WO2006006551A1 - フローサイトメーター - Google Patents

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Akira Saito
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Riken
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    • G01N23/223—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by measuring secondary emission from the material by irradiating the sample with X-rays or gamma-rays and by measuring X-ray fluorescence
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    • G01N2223/07—Investigating materials by wave or particle radiation secondary emission
    • G01N2223/076—X-ray fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a flow cytometer, and more particularly to a flow cytometer suitable for use in elemental analysis.
  • flow cytometry is a method of quantifying scattered light and fluorescence generated by applying a suspension of a labeled substance to a high-speed water stream and irradiating the high-speed water stream with laser light or mercury light. Therefore, it is a technique to accurately measure the amount and size of the target substance and to sort particles such as cells to be measured.
  • flow cytometer An instrument that performs such flow cytometry is called a “flow cytometer”.
  • flow cytometry is a method of analyzing and studying each cell by, for example, flowing and measuring a cell suspension at high speed.
  • a particle-containing solution such as cells is flowed and irradiated with laser light to measure the size and internal structure of each particle such as cells from the scattering intensity.
  • the fluorescence from the fluorescent label of the particles such as cells is counted simultaneously and the difference in intensity and color.
  • the amount of each protein can be replaced with fluorescence intensity, and the “increase / decrease in biological material” in one cell group can be measured. Because it becomes.
  • the conventional flow cytometer cannot directly measure the element and handle it as a parameter.
  • flow cytometry using conventional flow cytometers does not provide information on elements, and other methods can only indicate the increase or decrease in content at the tissue level. There is a problem that the mechanism of the mechanism and phenomenon has not yet been elucidated.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems with respect to the prior art, and the object of the present invention is to enable direct measurement of elements and particles such as cells.
  • the purpose of this study is to provide a flow cytometer that can obtain correlations between various elements.
  • the present invention can improve the flow cytometer, which is currently widely used in the analysis of particles such as cells, to greatly improve its performance and measure elements.
  • correlation between various elements in particles such as cells can be obtained.
  • a conventional flow cytometer flows a solution containing particles such as cells and irradiates it with a laser beam to measure the size and internal structure of each particle such as cells from the scattering intensity.
  • the correlation distribution is analyzed for the amount of specific proteins and DNA contained in particles such as cells.
  • the flow cytometer according to the present invention makes it possible to analyze the correlation between various elements in particles such as cells by directly measuring the amount of the element, not the dye.
  • monochromatic X-rays for example, high-intensity hard X-rays, which do not use a conventional laser as a light source for excitation, can be used in various kinds of particles such as cells.
  • fluorescent X-rays from various elements it was possible to directly measure the amount of elements, not dyes, and analyze the correlation between various elements in particles such as cells.
  • the present invention provides a sample liquid flow generating means for generating a sample liquid flow by flowing a sample liquid containing a measurement object at a predetermined flow rate, and a sample liquid flow generated by the sample liquid flow generating means.
  • a monochromatic X-ray irradiating means for irradiating a measuring object inside with a monochromatic X-ray, and the monochromatic X-ray irradiating means comprising the monochromatic X-ray irradiated to the measuring object.
  • a fluorescent X-ray detection means for detecting fluorescent X-rays emitted from the element.
  • the beam diameter of the monochromatic X-ray irradiated from the monochromatic X-ray irradiating means to the measurement object is 0.1 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less.
  • the present invention provides a monochromatic X-ray irradiated from the monochromatic X-ray irradiating means to the measurement object.
  • the incident energy of the beam is between 0. IKeV and 16 KeV.
  • the sample liquid flow generating means causes the sample liquid flow to flow in the tube, and the monochromatic X-ray irradiation means irradiates the measurement object in the tube with the monochromatic X-ray.
  • the diameter is 20 to 500 ⁇ m.
  • FIG. 1 is a conceptual configuration explanatory diagram of a flow cytometer according to an example of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing an element signal (SDD spectrum for one cell) obtained by flow cytometry using a flow cytometer according to the present invention.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of a histogram showing the correlation between elements.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram of a histogram showing the correlation between elements.
  • FIG. 1 shows a conceptual configuration explanatory diagram of a flow cytometer according to an example of an embodiment of the present invention.
  • This flow cytometer 10 is a flow as a sample liquid flow generating means for generating a sample liquid flow by flowing a sample liquid containing particles such as cells to be measured (hereinafter referred to as “specimen”) at a predetermined flow rate.
  • monochromatic X-ray irradiation system 14 as monochromatic X-ray irradiation means for irradiating a specimen in a sample flow of a predetermined flow velocity generated by flow system 12 and monochromatic X-ray irradiation system 14
  • X-ray detector 16 as X-ray detection means for detecting irradiated transmitted and scattered X-rays, and monochromatic X-rays irradiated from monochromatic X-ray irradiation system 14 constitute the sample.
  • Each elemental force X-ray fluorescence detection system 18 as a fluorescent X-ray detection means for detecting emitted fluorescent X-rays and a sample in a sample liquid flow with a predetermined flow rate generated by the flow system 12 are irradiated with laser light.
  • Laser light Laser light irradiation system 20 as a irradiating means, and forward scattered light detection as a forward scattered light detecting means for detecting forward scattered light of the laser light accompanying irradiation of the laser light irradiated from the laser light irradiating system 20 to the specimen
  • the sample liquid flow at a predetermined flow rate generated by the light detection system 26 for detecting the light emission of the labeling dye of the sample accompanying the irradiation of the laser light emitted from the laser light irradiation system 20 and the flow system 12 And a fractionation system 28 for fractionating a predetermined specimen therein.
  • the flow system 12 can use a conventionally known system except for the configuration of the tube 12d described later, and the sample liquid storage container 12a, the flow cell 12b, and the sample liquid storage container that store the sample liquid
  • the pipe 12c for transferring the sample liquid stored in the flow cell 12b to the flow cell 12b and the tube 12d through which the sample liquid flow flowing out from the flow cell 12b passes can be configured.
  • the tube 12d does not absorb monochromatic X-rays emitted from the monochromatic X-ray irradiation system 14 and fluorescent X-rays emitted from each elemental force constituting the specimen, for example, capton (polyimide), mylar or It can be composed of a thin resin such as polyethylene.
  • the tube 12d is not constituted by a thin resin such as Kapton (polyimide), Mylar, or polyethylene, only the portion irradiated with the monochromatic X-ray irradiated from the monochromatic X-ray irradiation system 14 of the tube 12d, for example, Thin beryllium may be composed of nitride nitride.
  • the tube 12d is preferably made of a material that does not contain impurities that generate X-ray fluorescence noise.
  • the size of the sample cells is 20 to 50 m, for example, about 20 to 50 / ⁇ ⁇ so that these sample cells can pass one by one. It is preferable that
  • the diameter of the tube 12d may be 500 ⁇ m, for example, and may be any diameter between 20 and 500 ⁇ m.
  • the tube 12d diameter exceeds 500 ⁇ m, the X-ray beam diameter cannot cover the tube 12d diameter, and the cells may be detached from the X-ray beam. Not very preferable! /.
  • the monochromatic X-ray irradiation system 14 for example, an undulator (high-intensity) beam line of a synchrotron radiation facility (for example, SPring-8 belonging to the National Institute of Science and Technology) is used.
  • a synchrotron radiation facility for example, SPring-8 belonging to the National Institute of Science and Technology
  • the specimen in the tube 12d may be irradiated with high-intensity hard X-rays that are monochromatic X-rays emitted from this undulator (high-intensity) beam line.
  • the beam diameter of the monochromatic X-ray when irradiating the specimen is, for example, 500 m or less, and more specifically, for example, appropriately set in the range of 0.1 to 500 / ⁇ ⁇ .
  • the monochromatic X-ray beam diameter when irradiating the specimen is set to 500 m or less, for example. If the monochromatic X-ray beam diameter when irradiating the specimen is too large, unnecessary scattering occurs. This is because it causes noise.
  • the photon density of the beam needs to be high. Therefore, it is inevitably preferable that the beam diameter of monochromatic X-rays is small.
  • the size of the cell that serves as the specimen is about 20 to 50 ⁇ m, and is large enough to cover that size. It is also preferable that the sample cells flow in the tube 12d, so that position blurring occurs in the tube 12d, and the size of the blurring area is preferably covered. For this reason, for example, it is selected appropriately within a range of 500 m or less.
  • the beam diameter of the monochromatic X-ray when irradiating the specimen may be set to 0.1 m, for example.
  • the incident energy of the monochromatic X-ray beam to the specimen may be set as appropriate within a range of, for example, 16 KeV or less, more specifically, for example, 0.1 to 16 KeV.
  • the incident energy of the monochromatic X-ray beam to the specimen is 16 KeV
  • the inner shell of almost all elements from Mg to Pb can be excited in the periodic table of elements.
  • the energy with high excitation efficiency which is not always sufficient if it is 16 KeV, differs depending on the element. Therefore, when focusing on an element, it is desirable to adjust the incident energy according to the absorption edge of the element. ,.
  • the fluorescent X-ray detection system 18 is, for example, a silicon drift X-ray detector (SDD: silicon drift detector) that is an energy dispersive fluorescent X-ray detector. Can be configured.
  • SDD silicon drift X-ray detector
  • the forward scattered light detection system 22 and the side scattered light detection system 24 can be configured using, for example, a photodiode, and the light detection system 26 includes, for example, a condensing lens 26a, a dike port, and the like. It can be configured using a mirror 26b, 26c, 26d, 26e, a phone multiplier 26f, 26g, 26h, 26i, etc.
  • the forward scattered light can be detected by the forward scattered light detection system 22, and the side scattered light is detected.
  • Side scattered light can be detected by the system 24, light emission from the labeled dye of the specimen can be detected by the light detection system 26, and a predetermined specimen can be sorted by the sorting system 28.
  • each element constituting the specimen can be measured as follows. In the following explanation, the case where a cell is used as a specimen is shown.
  • the sample solution which is the sample (cell) in the tube 12d of the flow system 12
  • the monochromatic X-ray irradiation system 14 applies a high-intensity monochrome X to the sample (cell) in the tube 12d. Irradiate the line.
  • the fluorescent X-rays released from each element in the specimen (cell) due to the irradiation of the monochromatic X-rays are collectively detected by the fluorescent X-ray detection system 18.
  • Mg, P, S, Cl, K Signal (SDD spectrum) force of most elements from Mg to Pb in the periodic table of elements such as Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Pt, Hg, Pb, etc. S is what you get.
  • SDD spectrum Signal (SDD spectrum) force of most elements from Mg to Pb in the periodic table of elements such as Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Pt, Hg, Pb, etc. S is what you get.
  • a histogram showing the correlation between element A and element B can be obtained, and the correlation between various elements, proteins, DNA, etc. Can be determined.
  • the measurement time is a force that varies depending on the density of the element to be measured, for example, about 0.01 to about LO seconds per cell. This time of 0.01 ⁇ per cell is about LO seconds, which is enough time for taking SDD spectrum with SDD used as fluorescent X-ray detection system 18 for one cell, and statistics for one day. This is the time when hundreds of meaningful cells can be measured.
  • the measurement time is about 0.01 to 10 seconds per cell, for example, 100 to 0.1 per second should be allowed to flow one specimen (cell).
  • the monochromatic X-ray irradiated by the monochromatic X-ray irradiation system 14 has a weak interaction with the substance, so that the cell damage is small, so the specimen is not damaged. Accurate specimen information can be obtained.
  • This flow cytometer 10 differs greatly from the conventionally known flow cytometers. First, by detecting fluorescent X-rays, a flow site that measures the “content of multiple elements” per many cells. It is in the point where a meter can be realized.
  • fluorescence obtained by flow cytometry using a flow cytometer 10 X-ray elemental information is excellent in that it is additive-free information with no other elements added, and is information measured directly. Furthermore, flow cytometry using the flow cytometer 10 uses a measurement technique that is already guaranteed to be quantitative in terms of fluorescent X-ray analysis. It is also excellent in that it can be determined.
  • Flow cytometry using such a flow cytometer 10 is used as follows, for example.
  • the resistance mechanism of cancer cells to various anticancer agents may involve a specific element, but the cellular mechanism is unknown even when observed at the tissue level. Therefore, two groups of cancer cells with and without anticancer drug resistance are prepared, and the role of the specific element is clarified by correlating the specific element and the amount of the anticancer drug for each cell. To be able to elucidate.
  • the target specimen (cell) can be separated and sorted by the sorting system 28 based on the “correlation distribution of element amounts in the cell group”.
  • this is not limited to the force that can obtain the monochromatic X-rays irradiating the specimen with the beam line force of the synchrotron radiation facility (high brightness).
  • a monochromatic X-ray light source that can be installed on a desktop may be used.
  • laboratory (encapsulated or rotating anode) X-ray sources the X-ray intensity must be reduced.
  • this can be dealt with by increasing the brightness (photon density) by emitting light in a wide area with a single beam and by increasing the measurement time.
  • the force that allows the specimen to pass through the tube 12d is not limited to this, and the specimen is dropped without using the tube 12d. Also good. Further, in the above-described embodiment, it is possible to irradiate a single sample with a monochromatic X-ray for a predetermined time by adjusting the pressure in the tube 12d. When dripping, the force that allows the specimen to pass through the tube 12d is not limited to this, and the specimen is dropped without using the tube 12d. Also good. Further, in the above-described embodiment, it is possible to irradiate a single sample with a monochromatic X-ray for a predetermined time by adjusting the pressure in the tube 12d. When dripping
  • a thin plastic film is wound around a rotating drum to prevent the X-ray intensity from drastically decreasing due to solvent absorption. If the specimen on the plastic film is irradiated with soft X-rays!
  • the force described in the case where the measurement time is about 0.01 to 10 seconds per cell is not limited to this.
  • 300 seconds per cell may be used.
  • 200 cells can be measured per day. .
  • the force described in the case of flowing 100 to 0.1 specimen (cell) per second is not limited to this.
  • the measurement time is 300 seconds per cell, for example, it may flow at a rate of 0.003 or more.
  • the present invention is expected to be used in the fields of biology and basic medicine (immunology, genetic engineering, protein engineering, molecular biology, cell biology, etc.) or in technical fields such as clinical medicine or drug discovery related to pathological diagnosis. It can be used for blood analysis, cell marker, cell experiment or pathological analysis.

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Abstract

　元素を直接に測定することを可能にして、細胞や血球などの粒子における様々な元素間の相関を得ることができるようにするため、測定対象物を含む試料液を所定の流速で流して試料液流を生成する試料液流生成手段と、上記試料液流生成手段により生成された試料液流中の測定対象物に単色Ｘ線を照射する単色Ｘ線照射手段と、上記単色Ｘ線照射手段から照射された単色Ｘ線の測定対象物への照射に伴い該測定対象物を構成する元素から放出された蛍光Ｘ線を検出する蛍光Ｘ線検出手段とを有するようにした。

Description

明 細 書
フローサイトメーター
技術分野
[0001] 本発明は、フローサイトメーターに関し、さらに詳細には、元素分析に用いて好適な フローサイトメーターに関する。 背景技術
[0002] 従来より、細胞、細胞内外構造体 (細胞内小器官、膜表面抗原、細菌、ウィルス等）
(本願においては、これらの「細胞、細胞内外構造体 (細胞内小器官、膜表面抗原、 細菌、ウィルス等）」を総称して、単に「粒子」と適宜に称する。）を蛍光で標識して、定 量と分離とをする技術たる「フローサイトメトリー」と 、う手法が知られて!/、る。
即ち、フローサイトメトリーとは、具体的には、標識した物質の懸濁液を高速の水流 にし、当該高速の水流にレーザー光や水銀光を照射することにより発生する散乱光 や蛍光を定量することによって、目的とする物質の量や大きさを精度よく測定したり、 測定対象の細胞などの粒子を分取したりする手法である。
そして、こうしたフローサイトメトリーを実施する機器を「フローサイトメーター」と称し ている。
[0003] ここで、従来のフローサイトメーターにより実現されているフローサイトメトリーの効果 について説明する。
即ち、上記したようにフローサイトメトリーは、例えば、細胞浮遊液を高速で流し測定 することにより、細胞 1個 1個を解析研究するという手法であるが、従来のフローサイト メーターにおいては、まず細胞などの粒子を含む溶液をフローし、そこにレーザー光 を照射して、散乱強度から細胞などの粒子の 1個 1個のサイズ、内部構造を測定する ようになされている。その際に、細胞などの粒子の各々の相対的大きさおよび内部構 造の違いを測定するのみならず、細胞などの粒子の蛍光標識からの蛍光を同時カウ ントしてその強度、色の違いを測定することによって、細胞などの粒子の 1個 1個につ いて細胞種の同定や、溶液内の様々な細胞の存在比を分析することができるもので ある。 そして、上記のようにして取得された複数の情報を組み合わせることにより、一群の 細胞について系統だった詳細な解析、例えば、細胞サイズと核蛍光などの解析を行 うことができるものであり、こうした詳細な解析を行うことの意味合いは極めて大きいも のであった。
つまり、 DNAや蛋白質を定量的に染色する蛍光色素を使用すれば、それぞれの 蛋白などの量を蛍光強度に置き換え、 1つの細胞群における「生体物質の増減の相 関」を測定することができることになるからである。
[0004] しかしながら、こうした従来のフローサイトメーターによるフローサイトメトリーにおい ては、測定対象にっ 、て「元素」と 、う基本的な概念が欠如して 、ると 、う大きな問題 点がめった。
即ち、通常は蛍光色素では元素自体の含有量を特定することができないため、従 来のフローサイトメーターでは元素を直接測定してパラメータとして扱うことができな いものであった。
一方、亜鉛や鉄の増減が知られる各種の腫瘍や、銅の著減で知られるウィルソン病 などのように、特性元素の増減がかかわる数多くの疾患の存在が知られている。 さらに、薬剤耐性やアポトーシス、神経伝達、エネルギー代謝あるいは細胞周期な ど、特定元素と深くかかわるとされる代謝や生体反応は極めて多い。
ところが、従来のフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーでは元素の情報 が得られず、また、他の方法では組織レベルで含有量の増減を指摘することができる のみであり、主因となる各元素の働きや現象のメカニズム解明までには至っていない という問題点があった。
[0005] なお、本願出願人が特許出願時に知って!/、る先行技術は、上記にお!、て説明した ようなものであって文献公知発明に係る発明ではないため、記載すべき先行技術情 報はない。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、従来の技術に対する上記したような問題点に鑑みてなされたものであり 、その目的とするところは、元素を直接に測定することを可能にして、細胞などの粒子 における様々な元素間の相関を得ることができるようにしたフローサイトメーターを提 供しょうとするものである。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成するために、本発明は、細胞などの粒子の分析で現在広く使われ ているフローサイトメーターを改良してその性能を大幅に向上させ、元素を測定する ことを可能にして、細胞などの粒子における様々な元素間の相関を得ることができる ようにしたものである。
即ち、従来のフローサイトメーターは、細胞などの粒子を含む溶液をフローし、そこ にレーザー光を照射して、散乱強度から細胞などの粒子の 1個 1個のサイズ、内部構 造を測定すると同時に、色素標識力もの光を測定することで、細胞などの粒子に含ま れる特定の蛋白や DN Aの量について相関分布を解析している。
一方、本発明によるフローサイトメーターは、色素ではなく元素の量を直接測定する ことにより、細胞などの粒子における様々な元素間の相関を解析可能としたものであ る。
本発明によるフローサイトメーターにおいては、励起用の光源に従来のようなレー ザ一を用いるのではなぐ単色 X線、例えば、高輝度の硬 X線を用い、細胞などの粒 子に含まれる様々な元素からの蛍光 X線を同時測定することにより、色素ではなく元 素の量を直接測定して細胞などの粒子における様々な元素間の相関を解析可能と した。
[0008] 即ち、本発明は、測定対象物を含む試料液を所定の流速で流して試料液流を生 成する試料液流生成手段と、上記試料液流生成手段により生成された試料液流中 の測定対象物に単色 X線を照射する単色 X線照射手段と、上記単色 X線照射手段 カゝら照射された単色 X線の測定対象物への照射に伴い該測定対象物を構成する元 素から放出された蛍光 X線を検出する蛍光 X線検出手段とを有するようにしたもので ある。
また、本発明は、上記単色 X線照射手段から測定対象物へ照射される単色 X線の ビーム径を 0. 1 μ m以上 500 μ m以下としたものである。
また、本発明は、上記単色 X線照射手段から測定対象物へ照射される単色 X線の ビームの入射エネルギーを 0. IKeV以上 16KeV以下としたものである。
また、本発明は、上記試料液流生成手段はチューブ内に試料液流を流し、上記単 色 X線照射手段は上記チューブ内の測定対象物に単色 X線を照射するものであり、 上記チューブの径を 20〜500 μ mとしたものである。
発明の効果
[0009] 本発明は、以上説明したように構成されているので、元素を直接に測定することが 可能になり、細胞などの粒子における様々な元素間の相関を得ることができるように なると!/ヽぅ優れた効果を奏する。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]図 1は、本発明の実施の形態の一例によるフローサイトメーターの概念構成説 明図である。
[図 2]図 2は、本発明によるフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより得 られる元素の信号 (細胞 1個に対する SDDスペクトル)を示す概念図である。
[図 3]図 3は、元素の相関関係を示すヒストグラムの概念図である。
[図 4]図 4は、元素の相関関係を示すヒストグラムの概念図である。
符号の説明
[0011] 10 フローサイトメーター
12 フローシステム
12a 試料液収容容器
12b フローセル
12c パイプ
12d チューブ
14 単色 X線照射システム
16 X線検出器
18 蛍光 X線検出システム
20 レーザー光照射システム
22 前方散乱光検出システム
24 側方散乱光検出システム 26 光検出システム
26a 集光レンズ
26b、 26c、 26d、 26e ダイク口イツクミラー
26f、 26g、 26h、 26i フォトマルチプライヤー
28 分取システム
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、添付の図面を参照しながら、本発明によるフローサイトメーターの実施の形 態の一例を詳細に説明するものとする。
[0013] 図 1には、本発明の実施の形態の一例によるフローサイトメーターの概念構成説明 図が示されている。
このフローサイトメーター 10は、測定対象の細胞などの粒子（以下、「検体」と称する 。）を含む試料液を所定の流速で流して試料液流を生成する試料液流生成手段とし てのフローシステム 12と、フローシステム 12により生成された所定の流速の試料液流 中の検体に単色 X線を照射する単色 X線照射手段としての単色 X線照射システム 14 と、単色 X線照射システム 14から照射された透過および散乱 X線を検出する X線検 出手段としての X線検出器 16と、単色 X線照射システム 14から照射された単色 X線 の検体への照射に伴い当該検体を構成する各元素力 放出された蛍光 X線を検出 する蛍光 X線検出手段としての蛍光 X線検出システム 18と、フローシステム 12により 生成された所定の流速の試料液流中の検体にレーザー光を照射するレーザー光照 射手段としてのレーザー光照射システム 20と、レーザー光照射システム 20から照射 されたレーザー光の検体への照射に伴う当該レーザー光の前方散乱光を検出する 前方散乱光検出手段としての前方散乱光検出システム 22と、レーザー光照射システ ム 20から照射されたレーザー光の検体への照射に伴う当該レーザー光の側方散乱 光を検出する側方散乱光検出手段としての側方散乱光検出システム 24と、レーザー 光照射システム 20から照射されたレーザー光の検体への照射に伴う当該検体の標 識色素の発光を検出する光検出システム 26と、フローシステム 12により生成された 所定の流速の試料液流中の所定の検体を分取するための分取システム 28とを有し て構成されている。 [0014] ここで、フローシステム 12は、後述するチューブ 12dの構成を除いて、従来より公知 のシステムを用いることができ、試料液を収容した試料液収容容器 12a、フローセル 12b、試料液収容容器 12aに収容された試料液をフローセル 12bへ移送するための パイプ 12cならびにフローセル 12bから流出される試料液流が通過するチューブ 12d などにより構成することができる。
チューブ 12dは、単色 X線照射システム 14から照射された単色 X線ならびに検体を 構成する各元素力 放出された蛍光 X線を吸収することがないように、例えば、カプト ン (ポリイミド）、マイラーあるいはポリエチレンなどの薄い榭脂により構成することがで きる。なお、カプトン (ポリイミド）、マイラーあるいはポリエチレンなどの薄い榭脂により チューブ 12dを構成しない場合には、チューブ 12dの単色 X線照射システム 14から 照射された単色 X線が照射される部分のみ、例えば、薄いベリリウムゃ窒化ケィ素な どで構成するようにしてもよい。
また、チューブ 12dは、蛍光 X線ノイズを生じる不純物を含まない材料により構成す ることが好ましい。
さらに、チューブ 12dの径については、検体となる細胞のサイズが 20〜50 mであ るため、これら検体となる細胞が 1個ずつ通過可能なように、例えば、 20〜50 /ζ πι程 度とすることが好ましい。
ここで、蛍光 X線収量を能率的に取得するために、公知のフローサイトメーターのよ うに一度に複数の細胞を流し、検出された信号を流した細胞数で割って 1個の細胞 データを取ることも可能である。この場合には、チューブ 12dの径は、例えば、 500 ^ mでもよく、 20〜500 μ mの間の任意の径とすることができる。
なお、チューブ 12dの径が 500 μ mを超えるような場合には、 X線ビーム径がチュ ーブ 12dの径をカバーすることができず、細胞が X線ビームから外れてしまう場合が あるのであまり好ましくはな！/、。
[0015] 次に、単色 X線照射システム 14としては、例えば、放射光施設 (例えば、独立行政 法人理ィ匕学研究所に所属する SPring— 8など。 )のアンジュレータ (高輝度)ビーム ラインを用いることができる。即ち、このアンジュレータ（高輝度)ビームラインから出射 される単色 X線たる高輝度硬 X線をチューブ 12d内の検体に照射すればよい。 ここで、検体に照射する際の単色 X線のビーム径は、例えば、 500 m以下、より詳 細には、例えば、 0. 1〜500 /ζ πιの範囲で適宜設定すればよい。なお、検体に照射 する際の単色 X線のビーム径を、例えば、 500 m以下にするのは、検体に照射す る際の単色 X線のビーム径が大きすぎると不要な散乱を生じてしまい、ノイズを生じる 原因となるからである。
また、高い蛍光 X線収量を得るためには、ビームの光子密度が高い必要がある。従 つて、必然的に単色 X線のビーム径は小さい方が好ましいものである力 検体となる 細胞のサイズが 20〜50 μ m程度であり、その大きさをカバーすることができる大きさ があることが好ましいとともに、検体となる細胞はチューブ 12d内を流れてゆくのでチ ユーブ 12d内で位置のブレが生じることになり、そのブレの領域をカバーすることがで きる大きさがあることが好ましいことから、例えば、 500 m以下の範囲で適宜選択す る。
なお、細胞ではなく核のような細胞内小器官を検体とする場合には、検体に照射す る際の単色 X線のビーム径は、例えば、 0. 1 mにしてもよい。それ以下の集光ビー ムは、現在は作製に非常に手間が力かるため、実用上はあまり好ましいものとはいえ ない。
一方、単色 X線のビームの検体への入射エネルギーは、例えば、 16KeV以下、よ り詳細には、例えば、 0. l〜16KeVの範囲で適宜設定すればよい。
なお、単色 X線ビームの検体への入射エネルギーが 16KeVあれば、元素の周期 律表において Mgから Pbまでのほぼ全ての元素の内殻を励起することができる。ただ し、常に 16KeVならばよいわけではなぐ励起効率の高いエネルギーは元素により 異なるため、特にある元素に注目する場合には、その元素の吸収端に応じて入射ェ ネルギーを調整することが望ま U、。
また、 0. l〜5KeVでは軟 X線領域となり、 5〜16KeVの場合とは異なった効果を 生じる。具体的には、励起効率が上がる利点がある。一方で、試料周りの吸収が大き いため、環境を真空槽にするなど、フロー方式を変えるなどの変更が必要となる。例 えば、溶媒によるフロー方式は溶媒による軟 X線の吸収が深刻であるため、薄いブラ スチックフィルムを回転ドラムに巻き、そこ力も展開したプラスチックフィルムに瞬間冷 却などにより検体を固定し、そのプラスチックフィルム上の検体に軟 X線を照射するな どの手法を用いることができる。ただし、 X線による内殻励起を用いた特定元素の判 別、という手法の本質は変わらない。
[0016] 次に、蛍光 X線検出システム 18について説明すると、蛍光 X線検出システム 18は、 例えば、エネルギー分散型の蛍光 X線検出器たるシリコンドリフト X線検出器 (SDD： シリコンドリフトディテクター）により構成することができる。
[0017] なお、 X線検出器 16、レーザー光照射システム 20、前方散乱光検出システム 22、 側方散乱光検出システム 24、光検出システム 26および分取システム 28については 、従来より公知の技術を適用することができるので、従来より公知の技術を援用するこ とによりそれらの構成ならびに作用に関する詳細な説明を省略する。
なお、前方散乱光検出システム 22ならびに側方散乱光検出システム 24は、例えば 、フォトダイオードなどを用いて構成することができ、また、光検出システム 26は、例え ば、集光レンズ 26a、ダイク口イツクミラー 26b、 26c、 26d、 26e、フォ卜マルチプライヤ 一 26f、 26g、 26h、 26iなどを用いて構成することができる。
[0018] 以上の構成において、このフローサイトメーター 10においては、従来より公知のフロ 一サイトメーターと同様に、前方散乱光検出システム 22により前方散乱光を検出する ことができ、側方散乱光検出システム 24により側方散乱光を検出することができ、光 検出システム 26により検体の標識色素からの発光を検出することができ、分取システ ム 28により所定の検体を分取することができる。
さらに、このフローサイトメーター 10においては、本発明の特徴として、以下のように 検体を構成する各元素の測定を行うことができる。なお、以下の説明においては、細 胞を検体とした場合にっ ヽて示す。
即ち、フローシステム 12のチューブ 12d内に検体 (細胞）の入った溶液たる試料液 を適正な条件でゆっくり流し、単色 X線照射システム 14によりチューブ 12d内の検体 (細胞）に高輝度な単色 X線を照射する。それと同時に、この単色 X線の照射に伴い 検体 (細胞）内の各元素カゝら放出された蛍光 X線を、蛍光 X線検出システム 18で一括 して検出でさる。
上記した処理を多数の検体 (細胞）について繰り返すことよって、検体を構成する元 素間の相関を得ることができる。
ここで、単色 X線照射システム 14による単色 X線の 1回の照射により、蛍光 X線検出 システム 18として用いる SDDでは、例えば、図 2に示すように、 Mg、 P、 S、 Cl、 K、 C a、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Pt、 Hg、 Pbなどのような、元素の周期律表 で Mgから Pbまでのほとんどの元素の信号（SDDスペクトル）力 S得られるものである。 そして、図 2に示すような SDDスペクトルから、例えば、図 3に示すように、元素 Aと 元素 Bとの相関関係を示すヒストグラムを得ることができ、様々な元素や蛋白あるいは DNAなどに関する相互関係を判定することが可能となる。
なお、測定時間は、測定対象の元素の密度に依存して幅がある力 例えば、細胞 1 個当り 0. 01〜： LO秒程度である。この細胞 1個当り 0. 01〜： LO秒程度という時間は、 細胞 1個について蛍光 X線検出システム 18として用いる SDDで SDDスペクトルをと るのに十分な時間であり、かつ、 1日で統計的に意味のある数百個の細胞が測れる 時間である。
また、フローシステム 12のチューブ 12d内に検体 (細胞）の入った溶液たる試料液 を流す適正な条件としては、測定時間を細胞 1個当り 0. 01〜10秒程度とするならば 、例えば、秒速 100〜0. 1個の検体 (細胞）を流すようにすればよい。
なお、単色 X線照射システム 14により照射される単色 X線は、電子線とは異なり物 質との相互作用が弱!、ため細胞の損傷が小さ!、ため、検体を損傷することなく極め て正確な検体の情報を得ることができる。
このフローサイトメーター 10が従来より公知のフローサイトメーターと大きく異なる点 は、まず、蛍光 X線を検出することにより、数多くの細胞 1個 1個につき「複数元素の 含有量」を測定するフローサイトメトリーを実現することができる点にある。
また、従来の検体への標識色素の添加という人工的な条件かつ間接的な量に頼ら ざるを得なかったフローサイトメトリーとは異なり、フローサイトメーター 10を用いたフロ 一サイトメトリーにより得られる蛍光 X線の元素情報は他の要素を添加していない無 添加な情報であり、かつ、直接的に測定した情報である点で極めて優れている。 さらに、フローサイトメーター 10を用いたフローサイトメトリーは、蛍光 X線分析という 点で定量性がすでに保証されている測定技術を用いるものであり、また、微量でも測 定可能である点でも極めて優れて 、る。
なお、フローサイトメーター 10においては、検体への標識色素の添カ卩を行うことによ つて、従来のフローサイトメトリーにより得られるデータにそのまま元素という大きな情 報をカ卩えるということも可能である。
[0020] こうしたフローサイトメーター 10を用いたフローサイトメトリーは、例えば、以下のよう にして利用される。
例えば、各種抗癌剤に対する癌細胞の耐性メカニズムには特定の元素がかかわる 可能性が示唆されて!ヽるが、組織レベルで観察しても細胞メカニズムは不明である。 そこで、抗癌剤の耐性をもつ癌細胞ともたない癌細胞の 2群を準備し、 1個 1個の細 胞について特定元素と抗癌剤の量の相関をとることにより、その特定元素の役割を明 確に解明することができるようになる。
即ち、耐性の有無や薬剤投与の有無などに応じて、フローサイトメーター 10を用い たフローサイトメトリーによって作成した図 4に示すようなヒストグラムのパターンの差を 検討することにより、例えば、制癌剤シスブラチン (プラチナ製剤）に対する癌細胞の 薬剤耐性機構を検証することができるようになる。つまり、 Ptとメタ口チォネイン (解毒 に関与する金属結合蛋白）の金属元素の相関をとる、などである。
[0021] 上記したように、フローサイトメーター 10を用いたフローサイトメトリーでは、高い客 観性のもとに「細胞群における元素量の相関分布」という、これまで得ることができな 力つた情報を得ることができるようになる。
また、フローサイトメーター 10においては「細胞群における元素量の相関分布」に 基づいて、分取システム 28により目的の検体 (細胞）を分離して分取することができる
[0022] なお、上記した実施の形態は、以下の（1)乃至（5)に示すように変形することができ るものである。
(1)上記した実施の形態においては、検体に照射する単色 X線を放射光施設のァ ンジユレータ（高輝度)ビームライン力も得るようにした力 これに限られるものではな いことは勿論であり、例えば、卓上に設置可能な単色 X線光源を用いるようにしてもよ い。実験室型 (封入または回転陽極) X線源の場合には、 X線強度をカゝせぐ必要があ るが、それにはキヤビラリ一で広い領域のビーム^^光することにより輝度 (光子密度 )を高めること、また、測定時間を長くすることで対処することができる。
(2)上記した実施の形態においては、チューブ 12d内に検体を通過させるようにし た力 これに限られるものではないことは勿論であり、チューブ 12dを用いることなく検 体を滴下させるようにしてもよい。また、上記した実施の形態においては、チューブ 1 2d内の圧力調整により任意の検体に所定時間だけ単色 X線を照射することができる ようにすることが可能である力 チューブ 12dを用いずに検体を滴下させる場合には
、フローセル 12bのオリフィスに液滴を形成し、この液滴に単色 X線を照射するように すればよい。
特に、軟 X線領域の場合には、溶媒の吸収による X線強度の激減を防ぐため、薄い プラスチックフィルムを回転ドラムに巻き、そこ力も展開したプラスチックフィルムに瞬 間冷却などにより検体を固定し、そのプラスチックフィルム上の検体に軟 X線を照射 すると!/、つた手法が可能である。
(3)上記した実施の形態においては、測定時間を、例えば、細胞 1個当り 0. 01〜1 0秒程度とした場合について説明した力 これに限られるものではないことは勿論で ある。特に、上記（1)で説明した実験室型 X線源の場合には、例えば、細胞 1個当り 3 00秒としてもよぐこの場合には 1日 200個の細胞の測定を行うことができる。
(4)上記した実施の形態においては、秒速 100〜0. 1個の検体 (細胞）を流すよう にした場合について説明した力 これに限られるものではないことは勿論であり、例え ば、上記（3)において示すように測定時間を細胞 1個当り 300秒とした場合には、例 えば、 0. 003個以上の速度で流すようにしてもよい。
(5)上記した実施の形態ならびに上記した（1)乃至 (4)に示す変形例は、適宜に 組み合わせるようにしてもよ!、。
産業上の利用可能性
本発明は、生物学、基礎医学の各分野 (免疫学、遺伝子工学、蛋白質工学、分子 生物学、細胞生物学など。）あるいは病理診断に関する臨床医学あるいは創薬など の技術分野での利用が期待され、血液分析、細胞マーカー、細胞実験あるいは病理 分析などに利用することができるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 測定対象物を含む試料液を所定の流速で流して試料液流を生成する試料液流生 成手段と、
前記試料液流生成手段により生成された試料液流中の測定対象物に単色 X線を 照射する単色 X線照射手段と、
前記単色 X線照射手段から照射された単色 X線の測定対象物への照射に伴い該 測定対象物を構成する元素カゝら放出された蛍光 X線を検出する蛍光 X線検出手段と を有することを特徴とするフローサイトメーター。
[2] 請求項 1に記載のフローサイトメーターにお 、て、
前記単色 X線照射手段から測定対象物へ照射される単色 X線のビーム径は、 0. 1 μ m以上 500 μ m以下である
ことを特徴とするフローサイトメーター。
[3] 請求項 1また 2のいずれ力 1項に記載のフローサイトメーターにおいて、
前記単色 X線照射手段から測定対象物へ照射される単色 X線のビームの入射エネ ルギ一は、 0. IKeV以上 16KeV以下である
ことを特徴とするフローサイトメーター。
[4] 請求項 1、 2また 3のいずれか 1項に記載のフローサイトメーターにおいて、
前記試料液流生成手段は、チューブ内に試料液流を流し、
前記単色 X線照射手段は、前記チューブ内の測定対象物に単色 X線を照射するも のであり、
前記チューブの径は、 20〜500 μ mである
ことを特徴とするフローサイトメーター。
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