WO2006019095A1

WO2006019095A1 - 新規ウレタナーゼ遺伝子

Info

Publication number: WO2006019095A1
Application number: PCT/JP2005/014950
Authority: WO
Inventors: Toshiaki Kambe; Yukie Shigeno
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2004-08-17
Filing date: 2005-08-16
Publication date: 2006-02-23
Also published as: JP2006055005A

Abstract

　本発明は、新規ウレタナーゼをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを組み込んだ宿主細胞にウレタン化合物分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法に関する。さらに本発明は、新規ウレタナーゼを発現している宿主細胞を利用したウレタン化合物の分解方法に関する。本発明によりウレタナーゼの遺伝子が得られ、大腸菌での発現系が確立されたことから、タンパク質工学的改変によって分解性を付与することにより、ポリウレタンの酵素的モノマーリサイクルに応用できる。

Description

新規ウレタナーゼ遺伝子

技術分野

[0001] 本発明は、新規ウレタンィ匕合物分解活性 (ウレタン結合分解活性)を有するポリべプチド、すなわち新規なウレタナーゼをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによりコードされるウレタナーゼ、前記ポリヌクレオチドを^ aみ込んだ宿主細胞にウレタン化合物分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。さらに本発明は、新規ウレタナーゼを発現している宿主細胞を利用したウレタンィ匕合物の分解方法に関する。

背景技術

[0002] ポリウレタンはその優れた性質力もさまざまな分野で利用されている。しかしその一方で廃棄量も年々増加し、高い燃焼熱による焼却炉の損傷や埋立地の飽和等、深刻な環境問題を起こしている。これらの廃棄物の対策として、低コスト、かつ省エネルギー型プロセスである微生物分解 ·酵素分解が注目されている。ポリウレタンを酵素によってモノマーに分解できれば、これを回収、再合成することにより一次生産品と全く同等のポリウレタンを作ることができ、リサイクルへの道が開ける。

[0003] ポリウレタンの生分解性については、これまで微生物や生体内酵素による劣化という面での研究が主体であり、いかに生分解を防止するかが主要なテーマであった。そのため、ポリウレタン分解微生物自身やその分解酵素についての研究は進んでいない。

[0004] ポリウレタンの分解は、ウレタン結合の分解と、ポリオール部分の分解とに大別される。このうちウレタン結合はすべてのポリウレタンに共通に存在する結合である。しかし、ポリウレタン中のウレタン結合の分解に関する知見はほとんどない。微生物分解に伴って、ウレタン結合が加水分解を受けているという報告はいくつかあるが（B. Jans en et al, Zentralbl BakterioL, 276, 36(1991)、 R. T. Darby and A. M. Kaplan, Appl. Microbiol, 16, 900(1968))、ウレタン結合の切断と微生物またはその酵素との因果関係は明らかでない。 [0005] 尚、ポリエステル型のポリウレタン分解菌としては、ベ-バチルスアミロリチカス TB— 13株（特願平 2002- 334162)およびコマモナスァシドボランス (Comamonas acidovora ns) TB— 35株 (T.Nakajima— KamDe'F.Onuma'N.Kimpara and T.Nakahara.Isolation a nd characterization of a bacterium which utilizes polyester polyurethane as a sole ca rbon and nitrogen source. FEMS Microbiology Letters, Vol. 129,39- 42,1995)力 S知られているが、これらの分解菌はウレタン中のエステル結合は分解するものの、ウレタン結合はほとんど分解しない。

[0006] 一方、低分子のウレタンィ匕合物が微生物によって分解されることはすでに報告されているが、その分解はウレタナーゼによるものではなくエステラーゼによるものであることが知られている。そして、そのほとんどは酒類の品種改良や力ルバメート系農薬の分解浄ィヒに関するものであり（特開平 01-300892、特開平 01-240179、特開平 02-1 28689、特開平 03-175985、特開平 04-104784、特開平 04-325079)、ポリウレタンの分解に利用できる技術ではない。ポリウレタン原料となりうる物質の分解菌としてはカビによるものが報告されているが（特開平 09-192633)、大量培養が容易な細菌によるものはなぐその分解酵素は特定されていない。

[0007] またポリウレタンのような非天然物の高分子を高効率で分解する場合に、天然型の酵素をそのまま使用するよりは、遺伝子工学的な改変や、大腸菌等による大量発現形を利用した方が好ましい。このため、ウレタナーゼ遺伝子の取得も必要とされていた。

発明の開示

[0008] 本発明は、ウレタンィ匕合物中のウレタン結合を分解することのできる新規ウレタナーゼをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによりコードされるウレタナーゼ、前記ポリヌクレオチドを組み込んだ宿主細胞にウレタナーゼを発現させ、該酵素を精製取得する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、新規ウレタナーゼを発現している宿主細胞を利用したウレタン化合物の分解方法を提供することを目的とする。

[0009] この問題を解決するため、本発明者らは、ポリウレタン合成原料として用いられる芳香族'脂肪族イソシァネートと一価アルコール力合成した低分子量ウレタン結合含有ィ匕合物を用いて、各種土壌を分離源として微生物のスクリーングを行い、当該化合物を高効率で分解することができるグラム陽性菌ロドコッカスェクイ（Rhodococcus e qui ) TB-60株を見出し、既に特許出願している（特願平 2003-055421)。さらに本発明者らは、ロドコッカスェクイ TB— 60株が生産するウレタナーゼを精製しその諸性質について詳細に検討を行い、そのウレタナーゼがポリウレタン合成原料として用いられる芳香族系のみならず脂肪族系化合物に対しても、ウレタン結合切断活性を有することを見出し、既に特許出願している（特願平 2004-58475)。

[0010] 本発明は、前記ウレタナーゼをコードするポリヌクレオチド、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチドである。

[0011] 本発明は、配列番号 2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号 2のヌクレオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチドである。

本発明は、また、配列番号 1に示すペプチド配列、または前記ペプチド配列に 1ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列を含む酵素ウレタナーゼである。

[0012] さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドを組み込んだ宿主細胞にウレタンィ匕合物分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。

[0013] さらに本発明は、新規ウレタナーゼを発現している宿主細胞を利用したウレタンィ匕合物の分解方法である。

[0014] 尚、本明細書では、「ウレタン化合物分解活性を有するポリペプチド」、および「ウレタナーゼ」を同義で用いており、ウレタンィ匕合物中のウレタン結合を分解することができる酵素のことである。また、本明細書でいう「ウレタンィ匕合物」とは、ウレタン結合を有する化合物をいい、いずれの分子量の化合物も含まれる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]図 1は、ロドコッカスェクイ TB60株由来のウレタナーゼ遺伝子のクローユング手順を示す。

[図 2]図 2は、ロドコッカスェクイ TB60株の菌体からの全 DNAの抽出方法を示す。

[図 3]図 3は、 PCR条件を示す。

[図 4]図 4は、塩基配列解析の結果であり、得られたプラスミド pURE9中の 4.2 kbpの断片は、目的ウレタナーゼ遺伝子の前半部分をコードしていることを示す。

[図 5]図 5は、ウレタナーゼ遺伝子 ORFの全塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

[図 6]図 6は、 PCRの条件を示す。

[図 7]図 7は、 E. coliを宿主とした発現の手順を示す。

[図 8]図 8は、精製酵素の SDS-PAGEを示す。得られた酵素は、 TB60株由来のウレタナーゼと同等の分子量を示した。

[図 9]図 9は、ウレタン分解活性の確認試験での分解産物の GC-MS分析条件およびその分析結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0016] ウレタナーゼをコードするポリヌクレオチド

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号 1のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列力もなるポリヌクレオチドである。ここで、配列番号 1のアミノ酸配列力なるポリペプチドは、ロドコッカスェクイ TB— 60株（ 2004年 1月 24日付けでドイツの特許生物寄託機関である DSMZに寄託されたロドコッカスェクイ TB— 60株（DSMZ 16175) )が生産するウレタナーゼである。

[0017] 本発明のポリヌクレオチドの一態様である配列番号 2のヌクレオチド配列力もなるポリヌクレオチドは、ロドコッカスェクイ TB- 60株のゲノム DNA、およびロドコッカスェクイ TB-60株の有するウレタナーゼの N末端アミノ酸配列等のアミノ酸配列に基づヽて調製したプローブを用いて、ハイブリダィゼーシヨンおよびクロー-ング工程等を経て得られた。当業者は、当業者に周知な方法、すなわち、配列番号 2のヌクレオチド配列の開示に基づいて適切なプローブを調製し、ロドコッカスェクイ TB-60株のゲノム DNA力も本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。

[0018] 本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレォチドコドンによって 1つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。力べして、配列番号 1 に示すアミノ酸配列を含むウレタナーゼをコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。

[0019] 配列番号 2に示したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号 2に示したポリヌクレオチドの相補配列に高度にストリンジェントな条件下で [たとえば 0. 5M N aHPO、 7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 ImM EDTA中、 65°Cでフィルター

4

結合 DNAにハイブリダィゼーシヨン、そして 0. 1 X SSC/0. 1% SDS中、 68°Cで洗净（Ausubel'F.M. et al.編, 1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Gre en Publishing Associates社，および John Wily & Sons社，ニューヨーク ,p.2.10.3) ]ノヽイブリダィズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同様のウレタナーゼ活性を有する限り、それらのポリヌクレォチドも、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号 2に示したポリヌクレオチドの相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で [たとえば 0. 2 X SSC/0. 1 % SD S中、 42°Cで洗浄 (Ausubel,et al., 1989,前掲）]ハイブリダィズするポリヌクレオチドにより、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同様のウレタナーゼ活性を有する限り、それらのポリヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。遺伝子組み換え技術によれば、基本となるポリヌクレオチドの特定の部位に、当該ポリヌクレオチドの基本的な特性を変化させることなぐあるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行うことにより、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号 2に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号 2に示す配列において、 20個以下、好ましくは 10個以下、更に好ましくは 5個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号 2に示す塩基配列とは、 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えば BLAST (Ba sic Local Alignment Search Tool)検索を用いることにより行うことができる。；)。その様なポリヌクレオチドも、ウレタナーゼ活性を有すると!、う特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。

遣伝子組換え細朐によりウレタナーゼの生産遺伝子組換え細胞によりウレタナーゼを生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え微生物を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターは RNAまたは DNA何れ力原核生物または真核生物何れかであり得る力典型的にはウィルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント (例えば、プラスミド）として発現させることができる力、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフエタトして組換え細胞を形成させる。トランスフエタトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類 (例えば酵母)を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等を含めた、ウレタナーゼの発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、ウレタナーゼを含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。

本発明のポリヌクレオチド配列を^ aみ込んだ宿主細胞からのウレタナーゼの分離' 精製は、通常細胞力の蛋白質の分離 *精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによるウレタナーゼの生産では、組み換え型酵素の C末端に His— tagを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリブラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素は C末端に His— tagを有して V、るため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。

ウレタナーゼ

本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞力得られるウレタナーゼの一態様は、配列番号 1のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 [0022] 他の態様は、配列番号 1に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号 1に示すアミノ酸配列において、 2 0個以下、好ましくは 10個以下、更に好ましくは 5個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、ウレタナーゼ活性を示すことがありうる。従って、ウレタナーゼ活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、配列番号 1に示すアミノ酸配列と、 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えば BLAST (Basic Local Alignment Search T ool)検索を用いることにより行うことができる。）ポリペプチドも、ウレタナーゼ活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。

[0023] 前記ウレタナーゼは、ウレタンィ匕合物の他に、アミド、エステルに対しても加水分解活性が認められる。本発明のウレタナーゼは、ポリウレタンの合成に用いられている芳香族系および脂肪族系化合物に対しても、ウレタン結合切断活性を有する。

[0024] 本明細書においてポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（一 NHCOO ）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシァネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ゥレア、力ルバメートなどの基を有するポリマーのことであり、ヒドロキシル基もしくはイソシァネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができ、それら全てが含まれる。

[0025] 本発明のウレタナーゼは、 pH8〜10の範囲で安定である。

[0026] 前記ウレタナーゼは、 472残基のアミノ酸からなり、推定分子量は 50,699Daである。

[0027] ウレタン化合物の分解方法

更に本発明は、遺伝子組換え細胞により生産されるウレタナーゼ、または本来ウレタナーゼを産生する能力を有する微生物による生産されるウレタナーゼの作用によりウレタン化合物を分解処理する方法を提供する。該方法に用いるウレタナーゼは、精製された酵素、粗精製酵素、または細胞を破砕した液であってもよい。細胞の破砕は、当業者に知られた方法により行うことができる。

[0028] 本発明のウレタナーゼが分解できるウレタンィ匕合物は、分子構造中にウレタン結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、トルエン 2, 4—力ルバミン酸ジブチルエステル、トルエン 2, 6 ジカルバミン酸ジブチルエステル、メチレンビスフエ-ルジカルバミン酸ジブチルエステル、へキサメチレンージカルバミン酸ジブチルエステル、ノルボルネンジ力ルバミン酸ジブチルエステルおよびそれらを合成原料とするポリウレタンが挙げられる。

[0029] 本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン榭脂の数平均分子量は、特に制限はない。

[0030] 分解に供されるウレタンィ匕合物は、例えば溶液中にェマルジヨンとして、あるいは粉体の形でカ卩えても良いし、フィルム、ペレット等の塊としてカ卩えても良い。なお、溶液に対するウレタン化合物の投入量は、 0. 01〜： LO重量％が望ましい。添加するウレタナーゼ量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してウレタンィ匕合物に対して 0 . 01重量％以上 (湿重量）が好ましい。また、分解に供するウレタンィ匕合物は、 1種類であっても複数種類であっても良い。溶液は、緩衝液にウレタンィ匕合物を添加したものであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添カ卩しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。

[0031] ウレタンィ匕合物の分解に要する時間は、分解に供するウレタン化合物の種類、組成、形状及び量、ウレタナーゼのウレタンィ匕合物に対する相対量、 pH、温度その他種々の分解条件等に応じて変化しうる。

[0032] 分解反応中のウレタンィ匕合物の分解の確認は、例えば、分解に供したウレタン化合物の重量減少の測定、残存ウレタン化合物量の高速液体クロマトグラフィ (HPLC)による測定、あるいはウレタン結合加水分解産物であるジァミン化合物の生成の測定により確認することができる。ジァミン化合物の生成の確認は、例えば薄層クロマトダラフィにて生成が予想されるジァミンィ匕合物を標準物質として用いることにより、またはガスクロマトグラフィにより行うことができる。

[0033] ポリウレタンの完全分解方法

固体ポリウレタンの分解方法の一態様として、ポリエステル型のポリウレタンのエステル結合分解菌として知られるベ-バチルスアミロリチカス TB— 13株 (受託番号 FE RM P— 19104、特願平 2002— 334162参照）および Zまたはコマモナスァシドボランス TB— 35株、あるいはそれらの菌株由来の酵素と、ウレタン結合分解能を有する本発明のウレタナーゼを用いることにより、ポリウレタンの完全分解を行うことができる。

[0034] 実施例

本発明を実施例によってさらに詳しく説明する力本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。

[0035] 実施例 1 ロドコッカスェクイ TB60株由来のウレタナーゼ遣伝子のクローニング

ロドコッカスェクイ TB60株由来のウレタナーゼ遺伝子のクローユング手順を図 1に示す。

工程 A.ロドコッカスェクイ TB60株の全 DNAの調製

肉汁液体培地で 30°C、 1晚培養したロドコッカスェクイ TB60株の菌体より、全 DN Aの抽出を行った。抽出方法は、図 2に示したとおりである。

工程 B. PCRによるウレタナーゼ遺伝子の増幅

B- 1.ウレタナーゼの N末端及び内部アミノ酸配列の決定

精製されたウレタナーゼを用いて、 N末端及び内部アミノ酸配列の決定を行った。内部配列の決定には、 V8プロテアーゼ消化で得られた約 2kDaのポリペプチド断片を用いた。決定された N末端及び内部アミノ酸配列を表 1に示す。

[0036] [表 1]

表 1 精の N 及び内部ァミノ酸酉 Ξ?ϋ

N

MNTSGLGWMSATEMAAQVAS

内部 N ^ AIPDWGDPSEAM

[0037] B- 2. TB60株全 DNAを铸型とした PCR

B— 1で決定された N末端アミノ酸配列をもとに、ウレタナーゼ遺伝子を増幅させるためのプライマーを設計した (表 2)。

[0038] [表 2] Φ ^に用いたプライマ'

プライマ一配列

N1-2 5'-ATGAACACS CS GGB CTS GGS GGATC-3'

歷 5'-GTC GCC SGA G C SGG GGT SGC-3'

SalF 5'-GAC GACAAC CTGATC GAAC-3'

PstR 5'-CAG CCAG C GGG CGC GAA-3'

Ure- PET-Nde 5'-GGAAIT CCA GAACACATC GGG TCT GGG GTC G-3¹ Ure-PET-Nhe 5'-(Τ ΑΟΓΤΑΓτ τΠ CCACAG GAC GAC GGTCCG C-3'

S=CorG

下線は画 »y "イトを、二重下線は Nhel ィトを示す。

[0039] Nl-2、 N3Rをプライマーとして用い、 TB60株全 DNAを铸型として図 3に示す条件で PCRを行った。

[0040] PCRの結果得られた約 lkbpの DNA断片を、 pGEM- TEasy (Promega社製）に挿入し、 E. coli DH10Bの形質転換を行った。その結果、 lkbpのインサートを有するプラスミド pN- TAが得られた。

工程 C.サザンハイブリダィゼーシヨン'クロー-ング（1)

C 1. DNAプローブの作製 ·ハイブリダィゼーシヨン

B— 2で得られたプラスミド pN-TAを制限酵素で処理し、インサート DNAを得た。この DNA断片を用いて、プローブを作製した（Probe 1)。プローブの作製には、 Gene Ima ge Random-Prime Labelling Module (Amersham Bioscience)を用ヽ 7こ。

[0041] Pstlで消化した TB60株の全 DNAに対して、作製したプローブを用いてサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。検出には CDP- Star Detection Module (Amersham Bioscie nce)を用いた。その結果、約 4kbpの DNA断片にシグナルが検出された。

C- 2.クローニング

TB60株の全 DNAを Pstlで消化し、約 4kbp付近の DNA断片をァガロースゲルより抽出した。抽出した DNAを、 Pstlで消化した pUC 19に挿入し、 E. coli DH10Bの形質転換を行った。得られた形質転換体を铸型として、 colony direct PC Rを行い目的の領域を有するプラスミドの検出を行った。その際のプライマーとして、 N1-2/N3Rを用いた。

[0042] その結果、 4.2 kbpの断片を有するプラスミド、 pURE9を得た。塩基配列解析の結果、この断片はウレタナーゼ遺伝子の前半部分をコードしていることが明ら力となった（図 4)。そこで、本遺伝子の後半部分をクローユングするため、再度サザンハイブリダィゼーシヨンを行った。

工程 D.サザンハイブリダィゼーシヨン ·クローユング（2)

D— 1. DNAプローブの作製 ·ハイブリダィゼーシヨン

PURE9の Pstl-Sall領域（約 0.2 kbp)を PCRで増幅し、プローブを作製した（Probe 2) 。 PCRには表 2に示したプライマー SalF/PstRを用いた。 PCR条件は B— 2に準じた。

[0043] BamHIで消化した TB60株の全 DNAに対して、作製したプローブを用いてサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。検出方法は C—1に準じた。その結果、約 2.5 kbpの D NA断片にシグナルが検出された。

D- 2.クローニング

TB60株の全 DNAを BamHIで消化し、約 2.5 kbp付近の DNA断片をァガロースゲルより抽出した。抽出した DNAを、 BamHIで消化した pUC19に挿入し、 E. coli DH10Bの形質転換を行った。得られた形質転換体を铸型として、 colony direct PCRを行い目的の領域を有するプラスミドの検出を行った。その際のプライマーとして、表 2に示した S alF/PstRを用いた。

[0044] その結果、 2.5 kbpの断片を有するプラスミド、 pURE41を得た。塩基配列解析の結果、 pURE41は pURE9の BamHI(3)-PstI(2)領域を有して!/、ることが確認された（図 4)。工程 E.塩基配列解析

PURE9及び pURE41の塩基配列を解析した結果、 Sacl(2)-Sall(2)領域にひとつの 0 RFが見、だされた。本 ORFの全塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を図 5に示した。本 ORFは 1419bpのヌクレオチドからなり、 472残基のアミノ酸をコードしていた（推定分子量 50,699Da)。 N末端力も 20残基のアミノ酸配列（Metl-Ser20)は精製したウレタナーゼの N末端アミノ酸配列と完全に一致した。また、 Ara300-Met311のアミノ酸配列は精製酵素の内部アミノ酸配列と同一であった。以上の結果より、本 ORFは A1株のウレタナーゼをコードしていることが示された。以後、本 ORFを ureAとする。

[0045] 本酵素と相同性を有するタンパク質を、データベース（DDBJ, GenBank)より検索した。その結果、いくつかのバクテリア由来のアミダーゼと相同性を示した力最高でもロドコッカス属菌（Rhodococcus sp.)由来のェナンチォ選択的アミダーゼ（ァクセッション番号 No. A19131)に対する 34%であり、それ以上の類縁タンパク質は見いだされなかった。

工程 F.発現

F- 1.発現ベクターの構築

pUR9及び pURE41を铸型として、 ureAを PCRで増幅した。その際、 5'末端に Ndelサイトを 3，末端に Nhelサイトを付カ卩できるようなプライマー（Ure- PET- Nde/Ure- PET- Nh e、表 2)を用いた。 PCRの条件は以下の図 6の通りとした。

[0046] 増幅した 1.4 kbの断片をァガロースゲルより抽出し、 Ndel/Nhelで切断した pET25b(+ )ベクター（Novagen)に挿入した。これにより、 UreAの C末端に His-Tagを付与した発現ベクターが構築された。ベクターに挿入された DNAの塩基配列解析を行い、 ureA と同一であることを確認した。これを pURE-petとした。

F- 2. E. coliを宿主とした発現

図 7に示した方法で、発現を行った。 pURE-petを有する E. coli BL21 (DE3)を 50 ml の LB培地（100 g/mlの Apを含む）に植菌し、 30°Cで 1晚回転振蘯培養を行った。それを 500 mlの LB培地（100 μ g/mlの Αρを含む）に全量植菌し、 20°Cで回転振蘯培養を行った。 5時間後に 0.5 mlの ImM IPTGを添カ卩し、 20°Cで 24時間誘導を行った。誘導後の菌体を超音波破砕し、遠心して得られた上清を粗酵素液 (Cell free extract)とした。

F- 3.発現酵素の精製

F— 2で得られた粗酵素液を、 40〜60%飽和硫酸アンモ-ゥム沈殿にて分画を行つた後、 HiTrap Chelating HPカラム（容量 1 ml、 Amersham Bioscience)を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーに供した。予め Ni²⁺をキレートさせた後、 0.5M NaClを含む 2 OmM K-リン酸緩衝液（pH 7.0)で平衡化を行った。 60-200mM/60minのイミダゾールリニアグラジェントで酵素の溶出を行った。ウレタナーゼ活性を有するフラクションを回収後、限外濾過にて脱塩、濃縮を行った。 20%となるようにグリセロールを添加し、 4°Cで保存した。精製酵素の SDS-PAGEを図 8に示した。本酵素は、 TB60株由来のゥレタナーゼと同等の分子量を示した。

F-4.ウレタン分解活性の確認

精製した組換型ウレタナーゼを用いて、ウレタン化合物中のウレタン結合分解活性を確認した。基質にはトルエンジカルノミン酸ジブチルエステル (TDCB)及びメチレンビスフエ-ルジカルバミン酸ジブチルエステル（MDCB)を用いた。小試験管に表 3 に示した反応液を入れ、 30°Cで 24時間反応を行った。反応後、遠心して残存した基質を除去した後、反応液と等量の酢酸ェチルで分解産物を抽出し、 GC-MSに供した。 GC- MSの条件は図 9に示した通りである。

[0047] 分解反応の結果、 TDCBを基質として用いたときに、 3.8分に分解産物のピークが検出された。マススペクトル解析の結果、この化合物はトルエンジァミンであると同定された。 MDCBを基質として用いたとき〖こは、 8.0分に分解産物のピークが検出された。マススペクトル解析の結果、この化合物はジアミノジフエニルメタンであると同定された。以上の結果より、組換型酵素が TDCB及び MDCBのウレタン結合を切断していることが確認された。また、その分解産物は、 TB60株由来ウレタナーゼと同一であった

産業上の利用可能性

[0048] 固体ポリウレタンを分解可能な酵素としては、ポリエステル型のポリウレタン分解酵素が数例報告されている。しかしこれらの酵素はエステラーゼであり、ポリウレタン中のエステル結合は分解する力ウレタン結合はほとんど分解しないため、低分子のゥレタンィ匕合物が最終産物として残る。本発明のウレタナーゼをこれらのポリウレタン分解酵素と共存させることにより、ポリウレタンの完全分解が可能になる。

[0049] し力も、本発明によりウレタナーゼの遺伝子が得られ、大腸菌での発現系が確立されたことから、タンパク質工学的改変によって分解性を付与することにより、ポリウレタンの酵素的モノマーリサイクルに応用できる。

Claims

請求の範囲

[I] 配列番号 1のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列力もなる、ポリヌクレオチド。

[2] 配列番号 2のヌクレオチド配列を含む、請求項 1のポリヌクレオチド。

[3] 配列番号 2のヌクレオチド配列の相補配列を含む、請求項 1のポリヌクレオチド。

[4] ストリンジェントな条件下で配列番号 2のヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダィズし、ウレタン化合物分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。

[5] 配列番号 2のヌクレオチド配列の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列であって、ウレタンィ匕合物分解活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補配列力もなる、ポリヌクレオチド。

[6] ウレタン化合物が低分子量ィ匕合物である、請求項 4または 5記載のポリヌクレオチド。

[7] ウレタン化合物がポリウレタンである、請求項 4または 5記載のポリヌクレオチド。

[8] 請求項 1ないし 7のポリヌクレオチドのいずれかを含む、組換えベクター。

[9] 請求項 8の組換えベクターを含む、形質転換宿主細胞。

[10] (a)配列番号 1に示すペプチド配列、または、

(b)配列番号 1に示すペプチド配列に 1ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列、

を含むウレタン化合物分解活性を有するポリペプチド。

[II] 配列番号 1のアミノ酸配列を含む実質的に精製または単離されているポリペプチドを調製する方法であって、請求項 9の宿主細胞を、ポリペプチドまたはペプチド断片の発現を導くことが可能な条件下で培養すること、および該細胞培養カゝらポリペプチドまたはペプチド断片を、実質的に精製または単離されている形態で回収することを含む、刖記方法。

[12] ウレタン化合物分解活性を有するポリペプチドを発現して、る請求項 9の宿主細胞をウレタン化合物と接触させる工程を含む、ウレタン化合物の分解方法。

[13] 前記細胞が大腸菌である、請求項 12記載の分解方法。

[14] ウレタン化合物が低分子量ィ匕合物である、請求項 12または 13記載の分解方法。ウレタン化合物がポリウレタンである、請求項 12または 13記載の分解方法。