WO2006030846A1 - 成長段階でコムギの二次加工性状を推定する方法 - Google Patents

成長段階でコムギの二次加工性状を推定する方法 Download PDF

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WO2006030846A1
WO2006030846A1 PCT/JP2005/017009 JP2005017009W WO2006030846A1 WO 2006030846 A1 WO2006030846 A1 WO 2006030846A1 JP 2005017009 W JP2005017009 W JP 2005017009W WO 2006030846 A1 WO2006030846 A1 WO 2006030846A1
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wheat
seq
expression
protein
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PCT/JP2005/017009
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English (en)
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Katsuyuki Hayakawa
Yosuke Kikuchi
Hirofumi Motoi
Kouji Uchida
Masahiro Kinugasa
Original Assignee
Nisshin Seifun Group Inc.
Oriental Yeast Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting genetic markers in wheat in a growing stage and presuming secondary processing properties of wheat at an early stage.
  • Non-patent Document 1 High molecular weight glutenin from wheat has long been studied as a protein that determines bread-making suitability.
  • this was compared with the subunits (1DX2 + 1DV12) associated with poor bread-making ability and the amino acid sequence, it was shown to be associated with the structure and physical characteristics of dulten (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 discloses a method for introducing a high molecular weight glutenin subunit by transformation for the purpose of improving bread-making suitability.
  • Proindoline is a starch-binding protein “Grain Softness Pr” that is characteristic of soft flour. It was identified as oteinj (Non-Patent Documents 5 and 6). This protein was originally named fly avirin. The protein has two major components, which have been shown to be homologous to lipid binding proteins known as prinindrin a and b. If this protein is contained, this protein is added to the strong wheat flour, and the amount of added koji and the hardness of the bread have an inverse correlation. This ability Proindoline has been shown to be a factor that affects bread quality (Non-patent Document 7).
  • ⁇ xyprotein has also been studied as a starch-binding protein.
  • cereal starch There are two types of cereal starch: linear amylose and branched amylopectin.
  • “glutinous” was not known in nature, but recently, the Tohoku Agricultural Research Center succeeded in developing the world's first waxy wheat. Wx protein is present in glutinous wheat, whereas Wx protein is not present in waxy wheat.
  • Common wheat (Triticum aestivum L.) is a hexaploid having three types of Wx genes, and has Wx—Al, Wx—B1, and Wx—D1 on chromatic body arms 7AS, 4AL, and 7DS.
  • Patent Document 2 describes a method for confirming the presence or absence of the expression of 3x Wx genes (Wx-Al, Wx-Bl, Wx-Dl) in wheat using two-dimensional electrophoresis. .
  • the patent publication also describes a method for producing sticky wheat using a wheat mutant lacking expression of two Wx genes for crossing.
  • Patent Document 3 discloses breads produced using flour containing 0.5 to 30% by weight of wheat flour produced from glutinous wheat, which is thawed and eaten after refrigerated storage or frozen storage. It also describes breads that do not deteriorate the texture.
  • the gene that codes for the xyxy protein is known as the oxyxylococcal gene.
  • Patent Document 4 describes a method for detecting these three types of mutant oxylocus genes.
  • Non-Patent Literature l Payne, P.I., Holt, L.M., Law, C.N. (1981) Theor Appl Genet 60: 229-236
  • Non-Patent Document 2 Payne, P.I., Corfield, K.G., Holt, L.M., Blackman, J.A. (1981) J Sci Food Agric 32: 51-60
  • Non-Patent Document 3 Flavell, R.B "Goldsbrough, A.P., Robert, L.S., Schnick, D., Thomps on, R.D. (1989)
  • Non-Patent Document 4 Barro, F “Rooke, B” Bekes, F., Gras, P., Tatham, AS, Fido, R “La zzeri, PS, Shewry, PR and Barcelo, P. (1997) Nature Biotec 15 : 1295—1299
  • Non-patent literature 5 Greenwell, P. and Schofield, J. (1986) Cereal Chem. 63: 379-380
  • Non-patent literature 6 Jolly, CJ, Rahman, S “Kortt, AA and Higgins, TJV ( 1993) Theor Appl Genet 86: 589-597
  • Non-Patent Document 7 Dubreil, L "Meliande, S., Chiron, H” Compoint, J.P., Quillien, L. Brarnard, G. and Marion, D. (1998) Cereal Chem. 75: 222-229
  • Patent Document 1 JP 2000-516097 Publication
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3170595
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 9 191819
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-284598
  • An object of the present invention is to provide a means for estimating the secondary cache properties of wheat flour from which harvested wheat deer can also be obtained at an early stage before the wheat seeds mature.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the kit comprising at least one probe that is specifically hybridized to a gene identified by any one of the nucleotide sequences of ⁇ 121 and that also has a continuous probe power of 10 to 40 bases long.
  • a continuous primer primer having a length of 10 to 40 bases for specifically amplifying the gene specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 8, 34, 48 and 45 is also selected. 10 to 40 bases in length, which hybridizes specifically to at least one primer and a gene identified by Z or any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 8, 34, 48 and 45.
  • Lobe force The kit according to (4), comprising at least one selected probe.
  • a continuous probe of at least 10 bases that specifically hybridizes to at least one gene selected from the genes specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 8, 34, 48, and 45 An array for estimating secondary calorie properties in mature wheat seeds using immature wheat. [0019] According to the present invention, it is possible to estimate the secondary processing properties of future mature wheat seeds at an early stage before the wheat seeds mature. This can reduce the risk of purchasing low-quality wheat.
  • the present inventors have found a gene whose expression level changes when exposed to high temperature or low temperature during the ripening period, and the expression level of the gene in immature wheat as a marker. It was found that the secondary processing characteristics of matured seeds in the future can be estimated by measuring
  • wheat means a plant belonging to the genus Gramineae, such as bread wheat, tarho wheat, macaroni wheat, etc. It is not limited.
  • the present invention is preferably used for bread wheat, particularly Triticum aestivum.
  • the gene used as a marker in the method of the present invention is a gene specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121, and the expression level of at least one gene selected from these is measured.
  • the gene power specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 8, 34, 48 and 45 is used to measure the expression level of at least one selected gene, preferably five genes. To do.
  • the gene specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 is a gene consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121, and is functionally equivalent to the gene. Genes are included.
  • “functionally equivalent” means that the polypeptide encoded by the gene of interest is biologically equivalent to the polypeptide encoded by the gene consisting of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121. It has a function and biochemical function.
  • Functionally equivalent genes usually have high homology at the amino acid sequence level.
  • High homology generally refers to at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity at the amino acid level.
  • the identity of amino acid sequences and base sequences can be determined by the algorithm BLAST by Karlin and Alt schul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Specific methods of these analysis methods are known.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA and cDNA.
  • ESTs are included as well as full-length genes.
  • the gene specified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 includes a gene comprising a nucleotide sequence including all or part of any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121. Is done.
  • the base length of a gene consisting of a base sequence containing all or part of any base sequence of SEQ ID NOS: 1-121 is not particularly limited as long as it encodes a functionally equivalent gene.
  • a part of the base sequence is a base sequence of a part of each base sequence, and has a length sufficient for hybridization under stringent conditions.
  • at least 50 bases Preferably, the sequence is at least 100 bases, more preferably at least 200 bases.
  • it is a sequence of at least 50 bases, preferably at least 100 bases, more preferably at least 200 bases continuous in each base sequence.
  • “continuous” means that a continuous base sequence is included in the reference base sequence.
  • stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed, that is, high homology (homology to each gene). 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher). More specifically, such conditions are 0.5 to: 42-68 ° C in the presence of LM NaCl, or 42 ° C in the presence of 50% formamide, or 65-68 ° C in aqueous solution. After hybridization, the filter can be washed at room temperature to 68 ° C. with an SSC solution having a concentration of 0.1 to 2 times.
  • the measurement of the expression level of the gene should be carried out by a method usually used in this technical field.
  • a method for detecting RNA encoding at least one gene selected from genes identified by any one of SEQ ID NOS: 1-121 in a sample derived from immature wheat can be mentioned. It is done.
  • the detection of RNA includes detection of cDNA and cRNA that have undergone RNA force conversion in addition to detection of mRNA.
  • a gene identified by any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 10 to 40 bases that specifically hybridize a 10 to 40 base long continuous primer and a gene specified by Z or any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121.
  • a method using at least one probe in which a long continuous probe force is also selected.
  • the primer for specifically amplifying the gene identified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 amplifies a part of any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 It may be a thing.
  • the nucleotide sequence of positions 27 to 176 of SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of positions 150 to 250 of SEQ ID NO: 8, the nucleotide sequence of positions 12 to 80 of SEQ ID NO: 34, the nucleotide sequence of positions 40 to 149 of SEQ ID NO: 48 Amplify the nucleotide sequence from positions 69 to 216 of SEQ ID NO: 45.
  • the design of a primer for specifically amplifying a specific gene and a probe specifically hybridizing to the specific gene can be performed by a method commonly used in this technical field.
  • the length of the primer is usually 10 bases or more, preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases.
  • the length of the probe is usually 10 or more bases, preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases.
  • Tm melting temperature
  • a known primer or probe design software can be used, and examples of software that can be used in the present invention include Amplify. Tm can also be checked by itself without using software. In that case, the calculation formula based on the nearest base pair method (Nearest Neighbor Method), Wallance method, GC% method, etc. can be used. In the present invention, it is preferable to use a primer having an average Tm of about 50 to 70 ° C and a probe having a temperature of 55 to 75 ° C. Other conditions that allow specific annealing or hybridization as a primer or probe include GC content, and such conditions are well known to those skilled in the art.
  • the primer may be homologous or complementary to the sequence used as a template at the time of design.
  • the forward primer is the same sequence as the template sequence
  • the reverse primer is the template sequence. It is necessary to design the primer while paying attention to the complementary sequence. The design of such primers is well known to those skilled in the art.
  • primers include the following primer sets:
  • the primer set As a primer set that specifically amplifies the gene specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34, the primer set consists of a forward primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 136 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 137. A set with a reverse primer is mentioned,
  • the primer set As a primer set that specifically amplifies the gene specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48, the primer set consists of a forward primer having the nucleotide sequence ability represented by SEQ ID NO: 139 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 140 A set with a reverse primer is mentioned,
  • a primer set that specifically amplifies the gene identified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45
  • a set of a forward primer having a base sequence ability represented by SEQ ID NO: 142 and a reverse primer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 143 is exemplified.
  • a probe that specifically hybridizes to a gene identified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 is specifically hybridized to a part of any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121. You may do. For example, the nucleotide sequence from positions 113 to 128 of SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence from positions 213 to 228 of SEQ ID NO: 8, the nucleotide sequence from positions 33 to 47 of SEQ ID NO: 34, the nucleotide sequence from positions 91 to 106 of SEQ ID NO: 48 It may be one that hybridizes to the nucleotide sequence of positions 178 to 194 of SEQ ID NO: 45! /.
  • the primer or probe as described above includes sequences other than the portion to be annealed or hybridized, for example, an additional sequence such as a tag sequence. Those added with such additional sequences are also included in the scope of the present invention.
  • each of the samples in the sample derived from immature wheat is used.
  • a method for measuring the expression level of a gene based on the amount of RNA encoding the gene is described below.
  • RNA is extracted from a sample derived from immature wheat.
  • the immature wheat is not particularly limited as long as it is a wheat from pollination to flowering and harvesting, but it is usually 1 to 40 days, preferably 5 to 35 days after flowering. It is.
  • seeds are used as a sample derived from immature wheat.
  • Examples of methods for extracting RNA include guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation, guanidine thiocyanate 'hot phenol method, guanidine hydrochloric acid method, guanidine thiocyanate' phenol. 'Cloczholski method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., (19 87) Anal. Biochem., 162, 156-159) can be used.
  • the extracted RNA is preferably further purified and used as mRNA.
  • the purification method is not particularly limited, many of the mRNAs present in the cytoplasm of eukaryotic cells have a poly (A) sequence at the 3 'end, so this feature can be used, for example, as follows. can do. First, a poly (A ) Adsorb + RNA. Next, the paramagnetic particle carrier on which streptavidin is immobilized is prepared, and poly (A) + RNA is captured by utilizing the bond between piotin Z streptavidin. After the washing operation, the poly (A) + RNA is finally eluted from the oligo (dT) probe.
  • RNA thus obtained, cDNA and cRNA obtained from the RNA cartridge, and amplification products thereof are hereinafter referred to as test nucleic acids, and the method for measuring the gene expression level in the present invention is described below. It also includes the case of measuring nucleic acid! / Deviation.
  • the method for measuring the gene expression level is not particularly limited, and can be carried out by a method commonly used in the art. Examples thereof include hybridization methods such as Northern hybridization and reverse transcription PCR method. In the present invention, it is preferable to use reverse transcription PCR method. Furthermore, in the present invention, preferably, the expression level of each gene is quantitatively measured by combining quantitative PCR methods such as real-time PCR method and competitive PCR method.
  • the present invention can measure immature wheat by measuring the ratio of the expression level of a specific gene to the expression level of a gene (housekeeping gene) whose expression level does not change depending on the tissue or growth stage. Measure the increase or decrease in the expression level of a specific gene in.
  • genes whose expression level does not change depending on the tissue or growth stage include ubiquitin gene, actin gene, tubulin gene, and ribosomal RNA gene.
  • the ubiquitin gene is used as a standard gene. Is preferred.
  • cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using the RNA obtained from the sample as a template, and then using a pair of primers using the prepared cDNA as a template. PCR method is performed.
  • the same primer is used to compare the amount of amplification product obtained from a competitive template, which is an internal standard for quantification, and the amount of amplification product obtained from the test nucleic acid strength.
  • the detection target contained in the test nucleic acid can be quantified.
  • the 5 'end is a fluorescent dye (reporter) and the 3' end is quenched.
  • a probe labeled with a dye (taentia) that hybridizes to a specific region of the target gene is used.
  • the fluorescence of the reporter is suppressed by the quencher.
  • PCR is performed using TaqDNA polymerase for its external force.
  • the exonuclease activity causes the fluorescent probe to hydrolyze from the 5 'end, releasing the reporter dye and emitting fluorescence.
  • Real-time PCR quantifies the initial amount of template DNA by monitoring this fluorescence intensity in real time.
  • the real-time PCR method for example, SYBR TM Green method or TaqMan TM method can be used.
  • As a reaction cycle of the real-time PCR method for example, 40 cycles of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes (95 ° C. for 15 seconds, 60 ° C.) can be used.
  • the obtained results can be standardized using, for example, 18s ribosomal RNA.
  • a known means capable of specifically recognizing an amplification product obtained by the amplification reaction can be used.
  • it can be carried out by allowing a label such as a radioisotope, fluorescent substance, or luminescent substance to act on dNTP incorporated during the amplification reaction and detecting this label.
  • radioisotope 32 P, 125 i, 35 s and the like can be used.
  • fluorescent material for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used.
  • luminescent substance luciferin or the like can be used.
  • the type of the labeled body there are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used.
  • a method for introducing a label a random prime method using a radioactive isotope can be mentioned.
  • any method known in the art for detecting the above-mentioned labeled body may be used.
  • the radioactivity can be measured using, for example, a liquid scintillation counter or a ⁇ counter.
  • fluorescence when fluorescence is used as the label, use a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, etc. Can be detected.
  • the expression level of each gene can also be measured by carrying out a hybridization reaction using the above probe and detecting its specific binding.
  • the hybridization reaction must be performed under conditions that allow the probe to specifically bind only to a base sequence derived from a specific gene, that is, under stringent conditions. Such stringent conditions are well known in the art and are not particularly limited.
  • appropriate labels such as fluorescent labels (such as FAM), radioactive labels, enzyme labels, and piotin labels can be added to the probes.
  • the measurement of the gene expression level can also be carried out by bringing a labeled probe into contact with a test nucleic acid obtained from immature wheat so that it can be hybridized.
  • “To be able to hybridize” means in an environment (temperature, salt concentration) where specific binding occurs under the stringent conditions described above.
  • the sample or test nucleic acid is supported on an appropriate carrier such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and the probe and the test nucleic acid are brought into contact with each other by adding a labeled probe. Then, a hybridization reaction is performed! After removing the probe that has not been hybridized, the label of the probe that is hybridized with the test nucleic acid is detected. Quantitative detection is possible by using the label concentration as an index. Examples of detection methods using a labeled probe include Southern hybridization method, Northern hybridization method, FISH (fluorescence in situ hybridization) method and the like.
  • examples of a method for detecting at least one of the test nucleic acids include an array method such as a microarray and a macroarray.
  • detection can be performed by the following method. That is, a probe that specifically hybridizes to a test nucleic acid is supported on an appropriate carrier such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and the hybridization reaction with the probe is performed after labeling the test nucleic acid. Then, after removing the hybridized test nucleic acid, the label of the test nucleic acid hybridized with the probe is detected. By using the label concentration as an index, quantitative detection is also possible.
  • Double-stranded nucleic acid can be detected using, for example, a fluorescent dye that specifically binds to the double-stranded portion of the nucleic acid. Examples of such a dye include a fluorescent intercalator described in JP-A-2002-181816.
  • the test nucleic acid may be either DNA or RNA. However, if high-sensitivity detection is required, RNA may be combined with the test nucleic acid. Is preferable.
  • the array of the present invention is prepared according to a known technique, for example, a method described in Masaaki Muramatsu, Hiroyuki Nami (supervised), "DNA microarray and the latest PCR method", Shujunsha (published in March 2003). Can be prepared, and an array method using this can also be carried out with reference to the literature.
  • secondary processing of a mature wheat seed is performed by measuring the expression level of at least one gene identified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 in immature wheat. Estimate the properties.
  • amylopectin side chain length of starch affects the suitability of udon (Shibanuma, K., Take da, Y "Hizukuri, S” and Shibata, S. (1994 ) Carbphydr. Polym. 25: 111—116). It has also been reported that amylose content increases when exposed to high temperatures during ripening (Tester, RF, Debon, SJJ, Davies, HV, and Gidley, MJ (1995) J. Sci. Food Agric). Ma Stone and Nicholas also stated that the ratio of glutenin to gliadin did not change even under high temperature stress, and that it decreased dramatically (Stone, PE, and Nicholas, ME (1994) Aust. J Plant Physiol.
  • the present inventors measured the expression level of the gene identified by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1-121 in immature wheat by the above method, and determined the expression level of each of the obtained genes. Calculated as a ratio to the expression level of a housekeeping gene such as a ubiquitin gene and comparing the results obtained with those exposed to high temperatures during the ripening period or in wheat exposed to low temperatures. We found out that it is possible to guess the secondary processing properties of ripe seeds obtained in the future.
  • the expression level of the gene specified by any one of SEQ ID NOS: 1-121 in immature wheat is calculated as a ratio to the expression level of the housekeeping gene. Subsequently, the obtained expression level ratio is compared with the expression level ratio of each gene when exposed to high temperature or low temperature during the ripening period.
  • the immature wheat deer is also a The secondary processing properties are similar to the secondary processing properties of fully-ripened seeds that can also be obtained from wheat cultivars exposed to high temperatures during the ripening period, i.e., reduced udon suitability, reduced dough characteristics, and dough strength S it can.
  • the immature wheat moss can be estimated to be similar to the secondary calorie properties of the fully matured seeds obtained from wheat cultivars exposed to low temperatures during the ripening period, that is, the bread making ability and the udon suitability are reduced.
  • the ratio of the gene expression level specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to the ubiquitin gene expression level is 0.06 to 0.24 times, the base of SEQ ID NO: 8
  • the ratio of the gene expression level specified by the sequence is 0.8 to 3.2 times
  • the ratio of the gene expression level specified by the sequence number 34 is 0.45: L 8 times and the base number of SEQ ID NO: 48
  • the ratio of the gene expression level specified by the sequence is 0.24 times or more and the ratio of the gene expression level specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45 is 0.0015 to 0.006 times, then a mature seed obtained in the future It can be inferred that the properties of the seeds are those of the fully matured seeds obtained from wheat cultivars exposed to high temperatures during the ripening period.
  • it has a characteristic that it has a large amount of glutenin polymer with a high ratio of glutenin, a high protein content, a low glutenin Z gliadin ratio, a high amylose content, a high side chain length of a high amylose content, and a long side chain length. Can be estimated.
  • the ratio of the gene expression level specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to the expression level of ubiquitin gene is 0.24 times or more, and the gene specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8
  • the ratio of expression levels is 3.2 times or more
  • the ratio of gene expression levels specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 is 0.45 times or less
  • the ratio of gene expression levels specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48 is 0.06 times or less
  • ratio of gene expression level specified by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45 If it is 0.0015 times or less, it can be determined that the properties of mature seeds obtained in the future have the secondary processing properties of mature seeds that can also be obtained in wheat at low temperatures during the ripening period.
  • amylose and amylopectin have low molecular weight because amylose and amylopectin, which have low amylose content, short side chain length, low starch gelatinization temperature, low protein content, and low starch content. Can be estimated.
  • the present invention also relates to a kit for estimating secondary cache properties in mature wheat seeds using immature wheat.
  • the kit comprises at least one primer selected from a primer having a length of 10 to 40 bases for specifically amplifying a gene identified by any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 1-121, and Z or the above At least one probe selected from probes having a length of 10 to 40 bases that specifically hybridize to a gene specified by any one of the base sequences of SEQ ID NOS: 1-121.
  • the kit of the present invention includes a primer, it further includes a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (such as reverse transcriptase and RNaseH), and a standard sample for calibration. Also good.
  • a probe it may further include a cell, an hybridization buffer, a washing buffer, a microplate, a nylon membrane, and the like.
  • a primer for specifically amplifying a housekeeping gene such as a ubiquitin gene and / or a probe that specifically hybridizes to the housekeeping gene may be included.
  • Hi-CEP High Coverage Expression Profiling
  • Double-stranded cDNA using Superscript TM Double-strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) with oligo dT (5, 1 biotin 1 ⁇ —3,) with biotin at the end as a primer was synthesized.
  • Mspl After digesting this double-stranded cDNA with the restriction enzyme Mspl, add the Mspl adapter (5'-AATGGCTAC ACG AAC TCGGTTCATGACA-3, and 5, CGTGTCATGAACCGAGTTCGTGTA GCCATT-3), and add avidin magnetic particles (Dynabeads M— 280 Streptavid in; Dynal) was used to collect only the poly A side fragments.
  • Primers were designed to bind to the adapter and PCR was performed. At that time, the end of the primer was designed to protrude 2 bases to the cDNA fragment side, and all 16 patterns were performed. In addition, fluorescent labeling using FAM was performed on the Mspl primer. Primers used Mspl primer (5, -F AM -ACTCGGTTC ATG A CACGGNN-3,) and Msel-primer (5,1 AGGCGTCCTACTGCGTAANN-3) as fluorescent primers, PCR cycle is 95 ° C-1 min: 1 Cycle (95 ° C—20 seconds, 71.5 ° C—30 seconds, 72 ° C—1 minute): 28 cycles, 60 ° C—30 minutes: 1 cycle.
  • Table 2 shows data obtained as a result of the expression analysis.
  • the sequence numbers in the table correspond to the sequence numbers in the sequence table.
  • the column labeled “Characteristics and Magnification” the behavior (increase or decrease in the amount of expression compared to the control) and the change The magnification is shown.
  • SEQ ID NO: 1 A gene encoding amylase (SEQ ID NO: 1), gene encoding catalase (SEQ ID NO: 8), gene encoding a-, ⁇ -gliadin (SEQ ID NO: 34), gene encoding heat shock protein 70 kDa (SEQ ID NO: 34) SEQ ID NO: 48), a gene encoding ⁇ -gliadin (SEQ ID NO: 45).
  • the expression levels of these target genes in wheat (T. aestivum L.) seeds on the 15th day after flowering were quantified.
  • Primer Express Ver. 2 gene analysis software primer
  • the precipitate was dried with a desiccator and dissolved in 100 ⁇ 1 DEPC-treated water.
  • the extracted RNA was electrophoresed using a denaturing gel, and the soundness was evaluated by the presence of ribosomal RNA.
  • the concentration was measured with a spectrophotometer in preparation for reverse transcription real-time PCR.
  • cDNA was synthesized by using Superscript TM Double-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Invitrogen, using total RNA as a template. The synthesis was according to the attached manual, but oligo-dT primer was used as a primer.
  • the ubiquitin gene was used as an internal standard gene whose expression level did not vary depending on the yarn and weaving or growth stage. Quantitative PCR was performed with internal standards at several concentration ranges, and a calibration curve was obtained to determine an appropriate concentration range. The most appropriate concentration solution was used as a template for the target quantitative PCR method. Quantitative PCR is performed in 96-well plates, and each sample is I used 4 wells. Table 4 shows the composition of the reaction solution in each well.
  • Quantitative PCR was performed using a PRISM 7700 Sequense detector. The cycle was 50 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 10 minutes, (95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute) x40 cycles. The obtained results were standardized using 18s ribosomal RNA.
  • Starch and protein characteristics of the ripe wheat seeds finally harvested were analyzed.
  • the analysis items are amylose content, amylopectin side chain length, protein content, and the ratio of glutenin to gliadin. Each measurement method is shown below.
  • the isoamylase-treated starch sample was dissolved in 0.4M NaOH, and impurities were removed with a filter.
  • the sample was subjected to an anion exchange chromatograph (HPAE-PAD) equipped with a pulse current titrator.
  • HPAE-PAD anion exchange chromatograph
  • glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, etc. were similarly subjected to HPAE-PAD, and the amylopectin chain lengths of each sample were compared.

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Abstract

　収穫したコムギから得られるコムギ粉の二次加工性状を、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で推定する手段を提供する。本発明は、未成熟コムギにおいて、配列番号１～１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定することを含む、コムギの完熟種子における二次加工性状を推定する方法に関する。

Description

明 細 書
成長段階でコムギの二次加工性状を推定する方法
技術分野
[0001] 本発明は、成長段階にあるコムギにおいて遺伝子マーカーを検出し、早期にコムギ の二次加工性状を推定する方法に関する。
背景技術
[0002] コムギ、特に日本国内で生産されるコムギは、生産年度による品質のぶれが問題と なる。この原因は、特に日本国内では、比較的栽培面積が小さいところに多品種を 生産していること、年度ごとの気象条件が種子の品質に影響していることなどが挙げ られる。ところが、種子が完熟するまで二次加工性状を推定することが困難であること から、低品質のコムギを購買してしまうというリスクがあり、種子が成熟する以前の早期 段階で将来の完熟種子の二次加工性状を推定する技術の開発が望まれていた。
[0003] このような状況下、コムギの二次加工性状を支配する遺伝子力 いくつか報告され ている。その中でも、高分子量グルテニンサブユニット、プロインドリン及びヮキシータ ンパク質にっ 、て研究が行われて 、る。
[0004] コムギの高分子量グルテニンは、製パン適性を決定付けるタンパク質として古くから 研究がなされている。 Payneらは、高分子量グルテニンをコードする遺伝子が第一染 色体の長腕に存在することを明らかにした (非特許文献 1)。これらは異なる分子量の サブユニットをコードしており、 D1染色体には、優れた製パン適性と関連の深いサブ ユニットペア（ 1DX5 + lDylO)が存在する（非特許文献 2)。これを、劣った製パン適 性と関連するサブユニット (1DX2+ 1DV12)と、アミノ酸配列について比較したところ 、ダルテンの構造や物理的特徴と関連することが示された (非特許文献 3)。実際に、 を元来持って ヽな ヽコムギにこれを遺伝子導入した場合、導入された遺伝子 のコピー数に応じて製パン適性が向上したという報告がある（非特許文献 4)。さらに 、フロリダ大学は、製パン適性を改良する目的で、高分子量グルテニンサブユニット を形質転換によって導入する方法を開示して ヽる (特許文献 1)。
[0005] プロインドリンは、薄力粉に特徴的な澱粉結合性タンパク質「Grain Softness Pr oteinjとして同定された (非特許文献 5及び 6)。このタンパク質は当初フライアビリン と名づけられた。該タンパク質は、 2つの主要なコンポーネントを有し、これらはプロイ ンドリン a及び bとして知られる脂質結合性タンパク質と相同であることが明らかになつ た。このタンパク質が含まれて 、な 、強力小麦粉にこのタンパク質をカロえて 、くとその 添カ卩量とパンの硬さが逆相関を示した。このこと力 プロインドリンは、パンの品質に 影響を与える因子であることが示された (非特許文献 7)。
[0006] ヮキシ一タンパク質も澱粉結合性タンパク質として研究されてきた。穀物の澱粉に は、直鎖状のアミロースと分岐構造を持つアミロぺクチンの 2種類がある。イネ及び大 麦などの多くの穀物には、アミロースとアミロぺクチンの両方の分子を含む「ウルチ性 品種」と、アミロースを含まない「モチ性品種」のものがある。コムギについては、「モチ 性」のものが天然には知られていなかつたが、最近、東北農業研究センターが世界 で初のモチ性コムギを開発することに成功した。ウルチ性コムギには Wxタンパク質が 存在しているのに対して、モチ性コムギでは Wxタンパク質の存在が見られない。普 诵系コムギ（Triticum aestivum L. )は 3種の Wx遺伝子を有する 6倍体であり、 Wx— Al、 Wx— Bl、 Wx— D1を ¾色体腕 7AS、 4AL、及び 7DS上にもつ。特許 文献 2には、コムギにおける 3糠の Wx遣伝子（Wx— Al、 Wx— Bl、 Wx— Dl)の発 現の有無を二次元電気泳動法を用いて確認する方法が記載されている。また、同特 許公報には、 Wx遺伝子 2種の発現を欠 、たコムギ変異体を交配に用いてモチ性コ ムギを作出する方法が記載されている。さらに特許文献 3には、モチ性コムギカ 製 造した小麦粉を 0. 5〜30重量％含有する穀粉を用いて製造したパン類であって、冷 蔵保存後又は冷凍保存後解凍して喫食しても食感が劣化しないパン類が記載され て 、る。ヮキシ一タンパク質をコードして 、る遺伝子はヮキシ一座遺伝子として知られ て 、る。この 3種類の変異型のヮキシ一座遺伝子を検出する方法が特許文献 4に記 載されている。
[0007] このように、コムギにおけるタンパク質の性状及び澱粉の性状を支配する遺伝子が いくつか知られており、従来の育種法や遺伝子組み換えにより作出されたコムギの粉 を用い、製パン試験を含む二次加工試験や生地物性を調査することにより、その機 能が実証されている。 [0008] しかし、上記の知見は特定の遺伝子とコムギの二次カ卩ェ性状との関係を示したに 過ぎず、また、コムギの二次カ卩ェ性状には、上記以外にも多くの因子が関係するもの と考えられる。従って、成長段階の未成熟コムギの段階で、将来結実した種子のもつ 二次加工性状を推定することは困難であった。
非特許文献 l : Payne, P.I., Holt, L.M., Law, C.N. (1981) Theor Appl Genet 60:229- 236
非特許文献 2 : Payne, P.I., Corfield, K. G.， Holt, L. M., Blackman, J. A. (1981) J Sci Food Agric 32:51-60
非特許文献 3 : Flavell, R. B" Goldsbrough, A.P., Robert, L.S., Schnick, D.， Thomps on, R.D. (1989)
非特許文献 4 : Barro, F" Rooke, B" Bekes, F.， Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R" La zzeri, P.S., Shewry, P.R. and Barcelo, P. (1997) Nature Biotec 15:1295—1299 非特許文献 5 : Greenwell, P. and Schofield, J. (1986) Cereal Chem. 63:379-380 非特許文献 6 : Jolly, C.J., Rahman, S" Kortt, A.A. and Higgins, T.J.V. (1993) Theor Appl Genet 86:589-597
非特許文献 7 : Dubreil, L" Meliande, S.， Chiron, H" Compoint, J.P., Quillien, L. Br anlard, G. and Marion, D. (1998) Cereal Chem. 75:222-229
特許文献 1：特表 2000— 516097号公報
特許文献 2 :特許第 3170595号公報
特許文献 3：特開平 9 191819号公報
特許文献 4：特開 2003 - 284598号公報
発明の開示
[0009] 本発明の課題は、収穫したコムギカも得られるコムギ粉の二次カ卩ェ性状を、コムギ 種子が成熟する以前の早期段階で推定する手段を提供することである。
[0010] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、成熟前の早期段階 にお!/、て発現量が変化し、その発現量の変化が将来の完熟種子の二次加工性状と 関連する遺伝子マーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
[0011] すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。 [0012] (1)未成熟コムギにおいて、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される 遺伝子から選ばれる少なくとも 1種の遺伝子の発現量を測定することを含む、コムギ の完熟種子における二次加工性状を推定する方法。
[0013] (2)少なくとも、配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配列で特定される 遺伝子から選ばれる少なくとも 1種の遺伝子の発現量を測定することを含む、（1)記 載の方法。
[0014] (3)逆転写定量 PCR法により遺伝子の発現量を測定する、（1)又は（2)記載の方法
[0015] (4)未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するため のキットであって、
配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅す るための、 10〜40塩基長の連続したプライマーから選ばれる少なくとも 1のプライマ 一、及び Z又は配列番号 1〜 121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特 異的にハイブリダィズする、 10〜40塩基長の連続したプローブ力も選ばれる少なくと も 1のプローブを含む、該キット。
[0016] (5)配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特 異的に増幅するための、 10〜40塩基長の連続したプライマーカも選ばれる少なくと も 1のプライマー、及び Z又は配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配 列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダィズする、 10〜40塩基長の連続したプ ローブ力 選ばれる少なくとも 1のプローブを含む、（4)記載のキット。
[0017] (6)配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる遺伝 子の少なくとも 1種に特異的にハイブリダィズする、少なくとも 10塩基の連続したプロ ーブを含む、未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定 するためのアレイ。
[0018] (7)配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から 選ばれる遺伝子の少なくとも 1種に特異的にハイブリダィズする、少なくとも 10塩基の 連続したプローブを含む、未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次カロ ェ性状を推定するためのアレイ。 [0019] 本発明により、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で、将来のコムギ完熟種子 の二次加工性状を推定することが可能になる。それにより、低品質のコムギを購買す るリスクを低減することができる。
[0020] 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 2004— 271391号 の明細書、請求の範囲および Zまたは図面に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明者らは、登熟期に高温又は低温にさらされたときに、その発現量が変化する 遺伝子を見 、だし、未成熟コムギにお 、て該遺伝子をマーカーとしてその発現量を 測定することにより、将来の完熟種子の二次加工性状を推定できることを見いだした
[0022] 本発明において、コムギとは、イネ科コムギ属に属する植物を意味し、例えば、パン コムギ、タルホコムギ、マカロニコムギ等を挙げることができる力 コムギに分類される ものであれば、これらに限定されるものではない。本発明は、パンコムギ、特に Tritic um aestivumにお ヽ飞好適に用 Vヽられる。
[0023] 本発明の方法においてマーカーとして用いられる遺伝子は、配列番号 1〜121の いずれかの塩基配列で特定される遺伝子であり、これらから選ばれる少なくとも 1種 の遺伝子の発現量を測定する。本発明においては、好ましくは配列番号 1、 8、 34、 4 8及び 45のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子力 選ばれる少なくとも 1種の 遺伝子、好ましくは 5種の遺伝子の発現量を測定する。
[0024] 本発明において、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に は、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列からなる遺伝子、及び該遺伝子と機能 的に同等な遺伝子が包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によ つてコードされるポリペプチド力 配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列からなる 遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有 することを指す。
[0025] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードする DNAを調製する当業 者によく知られた方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（Sambrook, J et al.， Mole cular Cloning 2nd ed., 9.47—9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)を利用する 方法が挙げられる。
[0026] 機能的に同等な遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有す る。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、 好ましくは 75%以上の同一性、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましく は 95%以上の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin及び Alt schulによるアルゴリズム BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993) によって決定することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。な お、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、 DNAのみならずその mRNA や cDNAも含むものとする。また、全長遺伝子のみならず ESTも含むものとする。
[0027] 従って、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子には、配列 番号 1〜121のいずれかの塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列からなる遺伝 子が包含される。配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列の全部又は一部を含む 塩基配列からなる遺伝子の塩基長は、機能的に同等の遺伝子をコードする限り特に 制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ス トリンジ ントな条件下でハイブリダィズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するも のであり、例えば、少なくとも 50塩基、好ましくは少なくとも 100塩基、より好ましくは少 なくとも 200塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも 5 0塩基、好ましくは少なくとも 100塩基、より好ましくは少なくとも 200塩基の配列であ る。ここで「連続する」とは、基準とする塩基配列のうち連続した塩基配列を含むことを 意味する。
[0028] 本明細書にぉ 、て、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い 相同性 (相同性が 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上）を有す るオリゴヌクレオチドがハイブリダィズする条件をいう。より具体的には、このような条件 は、 0. 5〜： LMの NaCl存在下 42〜68°Cで、又は 50%ホルムアミド存在下 42°Cで、 又は水溶液中 65〜68°Cで、ハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の S SC溶液を用いて室温〜 68°Cでフィルターを洗浄することにより達成できる。
[0029] 上記遺伝子の発現量の測定は、当技術分野で通常用いられる方法で実施すること ができ、好ましくは、未成熟コムギに由来する試料において、配列番号 1〜121のい ずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも 1種の遺伝子をコード する RNAを検出する方法が挙げられる。ここで、 RNAの検出には、 mRNAの検出 だけでなぐ RNA力 変換された cDNAや cRNAの検出も包含される。
[0030] 試料中の配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子をコードす る RNAを検出する方法としては、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定さ れる遺伝子を特異的に増幅するための、 10〜40塩基長の連続したプライマー、及 び Z又は配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に ハイブリダィズする、 10〜40塩基長の連続したプローブ力も選ばれる少なくとも 1の プローブを用いる方法が挙げられる。
[0031] 配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅す るためのプライマーは、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列において、その一 部を増幅するものであってもよい。例えば、配列番号 1の 27〜176位の塩基配列、配 列番号 8の 150〜250位の塩基配列、配列番号 34の 12〜80位の塩基配列、配列 番号 48の 40〜 149位の塩基配列、配列番号 45の 69〜216位の塩基配列を増幅 するちのでちょい。
[0032] 特定の遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー及び特定の遺伝子に特異的 にハイブリダィズするプローブの設計は、当技術分野にお!、て通常用いられる方法 によって実施できる。プライマーの長さは、通常 10塩基以上、好ましくは 10〜40塩 基、より好ましくは 15〜30塩基である。プローブの長さは、通常 10塩基以上、好まし くは 10〜40塩基であり、さらに好ましくは 15〜 30塩基である。
[0033] また設計の際には、プライマー又はプローブの融解温度 (Tm)を確認することが好 ましい。 Tmとは、任意の核酸鎖の 50%がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度 を意味し、テンプレート DNA又は RNAとプライマー又はプローブとが二本鎖を形成 してアニーリング又はハイブリダィズするためには、アニーリング又はハイブリダィゼ ーシヨンの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な 反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しょうとする プライマー又はプローブの Tmは、増幅反応又はハイブリダィゼーシヨンを行う上で重 要な因子である。 Tmの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトゥェ ァを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウェアとしては、例えば Amplify などが挙げられる。また Tmの確認は、ソフトウェアを使わず、 自ら計算すること〖こよつ ても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法 (Nearest Neighbor Meth od)、 Wallance法、 GC%法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では 、平均 Tmが約 50〜70°Cのプライマー及び 55〜75°Cのプローブを用いることが好 まし 、。プライマー又はプローブとして特異的なアニーリング又はハイブリダィズが可 能な条件としては、その他にも GC含量などがあり、そのような条件は当業者に周知 である。
[0034] プライマーは、設計時にテンプレートとして使用する配列に対し相同的な場合と相 補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合はテンプレート配列に対し相 同配列となり、リバースプライマーの場合はテンプレート配列に対し相補配列となるこ とに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業 者には周知である。
[0035] プライマーの具体例としては、例えば、以下のプライマーセットが挙げられる：
(a)配列番号 1の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット として、配列番号 130で表される塩基配列力もなるフォワードプライマーと配列番号 1 31で表される塩基配列力 なるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
(b)配列番号 8の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット として、配列番号 133で表される塩基配列力 なるフォワードプライマーと配列番号 1 34で表される塩基配列力 なるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
(c)配列番号 34の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセッ トとして、配列番号 136で表される塩基配列力 なるフォワードプライマーと配列番号 137で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
(d)配列番号 48の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセッ トとして、配列番号 139で表される塩基配列力 なるフォワードプライマーと配列番号 140で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
(e)配列番号 45の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセッ トとして、配列番号 142で表される塩基配列力 なるフォワードプライマーと配列番号 143で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられる。
[0036] 配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイプリ ダイズするプローブは、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列において、その一 部に特異的にハイブリダィズするものであってもよい。例えば、配列番号 1の 113〜1 28位の塩基配列、配列番号 8の 213〜228位の塩基配列、配列番号 34の 33〜47 位の塩基配列、配列番号 48の 91〜106位の塩基配列、配列番号 45の 178〜194 位の塩基配列にハイブリダィズするものでもよ!/、。
[0037] さらに、当業者には周知のように、上記のようなプライマー又はプローブには、ァニ 一リング又はノ、イブリダィズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が 含まれていてもよぐそのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含ま れるものとする。
[0038] 次に、未成熟コムギにおいて、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定さ れる遺伝子の発現量を測定する手段の一実施形態として、未成熟コムギに由来する 試料中の各遺伝子をコードする RNA量に基づき、該遺伝子の発現量を測定する方 法について以下に述べる。
[0039] まず未成熟コムギに由来する試料から全 RNAを抽出する。本発明において未成 熟コムギとは、受粉して花が咲いて力 収穫されるまでのコムギであれば特に制限さ れないが、開花後、通常 1〜40日、好ましくは 5〜35日のコムギである。本発明にお いて未成熟コムギに由来する試料としては、種子を使用する。
[0040] RNAを抽出する方法としては、例えば、チォシアン酸グァ-ジン ·塩化セシウム超 遠心法、チォシアン酸グァ-ジン'ホットフエノール法、グァ-ジン塩酸法、酸性チォ シアン酸グァ-ジン'フエノール'クロ口ホルム法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N.， (19 87) Anal. Biochem., 162, 156- 159)などを利用することができる。
[0041] 抽出された RNAはさらに精製して mRNAとして使用することが好ましい。精製方法 は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在する mRNAの多くは、その 3 '末 端にポリ (A)配列を持っため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施する ことができる。まず抽出した全 RNAにピオチン化オリゴ (dT)プローブをカ卩えてポリ（A ) +RNAを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定ィ匕した常磁性粒子担体をカロ え、ピオチン Zストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（A) +RNAを捕捉させる 。洗浄操作の後、最後にオリゴ (dT)プローブカゝらポリ (A) +RNAを溶出する。また、 オリゴ (dT)セルロースカラムを用いてポリ（A) +RNAを吸着させ、これを溶出して精 製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（A) +RNAは、さらに、ショ糖密度勾 配遠心法等により分画してもよい。このようにして得られた RNA、該 RNAカゝら得られ る cDNAや cRNA、及びその増幅産物を以下において被検核酸と称し、本発明にお ける遺伝子発現量の測定方法は、これら被検核酸の!/ヽずれを測定する場合も包含 する。
[0042] 遺伝子の発現量を測定する方法は、特に制限されず、当技術分野で通常用いられ る方法によって実施できる。例えば、ノーザンハイブリダィゼーシヨンなどのハイブリダ ィゼーシヨン法及び逆転写 PCR法などが挙げられ、本発明にお 、ては逆転写 PCR 法を用いるのが好ましい。さらに、本発明においては、好ましくはリアルタイム PCR法 及び競合 PCR法などの定量 PCR法を組み合わせることにより、各遺伝子の発現量を 定量的に測定する。
[0043] 本発明は、特に、組織や成長段階によって発現量の変化のない遺伝子 (ハウスキ 一ビング遺伝子）の発現量に対する特定の遺伝子の発現量の比を測定することによ り、未成熟コムギにおける特定の遺伝子の発現量の増減を測定する。組織や成長段 階によって発現量の変化のない遺伝子としては、ュビキチン遺伝子、ァクチン遺伝子 、チューブリン遺伝子、及びリボソ一マル RNA遺伝子等が挙げられ、本発明におい てはュビキチン遺伝子を標準遺伝子として使用するのが好ましい。
[0044] 逆転写 PCR法は、まず、試料カゝら得られた RNAをテンプレートとして、逆転写酵素 反応により cDN Aを作製し、その後、作製した cDNAをテンプレートとして一対のプラ イマ一を用いて PCR法を行うものである。
[0045] 競合 PCR法では、同じプライマーを用いて、定量の内部標準となる競合的テンプレ ートから得られる増幅産物と被検核酸力 得られる増幅産物との量を比較することに より、被検核酸に含まれる検出対象を定量することができる。
[0046] リアルタイム PCR法では、例えば、 5'端は蛍光色素（レポーター）で、 3'端は消光 色素（タエンチヤー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダィズするプロ一 ブが使用される。プローブは、通常の状態ではクェンチヤ一によつてレポーターの蛍 光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダィズさせた 状態で、その外側力も TaqDNAポリメラーゼを用いて PCRを行う。 Taq DNAポリメ ラーゼによる伸長反応が進むと、そのェキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが 5 '端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイム PCR法 は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、テンプレート DNAの初 期量を定量する。
[0047] リアルタイム PCR法には、例えば SYBR™Green法や TaqMan™法を使用するこ とができる。リアルタイム PCR法の反応サイクルとしては、例えば、 50°C2分、 95°C10 分、（95°C15秒、 60°C分) 40サイクルを使用できる。得られた結果は、例えば、 18s リボソーム RNAを用いて標準化することができる。
[0048] 上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反 応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いること ができる。例えば、増幅反応の過程で取り込まれる dNTPに、放射性同位体、蛍光物 質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することにより実施できる
。放射性同位体としては、 32P、 125i、 35sなどを用いることができる。また蛍光物質とし ては、例えば、フルオレセン（FITC)、スルホローダミン（TR)、テトラメチルローダミン (TRITC)などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いる ことができる。
[0049] これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく 、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放 射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。
[0050] 標識した dNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を 検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、 標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレ一 シヨンカウンター、 γ カウンターなどにより計測することができる。また標識体として 蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用い て検出することができる。
[0051] 本発明の方法においては、上記プローブを用いてハイブリダィゼーシヨン反応を行 い、その特異的結合を検出することにより、各遺伝子の発現量を測定することもでき る。ハイブリダィゼーシヨン反応は、プローブが特定の遺伝子に由来する塩基配列の みと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジ ントな条件下で行う必要があ る。そのようなストリンジ ントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。 ノ、イブリダィゼーシヨンを行う場合には、プローブに蛍光標識 (FAMなど）、放射性標 識、酵素標識、ピオチン標識等の適当な標識を付加することができる。
[0052] 本発明にお 、て遺伝子発現量の測定は、標識ィ匕プローブと未成熟コムギカ 得ら れた被検核酸とをハイブリダィズ可能なように接触させることによつても実施できる。「 ハイブリダィズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結 合が起こる環境 (温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、試料又は 被検核酸をスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に担 持し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブと被検核酸とを接触さ せてハイブリダィゼーシヨン反応を行! 、、 ノ、イブリダィズしなかったプローブを除去し た後、被検核酸とハイブリダィズしているプローブの標識を検出する。標識の濃度を 指標とすることにより、定量的な検出が可能となる。標識化プローブを用いた検出方 法の例としては、サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法 、 FISH (蛍光 in situハイブリダィゼーシヨン）法等を挙げることができる。
[0053] 本発明において、被検核酸の少なくとも 1つを検出する方法としてマイクロアレイ、 マクロアレイ等のアレイ法を挙げることができる。この場合は、次のような方法によって 検出を行うことができる。すなわち、被検核酸に特異的にハイブリダィズするプローブ をスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に担持し、被 検核酸を標識ィヒした後でプローブとのハイブリダィゼーシヨン反応を行 、、ハイブリダ ィズしなカゝつた被検核酸を除去した後、プローブとハイブリダィズして!/ヽる被検核酸の 標識を検出する。標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。
[0054] プローブ及び被検核酸のいずれも標識化せず、プローブと試料又は被検核酸との ノ、イブリダィゼーシヨンによって形成された二本鎖核酸 (ハイブリッド)を検出すること もできる。二本鎖核酸の検出は、例えば、核酸の二本鎖部分に特異的に結合する蛍 光色素等を用いて行うことができる。そのような色素としては、例えば、特開 2002— 1 81816号公報に記載された蛍光インターカレータ等を挙げることができる。
[0055] 遺伝子発現量の測定においてハイブリダィゼーシヨンを行う場合、被検核酸は DN A及び RNAのいずれでもよいが、高感度の検出を必要とする場合には、 RNAを被 検核酸とする方が望ましい。
[0056] 高感度の測定を行うためには、増幅反応とハイブリダィゼーシヨン反応とを組合せ、 プライマーを用いた増幅反応を行って得られる増幅産物に対し、別のプローブを用 V、てハイブリダィゼーシヨンを行うことが好ま ヽ。そのような組合せを利用する場合 のプライマー及びプローブは、当業者であれば設計することができ、その具体例は上 述のとおりである。
[0057] 本発明のアレイは、公知の技術、例えば、村松正明、那波宏之（監修）、「DNAマイ クロアレイと最新 PCR法」、秀潤社 (2003年 3月発行）に記載される方法に従って調 製することができ、これを用いたアレイ法も当該文献を参照して実施することができる
[0058] 本発明の方法では、未成熟コムギにおいて、配列番号 1〜121のいずれかの塩基 配列で特定される少なくとも 1種の遺伝子の発現量を測定することにより、コムギ完熟 種子の二次加工性状を推定する。
[0059] 松木らは、コムギが登熟期に高温にさらされるとアミロぺクチンの側鎖長が長くなる ことを報告している（Matsuki, J., Yasui, T.， Kohyama, Κ., and Sasaki, T. (2003) Cere al Chem. 80(4):476-480) o Shi及び Seibは、低温で育成されたコムギ中のアミロぺク チンは、側鎖長が短いものが多いことを報告しているが、その一方で、澱粉糊化温度 はアミロぺクチン側鎖長と相関関係にあることを報告している（Shi, Y.C., and Seib, P. A. (1995) Carbohydr.Polym. 26:141-147) )。また、 Shibanumaらは、澱粉のアミロぺ クチン側鎖長は、うどん適性に影響を与えることを報告している（Shibanuma, K., Take da, Y" Hizukuri, S" and Shibata, S. (1994) Carbphydr. Polym. 25:111—116)。また、 登熟期に高温にさらされるとアミロース含量が増加することが報告されている（Tester, R.F., Debon, S. J.J., Davies, H.V., and Gidley, M.J. (1995) J. Sci. Food Agric)。ま た、 Stoneと Nicholasは、グリアジンに対するグルテニンの割合は高温ストレスでも 変化がない品種も有れば、劇的に減るものもあるとしている（Stone, P.E., and Nichola s, M.E. (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21:887-900)。これに対して Blumenthalらは 、登熟期に 35°C以上の高温にさらされることにより、遺伝的改変により生地特性が低 下することを示している（Blumenthal, C.S., Barlow, E.W.R., and Wrigley. C.W. (1993 ) J. Cereal Sci. 18:3-21)。さらに Blumenthalらは、登熟期に高温ストレスにさらされ ることによるドウのもろさは、グリアジンに対するグルテニン比の減少とラージダルテ- ンポリマー割合の減少が原因であるとしている（Blumenthal, C, Bekes, F.， Gras, P. W.， Barlow, W.R., and Wrigley, C.W. (1995) Cereal Chem. 72(6):539- 544)。 DuPo ntらは、開花後肥料を追加しないという条件下では、高温によりタンパク質含量と ω —グリアジン量が増加することを報告している（DuPont, F.M., Altenbach, S.， Chan, R., Cronin, K., and Lieu, D. (2000) In: Shewry, P.R., and Tatham, A.S. (Eds.), Glut en Royal Society of Chemstry, Cambridge, pp. 488—491)。以上の知見を表 1にまとめ た。
[表 1] 登熟 の温度ス卜レスと完熟種子の性状との関係
Figure imgf000015_0001
[0060] 本発明者らは、未成熟コムギにおいて、上記配列番号 1〜121のいずれかの塩基 配列で特定される遺伝子の発現量を上記方法によって測定し、得られた各遺伝子の 発現量を、ュビキチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子の発現量に対する比とし て算出し、得られた結果を、登熟期において高温にさらされた場合又は低温にさらさ れたコムギにおいて得られる結果と比較することによって、将来得られる完熟種子の 二次加工性状を推測できることを見 、だした。
[0061] 各遺伝子の発現量に基づき、コムギ完熟種子の二次加工性状を推測する方法に ついて以下に述べる。
[0062] まず、未成熟コムギにおける配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定され る遺伝子の発現量を、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対する比として算出する。 続いて、得られた発現量比を、登熟期に高温又は低温にさらされた場合の各遺伝子 の発現量比と比較する。その結果、未成熟コムギにおける各遺伝子の発現量比が、 登熟期に高温にさらされた場合の各遺伝子の発現量比に類似する場合は、該未成 熟コムギカも将来得られる完熟種子の二次加工性状は、登熟期において高温にさら されたコムギカも得られる完熟種子の二次加工性状と類似する、すなわち、うどん適 性が低下し、生地特性が低下し、ドウ力 Sもろくなると推定できる。逆に、未成熟コムギ における各遺伝子の発現量比が、登熟期に低温にさらされた場合の各遺伝子の発 現量比に類似する場合は、該未成熟コムギカ 将来得られる完熟種子の二次加工 性状は、登熟期において低温にさらされたコムギカ 得られる完熟種子の二次カロェ 性状と類似する、すなわち、製パン適性及びうどん適性が低下すると推定できる。
[0063] より具体的には、未成熟コムギにおいて、ュビキチン遺伝子発現量に対する、配列 番号 1の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が 0. 06〜0. 24倍、配列番号 8 の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が 0. 8〜3. 2倍、配列番号 34の塩基 配列で特定される遺伝子発現量の比が 0. 45〜： L 8倍、配列番号 48の塩基配列で 特定される遺伝子発現量の比が 0. 24倍以上、配列番号 45の塩基配列で特定され る遺伝子発現量の比が 0. 0015〜0. 006倍であれば、将来得られる完熟種子の性 状は、登熟期に高温にさらされたコムギカ 得られる完熟種子の性状を有すると推測 できる。すなわち、アミロース含量が高ぐアミ口べクチンの側鎖長が長ぐ澱粉糊化 温度が高ぐタンパク質含量が高ぐグルテニン Zグリアジン比が低ぐラージグルテ ニンポリマーが少な 、と 、う特徴を有することが推定できる。
[0064] 一方、未成熟コムギにおいて、ュビキチン遺伝子発現量に対する、配列番号 1の塩 基配列で特定される遺伝子発現量の比が 0. 24倍以上、配列番号 8の塩基配列で 特定される遺伝子発現量の比が 3. 2倍以上、配列番号 34の塩基配列で特定される 遺伝子発現量の比が 0. 45倍以下、配列番号 48の塩基配列で特定される遺伝子発 現量の比が 0. 06倍以下、配列番号 45の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比 が 0. 0015倍以下であれば、将来得られる完熟種子の性状は、登熟期に低温にさら されたコムギカも得られる完熟種子の二次加工性状を有すると測定できる。すなわち 、アミロース含量が低ぐアミ口べクチンの側鎖長が短ぐ澱粉糊化温度が低ぐタン ノ ク質含量が低ぐアミロース及びアミロぺクチンが低分子化しているという特徴を有 することが推定できる。
[0065] そしてそのような性状と、表 1にまとめたような従来の知見とを組み合わせることによ り、完熟種子力 得られる小麦粉の二次加工性状を推定することができる。
[0066] 本発明はまた、未成熟コムギを用いて、コムギ完熟種子における二次カ卩ェ性状を 推定するためのキットに関する。該キットは、上記の配列番号 1〜121のいずれかの 塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための 10〜40塩基長のプライマ 一から選ばれる少なくとも 1のプライマー、及び Z又は上記の配列番号 1〜121のい ずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダィズする 10〜40塩基 長のプローブから選ばれる少なくとも 1のプローブを含む。
[0067] 本発明のキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファ 一、 dNTP混合物、酵素類 (逆転写酵素、 RNaseHなど）、校正用の標準試料などを 含んでいてもよい。本発明のキットは、プローブを含む場合には、さらに、ノ、イブリダイ ゼーシヨンバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含 んでいてもよい。さらに、ュビキチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子を特異的 に増幅するためのプライマー及び/又はハウスキーピング遺伝子に特異的にハイブ リダィズするプローブを含んで 、てもよ 、。
実施例
[0068] (実施例 1)
開花直前まで外で成育させたコムギを 15°Cの人工気象室で生育させた。開花後 1 0日目に一部を 20°C又は 10°Cの環境下に移し、開花後 15日目まで同一環境下で 生育させた。開花後 15日目に一部の未成熟種子を回収し、発現遺伝子解析用の試 料とした。残りの一部を 15°Cの環境に移動し開花後 50日目を完熟とみなし、成分分 祈に供した。
[0069] 一方、開花期に人工気象室に移動し 15°Cで生育させた後、開花後 30日目に一部 を 20°C又は 10°Cの環境下に移し、開花後 35日目まで同一環境下で生育させた。開 花後 35日目に一部の未成熟種子を回収し、発現遺伝子解析用の試料とした。残り の一部を 15°Cの環境に移動し、開花後 50日目を完熟とみなし、成分分析に供した。
[0070] 発現解析は、 Hi— CEP (High Coverage Expression Profiling)法で行った 。 Hi— CEP法は、放射線医学総合研究所の安倍ら（Fukumura R, Takahashi H, Sait o T, Tsutsumi Y, Fujimori A, Sato b, Tatsumi K, Araki R, Abe M., Nucleic Acids Re s. 2003, 15;31(16): e94)が開発した方法であり、以下の要素で構成される。
[0071] (l) mRNA抽出
三温度帯にて育成したコムギ未成熟種子から SDS フエノール法にて全 RNAを 抽出した。すなわち、種子を粉砕し抽出バッファー（lOOmM Tris-HCl(pH8. 0) 、 10mM EDTA(pH8. 0)、 lOOmM LiCl、 1% SDS)に懸濁後、フエノール Z クロ口ホルム処理を行った。さらにフエノール Zクロ口ホルム処理を行った後、 LiCl沈 殿を行った。沈殿物を 400 1の DEPC処理水に溶解し、フエノール/クロ口ホルム 処理、クロ口ホルム処理、 EtOH沈殿処理を行った。乾燥後 200 1の 0. 1M酢酸ナ トリウム (PH6. 0)に溶解し、 20 1の EtOHをカ卩え、多糖類を沈殿させて除いた。上 清を EtOH沈殿し、乾燥後、 DEPC処理水に溶解した。この溶液力 Micro— Fast Track™ 2. 0 mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製）を用いて mRNAを精製 した。精製法は、キットに付属のマニュアルに従った。
[0072] (2)選択的 PCR用テンプレート作製
5，末端にビォチンを付カ卩させたオリゴ dT (5，一ビォチン一 ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ ΤΤΤΤ— 3，）をプライマーとして、 Superscript™ Double - strand cDNA Syn thesis Kit (Invitrogen社製）を用いて 2本鎖 cDNAを合成した。この 2本鎖 cDNA を制限酵素 Msplで消化した後、 Msplアダプター（5 ' - AATGGCTAC ACG AAC TCGGTTCATGACA- 3，及び 5，一 CGTGTCATGAACCGAGTTCGTGTA GCCATT— 3，）を付カ卩し、アビジン磁性粒子（Dynabeads M— 280 Streptavid in;Dynal社製)を用いてポリ A側断片のみを集めた。続いて制限酵素 Mselで消化 してから Mselアダプター (5' - AAGTATCGTC ACG AGGCGTCCTACTGCG 3，及び 5， - TACGC AGTAGG ACGCCTCGTG ACG ATACTT - 3， )を付加 し、アビジン磁性粒子を用いてポリ A側断片を捨てた。残った断片を以下の選択的 P CR用のテンプレートに用 ヽた。
[0073] (3) 256種類のプライマーを用いた選択的 PCR
上記アダプターと結合するようにプライマーを設計し、 PCRを行った。その際にブラ イマ一の端を cDNA断片側に 2塩基はみだすように設計し、 16通り全てのパターン を行った。また Mspl側のプライマーに FAMを用いた蛍光標識を行った。プライマー には蛍光プライマーとして Mspl プライマー（5， - F AM - ACTCGGTTC ATG A CACGGNN— 3，）と Msel -プライマー（5，一 AGGCGTCCTACTGCGTAANN — 3，）を用い、 PCRサイクルは 95°C— 1分： 1サイクル， （95°C— 20秒， 71. 5°C— 3 0秒， 72°C— 1分）： 28サイクル， 60°C— 30分： 1サイクルで行った。
[0074] (4)サンプル間のプロファイルの比較及び発現量の変化して ヽる断片の選抜
PCR産物を適当な濃度に薄めて 3 μ 1とり、ホルムアミド 10 μ 1、 ROXマーカー（Αρ plied Bio systems社製） 0. 3 1をカ卩えて ABI Prism 3100 (Applied Biosyste ms社製）にて泳動を行った。得られた結果を GeneScan3. 7 (Applied Biosyste ms社製)を用いて解析し、発現量の変化して 、る断片を選抜した。
[0075] (5)選抜断片の塩基配列決定
20x40cmのガラス板にアクリルアミドゲルを作製した。（4)にて選抜した断片が含 まれる PCR混合物を泳動し、 目的断片を切り出した。切り出した断片を ΙχΤΕバッフ ァ一に懸濁し、その懸濁液をテンプレートに PCRを行い、切り出した断片と目的断片 が同じであるか否かを確認した。プライマーは Mspl— universal T7 プライマー（5
ATGACACGG— 3，）と Msel—universalプライマー（5，一 AGGCGTCCTACT GCGTAA— 3' )であった。同じ分子量の PCR産物が得られたら、ダイレクトシークェ ンスにてその配列を読んだ。その際には T7プライマー（5， - TAATACGACTCA CTATAGGG 3，）を用!ヽた。
[0076] 発現解析の結果得られたデータを表 2に示した。表中の配列番号は、配列表にお ける配列番号に対応している。特徴及び倍率と記載した列に、登熟期に温度変化を 与えたときの挙動 (対照区と比較した場合の発現量の増加又は減少）とその変化の 倍率を示した。また、国立遺伝学研究所の主催する DDBJで相同性検索を行った結 果、相同性が高力つた遺伝子、 ESTの例とそのァクセシヨン番号を示した。
[表 2]
HiCEP法により選抜した.発現変化が特徵的なコムギ遺伝子一覧
配列 Accession Kfo. Accession No.
相同性が高い遺伝子の例 特徴 倍率 番号 (Gene or EST) (Unj-gelie)
1 alpha - amylase gene X05809 15日低混にて発現誘導 8.1
2 germ agglutinin 2961 15曰高温にて発現誘導 13.1
3 germ ag^lutinirt isofectin D M25537 15曰萵温にて発現誘導 22.2
4 germ agglutinin isalectin A M2553G 15日高温にて発現誘導 22.1
5 ADP - glucose pyropho sph ory 1 a se X67151 35曰高温にて発現抑制 0.08
6 serpin WZS3 Y11486 15曰低温にて発現抑制 0.48
7 protein disulfide isom erase U11496 15曰低溫にて発規誘導 3.1
8 catalasc X94352 15日高温にて発現抑制 0 15
9 60s ribosomal protein L21 AF475114 15曰高温にて発現抑制 0.13
10 Em H2 73227 35日高 にて発現抑制 議
11 root abunda t protein TT9TS34 35曰高 Sにて発 抑制 0.23
12 secretory protein AF07&526 15曰低温にて発現抑制 0.37
13 glucose and riDitol dehydrogenase homolog S7292 & 15日高温にて発現 ^導 4 0
14 alpha— amylase tetrameric inhibitor C 3 X61032 15曰高温にて発現誘導 2.9
15 PST19 , L R19 , TAK19-1 .and L K19 genes AF325196 35曰高温にて発現抑制 o.oa
16 Accl AFG2i)S97 35日高温にて発現誘導 30.1
17 PDI3 AF26293i Ulld96 15日低 gにて発現誘導 3.1
18 His tan H3 gene X00937 15日低温にて発現 導 3.1
19 EC protein X68288 15曰高温にて発現誘導 5.3
20 7^-gliadin gene M16064 15曰高温にて発現誘導 3.0
21 WPR4a 4b AJOOS099 ，5日高 にて発現誘導 5.0
22 nodulin - like protein CN012339 Ta.2B330 15曰低温にて発現抑制 0.17
23 ADP-filucose pyrophosophorylase CD9092O Ta.2797 15曰高温にて発 ¾抑制 0.08
24 Gamma-thionin homolog CA701480 Ta,27389 35日高温にて発現抑制 005
25 hy d roxy methy I gluta ry ί- Co A lyase CD453645 Ta.8391 15日低显にて発現抑制 Q.56
26 nadulin一 like protein BG313072 丁 3.21043 15曰低温にて発現抑制 0.26
27 nodulin一 like protein Q579734 Ta.9559 15曰低 にて発現抑制 0.35
28 O -m eth y I tra n sf era se一 like protein CDS96263 Ta 11022 15曰低温にて発現抑制 0.28
29 putative carboxyl -terminal peptidase BE422634 Ta.1234 15曰高温にて 現抑制 0.15
30 plasma membrane intrinsic protein 1 N011928 Ta.1013 15 B高混にて発現誘導 47
31 putative phosphaprotein phosphatase BE 419998 Ta.29303 15曰窩温にて発現誘導 4,8
32 cytochrgme P 50, putative BJ297614 Ta.5854 15日髙溫にて発現誘導 4.6
33 3(2),5-bisphosphate nucleotidase RO 909591 Ta 3052 35日高温にて発現抑制 0 10
34 alpha/beta-gliadin BJ29326S TB.2452S 15曰低温にて発現抑制 0.34
35 latex allergen from Hevea hrasiliensis CD453773 Ta.28&66 15日高温にて発現抑制 0.30 Dhotosystem Q type I chlornphyll a b binding
36 protein ： EQ6丄 9858 Ta.22984 15日高温にて発現仰制 027
37 glucose— 6— phosphate dehydrogenase A 313188 -16992 15日低温にて発現抑制 0.34
38 heat shock protein BJ296904 Ta-1471 35日低 Sにて発現抑制 0_45
3 & calnexin - like protein OK210625 Ta 2538 35曰低還にて発現抑制 0.4
40 phosphatase 2 C Hike protein CDft20796 Ta.5734 35曰高温にて発現抑制 0.13
41 glutathione S -transferase CD934218 Ta.240 35曰高温にて発現抑制 0.25
42 filamentous flower rotein BE 402267 Ta.1410l 35曰高温にて発現抑制 0.25
43 dynein light subunit Ec6, flagellar outer arm CA639052 Ta.1S579 35曰;^温にて発現抑制 0.19
44 ri osomal protein S15 - like protein BJ22259S Ta.20532 35曰高溫にて発 誘導 2,5
Ab gamma-gliadin BE423434 15曰低温にて発現抑制 0.3 &
46 berberine bridge enzyme一 like protein BQ1GG&52 15 S低温にて発現誘導 2.2
47 Chalcoiie synthase CA70 I73 Ta.10418 15曰低温にて発現誘導 2.1
48 70 kDa heat shock protei CD912041 AF005993 15曰低温にて発現抑制 0.25
49 suhtilisin-ltke proteinase CD373689 Tg.24597 15曰; にて発現抑制 0.34
50 photosystem-I PSI-F sub u it precursor BE 42(3533 ■135 15曰高溫にて発現抑制 0.56
51 putative riboscm ] protein S1 GN011733 Ta.3522 i s e高温にて発現抑制 0.25 52 70 kDa heat shock protein CD912041 AFDD5993 15曰高温にて発現 導 2.7
53 O-methyltransf erase like protein CD919S15 Ta.5951 35曰低温にて発現抑制 0.05
54 nodulin-like protein C謂 6425 Ta.5650 35曰低温にて ¾現 導 5.3
55 ABC trans porter- like protein CDS81710 Οε.6Ί 18 35曰高温にて発現誘導 4.2
56 expressed protein AJfi 15971 Os.l 1603 15曰高温にて発現誘導 9.4
57 expressed protein BE 499562 Ta.S23D 35曰高温にて発現抑制 0.24
58 expressed protein CD899928 Ta.讓 5 35曰低温にて発現抑制 0.36
59 expressed protein BJ2G1310 Ta.1519 35曰高溫にて 抑制 0.Ί5
60 expressed protein CA595S7C Os.l B152 35曰 温にて発現抑制 0.09
61 expressed protein RK515S38 Os.l 8152 35日高温にて発現抑制 0.18
62 expressed protein CD902303 Ts.2B1fl5 15日高温にて発現^ ¾ 3.0
63 expressed protein BE44649R Ta.140S7 35曰低温にて発現誘導 5.3
64 expressed protein AL815606 Ta.10329 3S S低温にて発現諄導 12
65 unknown protein G 885342 Os.†8095 35曰低温にて 現誘導 5.1
66 unknown protein CD9171S9 Ta.9344 35日低^こて癸現誘導 2.7
67 unknown protein BJ2&Y693 15曰低温にて発現誘導 2.8
68 hy othetical protein CD920596 Ta.1 510 15曰低^にて発現仰制 0.24
69 hypothetical protein CD925669 Ta'13739 15曰高温にて発現誘導 10.6
70 hypothetical rotein EQ483298 Ta.7782 35曰高溫にて発現抑制 0,02
71 hypothetical protein Os.1849 & 35曰高溫にて発現抑制 0.30
72 hypothetical protein CD9l i035 Ta.14111 15曰低温にて発現抑制 0.42 73 hypothetical protein CA640372 Os.£8J 92 15曰诋温にて発現抑制 0.40
74 hypothetical protein CD912035 Ta.14111 15日低 Sにて発現抑制 0.63
75 hypothetical protein CD893S64 Tfi.837 15日高温にて発現抑制 0.16
7B putative protein CD9丄 7477 Ta.13237 35日 ½温にて発現誘 ¾ 10.5
77 putative prot in CD92050S Os.4124 35 S低温 て発現抑制 0.4
78 putative protein BJ272522 Ta.13392 35曰高温にて発現抑制 0.31
79 putative protein C建 7715 Ta.7485 35ョ高温にて発現 導 2.6
80 putative protein AL820153 Os,13027 35曰 温にて発現誘導 2.3
81 putative protein CD917477 Ta.13237 35曰低温にて発現誘導 11.6
82 unknown BQ2468B4 15 E低温にて発現誘導 7.5
83 unknown CK218032 Ta 25929 35曰低温にて発現抑制 0,15
84 unknown CDS99270 15曰低涅にて発現誘導 5.4
85 unknown BQ657S89 15曰低温にて発現誘導 7.8
86 unknown CDSSe9fi4 Hv. 6473 15曰高涅にて発現抑制 0.13
87 unknown BE606284 35曰低温にて発現抑制 0.37
88 unknown BJ304521 Ta.6418 曰低温にて発現抑制 0.23
89 unknown CD924903 35曰低温にて発現抑制 0.27
90 unknov/n CD924903 35曰低温にて発現抑制 0.3
91 unknown BJ2ft9636 Ta_57S5 35 B低温にて発現抑制 0.22
92 unknown EJ29B33S Ta-6135 35 S低 Sにて発現抑制 0,4
93 unknown BJ304247 Ta.9474 35曰髙温にて発現抑制 0,12
94 unknown CA6S571S Ta.7698 15 S低温にて発現抑制 0.43
95 unknown CD933817 Ta.9952 15日低温にて髡現誘導 2.8
95 unknown BQ 167139 Ta.9952 15曰坻温にて発現誘導 2.3
97 unknown ΒΞ 17536 Ta.3563 15 3髙 にて発現諉導 20
&8 unknown CA734406 15日高 にて発現抑制 0.37
99 unknown CD902294 35曰低温にて発現抑制 0.33
100 unknown CA6 723 Ta.Z3005 35 B低 にて究現誘導 3.2
101 unknown CA70S&28 35曰 ί¾温にて発現誘導 4.2
102 unknown CD921040 35曰高温にて発現抑制 0.33
103 unknown GDS24903 35曰高 にて発現抑制 0.24
104 unknown CD924903 35曰高温にて発現抑制 0.20
105 unknown 蘭 24430 Ta.27947 35日高温にて発現抑制 0.37
106 unknown CA7 11&7 T&.22349 35日高^にて発現抑制 0 29
107 unknown CK161796 35日高温にて発現誘導 3.60
108 unknown CD8S7242 35日高温にて免 誘導 3.3
109 unknown BF483601 Ta.1834 35曰 ¾温にて免現抑制 0.27
1 10 unknown BQ237369 15曰低温にて発 3 誘導 9.0 [0079]
Figure imgf000023_0001
[0080] (実施例 2)
表 2に挙げた遺伝子のリストから、相同検索にぉ 、て既知の遺伝子と高!、相同性が 確認された遺伝子から、 5種の遺伝子を選択した。すなわち、 a アミラーゼをコード する遺伝子 (配列番号 1)、カタラーゼをコードする遺伝子 (配列番号 8)、 a—、 β— グリアジンをコードする遺伝子（配列番号 34)、熱ショックタンパク質 70kDaをコード する遺伝子 (配列番号 48)、 γーグリアジンをコードする遺伝子 (配列番号 45)である 。そして、これらのターゲット遺伝子について、開花後 15日目のコムギ (T. aestivum L. )種子中における発現量の定量を試みた。遺伝子解析ソフト Primer Express Ver. 2を用い、それぞれターゲット遺伝子内に、定量リアルタイム PCR用のプライ マー及びプローブを設計した。その配列を表 3に示す。
[¾3] 逆転写定量 P C Rに使用したプライマ一及びプローブの組み合わせ
Figure imgf000023_0002
開花直前まで外で育てたコムギを人工気象室に移し、環境温度を 15°Cに保った。 この内の一部を開花後 10日目に 10°C又は 20°Cの室温の部屋に移し、開花後 15日 目に未成熟種子を一部収穫した。残りの鉢は 15°Cに移し、開花後 40日目に収穫し た。この未成熟種子力も全 RNAを抽出した。方法は、以下の手順に拠った。
[0082] 約 500mgのコムギ種子を微粉砕し、 12mlの抽出バッファー（lOOmM Tris— HC 1 (ρΗ8. 0)、 10mM EDTA(pH8. 0)、 lOOmM LiCl、 1% SDS) , 8mlの TE ( pH 8. 0)飽和フエノール Zクロ口ホルムで混合し、遠心分離（8, OOOXg、 30分）を 行った。上層に等量の TE (pH 8. 0)飽和フエノール/クロ口ホルム/イソアミルァ ルコール（25 : 24 : 1)を加え、遠心分離（8, OOOXg、 30分）を行った。上層に 1/3 量の 10M LiClを加え、遠心分離（8, OOOXg、 30分）を行った。 20°Cで 1時間静 置後、遠心分離（8, OOOXg、 30分）を行い沈殿物を 5mlの 2M LiClに懸濁した。さ らに遠心分離（8, OOOXg、 15分）を行い沈殿物を 400 1の DEPC処理水に懸濁し た。等量の TE (pH 8. 0)飽和フエノール/クロ口ホルム/イソァミルアルコール（25 : 24 : 1)を加え、遠心分離（8, OOOXg、 10分）を行った。上層に等量の TE (pH 8. 0)飽和クロ口ホルム Zイソアミルアルコール（24 : 1)を加え、遠心分離（8, OOOXg、 1 0分）を行った。上層に 1/10倍量の 3M NaOAc (pH5. 2)、 2. 5倍量の EtOHを 加え、遠心分離（8, 000Xg、 10分）を行った。沈殿を 200 1の 0. 1M 酢酸ナトリウ ム（pH6. 0)に溶解させた。 20 1の EtOHをゆっくり滴下し遠心分離（8, 000Xg、 1 0分）を行った。上清に 2. 5倍量の EtOHを加え遠心分離（8, 000Xg、 10分）を行つ た。沈殿を lmlの 70% EtOH (30% DEPC処理水）で洗い、遠心分離（8, 000X g、 10分)を行った。
[0083] 沈殿をデシケーターで乾燥し、 100 ^ 1の DEPC処理水に溶解した。抽出した RNA は、変性ゲルを用いて電気泳動し、リボソーム RNAの存在により健全度を評価した。 また、逆転写リアルタイム PCRに備えて分光光度計で濃度を測定した。
[0084] 次に、 Invitrogen社製 SuperscriptTMDouble— strand cDNA Synthesis Ki tにより全 RNAをテンプレートとして cDNAを合成した。合成は添付マニュアルに従 つたが、プライマーとして、 oligo— dTプライマーを用いた。
[0085] 糸且織又は成長ステージによって発現量が変動しない内部標準遺伝子としてュビキ チン遺伝子を使用した。いくつかの濃度幅で内部標準にて定量 PCR法を行い、検量 線を得て、適当な濃度幅を決めた。最も適当な濃度溶液をターゲット用定量 PCR法 のテンプレートとして使用した。定量 PCR法は、 96穴プレートで行い、各サンプルつ き 4ゥェルずつ使用した。各ゥエル中の反応液組成を表 4に示す。
[表 4]
逆転写定量 反 液組成
Figure imgf000025_0001
[0086] 定量 PCR法は ΑΒΙ PRISM 7700 Sequense detectorにて行った。サイクル は 50°C2分、 95°C10分、（95°C15秒、 60°C1分) x40サイクルで行った。得られた結 果は 18sリボソーム RNAを用いて標準化した。
[0087] 最終的に収穫したコムギ完熟種子の澱粉、タンパク質の特徴を解析した。解析項 目は、アミロース含量、アミロぺクチン側鎖長、タンパク質含量、グリアジンに対するグ ルテニンの量比である。それぞれの測定法を以下に示す。
[0088] アミロース含量
粉砕したコムギ完熟種子に少量の水を加え生地を作り、水中で揉み出しダルテン のみを取り出した。残りの澱粉懸濁液を遠心分離にかけ、沈殿物を乾燥し澱粉試料 とした。アミロース含量測定は、 Williamsらの方法 (Williams, P.C., Kuzina, F.D., and Hlynak, I. (1970) Cereal Chem. 47:411-420)に従った。この試料の水分を測定後、 約 lOOmgを精秤し、 1mlの 95% EtOHと 9mlの IN NaOHを加え熱湯中で 10分 間熱処理した。室温まで冷やした後、澱粉液を水で洗いながら別容器に回収した。 1 00mlにフィルアップし、 1mlの 1M AcOHと 2mlのョード液を加えた。良く混ぜた後 、 20分間静置し、分光光度計で 620nmの吸光度を測った。ポテトアミロース、アミ口 ぺクチンで検量線を引き、各試料のアミロース含量を決定した。
[0089] アミロぺクチン側鎖長分布の解析
小泉らの方法（Koizumi, K" Fukuda, M., and Hizukuri, S. (1991) J. Chromatogr. 5 85:233-238)に従い、アミ口べクチンの側鎖長分布を解析した。澱粉試料を熱メタノー ルで処理しアミラーゼを失活させた。水に懸濁し、 100°Cで 1時間処理しゲル化した。 酢酸緩衝液 (pH4. 5)中でイソアミラーゼ処理を行った (40°C、 8時間）。さらに酵素 を追加し 16時間処理した。その後、沸騰水中で失活させ、側鎖分布を HPAECで決 定した。イソアミラーゼ処理した澱粉試料を 0. 4M NaOHに溶解し、フィルターで夾 雑物を除き、パルス電流滴定装置付きの陰イオン交換クロマトグラフ (HPAE— PAD )に供した。コントロールとしてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラ オースなどを同様に HPAE— PADにかけ、各試料のアミロぺクチン鎖長を比較した
[0090] 澱粉糊化温度の測定
早川らの手法 (Hayakawa, K., Tanaka, K., Nakamura, T., Endo, S., and Hoshino, T. (1997) Cereal Chem. 74(5):576-580)に従った。すなわち、 DSC (示差走査熱分 析計）により澱粉の糊化ピーク温度を測定した。 DSC専用の銀製パンに澱粉 10mg を採り蒸留水 40 1を力卩ぇ蓋をシールした。 25°Cから 150°Cに一定速度（毎分 5°C) で昇温 粉糊化に伴う吸熱を測定した。糊化のピーク温度 (Tp)を糊化温度として 測定した。
[0091] ffiタンパク皙含量
一般に良く知られて 、るケルダール分解法により測定した。粉砕した完熟コムギ種 子を加水分解後、遊離窒素を測定した。タンパク質換算係数 5. 7を力ゝけ粗タンパク 質含量とした。
[0092] グルテニン グリアジン比の測定
Blumenthalらの方法（Blumenthal, C, Bekes, F.， Gras, P.W., Barlow, W.R., and Wrigley, C.W. (1995) Cereal Chem. 72(6):539- 544)に従った。すなわち、タンパク質 を還元剤なしで完熟コムギ種子の粉砕物力も抽出した。 SDS (ドデシル硫酸ナトリウ ム）を含むリン酸緩衝液中に懸濁し、超音波処理を施し十分に溶解した。フィルター ろ過した後、サイズ排除型 HPLCにかけた。最初に出現するピークを凝集したグルテ ニンとして 2番目に出現するピークを単体のグリアジンとして定義し、面積比をグルテ ニン Zグリアジン比として算出した。
[0093] 上記試験の結果を表 5及び表 6に示す。
[表 5] 登熟期の環境温度を変えたときの未成熟種子における遺伝子発現量の変
Figure imgf000027_0001
[表 6] 登熟期の環境温度を変えたときの完熟稀子の二次加工件状の解析結果
Figure imgf000027_0002
[0094] (実施例 3)
開花後 15日目〜 20日目の麵用国内産コムギの未成熟種子を一部収穫した。一方 、収穫後の完熟種子も収穫した。この未成熟種子力も全 RNAを抽出した。方法は、 上記実施例 2に示した手順に従った。分光光度計で濃度を測定後、同様の方法で、 cDNAを合成し定量リアルタイム PCRに供した。
[0095] 定量リアルタイム PCRを行 、、 5種の遺伝子につ!、て、ュビキチン遺伝子の発現量 に対する相対発現量を測定した。結果を表 7に示す。
[表 7] 未成熟種子における遺伝子相対発現量
Figure imgf000027_0003
表 7に示される遺伝子発現パターンは、登熟期に低温にさらされたコムギにおける 発現パターンと類似していることから、このコムギカ 得られる成熟種子は、表 1に示 された特徴、すなわち、アミ口べクチンの側鎖長が短ぐ澱粉糊化温度が低く、アミ口 ース及びアミロぺクチンが低分子化して 、ると 、う特徴を有することが予想された。 そこで、実施例 2に示した方法に従い、完熟後に収穫した種子の成分分析を実施 したところ、収穫した完熟種子が予想される特徴を有することが証明された (表 8)。以 上から、上記の 5遺伝子の発現量を登熟段階の種子において評価することにより、将 来収穫する完熟種子から得られる小麦粉の二次加工性状を推定できることが明らか になった。
[表 8]
完熟種了-における性状解析結果
Figure imgf000028_0001
(実施例 4)
開花後 20日目力ら 30日目と思われる国内産コムギの未成熟種子を一部収穫した 。一方、収穫後の完熟種子もサンプリングした。この未成熟種子力 全 RNAを抽出し た。方法は、対照実験に示した手順に拠った。分光光度計で濃度を測定後、同様の 方法で、 cDNAを合成し定量リアルタイム PCRに供した。定量リアルタイム PCRの結 果、ュビキチン遺伝子の発現量に対する相対発現量は、表 9に示すとおりだった。
[表 9]
未成熱撺子における遺伝子相対発現量
Figure imgf000028_0002
表 9に示される遺伝子発現パターンは、登熟期に高温にさらされたコムギにおける 発現パターンと類似していることから、このコムギカ 得られる成熟種子は、表 1に示 された特徴、すなわち、アミロース含量が高ぐアミ口べクチンの側鎖長が長ぐ澱粉 糊化温度が高ぐタンパク質含量が高ぐグルテニン Zグリアジン比が低ぐラージグ ルテニンポリマーが少な ヽ、 t ヽぅ特徴を有することが予想された。
そこで、実施例 2に示した方法に従い、完熟後に収穫した種子の成分分析を実施 したところ、収穫した完熟種子が予想される特徴を有することが証明された (表 10)。 以上から、上記の 5遺伝子の発現量を登熟段階の種子において評価することにより、 将来収穫する完熟種子力 得られる小麦粉の二次加工性状を推定できることが明ら かになつた。
[表 10] 完熟種子における性状解析結果
Figure imgf000029_0001
産業上の利用の可能性
[0101] 本発明により、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で、将来のコムギ完熟種子 の二次加工性状を推定することが可能になる。それにより、低品質のコムギを購買す るリスクを低減することができる。
[0102] 本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書中に取り入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 未成熟コムギにおいて、配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺 伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子の発現量を測定することを含む、コムギの 完熟種子における二次加工性状を推定する方法。
[2] 少なくとも、配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配列で特定される遺 伝子力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子の発現量を測定することを含む、請求項 1 記載の方法。
[3] 逆転写定量 PCR法により遺伝子の発現量を測定する、請求項 1又は 2記載の方法
[4] 未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するための キットであって、
配列番号 1〜121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅す るための、 10〜40塩基長の連続したプライマーから選ばれる少なくとも 1のプライマ 一、及び Z又は配列番号 1〜 121のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特 異的にハイブリダィズする、 10〜40塩基長の連続したプローブ力も選ばれる少なくと も 1のプローブを含む、該キット。
[5] 配列番号 1、 8、 34、 48及び 45の 、ずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異 的に増幅するための、 10〜40塩基長の連続したプライマーカも選ばれる少なくとも 1 のプライマー、及び Z又は配列番号 1、 8、 34、 48及び 45のいずれかの塩基配列で 特定される遺伝子に特異的にハイブリダィズする、 10〜40塩基長の連続したプロ一 ブ力 選ばれる少なくとも 1のプローブを含む、請求項 4記載のキット。
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