WO2006019118A1

WO2006019118A1 - う蝕リスクの判定方法及び判定薬

Info

Publication number: WO2006019118A1
Application number: PCT/JP2005/015017
Authority: WO
Inventors: Kazuo Fukushima; Kiichiro Kobori; Koji Ushizawa
Original assignee: Nihon University; Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Nihon University; Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-17
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2007-02-18
Also published as: JP2007322124A

Abstract

　う蝕の発生程度や発生の危険性を簡便かつ迅速に判定するための方法及び判定薬を提供する。　本発明は、ストレプトコッカス・ソブリヌス由来のＧＴＦ－Ｉに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該ＧＴＦ－Ｉ量を測定することを特徴とするう蝕リスクの判定方法、並びにストレプトコッカス・ソブリヌス由来のＧＴＦ－Ｉに対するモノクローナル抗体及びストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦ－Ｂに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕リスクの判定薬。

Description

明細書

う蝕リスクの判定方法及び判定薬

技術分野

[0001] 本発明は、う蝕リスクの判定方法及び判定薬に関する。

背景技術

[0002] ヒトのう蝕原因菌としては、ストレプトコッカス'ミュータンス（以下、 S. mutansと表記する場合がある）が広く知られており、う蝕は、ストレプトコッカス-ミュータンスが産生するグノレコシルトランスフェラーゼ（以下、「GTFという」）により、口中のショ糖から粘着性 ·非水溶性のグルカンが生成され、これにより当該菌体が歯表面に付着してバイオフイルムを形成し歯垢となり、この歯垢中で種々の口腔内細菌が繁殖して有機酸が産生され、歯表面の pHが低下することによりエナメル質表面に脱灰を招く結果発生すると考えられている。

[0003] 最近になって、ストレプトコッカス 'ソブリヌス（以下、 S. sobrinusと表記する場合がある）が、ストレプトコッカス'ミュータンスよりもヒトのう蝕に強く影響していることが明らかになつて'きた。すなわち、ストレプトコッカス 'ミュータンスはう蝕のなレ、ヒトの口腔内力もも検出されたのに対し、ストレプトコッカス 'ソプリヌスはう蝕の多い患者のみから検出された (非特許文献 1)。

[0004] ストレプトコッカス-ソブリヌスの検出手段としては、発色培地を用いる方法 (特許文献 1等）が一般的である。しかし、この方法では、菌の培養を伴うことから判定までに 3 日〜1週間を必要とした。一方、ストレプトコッカス 'ソブリヌスの乾燥菌体を直接抗原として用レ、て得られた抗ストレプトコッカス ·ソプリヌス抗体を用レ、た診断薬 (特許文献 2及び 3)が報告されている。

非特許文献 1：. J. Dent. Res. 74, Special Issue, IADR Abstracts No.802(1995) 特許文献 1 :特開 2003— 38167号公報

特許文献 2 :特開 2002— 58476号公報

特許文献 3 :特開 2002— 105100号公報

発明の開示

訂正された用紙（規則 91) 発明が解決しょうとする課題

[0005] し力しながら、上記の抗ストレプトコッカス 'ソブリヌス抗体は、菌体全体を抗原として用いていることから、これを利用したう蝕判定法は臨床症状と一致しない。すなわち、ストレプトコッカス .ソブリヌスもストレプトコッカス ·ミュータンス同様に、ダルコシルトランスフエラーゼにより、口中のショ糖から粘着性'非水溶性のグルカンを生成する。そして、これにより当該菌体が歯表面に付着してバイオフィルムを形成し歯垢となり、その歯垢中で種々の口腔内細菌が繁殖して有機酸が産生され、歯表面の pHが低下することによりエナメル質表面に脱灰が生じさせるためう蝕が生じる。菌体全体を抗原として作成した抗体では、このストレプトコッカス ·ソブリヌス特有の特性を認識する抗体とはいえない。

従って、本発明の目的は、う蝕の発生程度や発生の危険性を簡便かつ迅速に判定するための方法及び判定薬を提供することにある。

[0006] そこで本発明者は、ストレプトコッカス 'ソブリヌスによって分泌され、その菌体表面に定着する性質を有する菌体結合性ダルコシルトランスフェラーゼ (以下、 GTFとヽう）のうち、 GTF—Iがストレプトコッカス 'ソブリヌスに特異的であることに着目し、当該 GTF - 1に対するモノクローナル抗体を作成し、これを利用して GTF - 1量を測定すれば、ストレプトコッカス 'ソブリヌスの存在量及びう蝕リスクを正確に判定できることを見出した。さらに本発明者は、当該 GTF— I量と、ストレプトコッカス'ミュータンスに特異的な GTF— B量とを同時に測定すれば、う蝕リスクがより正確に判定できることを見出し、本発明を完成した。

[0007] すなわち、本発明は、ストレプトコッカス 'ソブリヌス由来の GTF— Iに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該 GTF— I量を測定することを特徴とするう蝕リスクの判定方法を提供するものである。

また、本発明は、ストレプトコッカス 'ソブリヌス由来の GTF— Iに対するモノクローナル抗体を含有する試薬、及びストレプトコッカス ·ミュータンス由来の GTF— Bに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて、口腔内の当該 GTF— I量及び GTF B量を測定することを特徴とするう蝕リスクの判定方法を提供するものである。また、本発明は、ストレプトコッカス 'ソブリヌス由来の GTF— Iに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕リスクの判定薬を提供するものである。

さらに本発明は、ストレプトコッカス ·ソブリヌス由来の GTF— Iに対するモノクローナル抗体及びストレプトコッカス ·ミュータンス由来の GTF— Bに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕リスクの判定薬を提供するものである。

発明の効果

[0008] 本発明によれば、う蝕リスクと相関性の高いストレプトコッカス 'ソブリヌス由来の GT F— I量が正確かつ迅速に測定でき、その結果、正確なう蝕リスクの判定が可能となつた。当該 GTF— I量と GTF— B量とを同時に測定することにより、う蝕リスクがさらに正確に判定可能である。

図面の簡単な説明

[0009] [図 1]本発明測定系によるストレプトコッカス ·ソブリヌス由来の GTF— I測定結果を示す検量線である。

[図 2]歯垢中の GTF— Iと DMF—Tとの関係を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0010] 本発明に用いられる GTF—Iに対するモノクローナル抗体は、 GTF—Iを抗原として用いて得られたモノクローナル抗体であればよいが、その抗原としては、菌体表層より収集して精製して得られた GTF—Iでもよいが、組み換え GTF— I (rGTF— I)がより好ましい。ここで rGTF— Iとしては、例えば、岡山大学 '英保 (あぼ）らによって解析されたストレプトコッカス 'ソブリヌス由来の GTF— Iのアミノ酸配列（配列番号 4)をコードする遺伝子配列を用いて製造することができる。この配列番号 4に示す GTF— Iをコードする DNAから rGTF— Iを製造する方法として、 GTF— Iをコードする DNA を含む組み換えベクターを作製し、該ベクターより適当なホスト細胞を形質転換し、その転換体を適当な培地 (M4培地など)で培養して得られる培養物から精製することにより GTF— Iを製造することができる。また、ストレプトコッカス 'ソブリヌスを含む同属由来のもので、 GTF— Iの存在が明らかになつている菌体であれば、いずれの菌種を使っても差し支えない。具体的には、当該 rGTF— Iは、例えば、 Streptococcus anginosusく Zl>SS03E形質転^ ¾を 1%アンモ-ゥム及び M mp—ァミノフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライドを添カ卩した M4培地の 8L中で 37°Cにて 30時間培養した後、培養液を遠心分離して、その上清を回収した。この上清より調製用 S DS— PAGE等で精製することによって製造することができる。これに用いる Strepto coccus anginosusく Zl > SS03E形質転^ ¾は、すでに Shirozaらによって開発 (T. Shirozaら、 Secretion 01 heterologous protein oy genetically engi neered Streptococcus bordomi、 Methods in Cell Science、 1998、 vol. 20、 127— 136)されてヽる口腔連鎖球菌染色体上の外来遺伝子を導入できるインテグレイシヨンーメデイエートトランスフォーメーションシステムを用いてストレプトコッカス ·ソブリヌスの gtfl遺伝子を導入することで酵素学的に活性な GTF - 1を発現 · 分泌させることができるものである。調製された精製 rGTF— Iの濃度は、 SDS— PA GEで 1本の均一なバンドとして認識され、その濃度は lmgZmLである。

[0011] モノクローナル抗体の製造は、実験医学 (別冊)細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第 66〜第 74頁、 1992年)及び単クローン抗体実験操作入門 (安東民衛ら著作、講談社発行、 1991年)等に記載されているようなモノクローナル抗体の一般的な製造方法によって行うことができる。すなわち、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞 (ミエローマ細胞)からハイプリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。

本発明のう蝕リスクの判定方法及び判定薬に用いられるモノクローナル抗体の好ま LV、製造例を示せば以下の通りである。

[0012] 抗体産生細胞の取得は、抗原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット又はゥサギ等の哺乳動物 (ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジエニック動物も含む）、好ましくはマウス、ラット又はハムスターの皮下、筋肉内、静脈内、フットパッド内あるいは腹腔内に 1〜数回注射することにより免疫感作を施し、通常、初回免疫から約 1〜14日毎に 1〜4回免疫を行い、最終免疫より約 1〜5日後に脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓を摘出すること〖こより行われる。

[0013] モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（ネイチヤー（Nature)、第 256卷、第 495〜第 497頁、 1975年）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる力抗体産生細胞と、マウス、ラット、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合することにより調製される。ミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ P3ZX63—Ag8. 6 53、 P3ZNS1Z1— Ag4— 1、 P3/X63-Ag8. Ul (P3U1) , Sp2/0-Agl4, PA1、 FOある!/ヽ ίま BW5147、ラット由来ミエローマ 210RCY3— Agl. 2. 3. 、ヒト由来ミエローマ U— 266AR1、 GM1500— 6TG— A1— 2、 UC729— 6、 CEM— AG R、 D1R11あるいは CEM— T15等を使用することができる。

[0014] ハイプリドーマのスクリーニングは、ハイプリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたゥエルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、 RIAや ELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。

[0015] また、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローユングする方法は、通常の方法に従えばよい。例えば限外希釈法、軟寒天法、フイブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができる。

[0016] ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイプリドーマの培養をインビト口又はインビボ（マウス、ラット、モルモット、ハムスター若しくはゥサギ等の腹水中等）で行い、得られた培養上清又は哺乳動物の腹水力単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイプリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地カゝら誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。基本培地としては、例えば、 Ham' s F12培地、 MCDB153培地あるいは低カルシウム MEM培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D— MEM培地、 RPMI1640培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシゥム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイト力イン及び Z又は種々の無機若しくは有機物質等を含有することができる。 [0017] モノクローナル抗体の単離及び精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモ-ゥム、ユーグロブリン沈殿法、力プロイン酸法、力プリル酸法、イオン交換ク口マトグラフィー（DEAE又は DE52等）、抗ィムノグロブリンカラム又はプロテイン A力ラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。

[0018] 採取したモノクローナル抗体が目的とするモノクローナル抗体であることの確認は、例えば精製 GTF— Iに対する反応性を ELISA等の酵素免疫測定法によって測定すること〖こより行うことができる。

[0019] 本発明で用いられる抗 GTF— Iモノクローナル抗体としては、ハイプリドーマ # 5A( FERM BP— 10386)が産生するモノクローナル抗体が特に好ましい。このモノクローナル抗体は、本発明者らが先に報告した抗 GTF— Iモノクローナル抗体 B17 (FE MS Immunology and Medical Microbiology, 27 (2000) , 9— 15)に比べて 2. 8-25. 6倍 GTF— Iとの反応性が高ぐ特に好ましい。このハイプリドーマ # 5 Aは、 FERM BP— 10386として、〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1—1 1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

[0020] 一方、ポリクローナル抗体の調製は、常法に従って行うことができる。すなわち、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ブタ又はゥシ等の哺乳動物、好ましくはラット、モルモット、ゥサギ又はャギに、精製 GTF— Iを、前述モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫することにより抗 GTF— I抗体を含む血清を得ることができるまた、本発明のポリクローナル抗体は、上述の哺乳動物由来の抗血清を、飽和硫酸アンモ-ゥム、ユーグロブリン沈殿法、力プロイン酸法、力プリル酸法、イオン交換ク口マトグラフィー（DEAE又は DE52等）、抗ィムノグロブリンカラム又はプロテイン A力ラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により単離及び精製した抗体であることが好ましい。

[0021] 採取したポリクローナル抗体が目的とするポリクローナル抗体であることの確認は、前述の哺乳動物の免疫感作で用いた精製 GTF— I等に対する反応性を、 RIAや EL ISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。 [0022] 上記で得られた抗体を用い、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオィムノアツセィ、フルォロイムノアツセィ、ィムノクロマトアツセィ、光学免疫測定法等の免疫学的測定法を用いることにより菌体表面上の GTF— I量を測定することができる。また、 GTF—Iはストレプトコッカス 'ソブリヌスの菌体表面に定着する不溶性酵素であるため、後記実施例に示すように GTF— I量を測定することにより同時にストレプトコッカス .ソブリヌスの検出及び該菌の菌濃度を測定することが可能となる。一方、必要に応じて、膜蛋白質可溶ィ匕に有効な界面活性剤を用い、その種類や濃度をコントロールすることで、菌体表面に定着している GTF— Iを遊離させることができ、 GTF— Iのみを測定することも可能である。

[0023] 本発明のう蝕リスクの判定方法及び判定薬にお!ヽて使用される好まヽ免疫測定法の一つとして、競合免疫測定法が挙げられる。

すなわち、検体に放射性同位体等で標識した GTF—Iを一定量混合し、更に抗 G TF I抗体を混合し検体中の GTF— I及び標識 GTF— Iと反応させる。検体中の GT F— Iは、標識 GTF— Iと競合して抗 GTF— I抗体と反応するため、検体中に GTF— I が存在する分、標識 GTF— Iとの反応が減少する。反応後、抗 GTF— I抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗ィムノグロブリン抗体、プロテイン Aと抗 GTF— I抗体を反応させることにより、結合、非標識 GTF— Iを分離する。一般に用いられる方法により結合して、なヽ分画を測定することが可能となる。

[0024] また、、わゆるサンドイッチ系の測定も好適である。すなわち、抗 GTF—I抗体を、マイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる担体に結合させ、これを検体と接触させることにより、検体中の菌体表面 GTF— Iを担体上にある抗 GTF— I抗体と反応させる。一般に用ヽられて!、る方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ピオチン等で標識した抗 GTF— I抗体と接触させ、担体上にある抗 GTF— I抗体と結合した菌体表面 GTF— Iと反応させる。一般に用いられて、る方法により結合して、な、分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ピオチン等を検出することにより菌体表面 GTF— I量を測定することが可能となる。また、金コロイドのような視覚的に判定可能な物質を前述の抗体の一つに標識をして、上述のサンドイッチ系又は競合法に応用し、判定することも可能である。

[0025] この測定系に用いる抗 GTF— I抗体、標識抗 GTF— I抗体は、前述したようにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその組み合わせのいずれを用いることも可能である。ここで肝要なことは、担体に結合する抗体と GTF— Iとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わせることである。

[0026] 本発明においては、 GTF—Iを認識するモノクローナル抗体をプラスチックプレートに固定ィ匕し、 2次抗体に GTF—Iに対するポリクローナル抗体、 3次抗体にペルォキシダーゼ標識した 2次抗体に対する抗体を用いた ELISA法が特に好ま、。当該好ましい態様において、抗体の作成に使用する動物種は、抗体の組合せを考慮して適宜選択可能である。従って、本発明のう蝕リスクの判定薬は、これらの抗 GTF— I抗体、標識抗体及び検出試薬等を含有した酵素免疫測定試薬である場合が好まし、

[0027] また、凝集検定も有利な実施形態であり、前述の抗体の一方で被覆された粒子と、他の抗体で被覆された粒子を作製し、検出すべき物質への粒子の結合により、凝集が起こり、これは濁り変化により判定あるいは検出することができる。

[0028] 尚、以上の測定法においては、抗 GTF— I抗体のみならず、ペプシン、パパイン等で処理した抗体フラグメント (Fab，又は F (ab，））を使用することもできる。

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[0029] 本発明における被検試料としては、唾液又は歯垢が好ましい。

[0030] 本発明においては、 GTF— Iだけでなく GTF— Bを同時に測定するの力う蝕リスクをより正確に判定するうえで好ましい。 GTF— Bの測定には、抗 GTF— B抗体、特に抗 GTF— Bモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

[0031] 本発明で用いられる抗 GTF— Bモノクローナル抗体の好ましい具体例としては、特開 2002— 267673号公報記載の GTF - Bのデキストラン結合部位 (配列番号 3)を認識するモノクローナル抗体として寄託番号 FERM BP— 10397であるハイブリド一マ MHP 126により産生されるモノクローナル抗体、 GTF - Bの N末端側活性部位 (配列番号 2)を認識するモノクローナル抗体として寄託番号 FERM BP- 10398 であるハイプリドーマ MHP136により産生されるモノクローナル抗体等が挙げられる。なお、配列番号 1は、 GTF— Bのアミノ酸配列である。これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

[0032] また、 GTF— Bモノクローナル抗体は、 GTF— B等に特異的に反応し、ストレブトコッカス'ミュータンスが産生する GTF— D及び GTF— Cに反応しないという性質を併せ持つことが好ましい。

[0033] 斯カるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、それぞれを単独で用いてもよいが、複数の抗体を組み合わせて用いることもでき、特に、 GTF—Bのデキストラン結合部位 (配列番号 3)を認識するモノクローナル抗体と GTF— Bの N末端側活性部位 (配列番号 2)を認識するモノクローナル抗体及び GTF— Bに対するポリクローナル抗体を組合せて用いることが好ましヽ。

これらの抗 GTF - B抗体を用いる測定系も、前記抗 GTF - 1抗体を用いることができる測定系として記載した測定系をすベて用いることができる。このうち、 ELISAが特に好ましい。

[0034] 斯カる方法により、無う蝕 (正常)者及び高う蝕者の唾液中の GTF— I量を測定したところ、後記実施例に示すように総菌濃度あたりの GTF-I濃度及び GTF— Iを分泌する菌濃度は、高う蝕者のものが無う蝕者のものより高い結果となり、 GTF— I濃度及び GTF— Iを分泌する菌濃度はう蝕の程度と有意に相関することが示された。従って、口腔中の GTF— I量は、う蝕の程度を把握するための指標となり、これを測定することによりう蝕リスクを判定することができ、また抗 GTF— I抗体を含有する GTF— I量の測定試薬は、う蝕リスクの判定薬として用いることができる。また、上記の結果に、さらに、抗 GTF— B抗体を用いる GTF— Bの測定結果を組み合せると、よりう蝕リスクの高い患者が正確に判定できる。従って、口腔中の GTF— I量と GTF— B量を測定することは、より正確にう蝕の程度を把握するための指標となり、これらを測定することによりう蝕リスクをより正確に判定できる。

実施例

[0035] 次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

[0036] 実施例 1 サンドイッチ ELISAによるソブリヌス菌ダルコシルトランスフェラーゼ（GTF I)の定量法

< 1 1 >免疫抗原 GTF— Iの調整

免疫原としての GTF— I酵素蛋白は、 Streptococcus anginosus< /I > SS03 E形質転^ ¾を 1%アンモ-ゥム及び 10 μ M mp ァミノフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライドを添カ卩した M4培地の 8L中で 37°Cにて 30時間培養した後、培養液を遠心分離 (8, 000rpm、 lOmin)して、その培養上清を回収した。この上清より調製用 S DS— PAGEで精製し、 rGTF - 1の純化標品を取得した。

< 1 2 >免疫及び細胞融合

(i)免疫動物からの脾臓細胞の調整

免疫方法は 8〜10週令の BALBZcマウスの皮下に、精製 GTF— Iを適当なアジュバンド、フロインドアジュバンド、 RPMI— 1640とともに注射することにより初回免疫した。初回免疫から 14、 28、 42日目に精製 GTF— Iを皮下に注射することにより追カロ免疫し、さらにモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ調製の前々日及び前日に同様にして免疫し、マウス力脾臓細胞を調製した。

(ii)マウスミエローマ細胞の調製

8 ァザグァニン而性マウスミエローマ細胞（P3U1)を正常培地「： RPMI— 1640にグルタミン 1. 5mM及び牛胎児血清 13%を加えた培地」に培養（37°C、 CO、 5%通

2 気）し、 4日後に 2 X 10⁷以上の細胞を得た。

(iii)ハイプリドーマの作製

RPMI- 1640 (日本製薬社 (製) )でよく洗浄した免疫マウス脾臓細胞 1 X 10⁸個とマウス骨髄細胞 2 X 10⁷個とを混合し、 1500rpmで 5分間遠心分離した。

沈殿として得られた脾臓細胞と P3U1ミエローマ細胞の混合した細胞群をほぐした後、攪拌しながら 50%ポリエチレングリコール、 10%DMSO溶液をカ卩え、 RPMI— 1 640を徐々にカロえる。遠心後、集めて細胞を HAT培地（RPMI— 1640にヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンをカ卩えた培地）をカ卩え、細胞を懸濁し、 COインキュべ

2

一ター 37°C中で 2時間培養する。再度遠心後、上清を捨て、細胞をゆるやかにほぐし、 HAT培地に懸濁し、 96穴プレートに分注し、 5%COインキュベーターで 10〜1

2

4日間培養する。 [0038] < 1 3 >ハイブリドーマのスクリーニング

抗 rGTF— Iモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングは、精製 rGTF— Iを固相化した ELISAを用いて行った。すなわち、精製 rGTF— Iを 2 gZ mLの濃度に調整後、 96穴 EIAプレートに 50 LZ穴ずつ分注し、室温で固相化した。 2時間後、 Tween20及び NaCl及びリン酸緩衝液でブロッキングを行った。一次抗体として上記ノ、イブリドーマ培養上清を 96穴に移し、 4°C一晩放置した。その後、二次抗体としてャギの抗マウス IgG— POD結合物を分注し、室温で一時間反応させた。反応後、同緩衝液にて 2回洗浄し、 OPD基質液 (o フエ-レンジァミンに過酸化水素を添加した溶液)を分注し発色させ、 1Nの硫酸で反応を停止させる。プレートリーダーにより吸光度を主波長 492nm、副波長 620nmにて測定する。抗 rGTF— I モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが認められたゥエルについて、限界希釈法によりクローユングを 2から 4回繰り返し、安定して抗体産生の認められたものを、抗 GTF— Iモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株 # 1B、 # 1G、 # 3E、 # 5Aとして選択した。

[0039] < 1 4 >モノクローナル抗体の大量調製

プリスタン処理（2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン 0. 5mLZ匹を腹腔内投与し、 1〜2週間飼育する。）した 10週令マウス（BALBZc)に上記のハイプリドーマ株各 I X 10⁶個細胞 Z匹を腹腔内注射する。 10〜21日後にハイプリドーマ株は腹水癌化する。 10〜21日後に腹水のたまったマウス力も腹水 (4〜： LOmLZ匹）を採取し、遠心分離して固形分を除去した。上清を 50%硫安塩析後、 150mMの NaCl及び 20mMリン酸緩衝液 (pH7. 4)で一晩透析し、これを粗精製モノクローナル抗体とする。

[0040] < 1 5 >抗0丁？ Iポリクローナル抗体の調製

粗精製 GTF— Iの 100 μ gとフロインドの完全アジュバンド（Freud' s Complete adjuvant, Sigma社 (製)）を等量混合し、ゥサギ四肢及び背中の皮膚数十ケ所に注射して免疫した。 2力月〜 3力月の間に 5〜6回同様に投与した。最終投与 2週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。血清を 50%硫安塩析後、 150mMの NaCl 及び 20mMリン酸緩衝液 (pH7. 4)で一晩透析し、これを粗精製ポリクローナル抗体とする。

[0041] < 1 6 >モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製

前記く 1—3 >で取得したモノクローナル抗体 # 1B、 # 1G、 # 3E、 # 5A各々の粗精製モノクローナル抗体、及び前記く 1 4>で取得した粗精製ポリクローナル抗体に、 MAPSII結合バッファー (バイオラッド社 (製)）を等量カ卩え、フィルター（ミリポア社 (製)）で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液を HiTrap Protein Aァフィ-ティ一力ラム（フアルマシアバイオテック社 (製））に添カ卩した。 MAPSII結合バッファー（バィォラッド社 (製)）で洗浄後、 MAPSII溶出ノッファー (バイオラッド社 (製)）で溶出させた（3mLZチューブ， 10本)。溶出パターンを波長 280nmでの吸光度で測定し、該溶出パターンに従い、抗体を含む分画を回収した。

[0042] < 1 - 7 >固相化抗体の作製

150mMの NaClを含む 20mMリン酸緩衝液（pH7. 4、以下 PBSという）に前記で調製した精製モノクローナル抗体 # 1B、 # 1G、 # 3E、 # 5A及び精製ポリクローナル抗体を 10 μ gZmLの濃度で調製後、 96穴 EIAプレートに 50 μ LZ穴ずつ分注し、室温で 2時間放置し抗原をプレートに固相化した。 0. 05%の Tween20を含む PB S (以下、 T—PBSという）で 2回洗浄後、 1%の83八を含む丁ー？83を350 1^/穴ずつ分注し、室温で 1時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。内容物を除去後、 1%の BSA及び 10%のシユークロースを含む T—PBSを 350 μ L/穴ずつ分注した。室温で 1時間放置後、内容物を除去し自然乾燥させた。

[0043] < 1 8 >モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製のペルォキシダーゼ標識

5mMの酢酸ナトリウム緩衝液（ρΗ4. 5)にペルォキシダーゼ（以下、 HRPという）を lOmgZmLの濃度で溶解した溶液に、メタ過よう酸ナトリウムを蒸留水で lOOmgZ mLの濃度で溶解した溶液を、 HRP :メタ過よう酸ナトリウム = lmg : 0. 43mgの比で加え、暗所、室温で 30分間反応させた。ついで反応液を 5mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH4. 5)で平衡化したセフアデックス G— 25ゲル（1. 5 X 30cm;フアルマシアバィテック社 (製)）のカラムに添加して、活性ィ匕 HRP画分を回収した。次に精製 # 1B、 # 1G、 # 3E、 # 5Aモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を 0. 1Mの重炭酸ナトリウム緩衝液 (pH9. 3)で一晩透析した溶液に、活性ィ匕 HRP画分を重量比 1 : 1 で混合し、暗所、室温で 1時間反応させた。反応後、テトラヒドロホウ酸ナトリウムを蒸留水で 2mgZmLの濃度で溶解した溶液を、反応液 500 μ Lに対して 10 μ Lで混合し、暗所、室温で 15分間反応させた。反応後、等量の飽和硫安を加え、氷上で 1時間放置した。 12000rpmで 10分間遠心分離後、上清を除去して HRP標識抗体を回収し、 PBSに懸濁した。波長 280nmでの吸光度を測定し、吸光度を用い以下の試験を行なった。

[0044] く 1 9 >モノクローナル抗体の選択

前記く 1— 7>で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体 # 1B、 # 1G、 # 3E、 # 5A及びポリクローナル抗体（以下、固相化マイクロプレートという）を用いる。固相化マイクロプレートの各ゥヱルに 0. 2%の BSAを含む T PBSで希釈した測定試料（ 50 μ L、ストレプトコッカス ·ソブリヌス菌 (Streptococcus sobrinus)菌体を生理食塩水で懸濁した溶液）を加え、室温で 2時間インキュベートした。固相化マイクロプレートを T—PBSで 2回洗浄後、 0. 2%の BSAを含む T—PBSで希釈した前述く 1 8 >で作製したペルォキシダーゼ標識モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を 4mODに希釈した溶液を 50 L/穴ずつ分注し、室温で 1時間インキュベートした。固相化マイクロプレートを T—PBSで 2回洗浄後、 OPD基質液（o フエ-レンジアミン 2塩酸塩 60mgをクェン酸'リン酸緩衝液 (pH5. 2) 20mLに溶かした溶液に、 30 %の過酸化水素 20 μ Lをカ卩えた溶液）を 50 μ LZ穴ずつ分注し発色後、 1Nの硫酸溶液を 50 LZ穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長 492nm、副波長 620nmで測定し、測定中の菌体量は、ストレプトコッカス 'ソブリヌス菌由来標準物質力作製した検量線力求めた。この中より、特異性が最も優れて、た # 5A抗体とポリクローナル抗体の組み合わせを選択した (表 1)。

[0045] [表 1]

* 標識抗体はポリクローナル抗体 [0046] ウェスタンブロッテイングにより、 # 5A抗体及び本発明者が先に作成した抗 GTF— Iモノクローナル抗体である B17抗体の rGTF—Iに対する反応性を検討した。その結果、 B17抗体の 100倍希釈と # 5A抗体の 1280〜2560倍希釈の反応性がほぼ同等であり、 # 5A抗体は B17抗体の 12. 8〜25. 6倍 GTF— Iに対する反応性が高いことが判明した。

[0047] く 1 10 >サンドイッチ ELIS A

本発明で確立されたサンドイッチ ELISAによる GTF— I定量法はく 1 9 >で選択された # 5Aを用いたく 1 9 >で示した方法である。

GTF— I酵素量は、上述の測定方法において、測定試料を 0. 5N NaOHで抽出することにより定量することができた。検量線を図 1に示す。

[0048] 実施例 2 サンドイッチ ELISAによるソブリヌス菌ダルコシルトランスフェラーゼ（GTF

I)の定量及びう蝕リスク判定

DMF— Tとは、永久歯の一人当たりの虫歯罹患経験歯数を言い、 D ; Decayed t eethの略（未処置のムシ歯）、 M ;Missing teethの略（喪失歯）、 F;Filled teeth の略（治療済みの歯）、 T;Teethの略である。 DMF—Tが 15以上のヒトを高う蝕者（ H)と定義する。

この検体 2種を用、て GTF— I量との関係を確認した。

[0049] (1)方法

実検体を用いたストレプトコッカス 'ソブリヌスからの菌体結合性 GTF— I抽出の検討を行い、実検体 (被検者 A及び Bから採取した歯垢懸濁液)を、 0. 5N NaOHの条件で抽出して、検量線カゝら GTF-I濃度を計算した。

すなわち、 2mLの歯垢懸濁液を遠心（10, OOOrpm, 5min)し、沈殿に 0. 5N Na OHを 50 L添カ卩して、 1分間放置した。 100 /z Lの中和液を添カ卩したものを遠心（1 0, OOOrpm, 5min)し、 150 の上清（1)を得た。他方、再度沈殿に、 50 の0 . 5N NaOHを添カ卩して（再抽出）、 1分間放置した。 100 Lの中和液を添カ卩した後、再度遠心（10, OOOrpm, 5min)し、 150 Lの上清（2)を得た。上清（1)と（2) を混合して、約 300 μ Lを ELISA用の検体とした。この検体 50 μ Lを ELISAに用いて、検量線 (0. 5Ν NaOH)から、 GTF— I濃度を計算した。表 2には、 DMF-T、ストレプトコッカス 'ソブリヌス数の比較と精製 GTF— I標準物力も作製した検量線から求めた GTF— I量の結果の比較を示した。また図 2にそれらを図式ィ匕したものを示した。

[0050] [表 2]

[0051] 実施例 3 GTF— Bとの組み合わせによるう蝕度判定

虫歯罹患経験歯数、 S. mutans及び S. sobrinus菌数既知のブラッシング歯垢 0. 3mLを 0. 5N NaClで抽出し、 GTF— I及び GTF— Bの両 ELISA試薬で測定を行い、発色の有無及び強弱を + ·—で評価した。なお、 GTF— B ELISA試薬は、以下のように作製した試薬を用いた。すなわち、実施例 1のく 1—10>サンドイッチ EL IS Aの項で示した固相化抗体で使用して、る # 5 Aの抗体の替わりに抗 GTF— B抗体である # 136あるいは # 126 (特開 2002— 267673号公報記載の寄託番号 FER M BP— 10398あるいは FERM BP— 10397であるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体)を用いて、 GTF—I定量法と同様な処方の試薬を作成した。表 3には、抗 GTF—Bモノクローナル抗体として # 136を用いた場合の結果を示した力 # 126でも同様の結果を得た。

[0052] [表 3] 被験者虫 *罹患経験齒数ブラッシング歯垢中の菌数ブラッシング歯垢の E L I S A反応性 (DMFT) ( 10⁵CFU/mL)

S. mu t ans S. sobr i nus GTF-B試薬 GTF-I試薬

a 3 1 8 1 9 2 + + + + b 3 4 1 4 4 + + +

c 高 1 9 8 0 + + +

d 低 6 5 2 3 + +

e 低 4 9 0 + +

f 低 1 2 0 +

g 6 0 +

h 無 0 . 2 0 ― j 無 0 0

D M F T 高： 1 0本以上、低： 1〜9 τ| ∑、無： 0本上記の結果、虫歯罹患経験歯数と S. mutans及び S. sobrinus菌数並びに GTF I及び GTF— Bの両 ELISA試薬で測定との間に相関があり、特に菌数を測定しなくても本 GTF酵素を測定することで、う蝕度の判定が可能であった。

Claims

請求の範囲

[I] ストレプトコッカス ·ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて口腔内の当該ダルコシルトランスフェラーゼ I量を測定することを特徴とするう蝕リスクの判定方法。

[2] 前記モノクローナル抗体が、寄託番号 FERM BP— 10386であるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項 1記載の判定方法。

[3] 前記試薬が、前記モノクローナル抗体及びストレプトコッカス 'ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するポリクローナル抗体を含有するものである請求項 1又は 2記載の判定方法。

[4] 唾液又は歯垢を被検体とする請求項 1〜3の!ヽずれか 1項記載の判定方法。

[5] ストレプトコッカス'ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するモノクローナル抗体を含有する試薬、及びストレプトコッカス'ミュータンス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Bに対するモノクローナル抗体を含有する試薬を用いて、口腔内の当該ダルコシルトランスフェラーゼ I量及びダルコシルトランスフェラーゼ B量を測定することを特徴とするう蝕リスクの判定方法。

[6] 前記モノクローナル抗体が、寄託番号 FERM BP— 10386であるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項 5記載の判定方法。

[7] 前記試薬が、前記モノクローナル抗体及びストレプトコッカス 'ソブリヌス由来のグルコシルトランスフェラーゼ Iに対するポリクローナル抗体を含有するものである請求項 5又は 6記載の判定方法。

[8] 唾液又は歯垢を被検体とする請求項 5〜7の!ヽずれか 1項記載の判定方法。

[9] ストレプトコッカス'ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕リスクの判定薬。

[10] 前記モノクローナル抗体が、寄託番号 FERM BP— 10386であるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である請求項 9記載の判定薬。

[II] さらに、ストレプトコッカス 'ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するポリクローナル抗体を含有するものである請求項 9又は 10記載の判定薬。

[12] ストレプトコッカス'ソブリヌス由来のダルコシルトランスフェラーゼ Iに対するモノクロナル抗体及びストレプトコッカス'ミュータンス由来のダルコシルトランスフェラ Bに対するモノクローナル抗体を含有するう蝕リスクの判定薬。