WO2006008154A1 - mRNA-GEMISCH ZUR VAKZINIERUNG GEGEN TUMORERKRANKUNGEN - Google Patents

mRNA-GEMISCH ZUR VAKZINIERUNG GEGEN TUMORERKRANKUNGEN Download PDF

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WO2006008154A1
WO2006008154A1 PCT/EP2005/007930 EP2005007930W WO2006008154A1 WO 2006008154 A1 WO2006008154 A1 WO 2006008154A1 EP 2005007930 W EP2005007930 W EP 2005007930W WO 2006008154 A1 WO2006008154 A1 WO 2006008154A1
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Ingmar Hoerr
Steve Pascolo
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Curevac Gmbh
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    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof

Definitions

  • the present invention relates to a mixture which contains mRNA for vaccination, wherein at least one mRNA contains a region coding for at least one antigen from a tumor and at least one further mRNA contains a region coding for at least one immunogenic protein. Furthermore, the invention relates to a pharmaceutical composition which contains an mRNA mixture according to the invention and to the use for the treatment of tumor diseases.
  • nucleic acids are both DNA and RNA.
  • the hitherto customary methods of gene therapy and genetic vaccination are based on the use of DNA in order to introduce the required genetic information into the cell.
  • various methods for introducing DNA into cells such as, for example, Caldumphosphat transfection, polypren transfection, protoplast fusion, electroporation, microinjection and lipofection, have been developed, with lipofection in particular having proven to be a suitable method.
  • DNA viruses as DNA vehicles. Due to their infectious properties, such viruses achieve a very high transfection rate. The viruses used are genetically modified in this method, so that in the transfected cell no functional hige ⁇ infectious particles are formed.
  • this precautionary measure for example due to possible recombination events, a risk of uncontrolled spread of the gene therapy and viral genes introduced can not be ruled out.
  • RNA is also suitable as a usable nucleic acid in gene therapy.
  • RNA expression systems are opposed to DNA expression systems in gene therapy and genetic vaccination are significant advantages. This includes, inter alia, that incorporated into a cell RNA does not integrate into the genome, while using DNA (eg as a DNA vehicle derived from DNA viruses), in a Cell is incorporated, this DNA to some extent integrated into the genome.
  • DNA as a vaccine (or gene therapeutic) is a danger with the use of DNA as a vaccine (or gene therapeutic) is the induction of pathogenic anti-DNA antibodies in the patient into which the foreign DNA is introduced, eliciting a potentially fatal immune response.
  • RNA is much easier degraded in vivo, ie in the patient's organism wkd. RNA has relatively short half-lives in the bloodstream compared to DNA.
  • RNAases ribonucleases
  • EP-A-1083232 proposes a method for introducing RNA, in particular mRNA, into cells and organisms, in which the RNA is in the form of a complex with a cationic peptide or Protein is present.
  • WO 99/14346 describes further methods for stabilizing mRNA.
  • modifications of the mRNA are proposed which stabilize the mRNA species against the degradation of RNases.
  • modifications relate to the stabilization by. Sequence modifications, in particular the reduction of the C and / or U content by base elimination or base substitution.
  • chemical modifications in particular the use of nucleotide analogues, as well as 5'- and 3'-buring groups, an increased length of the poly A tail and the complexation of the mRNA with stabilizing agents and combinations of the measures mentioned are proposed.
  • TGT transient gene therapy
  • Bieler and Wagner report the use of synthetic genes in conjunction with gene therapy methods using DNA vaccines and lentiveral vectors. It will be the construction of a synthetic, derived from HIV-1 in which the codons were modified from the wild-type sequence (alternative codon usage) to correspond to the use of codons found in highly expressed mammalian genes. As a result, in particular the A / T content was compared to the wild-type sequence vermiti-. In particular, the authors note an increased expression rate of the synthetic gag gene in tansed cells.
  • mice an increased antibody formation against the gag ligand in mice immunized with the synthetic DNA construct and also an increased cytokine release in vitro were observed in transplanted spleen cells of mice. Finally, an induction of a cytotoxic immune response in the immunized mice.
  • the authors of this article essentially attribute the improved properties of their DNA vaccine to a change in nucleocytoplasmic transport of the mRNA expressed by the DNA vaccine as a result of optimized codon usage. In contrast, the authors consider the effect of the changed codon usage on the translation efficiency to be low.
  • WO 02/098443 describes a pharmaceutical composition containing a stabilized mRNA and as a vaccine for the treatment of cancer and infectious diseases and used for tissue regeneration.
  • the mRNA encodes a biologically active or antigenic peptide and is stabilized in particular by increasing the C / G content in the coding region.
  • WO 03/051401 describes a pharmaceutical composition which contains an mRNA which codes for a tumor antigen and optionally contains a cytokine for the treatment and prophylaxis of cancers. Again, various variants for stabilizing the mRNA in this composition are described.
  • an object of the invention relates to a mixture containing mRNA for vaccination, wherein at least one mRNA contains a region coding for at least one antigen from a tumor and at least one further mRNA contains a region coding for at least one immunogenic protein.
  • the invention is based on the finding that almost every organism has so-called "memory immune responses" against certain foreign molecules, eg proteins, in particular viral proteins, antigens. This means that an organism has already been infected with such a foreign molecule at an earlier point in time, and that an immune response to this foreign molecule, eg a vital protein, has already been triggered by this infection. This infection is reactivated in the event of a renewed infection with the same foreign molecule.
  • foreign molecules eg proteins, in particular viral proteins, antigens.
  • such a reactivation of the immune response can be effected by the vaccination with the mixture according to the invention, specifically by the method described in US Pat According to the invention, this reactivation can even take place specifically, namely at the site of application of the mixture, eg application into a tumor tissue described foreign molecule (against which there is a memory immune response t) be supported / facilitated.
  • vaccination means the introduction of one or several v rer antigens of a tumor or in the context of the invention the introduction of the genetic information for one or more antigen (s) of a tumor in the form of for / the anti- ⁇ gen ⁇ ) mRNA encoding a tumor in an organism, in particular in ei ⁇ ne / several ZeEe / cells or tissue of this organism.
  • the thus administered mRNA is translated into the (tumor) antigen in the organism or in its cells, ie the antigen encoded by the mRNA (also: antigenic polypeptide or antigenic peptide) is expressed, as a result of which an immune response directed against this antigen is stimulated.
  • an "antigen from a tumor” or “tumor antigen” means that the corresponding antigen is expressed in cells associated with a tumor.
  • these are antigens that are produced in the degenerate cells (tumor cells) themselves. These are preferably antigens which are located on the surface of the cells.
  • those antigens also comprise tumors which are expressed in cells which are not themselves degenerate or were originally not themselves degenerate, but are associated with the above-mentioned tumor.
  • tumor-associated antigens also include antigens derived from cells of the tissue that embed the tumor. These may, for example, be antigens of connective tissue cells, for example antigens of the extracellular matrix.
  • the mixture of the invention may contain (at least one) mRNA encoding / encoding from 1 to 50, preferably 1 to 10, such antigens from a tumor.
  • tumor antigens are 707-AP, AFP, ART-4 (adenocarcinoma recognized antigen; AB026125), BAGE, ⁇ -catenin / m, Bcr-abl, CAMEL (AJ012835), CAP-1, CASP-8, CDC27 / m, CDK4 / m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, eg GAGE-4, GnT-V, GP 100HAGE, HAGE, HAST-2, HLA-A * 0201 -R170I, HPV-E7, HSP70-2M, hTERT (or hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, eg LAGE-I, LDLR / FUT, MAGE, eg MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, MAGEAl, MAGEA2 (L18920), MAGE-A3, MAGE
  • tumor antigens are MAGE, in particular MAGE-Al and MAGE-A6, melan-A, GP100, tyrosinase, survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2 / neu and mucin-1. It is furthermore preferred if an RNA mixture according to the invention contains at least one vital tumor antigen (for example HPV E7 or HCV polyprotein or Adenovkus protein E3, E1a or Eib), if appropriate in combination with at least one original hu manen , Preferably autologous tumor antigen of the patient to be treated.
  • vital tumor antigen for example HPV E7 or HCV polyprotein or Adenovkus protein E3, E1a or Eib
  • the autologous tumor antigen is preferably one of the abovementioned antigens, in particular MAGE, in particular MAGE-Al and MAGE-A6, melan-A, GP100, tyrosinease, survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), herbal tumor antigen. 2 / neu, mucin-1, PSA, p53, Bcr-Abl, PDGFR, Her3 or cyclin.
  • one or two different vital tumor antigens are present in an RNA mixture according to the invention in combination with 2 to 6 different autologous tumor antigens of the patient. In the case of an RNA mixture without vital tumor antigens, it is likewise preferred that this contains 2 to 6 different tumor antigens, in particular selected from the group of the aforementioned tumor antigens.
  • the at least one mRNA of the mixture which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, encodes an antigen selected from the group consisting of MAGE, in particular MAGE-Al and MAGE-A6 , Melan-A, GP100, Tyrosinase and Survivin.
  • a likewise preferred embodiment of the present invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen which belongs to the group consisting of MAGE, in particular MAGE-Al, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2 / neu, mucin-1 and survivin.
  • MAGE MAGE-Al
  • CEA Carcino Embryonic Antigen
  • Her-2 / neu Her-2 / neu
  • mucin-1 mucin-1
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mixture, wherein the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen which belongs to the group consisting of telomerase TERT, PR3, WT1, PRAME, mucin-1 and survivin.
  • the at least one mRNA of the mixture which contains a region coding for at least one antigen from a tumor codes for an antigen selected from the group consisting of TNC (tenascin C), EGFRI, SOX9 , SEC61G and PTPRZl.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mixture, wherein the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen selected from the group consisting of accession number M77481, accession number NM_005363, Accession number NM_005511, accession number M77348, accession number NM_000372 and accession number AF077350.
  • a likewise preferred embodiment of the present invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen selected from the group consisting of accession number M77481, Accession number NM_004363, accession number Ml 1730, accession number NM_002456 and accession number AF077350.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mixture, wherein the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen selected from the group consisting of accession number NM_003219, accession number NM_002777, Accession number NM_000378, accession number NM_006115, accession number NM_002456] and accession number AF077350.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mixture, wherein the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor encodes an antigen selected from the group consisting of accession number X78565, Accession number AF288738, accession number Z46629, accession number NM_014302 and accession number NM_002851.
  • the antigen (s) from a tumor is a polyepitope of the antigen (s) from a tumor.
  • a "polyepitone" of one or more antigens is an amino acid sequence that represents multiple or multiple regions of the antigen (s) that interact with the antigen-binding portion of an antibody or with a T cell receptor.
  • the polyepitope may be present completely and unmodified, however, according to the present invention, in particular for optimizing the antibody / antigen or T cell receptor / antigen interaction, it may also be present modified, a modification compared to the wild-type
  • polyepitope may comprise a deletion, addition and / or substitution of one or more amino acid residues Accordingly, in the modified polyepitope-encoding mRNA of the present invention, one or more nucleotides are removed from the wild-type polyepitope-encoding mRNA ⁇ added and / or replaced.
  • Immunogenic protein in the sense of the invention refers to a “foreign protein”, in particular a “protein of a pathogen”, which triggers an immune response if it enters a foreign organism.
  • immunogenic protein foreign protein
  • protein of a pathogen which triggers an immune response if it enters a foreign organism.
  • proteins synonymously also stands for "polypeptide” and "peptide.”
  • an immunogenic protein is, in particular, a viral or bacterial protein or a fungal protein, but according to the invention, proteins are also any.
  • a pathogenic organism eg a virus, which contains or carries this immunogenic protein on the surface
  • the immune response thus triggered be stored, and that in the case of a renewed infectious on with this protein this immune response is reactivated. Accordingly, there is a so-called memory immune response against the immunogenic protein.
  • influenza virus proteins including the influenza matrix proteins. If such an influenza virus protein, in particular an influenza matrix protein, returns to the already previously infected organism, it reactivates the immune response against the protein (s).
  • Immunogenic proteins within the meaning of the invention are preferably structural proteins of viruses, in particular matrix proteins, capsid proteins and surface proteins of the lipid membrane. Further examples of such vital proteins are proteins of Adenovken, rhinoviruses, corona viruses. Particularly preferred here is the hepatitis B surface antigen ("hepatitis B surface antigen", hereinafter referred to as "HBS antigen").
  • the HBS antigen [accession number E00121] is a foreign antigen that has been vaccinated against most humans, especially mammals, in particular those who are or were not infected with the Hepatitis B virus (HBV) or against HBV. represents a new antigen.
  • an immune reaction to foreign antigens is usually more efficient than on own An ⁇ antigens, such as tumor antigens, since cells that carry these own antigens are usually inactivated or destroyed by the immune system to avoid autoimmunity.
  • An immune response to the HBS antigen may therefore serve as a surrogate marker for the efficiency of the administered mixture of the invention.
  • the HBS antigen in interaction with a further immunogenic protein of the invention can significantly enhance the immune response of the organism to which the mixture according to the invention is administered.
  • Another preferred immunogenic protein is the CMV pp65 [Accession number Ml 5120].
  • a most preferred immunogenic protein is the influenza matix protein, more specifically the influenza matrix Ml protein.
  • Two types of influenza virus are known, the influenza A virus and the influenza B virus.
  • different types of serotypes are known, each having slight sequence differences from each other.
  • a preferred embodiment of the invention therefore relates to a mixture in which the at least one rr ⁇ RNA which contains a coding for at least one immunogenic protein or polypeptide polypeptide coding region for a matrix protein, preferably an influenza matrix protein, particularly preferably be ⁇ the influenza A matrix Ml protein or the influenza B matrix Ml protein encoded.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a coding for at least one immunogenic protein region, for a matrix protein, preferably an influenza matrix protein, more preferably the influenza A matrix Ml Protein or the influenza B matrix Ml protein, or encoded for HBS or for CMV pp65.
  • a matrix protein preferably an influenza matrix protein, more preferably the influenza A matrix Ml Protein or the influenza B matrix Ml protein, or encoded for HBS or for CMV pp65.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mixture, wherein the at least one mRNA which contains a coding for at least one immunogenic protein coding region coding for an immunogenic protein selected from the group consisting of Accession number AF348197, Accession number VOl 099 , Accession number E00121 and Accession number M15120.
  • immunogenic proteins of the invention are proteins of common pathogens, i. Pathogens that are likely to infect any organism, especially mammals, preferably humans, at least once in their lifetime. These include, for example, any structural or non-structural protein of:
  • Picornaviruses such as rhinovirus or hepatitis A virus
  • Togaviruses such as alphavirus or rubivirus, e.g. Sindbis, Semliki-Forest or Rubeolavirus (measles virus), Rubella virus (Röteinvirus),
  • Coronaviruses in particular the subtypes HCV-229E or HCV-OC43,
  • Paramyxoviruses such as mumps virus
  • Reoviruses such as group A, B or C rotavirus, hepadnaviruses, such as hepatitis B virus,
  • Papoviruses such as human papillomavites (HPV) of any serotype (from 1 to 75),
  • Herpesviruses such as herpes simplex virus 1, 2 or 3, cytomegalovirus (CMV), in particular preferably CMVpp65, or Epstein-Barr virus (EBV),
  • CMV cytomegalovirus
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Chlamydophila pneumoniae Chlamydia pneumoniae
  • immunogenic proteins are proteins of pathogens which rarely infect an organism, in particular a mammal, preferably a human. These include, for example, any structural or non-structural protein of:
  • Flaviviruses such as dengue virus type 1 to 4, yellow fever virus, West Nile virus, Japanese encephalitis virus or hepatitis C virus calicivirus,
  • Filoviruses such as Ebokvirus, - bornaviruses,
  • Bunyaviruses such as Rift Valley fever virus
  • Arenavken such as LCMV (virus of lymphocytic choriomeningitis) or viruses of hemorrhagic fever, retrovirus, such as HIV and parvoviruses.
  • immunogenic protein or of an antigen from a tumor of the invention as well as the mRNA according to the invention are also included.
  • “Functional” in the sense of the invention means that the immunogenic protein or the antigen from a tumor or the mRNA has immunological or immunogenic activity, in particular triggers an immune response in an organism in which it is foreign mRNA is functional if it can be translated into a functional immunogenic protein or tumor antigen (or fragment thereof).
  • a “fragment” in the sense of the invention is to be understood as meaning a truncated immunogenic protein or tumor antigen or a truncated mRNA of the present invention This may be N-terminal, C-terminal or intrasequentially abbreviated Aminoklare ⁇ or nucleic acid sequences.
  • fragments of the invention are well known in the art and may be carried out by one skilled in the art using standard techniques (see, e.g., Maniatis et al., (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, ColD Spring Harvest Laboratory Press).
  • the production of the fragments of the immunogenic protein or the antigen can be carried out by modifying the DNA sequence which codes for the wild-type molecule, followed by a transformation of this DNA sequence into a suitable host and expression of this modified DNA sequence, provided that the modification of the DNA does not destroy the described functional activities.
  • the production of the fragment can also be carried out by modifying the wild-type DNA sequence followed by an in vitro transcription and isolation of the mRNA, also with the proviso that the modification of the DNA is the functional activity of the mRNA not destroyed.
  • the identification of a fragment according to the invention can take place, for example, via sequencing of the fragment and subsequent comparison of the sequence obtained with the wild-type sequence. The sequencing can be carried out using standard methods which are numerous and well known in the prior art.
  • variants are in particular those immunogenic proteins, antigens or mRNA which have sequence differences from the corresponding wild-type sequences, which can be one or more insertions, deletion (s) and / or Substitutions) of amino acids or nucleic acids, wherein a sequence homology of at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, also more preferably 85%, even more preferably 90% and most preferably 97% is present.
  • the sequences can be aligned to be compared below. For this purpose, for example, gaps can be introduced into the sequence of the first amino acid or nucleic acid sequence and the amino acids or nucleic acids can be added to the corresponding amino acid or nucleic acid sequence. be compared position of the second amino acid or nucleic acid sequence. If a position in the first amino acid sequence is occupied by the same amino acid or nucleic acid as it is at a position in the second sequence, then both sequences are identical at that position. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions divided by the sequences.
  • the determination of the percentage identity of two sequences can be carried out by means of a mathematical algorithm.
  • a preferred, but not limiting, example of a mathematical algorithm that can be used to compare two sequences is the algorithm of Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90: 5873-5877. Such an algorithm is integrated into the NBLAST program, which can identify sequences having a desired identity to the sequences of the present invention.
  • the gapped BLAST program can be used, as described in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
  • Functional variants within the meaning of the invention may preferably be mRNA molecules which have an increased stability and / or translation rate compared to their wild-type molecules. Likewise, better transport into the cell of the (host) organism may be present. Variants may in particular also be immunogenic proteins which are stabilized in order to avoid physiological degradation, for example by stabilization of the protein backbone by substitution of the amide-like bond , for example, by the use of ß-amino acids.
  • variants includes in particular those amino acid sequences which have conservative substitution with respect to the physiological sequences.
  • conservative Substi ⁇ tutionen such substitutions are referred to, in which amino acids are replaced with each other, which come from the same class.
  • amino acids with aliphatic side chains, positively or negatively charged side chains, aromatic groups in the side chains or amino acids whose side chains can enter hydrogen bonds for example side chains which have a hydroxy function.
  • an amino acid having a polar side chain is replaced by another amino acid with a likewise polar side chain or, for example, an amino acid characterized by a hydrophobic side chain is substituted by another amino acid with a likewise hydrophobic side chain (eg serine (threonine) by threonine (Serin ) or leucine (isoleucine) by isoleucine (leucine)). Insertions and substitutions are possible in particular at those sequence positions which do not cause any change in the three-dimensional structure or affect the binding region.
  • a change of a three-dimensional structure by insertions) or deletion (s) can be easily checked, for example, with the aid of CD spectra (circular dichroism spectra) (Urrv, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (Ed.), Elsevier, Amsterdam).
  • CD spectra circular dichroism spectra
  • Each amino acid is encoded by a codon defined by three nucleotides (triplet), and it is possible to have one codon that encodes a particular amino acid for another By choosing suitable alternative codons, for example, the stability of the mRNA according to the invention can be increased.
  • variants according to the invention having amino acid sequences which have substitutions with respect to the wild-type sequences are disclosed, for example, in the publications US Pat. Nos. 4,737,462, 4,588,585, 4,959,314, 5,116,943, 4,879,111 and 5,017,691.
  • the preparation of variants in general is described in particular also by Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press). It codons can be omitted, supplemented or replaced.
  • Variations within the meaning of the invention can also be prepared by introducing changes into the nucleic acids which code for the variants, such as, for example, insertions, delitions and / or substitutions of one or more nucleotides.
  • Numerous methods for such alterations of nucleic acid sequences are known in the art.
  • One of the most widely used technique is oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis (see Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et al., Ed. 1991).
  • an oil is gonucleotide whose sequence has a specific mutation. This oligonucleotide is then hybridized with a template containing the wild-type nucleic acid sequence.
  • a single-stranded template is used in this technique.
  • a DNA-dependent DNA polymerase is used to synthesize the second strand of the oligonucleotide that is complementary to the template DNA strand.
  • a heteroduplex molecule containing a mismatch resulting from the above-mentioned mutation in the oligonucleotide is obtained.
  • the oligonucleotide sequence is introduced into a suitable plasmid, this is introduced into a host cell and in this host cell, the oligonucleotide DNA is replicated.
  • the present invention may be used in the treatment and / or prophylaxis of tumor disease and more preferably in the treatment and / or prophylaxis of melanoma, carcinoma, AML (acute myeloid leukemia) and glioma (glioma).
  • a vaccination with the mixture according to the invention can be carried out, wherein the mRNA coding for an antigen codes for a plurality of different antigens which are specific for melanomas (eg MAGE-Al, MAGE-A6, melan-A, GP100, tyrosinase and survivin ) or specific for carcinomas (eg MAGE-Al, CEA, Her-2 / neu, mucin-1 and survivin) or are specific for AML (eg telomerase TERT, PR3, WTI, PRAME, mucin-1 and survivin) or specific for glioma (eg TNC (tenascin C), EGFRI (epidermal growth factor receptor 1), SOX9, SEC61G and PTPRZ1 (protein tyrosine phosphatase, receptor type, Z polypeptide 1).
  • melanomas eg MAGE-Al, MAGE-A6, melan-A, GP100, tyrosinas
  • an influenza matrix protein especially an influenza A or B matrix Ml protein
  • the respective mixture may contain the itnumogenous protein HBS.
  • a particularly preferred embodiment of the invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, for the antigens MAGE-Al [accession number (accession number) M77481], MAGE- A6 [Accession number NM_005363], Melan-A [Accession number NM_005511], GP100 [Accession number M77348], Tyrosinase [Accession number NM_000372] and Survivin [Accession number AF077350] and the at least one mRNA which has a DNA coding for contains at least one immunogenic protein or polypeptide codie ⁇ ing region, encoded for an influenza matrix protein [Accession number AF348197 or Accession number VOl 099].
  • the mixture contains functional fragments and / or functional variants of the aforementioned mRNAs
  • a likewise particularly preferred embodiment of the invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, for the antigens MAGE-Al [accession number M77481], CEA [ Accession number NM_004363], Her-2 / neu [Accession number M1730], mucin-1 [Accession number NM_002456] and Survivin [Accession number AF077350], and the at least one mRNA encoding at least one immunogenic protein Polypeptide coding region encoded for an influenza matrix protein [Accession number AF348197 or Accession number V01099].
  • the mixture contains functional fragments and / or functional variants of the aforementioned mRNAs.
  • a further particularly preferred embodiment of the invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, for the antigens telomerase TERT [Accession number
  • Survivin [Accession number AF077350] and the at least one mRNA containing a coding for at least one immunogenic protein or polypeptide area, for an influenza matrix protein [Accession number AF348197 or Accession number V01099] coded.
  • the mixture preferably contains functional fragments and / or functional variants of the abovementioned rRNAs.
  • a further particularly preferred embodiment of the invention relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, for the antigens TNC (Tenascin C) [Accession number X78565], EGFRI ("Epidermal Growth Factor Receptor 1 ") [Accession number AF288738], SOX9 [Accession number Z46629], SEC61G [Accession number NM_014302] and PTPRZl (Protein tyrosine phosphatase, receptor type, Z polypeptide 1) [Accession number NM_002851] and the at least one mRNA which contains a region coding for at least one immunogenic protein or polypeptide encodes an influenza matrix prototer ⁇ [Accession number AF348197 or Accession number VO1099]
  • the mixture contains functional fragments and / or functional variants of the abovementioned mRNAs ,
  • a preferred embodiment relates to a mixture in which the at least one mRNA which contains an area coding for at least one immunogenic protein or polypeptide, for a matrix protein, preferably an influenza matrix protein, or more preferably the influenza A matrix-Mi protein or the influenza B matrix Ml protein, and for a HBS antigen [Accession number E00121] encoded.
  • a matrix protein preferably an influenza matrix protein, or more preferably the influenza A matrix-Mi protein or the influenza B matrix Ml protein
  • HBS antigen accesion number E00121
  • the mRNA of the mixture according to the invention can be present as naked mRNA and / or as modified mRNA, in particular stabilized mRNA. Modifications of the mRNA according to the invention serve above all to increase the stability of the mRNA but also to improve the transfer of the mRNA into a cell or a tissue of an organism.
  • the mRNA of the mixture according to the invention preferably has one or more modifications, in particular chemical modifications, which contribute to increasing the half-life of the mRNA in the organism or improve the transfer of the mRNA into the cell or a tissue.
  • the G / C content of the coding region of the modified rRNA of the mixture according to the invention is increased over the G / C content of the coding region of the wild-type RNA, the encoded amino acid sequence of the modified mRNA preferably unchanged from the coded amino acid sequence of the wild-type mRNA.
  • sequence of sequence of the rRNA to be translated is essential for the efficient translation of an rRNA. Meaningful here is the composition and sequence of the various nucleotides.
  • sequences with elevated G (guanosine) / C (cytosine) content are more stable than sequences with an increased A (adenosine) / U (uracil) content. Therefore, according to the invention, while maintaining the translated amino acid sequence, the codons are varied with respect to the wild-type mRNA in such a way that they increasingly contain G / C nucleotides.
  • the modified rRNA Depending on the amino acid to be coded by the modified rRNA, different possibilities for modifying the mRNA sequence compared to the wild-type sequence are possible. In the case of amino acids which are encoded by codons which exclusively contain G or C nucleotides, no modification of the codon is required. Thus, the codons for Pro (CCC or CCG), Arg (CGC or CGG), Ala (GCC or GCG), and Gly (GGC or GGG) require no change since there is no A or U present.
  • codons which contain A and / or U nucleotides can be modified by substitution of other codons which code for the same amino acids but do not contain A and / or U. Examples for this are:
  • the codons for Pro can be changed from CCU or CCA to CCC or CCG; the codons for Arg can be changed from CGU or CGA or AGA or AGG to CGC or CGG; the codons for AIa can be changed from GCU or GCA to GCC or GCG; the codons for GIy can be changed from GGU or GGA to GGC or GGG.
  • the codons for Phe can be changed from UUU to UUC;
  • the codons for Leu can be changed from UUA, UUG, CUU or CUA to CUC or CUG;
  • the codons for Ser can be changed from UCU or UCA or AGU to UCC, UCG or AGC;
  • the codon for Tyr can be changed from UAU to UAC;
  • the codon for Cys can be changed from UGU to UGC;
  • the codon His can be changed from CAU to CAC;
  • the codon for GIn can be changed from CAA to CAG;
  • the codons for He can be changed from AUU or AUA to AUC;
  • the codons for Thr can be changed from ACU or ACA to ACC or ACG;
  • the codon for Asn can be changed from AAU to AAC;
  • the codon for Lys can be changed from AAA to AAG;
  • the codons for VaI can be changed from GUU or GUA to GUC or GUG;
  • the codon for Asp can be changed from GAU to GAC
  • substitutions listed above can be used both individually but also in all possible combinations for increasing the G / C content of the modified mRNA compared to the wild-type mRNA (the original sequence).
  • all codons occurring in the wild-type sequence for Thr may change to ACC (or ACG). be changed.
  • combinations of the above options for substitution are preferably used:
  • the G / C content of the protein-coding region of the modified mRNA is increased by at least 7% -points, more preferably by at least 15% -points, more preferably by at least 20% -points relative to the G / C content of the encoded Be ⁇ rich increases the protein coding Wildtvp mRNA.
  • G / C-maximized sequences for the coding regions of a preferred selection of vital or tumor antigens that can be used in an RNA mixture according to the invention are shown in FIGS. 19 to 81.
  • Another preferred modification of the mRNA of the mixture according to the invention is based on the finding that the translation efficiency is likewise determined by a different frequency in the occurrence of tRNAs in cells. Therefore, if so-called "rare" codons are increasingly present in an RNA sequence, the corresponding mRNA is significantly worse translated than in the case that codons coding for relatively "frequent" tRNAs are present.
  • the region coding for the protein, peptide or polypeptide is modified relative to the corresponding region of the wildtvp mRNA in such a way that at least one codon of the wild-type sequence that is in the cell relatively rare tRNA coded, exchanged for a codon which codes for a relatively frequent in the cell tRNA, which carries the same amino acid as the relatively rare tRNA.
  • This modification modifies the RNA sequences to insert codons for which common tRNAs are available.
  • all codons of the wild-type sequence which code for a relatively rare tRNA in the cell can each be exchanged for a codon which codes for a relatively frequent tRNA in the cell, which carries the same amino acid like the relatively rare tRNA.
  • Which tRNAs telativ often occur in the cell and which in contrast relatively rarely occur is known to a person skilled in the art; see. eg Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11 (6): 660-666.
  • the invention it is particularly preferred to link the, in particular the maximum, sequential G / C portion of the modified mRNA with the "frequent" codons, without the amino acid sequence of the protein, peptide or polypeptide encoded by the coding region of the mRNA change.
  • This preferred embodiment provides a particularly efficiently translated and stabilized mRNA, for example, for the mixture according to the invention.
  • the determination of an mRNA modified as described above can be determined by means of the computer program explained in WO 02/098443, whose disclosure content is fully incorporated into the present invention.
  • the computer program can be used to modify the nucleotide sequence of any desired mRNA in such a way that a maximum G / C content in conjunction with the use of codons which is as frequently as possible in the encoding the cell occurring tRNAs results, wherein the amino acid sequence encoded by the modified mRNA is preferably unchanged from the unmodified sequence.
  • only the G / C content or only the codon usage can be modified relative to the original sequence.
  • the source code in Visual Basic 6.0 development environment used: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Service Pack 3
  • Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Service Pack 3 is also given in WO 02/098443.
  • the A / U content in the vicinity of the ribosome binding site of the modified mRNA of the mixture according to the invention is increased compared to the A / U content in the vicinity of the ribosome binding site of the wild-type mRNA.
  • This modification increases the efficiency of ribosome binding to the mRNA. Effective binding of the ribosomes to the ribosome binding site (Kozak sequence: GCCGCCACCAUGG, the AUG forms the start codon) in turn causes an efficient translation of the mRNA.
  • a likewise preferred embodiment of the present invention relates to a mixture according to the invention, wherein the coding region and / or the 5 'and / or 3' untranslated region of the modified mRNA is so modified relative to the WMdype mRNA that it contains no destabilizing sequence elements, wherein the encoded Amino ⁇ acid sequence of the modified mRNA compared to the wild-type mRNA is preferably not changed.
  • destabilizing sequence elements DSE
  • DSE destabilizing sequence elements
  • one or more such changes may be made to the corresponding region of the wild-type mRNA so that there are no or substantially no destabilizing sequence elements.
  • DSE present in the non-translated regions (3'- and / or 5'-UTR) can also be eliminated from the mRNA.
  • Such destabilizing sequences are, for example, AU-rich sequences ("AURES") which occur in 3 'UTR sections of numerous unstable mRNAs (Caput et al., Proc. Natl. Acad.
  • the mRNA molecules contained in the mixture according to the invention are therefore preferably modified from the wild-type mRNA in such a way that they have no such destabilizing sequences. This also applies to such
  • Sequence motifs which are recognized by possible endonucleases, for example the sequence GAACAAG, which is contained in the 3 'UTR segment of the gene coding for the transferin receptor (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 to 1980). These sequence motifs are preferably removed in the modified mRNA of the mixture according to the invention.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention has a 5'-cap structure.
  • cap structures that can be used in the present invention are m7G (5 ') ppp (5' (A, G (5 ') ppp (5') A and G (5 ') ppp (5') G.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention comprises a poly (A) tail, preferably of at least 25 nucleotides, more preferably of at least 50 nucleotides, even more preferably of at least 70 nucleotides, also more preferably of at least 100 nucleotides, most preferably at least 200 nucleotides.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention comprises at least one IRES and / or at least one 5'- and / or 3 3 -Stabilmaschinessequenz.
  • IRES internal ribosomal entry side
  • IRES sequences which can be used according to the invention are those from picornaviruses (eg FMDV), pestiviruses (CFFV), polioviruses (PV), Encephalic Myocarditis Viruses (ECMV), Foot-and-Mouth Disease Viruses (FMDV), Hepatitis C Viruses (HCV),
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention has at least one 5 'and / or 3' stabilization sequence.
  • These stabilization sequences in the 5 1 and / or 3 'untranslated regions cause an increase in the half-life of the mRNA in the cytosol.
  • These stabilizing sequences may have 100% sequence homology to naturally occurring sequences found in viruses, bacteria and eukaryotes, but may also be partially or wholly synthetic.
  • the untranslated sequences (UTR) of the ⁇ -globin gene for example of Homo sapiens or Xenopus laevis, may be mentioned.
  • a stabilization sequence has the general formula (C / U) CCAN x CCC (U / A) Py x UC (C / U) CC contained in the 3 1 UTR of the very stable mRNA coding for ⁇ -globin , ⁇ - (T) -collagen, 15-Iipoxygenase or for tyrosine hydroxylase (see Holcik et al, Proc. Natl. Acad., USA, 1997, 94: 2410 bis 2414).
  • stabilizing sequences can be used individually or in combination with one another or in combination with other stabilizing sequences known to a person skilled in the art.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention comprises at least one analogous naturally occurring nucleotide.
  • This analogue (s) serves to further stabilize the modified mRNA, this being based on the fact that the RNA-degrading enzymes present in the cells preferably recognize naturally occurring nucleotides as substrate. Therefore, by incorporating nucleotide analogues into the RNA, RNA degradation can be impeded, and the effect on the translation efficiency when these analogs are incorporated, in particular in the coding region of the mRNA, can have a positive or negative effect on the translation efficiency.
  • nucleotide analogues which can be used according to the invention include phosphoramidates, phosphorothioates, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine and inosine.
  • the preparation of such analogs are known to a person skilled in the art, for example, from US Pat. Nos.
  • such analogs can occur in untranslated and translated regions of the modified mRNA.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention which contains a region coding for at least one antigen from a tumor, may additionally contain an additional functional segment which is, for example, suitable for a cytokine promoting the immune response (monokine, lymphokine, interleukin or chemokine such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF- ⁇ , INF- ⁇ , GM-CFS, LT- ⁇ or growth factors such as hGH.
  • a cytokine promoting the immune response monokine, lymphokine, interleukin or chemokine such as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF- ⁇ , INF- ⁇ , GM-CFS, LT- ⁇ or growth factors such as hGH.
  • substitutions, additions or eliminations of bases using a DNA template for the production of the modified mRNA are preferably introduced by means of techniques of customary site-directed mutagenesis (see, for example, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Col Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., CoId Spring Harbor, NY, 2001).
  • a corresponding DNA molecule is transcribed in vitro to produce the mRNA.
  • This DNA template has a suitable promoter, for example a T7 or SP6 promoter, for in vitro transcription, followed by the desired nucleotide sequence for the mRNA to be produced and a termination signal for in vitro transcription.
  • the DNA molecule which forms the template of the RNA construct to be produced is prepared by fermentative propagation and subsequent isolation as part of a plasmid replicable in bacteria.
  • suitable plasmids may, for example, the plasmids pT7Ts (GenBank accession number U26404; Lai et al, Development, 1995, 121:. 2349-2360).
  • PGEM ® series for example, pGEM ® -l (GenBank accession number X65300. from Promega) and pSP64 (GenBank accession number X65327); see.
  • Mezei and Storts Purification of PCR Products, in: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
  • the desired nucleotide sequence can be cloned into a suitable plasmid according to methods familiar to a person skilled in the art in molecular biology (cf., Maniatis et al., supra).
  • the DNA molecule is then cut out of the plasmid in which it can be present in single or multiple copies by digestion with restriction endonucleases.
  • the modified mRNA of the mixture according to the invention is at least one cationic or polycationic Agent is complexed or condensed.
  • a cationic or polycationic agent is preferably an agent selected from the group consisting of protamine, poly-L-lysine, poly-L-arginine and histones.
  • the effective transfer of the modified mRNA into the cells to be treated, or the tissue or the organism to be treated can be improved by associating or binding the modified mRNA with a cationic peptide or protein ,
  • a cationic peptide or protein in particular, the use of protamine as a polycationic, nucleic acid-binding protein is particularly effective.
  • protamine as a polycationic, nucleic acid-binding protein
  • other cationic peptides or proteins such as poly-L-lysine or histones, is of course also possible.
  • This procedure for stabilizing the modified mRNA is described, for example, in EP-A-1083232, the disclosure content of which in this respect is fully included in the present invention.
  • Another object of the present invention relates to a mixture according to the invention for use as a pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical Zusam ⁇ composition containing a mixture according to the invention as well as pharmaceutically suitable excipients and / or carriers.
  • a combination of the mRNAs according to the invention with pharmaceutically acceptable excipients, auxiliaries and / or additives is also disclosed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention additionally contains at least one RNase inhibitor, preferably RNasin .
  • RNase inhibitor preferably RNasin
  • Suitable carriers for parenteral administration are, for example, sterile water, sterile saline solutions, polyalkylene glycols, hydrogenated naphthalene and in particular biocompatible lactide polymers, lactide / glycolide copolymer or polyoxyethylene / polyoxypropylene copolymers.
  • compositions according to the invention may be fillers or substances such as lactose, mannitol, substances for the covalent attachment of polymers such as polyethylene glycol to inhibitors of the invention, complexation with metal ions or inclusion of materials in or on special preparations of polymer compound such as polylactate , Polyglycolic acid, hydrogel or on liposomes, microemulsion, micelles, unilamellar or multilamellar vesicles, erythrocyte fragments or spheroplasts.
  • the respective embodiments of the pharmaceutical composition are chosen depending on the physical behavior, for example with regard to solubility, stability, bioavailability or degradability.
  • Controlled or constant release of the active ingredient according to the invention in the composition includes formulations based on lipophilic depots (eg fatty acids, waxes or oils). Coatings of substances according to the invention or compositions containing such substances, namely coatings with polymers (for example poloxamers or poloxamines) are also disclosed in the context of the present invention. Furthermore, substances or compositions according to the invention may have protective coatings, for example protease inhibitors or permeability enhancers.
  • Preferred carriers are typically aqueous carrier materials using water for injection (WFI) or water buffered with phosphate, citrate or acetate, etc., and the pH is typically 5.0 to 8.0, preferably 6.0 to 7 , 0, is set.
  • the carrier or the vehicle will additionally preferably contain salt components, for example sodium chloride, potassium chloride or other components which make the solution, for example, isotonic.
  • the carrier may contain additional components, such as human serum albumin (HSA), polysorbate 80, sugars or amino acids.
  • HSA human serum albumin
  • polysorbate 80 polysorbate 80, sugars or amino acids.
  • the manner of administration and the dosage of the pharmaceutical composition according to the invention depend on the disease to be treated and its progress stage, as well as the body weight, the age and the sex of the patient.
  • the concentration of the modified rnRNA in such formulations can therefore vary within a wide range of 1 ⁇ g to 100 mg / ml.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is preferably administered to the patient parenterally, for example intravenously, intraarterially, subcutaneously, intramuscularly. Likewise, it is possible to administer the pharmaceutical composition topically or orally.
  • the present invention likewise provides a process for the treatment of diseases, in particular cancer or tumor diseases or a vaccination for the prevention of the abovementioned diseases, which comprises administering the pharmaceutical composition according to the invention to a patient, in particular a human, includes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention further contains one or more adjuvants / adjuvants.
  • adjuvant means any chemical or biological compound which favors a specific immune response.
  • various mechanisms may be considered in this regard. For example. Compounds which promote endocytosis of the modified mRNA contained in the pharmaceutical composition by dendritic cells (DC) form a first class of useful adjuvants.
  • DC dendritic cells
  • Other compounds which permit the maturation of DC for example ipipopolysaccharides, TNF- ⁇ or CD40 ligand, are another class of suitable adjuvants.
  • any gene which influences the immune system can be used as an "danger signal" (LPS, GP96, Oligonucleotide.de with the CpG motif) or cytokines, such as GM-CFS, as an adjuvant, which allow an immune system immune response to an antigen encoded by the modified mRNA and / or directed to influence.
  • the above-mentioned cytokines are preferred.
  • Further known adjuvants are aluminum hydroxide, Freud's Adjuvans and the abovementioned stabilizing cationic peptides or Polypepti ⁇ de, such as protamine.
  • ipopeptides such as Pam3Cys are also particularly suitable for use as adjuvants in the pharmaceutical composition of the present invention; see. Deres et al, Nature 1989, 342: 561-564.
  • a broad subject of the present invention relates to a method for obtaining a mixture according to the invention comprising the following steps: a. in vitro transcription of at least one template DNA encoding at least one
  • Antigen from a tumor b. in vitro transcription of at least one template DNA encoding at least one immunogenic ptotein, c. Degtadation det template DNA by appropriate means, d. Isolating det in steps a. and b. containing mRNA by suitable means, e. Mix det in step d. isolated mRNAs.
  • step c. may preferably be by a DNAse treatment (well known in the art).
  • the isolation of the mRMA can be carried out by preferably more consecutive precipitation and / or extraction processes. For example, IiCl precipitation, ethanol / NaCl precipitation, and phenol / chloroform extraction are contemplated. Further processes are well known to the person skilled in the art. Furthermore, further purification by chromatography can follow.
  • the isolated mRNAs may be present for mixing preferably in water, also preferably at the same concentrations. However, different concentrations can also be selected. Suitable conditions and concentrations below which the mRNAs can advantageously be mixed are also well known to the person skilled in the art.
  • the isolated and / or mixed mRNA may be present in aqueous solvents.
  • This may be, for example, PBS.
  • PBS can be present in various concentrations, for example 1 ⁇ PBS or 10 ⁇ PBS.
  • it may be isotonic saline, which may also be buffered with HEPES.
  • Particularly preferred is the use of Ri ⁇ ger-lactate solution (Fa. Fresenius) alletdings.
  • Ri ⁇ ger-lactate solution Fra. Fresenius alletdings.
  • Ktebs- or Tumetetktankept for example, melanoma, such as malignant melanoma, Hautmelanom, Catzinom, such as Coloncatzinom, lung catcinoma, such as small cell
  • Lung carcinoma adenocarcinoma, ptostatacatcinoma, cervical catcinoma, btustcanccinoma,
  • the substance of the invention which codes for a tumor antigen encodes preferably a tumor-specific surface antigen (TSSA).
  • TSSA tumor-specific surface antigen
  • a further object of the invention relates to the use of a mixture according to the invention for the production of a medicament for the treatment of cancer or tumor diseases, for example melanoma, such as malignant melanoma, melanoma of the skin, carcinoma, such as colon carcinoma, lung carcinoma, such as small cell lung carcinoma, Adenocar ⁇ cinoma, prostate carcinoma, esophageal carcinoma, breast carcinoma, renal catcinoma, sacrum, myeloma, leukemia, especially acute myeloid leukemia, glioma, lymphoma, and blastoma.
  • the mRNA according to the invention coding for a tumor antigen preferably codes for a tumor-specific surface antigen (TSSA).
  • TSSA tumor-specific surface antigen
  • FIGS. 1 to 13 which represent RNA nucleic acid sequences, the start codon and optionally also the stop codon are indicated in bold letters in each case. Shaded in gray are the sequence segments which contain the untranslated region (below). lated region, UTR) of the human alpha-globin gene, which stabilizes the mRNA and further increases the translation of the mRNA.
  • UTR lated region
  • Figure 1 shows the melan A- ⁇ g-A 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 2 shows the tyrosinase ⁇ gA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 3 shows the MAGE Al- ⁇ gA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 4 shows the MAGE A6- ⁇ GA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 5 shows the survivin ⁇ gA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 6 shows the HER-2 / neu ⁇ gA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 7 shows the CEA -OCgA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 8 shows the mucin I -OCgA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 9 shows the GPlOO-CCgA 70 RNA nucleic acid sequence
  • Figure 10 shows the ⁇ g-FLUWT-OCgA 70 RNA nucleic acid sequence. It is the nucleic acid sequence of a variant - containing a point mutation - of the influenza A / Hong Kong / 1/68 Mattix protein. Accession number AF348197
  • Figure 11 shows the ⁇ g-FLUGC rich- ⁇ gA 70 RNA nucleic acid sequence. It is the GC-enriched nucleic acid sequence that encodes a protein that is identical to the influenza A / PR / 8/34 matrix protein, Accession number V01099.
  • Figure 12 shows the HBS-OCgA 70 RNA nucleic acid sequence
  • RNA sequences shown in the figures contain both the coding region and further sequences at the 5 'and at the 3' terminus.
  • Kozak sequences or ribosome binding sequences may be present at the 3'-terminus.
  • a poly-A sequence for example. From a globin gene ( ⁇ or ß), be present.
  • ⁇ or ß globin gene
  • FIG. 13 shows the effect of using different buffers on the expression of mRNA.
  • various mice were injected with different injection agents (containing mRNA coding for luciferase and in each case different buffers) into the ear and the expression rate was determined by measuring the luciferase activity by means of light emission. The exact experimental procedure is explained in Example 2 below. The measurements were taken every 15 seconds for 45 seconds.
  • the values in Figure 13 are plotted on the x-axis in each of three columns for each of the buffers. On the Y axis, the expression rate is in NLU / sec. Mouse played back. As can be seen, the expression rate of the Injetechnischsan ⁇ rate containing Ringer's lactate solution as a buffer, is extremely higher than the other buffer systems used.
  • FIG. 14 shows the course of the clinical trial. Here, two different experimental arrangements are shown (I (upper table), II (lower table).
  • RNA mixture according to the invention which consists of tumor antigen RNA (Survivin, CEA, Mucin-1, Her-2 / neu, MAGE-Al) and viral antigen RNA (Influenza matrix GC, HBS) in same absolute amounts zu ⁇ sammenyear.
  • the administered tumor antigen RNAs corresponded to the sequences shown in FIGS. 3 (MAGE-Al), 5 (survivin), 6 (HER2 neu) and 7 (CEA) or 8 (mucin1).
  • the administered vital antigen HBS corresponded to the sequence in FIG. 12 and the further vital antigen of the FLU-GC sequence shown in FIG. The latter is the only G / C optimized sequence contained in the administered mixture.
  • 200 ⁇ g RNA of the aforementioned antigens were dissolved in 300 ⁇ l of Ringer's lactate solution. Approximately 100 ⁇ l of the solution (per injection) was administered to the patients in the left or right leg. The remainder of the solution remained in the syringe.
  • One day after administration of the RNA mixture the patient was given GM-CSF, also intradermally in the leg.
  • the representation of the agarose gel shows the bands of the eight different RNA antigens in the mixture according to the invention.
  • FIG. 15 shows the experimental arrangement 1 (arm 1) with a total of 16 patients suffering from malignant diseases (RCC: kidney cell carcinoma, ovarian carcinoma or breast cancer) or (arm 2) 11 patients with RCC or colorectal carcinoma , These are each the indication of primary tumors. However, the patients also show metastatic secondary tumors. The patients were subjected to computed tomography (CT scan). In this way, the status of the patients (S: stable, P: progressive or R: regressive) was determined.
  • CRCC kidney cell carcinoma, ovarian carcinoma or breast cancer
  • CT scan computed tomography
  • FIG. 16 shows the intracellular cytokine staining.
  • the cellular immune response was evaluated by FACS analysis. At various times (T), the blood cells were harvested and frozen. After T 8, all the samples were evaluated by analyzing the IFN-gamma secretion and using it as an activation marker for a CD4 T cell response or CD8 T cell response. Answer was viewed.
  • FIG. 17 In the plots of FIG. 17, the course of the measured cell counts for CD4 or CD8 cells is shown in three different patients. The plots show the correlation of biochemical findings (see Example 4) and clinical outcomes in the patient. Patient 1 showed clinical stability at all times when CT scans were taken (before treatment and once every three months thereafter) (SSSS).
  • Patient 2 (Pat2), however, had progressive disease progression (SSSP) at the time of the last CT scan. Progressive disease progression correlates with lower CD4 or CD8 cell titers. Plotted are% of interferon-gamma positive cells per patient.
  • FIG. 18 shows representations from CT scans, the lung of the patient being shown before (left) or after (right) vaccination with the RNA mixture according to the invention. As shown by the tumor size (see arrows) of this secondary tumor in the lungs, this has decreased significantly in the patients after 6 months of treatment.
  • FIGS. 19 to 81 represent RNA sequences of different, respectively designated genes, which were sequence-optimized with regard to their respective G / C content. Sequence optimization was carried out according to the process described in published patent application WO 2002/098443, ie the sequences have a maximum G / C content, without leading to a change in the respectively encoded protein, thereby stabilizing the RNA is achieved. All sequences of FIGS. 19 to 81 (which represent only the coding region) can be prepared in an RNA mixture according to the invention, preferably with modification at the 3 'and / or 5' terminus (for example with the addition of a Kozak sequence or a poly Tail or a ribosome binding site). Examples:
  • the tRNA was obtained by in vitro transcription of suitable template DNA and subsequent extraction and purification of the mRNA.
  • standard methods can be used which are described in detail in the prior art and are familiar to the person skilled in the art.
  • Maniatis et al. 2001
  • Molecular Cloning Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press.
  • the NBLAST program was used here, as already described above.
  • pT7TS contains untranslated regions of alpha or beta globin gene and a polyA tail of 70 nucleotides:
  • Xenopus ß-globin 5'Untranslated region GCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGC
  • Xenopus ß-globin 3 'untranslated region GACTGACTAGGATCTGGTTACCACTAAACCAGCCTCAAGAACACCC- GAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTACAA- AATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAA- AAGAAAGTT TCTTCACATTCTA or human ⁇ -globin untranslated region: CT AGTGACTGA- o TAGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACC
  • FLUWT Plasmid fragment SpeI blunt in T7TS BglII blunt / SpeI blunt 0 FLUGC-rich encodes a matrix Ml protein that is 60%, preferably 65%, more highly expressed 70%, also more preferably 80%, also more preferably 85%, most preferably 90% sequence homology to the protein with the accession number V01099: plasmid fragment Bglll / Spel in T7TS Blgll / Spel
  • GP100 (Accession number M77348): PCR fragment SpeI in T7TS HinDIII blunt / Spel
  • MAGE-Al (Accession number M77481): plasmid fragment HinDIII / Spel in T7TS HinDIII / Spel
  • MAGE-A6 (Accession number: NM_005363): PCR fragment SpeI in T7TS HinDIIIblunt / Spel
  • Her2 / new (Accession number: M11730):
  • Tyrosinase (Accession number: NM_000372): Plasmid fragment EcoRI blunt in T7TS HinDIII blunt / Spel blunt
  • CEA (Accession number: NM_004363): HinDIII / Spel PCR fragment in T7TS HinDIII / Spel
  • CMV pp65 (Accession number: M15120): PCR fragment BamHI / Spel in T7TS Bglll / Spel
  • PR3 Plasmid fragment EcoRI blunt / XbaI in T7TS HinDIII blunt / Spel
  • PRAME (Accession number: NM_006115):
  • Plasmid fragment SacI blunt / BamHI in T7TS HinDIII blunt / BglII
  • Tenascin (Accession number X78565):
  • EGFR1 (accession number AF288738): HinDIII / Spel PCR fragment in T7TS HinDIII / Spe I
  • Sox9 (Accession number Z46629):
  • 500 ⁇ g of each of the above-described plasmids were linearized in a volume of 2.5 ml by digestion with the restriction enzyme PstI or XbaI in a 15 ml Falcon tube. This cut DNA construct was transferred to the RNA production unit. 2.5 ml of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture was added to the linearized DNA. The reaction vessel was vortexed for 2 minutes and centrifuged for 5 minutes at 4,000 rpm. The aqueous phase was lifted off and mixed with 1.75 ml of 2-propanol in a 15 ml Falcon tube.
  • This vessel was centrifuged for 30 minutes at 4,000 rpm, the supernatant discarded and 5 ml of 75% ethanol added.
  • the reaction vessel was centrifuged for 10 minutes at 4,000 rpm and the ethanol was removed.
  • the vessel was again centrifuged for 2 minutes and the remainder of the ethanol was removed with a microliter pipette tip.
  • the DNA pellet was then dissolved in 500 ⁇ l of RNase-free water (1 ⁇ g / ⁇ l).
  • T7 polymerase purified from an E. coli strain containing a plasmid with the polymerase gene. This RNA polymerase uses as substrate only T7 phage promoter sequences (Fa. Fermentas),
  • NTPs chemically synthesized and purified by HPLC. Purity over 96% (Fermentas),
  • RNase inhibitor Rnasin, Injectable grade, produced recombinantly (E. coli) (Fermentas), • DNase: Distributed as a drug through pharmacies as Pulmozym® (dornase alfa) (Roche).
  • ribonuclease inhibitor (recombinant, 40 U / ⁇ l); 80 ⁇ l of rNTP-Mk (ATP 5 CTP, UTP 10 mM), 29 ⁇ l of GTP (100 mM); 116 ⁇ l Cap Analog (100 mM);
  • the total volume was 2 ml and was incubated for 2 hours at 37 ° C in the heating block. Thereafter, 300 ⁇ l of DNAse: Pulmozyme TM (1 U / ⁇ l) were added and the mixture was incubated at 37 ° C. for a further 30 minutes. In this case, the DNA template was enzymatically degraded.
  • the final cleaning was carried out by phenol-chloroform extraction. It can likewise be effected by means of anion exchange chromatography (for example MEGAclear TM from Ambion or Rneasy from Fa. Qiagen). After this purification of the mRNA, the RNA was precipitated against isopropanol and NaCl (1 M NaCl 1:10, isopropanol 1: 1, vortexed, centrifuged at 30 ° C., 4,000 rpm and 4 ° C. and the pellet was treated with 75% ethanol washed). The purified by phenol-chloroform extraction RNA was dissolved in RNase free water and incubated at 4 ° C for at least 12 hours.
  • anion exchange chromatography for example MEGAclear TM from Ambion or Rneasy from Fa. Qiagen.
  • the concentration of each mRNA was measured at OD 260 absorbance.
  • the chloroform-phenol extraction was carried out according to Sambrook J., Fritsch EF, and Maniatis T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Colard Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3 (1989)).
  • the purified mRNAs were mixed in the composition desired for the particular mRNA mixture according to the invention.
  • Equal amounts of each mRNA contained in the respective mixture according to the invention were mixed and the solution was lyophilized by freeze-drying or by alcohol precipitation (isopropanol or ethanol with NaCl). The pellet was resuspended in RNAse-free water at a concentration of 5 mg / ml.
  • this solution was diluted as needed with a buffer.
  • Preferred buffers for this were: Ringer's lactate solution (Fresenius) or PBS (phosphate buffered saline) or isotonic saline, which can also be buffered by HEPES.
  • the dilutions were used to a final concentration for injection (about 0.6 ⁇ g / ⁇ l RNA, a range of 0.1 ⁇ g / ⁇ l up to 10 ⁇ g / ⁇ l was used, preferably the concentration was 0.6 or 0.8 or 1 ⁇ g / ⁇ l).
  • the mixture was mixed with stabilizing cationic agents, as required, as required.
  • B. Protamine, added (about 0.12 ug / ul, it was used a variation range of 0.01 ug / ul up to 10 ug / ul ver ⁇ , preferred, the concentration was 0.12 or 0.16 or 0 , 2 ⁇ g / ⁇ l).
  • the mixture was stored stably at -20 to -80 ° C., optionally it was stored 4 0 C until injection before injection for a shorter time even at room temperature.
  • mice were sacrificed 15 hours after injection by cervical dislocation. The ears were removed, shaved, crushed under nitrogen, and then lysed in buffer (25mM TrisHCl pH 7.5, 2mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100, fresh DTT added to 2mM and PMSF to 1mM ) homogenized. The homogenization took place on ice. Subsequently, the homogenate was centrifuged at 4 ° C for 10 min at maximum rotation in a microfuge (microfuge). The supernatant was then removed, the lysate aliquoted and stored at -80 ° C.
  • buffer 25mM TrisHCl pH 7.5, 2mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X-100, fresh DTT added to 2mM and PMSF to 1mM
  • luciferase reporter gene assay constant light signal chemiluminescence assay for quanti ⁇ tative determination of luciferase activity in transfected cells
  • the luciferase activity was determined twice by measuring the light emission of 50 ⁇ l lysate after addition of 300 ⁇ l measuring buffer (25 mM glycylglycine pH 7.8, 15 mM magnesium sulfate, 5 mM ATP ( freshly added)) and 100 ⁇ l of luciferin (250 ⁇ M in water) as substrate
  • the measurements were made against an empty plate (LP) and against mRNA encoding lacZ in PBS ("lacZ mRNA”) as negative controls.
  • the nucleic acid sequence of the coding region of the mRNAs contained in the mixture was optimized with respect to its G / C content.
  • the computer program already mentioned above and described in WO 02/098443 was used, which modifies the nucleotide sequence of any desired mRNA with the help of the genetic code or its degenerate nature in that a maximum G / C content results in conjunction with the use of codons which code for tRNAs occurring as frequently as possible in the cell, the amino acid sequence encoded by the modified mRNA preferably being preferred to the unmodified sequence is identical.
  • only the G / C content or only the codon usage can be modified from the original sequence.
  • the source code in Visual Basic 6.0 (used development environment: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Service Pack 3) is also disclosed in WO 02/098443.
  • RNA mixtures The carrying out of the clinical trials in the patients treated with RNA mixtures according to the invention is described in FIG.
  • parallel examinations were performed on blood samples taken from the patients before and during the treatment.
  • the blood samples were then analyzed for Ifn- ⁇ positive cells (CD4 and CD8 cells) and their proportion of the total number of cells in each individual patient treated was determined.
  • the increase or decrease in these cell numbers correlates with the clinical phenotype of the patients and thus proves to be a marker for therapeutic success.
  • peripheral blood monocytes PBMCs
  • PBMCs peripheral blood monocytes
  • T4 fourth vaccine day
  • VM peripheral blood monocytes
  • one vial VM was thawed with 10 ⁇ g of an rRNA mixture according to the invention containing equal amounts of tumor antigens (Survivin + Mage-Al + Her2new + Mucinl + CEA) or equal amounts of viral antigens (Influenza GC Rieh + HBS), transfected. The transfection was performed by electroporation.
  • the cells were cultured and re-stititated after one week by newly transfected, thawed autologous peripheral blood monocytes. After another week of culture, again some newly transfected, autologous, thawed peripheral blood monocytes were added to the culture. Six hours later, the cells were collected, fixed and permeabilized using the Cytoficx Cytoperm kit from BD-Pharmingen. A cocktail of antibodies was used to stain the cells: CD4-FITC, antife- rone- ⁇ PE and CD8 PercP. After washing, the cells were analyzed by FACS.
  • the plots according to FIGS. 16 and 17 show the number of CD4 or CD8 T lymphocytes which are reactive with the antigen cocktails (interferon- ⁇ positive cells). There are more reactive cells among the cells collected at the end of the treatment than among the cells collected in the blood at the beginning of the treatment. This suggests that the injections of the active RNA mixture have an antiviral (Flu and / or Hbs) and an antitumor (Her2neu and / or Suvivin and / or Mucin-1 and / or Her2 and / or CEA) Cell response has triggered. In some patients (essentially four and ten) more reactive cells were collected in the blood at the end of the treatment than at the beginning of the treatment. In FIG. 17, SSS represents a stabilized disease after three consecutive CT scans. P means progression.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch, welches mRNA zur Vakzinierung enthält, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodieren­den Bereich enthält und mindestens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immuno­genes Protein (Polypeptid) kodierenden Bereich enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das mRNA-Gemisch enthält, sowie die Verwen­dung zur Behandlung von Tumorerkrankungen.

Description

mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch, welches mRNA zur Vakzinierung enthält, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodieren- den Bereich enthält und mindestens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immuno- genes Protein kodierenden Bereich enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeu¬ tische Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes mRNA-Gemisch enthält, sowie die Verwendung zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
In der Therapie und Prävention zahlreicher Erkrankungen spielen molekularmedizinische Verfahren, wie die Gentherapie und die genetische Vakzinierung, eine große Rolle. Basis die¬ ser Verfahren ist die Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. Gewebe des Patienten, gefolgt von der Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren kodierten Informa¬ tionen, d.h. der Expression der erwünschten Polypeptide bzw. Proteine. Als einzubringende Nukleinsäuren kommt hierbei sowohl DNA als auch RNA in Betracht.
Die bisher üblichen Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung basieren auf der Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzu¬ schleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Caldumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplas¬ ten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion und lipofektion, entwickelt worden, wobei sich insbesondere die lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat. Ebenfalls kommt die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren erzielen aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate. Die verwendeten Viren werden bei diesem Verfahren genetisch verändert, damit in der transfizierten Zelle keine funktionsfä- higeα infektiösen Partikel gebildet werden. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme kann jedoch, z.B. aufgrund möglicher Rekombinationsereignisse, ein Risiko der unkontrollierten Ausbrei¬ tung der eingebrachten gentherapeutisch wirksamen sowie viralen Gene nicht ausgeschlossen werden.
Wie erwähnt, kommt in der Gentherapie neben DNA auch RNA als verwendbare Nuklein¬ säure in Betracht. Und obwohl im Stand det Technik bekannt ist, dass die Instabilität von mRNA bzw. von RNA im allgemeinen ein Problem in der Anwendung von medizinischen Verfahren, die auf RNA-Expressionssystemen beruhen, darstellen kann, stellen RNA- Expressionssysteme gegenüber DNA-Expressionssystemen in der Gentherapie und in der genetischen Vakzinierung erhebliche Vorteile dar. Hierzu gehört u.a., dass eine in eine Zelle eingebrachte RNA nicht in das Genom integriert, während bei Verwendung von DNA (z.B. als DNA-Vehikel, die von DNA-Viren abgeleitet werden), die in eine Zelle eingebracht wird, diese DNA in gewissem Ausmaß in das Genom integriert. Dies birgt die Gefahr, dass die DNA in ein intaktes Gen des Genoms der Wirtszelle inseriert, mit der Folge, das dieses Gen mutiert und damit vollständig oder teilweise inaktiviert werden kann oder zu einer Fehlinfor¬ mation führt. D.h., die Synthese eines für die Zelle lebenswichtigen Genprodukts kann voll¬ ständig ausgeschaltet werden oder aber ein verändertes oder falsches Genprodukt wird exprimiert. Eine besondere Gefahr besteht dann, wenn die Integration der DNA in ein Gen erfolgt, das in die Regulation des Zellwachstums involviert ist. In diesem Fall kann die Wirts¬ zelle in einen entarteten Zustand gelangen und zur Krebs- bzw. Tumorbildung führen. Dar¬ über hinaus ist für die Expression einer in die Zelle eingebrachten DNA erforderlich, dass die entsprechenden DNA-Vehikel einen starken Promotor, wie den vitalen CMV-Promotor, ent¬ halten. Die Integration derartiger Promotoren in das Genom der behandelten Zelle kann zu unerwünschten Veränderungen der Regulierung der Genexpression in der Zelle führen. Im Gegensatz dazu sind bei der Verwendung von RNA als Vakzine keine vitalen Sequenzen, wie Promotoren etc., zur wirksamen Transkription, erforderlich.
Eine weitere Gefahr bei der Verwendung von DNA als Vakzine (oder Gentherapeutikum) ist die Induktion pathogener Anti-DNA-Antikörper in dem Patienten, in den die Fremd-DNA eingebracht wird, unter Hervorrufung einer - möglicherweise tödlichen - Immunantwort. Im
Gegensatz dazu sind bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen worden. Ursächlich hierfür wird die Tatsache sein, dass RNA wesentlich einfacher in vivo, also in dem Organismus des Patienten, abgebaut wkd. RNA besitzt gegenüber DNA relativ kurze Halbwertszeiten im Blutkreislauf.
Trotz der erwähnten mannigfaltigen Vorteile der Verwendung von RNA gegenüber DNA in molekulargenetischen Verfahren, stellt die bereits erwähnte Instabilität der RNA ein Problem dar. Verantwortlich für die Instabilität der RNA sind insbesondere RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonucleasen), wobei selbst die kleinsten Verunreinigungen mit Ribonuclea- sen reichen ausreichen, um RNA in Lösung vollständig abzubauen. Daneben gibt es zahlrei- che weitere Prozesse, welche die RNA destabilisieren. Viele diese Prozesse sind noch unbe¬ kannt, oftmals scheint jedoch eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich zu sein. Auf der anderen Seite sind auch zahlreiche Phänomene bekannt, die eine RNA stabilisieren.
In diesem Zusammenhang sind im Stand der Technik einige Maßnahmen vorgeschlagen worden, die Stabilität von RNA zu erhöhen und dadurch ihren Einsatz als Gentherapeutikum bzw. RNA-Vakzine zu ermöglichen.
In EP-A-1083232 wird zur Lösung des Problems der Instabilität von RNA ex vivo ein Verfah- ren zur Einbringung von RNA, insbesondere mRNA, in Zellen und Organismen vorgeschla¬ gen, bei welchem die RNA in Form eines Komplexes mit einem kationischen Peptid oder Protein vorliegt.
WO 99/14346 beschreibt weitere Verfahren zur Stabilisierung von mRNA. Insbesondere werden Modifizierungen der mRNA vorgeschlagen, welche die mRNA-Spezies gegenüber dem Abbau von RNasen stabilisieren. Derartige Modifikationen betreffen einerseits die Stabi¬ lisierung durch. Sequenzmodifikationen, insbesondere die Verminderung des C- und/oder U- Gehalts durch Baseneliminierung oder Basensubstitution. Andererseits werden chemische Modifikationen, insbesondere die Verwendung von Nukleotidanaloga, sowie 5'- und 3'- BIo- ckierungsgruppen, eine erhöhte Länge des Poly-A-Schwanzes sowie die Komplexierung der mRNA mit stabilisierenden Mitteln und Kombinationen der genannten Maßnahmen vorge¬ schlagen. In den US-Patenten US 5,580,859 und US 6,214,804 werden unter anderem im Rahmen der "transienten Gentherapie" (TGT) mRNA-Vakzine und -Therapeutika offenbart. Es werden verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Translationseffizienz und der nαRNA-Stabüität beschrieben, die sich vor allem auf die nicht-translatierten Sequenzbereiche beziehen.
Bieler und Wagner (in: Schleef (Hrsg.), Plasmids for Therapy and Vaccination, Kapitel 9, Sei¬ ten 147 bis 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) berichten von der Verwendung synthetischer Gene im Zusammenhang mit gentherapeutischen Methoden unter Verwendung von DNA- Vakzinen und lentiveralen Vektoren. Es wird die Konstruktion eines synthetischen, von HIV- 1 abgeleiteten
Figure imgf000005_0001
beschrieben, bei welchem die Codons gegenüber der Wildtyp- Sequenz derart modifiziert wurden (alternative Codonverwendung, engl, "codon usage"), dass sie der Verwendung von Codons entsprach, die in hoch exprimierten Säugergenen zu finden ist. Dadurch wurde insbesondere der A/T-Gehalt gegenüber der Wildtyp-Sequenz vermiti- dert. Die Autoren stellen insbesondere eine erhöhte Expressionsrate des synthetischen gag- Gens in ttansfizietten Zellen fest. Des weiteren wurde in Mäusen eine erhöhte AntLkörperbil- dung gegen das gag-Viotάn bei mit dem synthetischen DNA-Konstrukt immunisierten Mäu¬ sen und auch eine verstärkte Cytokinfreisetzung in vitro bei ttansfizierten Milzzellen von Mäu¬ sen beobachtet. Schließlich konnte eine Induzierung einer cytotoxischen Immunantwort in mit dem
Figure imgf000005_0002
immunisierten Mäusen festgestellt werden. Die Autoren dieses Artikels führen die verbesserten Eigenschaften ihrer DNA-Vakzine im wesentlichen auf einen durch die optimierte Codonverwendung hervorgerufene Veränderung des Nukleo- cytoplasmatischen Transports der vom DNA-Vakzin exprimierten mRNA zurück. Im Ge¬ gensatz dazu halten die Autoren die Auswirkung der veränderten Codonverwendung auf die Translationseffizienz für gering.
Zwischenzeitlich werden im Stand der Technik auch Verfahren beschrieben, die auf einer mRNA-Vakzinierung basieren sowie hierfür verwendbare Zusammensetzungen, bei denen mRNA vorzugsweise stabilisiert wird.
So beschreibt WO 02/098443 eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine stabilisierte mRNA enthält und als Vakzine zur Behandlung von Krebs- und Infektionserkrankungen sowie zur Geweberegeneration verwendet wird. Die mRNA kodiert für ein biologisch wirk¬ sames oder antigenes Peptid und wird insbesondere durch Erhöhung des C/G-Gehalts in der kodierenden Region stabilisiert.
Die WO 03/051401 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine mRNA enthält, die ein Tumorantigen kodiert, und ggf. ein Cytokin enthält zur Behandlung und Pro¬ phylaxe von Krebserkrankungen. Auch hier werden verschiedene Varianten zur Stabilisierung der mRNA in dieser Zusammensetzung beschrieben.
Im Stand der Technik werden jedoch keine mRNA-Vakzine beschrieben, die auch die Auslö¬ sung einer Immunantwort in dem Organismus, dem sie appliziert werden, sicherstellen bzw. erhöhen bzw. erleichtern. Dies wäre jedoch von erheblichem Vorteil, da der Organismus (Pa¬ tient) einer erhöhten Belastung, durch beispielsweise mehrfache Applikationen, erhöhte Do¬ sierungen etc., ausgesetzt werden könnte oder müßte, wenn die mRNA-Vakzinierung nicht oder nicht in dem gewünschten Ausmaß erfolgreich verläuft. Hierdurch wird auch das Risiko auftretender Nebenwirkungen gegen die Vakzine erhöht.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Genthe¬ rapie oder genetischen Vakzinierung bereitzustellen, das zum einen die Nachteile der Ver- wendung von DNA-Therapeutika und DNA-Vakzinierung beseitigt und zum anderen eine effektivere Wirkung von auf mRNA basierenden Therapeutika und Vakzinen erzielt.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Ein Gegenstand der Erfindung betrifft demnach ein Gemisch, das mRNA zur Vakzinierung enthält, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält und mindestens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass nahezu jeder Organismus sogenannte „Gedächtnis-Immunantworten" gegen gewisse Fremd-Moleküle, z.B. Proteine, insbesondere virale Proteine, Antigene, besitzt. Das bedeutet, dass ein Organismus bereits zu einem frühe¬ ren Zeitpunkt mit einem solchen Fremd-Molekül infiziert worden ist, und dass durch diese Infektion bereits eine Immunantwort gegen dieses Fremd-Molekül, z.B. ein vitales Protein, ausgelöst wurde, die dem Immunsystem im „Gedächtnis" bleibt, d.h. die es speichert. Bei einer erneuten Infektion mit dem gleichen Fremd-Molekül wird diese Immunantwort reakti¬ viert. Erfindungsgemäß kann eine solche Reaktivierung der Immunantwort durch die Vakzi¬ nierung mit dem erfindungsgemäßen Gemisch erfolgen, und zwar durch die in dem Gemisch enthaltene mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält. Diese Reaktivierung kann erfindungsgemäß sogar ortsspezifisch, nämlich am Ort der Applikation des Gemisches, z.B. Applikation in ein Tumorgewebe, erfolgen. Hierdurch kann die Auslösung einer (neuen) Immunantwort gegen das oben beschriebene Fremd-Molekül (gegen das eine Gedächtnis-Immunantwort vorliegt) unterstützt/erleichtert werden.
„Vakzinierung" bzw. „Impfung" bedeutet im allgemeinen die Einbringung eines oder mehre- v rer Antigene eines Tumors oder im Sinne der Erfindung die Einbringung der genetischen Information für ein oder mehrere Antigen(e) eines Tumors in Form der für das/die Anti¬ gen^) eines Tumors kodierenden mRNA in einen Organismus, insbesondere in ei¬ ne/mehrere ZeEe/Zellen bzw. Gewebe dieses Organismus. Die so verabreichte mRNA wird in dem Organismus bzw. in dessen Zellen in das (Tumor-)Antigen translatiert, d.h. das von der mRNA kodierte Antigen (auch: antigenes Polypeptid oder antigenes Peptid) wird expri- miert, wodurch eine gegen dieses Antigen gerichtete Immunantwort stimuliert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein „Antigen aus einem Tumor" oder auch „Tumorantigen", dass das entsprechende Antigen in Zellen exprimiert wird, die mit einem Tumor assoziert sind. Insbesondere handelt es sich hierbei um Antigene, die in den entarteten Zellen (Tumorzellen) selbst produziert werden. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um An¬ tigene, die auf der Oberfläche der Zellen lokalisiert sind. Weiterhin sind erfindungsgemäß auch solche Antigene aus Tumoren umfasst, die in Zellen exprimiert werden, die nicht selbst entartet sind oder ursprünglich nicht selbst entartet waren, jedoch mit dem vorstehend er- wähnten Tumor assoziiert sind. Dazu gehören zum Beispiel auch Antigene, die mit Tumor¬ versorgenden Gefäßen bzw. deren Bildung oder Neubildung zusammenhängen, insbesondere solche Antigene, die mit der Neovaskularisierung oder Angiogenese assoziiert sind, z.B. Wachstumsfaktot en wie VEGF, bFGF, usw. Weiterhin umfassen derartige mit einem Tumor zusammenhängende Antigene auch Antigene, die aus Zellen des Gewebes stammen, die den Tumor einbetten. Hierbei kann es sich beispielsweise um Antigene von Bindegewebszellen, z.B. Antigene der extrazellulären Matrix, handeln. Das erfindungsgemäße Gemisch kann (mindestens eine) mRNA enthalten, die von 1 bis 50, vorzugsweise 1 bis 10 solcher Antigene aus einem Tumor kodiert/kodieren.
Beispiele für derartige Tumorantigene sind 707-AP, AFP, ART-4 (Adenocarcinoma recogni- zed Antigen; AB026125), BAGE, ß-Catenin/m, Bcr-abl, CAMEL (AJ012835), CAP-1, CASP- 8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, z.B. GAGE-4, GnT-V, GP 100HAGE, HAGE, HAST-2, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, hTERT (oder hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, z.B. LAGE-I, LDLR/FUT, MAGE, z.B. MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, MAGEAl, MAGEA2 (L18920), MAGE-A3, MAGE-A4 (U10687), MAGE-A6, MAGE-AlO; MClR (Melanocyte Stimulating Hormone Receptor; X65634), Myosin/m, Melan-A, Melan-A/MART-1, Mucl, Mucin-1, MUM-I, -2, - 3, NA88-A, NY-ESO-I, NY-ESO-I /LAGE-2, pl90 minor bcr-abl, Pml/RARα, PRAME (U65011), Proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, z.B. RAGE-3 (Ü46193), RUl oder RU2, SAGE, SART-I (AB006198), SART-2 (AF098066) oder SART-3 (AB020880), SCPl, SSX, z.B. SSX2 (X86175), Survivin, TEL/ AMLl, TPI/m, TRP-I, TRP-2, TRP-2/INT2, Tyrosinase und WTl (BC046461), VEGF (M32977), VEGFR-2 (AF063658), VEGFR-I (XM_497921), PDGF-R (BC032224), Her3 (M34309), Ep-CAM (KSA bzw. GA733-2; M32325 bzw. M33011), PSMA (AF007544), PSA (M26663), PSCA (AF043498), Vimentin (Z19554), Adi- pose Differentiation Antigen (X97324), ß-Actin (Ml 0277), Met-Protoonkogen 002958), Iso¬ form G250 der Carbonanhydrase (X66839), Cytochrom P450 (AF450132), Cyclin Dl (X59798), Cyclin (M15796), DAM (X82539), HCV-Polyprotein (L20498), p53 (M14695), MDM2 (X58876), Sperm-Protein (AF015527), Adenovirus-Protein E3, α-Actinin 4, CD4- Cyclin-abhängige Proteinkinase, KIAA 0020 (D13645), Malic Enzyme (L34035), MYO IG, Pmell7 (M77348), Wegner's Autoantigen (X56132), Silencing Information Regulator 2-like Protein (AF095714), Ribosomal Protein S2 (BC001795), Multidrug Resistance Protein-3 (Y17151), Adenovirus-Protein EIa, Adenovirus EIb, Bcr-AbL PR33 E/L-Selectin, Recoverin, hTERT, und CMV pp65. Besonders bevorzugte Tumorantigene sind MAGE, insbesondere MAGE-Al und MAGE- A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase, Survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu und Mucin-1. Weiterhin bevorzugt ist es, wenn ein erfindungsgemäßes RNA-Gemisch min¬ destens ein vitales Tumorantigen (bspw. HPV-E7 oder HCV-Polyprotein oder Adenovkus- Protein E3, EIa oder EIb) enthält, ggf. in Kombination mit mindestens einem originär hu¬ manen, vorzugsweise autologen Tumorantigen des zu behandelnden Patienten. Bevorzugt handelt es sich bei dem autologen Tumorantigen um eines der vorgenannten Antigene, insbe¬ sondere MAGE, hierbei insbesondere MAGE-Al und MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosi¬ nase, Survivin, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu, Mucin-1, PSA, p53, Bcr-Abl, PDGFR, Her3 oder Cyclin. Ganz besonders bevorzugt liegt in einem erfindungsgemäßen RNA-Gemisch ein oder zwei verschiedene vitale Tumorantigene in Kombination mit 2 bis 6 verschiedenen autologen Tumorantigenen des Patienten vor. Im Falle eines RNA-Gemisches ohne vitale Tumorantigene ist es ebenfalls bevorzugt, dass dieses 2 bis 6 verschiedene Tu¬ morantigene, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der vorgenannten Tumorantigene, enthält.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die mindestens eine mRNA des Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodie¬ renden Bereich enthält, für ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al und MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase und Survivin.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu, Mu- cin-1 und Survivin ausgewählt ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus Te- lomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin. In einer weiteten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert die mindestens eine mRNA des Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tu¬ mor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNC (Tenascin C), EGFRI, SOX9, SEC61G und PTPRZl.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acession number M77481, Accession number NM_005363, Accession number NM_005511, Accession number M77348, Accession number NM_000372 und Accession number AF077350.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe be¬ stehend aus Acession number M77481, Accession number NM_004363, Accession num¬ ber Ml 1730, Accession number NM_002456 und Accession number AF077350.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number NM_003219, Accession number NM_002777, Accession number NM_000378, Accession number NM_006115, Accession number NM_002456]und Accessi¬ on number AF077350.
Eine weiterhin bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Ge¬ misch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe be¬ stehend aus Accession number X78565, Accession number AF288738, Accession number Z46629, Accession number NM_014302 und Accession number NM_002851. Sämtliche in der vorliegenden Erfindung aufgeführten Accession numbers (Zugriffsnum¬ mern) beziehen sich auf die jeweiligen Proteinsequenzen, erhalten aus der ncbi (PubMed)- Datenbank, im Internet unter http://www.ncbi.nlm.nui.gov/entrez/query.fcgi (bzw. http://www.ncbi.nkn.nih.gov/ entrez/que:ty.fcgi?db=Protein&itool=toolbar).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das oder sind die Antigen(e) aus einem Tumor ein Polyepitop des/der Antigens/Antigene aus einem Tumor. Ein „Polyepi- top" eines Antigens bzw. mehrerer Antigene ist eine Aminosäuresequenz, in der mehrere oder viele Regionen des/der Antigens/Antigene repräsentiert werden, die mit dem Antigen- bindenden Teil eines Antikörpers oder mit einem T-Zell-Rezeptor in Wechselwirkung treten. Das Polyepitop kann dabei vollständig und unmodifiziert vorliegen. Es kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Optimierung der Antikörper/ Antigen- bzw. T- Zell-Rezeptor/Antigen-Wechselwirkung, auch modifiziert vorliegen. Eine Modifikation ge¬ genüber dem Wildtyp-Polyepitop kann bspw. eine Deletion, Addition und/ oder Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste umfassen. Dementsprechend wird/werden in der für das modifizierte Polyepitop kodierenden mRNA der vorliegenden Erfindung gegenüber der für das Wildtyp-Polyepitop kodierenden mRNA ein oder mehrere Nukleotide entfernt, hin¬ zugefügt und/ oder ersetzt.
„Immunogenes Protein" im Sinne der Erfindung betrifft ein „Fremdprotein", insbesondere ein „Protein eines Pathogens", das eine Immunantwort auslöst, sofern es in einen fremden Organismus gelangt. Die Begriffe „immunogenes Protein", „Fremdprotein" und „Protein eines Pathogens" sind synonym zu verwenden. Weiterhin steht der Begriff „Protein" syn¬ onym auch für „Polypeptid" und „Peptid". Bei einem solchen immunogenen Protein handelt es sich insbesondere um ein virales oder bakterielles Protein oder ein Pilz-Protein. Erfin¬ dungsgemäß sind jedoch auch Proteine jedes beliebigen anderen Pathogens umfasst. Das Auslösen der Immunantwort erfolgt in der Regel durch die Infektion des fremden Organis¬ mus (z.B. einem Säugetier, insbesondere einem Mensch) mit einem pathogenen Organismus, z.B. einem Virus, der dieses immunogene Protein enthält oder auf der Oberfläche trägt und durch den Infektionsvorgang mit in den fremden Organismus einbringt. Es ist bevorzugt, dass in dem Organismus, der einmal mit einem solchen immunogenen Protein infiziert wird, die dadurch ausgelöste Immunantwort gespeichert wird, und dass bei einer erneuten Infekti- on mit diesem Protein diese Immunantwort reaktiviert wird. Es liegt demnach eine sog. Ge- dächtois-Immunantwort gegen das immunogene Protein vor. Ein Beispiel für einen solchen Vorgang gibt ein weit verbreitetes Virus, mit dem sich beispielsweise nahezu jedes erwachse¬ ne Individuum, insbesondere der Mensch, in seinem Leben bereits infiziert hat, und zwar das Influenza A oder B Virus. Bei dieser Infektion wird eine Immunantwort gegen die Influenza- Virusproteine, einschließlich der Influenza-Matrixproteine, gebildet. Gelangt ein solches In¬ fluenza-Virusprotein, insbesondere ein Influenza-Matrixprotein, erneut in den bereits früher infizierten Organismus, reaktivert dieser die Immunantwort gegen das/die Protein(e).
Immunogene Proteine im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise Strukturproteine von Viren, insbesondere Matrixproteine, Capsidproteine und Oberflächenproteine der Iipidmembran. Weitere Beispiele für solche vitalen Proteine sind Proteine von Adenovken, Rhinoviren, Co- rona-Viren. Besonders bevorzugt ist hierbei das Hepatitis B Oberflächen-Antigen („Hepatitis B Surface Antigen", nachfolgend als „HBS-Antigen" bezeichnet). Das HBS-Antigen [Acces- sion number E00121] ist ein fremdes Antigen, das für die meisten Organismen, insbesondere Säugetiere, vor den allem Mensch, die weder mit dem Hepatits B Virus (HBV) infiziert sind oder waren oder gegen HBV vakziniert wurden, ein neues Antigen darstellt. Der Nachweis einer Immunreaktion auf fremde Antigenen erfolgt in der Regel effizienter als auf eigene An¬ tigene, wie Tumorantigene, da Zellen, die diese eigenen Antigene tragen, meistens durch das Immunsystem inaktiviert oder zerstört werden, um eine Autoimmunität zu vermeiden. Eine Immunreaktion auf das HBS-Antigen, kann daher einen Surrogat-Marker für die Effizienz des verabreichten erfindungsgemäßen Gemisches dienen. Weiterhin kann das HBS-Antigen im Zusammenwirken mit einem weiteren immunogenen Protein der Erfindung die Immun¬ antwort des Organismus, dem das erfindungsgemäße Gemisch verabreicht wird, erheblich verstärken. Ein weiteres bevorzugtes immunogenes Protein ist das CMV pp65 [Accession number Ml 5120].
Ein ganz besonders bevorzugtes immunogenes Protein ist das Influenza-Matixprotein, ge¬ nauer das Influenza Matrix-Ml -Protein. Es sind zwei Typen des Influenzavirus bekannt, das Influenza A Virus und das Influenza B Virus. Für beide Typen sind verschiedene Sero-Typen bekannt, die jeweils leichte Sequenzunterschiede zueinander aufweisen. Eine bevorzugte Aus¬ führungsform der Erfindung betrifft daher ein Gemisch, in welchem die mindestens eine rrϊRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein odet Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixprotein, besonders be¬ vorzugt das Influenza A-Matrix-Ml -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml -Protein kodiert.
Konsequenterweise betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immuno- genes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza- Matrixprotein, besonders bevorzugt das Influenza A-Matrix-Ml -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml-Protein, oder für HBS oder für CMV pp65 kodiert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Gemisch, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodie¬ renden Bereich enthält, für ein immunogenes Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number AF348197, Accession number VOl 099, Accession number E00121 und Accession number M15120.
Beispiele für bevorzugte erfindungsgemäße immungenetische Proteine sind Proteine weit verbreiteter Pathogene, d.h. Pathogene, mit denen mit großer Wahrscheinlichkeit jeder Orga¬ nismus, insbesondere Säugetiere, bevorzugt der Mensch, mindestens einmal in seinem Leben infiziert wird. Hierzu zählen beispielsweise jedes Struktur- oder Nicht-Strukturprotein von:
- Influenzavirus Typ A oder B oder jedes anderen Orthomyxoviren (Influenza Typ C),
- Picornaviren, wie Rhinovirus oder Hepatitis A Virus,
- Togaviren, wie Alphavirus oder Rubivirus, z.B. Sindbis, Semliki-Forest oder Rubeo- lavirus (Masernvirus), Rubellavirus (Röteinvirus),
- Coronaviren, insbesondere die Subtypen HCV-229E oder HCV-OC43,
- Rhabdovken, wie Rabiesvirus,
- Paramyxoviren, wie Mumpsvirus,
- Reoviren, wie Rotavirus der Gruppe A, B oder C, - Hepadnaviren, wie Hepatitis B Virus,
- Papoviren, wie humane Papillomaviten (HPV) jedes Serotyps (von 1 bis 75),
- Adenoviren von Typ 1 bis 47, - Herpesviren, wie Herpes Simplexvirus 1, 2 oder 3, Cytomegalievirus (CMV), insbe¬ sondere bevorzugt CMVpp65, oder Epstein-Barr-Virus (EBV),
- Vacciniaviren und
- dem Bakterium Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae).
Beispiele für ebenfalls bevorzugte erfindungsgemäße immungenetische Proteine sind Proteine von Pathogenen, die einen Organismus, insbesondere ein Säugetier, vorzugsweise einen Men¬ schen, selten infizieren. Hierzu gehören zum Beispiel jedes Struktur- oder Nicht- Strukturprotein von:
Flaviviren, wie Denguevirus Typ 1 bis 4, Gelbfiebervirus, West-Nile-Virus, Japa- nisches-Encephalitis-Virus oder Hepatitis C Virus Caliciviren,
Filoviren, wie Ebokvirus, - Bornaviren,
Bunyaviren, wie Rift-Valley-Fieber Virus,
Arenavken, wie LCMV (Virus der lymphocytären Choriomeningitis) oder Viren des Hämorrhagischen Fiebers, Retrovirus, wie HIV und - Parvoviren.
Erfindungsgemäß sind ebenfalls funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten eines immunogenen Proteins bzw. eines Antigens aus einem Tumor der Erfindung sowie der erfindungsgemäßen mRNA uthfasst. „Funktionell" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass das immunogene Protein bzw. das Antigen aus einem Tumor bzw. die mRNA immunologische bzw, immunogene Aktivität aufweist, insbesondere eine Immunantwort in einem Organis¬ mus, in dem es fremd ist, auslöst. Die erfindungsgemäße mRNA ist funktionell, wenn sie in ein funktionelles immunogenes Protein bzw. Tumorantigen (oder Fragment hiervon) transla- tiert werden kann.
Unter einem „Fragment" im Sinne der Erfindung ist ein verkürztes immunogenes Protein bzw. Tumorantigen bzw. eine verkürzte mRNA der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Es kann sich hierbei um N-terminal, C-terminal oder intrasequentiell verkürzte Aminosäure¬ bzw. Nukleinsäuresequenzen handeln.
Die Herstellung erfindungsgemäßer Fragmente ist im Stand der Technik gut bekannt und kann von einem Fachmann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden (siehe z.B. Maniatis et al. (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, CoId Spring Har- bour Laboratory Press). Im allgemeinen kann die Herstellung der Fragmente des immunoge- nen Proteins bzw. des Antigens durch Modifizieren der DNA-Sequenz, die das Wildtyp- Molekül kodiert, gefolgt von einer Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression dieser modifizierten DNA-Sequenz, unter der Voraussetzung, dass die Modifikation der DNA die beschriebenen funktionellen Aktivitäten nicht zerstört, durchge¬ führt werden. Im Falle der erfindungsgemäßen mRNA kann die Herstellung des Fragements ebenfalls durch Modifizieren der Wildtyp-DNA-Sequenz gefolgt von einer in vitro Transkrip¬ tion und Isolierung der mRNA erfolgen, ebenfalls unter der Voraussetzung, dass die Modifi- kation der DNA die funktionelle Aktivität der mRNA nicht zerstört. Die Identifizierung eines erfindungsgemäßen Fragments kann beispielsweise über eine Sequenzierung des Fragments und einem nachfolgenden Vergleich der erhaltenen Sequenz mit der Wildtyp-Sequenz erfol¬ gen. Die Sequenzierung kann anhand von Standardverfahren, die im Stand der Technik zahl¬ reich und gut bekannt sind, erfolgen.
Als „Varianten" im Sinne der Erfindung werden insbesondere solche immunogenen Proteine, Antigene bzw. mRNA bezeichnet, die Sequenzunterschiede zu den entsprechenden Wildtyp- Sequenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichungen kann es sich um eine oder mehrere Insertionen), Deletion(en) und/oder Substitutionen) von Aminosäuren bzw. Nukleinsäuren handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 60%, bevorzugt 70%, stärker bevor¬ zugt 80%, ebenfalls stärker bevorzugt 85%, noch stärker bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 97% vorliegt.
Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen zu bestim- men, können die Sequenzen abgeglichen werden, um nachfolgend miteinander verglichen zu werden. Hierfür können z.B. Lücken in die Sequenz der ersten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenz eingeführt werden und die Aminosäuren bzw. Nukleinsäuren an der entspre- chenden Position der zweiten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Aminosäuresequenz mit der gleichen Aminosäure bzw. der gleichen Nukleinsäure besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Se¬ quenzen.
Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathemati¬ schen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen heran¬ gezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873- 5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegen¬ den Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped alignment"), wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das "Gapped BLAST" -Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 beschrieben.
Funktionelle Varianten im Sinne der Erfindung, können vorzugsweise mRNA-Moleküle sein, die eine erhöhte Stabilität und/oder Translationsrate gegenüber ihren Wildtyp-Molekülen aufweisen. Ebenfalls kann ein besserer Transport in die Zelle des (Wirts-) Organismus vorlie¬ gen. Varianten können insbesondere auch immunogenen Proteine sein, die stabilisiert sind, um einer physiologischen Degradation zu entgehen, bspw. durch Stabilisierung des Protein¬ rückgrats durch Substitution der amidartigen Bindung, bspw. auch durch den Einsatz von ß- Aminosäuren.
Unter den Begriff Varianten fallen insbesondere solche Aminosäuresequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitution aufweisen. Als konservative Substi¬ tutionen werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Insbesondere gibt es Aminosäu- ren mit aliphatischen Seitenketten, positiv oder negativ geladenen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenketten oder Aminosäuren, deren Seitenketten Wasserstoffbrücken ein¬ gehen können, bspw. Seitenketten, die eine Hydroxyfunktion besitzen. Das bedeutet, dass bspw. eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einer gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispielsweise eine durch eine hydrophobe Seitenkette gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichfalls hyd¬ rophober Seitenkette substituiert wird (z.B. Serin (Threonin) durch Threonin (Serin) bzw. Leucin (Isoleucin) durch Isoleucin (Leucin)). Insertionen und Substitutionen sind insbesonde¬ re an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Veränderung der dreidimensionalen Struktur hervorrufen oder den Bindungsbereich betreffen. Eine Veränderung einer dreidi¬ mensionalen Struktur durch Insertionen) oder Deletion(en) ist bspw. mit Hilfe von CD- Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar (Urrv, 1985, Absorption, circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neu- berger et al. (Hrgb.), Elsevier, Amsterdam).
Ebenfalls umfasst sind Varianten, bei denen ein „codon usage" erfolgt. Jede Animosäure wird durch ein Codon, das durch jeweils drei Nukelotide (Triplet) definiert wird, kodiert. Es ist möglich, ein Codon, das eine bestimmte Aminosäure kodiert, gegen ein anderes Codon, das dieselbe Aminosäure kodiert, auszutauschen. Durch die Wahl geeigneter alternativer Codons kann beispielsweise die Stabilität der erfindungsgemäßen mRNA erhöht werden. Hierauf wird nachstehend noch näher eingeganten.
Geeignete Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Varianten mit Aminosäurese¬ quenzen, die gegenüber den Wildtyp-Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden bspw. in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585, US 4,959,314, US 5,116,943, US 4,879,111 und US 5,017,691 offenbart. Die Herstellung von Varianten im allgemeinen wird insbesonde¬ re auch von Maniatis et al, (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Es können hierbei Codons weggelassen, ergänzt oder ausgetauscht werden. Varianten im Sinne der Erfindung können ebenfalls hergestellt werden, indem in die Nukleinsäuren, welche für die Varianten kodieren, Veränderungen eingeführt werden, wie bspw. Insertionen, Delitionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Nukleotide. Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren für derartige Veränderungen von Nukleinsäuresequenzen bekannt. Eine der meist verwendeten Technik ist die Oligo- nukleotid-gerichtete Orts-spezifische Mutagenese (siehe Comack B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.01-8.5.9, Ausubel F. et al., Aufl. 1991). Bei dieser Technik wird ein Oli- gonukleotid synthetisiert, dessen Sequenz eine bestimmte Mutation aufweist. Dieses Oligo- nukleotid wird dann mit einem Template hybridisiert, das die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz enthält. Bevorzugt wird bei dieser Technik ein einzelsträngiges Template verwendet. Nach dem Annealing von Oligonukleotid und Template, wird eine DNA-abhängige DNA- Polymerase eingesetzt, um den zweiten Strang des Oligonukleotids, der komplementär zu dem Template-DNA-Strang ist, zu synthetisieren. Als Ergebnis wkd ein Heteroduplex- Molekül erhalten, welches eine Fehlpaarung enthält, die durch die oben erwähnte Mutation in dem Oligonukleotid entsteht. Die Oligonukleotidsequenz wird in ein geeignetes Plasmid ein¬ geführt, dieses wird in eine Wirtszelle eingeführt und in dieser Wirtszelle wird die Oligo- nukleotid-DNA repliziert. Mit dieser Technik erhält man Nukleinsäuresequenzen mit geziel¬ ten Veränderungen (Mutationen), welche für die Herstellung von Varianten gemäß der Erfin¬ dung verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhafterweise in der in der Behandlung und/ oder Pro- phylaxe von Tumorerkrankung und insbesondere bevorzugt in der Behandlung und/oder Prophylaxe von Melanomen, Carzinomen, AML (akute myeloische Leukämie) und Gliom (Glioma) zur Anwendung kommen. Hierfür kann eine Vakzinierung mit dem erfindungsge¬ mäßen Gemisch vorgenommen werden, wobei die für ein Antigen kodierende mRNA für mehrere verschiedene Antigene kodiert, die spezifisch für Melanome sind (z.B. MAGE-Al, MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase und Survivin) bzw. spezifisch für Carzinome sind (z.B. MAGE-Al, CEA, Her-2/neu, Mucin-1 und Survivin) bzw. spezifisch für AML sind (z.B. Telomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin) bzw. spezifisch für Gliom sind (z.B. TNC (Tenascin C), EGFRI (Epidermal Growth Factor Receptor 1), SOX9, SEC61G und PTPRZl (Protein Tyrosine Phosphatase, Rezeptor-Typ, Z-Polypeptid 1). Da- durch wird erfindungsgemäß erreicht, dass ein Melanom bzw. Carzinom bzw. AML bzw. Gliom effektiver bekämpft werden kann, da die Kombination aus verschiedenen für den je¬ weiligen Tumor spezifischen Antigene ein extrem breites Wirkspektrum aufweisen. Wie be¬ reits beschrieben, enthält das jeweilige Gemisch weiterhin eine für ein immunogenes Protein kodierende mRNA, welche vorzugsweise die Reaktivierung einer Immunantwort vermittelt. Hierbei wird erfindungsgemäß besonders ein Influenza-Matrix-Protein, speziell ein Influenza A oder B Matrix-Ml -Protein, bevorzugt. Zusätzlich kann das jeweilige Gemisch das itnmu- nogene Protein HBS enthalten. Demgemäss betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch., in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al [Acession number (Zugriffsnummer) M77481], MAGE-A6 [Accession number NM_005363], Melan-A [Acces¬ sion number NM_005511], GP100 [Accession number M77348], Tyrosinase [Accession number NM_000372] und Survivin [Accession number AF077350] kodiert und die mindes¬ tens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodie¬ renden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099] kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs
Konsequenterweise betrifft eine ebenfalls besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfin¬ dung ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein An- tigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al [Acession number M77481], CEA [Accession number NM_004363], Her-2/neu [Accession number Ml 1730], Mucin-1 [Accession number NM_002456] und Survivin [Accession number AF077350] kodiert, und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immuno¬ genes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number V01099] kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene Telomerase TERT [Accession number
NM_003219], PR3 [Accession number NM_002777], WTl [Accession number NM_000378],
PRAME [Accession number NM_006115], Mucin-1 [Accession number NM_002456] und
Survivin [Accession number AF077350] kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein [Accession number AF348197 oder Accession number V01099] kodiert. Bevorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Vari¬ anten der vorgenannten rnRNAs.
Eine weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene TNC (Tenascin C) [Accession number X78565], EGFRI („Epidermal Growth Factor Receptor 1") [Accession number AF288738], SOX9 [Accession number Z46629], SEC61G [Accession number NM_014302] und PTPRZl (Protein Tyrosine Phosphatase, Rezeptor-Typ, Z-Polypeptid 1) [Accession number NM_002851] kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immu- nogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza- Matrixproterα [Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099] kodiert. Be¬ vorzugt enthält das Gemisch funktionelle Fragmente und/oder funktionelle Varianten der vorgenannten mRNAs.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform betrifft ein Gemisch, in welchem die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein oder Polypeptid kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixproteinf Accession number AF348197 oder Accession number VOl 099], besonders bevorzugt das Influenza A- Matrix-Mi -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml -Protein, und für ein HBS-Antigen [Ac¬ cession number E00121] kodiert. Das Hepatitis B Oberflächen-Antigen ist, wie oben be¬ schrieben, zur Anwendung bei anti-viraler Vakzinierung besonders geeignet.
Die mRNA des Gemisches gemäß der Erfindung kann als nackte mRNA und/oder als modi- fizierte mRNA, insbesondere stabilisierte mRNA, vorliegen. Modifikationen der erfindungs¬ gemäßen mRNA dienen vor allem der Erhöhung der Stabilität der mRNA aber auch einer Verbesserung des Transfers der mRNA in eine Zelle bzw. ein Gewebe eines Organismus. Vorzugsweise weist die mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches eine oder mehrere Modi¬ fikationen, insbesondere chemische Modifikationen, auf, die zur Erhöhung der Halbwertszeit der mRNA im Organismus beitragen bzw. den Transfer der mRNA in die Zelle bzw. ein Gewebe verbessern. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform, der vorliegenden Erfindung ist der G/C- Gehalt des kodierenden Bereichs der modifizierten rnRNA des erfindungsgemäßen Gemi¬ sches gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der Wildtyp-RNA erhöht, wobei die kodierte Aminosäuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der kodierten Amino- säuresequenz der Wildtyp-mRNA vorzugsweise nicht verändert ist.
Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, dass für die effiziente Translation einer rnRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der rnRNA wesentlich ist. Bedeutungs¬ voll ist hier die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide. Insbeson- dere sind Sequenzen mit erhöhtem G (Guanosin) / C (Cytosin) -Gehalt stabiler als Sequen¬ zen mit einem erhöhten A (Adenosin) / U (Uracil) -Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp- mRNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Aufgrund der Tatsache, dass mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (sog. „Degeneration des genetischen Codes"), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (sog. „alternative Codonverwendung" oder englisch: „codon usage").
In Abhängigkeit von der durch die modifizierte rnRNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der mRNA-Sequenz gegenüber der Wildtyp- Sequenz möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die aus¬ schließlich G- oder C- Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), AIa (GCC oder GCG) und GIy (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist.
Demgegenüber können Codons, welche A- und/oder U-Nukleotide enthalten durch Substi¬ tution anderer Codons, welche die gleichen Aminosäuren kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert werden. Beispiele hierfür sind:
die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden; - die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden; die Codons für AIa können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden; die Codons für GIy können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden.
In anderen Fällen können A- bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert wer¬ den, jedoch ist es möglich, den A- und U-Gehalt zu verringern, indem Codons verwendet werden, die einen geringeren Anteil A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Beispiele hierfür sind:
die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden;
- die Codons für Leu können von UUA, UUG, CUU oder CUA zu CUC oder CUG ver- ändert werden; die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden; das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden; das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden; - das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden; das Codon für GIn kann von CAA zu CAG verändert werden; die Codons für He können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden; die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden; das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden; - das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden; die Codons für VaI können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden; das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden; das Codon für GIu kann von GAA zu GAG verändert werden, das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden.
Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation.
Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können sowohl einzeln aber auch in allen mögli- chen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der modifizierten mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA (der ursprünglichen Sequenz) verwendet werden. So können beispiels¬ weise alle in der Wildtyp-Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verän- dert werden. Bevorzugt werden jedoch beispielsweise Kombinationen der vorstehenden Sub¬ stitutionsmöglichkeiten verwendet:
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz (Wildtyp-mRNA) für Thr kodierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden Co- dons zu UCC ( oder UCG oder AGC);
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für He kodierenden Codons zu AUC und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden Codons zu AAG und Substituti- on aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu UAC;
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für GIu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für AIa kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu CGC (oder CGG);
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für GIu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für AIa kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für GIy kodierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substituion aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu AAC;
Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für VaI kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu UGC und Substitution al¬ ler ursprünglich für Leu kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für GIn kodierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu CCC (oder CCG);
usw. Vorzugsweise -wird der G/C-Gehalt des für das Protein kodierenden Bereichs der modifizier¬ ten mRNA um mindestens 7%-Punkte, mehr bevorzugt um mindestens 15%-Punkte, beson¬ ders bevorzugt um mindestens 20%-Punkte gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierten Be¬ reichs der für das Protein kodierenden Wildtvp-mRNA erhöht.
Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der modifizierten mRNA, insbesondere in dem für das Protein kodierenden Bereich, im Vergleich zur Wildtyp- Sequenz maximal zu erhöhen. G/C-maximierte Sequenzen für die codierenden Bereiche einer bevorzugten Auswahl von vitalen oder Tumorantigenen, die in einem erfindungsgemäßen RNA-Gemisch eingesetzt werden können, sind in den Figuren 19 bis 81 dargestellt.
Eine weitere bevorzugte Modifikation der mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches basiert auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz ebenfalls durch eine unterschiedliche Häu¬ figkeit im Auftreten von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden, so wird die entsprechende mRNA deut¬ lich schlechter translatiert als in dem Fall, dass für relativ "häufige" tRNAs kodierende Co¬ dons vorhanden sind.
Somit wird erfindungsgemäß in der modifizierten mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches, der für das Protein, Peptid bzw. Polypeptid kodierende Bereich gegenüber dem entsprechen¬ den Bereich der Wildtvp-mRNA derart verändert, dass mindestens ein Codon der Wildtyp- Sequenz, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausge¬ tauscht, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Durch diese Modifikation werden die RNA-Sequenzen derart modifiziert, dass Codons eingefügt werden, für die häufig vorkommende tRNAs zur Verfügung stehen. Anders ausgedrückt, können durch diese Modifikation erfindungsgemäß alle Codons der Wildtyp-Sequenz, die für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein Codon ausgetauscht werden, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Welche tRNAs telativ häufig in der Zelle auftreten und welche demgegenüber relativ selten auftreten, ist einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, den erfindungsgemäß in der modifizierten mRNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die Aminosäuresequenz des durch den kodierenden Bereich der mRNA kodierten Proteins, Peptids bzw. Polypeptids zu verändern. Diese bevorzugte Aus¬ führungsform stellt eine besonders effizient translatierte und stabilisierte mRNA bspw. für das erfindungsgemäße Gemisch bereit.
Die Ermittlung einer wie vorstehend beschrieben modifizierten mRNA (Erhöhung des G/C- Gehalts; Austausch von tRNAs) kann anhand des in der WO 02/098443 - deren Offenba¬ rungsgehalt vollinhaltlich in die vorliegende Erfindung einbezogen wird — erläuterten Compu- terprogramms ermittelt werden. Mit diesem Computerprogramm kann anhand des geneti¬ schen Codes bzw. dessen degenerativer Natur die Nucleotid-Sequenz einer beliebigen mRNA derart modifiziert werden, dass sich ein maximaler G/C-Gehalt in Verbindung mit der Ver¬ wendung von Codons, die für möglichst häufig in der Zelle vorkommende tRNAs kodieren, ergibt, wobei die durch die modifizierte mRNA kodierte Aminosäure-Sequenz gegenüber der nicht-modifizierten Sequenz vorzugsweise nicht verändert ist. Alternativ kann auch nur der G/C-Gehalt oder nur die Codonverwendung gegenüber der ursprünglichen Sequenz modifi¬ ziert werden. Der Quellcode in Visual Basic 6.0 (eingesetzte Entwicklungsumgebung: Micro¬ soft Visual Studio Enterprise 6.0 mit Servicepack 3) ist ebenfalls in der WO 02/098443 ange¬ geben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der A/U- Gehalt in der Umgebung der Ribosomen-Bindungsstelle der modifizierten mRNA des erfin¬ dungsgemäßen Gemisches gegenüber dem A/U-Gehalt in der Umgebung der Ribosomen- Bindungsstelle der Wildtyp-mRNA erhöht. Diese Modifikation (ein erhöhter A/U-Gehalt um die Ribosomen-Bindungsstelle) erhöht die Effizienz der Ribosomen-Bindung an die mRNA. Eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG, das AUG bildet das Startcodon) bewirkt wiederum eine effiziente Translation der mRNA.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfin- dungsgernäßes Gemisch, wobei der kodierende Bereich und/oder der 5'- und/oder 3'-nicht- translatierte Bereich der modifizierten mRNA gegenüber der WMdtyp-mRNA derart verän¬ dert ist, dass er keine destabilisierenden Sequenzelemente enthält, wobei die kodierte Amino¬ säuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA vorzugsweise nicht verändert ist. Es ist bekannt, dass beispielsweise in den Sequenzen eukaryotischer mRNAs destabilisierende Sequenzelemente (DSE) auftreten, an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der mRNA in ήvo regulieren. Daher können zur weiteren Stabilisierung der erfindungsgemäßen modifizierten mRNA gegebenenfalls im für das Protein kodierenden Bereich ein oder mehrere derartige Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen werden, so dass dort keine bzw. im wesentlichen keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Durch derartige Veränderungen können erfindungsgemäß ebenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/ oder 5'-UTR) vor¬ handene DSE aus der mRNA eliminiert werden.
Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'- UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die in dem erfindungsgemäßen Gemisch enthaltenen mRNA-Moleküle sind daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, dass sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweisen. Dies gilt auch für solche
Sequenzmotive, die von möglichen Endonucleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der modifizierten mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches entfernt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die modi- fizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches eine 5'-Cap-Struktur auf. Beispiele von Cap-Strukturen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G. Ferner ist es bevorzugt, dass die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches ei¬ nen Poly(A)-Schwanz, vorzugsweise von mindestens 25 Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 50 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt von mindestens 70 Nukleotiden, eben- falls stärker bevorzugt von mindestens 100 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von mindes¬ tens 200 Nukleotiden aufweist.
Ebenfalls bevorzugt weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches min¬ destens eine IRES und/ oder mindestens eine 5'- und/ oder 33-Stabilisierungssequenz auf. Erfindungsgemäß können demnach in die modifizierte mRNA eine oder mehrere sog. IRES (engl, „internal ribosomal entry side") eingefügt werden. Eine IRES kann so als alleinige Ri- bosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA die¬ nen, die mehrere Proteine, Peptide bzw. Polypeptide kodiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistconische mRNA"). Beispiele erfin- dungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und- Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Gricket- Paralysis-Viren (CrPV).
Weiterhin bevorzugt weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches min¬ destens eine 5'- und/ oder 3'-Stabilisierungssequenz auf. Diese Stabilisierungssequenzen in den 51- und/oder 3'- nicht-translatierten Bereichen bewirken eine Erhöhung der Halbwerts¬ zeit der mRNA im Cytosol. Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenz- homologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, aufweisen, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des ß-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC auf, die im 31UTR der sehr stabilen mRNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(T)-Collagen, 15-Iipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombi¬ nation miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabi¬ lisierungssequenzen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung weist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches mindestens ein Analoges natürlich vorkommen¬ der Nukleotide auf. Dieses/diese Analoges /Analoga dient/dienen der weiteren Stabilisierung der modifizierten mRNA, wobei dies auf der Tatsache beruht, dass die in den Zellen vor¬ kommenden RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nukleotide erkennen. Durch Einfügen von Nukleotid-Analoga in die RNA kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Ein¬ fügen dieser Analoga, insbesondere in den kodierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann. In einer keineswegs abschlie¬ ßenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7- Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden. Die Herstellung derartiger Ana¬ loga sind einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt. Erfindungsgemäß können derartige Analoga in nicht-translatierten und translatierten Bereichen der modifizierten mRNA vorkommen.
Vorzugsweise kann die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches, die einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, zusätzlich einen wei- teren funktionellen Abschnitt enthalten, der bspw. für ein die Immunantwort förderndes Cy- tokin (Monokin, Lymphokin, Interleukin oder Chemokin, wie IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-α, INF-γ, GM-CFS, LT-α oder Wachstumsfaktoren, wie hGH, kodiert.
Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die beschriebenen Modifikationen vorzunehmen. Einige dieser Verfahren wurden bereits in dem obigen Abschnitt zu den Vari¬ anten der Erfindung beschrieben. Beispielsweise kann zur Substitution von Codons in der erfindungsgemäßen modifizierten tαRNA im Falle kürzerer kodierende* Bereiche (die für biologisch wirksame oder antigene Proteine oder Peptide kodieren) die gesamte mRNA che¬ misch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden.
Bevorzugt werden allerdings Substitutionen, Additionen oder Eliminierungen von Basen un¬ ter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der modifizierten mRNA mit Hilfe von Techniken der gängigen zielgerichteten Mutagenese eingeführt (siehe z.B. Maniatis et al., Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl., CoId Spring Harbor, NY, 2001). Bei einem solchen Verfahren wird zur Herstellung der mRNA ein entsprechendes DNA-Molekül in vitro transkribiert. Diese DNA-Matrize besitzt einen geeig¬ neten Promotor, bspw. einen T7 -oder SP6-Promotor, für die in vitro Transkription, dem die gewünschte Nukleotidsequenz für die herzustellende mRNA und ein Termisationssignal für die in in vitro Transkribtion folgen. Erfindungsgemäß wird das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden RNA-Konstrukts bildet, durch fermentative Vermehrung und anschlie- ßende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt. Als für die vorliegende Erfindung geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7Ts (GenBank- Zugriffsnummer U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360), pGEM®-Reihe, bspw. pGEM®-l (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank- Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgl. auch Mezei und Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer DNA-Oligonukleotide, die an den ent¬ stehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene die gewünschte Nukleotidsequenz nach einem Fachmann geläufi¬ gen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid cloniert werden (vgl. Maniatis et al., supra). Das DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen ausge¬ schnitten.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die modifizierte mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches mit mindestens einem kationischen oder polykationischen Agens komplexiert oder kondensiert ist. Bevorzugt handelt es sich bei einem solchen kationi¬ schen oder poykationischen Agens um ein Agens, das aus der Gruppe bestehend aus Prota¬ min, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin und Histonen ausgewählt ist.
Durch diese Modifikation der erfindungsgemäßen mRNA kann der wirksame Transfer der modifizierten mRNA in die zu behandelnden Zellen, bzw. das zu behandelndes Gewebe bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, dass die modifizierte mRNA mit einem kationischen Peptid oder Protein assoziiert oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin als polykationisches, Nukleinsäure-bindendes Protein besonders wirksam. Die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L- Lysin oder Histonen, ist selbstverständlich ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Sta¬ bilisierung der modifizierten mRNA wird beispielsweise in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlos¬ sen ist.
Die vorstehend beschriebenen, sämtlichen Modifikationen der mRNA des erfindungsgemä¬ ßen Gemisches können im Sinne der Erfindung einzeln oder in Kombinationen miteinander auftreten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Ge¬ misch zur Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusam¬ mensetzung, die ein erfindungsgemmäßes Gemisch enthält sowie pharmazeutisch geeignete Hilfs- und/oder Trägerstoffe. Damit wird erfindungsgemäß auch eine Kombination der er¬ findungsgemäßen mRNAs mit pharmazeutisch akzeptablen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatz¬ stoffen offenbart. Entsprechende Herstellungswege sind bei „Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zusätzlich mindestens einen RNase-Inhibitor, vorzugsweise RNasin. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokom¬ patible Lactidpolymere, Lactid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen- /Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammen- Setzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf be¬ sondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylactat, Polyglykolsäure, Hydro- gel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzung werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubar- keit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wkkstoff- komponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler De- pots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Poloxamere oder Poloxamine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injekti¬ on (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Citrat oder Acetat usw. verwendet wird, und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlo¬ rid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Kom¬ ponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, enthalten.
Die Art und Weise der Verabreichung und die Dosierung der erfindungsgemäßen pharmazeu- tischen Zusammensetzung hängen von der zu behandelnden Erkrankung und deren Fort¬ schrittsstadium, wie auch dem Körpergewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab. Die Konzentration der modifizierten rnRNA in derartigen Formulierungen kann daher innerhalb eines weiten Bereichs von 1 μg bis 100 mg/ml variieren. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise parenteral, bspw. intravenös, intraar¬ teriell, subkutan, intramuskulär, dem Patienten verabreicht. Ebenso ist es möglich, die phar¬ mazeutische Zusammensetzung topisch oder oral zu verabreichen.
Konsequenterweise ist von der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behand¬ lung von Erkrankungen, insbesondere Krebs- bzw. Tumorerkrankungen bzw. eine Vakzinie¬ rung zur Prävention der vorstehend genannten Erkrankungen bereitgestellt, welches das Ve¬ rabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung der vorlie¬ genden Erfindung weiterhin ein oder mehrere Adjuvanz/Adjuvanzien enthält. Hierdurch kann eine Erhöhung der Immunogenizität der pharmazeutische Zusammensetzung bewirkt erden. Unter "Adjuvans" ist erfindungsgemäß jede chemische oder biologische Verbindung zu verstehen, die eine spezifische Immunantwort begünstigt. In Abhängigkeit der verschiede¬ nen Arten von Adjuvanzien können diesbezüglich verschiedene Mechanismen in Betracht kommen. Bspw. bilden Verbindungen, die eine Endocytose der in der pharmazeutischen Zu¬ sammensetzung enthaltenen modifizierten mRNA durch dendritische Zellen (DC) fördern, eine erste Klasse von verwendbaren Adjuvanzien. Andere Verbindungen, welche die Reifung der DC erlauben, bspw. Iipopolysaccharide, TNF-α oder CD40-Iigand, sind eine weitere Klasse geeigneter Adjuvanzien. Allgemein kann jedes das Immunsystem beeinflussende A- gens von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96, Oligonucleoti.de mit dem CpG-Motiv) oder Cytokine, wie GM-CFS, als Adjuvans verwendet werden, welche es erlauben, eine Im- munantwort gegen ein Antigen, das durch die modifizierte mRNA kodiert wird, zu erhöhen und/oder gerichtet zu beeinflussen. Insbesondere sind dabei die vorstehend genannten Cyto¬ kine bevorzugt. Weitere bekannte Adjuvanzien sind Aluminiumhydroxid, das Freud'sche Ad¬ juvans sowie die vorstehend genannten stabilisierenden kationischen Peptide bzw. Polypepti¬ de, wie Protamin. Des weiteren sind Iipopeptide, wie Pam3Cys, ebenfalls besonders geeignet, um als Adjuvanzien in der pharmazeutischen Zusammmensetzung der vorliegenden Erfin¬ dung eingesetzt zu werden; vgl. Deres et al, Nature 1989, 342: 561-564. Ein weitetet Gegenstand det votliegenden Etfindung betrifft ein Vetfahten zut Hetstellung eines eifindungsgemäßen Gemisches, das die folgenden Schritte umfaßt: a. in vitro Transkription mindestens einet Template-DNA, kodietend füt mindestens ein
Antigen aus einem Tumot, b. in vitro Ttanskription mindestens einet Template-DNA, kodietend füt mindestens ein immunogenes Ptotein, c. Degtadation det Template-DNA mit geeigneten Mitteln, d. Isolietung det in den Schritten a. und b. ethaltenen mRNA mit geeigneten Mitteln, e. Mischen det in Schritt d. isolierten mRNAs.
Votgehensweisen zut in vitro Ttanskription wurden bereits votstehend beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. Maniatis et al., supra). Etfindungsgemäß verwend¬ bare Antigene aus einem Tumor sowie immunogene Proteine wurden ebenfalls vorstehend beschrieben. Die Degradation der Template-DNA in Schritt c. kann vorzugsweise durch eine (im Stand der Technik wohlbekannte) DNAse- Behandlung erfolgen. Die Isolierung der mRMA kann durch vorzugsweise mehrete aufeinanderfolgende Präzipitations- und/oder Ex¬ traktionsprozesse erfolgen. Hierbei kommt beispielsweise eine IiCl-Präzipitation, eine Etha- nol/NaCl-Präzipitation und eine Phenol/Chloroform-Exttaktion in Betracht. Weitere Ver¬ fahren sind dem Fachmann gut bekannt. Ferner kann sich eine weitergehende Aufreinigung mittels Chromatographie anschliessen. Die isolierten mRNAs können zum Mischen vor¬ zugsweise in Wasser, ebenfalls bevorzugt bei gleichen Konzentrationen, vorliegen. Es können jedoch auch unterschiedliche Konzentrationen gewählt werden. Geeignete Bedinungen und Konzentrationen untet denen die mRNAs vorteilhaft gemischt werden können sind dem Fachmann ebenfalls gut bekannt.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die isolierte und/oder gemischte mRNA in wässrigen Lö¬ sungsmittel vorliegt. Hierbei kann es sich beispielsweise um PBS handeln. PBS kann hierbei je nach Geeignetheit in verschiedenen Konzentrationen vorliegen, z.B. 1 x PBS oder 10 x PBS. Weiterhin kann es sich um isotonische Kochsalzlösung handeln, die auch mit HEPES gepuf- fert sein kann. Besonders bevorzugt ist alletdings die Verwendung von Riαger-Lactat-Lösung (Fa. Fresenius). Bei Verwendung von Riαger-Lactat-Lösung als Puffer wurde von den Erfin¬ dern erstmals eine gegenübet dem Stand det Technik 5-fach höhete Effektivität erzielt. Ein weitetet Gegenstand det Etfindung betrifft die Vetwendung eines erfindungsgemäßen
Gemisches und/ oder einet etfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zut
Behandlung von Ktebs- bzw. Tumotetktankungen, beispielsweise Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Catzinom, wie Coloncatzinom, Lungencatcinom, wie kleinzelligem
Lungencarzinom, Adenocarcinom, Ptostatacatcinom, Speisetöhtencatcinom, Btustcatcinom,
Nietencatcinom, Sactom, Myelom, Leukämie, insbesondete akutet myeloischer Leukämie,
Gliom, Lymphomen, und Blastomen. Bei Tumotetktankungen kodiett die etfindungsgemäße füt ein Tumotantigen kodietende mRNA votzugsweise füt ein tumotspezifisches Oberflä- chenantigen (TSSA).
Ein ebenfalls weitetet Gegenstand der Etfindung betrifft die Verwendung eines etfindungs¬ gemäßen Gemisches zut Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, beispielsweise Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Car- zinom, wie Coloncarzinom, Lungencarcinom, wie kleinzelligem Lungencarziαom, Adenocar¬ cinom, Prostatacarcinom, Speiseröhrencarcinom, Brustcarcinom, Nierencatcinom, Sacrom, Myelom, Leukämie, insbesondere akuter myeloischer Leukämie, Gliom, Lymphomen, und Blastomen. Bei Tumorerkrankungen kodiett die erfindungsgemäße für ein Tumorantigen kodierende mRNA vorzugsweise für ein tumorspezifisches Oberflächenantigen (TSSA). Der Begriff „Arzneimittel" und der Begriff „pharmazeutische Zusammensetzung" sind erfin¬ dungsgemäß synonym zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen weiter il¬ lustriert, ohne dass diese dazu gedacht sind, die Gegenstände der vorliegenden Erfindung hierauf zu beschränken.
Figuren:
In den nachfolgenden Figuren 1 bis 13, die RNA-Nukleinsäuresequenzen darstellen, ist das Start-Codon und gegebenenfalls auch das Stop-Codon jeweils in Fettdruck-Buchstaben ange¬ geben. Grau unterlegt sind die Sequenzabschnitte, die die nicht translatierte Region (unttans- lated region, UTR) des humanen alpha-globin Gens betreffen, welches die mRNA stabilisiert und ferner die Translation der mRNA erhöht.
Figur 1 zeigt die Melan A-αg- A70RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 2 zeigt die Tyrosinase-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 3 zeigt die MAGE Al -αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 4 zeigt die MAGE A6-αGA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 5 zeigt die Survivin-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 6 zeigt die HER-2/neu-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 7 zeigt die CEA -OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 8 zeigt die Mucinl -OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 9 zeigt die GPlOO-CCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Figur 10 zeigt die ßg -FLUWT-OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz. Es handelt sich um die Nukleinsäuresequenz einer Varianten — eine Punktmutation enthaltend - des Influenza A/Hong Kong/1/68 Mattixprotein. Accession number AF348197
Figur 11 zeigt die ßg-FLUGC rich-αgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz. Es handelt sich um die GC-angereichterte Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, das identisch zu dem Influenza A/PR/8/34 Matrixprotein, Accession number V01099, ist. Figur 12 zeigt die HBS-OCgA70 RNA-Nukleinsäuresequenz
Die vorgenannten in den Figuren dargestellten RNA-Sequenzen enthalten sowohl den codie¬ renden Bereich als auch weitere Sequenzen am 5'- und am 3'-Terminus. Am 3'-Terminus können bspw., wie in den Figuren dargestellt, Kozak-Sequenzen bzw. Ribosomen- Bindungssequenzen vorliegen. Am 5'-Terminus kann eine Poly-A-Sequenz, bspw. aus einem Globin-Gen (α oder ß), vorliegen. Bei den vorgenannten Sequenzen wurde jeweils die nicht translatierte α-Globin-Sequenz flankierend am 5'- und am 3'-Ende die codierenden Bereiche der bezeichneten Gene angefügt.
Figur 13 zeigt die Auswirkung der Verwendung verschiedenen Puffer auf die Expressi¬ on von mRNA. Hierzu wurden verschiedenen Mäusen verschiedene Injekti- onsansäzte (enthaltend mRNA, kodierend für Luziferase, und jeweils unter¬ schiedliche Puffer) ins Ohr injiziert und die Expressionsrate durch Messung der Luziferaseaktivität mittels Iichtemission bestimmt. Die genaue Versuchs¬ durchführung wird im nachfolgenden Beispiel 2 erläutert. Die Messungen wurden alle 15 Sekunden für 45 Sekunden vorgenommen. Entsprechend sind die Werte in Fig. 13 auf der x-Achse in jeweils drei Säulen für jeden der Puffer dargestellt. Auf der Y-Achse ist die Expressionsrate in NLU/sec. Maus wie- dergegeben. Wie zu erkennen ist, liegt die Expressionsrate des Injektionsan¬ satzes, der Ringer-Lactat-Lösung als Puffer enthält, extrem höher als bei den anderen verwendeten Puffersystemen.
Figur 14: In Figur 14 ist der Verlauf des klinischen Versuchs dargestellt. Hierbei sind zwei verschiedene Versuchsanordnungen gezeigt (I (obere Tabelle), II (untere
Tabelle)). W (= Wochen). Nach der ersten Versuchsanordnung wurde zu¬ nächst alle zwei Wochen injiziert, später im Abstand von 4 Wochen (X indi¬ ziert Verabreichung). Nach der zweiten Versuchsanordnung wurde 2x in den ersten beiden Wochen injiziert, dann alle 4 Wochen. Die Injektionen (jeweils identisch in den beiden Versuchsanordnungen) wurden den Patienten der bei¬ den Versuchsanordnungen jeweils parallel intradermal in das linke und rechte Bein verabreicht. Die injizierten Lösungen enthielten bei beiden Versuchsan- Ordnungen ein erfindungsgemäßes RNA-Gemisch, das sich aus Tumoranti- gen-RNA (Survivin, CEA, Mucin-1, Her-2/neu, MAGE-Al) und viraler Anti- gen-RNA (Influenza matrix GC rieh, HBS) in gleichen absoluten Mengen zu¬ sammensetzt. Die verabreichten Tumorantigen-RNAs entsprachen den iα den Figuren 3 (MAGE-Al), 5 (Survivin), 6 (HER2 neu) und 7 (CEA) bzw. 8 (Mu- cinl) dargestellten Sequenzen. Das verabreichte vitale Antigen HBS entsprach der Sequenz in Figur 12 und das weitere vitale Antigen der in Figur 11 darge¬ stellten FLU-GC rieh Sequenz. Bei letzterer handelt es sich um die einzige im verabreichten Gemisch enthaltene G/C optimierte Sequenz. Insgesamt wur- den 200 μg RNA der vorbezeichneten Antigene in 300 μl Ringer-Laktatlösung aufgelöst. Den Patienten wurden hiervon ca. 100 μl der Lösung (pro Injekti¬ on) in das linke bzw. rechte Bein verabreicht. Die restliche Lösung verblieb in der Injektionsspritze. Jeweils einen Tag nach der Verabreichung des RNA- Gemisches "wurde den Patienten GM-CSF, ebenfalls intradermal in das Bein, verabreicht.
Die Darstellung des Agarose-Gels zeigt die Banden der acht verschiedenen RNA-Antigene im erfindungsgemäßen Gemisch.
Figur 15 : Figur 15 zeigt die Versuchsanordnung 1 (Arm 1) mit insgesamt 16 behandel- ten Patienten, die an malignen Erkrankungen leiden (RCC: Nierenzellcarci- nom, Ovarialkarzinom oder Brustkrebs) bzw. (Arm 2) 11 Patienten mit RCC oder colorektalem Carcinom. Es handelt sich jeweils um die Angabe der Pri- märtumore. Die Patienten zeigen allerdings auch metastasierende Sekundär- tumore. Die Patienten wurden einer Computertomographie unterzogen (CT- Scan). Auf diese Weise wurde der Status der Patienten (S: stabil, P: progressiv oder R: regressiv) ermittelt.
Figur 16 : Figur 16 zeigt die intrazelluläre Cytokin-Anfärbung. Es wurde die zelluläre Immunantwort über FACS Analyse ausgewertet. Nach verschiedenen Zeit- punkten (T) wurden die Blutzellen geerntet und eingefroren. Nach T 8 wer¬ den alle Proben ausgewertet, indem die IFN-gamma-Sekretion analysiert und als Aktivierungsmarker für eine CD4-T-Zell-Antwort oder CD8-T-Zell- Antwort angesehen wurde. Der verabreichte erfindungsgemäße RNA-Cocktail ■wurde hierbei getrennt nach Stimulatoren (Flu und HBS) oder Tumorantige¬ nen (der Rest) untersucht.
Figur 17 : In den Auftragungen von Figur 17 wird der Verlauf der gemessenen Zellzah¬ len für CD4- bzw. CD8-Zellen bei drei verschiedenen Patienten dargestellt. Die Auftragungen zeigen die Korrelation der biochemischen Befunde (siehe Beispiel 4) und der klinischen Ergebnisse beim Patienten. Beim Patienten 1 zeigte sich klinische Stabilität zu allen Zeitpunkten, zu denen CT-Scans (vor Behandlung und jeweils vierteljährlich danach) aufgenommen wurden (SSSS).
Patient 2 (Pat2) hingegen wies zum Zeitpunkt des letzten CT-Scans einen progressiven Krankheitsverlauf auf (SSSP). Progressiver Krankheitsverlauf korreliert mit geringeren CD4- bzw. CD8-Zelltitern. Aufgetragen sind % der Interferon-gamma-positiven Zeilen pro Patient.
Figur 18 : Figur 18 zeigt Darstellungen aus CT-Scans, wobei die Lunge des Patienten vor (links) bzw. nach (rechts) Vakzinierung mit dem erfindungsgemäßen RNA- Gemisch dargestellt ist. Wie durch die Tumorgröße (siehe Pfeile) dieses Se¬ kundärtumors in der Lunge dargestellt, hat sich diese bei den Patienten nach 6-monatiger behandlung signifikant verkleinert.
Die Figuren 19 bis 81 stellen RNA-Sequenzen von verschiedenen, jeweils bezeichneten Ge¬ nen dar, die in Hinblick auf deren jeweiligen G/C-Gehalt sequenzoptimiert wurden. Die Se¬ quenzoptimierung erfolgte nach dem in der veröffentlichten Patentanmeldung WO 2002/098443 beschriebenen Verfahren, d.h. die Sequenzen weisen — ohne zu einer Verände¬ rung des hierdurch jeweils codierten Proteins zu führen — einen maximalen G/C-Gehalt auf, wodurch eine Stabilisierung der RNA erreicht wird. Alle Sequenzen der Figuren 19 bis 81 (welche nur den codierenden Bereich darstellen) können in einem erfindungsgemäßen RNA- Gemisch, bevorzugt unter Modifizierung am 3'- und oder 5'-Terminus (bspw. unter Hinzufü- gung einer Kozak-Sequenz oder eines Poly-Schwanzes oder einer Ribosomen-Bindungsstelle), enthalten sein. Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung des erfindungsgemäßen Gemisches
Die tnRNA wurde durch in vitro Transkription geeigneter Template-DNA und anschliessen- der Extraktion und Aufreinigung der mRNA erhalten. Hierzu können Standardverfahren verwendet, die im Stand der Technik zahlreich beschrieben werden und dem Fachmann ge¬ läufig sind. Beispielsweise Maniatis et al. (2001), Molecular Cloning: Laboratory Manual, CoId Spring Harbour Laboratory Press. Gleiches gilt auch für die Sequenzierung der mRNA, die sich der (nachfolgend beschriebenen) Aufreinigung der mRNA anschloss. Hier wurde insbe¬ sondere das NBLAST-Programm verwendet, wie bereits oben beschrieben.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Gemische erfolgte generell gemäß nachfolgender Vorgehensweise:
1. Vektor
Die Gene, welche für die in den jeweiligen Gemischen eingesetzten mRNAs kodieren, wur¬ den in den PlasmiάVektor pT7TS eingeführt. pT7TS enthält nicht translatierte Regionen des alpha- oder des beta-Globingens sowie einen polyA-Schwanz von 70 Nukleotiden:
T7 promoter Xbal
Figure imgf000039_0001
Xenopus ß-globin 5'Untranslated region: GCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGC
Xenopus ß-Globin 3' nicht translatierte Region ("Untranslated region"): GACTGACTAGGATCTGGTTACCACTAAACCAGCCTCAAGAACACCC- GAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTACAA- AATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAA- AAGAAAGTT TCTTCACATTCTA oder human α-Globin nicht translatierte Region: CT AGTGACTGA- o TAGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACC
Abbildung: Graphik des Plasmidvektors pT7TS
Es wutden Plasmide hoher Reinheit mit dem. Qiagen Endo-free Maxipreparation Kit oder mit dem Machery-Nagel GigaPrep Kit erhalten. Die Sequenz des Vektors wurde über eine 5 Doppelstrang-Sequenzierung vom T7 Promotor bis zur Pstl- oder Xbal-Stelle kontrolliert und dokumentiert. Plasmide, deren eiαklonierte Gensequenz korrekt und ohne Mutationen ist, wurden für die in vitro Transkription benutzt.
2. Gene
0 Die Gene, welche für erfindungsgemäßen Gemische eingesetzten mRNAs kodieren, wurden mittels PCR amplifiziert oder aus den (oben beschriebenen) Plasmiden extrahiert. Für die erfindungsgemäßen „Carcinoma"- bzw. „meloma"- bzw. „AML"-Gemische wurden folgende Konstrukte eingesetzt:
5 HBS (Accession number E00121):
Plasmid-Fragment Hindlll/ Nsil blunt (= mit stumpfem Ende) in T7TS HinDIII/Spel blunt
FLUWT (Accession number AF348197): Plasmid-Fragment Spei blunt in T7TS BgIII blunt/ Spei blunt 0 FLUGC-reich kodiert für ein Matrix Ml Protein, das 60%, vorzugsweise 65%, stärker bebor- zugt 70%, ebenfalls stärker bevorzugt 80%, ebenfalls stärker bevorzugt 85%, am. stärksten bevorzugt 90% Sequenzhomologie zu dem Protein mit der Accession number V01099: Plas- mid-Fragment Bglll/Spel in T7TS Blgll/Spel
GP100 (Accession number M77348): PCR-Fragment Spei in T7TS HinDIII blunt/Spel
MAGE-Al (Accession number M77481): Plasmid-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
MAGE-A6 (Accession number: NM_005363): PCR-Fragment Spei in T7TS HinDIIIblunt/Spel
Her2/neu (Accession number: M11730):
PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
Tyrosinase (Accession number: NM_000372): Plasmid-Fragment EcoRI blunt in T7TS HinDIII blunt/Spel blunt
Melan-A (Accession number: NM_005511):
Plasmid-Fragment NotI blunt in T7TS Hindill blunt/Spel blunt
CEA (Accession number: NM_004363): PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
CMV pp65 (Accession number: M15120): PCR-Fragment BamHI/Spel in T7TS Bglll/Spel
Tert (Accession number: NM_003219) :
PCR fragment HindHI/Spel in T7TS HinDIII/Spel WTl (Accession number: NM_000378):
Plasmid fragment EcoRV/Kpnl blunt in T7TS HinDIII blunt/Spel blunt
PR3 (Accession number: NM_002777): Plasmid fragment EcoRl blunt/Xbal in T7TS HinDIII blunt/Spel
PRAME (Accession number: NM_006115):
Plasmid fragment BamHl blunt/Xbal in T7TS HinDIII blunt/Spel
Survivin (Accession number AF077350):
PCR-Fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
Mucinl (Accession number NM_002456):
Plasmid-Fragment: SacI blunt/BamHI in T7TS HinDIII blunt/Bglll
Tenascin (Accession number X78565):
PCR fragment BgIII blunt/Spel in T7TS HinDIII blunt/Spel
EGFRl (Accession number AF288738): PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spe I
Sox9 (Accession number Z46629):
PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
SecόlG (Accession number NM_014302):
PCR fragment HinDIII/Spel in T7TS HinDIII/Spel
PTRZl (Accession number NM_002851):
PCR fragment EcoRV/Spel in T7TS HinDIII blunt/Spel
3. in vitro Transkription 3.1. Herstellung Protein-freier DNA
500 μg von jedem der vorbeschriebenen Plasmide wurden in einem Volumen von 2,5 ml durch einen Verdau mit dem Restriktionsenzym PstI oder Xbal in einem 15 ml Falcon Röhr- chen linearisiert. Dieses geschnittene DNA-Konstrukt wurde in die RNA Produktionseinheit überfuhrt. 2,5 ml einer Mischung aus Phenol/ Chloroform/Isoamylalkohol wurde zu der line- arisierten DNA zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde für 2 Minuten gevortext und für 5 Minuten bei 4.000 rpm zentrifuguiert Die wässάg Phase wurde abgehoben und mit 1,75 ml 2-Propanol in einem 15 ml Falcon Röhrchen vermischt. Dieses Gefäß wurde 30 Minuten bei 4.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und 5 ml von 75% Ethanol zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde für 10 Minuten bei 4.000 rpm zenrifugiert und der Ethanol wurde ent¬ fernt. Das Gefäß wurde nochmals für 2 Minuten zentrifugiert und die Reste des Ethanols wurden mit einer Mikroliter-Pipettenspitze entfernt. Das DNA Pellet wurd dann in 500 μl RNase-freien Wasser aufgelöst (1 μg/μl).
3.2. enzymatische mRNA-Synthese Materialien:
• T7 Polymerase: aufgereinigt aus einem E.co/Ϊ-Stamm, der ein Plasmid mit dem Gen für die Polymerase enthält. Diese RNA-Polymerase verwendet als Substrat nur T7 Phagen-Promotor-Sequenzen (Fa. Fermentas),
• NTPs: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 96% (Fa. Fermentas),
• CAP Analogon: chemisch synthetisiert und über HPLC aufgereinigt. Reinheit über 90% (Fa. Trilink),
• RNase Inhibitor: Rnasin, Injectable grade, rekombinant hergestellt (E.coli) (Fa. Fer¬ mentas), • DNase: Vertrieb als Medikament über Apotheken als Pulmozym® (dornase alfa) (Fa. Roche).
In ein 15 ml Falcon Röhrchen witd folgendes Reaktionsmix pipettiert: 100 μg linearisierte proteinfreie DNA,
400 μl 5x Puffer (Tris-HCl pH 7.5, MgCl2, Spermidin, DTT, Inorganische Pyrophosphotase
25 U),
20 μl Ribonuclease Inhibitor (rekombinant, 40 U/μl); 80 μl rNTP-Mk (ATP5 CTP, UTP 10OmM) , 29μl GTP (100 mM); 116 μl Cap Analog (100 mM);
50 μl T7 RNA Polymerase (200 U/μl) ; 1045 μl RNase-freies Wasser.
Das Gesamtvolumen betrug 2 ml und wurde für 2 Stunden bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Danach wurden 300 μl DNAse: Pulmozyme ™(1 U/μl) zugegeben und die Mischung wurde für weitere 30 Minuten bei 37 0C inkubiert. Hierbei wurde das DNA-Template enzymatisch abgebaut.
5. Aufreinigung der mRNAs
5.1. LiCl-Präzipitation (Lithium-Chlorid/Ethanolfallung)
Bezogen auf 20-40 ug RNA wurde diese folgendermaßen durchgeführt:
LiCl-Fällung 25 μl liCl-Lösung [8M]
30 μl WFI („water for injection", Wasser zur Injektion) wurden zu dem Transkriptionsansatz (20 μl) gegeben und vorsichtig gemischt. In das Reaktionsgefäß wurden 25 μl IiCl-Lösung zugegeben und die Lösungen mindestens 10 Sekunden gevortext. Der Ansatz wurde bei — 20°C für mindestens 1 Stunde inkubiert. Das verschlossene Gefäß wurde anschließend bei 40C mit 4.000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Waschen Es wurden 5 μl 75%iger Ethanol zu jedem Pellet zugegeben (unter der Sicherheitswerkbank). Die verschlossenen Gefäße wurden 20 Minuten bei 40C mit 4.000 rpm zentrifugiert. Der Ü- berstand wurde verworfen (unter der Sicherheitswerkbank) und es wurde nochmals 2 Minu¬ ten bei 40C mit 4.000 rpm zentάfugiert. Der Überstand wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt (unter der Sicherheitswerkbank). Danach wurde das Pellet ca. 1 Stunde getrocknet (unter der Sicherheitswerkbank). Resuspension
Zu den gut getrockneten Pellets wurden je 10 μl WFI gegeben (unter der Sicherheitswerk¬ bank). Das jeweilige Pellet wurde sodann in einem Schüttelgerät über Nacht bei 4°C gelöst.
5.2. Endreinigung Die Endreinigung erfolgte durch Phenol-Chloroform-Extraktion. Sie kann ebenfalls mit¬ tels Anionenaustauschchromatographie erfolgen (z.B. MEGAclear ™ von Fa. Ambion oder Rneasy von Fa. Qiagen). Nach dieser Aufreinigung der mRNA, wurde die RNA ge¬ gen Isopropanol und NaCl präzipitiert (1 M NaCl 1:10, Isopropanol 1:1, gevortext, 30' bei , 4.000 rpm und 4 °C zentrifugiert und das Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen). Die mittels Phenol-Chloroform-Extraktion aufgereinigte RNA wurde in RNase freiem Wasser gelöst und mindestens 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Konzentration jeder mRNA wurde bei OD260 Absorption gemessen. (Die Chlorophorm-Phenol-Extraktion erfolgte nach Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3 (1989)).
6. Mischen der mRNAs
Die aufgereinigten mRNAs wurden in der für das jeweilige erfindungsgemäße mRNA Gemisch gewünschten Zusammensetzung gemischt.
Es wurden gleiche Mengen von jeder in dem jeweiligen erfindungsgemäßen Gemisch enthal- tenen mRNA gemischt und die Lösung wurde durch Gefriertrocknen oder durch Alkohol- Präzipitation (Isopropanol oder Ethanol mit NaCl) lyophilisiert. Das Pellet wurde in RNAse- freiem Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/ml resuspendiert.
Nachfolgend wurde diese Lösung je nach Bedarf mit einem Puffer verdünnt. Bevorzugt ver- wendete Puffer hierfür waren: Ringer-Lactat-Lösung (Fresenius) oder PBS (Phosphat gepufferte Saline) oder isotonischer Kochsalzlösung, welche auch durch HEPES gepuffert werden kann.
Hierbei ist besonders hervorzuheben, dass den Erfindern mit der Ringer-Lactat-Lösung als verwendetem Puffer eine 5-fach höhere Effektivität erzielt wurde, als mit allen anderen ver¬ wendeten Puffern. Solche Werte sind im Stand der Technik bislang nicht bekannt. Nähere Daten hierzu ergeben sich aus Beispiel 2 (s. unten)
Die Verdünnungen wurden bis zu einer finalen Konzentration für die Injektion (ca. 0,6 μg/μl RNA, es wurde eine Variationsbreite von 0,1 μg/μl bis zu 10 μg/μl verwendet, bevorzugt wurde die Konzentration auf 0,6 oder 0,8 oder 1 μg/μl eingestellt) vorgenommen. Das Ge¬ misch wurde je nach Bedarf mit stabilisierenden kationischen Agenzien, wie z. B. Protamin, versetzt (ca. 0,12 μg/μl, es wurde eine Variationsbreite von 0,01 μg/μl bis zu 10 μg/μl ver¬ wendet, bevorzugt wurde die Konzentration auf 0,12 oder 0,16 oder 0,2 μg/μl eingestellt). Das Gemisch wurde bei -20 bis -80 °C stabil aufbewahrt, ggf. wurde es vor einer Injektion für kürzere Zeit auch bei Raumtemperatur 40C bis vor Injektion aufbewahrt.
Beispiel 2: Auswirkung verschiedener Puffer auf die Expressionsrate
Um die Effektivität verschiedener Puffer zu testen, wurde folgendes Experiment durchge¬ führt: Es wurden mehreren Mäusen jeweils gleiche Mengen an mRNA, die für Luziferase aus Photi- nuspjralis kodiert, ins Ohr injiziert, wobei die mRNA in getrennten Versuchsansätzen in ver¬ schiedenen Puffern (s. Beispiel 1) aufgenommen war. Die Injektionsansätze pro Ohr enthiel¬ ten die folgenden Zusammensetzungen:
Injektionsansatz mit Ringer-Lactat-Lösung 20μl lmg/mlmRNA 80μl 1 x Ringer Lactat (#2620521, Fa. Fresensius-Kabi) In)ektionsansat2 mit PBS 20μl lmg/ml mRNA 50μl 2 x PBS (Standard-Lösung) 30μl Wasser (H2O)
Injektionsansatz mit HEPES /NaCl 20μl lmg/ml mRNA
50μl 2 x Puffer (2OmM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl) 30μl Wasser (H2O)
Die Mäuse wurden 15 Stunden nach der Injektion durch cervicale Dislokation getötet. Die Ohren wurden entfernt, rasiert, unter Stickstoff zerkleinert und anschliessend in Lysepuffer (25 mM TrisHCl pH 7,5, 2 mM EDTA, 10% Glycerol, 1% Triton X-IOO; frische Zugabe von DTT auf 2 mM und PMSF auf 1 mM) homogenisiert. Die Homogenisierung erfolgte auf Eis. Nachfolgend wurde das Homogenisat bei 4 °C für 10 Min bei maximaler Umdrehung in einer Mikrozentrifuge (Microfuge) zentrifugiert. Der Überstand wurde danach abgenommen, das Lysat aliquotiert und bei — 80°C gelagert.
Der Nachweis der Luziferaseaktivität wurde anhand eines Standardverfahren durchgeführt („Luciferase Reporter Gene Assay, constant light signal Chemilumineszenz-Assay zur quanti¬ tativen Bestimmung der Luciferase-Aktivität in transfizierten Zellen", optimiert für den Gebrauch mit Luminometern, Fa. Roche, Best. Nr. 1 897 667). Zusammengefasst, erfolgte die — jeweils doppelt durchgeführte - Bestimmung der Luziferaseaktivität durch die Messung der Lichtemission von 50 μl Lysat nach Zugabe von 300 μl Messpuffer (25 mM Glycylglycin pH 7,8, 15 mM Magnesiumsulfat, 5 mM ATP (frisch zugegeben)) und 100 μl Luciferin (250 μM in Wasser) als Substrat. Die Messungen erfolgten gegen eine leere Platte (LP) und gegen mRNA, kodierend für lacZ in PBS („lacZ mRNA") als Negativkontrollen. Im Ergebnis (s. Figur 13) ergibt sich eine bei weitem höhere Expression von Luziferase, wenn die Luziferase mRNA in der Ringer-Lactat-Lösung aufgenommen wurde, im Vergleich zu den Injektionsan¬ sätzen, in denen die Luziferase mRNA in PBS oder in HEPES /NaCl-Puffer aufgenommen wurde. Beispiel 3: Stabilisierung det mRNA des erfindungsgemäßen Gemisches
Als eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Gemisches wurde die Nuk- leinsäuresequenz des codierenden Bereichs der in dem Gemisch enthaltenen mRNAs bezüg¬ lich ihres G/C-Gehalts optimiert. Zur Ermittlung der Sequenz einer erfindungsgemäß modi¬ fizierten mRNA wurde das bereits oben erwähnte, und in der WO 02/098443 beschriebene, Computerprogramm verwendet, das mit Hilfe des genetischen Codes bzw. dessen degenerati- ver Natur die Nucleotid-Sequenz einer beliebigen mRNA derart modifiziert, dass sich ein maximaler G/C-Gehalt in Verbindung mit der Verwendung von Codons, die für möglichst häufig in der Zelle vorkommende tRNAs codieren, ergibt, wobei die durch die modifizierte mRNA codierte Aminosäure-Sequenz gegenüber der nicht-modifizierten Sequenz vorzugs¬ weise identisch ist. Alternativ kann auch nur der G/C-Gehalt oder nur die Codonverwendung gegenüber der ursprünglichen Sequenz modifiziert werden. Der Quellcode in Visual Basic 6.0 (eingesetzte Entwicklungsumgebung: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 mit Servicepack 3) ist ebenfalls in der WO 02/098443 offenbart.
Beispiel 4: Klinische Versuche
Die Durchführung der klinischen Versuche bei den mit erfindungsgemäßen RNA-Gemischen behandelten Patienten findet sich in Figur 14 beschrieben. Zur Überprüfung der klinischen Ergebnisse wurden parallel Untersuchungen von Blutproben vorgenommen, die den Patien- ten vor und während der Behandlung entnommen wurden. Die Blutproben wurden dann auf Ifn-γ positive Zellen (CD4- und CD8-Zellen) hin untersucht und deren Anteil an der Ge¬ samtzahl der Zellen bei jedem einzelnen behandelten Patienten bestimmt. Die Zu- oder Ab¬ nahme dieser Zellzahlen korreliert mit dem klinischen Phänotyp der Patienten und erweist sich somit als Marker für den Therapieerfolg.
Im einzelnen wurden periphere Blutmonozyten (PBMCs) den Patienten am Tag der ersten Vakzinierung, am Tag der vierten Vakzinierung (T4) etc. entnommen und durch Ficoll- Gradienten gereinigt und in flüssigem Stickstoff gefroren. Am Ende der Vakzinierungsperio- de wurde ein Röhrchen (VM) aufgetaut, mit 10 μg eines erfindungsgemäßen rnRNA- Gemisches, enthaltend gleiche Mengen an Tumorantigenen (Survivin + Mage- Al+Her2neu+Mucinl+CEA) oder gleichen Mengen von viralen Antigenen (Influenza GC rieh + HBS), transfiziert. Die Transfektion wurde durch Elektroporation durchgeführt. Die Zellen wurden in Kultur gegeben und nach einer Woche durch neu transfizierte, aufgetaute autologe periphere Blutmonozyten re-stitnuliert. Nach einer weiteren Woche der Kultivierung wurden wiederum einige neu transfizierte, autologe, aufgetaute periphere Blutmonozyten zur Kultur hinzugefügt. 6 Stunden später wurden die Zellen gesammelt, fixiert und permeabili- siert, und zwar unter Verwendung des Cytoficx-Cytoperm Kits von BD-Pharmingen. Ein Cocktail von Antikörpern wurde verwendet, um die Zellen anzufärben: CD4-FITC, Antife- ron-γ PE und CD8 PercP. Nach dem Waschen wurden die Zellen durch FACS analysiert.
Die Auftragungen gemäß Figuren 16 und 17 zeigen die Anzahl von CD4 oder CD8 T- Lymphocyten, die gegenüber den Antigen-Cocktails reaktiv sind (Interferon-γ positive Zel¬ len). Es gibt unter den am Ende der Behandlung gesammelten Zellen mehr reaktive Zellen als unter den im Blut zur Beginn der Behandlung gesammelten Zellen. Dies lässt darauf schlie¬ ßen, dass die Injektionen des aktiven RNA-Gemisches eine antivirale (Flu- und/oder Hbs) und eine Antitumor- (Her2neu und/oder Suvivin und/oder Mucin-1 und/oder Her2 und/oder CEA) Zellantwort ausgelöst hat. In einigen Patienten (im wesentlichen vier und zehn) wurden mehr reaktive Zellen im Blut am Ende der Behandlung gesammelt als zu Be¬ ginn der Behandlung. In Figur 17 stellt SSS eine stabilisierte Erkrankung nach drei konsekuti¬ ven CT-Scans dar. P bedeutet Progression.

Claims

Patentansprüche
1. Gemisch enthaltend mRNA zur Vakzinierung, wobei mindestens eine mRNA einen für mindestens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält und min¬ destens eine weitere mRNA einen für mindestens ein immunogenes Protein kodie¬ renden Bereich enthält.
2. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al und MAGE-A6, Melan-A, GP100, Tyrosinase und Survivin.
3. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein. Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MAGE, insbesondere MAGE-Al, CEA (Carcino Embryonic Antigen), Her-2/neu, Mucin-1 und Survivin.
4. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Telomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin.
5. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TNC (Tenascin C), EGFRI, SOX9, SEC61G und PTPRZl.
6. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acession number M77481, Accession number NM_005363, Accession number NM_005511, Accession nutnber M77348, Accession number NM_000372 und Accession number AF077350.
7. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mitides- tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acession number M77481, Acces¬ sion number NM_004363, Accession number Ml 1730, Accession number NM_002456 und Accession number AF077350.
8. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die. einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number NM_003219, Ac¬ cession number NM_002777, Accession number NM_000378, Accession number NM_006115, Accession number NM_002456]und Accession number AF077350.
9. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für ein Antigen ko¬ diert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number X78565, Accessi¬ on number AF288738, Accession number Z46629, Accession number NM_Ö14302 und Accession number NM_002851.
10. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixprotein, besonders bevorzugt das In- fluenza A-Matrix-Ml -Protein oder das Influenza B-Matrix-Ml -Protein, oder für HBS oder für CMV pp65 kodiert.
11. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein immunogenes Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Accession number AF348197, Accession number VOl 099, Accession number E00121 und Ac¬ cession number Ml 5120.
12. Gemisch nach Ansprach 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al, MAGE-A6, Mekn-A, GP100, Tyrosinase und Survivin kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodie¬ renden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein kodiert.
13. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene MAGE-Al, CEA, Her-2/neu, Mucin-1 und Survivin kodiert und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich ent¬ hält, für ein Influenza-Matrixprotein kodiert.
14. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes- tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene Te- lomerase TERT, PR3, WTl, PRAME, Mucin-1 und Survivin kodiert und die mindes¬ tens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Be¬ reich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein kodiert.
15. Gemisch nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor kodierenden Bereich enthält, für die Antigene TNC, EGFRI, SOX9, SEC61G und PTPRZl und die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein Influenza-Matrixprotein kodiert.
16. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die mindestens eine mRNA, die einen für mindestens ein immunogenes Protein kodierenden Bereich enthält, für ein Matrixprotein, bevorzugt ein Influenza-Matrixprotein, besonders bevorzugt das In¬ fluenza A-Matribc-Ml-Protein oder das Influenza B-Mattix-Ml -Protein, und für ein HBS-Antigen kodiert bzw. kodieren.
17. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die mRNA als nackte mRNA vorliegt.
18. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die mRNA als modifizierte mRNA, insbesondere als stabilisierte mRNA, vorliegt.
19. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der G/C-Gehalt des kodieren¬ den Bereichs der modifizierten mRNA gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der Wildtyp-RNA erhöht ist, wobei die kodierte Aminosäuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der kodierten Aminosäuresequenz der Wildtyp-
' mRNA vorzugsweise nicht verändert ist.
20. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der A/U-Gehalt in der Umge¬ bung der Ribosomen-Bindungsstelle der modifizierten mRNA gegenüber dem A/U- Gehalt in der Umgebung der Ribosomen-Bindungsstelle der Wildtyp-mRNA erhöht ist.
21. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der kodierende Bereich und/oder der 5'- und/oder 3'-nicht-translatierte Bereich der modifizierten mRNA ge- genüber der Wildtyp-mRNA derart verändert ist,. dass er keine destabilisierenden Se¬ quenzelemente enthält, wobei die kodierte Aminosäuresequenz der modifizierten mRNA gegenüber der Wildtyp-mRNA vorzugsweise nicht verändert ist.
22. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die modifizierte mRNA eine 5'- Cap-Struktur und/oder einen PoIy(A) -Schwanz, vorzugsweise von mindestens 25
Nukleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 50 Nukleotiden, noch stärker bevor¬ zugt von mindestens 70 Nukleotiden, ebenfalls stärker bevorzugt von mindestens 100 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von mindestens 200 Nukleotiden, und/oder mindestens eine IRES und/oder mindestens eine 5'- und/oder 3'- Stabilisierungssequenz aufweist.
23. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die modifizierte mRNA mindes¬ tens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide aufweist.
24. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die modifizierte mRNA mit mindestens einem kationischen oder polykationischen Agens komplexiert oder kon¬ densiert ist.
25. Gemisch nach Anspruch 24, wobei das kationische oder polykationische Agens aus¬ gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protamin, Poly-L-Lysin, Poly-L-Arginin und Histonen.
26. Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 25 zur Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Gemisch nach einem der An¬ sprüche 1 bis 25 sowie pharmazeutisch geeignete Hilfs- und/ oder Trägerstoffe.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei diese zusätzlich min¬ destens einen RNase-Inhibitor, vorzugsweise RNasin, enthält.
29. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 26, fol¬ gende Schritte umfassend: a. in vitro Transkription mindestens einer Template-DNA, kodierend für mindes¬ tens ein Antigen aus einem Tumor, b. in vitro Transkription mindestens einer Template-DNA, kodierend für min¬ destens ein immunogenes Protein, c. Degradation der Template-DNA mit geeigneten Mitteln, d. Isolierung der in den Schritten a. und b. erhaltenen mRNA mit geeigneten Mitteln, e. Mischen der in Schritt d. isolierten mRNAs.
30. Verfahren, nach Anspruch 29, in welchem die mRNA aus den Schritten d. und e. in wässrigen Lösungsmittel vorliegt.
31. Verwendung eines Gemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 26 und/oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 27 bis 28 zur Be¬ handlung von Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, beispielsweise Melanom, wie malig¬ nem Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Carzinom, wie Coloncarzi- nom, Lungencarcinom, wie kleinzelligem Lungencarzinom, Adenocarcinom, Prosta- tacarcinom, Speiseröhrencarcinom, Brustcarcinom, Nierencarcinom, Sacrom, Mye- lom, Leukämie, insbesondere akuter myeloischer Leukämie, Gliom, Lymphomen, und
Blastomen.
32. Verwendung eines Gemisches nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Herstellung ei¬ nes Arzneimittels zur Behandlung von Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, beispiels- weise Melanom, wie malignem Melanom, Hautmelanom, Carzinom, wie Coloncarzi- nom, Lungencarcinom, wie kleinzelligem Lungencarzinom, Adenocarcinom, Prosta- tacarcinom, Speiseröhrencarcinom, Brustcarcinom, Nierencarcinom, Sacrom, Mye- . lom, Leukämie, insbesondere akuter myeloischer Leukämie, Gliom, Lymphomen, und Blastomen.
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