AMENDED CLAIMS received by the International Bureau on 26 JuIy 2006 (26.07.2006)Ansprüche
1. Enzym-Konjugat für eine Interaktion mit Ziel-DNA, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Enzym-Konjugat um eine Verbindung handelt, bei der ein Enzym über je einen Linker kovalent an mindestens einen Spezifitätsanker gebunden ist, wobei
- das Enzym auf seiner Oberfläche eine reaktive funktionelle Gruppe zur Bindung eines Linkers aufweist,
- es sich bei dem mindestens einen Spezifitätsanker um eine Oligo- nukleotidverbindung handelt, die über eine komplementäre Basenpaa- rung mit einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) der Ziel-DNA eine Tripelhe- lix ausbildet, und die am 5'-Ende oder am 3'-Ende eine reaktive funktionelle Gruppe aufweist,
- der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur Triplex-Bindungsstelle der Ziel-DNA aufweist, - der mindestens eine Linker eine molekulare Verbindung darstellt, die mindestens eine Kette aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reaktiven funktionellen Gruppen derivatisiert ist,
- je eine der beiden funktionellen Gruppen des mindestens einen Linkers eine kovalente chemische Bindung mit der reaktiven funktionellen
Gruppe des Enzyms und der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezi- fitätsankers ausbildet, und
- Enzym und Spezifitätsanker mit einem Abstand von mindestens zwei Basenpaaren an die Ziel-DNA gebunden werden. 45
2. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe Typ Il-Restriktionsendonuklease, Homingendonuklease, DNA-Reparaturenzym, DNA-Methyltransferase.
3. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Typ Il-Restriktionsendonuklease ist.
4. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Methyltransferase ist.
5. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Spezifitätsanker ausgewählt ist aus der Gruppe Oligo- nukleotid, Oligonukleotidanalogon, PNA, Threose-NukleinsäureanalogON.
6. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Spezifitätsanker um ein Oligonukleotidanalogon ausgewählt aus den Gruppen
- Oligonukleotide mit modifiziertem Phosphatgerüst: mixed backbone- Oligonukleotide, Methylphosphonat-, Methyl-(methylenimino)-, Methyl- carboxamid-modifizierte Oligonukleotide,
- Oligonukleotide mit modifizierter Riboseeinheit: am 2'- oder 4'-C-AtOm
modifizierte Ribose, α-Anomere, 3'-Desoxyribose handelt. 46
7. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Spezifitätsanker aus 10 bis 20 Nukleotiden besteht.
8. Enzym-Konjugat gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Spezifitätsanker aus 10 bis 20 Nukleotiden besteht und eine Sequenzhomologie zur Triplex-bildenden Stelle der Ziel-DNA von 100 % aufweist.
9. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine kovalente chemische Verknüpfung aus einem Crosslinker und einem 3'-Link oder 5'-Link ist, wobei
- der Crosslinker eine molekulare Verbindung aus mindestens einer Kohlenwasserstoffkette darstellt, wobei diese mindestens eine Kohlenwasserstoffkette mindestens zwei C-Atome enthält und an zwei Stellen reaktive funktionelle Gruppen enthält, - der 5'-Link oder 3'-Link eine molekulare Verbindung darstellt, die eine
Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C-Atomen enthält, an das 5'-Ende oder 3'-Ende des Spezifitätsankers gebunden ist und an einer Stelle eine reaktive funKtionelle Gruppe enthält und
- eine reaktive funktionelle Gruppe des Crosslinkers mit der funktionellen reaktiven Gruppe des 3'-Links oder 5'-Links chemisch kovalent verbunden ist.
10. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der der Spezifitätsanker mit einem 5'-Aminolink chemisch ko- valent verbunden ist und der 5'-Aminolink 6 bis 12 Methylengruppen enthält.
11. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Crosslinker eine Succinimidester- und Maleimid-Funktion enthält.
12. Enzym-Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass Enzym und Spezifitätsanker in einem Abstand von 2 bis 20 Basenpaaren an die Ziel-DNA gebunden werden, bevorzugt in einem Abstand von 9 bis 13 Basenpaaren.
13. Verfahren zur Herstellung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: a) Umsetzung des Linkers mit dem Spezifitätsanker, wobei eine reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers eine kovalente chemische Bindung eingeht, b) Umsetzung des mit dem Spezifitätsanker verbundenen Linkers mit dem Enzym, wobei eine weitere reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der oberflächlich zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms eine kovalente chemische Bindung eingeht, c) Reinigung des Enzym-Konjugates.
14. Verfahren zur Herstellung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Methyltransferase ist und vor der Durchführung von Schritt b) in Anspruch 9 über PCR-basierte ortsspezi- fische Mutagenese ein oberflächlich zugänglicher Cysteinrest am Enzym eingeführt wird. 48
15. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur in vitro-Klonierung und/oder Charakterisierung von DNA-Fragmenten, die aus mindestens 10.000 Basenpaaren bestehen.
16. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur DNA-Methylierung in vitro.
17. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zum in vitro-Mapping von genomischer DNA.
18. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 deren Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Reagenz zur spezifischen Repression der Expression eines Gens in vivo.
19. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels.
20. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 und 19 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder A- mide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Erkrankungen, die durch die Expression pathogener Gene verursacht werden. 49
21. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 3, 5 bis 12 sowie 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Herbeiführung eines gezielten DNA-Doppelstrangbruches in vivo.
22. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 19 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels, welches die homologe Rekombination und/oder die DNA-Reparatur in vivo stimuliert.
23. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 4 bis 12 sowie 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur spezifischen Methy- lierung von DNA in vivo.
24. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß Anspruch 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur spezifischen Repression von pathogenen Genen in vivo.
25. Verwendung von Enzym-Konjugaten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, 19 und 20 sowie deren pharmazeutisch aktzeptabler Salze, Ester und/oder Amide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie, Diagnose und Prophylaxe von Erkrankungen, bei denen Onkogenprodukte, virale Proteine o- der Vorläuferproteine amyloider Speichererkrankungen produziert werden. 50
26. Pharmazeutisch akzeptable Komposition enthaltend Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 als aktive Komponente und einen physiologisch akzeptablen Trägerstoff.
27. Pharmazeutisch akzeptable Komposition gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie oral, rektal, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathe- kal, intravesikal, topisch, lokal oder als Aerosol verabreicht wird.