, sowie einen pH-Wert von 6-8, bevorzugt etwa 7 aufweist, und
(c) die aktivierende Lösung mindestens - ein geeignetes Kation und gegebenenfalls einen Kompensator und ein Substrat des Typ-PepTl-Proteins, bevorzugt Gly-Gly in einer Konzent¬ ration von etwa >0 bis 100 mmol/1 umfasst, sowie einen pH-Wert von 6-8, bevorzugt etwa 7 aufweist.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die nicht-aktivierende und/ oder die aktivierende Lösung einen Kompensator umfassen.
20. Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex,
- welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes , der ein Typ -PepTl -Protein enthält, oder eines Teils davon modifiziert,
- welcher gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 identi¬ fiziert ist, wird oder wurde.
21. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/ oder eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine bestimmte enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes , welcher ein Typ-PepTl -Protein enthält, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, mit Hilfe eines Verfahrens nach ei¬ nem der Ansprüche 1 bis 19,
- Herstellen und/ oder Isolieren des Wirkstoffs , des Wirkstoffkomplexes , ei¬ nes Teils und/ oder eines Derivats davon, - ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats,
- ggf. Mischen und/ oder Portionieren des Wirkstoffs , des Wirkstoffkomplexes , des Teils oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersub¬ stanz.
22. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit:
- mindestens einem Primärträger , - einem Messbereich ,
- gegebenenfalls einem ersten oder Anlagerungspuffer, einer zweiten oder nicht-aktivierenden Lösung, einer dritten oder aktivierenden Lösung zur Aufnahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes und
- weiterhin gegebenenfalls mindestens einem potenziellen Wirkstoffkomplex .
23. Screeningverfahren zum Identifizieren:
- eines unbekannten Wirkstoffs , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats da¬ von,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon, - der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes , Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon oder
- einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaf¬ ten durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/ oder des Testkits gemäß Anspruch 22, wobei der Wirkstoff , der Wirkstoffkomplex , der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes , welcher einen Typ ei¬ nes PepTl -Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktiva¬ toren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkom- plexes , welcher einen Typ eines PepTl -Proteins enthält, und insbesondere des humanen PepTl -Proteins.
25. Verwenden des Testkits gemäß Anspruch 22, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibi¬ toren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkom- plexes , welcher einen Typ eines PepTl -Proteins enthält, und insbesondere des humanen PepTl -Proteins.
26. Verwenden eines Arzneimittels,
- welches gemäß dem Verfahren nach Anspruch 21 hergestellt wurde,
- zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition oder Modulation einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes , welcher einen Typ ei¬ nes PepTl -Proteins enthält, oder eines Teils davon und insbesondere des humanen PepTl-Proteins.
PCT/EP2005/010601 2004-10-01 2005-09-30 Typ-pept1-protein-assay WO2006037573A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/664,541 US20080248486A1 (en) 2004-10-01 2005-09-30 Type Pept1 Protein Assay
EP05790083A EP1797434A1 (de) 2004-10-01 2005-09-30 Typ-pept1-protein-assay

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004048391A DE102004048391B4 (de) 2004-10-01 2004-10-01 Typ-PepT1-Protein-Assay
DE102004048391.4 2004-10-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006037573A1 true WO2006037573A1 (de) 2006-04-13
WO2006037573B1 WO2006037573B1 (de) 2006-06-08

Family

ID=35610207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2005/010601 WO2006037573A1 (de) 2004-10-01 2005-09-30 Typ-pept1-protein-assay

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080248486A1 (de)
EP (1) EP1797434A1 (de)
DE (1) DE102004048391B4 (de)
WO (1) WO2006037573A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008006536A1 (de) * 2006-07-10 2008-01-17 Iongate Biosciences Gmbh Gat1-assay

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002074983A1 (de) * 2001-03-15 2002-09-26 Iongate Biosciences Gmbh Sensoranordnung, vorrichtung und verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen wirkort- und/oder wirkstofftestung
US20030125538A1 (en) * 1993-10-20 2003-07-03 Amara Susan G. Amino acid transporters and uses

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666610B2 (en) * 2002-03-29 2010-02-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expressing transporters on viral envelopes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030125538A1 (en) * 1993-10-20 2003-07-03 Amara Susan G. Amino acid transporters and uses
WO2002074983A1 (de) * 2001-03-15 2002-09-26 Iongate Biosciences Gmbh Sensoranordnung, vorrichtung und verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen wirkort- und/oder wirkstofftestung

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HABER C ET AL: "A novel electrogenic screening tool for membrane transporter assays", AMERICAN BIOTECHNOLOGY LABORATORY, vol. 23, no. 9, August 2005 (2005-08-01), pages 18,20, XP009059242, ISSN: 0749-3223 *
NUSSBERGER S ET AL: "Nonradioactive monitoring of organic and inorganic solute transport into single Xenopus oocytes by capillary zone electrophoresis.", BIOPHYSICAL JOURNAL. FEB 1996, vol. 70, no. 2, February 1996 (1996-02-01), pages 998 - 1005, XP009061043, ISSN: 0006-3495 *
WATZKE NATALIE ET AL: "Early intermediates in the transport cycle of the neuronal excitatory amino acid carrier EAAC1", JOURNAL OF GENERAL PHYSIOLOGY, vol. 117, no. 6, June 2001 (2001-06-01), pages 547 - 562, XP009059238, ISSN: 0022-1295 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008006536A1 (de) * 2006-07-10 2008-01-17 Iongate Biosciences Gmbh Gat1-assay

Also Published As

Publication number Publication date
EP1797434A1 (de) 2007-06-20
DE102004048391B4 (de) 2007-08-16
WO2006037573B1 (de) 2006-06-08
DE102004048391A1 (de) 2006-04-13
US20080248486A1 (en) 2008-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Donovan et al. Ion-conducting channels produced by botulinum toxin in planar lipid membranes
Schulz et al. SSM-based electrophysiology
Catterall et al. Binding to saxitoxin to electrically excitable neuroblastoma cells.
DE10112505C1 (de) Sensoranordnung und Vorrichtung zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung sowie Verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
EP0799890A2 (de) Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten
DE60118621T2 (de) Verfahren zur bestimmung der nitrosylierung von proteinen
EP2167965B1 (de) Verfahren zur detektion von analyten
Nolli et al. ANTIR () DIES A (, AINST THE ANTIRI () TICS: AN () VERVIEW
WO2006037573A1 (de) Typ-pept1-protein-assay
EP2016416A2 (de) In vitro verfahren zur erkennung und früherkennung und zur begleitenden kontrolle der therapie von arznei- und suchtmittelinduzierten leberschäden
DE69909312T2 (de) Methoden zur identifizierung von &#34;hot-spot&#34; resten bindender proteine und kleine verbindungen die an diese binden
WO2006037570A2 (de) Typ-sglt1-protein-assay
Tadini‐Buoninsegni et al. Recording of Pump and Transporter Activity Using Solid‐Supported Membranes (SSM‐Based Electrophysiology)
DE102005051978A1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Spaltbarkeit von Substraten
DE102004048396B4 (de) Typ-EAAC1-Protein-Assay
DE102006011925B3 (de) Typ-PAT1-Protein-Assay
DE10244129B4 (de) H+-K+-ATPase-Assay
DE102006031913A1 (de) GAT1-Assay
EP1405079B1 (de) Modulierung der wechselwirkung zwischen evh1-domänen
FariN et al. Calcium channel antagonist omega-conotoxin binds to intramembrane particles of isolated nerve terminals
DE102005044418A1 (de) Typ-CNT1-Protein-Assay
DE19719001C2 (de) Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay
DE102007006585B3 (de) Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines synaptosomalen/synaptischen Wirkortkomplexes im Bereich einer synaptosomalen/synaptischen Membran modifiziert
DE102011118031B4 (de) Calicivirus bindende Peptide, dafür kodierende Nukleinsäuren, deren Verwendungen und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Caliciviren
DE102009052404B4 (de) System und Verfahren zum Screenen von Kandidatenverbindungen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

B Later publication of amended claims

Effective date: 20060424

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005790083

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005790083

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11664541

Country of ref document: US