WO2006004149A1 - 神経細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2006004149A1
WO2006004149A1 PCT/JP2005/012472 JP2005012472W WO2006004149A1 WO 2006004149 A1 WO2006004149 A1 WO 2006004149A1 JP 2005012472 W JP2005012472 W JP 2005012472W WO 2006004149 A1 WO2006004149 A1 WO 2006004149A1
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cells
embryonic stem
stem cells
differentiation
medium
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PCT/JP2005/012472
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English (en)
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Hiroo Iwata
Yoshiki Sasai
Hironori Yamazoe
Masato Kobori
Mitsuo Satoh
Keiichi Yano
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing neural cells by inducing differentiation of embryonic stem cells, a method for inducing differentiation of embryonic stem cells into neural cells, a medium used for the production method and differentiation inducing method, and embryonic stem cells.
  • the present invention also relates to a method for increasing the purity of nerve cells induced by force.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease that occurs when dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra degenerate and drop off, and dopamine decreases in the striatum, causing tremor, stiffness, peristalsis, etc. Cause movement disorders.
  • L-DOPA L-dihydroxyphenol-lanalanin
  • Attenuation is recognized.
  • cell transplantation treatment has been attempted (see Non-Patent Document 1), but it is difficult to secure a large number of cells for transplantation.
  • Embryonic stem cells can be cultured in vitro and can be differentiated into all cells, including germ cells, when injected into the blastocysts of other individuals before implantation, for example, blastocysts Cells, also called ES cells.
  • blastocysts Cells also called ES cells.
  • Various attempts have been made to induce differentiation of ES cells into dopaminergic neurons in order to obtain cells to be transplanted into Parkinson's disease patients.
  • Vitamin B12 has long been known for its pharmacological actions, such as promoting the metabolism of nucleic acids, proteins, and lipids by the methyl group transfer reaction to repair the peripheral nerve tissue.
  • a group of sulfated mucopolysaccharides called heparin has been used in the prevention and treatment of thrombo-occlusive disorders. It has been reported to have an effect (see Patent Document 2).
  • Polyamines such as piotin and putrescine, and iron-containing compounds are components that are generally contained in various culture media such as microorganisms, plant cells, and animal cells, and contain vitamins, coenzymes, polyamines, or micronutrients.
  • Piotin (vitamin H) plays an essential role in enzyme-catalyzed carboxylation and decarboxylation reactions, but almost all animals cannot synthesize biotin themselves, so they take piotin from the outside world. It is an essential factor in living cells. Polyamines are known to promote the growth of axons in rat cultured hippocampal neurons! / Speak (see Non-Patent Document 6).
  • Patent Document 1 International Publication No. 03Z42384 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-53243
  • Non-Patent Document 1 "New England Journal of Medicine", 2001, 344th, p. 710
  • Non-Patent Document 2 “Nature Biotechnology”, 2000, No. 18, p. 675
  • Non-Patent Literature 3 “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America), 2002, 99th, p. 1580
  • Non-Patent Document 4 "Nature", 2002, 418, p. 50
  • Non-Patent Document 5 “Nature Biotechnology”, 2002, No. 20, p. 1240
  • Non-Patent Document 6 “Neuroscience Research”, 1994, 19th, p. 155
  • the present invention relates to a method for producing neural cells by inducing differentiation of embryonic stem cells, a method for inducing differentiation of embryonic stem cells into neural cells, a medium used for the production method or the method for inducing differentiation, or embryonic properties. It is an object of the present invention to provide a method for increasing the purity of nerve cells that have been induced to differentiate from stem cells.
  • the present invention relates to the following (1) to (16).
  • embryonic stem cells are cultured in a non-aggregated state to induce differentiation into neurons, and the culture
  • a method for producing a nerve cell comprising the step of collecting the nerve cell from a product.
  • the serum-free medium is a serum-free medium containing one or more compounds selected from piotin or a salt thereof, polyamine, and an iron-containing compound.
  • a medium having an activity of inducing differentiation of embryonic stem cells into neurons which is used in the production method according to any one of (1) to (6) above.
  • Embryonicity comprising a step of culturing embryonic stem cells in a non-aggregated state using vitamin B12 or a salt thereof and a substance having heparin or henoline-like action or a salt thereof A method of inducing differentiation of stem cells into neurons.
  • the serum-free medium is a serum-free medium containing one or more compounds selected from piotin or a salt thereof, a polyamine, and an iron-containing compound.
  • a medium having an activity of inducing differentiation of embryonic stem cells into neural cells which is used in the method according to any one of (8) to (13) above.
  • Anticancer drug power The method according to (15) above, which is an anticancer drug selected from the group consisting of mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, ala C, and methotrexate.
  • the invention's effect is an anticancer drug selected from the group consisting of mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, ala C, and methotrexate.
  • a method for producing a nerve cell by inducing differentiation of an embryonic stem cell a method for inducing differentiation of an embryonic stem cell into a nerve cell, a medium used for the production method or the method for inducing differentiation, or differentiation induced from an embryonic stem cell
  • a method for increasing the purity of a neuron is provided.
  • the present invention without using a specific protein factor, it is also easy to perform complicated operations such as multi-stage culture, co-culture with different cells, and genetic manipulation to induce differentiation in a specific direction, Selective and inexpensive separation of embryonic stem cells into dopaminergic neurons Can be induced.
  • FIG. 1 is a diagram showing the number of colonies formed from EB5 when the concentrations of heparin and vitamin B12 are changed.
  • the countries in the graph indicate the conditions for adding 0.01% heparin, and the triangles indicate the conditions for adding 0% heparin.
  • the horizontal axis of the graph represents the concentration of vitamin B12 (nmol / l) contained in Test Solution 1, and the vertical axis represents the total number of colonies observed 14 days after the start of culture.
  • FIG. 2 is a graph showing the ratio of nerve cells derived from EB5, that is, the nerve cell induction rate when heparin and vitamin B12 concentrations are changed.
  • the countries in the graph indicate the conditions for adding 0.01% heparin, and the triangles indicate the conditions for adding 0% heparin.
  • the horizontal axis of the graph represents the concentration of vitamin B12 (nmol / 1) contained in test solution 1, and the vertical axis represents the nerve cell induction rate (%) 14 days after the start of culture.
  • Fig. 3 is a graph showing the total number of colonies and the number of neuronal colonies formed from EB5 when the concentration of hen is changed under the condition where vitamin B12 is not added.
  • the countries in the graph indicate neural cell colonies, and the triangles indicate total colonies.
  • the horizontal axis of the graph represents the concentration (%) of heno ⁇ phosphorus contained in test solution 1, and the vertical axis represents the number of cells observed 14 days after the start of culture.
  • FIG. 4 is a graph showing the ratio of nerve cells derived from EB5, that is, the nerve cell induction rate when test solutions 2 to 7 are added instead of test solution 1 in Example 1. .
  • Column 1 of the graph is test solution 2 addition condition
  • column 2 is test solution 3 addition condition
  • force ram 3 is test solution 4 addition condition
  • column 4 is test solution 5 addition condition
  • column 5 is test solution 6
  • Column 6 shows the addition conditions of Test Solution 7.
  • the vertical axis of the graph represents the nerve cell induction rate (%) 14 days after the start of cultivation.
  • FIG. 5 is a diagram showing dopamine production in neurons induced by EB5.
  • column 1 shows the PBS addition conditions
  • column 2 shows the test solution 8 addition conditions
  • column 3 shows the test solution 9 addition conditions
  • column 4 shows the test solution 10 addition conditions.
  • embryonic stem cells can be cultured in vitro, and when injected into the vesicle of an embryo before implantation in another individual, for example, the blastocyst's vesicle, all cells including germ cells are separated. And include embryonic stem cells listed in (1), (2), and (3) below.
  • Mammal embryonic stem cells established by culturing early embryos prior to implantation; more specifically, ES cells established from the inner cell mass constituting the early embryos, primordial germ cells Culturing EG cells (embryonic germ cells) established from vesicles, or cell populations that have the potential to diversify early embryos before implantation (eg, primitive ectoderm), or culturing these cells
  • ES cells established from the inner cell mass constituting the early embryos
  • primordial germ cells Culturing EG cells (embryonic germ cells) established from vesicles, or cell populations that have the potential to diversify early embryos before implantation (eg, primitive ectoderm), or culturing these cells
  • embryonic carcinoma cells hereinafter also referred to as “EC cells” established from malignant teratomas are known to exhibit the same properties as ES cells! / ⁇ Therefore, it is included in embryonic stem cells.
  • An embryonic stem cell obtained by modifying the gene on the chromosome of the embryonic stem cell of (1) or (2) using a genetic engineering technique.
  • embryonic stem cells are cultured from the early embryo. Can be prepared.
  • Embryonic stem Cells can also be cultured serum-free, for example, 15-20% KN OCKOUT TM SR (Life Technologies), 2 mmol / l glutamine, 100 ⁇ mol / 1 MEM No n- Essential Amino Acids in Dulbecco MEM medium Using a medium containing solution, 50U / ml penicillin, 50U / ml streptomycin, 100 ⁇ mol / 12-mercaptoethanol, and l000U / ml LIF, while maintaining the characteristics of undifferentiated embryonic stem cells Can be subcultured [Focus, 20, 8, (19 98)].
  • Eggs that have started normal development after transplanting the somatic nucleus of mammalian cells are [Nature, 385, 810, (1997)], [Science, 280, 1256, (1998)], [Protein Nucleic Acid Enzyme, 44 , 892, (1999)], [Nature Biotechnology, ⁇ 7, 456, (1999)], [Nature, 394, 369, (1998); Nature Genetics, 22, 127, (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984, (1999)], [Nature Genetics, 24, 109, (2000)] and the like, for example, can be prepared as follows.
  • the development is started using a method of injecting the enucleated mammal into an unfertilized egg, By culturing an egg that has started development, an egg that has a nucleus of another somatic cell and has started normal development is obtained.
  • a plurality of methods are known as methods for reprogramming somatic cell nuclei. For example, the following methods are known.
  • the medium in which the cells providing the nucleus are cultured is changed to a medium containing 5-30%, preferably 10% fetal calf fetal serum (for example, M2 medium) for 3-10 days, preferably Inducing cell cycle to resting state (G0 phase or G1 phase) by culturing in an oligotrophic medium containing 0 to 1%, preferably 0.5% fetal calf serum for 5 days It can be initialized with.
  • This method is suitable when the mammal is, for example, a hedgehog, goat, sushi or the like.
  • the nucleus of the cell that provides the nucleus can be initialized by injecting the nucleus of the cell that provides the nucleus into an enucleated unfertilized egg of the same species of mammal and culturing for several hours, preferably about 1 to 6 hours.
  • This method is suitable in the case of a mammal power such as a mouse.
  • the initialized nucleus can begin development in an enucleated unfertilized egg.
  • Initialized Several methods are known as methods for generating a removed nucleus in an enucleated unfertilized egg.
  • the nucleus is induced by inducing the cell cycle to the resting state (GO phase or G1 phase) and transplanted into an enucleated unfertilized egg of the same mammal by electrofusion or the like. Generation can be started. This method is suitable when the mammal is, for example, a hedgehog, a goat or a lion.
  • a nucleus initialized by injecting a nucleus into an enucleated unfertilized egg of a mammal of the same species is converted into an unfertilized egg enucleated by a mammal of the same kind by a method using a micromanipulator again.
  • an egg active substance e.g., strontium, etc.
  • a cell division inhibitor e.g., cytochalasin B, etc.
  • embryonic stem cells in which genes on the chromosome are modified can be produced.
  • the gene on the chromosome to be modified includes a histocompatibility antigen gene, a gene related to a disease based on a disorder of a nervous system cell, and the like.
  • Modification of the target gene on the chromosome is carried out using the methods described in Mapuating 'The Mouse Embryo Laboratories, Human, Gene' Targeting, Production of Mutant Mice Using ES Cells, etc. Can be done.
  • a genomic gene of a target gene to be modified (for example, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene) is isolated, and the target gene is homologous using the isolated genomic gene.
  • a target vector for recombination is prepared. The prepared target vector is introduced into embryonic stem cells, and the cells that have undergone homologous recombination between the target gene and the target vector are selected to produce embryonic stem cells with modified genes on the chromosome. That's right.
  • As a method for isolating the genomic gene of the target gene Molecular Cloning, A Labora tory Manual, Second Edition, Cola Spring Harbor Laooratory Press (1989) .
  • the genomic gene of the target gene can be obtained by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CLONTECH). Can be isolated.
  • a target vector for homologous recombination of a target gene can be prepared according to the methods described in Gene's targeting, production of mutant mice using ES cells, and the like.
  • the target vector can be either a replacement type or an insertion type.
  • a method for efficiently selecting homologous recombinants for example, methods such as gene selection, positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection described in the production of mutant mice using ES cells should be used. Can do. Methods for selecting the desired homologous recombinants from the selected cell lines include the Southern Hybridization Method (Molecular Cloning 2nd Edition) for genomic DNA and PCR [PCR Protocols , A cademic Press (1990)].
  • a neuron that can be produced by induction of differentiation from embryonic stem cells refers to a stimulus from another neuron or a stimulating receptor cell, and transmits the stimulus to another neuron, muscle, or gland cell. It means a cell having a function.
  • Nerve cells are classified according to differences in neurotransmitters produced by the nerve cells, and specifically, classified according to differences in neurotransmitters, synthases of neurotransmitters, and the like.
  • Neurotransmitters include both peptidic and non-peptidic.
  • Nonpeptidic neurotransmitters include dopamine, noradrenaline, adrenaline, serotonin, acetylcholine, ⁇ -aminobutyric acid, and glutamic acid.
  • Three types of dopamine, noradrenaline and adrenaline are called catecholamines.
  • Examples of neurons classified by these neurotransmitters include dopaminergic neurons, acetylcholinergic neurons, ⁇ -aminobutyric acid neurons, serotoninergic neurons, and noradrenergic neurons. Adrenergic neurons, glutamatergic neurons and the like. Dopaminergic neurons, nordrenergic neurons, and adrenergic neurons are collectively referred to as catecholaminergic neurons.
  • Examples of a method for recognizing a nerve cell include an identification method using an antibody that recognizes the enzyme, and a method for detecting the expression of mRNA encoding the enzyme.
  • Peptide neurotransmitters include corticotropin (ACT H), aay, j8-lipotropin, ⁇ -melanocyte stimulating hormone (MSH), a-endorphin, ⁇ -endorphin, ⁇ -endorphin, methi-enkephalin, leucine enkephalin, a-neoendorphin, ⁇ -neoendorphin, dynorphin A, dyno Rufin B (Dynorphin B), Leumorphin, Vaso pressin, Neurophysin, Oxytocin, Neurophysin I, Substance P, Neurocyn A ( Neurokinin A), Nekine peptide K (Neuropeptide K), Nekine peptide— ⁇ (Neuropeptide— ⁇ ), Neurokinin B ), Bombesin, Gastrin-releasing peptide, Secretin, Motilin, Glucagon, intestinal peptide, growth hormone-releasing factor, insulin, insulin-like growth Insulin-
  • Nerve cells that produce these peptide neurotransmitters must detect the expression of an antibody that recognizes the neurotransmitter or neurotransmitter precursor peptide, or the mRNA that encodes the neurotransmitter or neurotransmitter precursor peptide. Can be identified.
  • Motor neurons transmit information to skeletal muscle by secreting acetylcholine from their nerve endings, and are classified as acetylcholinergic neurons.
  • motor neuron marker proteins include islet 1 [Nature, 344, 879, (1990)].
  • the production method of the present invention is used for production of nerve cells, preferably catecholaminergic nerve cells, more preferably donominergic nerve cells.
  • dopaminergic neurons that are induced by differentiation from embryonic stem cells by the production method of the present invention is observed in common with catecholaminergic neurons. It is characterized as a cell that expresses tyrosine hydroxylase! / Speaks but does not express dopamine- ⁇ -hydroxylase, which is commonly observed in noradrenergic and adrenergic neurons. Can improve symptoms of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.
  • Heno ⁇ phosphorus is a group of sulfated mucopolysaccharides !, and these are also called glycosaminoglycans.
  • Heparin is characterized by a disaccharide unit consisting of ⁇ -1,4-glycosidically linked D-darcosamine and L-iduronic acid units, and ⁇ -1,4-glycosidically linked D-darcosamine and D- It is a disaccharide unit consisting of glucuronic acid units.
  • the position and number of sulfate groups (sulfo groups) can vary. They are oxygen (0- Can be coupled via sulfation) and nitrogen (N-sulfation)! / ⁇ .
  • Dizuronic acid residues are often 2-0-sulfated and darcosamine residues are often N-sulfated, but if necessary 6-0-sulfated.
  • Glucuronic acid residues are often not sulfated.
  • the disaccharide units then form ⁇ - 1,4-glycosidic linkages to form a heteroline molecule.
  • the number and sequence of these disaccharide units are likewise variable.
  • Henoline is therefore a number of structurally distinct molecules that can be distinguished, for example, by elemental analysis or based on their chain length, molecular weight, or charge.
  • Hennon usually means a mixture of structurally different heparin molecules of the type described above (hyperheparin), which optionally contains other components such as V, the so-called ⁇ -heparin. May contain chondroitin sulfate (also called chondroitin sulfate or dermatan sulfate) and sputum or other cellular components (especially proteins). Heparin may be present as the free acid or in the form of a physiologically acceptable salt. Examples of physiologically acceptable salts of heparin include sodium, calcium, and magnesium salts.
  • the molecular weight of the heparin molecule is usually in the range of 200 to 30,000 Da.
  • the henolin used in the present invention may be any of henolin ⁇ phosphorus within this molecular weight range or a fragment thereof. Of these, it is preferable to use a mixture of heparin molecules (LMW heline) having a weight average molecular weight of about 500 to about 10,000 Da. Fragmentation can be preferably performed by controlled partial chemical, enzymatic or physical cleavage of heparin.
  • Chemical cleavage can be performed using, for example, sodium nitrate, enzymatic cleavage can be performed using, for example, helinase derived from flavovaterium, and physical cleavage can be performed, for example, by ultrasound. It can be carried out.
  • Substances having a heparin-like action refer to a group of substances having an action of inhibiting blood coagulation and thrombus formation, such as heparin.
  • Specific examples include sulfated plant oligosaccharides or polysaccharides such as alginic acid, pectin, xylan, starch, or dextran-powered polysulfate, and sulfated animal glycosaminodarlicans.
  • These substances having a henolin-like action can be obtained by natural products, or can be prepared by semi-synthesis or complete synthesis. For example, by reacting with chlorosulfonic acid and neutralizing the liberated hydrochloric acid with a base.
  • the concentration of henoline or a substance having a henoline-like action or a salt thereof in the culture solution is preferably 0.00001 to 5 as henoline or a henoline-like substance.
  • % By weight, more preferably 0.0001 to 1% by weight, particularly preferably 0.001 to 0.1% by weight.
  • vitamin B12 used in the present invention examples include hydroxocobalamin hydrochloride, hydroxocobalamin acetate, hydroxocobalamin, cyanocobalamin, methylcobalamin, nitrocobalamin, adenosylcobalamin, acococobalamin and salts thereof.
  • the concentration of vitamin B12 or a salt thereof in the culture solution is preferably 100 pmol / l to 10 ⁇ mol / l, more preferably lnmol / l to 10 ⁇ mol / l as vitamin B12. Particularly preferred is 10 nmol / l to 10 ⁇ mol / 1.
  • Piotin Piotin is a member of the vitamin B group and is also called vitamin H.
  • piotin and salts thereof are used.
  • the concentration of piotin or a salt thereof in the culture solution is preferably 0.001 to 10 ⁇ g / ml, more preferably 0.01 to 1 ⁇ g / ml as piotin.
  • polyamine used in the present invention examples include non-protein aliphatic amines having a plurality of amino groups, and specifically, biological amines such as putrescine, spermine, cadaverine and spermidine.
  • concentration of polyamine in the culture solution is preferably 0.001 to 10 ⁇ g / ml, more preferably 0.01 to 10 ⁇ g / ml.
  • iron-containing compound used in the present invention examples include a compound containing iron ion ( ⁇ ⁇ ⁇ ) or iron ion (III).
  • a compound containing iron ion (II) is used. Is done.
  • Examples of the compound containing iron ion (II) include FeCl 4, FeSO 4, FeSO 2-(NH 2) 2 SO 4
  • Examples of the compound containing iron ion (III) include FeCl, Fe (SO), Fe (SO)-(NH
  • An anhydride or hydrate containing iron ions (III) such as SO, Fe (NO), K [Fe (CN)], etc.
  • the concentration of the iron-containing compound in the medium is preferably 0.01 to 10 ⁇ mol / U, more preferably 0.1 to 10 ⁇ m as iron ion (II) or iron ion (III). mol / 1.
  • the medium used in the production method of the present invention can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basic medium.
  • BME medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89, 362, (1965)
  • BGJb medium Exp. Cell Res., 25, 41, (1961)
  • CMRL 1066 medium NY Academy of Sciences
  • a medium supplemented with various growth factors as a serum substitute, or a protein-free medium.
  • any medium can be used as long as animal cells can be cultured.
  • serum-free medium supplemented with KNOCKOUT TM SR MD Goldsborough et al .; Focus, 20, 8, (1998)
  • serum-free medium supplemented with insulin and transferrin, and cell-derived factors examples include added media.
  • Serum-free media supplemented with insulin and transferrin include CHO-S-SFM II (GIBCOBRL), Hybridoma-SFM (GIBCOBRL), eRDF Dry Powdered Media (GIBCOBRL), UltraCULTURE TM (BioWhittaker), UltraDOMA TM (BioWhittker), UltraCHO TM (BioWhittaker), UltraMDCK TM (BioWhittaker), I TPSG medium [S. Hosoi et al .; Cytotechnology, 5, S17, (1991) ], ITSFn medium [A. Rizzino and C. Growley; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457, (1980)], mN3 medium [S. Okabe et al .; Mech. Dev., 59, 89, ( 1996)].
  • a medium supplemented with cell-derived factors a medium supplemented with a culture supernatant of pluripotent teratocarcinoma cell PSA1 (GR Martin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981). ).
  • protein-free medium examples include CD-CHO (manufactured by GIBCOBRL), PFHM-II (manufactured by GIBCOBRL), and UltraDOMA-PF TM (manufactured by BioWhittaker).
  • a medium for inducing differentiation of embryonic stem cells can be prepared by adding the above-mentioned vitamin B12 or a salt thereof and heparin or a substance having a heparin-like action or a salt thereof to these media.
  • vitamin B12 or a salt thereof 10% KNOC KOUT TM SR (GIBCOBRL), 2 mmol / l glutamine, 50 U / ml penicillin, 50 U / ml streptomycin, and 0.1 mmol / l 2-mercaptoethanol
  • any incubator capable of culturing embryonic stem cells can be used.
  • an incubator used for cell culture is used.
  • the incubator for cell culture include a flask, a bacterial culture flask, a cell culture flask, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a tour dish, a normal ox dish, a mano tide, a microplate, and a microweno.
  • the surface of the incubator in contact with the cells can be artificially treated.
  • artificially treating the surface of an incubator include collagen type I coat, collagen type IV coat, gelatin coat, poly L-lysine coat, fibronectin coat, laminin coat, proteoglycan coat, glycoprotein coat, Matrigenore coat, silicon coat, etc.
  • collagen type cocoon coat, collagen type IV coat, gelatin coat, fibronectin coat, laminin coat are preferably used. It can also be treated to have a negative charge, such as profia (Falcon). An incubator subjected to these treatments can also be used in the production method of the present invention.
  • vitamin B12 or a salt thereof and a substance having a non- or heparin-like action or a salt thereof are used to culture embryonic stem cells in a non-aggregated state. It includes a step of inducing differentiation into nerve cells and collecting the nerve cells from the culture.
  • the activity of stromal cells to induce differentiation of embryonic stem cells into ectoderm cells or ectoderm-derived cells (hereinafter abbreviated as "SDIA activity”).
  • Embryonic stem cells can be induced into neural cells without using a specific protein factor such as a protein factor having).
  • Specific protein factors such as protein factors having SDIA activity include secreted frizzled-related protein (hereinafter abbreviated as “SFRP”) 1, one or more amino acids constituting SFRP1 are deleted, substituted or Examples of the added polypeptide include those having an activity of inducing differentiation of embryonic stem cells into ectoderm cells or ectoderm-derived cells (WO03 / 42384).
  • To cultivate embryonic stem cells in a non-aggregated state is to start culturing in a single cell state in which cell-cell adhesion is released and to continue culturing.
  • the single cell state refers to a state in which individual cells that are not adhered to each other are separated by enzymatic digestion or the like.
  • the seeded cells do not aggregate and do not form an embedded body.
  • cultivate embryonic stem cells It is preferable to seed and culture at a lower cell density than that used for normal embryonic stem cell passage.
  • the embryonic stem cells are subjected to a treatment such as enzymatic digestion, and a cell suspension in a single cell state is prepared using a medium, and the cells are not in contact with each other in the culture system. Incubate to the extent that it can exist in the state.
  • the cell density of the embryonic stem cells for seeding to such an extent that the cells can be present in the culture system without contacting each other is preferably several tens to several thousand cells Zcm 2 , more preferably 30 to 300 cells Zcm. 2 .
  • Examples of a method for obtaining embryonic stem cells in a single cell state include known enzyme digestion methods used in tissue cell culture. Specifically, after exchanging the medium the day before and removing the culture dish where the embryonic stem cells proliferated to several tens of percent to almost confluent were removed, phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “buffered saline”) Wash with PBS several times, preferably 2-3 times. After washing, a suitable enzyme digestion solution (eg, PBS containing lmmol / 1 EDTA and 0.25% trypsin) is placed in a culture dish containing embryonic stem cells, and maintained at 37 ° C for several tens of minutes, preferably 5 to Incubate for 20 minutes.
  • a suitable enzyme digestion solution eg, PBS containing lmmol / 1 EDTA and 0.25% trypsin
  • Embryonic stem cells in a cell state can be collected.
  • An embryonic stem cell prepared in a single cell state is a culture method suitable for inducing differentiation of an embryonic stem cell using the medium described in 9 and the culture vessel described in 10, specifically, It can be induced in neurons by monolayer culture, microcarrier culture, reflux culture, soft agar culture, and the like. To induce embryonic stem cells into neurons, It is preferable to continue the culture while appropriately changing the medium in the production method including
  • embryonic stem cells are induced to differentiate into neurons, and 5% or more, preferably 15% or more, more preferably 40% or more of the embryonic stem cells subjected to the production method of the present invention. It can induce differentiation into neuronal cells.
  • the nerve cells produced by the production method of the present invention can be used, for example, for the treatment of diseases based on cytotoxicity of nerve cells.
  • Examples of diseases based on nerve cell damage include Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease, ischemic brain disease, epilepsy, brain injury, spinal cord injury, motor nerve disease, neurodegenerative disease, retinitis pigmentosa Disease, inner ear deafness, Down syndrome, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, diseases caused by neurotoxin disorders, and the like.
  • the treatment of diseases based on cell damage compensates for the functions of impaired cells, the precursor cells of damaged cells, and the functions of damaged cells that are available for transplantation. Cells and cells having a function of promoting the regeneration of damaged cells are used.
  • Any cell purification method can be used as long as it is a known cell separation and purification method.
  • Antibodies Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14]. (1988)], Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)], 7-centibo engineering [Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996)], Int. Immunol, 10, 275, (1998), Exp. HematoL, 25, 972, (1997), etc., method using a flow cytometer, monoclonal antibody, antibody Using the density difference of sucrose concentration described in engineering, J.
  • the method for increasing the purity of nerve cells produced according to the present invention includes the use of vitamin B12 or a salt thereof and a heparin or heparin-like substance or a salt thereof using an embryo.
  • examples include a step of culturing sex stem cells in a non-aggregated state and then culturing in a medium containing an anticancer agent.
  • undifferentiated cells can be removed, and nerve cells with higher purity can be obtained. That is, by treating with an anticancer agent, cells other than the target nerve cells, such as unidentified cells, can be removed.
  • anticancer agents used in the method for increasing the purity of nerve cells produced according to the present invention include mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, ala C, and methotrexate. These anticancer agents are preferably used at concentrations that are more cytotoxic to cells in an undifferentiated state than differentiated nerve cells. For example, a concentration that is 1 to 1/100 times the concentration described in the Japanese Pharmacopoeia when these anticancer agents are used in living bodies is preferable.
  • the step of culturing neuronal cells obtained by inducing differentiation of embryonic stem cells in a medium containing an anticancer agent specifically means that the culture system in which the medium was exchanged on the previous day has an appropriate concentration.
  • Anti-cancer agent for example, 1 to 100 ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml mitomycin C, CO incubator aerated with 5% carbon dioxide, preferably at 37 ° C for several hours Incubate for 2-3 hours
  • any medium can be used as long as it is capable of culturing differentiated cells. Specifically, the medium described in 9 above can be mentioned.
  • embryonic stem cells obtained by nuclear transfer of somatic cell nuclei as described in 2 (2) above or on chromosomes as described in 2 (3) above. By using embryonic stem cells in which these genes are modified, rejection due to histocompatibility antigen errors can be avoided.
  • any method suitable for the target disease can be used, and a deviation method can also be used.
  • Known methods suitable for each disease are known for each disease.
  • the somatic cell power of a diseased patient is prepared as described in 2 (2) or (3) above, and after the embryonic stem cell is induced to differentiate into a neuron, it is transplanted to the diseased site of the patient.
  • methods for transplanting nerve cells to Parkinson's disease patients include the methods described in Nature Neuroscience 2, 1137, (1999) and the like.
  • ES cells EB5 (Nature Genet., 24, 372, (2000)] were used as embryonic stem cells.
  • EB5 is seeded in a dish coated with 0.1% gelatin, 1% fetal bovine serum (manufactured by JRH Biosciences), 10% Knockout berum Replacement (Invitrogen), lmmol / 1 pinolevic acid (manufactured by Sigma) , 0.1 mmol / 1 non-essential amino acid (Invitrogen), 0.1 mmol / 1 2-mercaptoethanol (Nacalai Testa), 20 mg / ml blasticidin (Invivogen), and 2 X 10 3 U / ml ESGRO Using G-MEM (Invitrogen) (hereinafter referred to as "maintenance medium”) containing (Chemicon), in a CO incubator aerated with 5% carbon dioxide at 37 ° C,
  • the cells were subcultured while maintaining the crystallization state.
  • EB5 in inducing differentiation EB5 is seeded with 2.5 X 1 0 3 single EB5 to 24 ⁇ El plate coated with 0.1% gelatin, serum from maintenance medium, medium minus blasticidin, and ESGRO ( Hereafter, 1 ml of each “well” was added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours to allow the cells to adhere. Thereafter, 500 1 of PBS (hereinafter referred to as “Test Solution 1”) containing various concentrations of henolin (Sigma) or vitamin B12 (cyanocobalamin, manufactured by Nacalai Testa) was added at 37 ° C. Incubated without changing medium for 14 days. Each experimental article The case was conducted in duplicate. In the following, the concentrations of heno ⁇ phosphorus and vitamin B12 mean the concentrations in test solution 1.
  • test solution 2 PBS containing 0.01% heparin and lOOnmol / 1 vitamin B12 (hereinafter referred to as “test solution 2”), 0.1 ⁇ g / ml pio Test solution 3 containing Chin [(+)-Piotin, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] Test solution 4 containing 0.42 g / ml K [Fe (CN)] (Nacalai Testa) in Test solution 2, Test solution 2 0.081 ⁇ g / ml
  • Test Solution 5 containing Resin (Sigma), Test Solution 2 containing 0.1 g / ml Piotin, 0.42 ⁇ g / ml K [Fe (CN)] and 0.081 ⁇ g / ml Putrescine 6, 0.01% hepa
  • the nerve cell differentiation induction rate was examined in the same manner as in Example 1 except that the test solution 7 containing syn was used.
  • neural tissue marker NC AM neural cell adhesion molecule
  • mature neuron marker class III ⁇ tubulin mature neuron marker class III ⁇ tubulin
  • catecholaminergic neuron marker tyrosine Immunostaining of neuronal colonies with various antibodies against hydroxylase ( ⁇ ) was performed as follows.
  • each well cell was washed once with 1 ml of PBS, and then PBS containing 4% (w / v) paraformaldehyde. Treated with 0.25 ml for 15 minutes at room temperature. Then, after washing twice with 0.5 ml of PBS, 0.25 ml of methanol was added and treated at -20 ° C for 15 minutes. Further, the cells were washed twice with 0.5 ml of PBS, and then added with 0.25 ml of PBS containing 2% (w / v) skim milk (Difco) and blocked at room temperature for 2 hours.
  • Example 3 Induction of differentiation into nerve cells such as ES cells by vitamin and vitamin B12 (3)
  • Example 1 instead of a 24 well plate coated with 0.1% gelatin, coated with 0.005% poly-L-onorenitine (SIGMA) and 50 ⁇ g / ml fibronectin (Invitrogen) 8 Using a well plate, instead of test solution 1, PBS, 0.01% heparin and PBS containing 10 nmol / l vitamin B12 (hereinafter referred to as “test solution 8”), 0.01% heno ⁇ phosphorus and PBS containing lOOOnmol / 1 vitamin B12 (hereinafter referred to as “Test Solution 9”), 0.01% heparin, 10 nmol / l vitamin B12, 0.3 ⁇ g / ml biotin, 3 ⁇ mol / 1 K [Fe (CN)] (
  • test solution 10 PBS containing 4 6 (Nacalai Testa) and PBS containing 1.6 ⁇ g / ml putrescine
  • CDNA was prepared using For detection of the transcription product of the Nurrl gene, a marker of dopaminergic neurons in the midbrain, DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is used as a primer, and transcription of the TH gene For detection of the product, DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was used as a primer. As a control, DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 was used as a primer for detection of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene transcript.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • PCR reaction was performed using GeneAmp PCR system 9700Ex (Applied Biosystems) and Ex Taq (Takara) for 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 60 ° C, 30 seconds at 72 ° C. The reaction for 30 seconds was performed 30 cycles. The reaction solution was analyzed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • a method for producing neural cells by inducing differentiation of embryonic stem cells a method for inducing differentiation of embryonic stem cells into neurons, a medium used for the production method or the method for inducing differentiation, or embryonic stem cells
  • a method for increasing the purity of differentiation-induced neurons is provided.

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Abstract

　本発明は、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法を提供することを目的とする。 　本発明によれば、胚性幹細胞をビタミンB12またはそれらの塩およびヘパリンもしくはヘパリン様作用を有する物質またはそれらの塩により分化誘導することにより、神経変性疾患等の治療に適用することができる神経細胞を簡便、選択的または安価に製造する方法が提供される。

Description

明 細 書
神経細胞の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神 経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法および分化誘導方法に使用される培地 、ならびに胚性幹細胞力も分ィ匕誘導された神経細胞の純度を高める方法に関する。 背景技術
[0002] パーキンソン病は中脳黒質に存在するドーパミン作動性神経細胞が変性 ·脱落し て発症する神経変性疾患であり、線条体でドーパミンが減少するため、振戦、固縮、 寡動などの運動障害を生じる。その治療法としては線条体のドーパミンを補うために ドーパミンの前駆物質である L-DOPA (L-ジヒドロキシフエ-ルァラニン）の投与がよく 用いられているが、長期投与や症状の進行に伴い効果の減弱が認められる。このよ うな重症パーキンソン病患者に対しては細胞移植治療が試みられて 、るが（非特許 文献 1参照)、移植するための細胞を大量に確保することは困難な状況にある。
[0003] 胚性幹細胞とはインビトロで培養が可能で、かつ他の個体の着床以前の胚、例え ば胚盤胞の胞腔中に注入すると、生殖細胞をも含む全ての細胞に分化できる細胞で あり、 ES細胞とも呼ばれている。パーキンソン病患者へ移植する細胞を得るために、 E S細胞からドーパミン作動性神経細胞への分化誘導も種々試みられて ヽる。
[0004] Leeらは ES細胞から細胞塊（embryoid bodies)を形成した後、ネスチン陽性細胞を 選択 '増殖させることによりドーパミン作動性神経細胞が得られることを報告している（ 非特許文献 2参照)。また、川崎らはマウス由来 PA6細胞をフィーダ一細胞として ES細 胞を培養することにより、ドーパミン作動性神経細胞が短期間に得られることを報告し ている（非特許文献 3参照)。該フィーダ一細胞力もは、胚性幹細胞を外胚葉細胞ま たは外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性（Stromal cell-derived inducing activity )を有する蛋白性の因子が同定され、該蛋白性因子を培地に添加することで ES細胞 力もドーパミン作動性神経細胞が誘導されることが示されている (特許文献 1参照)。 また、核内受容体 Nurrl (非特許文献 4参照)や Wntアンタゴスト SFRP-2 (非特許文献 5 参照）を ES細胞に過剰発現させることによりドーパミン作動性神経細胞が誘導できる ことが報告されている。
[0005] ビタミン B12はメチル基転移反応により核酸、タンパク質、脂質の代謝を促進して末 梢神経組織を修復するなどの薬理作用が古くから知られている。一方、へパリンと称 される一群の硫酸ィ匕ムコ多糖類は、血栓閉塞性障害の予防や処置に使用されてい る力 最近、低分子へノ^ンについて、運動-ユーロンの生存や成長に関する作用 があることが報告されている（特許文献 2参照)。ピオチン、プトレシン等のポリアミン、 鉄含有化合物は微生物、植物細胞、動物細胞など様々な培養を行うための培地に 一般的に含まれている成分であり、ビタミン、補酵素、ポリアミン、または微量栄養素と しての役割を通じて、代謝亢進作用、タンパク質や核酸の合成促進作用など様々な 作用を示すことが知られている。ピオチン (ビタミン H)は酵素触媒によるカルボキシル 化反応および脱カルボキシルイ匕反応にぉ 、て必須の役割を果たして 、るが、殆ど全 ての動物は自らビォチンを合成できないため、外界からピオチンを摂取する必要が あり、生細胞における必須の因子である。ポリアミンについては、ラット培養海馬神経 細胞の軸索突起の伸展を促進する作用が知られて！/ヽる (非特許文献 6参照)。
[0006] 特許文献 1：国際公開第 03Z42384号パンフレット
特許文献 2：特表 2002— 53243号公報
非特許文献 1 :「ニュ^ イングランド 'ジャーナル'ォブ 'メディスン（New England Jour nal of Medicine)」、 2001年、第 344卷、 p. 710
非特許文献 2：「ネイチヤ^ ~ ·バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」、 2000年、 第 18卷、 p. 675
非特許文献 3：「プロシーディンダス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シズ ·ォブ ·ユナイテッド ·ステイツ ·ォブ ·アメリカ（Proceedings of the National Academ y of Sciences of the United States of America)」、 2002年、第 99卷、 p. 1580 非特許文献 4 :「ネイチヤー（Nature)」、 2002年、第 418卷、 p. 50
非特許文献 5：「ネイチヤ^ ~ ·バイオテクノロジー（Nature Biotechnology)」、 2002年、 第 20卷、 p. 1240
非特許文献 6 :「ニューロサイエンス 'リサーチ（Neuroscience Research)」、 1994年、 第 19卷、 p. 155
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を神 経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される培 地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法を提供する ことを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は以下の（1)〜（16)に関する。
(1)ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへノリン様作用を有する物 質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養して神経細胞に分ィ匕 誘導し、該培養物より神経細胞を採取する工程を含む、神経細胞の製造方法。
(2)神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である上記（1)に記載の製造方法
(3)カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である上記（2)に 記載の製造方法。
(4)無血清培地中で分化誘導することを特徴とする上記（1)〜（3)の ヽずれか 1項に 記載の製造方法。
(5)ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞 に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、上記 (4)に記 載の製造方法。
(6)無血清培地が、ピオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選 ばれる 1種以上の化合物を含有する無血清培地である、上記 (4)または（5)に記載 の製造方法。
(7)上記（1)〜（6)の 、ずれか 1項に記載の製造方法に使用される、胚性幹細胞を 神経細胞に分化誘導する活性を有する培地。
(8)ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへノリン様作用を有する物 質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性 幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法。
(9)神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である上記（8)に記載の方法。
(10)カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である上記（9) に記載の方法。
(11)無血清培地中で分ィ匕誘導することを特徴とする上記 (8)〜（10)の 、ずれか 1 項に記載の方法。
( 12)ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細 胞に分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、上記（11)に 記載の方法。
(13)無血清培地が、ピオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選 ばれる 1種以上の化合物を含有する無血清培地である、上記（11)または（12)に記 載の方法。
(14)上記（8)〜（13)のいずれか 1項に記載の方法に使用される、胚性幹細胞を神 経細胞に分化誘導する活性を有する培地。
(15)ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物 質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養した後、抗癌剤を含む 培地中で培養する工程を含む、胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を 高める方法。
(16)抗癌剤力 マイトマイシン C、 5-フルォロウラシル、アドリアマイシン、ァラ Cおよ びメトトレキセートからなる群より選ばれる抗癌剤である、上記（15)に記載の方法。 発明の効果
本発明により、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を 神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される 培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法が提供 される。
本発明により、特定の蛋白性因子を使用することなぐまた、多段階の培養や異種 細胞との共培養、特定方向へ分化を誘導するための遺伝子操作等の煩雑な操作を 行うことなぐ簡便、選択的かつ安価に胚性幹細胞をドーパミン作動性神経細胞へ分 ィ匕誘導させることができる。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、へパリンおよびビタミン B12の濃度を変化させた場合において、 EB5から 形成されるコロニー数を示す図である。グラフの國はへパリンの 0.01%添加条件、▲は へパリンの 0%添加条件を示す。また、グラフの横軸は試験溶液 1に含まれているビタ ミン B12の濃度 (nmol/l)、縦軸は培養開始 14日後に観察された総コロニーの個数を 表す。
[図 2]図 2は、へパリンおよびビタミン B12の濃度を変化させた場合において、 EB5から 誘導される神経細胞の割合、すなわち神経細胞誘導率を示す図である。グラフの國 はへパリンの 0.01%添加条件、▲はへパリンの 0%添加条件を示す。また、グラフの横 軸は試験溶液 1に含まれているビタミン B12の濃度 (nmol/1)、縦軸は培養開始 14日 後における神経細胞誘導率 (％)を表す。
[図 3]図 3は、ビタミン B12非添加条件でへノ^ンの濃度を変化させた場合において、 EB5から形成される総コロニー数および神経細胞コロニー数を示す図である。グラフ の國は神経細胞コロニーを、▲は総コロニーを示す。また、グラフの横軸は試験溶液 1に含まれているへノ《リンの濃度 (％)を、縦軸は培養開始 14日後に観察されたコ口- 一の個数を表す。
[図 4]図 4は、実施例 1における試験溶液 1に代えて試験溶液 2〜7を添加した場合に おける EB5から誘導される神経細胞の割合、すなわち神経細胞誘導率を示す図であ る。グラフのカラム 1は試験溶液 2の添加条件、カラム 2は試験溶液 3の添加条件、力 ラム 3は試験溶液 4の添加条件、カラム 4は試験溶液 5の添加条件、カラム 5は試験溶 液 6の添加条件、カラム 6は試験溶液 7の添加条件を示す。また、グラフの縦軸は培 養開始 14日後における神経細胞誘導率 (％)を表す。
[図 5]図 5は、 EB5から分ィ匕誘導した神経細胞におけるドーパミンの産生を示す図で ある。グラフのカラム 1は PBSの添加条件、カラム 2は試験溶液 8の添加条件、カラム 3 は試験溶液 9の添加条件、カラム 4は試験溶液 10の添加条件を示す。また、グラフの 縦軸は、分ィ匕誘導した細胞 107個あたりのドーノ ミン産生量 (pmol/107cells)を表し、 値は平均値士標準偏差 (n= 3)で示した。 発明を実施するための最良の形態
[0011] 1.胚性幹細胞
本発明において、胚性幹細胞とはインビトロで培養が可能で、かつ他の個体の着 床以前の胚、例えば胚盤胞の胞腔中に注入すると、生殖細胞をも含む全ての細胞 に分ィヒできる細胞であり、下記の（1)、（2)、および（3)にあげる胚性幹細胞を包含 する。
(1)着床以前の初期胚を培養することによって榭立した哺乳動物等の胚性幹細胞、 より具体的には、初期胚を構成する内部細胞塊より榭立された ES細胞、始原生殖細 胞から樹立された EG細胞（embryonic germ cell)、もしくは着床以前の初期胚の多分 化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉)から単離した細胞、またはこれらの細 胞を培養することによって得られる細胞、また、悪性奇形腫より榭立された胚性癌腫 細胞（embryonal carcinoma cell ;以下「EC細胞」ともいう。）も ES細胞と同様の性質を 示すことが知られて!/ヽることから、胚性幹細胞に含まれる。
(2)体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって 榭立した胚性幹細胞。
(3) (1)または（2)の胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて 改変した胚性幹細胞。
[0012] 2.胚性幹細胞の作製法
上記 1で述べた（1)、（2)、および (3)の胚性幹細胞の作製法を具体的に説明する
(1)着床以前の初期胚を培養することによって榭立した胚性幹細胞の調製
着床以前の初期胚を、文献 (マ-ピュレイティング 'ザ 'マウス'ェンブリオ'ァ ·ラボラ トリー'マ-ユアル）に記載された方法に従って培養することで、該初期胚より胚性幹 細胞を調製することができる。
[0013] 得られた胚性幹細胞の培養方法としては、文献 (マ-ピュレイティング ·ザ'マウス' ェンブリオ 'ァ'ラボラトリー 'マ-ユアノレ； Methods in Enzymology volume 225, Guide t o Techniques in Mouse Development, Academic Press, 1993 ; ES糸田胞を用 ヽ 7こ変異 マウスの作製)等に記載の胚性幹細胞を培養するための方法があげられる。胚性幹 細胞は無血清培養することも可能で、例えば、 Dulbecco MEM培地に 15〜20%の KN OCKOUT™ SR (Life Technologies社製）、 2mmol/lグルタミン、 100 μ mol/1 MEM No n- Essential Amino Acids溶液、 50U/mlペニシリン、 50U/mlストレプトマイシン、 100 μ mol/1 2—メルカプトエタノール、および l,000U/ml LIFをカ卩えた培地を用い、未分化 な胚性幹細胞としての形質を保ったまま継代培養することができる [Focus, 20, 8, (19 98)]。
[0014] (2)体細胞の核を核移植した胚性幹細胞の作製
哺乳類動物細胞の体細胞の核を移植し正常な発生を開始した卵は、 [Nature, 385 , 810, (1997)]、 [Science, 280, 1256, (1998)]、 [蛋白核酸酵素， 44, 892, (1999)]、 [ Nature Biotechnology, Γ7, 456, (1999)]、 [Nature, 394, 369, (1998); Nature Genetic s, 22, 127, (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984, (1999)]、 [Nature Geneti cs, 24, 109, (2000)]等に記載された方法を用い、例えば以下のように作製することが できる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化 (核を再び発生を繰り返すことができるような 状態に戻す操作)し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を 開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ 正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、以下 の方法が知られている。
[0015] 核を提供する側の細胞を培養している培地を、 5〜30%、好ましくは 10%の仔ゥシ 胎児血清を含む培地 (例えば、 M2培地)から 3〜10日、好ましくは 5日間、 0〜1%、好 ましくは 0.5%の仔ゥシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周 期を休止期状態 (G0期もしくは G1期）に誘導することで初期化することができる。この 方法は、哺乳動物が、例えばヒッジ、ャギ、ゥシなどの場合に好適である。また、同種 の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し数時間、 好ましくは約 1〜6時間培養することで初期化することができる。この方法は、哺乳動 物力 例えばマウスなどの場合に好適である。
[0016] 初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することができる。初期化さ れた核を除核された未受精卵中で発生させる方法としては複数の方法が知られてい る。例えば、細胞周期を休止期状態 (GO期もしくは G1期）に誘導し初期化した核を、 電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子 を活性ィ匕し発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばヒッジ、 ャギ、ゥシなどの場合に好適である。
[0017] また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、 再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した 未受精卵に移植し、卵子活性ィ匕物質 (例えば、ストロンチウムなど)で刺激後、細胞 分裂の阻害物質 (例えば、サイトカラシン Bなど)で処理し第二極体の放出を抑制する ことで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの 場合に好適である。
[0018] いったん発生を開始した卵が得られれば、マニピュレイティング ·ザ'マウス'ェンブ リオ 'ァ'ラボラトリー 'マ-ユアル、ジーン'ターゲッティング、 ES細胞を用いた変異マ ウスの作製等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
(3)染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞の作製
相同組換え技術を用いることによって、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞 を作製することができる。
[0019] 例えば、改変する染色体上の遺伝子としては、組織適合性抗原遺伝子、神経系細 胞の障害に基づく疾患に関連した遺伝子などが挙げられる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、マ-ピュレイティング 'ザ.マウス.ェンブリオ.ァ . ラボラトリ一.マ-ユアル、ジーン'ターゲッティング、 ES細胞を用いた変異マウスの作 製等に記載の方法を用い、行なうことができる。
[0020] 具体的には、例えば、改変する標的遺伝子 (例えば、組織適合性抗原遺伝子ゃ疾 患関連遺伝子など)のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺 伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットべク ターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起 こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製す ることがでさる。 [0021] 標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、 Molecular Cloning, A Labora tory Manual, Second Edition, Cola Spring Harbor Laooratory Press (1989) 下「モ レキユラ一'クロー-ング第 2版」と略す。）やカレント 'プロトコールズ 'イン'モレキユラ ~~ 'ノヽィォロン ~~ (Current Protocols in Molecular Biology, Jonn Wiley & Sons (1987- 1997) (以下「カレント 'プロトコールズ'イン'モレキユラ一'バイオロジー」と略す。）等 に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノム DNAライブラリースクリーニング システム（Genome Systems社製）や Universal GenomeWalker™ Kits (CLONTECH社 製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
[0022] 標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、ジーン'ターゲッティン グ、 ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することが できる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーシヨン型いずれでも用いる ことができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、ジーン'ターゲッティング、 ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、 ネガティブ選択、ポリ A選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中か ら目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノム DNAに対するサザンハイ ブリダィゼーシヨン法（モレキュラ^ ~ ·クロー-ング第 2版）や PCR法 [PCR Protocols, A cademic Press(1990)]等があげられる。
[0023] 3.神経細胞
本発明において、胚性幹細胞から分化誘導させて、製造することができる神経細胞 とは、他の神経細胞または刺激受容細胞からの刺激を受け、別の神経細胞、筋また は腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。
[0024] 神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類されており、具 体的には、神経伝達物質、神経伝達物質の合成酵素などの違いで分類されている。 神経伝達物質としては、ペプチド性、非ペプチド性のいずれも包含される。非ぺプチ ド性の神経伝達物質としては、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン 、アセチルコリン、 γァミノ酪酸、グルタミン酸があげられる。ドーパミン、ノルアドレナリ ン、アドレナリンの 3種類をカテコールアミンと称す。 [0025] これら神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドーパミン作動性神 経細胞、アセチルコリン作動性神経細胞、 γァミノ酪酸作動性神経細胞、セロトニン 作動性神経細胞、ノルアドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞、 グルタミン酸作動性神経細胞などがあげられる。ドーパミン作動性神経細胞、ノルァ ドレナリン作動性神経細胞、アドレナリン作動性神経細胞を総称してカテコールアミ ン作動性神経細胞と呼ぶ。
[0026] カテコールアミン作動性神経細胞は共通してチロシン水酸ィ匕酵素を発現し、ノルァ ドレナリン作動性神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞では共通してドーパミン- j8 -ヒドロキシラーゼを発現する。また、ノルアドレナリン作動性神経細胞ではフエ-ルェ タノールァミン N—メチルトランスフェラーゼを発現し、セロトニン作動性神経細胞で はトリブトファンヒドロキシラーゼを発現し、アセチルコリン作動性神経細胞ではコリン ァセチルトランスフェラーゼを発現し、 γァミノ酪酸作動性神経細胞ではグルタミン酸 デカルボキシラーゼをそれぞれ特異的に発現している。したがって、神経細胞を認識 する方法としては、上記酵素を認識する抗体を用いた識別方法、上記酵素をコード する mRNAの発現を検出する方法などがあげられる。
[0027] ペプチド性の神経伝達物質としては、副腎皮質刺激ホルモン [Corticotropin (ACT H)]、 a a y , j8—リポトロピン（Lipotropin)、 α -メラニン細胞刺激ホルモン（MSH)、 a -エンドルフィン（Endorphin)、 β -エンドルフィン、 Ύ -エンドルフィン、メチォ -ンェ ンケフアリン（Met- Enkephalin)、ロイシンエンケフアリン（Leu- Enkephalin)、 a -ネオェ ンドルフイン（Neoendorphin)、 β -ネオエンドルフィン、ダイノルフィン A (Dynorphin A) 、ダイノルフィン B (Dynorphin B)、ロイモルフイン（Leumorphin)、バソプレツシン（Vaso pressin)、ニューロフイシン (Neurophysin)、ォキシトシン (Oxytocin)、ニューロフイシン I (Neurophysin I)、サブスタンス P (Substance P)、ニューロキュン A (Neurokinin A)、 ネ申経ペプチド K (Neuropeptide K)、ネ申経ペプチド— γ (Neuropeptide— γ )、ニューロキ ニン B (Neurokinin B)、ボンべシン（Bombesin)、ガストリン放出ペプチド（Gastrin- rele asing peptide)、セクレチン（Secretin)、モチリン（Motilin)、グルカゴン（Glucagon)、ノ
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intestinal peptideノ、成お ルモン 放出因子（Growth hormone-releasing factor)、インスリン（Insulin)、インスリン様増殖 因子（Insulin-like growth factors)、ソマトスタチン（Somatostain)、ガストリン（Gastrin) 、コレシストキニン（Cholecystokinin)、神経ペプチド Ύ (Neuropeptide Y)、脾臓ポリぺ プチド（Pancreatic polypeptide)、ペプチド ΎΥ (Peptide YY)、副腎皮質刺激ホルモン 放出因子 (Corticotropin— releasing factor)、カノレシトニン (Calcitonin)、カノレシトニン 遺伝子関連ペプチド（Calcitonin gene-related peptide) ,アンギオテンシン（Angioten sin)、ブラジキュン（Bradykinin)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（Thyrotropin-re leasing hormone)、ニューロテンシン (Neurotensin)、ガラニン (Galanin)、黄体开成ホ ノレモン放出ホノレモン (Luteinizing hormone-releasing dormone)等力あげられる。これ らのペプチド性の神経伝達物質を産生する神経細胞は、神経伝達物質または神経 伝達物質前駆ペプチドを認識する抗体、神経伝達物質または神経伝達物質前駆べ プチドをコードする mRNAの発現を検出することで識別することができる。
[0028] また、 運動神経は、その神経終末よりアセチルコリンを分泌することで骨格筋に情 報を伝えており、アセチルコリン作動性神経細胞に分類される。運動神経のマーカー 蛋白質としては、 islet 1 [Nature, 344, 879, (1990)]等があげられる。
本発明の製造方法は、神経細胞、好ましくはカテコールアミン作動性神経細胞、よ り好ましくはドーノ ミン作動性神経細胞の製造に用いられる。
[0029] 特に、本発明の製造方法により、胚性幹細胞から分化誘導され、製造されるドーパ ミン作動性神経細胞は、前述したように、カテコールアミン作動性神経細胞に共通し て発現が観察されるチロシン水酸化酵素を発現して!/ヽるが、ノルアドレナリン作動性 神経細胞とアドレナリン作動性神経細胞に共通して発現が観察されるドーパミン- β - ヒドロキシラーゼを発現しない細胞として特徴づけられ、移植により神経変性疾患、例 えばパーキンソン病の症状を改善することができる。
[0030] 4.へパリンおよびへパリン様作用を有する物質
へノ《リンとは一群の硫酸ィ匕 (スルホン化)ムコ多糖類を!、 、、これらはまたグリコサミ ノグリカンとも呼ばれる。へパリンの構造の特徴は、 α - 1,4-グリコシド結合した D-ダル コサミンおよび L-ィズロン酸ユニットから成る二糖ユニット、および α -1,4-グリコシド結 合した D -ダルコサミンおよび D-グルクロン酸ユニットから成る二糖ユニットである。ス ルフェート基 (スルホ基）の位置および数は 、ずれも可変である。それらは酸素（0- 硫酸化）および窒素 (N-硫酸化）を介して結合してもよ!/ヽ。ィズロン酸残基は多くの場 合 2-0-硫酸ィ匕され、ダルコサミン残基は多くの場合 N-硫酸ィ匕されるが、必要により 6 -0-硫酸化もされる。グルクロン酸残基は多くの場合硫酸ィ匕されない。次に、その二 糖ユニットは互いに α - 1,4-グリコシド結合してへノ リン分子を形成する。これらの二 糖ユニットの数および配列は同様に可変である。従ってへノ リンは多くの構造的に異 なる分子であり、それらは例えば元素分析によって、またはその鎖長、分子量、もしく は電荷に基づいて区別できる。へノ^ンとは、通常、上記のタイプの構造的に異なる へパリン分子（ひ-へパリン)の混合物を意味し、これは必要により、他の成分、例えば V、わゆる β -へパリン（コンドロイチン硫酸 Βまたはデルマタン硫酸とも呼ばれる）およ び Ζまたは他の細胞成分 (特にタンパク質)を含有してもよ ヽ。へパリンは遊離酸とし て、または生理学上許容される塩の形態で存在してもよい。へパリンの生理学上許容 される塩としては、ナトリウム、カルシウム、またはマグネシウム塩等があげられる。
[0031] へパリン分子の分子量は通常、 200から 30,000Daの範囲内にある。本発明において 使用されるへノ リンは、この分子量の範囲内のへノ《リン、またはその断片化したもの のいずれでもよい。このうち、重量平均分子量が約 500から約 10,000Daであるへパリ ン分子の混合物（LMWへノ リン)を使用することが好ましい。断片化は、好ましくはへ パリンの制御された部分的な化学的、酵素的、または物理的開裂によって行うことが できる。化学的開裂は、例えば硝酸ナトリウムを用いて行うことができ、酵素的開裂は 、例えばフラボバタテリゥム由来のへノ リナーゼを用いて行うことができ、また、物理 的開裂は、例えば超音波により行うことができる。
[0032] へパリン様作用を有する物質とは、へパリンのように血液の凝固および血栓の生成 を阻害する作用を有する一群の物質をいう。具体的には、硫酸化した植物性オリゴ 糖または多糖、例えばアルギン酸、ぺクチン、キシラン、デンプン、またはデキストラン 力 調製した多硫酸エステル、および硫酸ィ匕した動物性グリコサミノダリカン等があげ られる。 これらのへノ リン様作用を有する物質は天然物力 得る力、または半合成も しくは完全合成して調製してもよぐ合成は通常、上記の植物性または動物性多糖の 硫酸ィ匕により、例えばクロロスルホン酸と反応させ、遊離した塩酸を塩基で中和するこ とにより行う。 [0033] 本発明の製造方法において、へノ リンもしくはへノ リン様作用を有する物質または それらの塩の培養液中の濃度は、へノ リンまたはへノ リン類似物質として、好ましく は 0.00001〜5重量％、より好ましくは 0.0001〜1重量％、特に好ましくは 0.001〜0.1重量 %である。
[0034] 5.ビタミン B 12
本発明において使用されるビタミン B12としては、例えば塩酸ヒドロキソコバラミン、 酢酸ヒドロキソコバラミン、ヒドロキソコバラミン、シァノコバラミン、メチルコバラミン、ニト リトコバラミン、アデノシルコバラミン、アコココバラミンおよびそれらの塩等があげられ る。
本発明の製造方法において、ビタミン B12またはそれらの塩の培養液中の濃度は、 ビタミン B12として、好ましくは 100pmol/l〜10 μ mol/l、より好ましくは lnmol/l〜10 μ m ol/l、特に好ましくは 10nmol/l〜10 μ mol/1である。
[0035] 6.ピオチン ピオチンはビタミン B群の一種であり、ビタミン Hとも呼ばれている力 本 発明にお 、てはピオチンおよびそれらの塩が使用される。本発明の製造方法にお!ヽ て、ピオチンまたはその塩の培養液中の濃度は、ピオチンとして、好ましくは 0.001〜 10 μ g/ml、より好ましくは 0.01〜1 μ g/mlである。
[0036] 7.ポリアミン
本発明において使用されるポリアミンとしては、複数のアミノ基を持つ非蛋白性の脂 肪族ァミンがあげられ、具体的には、プトレシン、スペルミン、カダベリン、スペルミジ ン等の生体ァミンがあげられる。本発明の製造方法において、ポリアミンの培養液中 の濃度は、好ましくは 0.001〜10 μ g/ml、より好ましくは 0.01〜10 μ g/mlである。
[0037] 8.鉄含有化合物
本発明にお 、て使用される鉄含有化合物としては、鉄イオン (Π)または鉄イオン (III )を含有する化合物があげられるが、好ましくは、鉄イオン (II)を含有する化合物が使 用される。
鉄イオン（II)を含有する化合物としては、例えば、 FeCl 、 FeSO 、 FeSO -(NH ) SO
2 4 4 4 2 4
、 Fe[CH CH(OH)COO] 、 K [Fe(CN) ]、等の鉄イオン（II)を含有する無水物または水
3 2 4 6
和物があげられる。 鉄イオン (III)を含有する化合物としては、例えば、 FeCl、 Fe (SO )、 Fe (SO ) - (NH
3 2 4 3 2 4 3
) SO、 Fe(NO )、 K [Fe(CN) ]、等の鉄イオン (III)を含有する無水物または水和物が
4 2 4 3 3 3 6
あげられる。
[0038] 本発明の製造方法において、鉄含有化合物の培地中の濃度は、鉄イオン (II)また は鉄イオン（III)として、好ましくは 0.01〜10 μ mol/Uより好ましくは 0.1〜10 μ mol/1 である。
9.培地の調製
本発明の製造方法で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培 地として調製することができる。
[0039] 基礎培地としては、 BME培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 89, 362, (1965)]、 BGJb 培地 [Exp. Cell Res., 25, 41, (1961)]、 CMRL 1066培地 [N. Y. Academy of Sciences,
5, 303, (1957)]、 Glasgow MEM培地 [Virology, 16, 147, (1962)]、 Improved MEM Zi nc Option培地 [J. National Cancer Inst., 49, 1705, (1972)]、 IMDM培地 [In Vitro, 9,
6, (1970)]、 Medium 199培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1, (1950)]、 Eagle ME M培地 [Science, 130, 432, (1959)]、 Alpha MEM培地 [Nature New Biology, 230, 310 , (1971)]、 Dulbecco MEM培地 [Virology, 8, 396, (1959)]、ハム培地 [Exp. Cell Res.,
29, 515, (1963); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288, (1965)]、 RPMI 1640培地 [J.
A. M. A" 199, 519, (1967)]、 Fischer' s培地 [Methods in Med. Res., 10, (1964)]、 M cCoy' s培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,崖， 115, (1959)]、ウイリアムス E培地 [Exp. Cell Res., 69, 106, (1971); Exp. Cell Res., 89, 139, (1974)]およびこれらの混合培 地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることがで きる。
[0040] また、マ-ピュレイティング 'ザ ·マウス'ェンブリオ 'ァ'ラボラトリ一'マ-ユアル、 Met hods in Enzymology volume 225, Guide to Techniques in Mouse Development, Acad emic Press, (1993) ;胚性幹細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の胚培養のた めの培地、例えば、 M2培地、 M16培地、 Whitten培地、体外受精用培地など、胚の培 養に用いることのできる培地であればいずれも基礎培地として用いることができる。
[0041] さらに血清代替物としての各種増殖因子を添加した培地、または無蛋白培地であ つても、動物細胞ゃ胚の培養が可能なものであれば 、ずれの培地も用いることがで きる。具体的には、 KNOCKOUT™ SRを添カ卩した無血清培地 [M. D. Goldsboroughら ； Focus, 20, 8, (1998)]、インスリンおよびトランスフェリンを添カ卩した無血清培地、細 胞由来の因子を添加した培地等があげられる。
[0042] インスリンおよびトランスフェリンを添カ卩した無血清培地としては、 CHO-S-SFM II (G IBCOBRL社製）、 Hybridoma- SFM (GIBCOBRL社製）、 eRDF Dry Powdered Media ( GIBCOBRL社製）、 UltraCULTURE™(BioWhittaker社製）、 UltraDOMA™ (BioWhitt aker社製）、 UltraCHO™ (BioWhittaker社製）、 UltraMDCK™ (BioWhittaker社製）、 I TPSG培地 [S. Hosoiら； Cytotechnology, 5, S17, (1991)]、 ITSFn培地 [A. Rizzino and C. Growley; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457, (1980)]、 mN3培地 [S. Okabeら； Mech. Dev., 59, 89, (1996)]等があげられる。
[0043] 細胞由来の因子を添加した培地としては、多能性奇形癌腫細胞 PSA1の培養上清 を添カ卩した培地（G. R. Martin; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981)があげ られる。
無蛋白培地としては、 CD- CHO (GIBCOBRL社製）、 PFHM- II (GIBCOBRL社製）、 UltraDOMA- PF™ (BioWhittaker社製）等があげられる。
これら培地に、上述のビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン 様作用を有する物質またはそれらの塩を添加することで、胚性幹細胞を分化誘導す るための培地を調製することができる。例えば、 Dulbecco MEM培地に 10%の KNOC KOUT™ SR (GIBCOBRL社製）、 2mmol/lグルタミン、 50U/mlペニシリン、 50U/mlスト レプトマイシン、および 0.1mmol/l 2-メルカプトエタノール、ならびにビタミン B12また はそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物質またはそれらの塩 を添加することにより調製することができる。さらに、この培地に上述のピオチンまたは その塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ばれる 1種以上の化合物を添加する ことが好ましい。
[0044] 10.培養器
本発明で使用される培養器としては、 胚性幹細胞を培養できるものであればいか なる培養器でも用いることができる力 好ましくは細胞培養用に用いられる培養器が 好ましい。細胞培養用の培養器としては、例えば、フラスコ、細菌培養用フラスコ、細 胞培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、コンツアーデッシ ュ、ノ ーマノックスデッシュ、マノレチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエノレプレー ト、マノレチプレート、マノレチウェノレプレート、セパレートストリップゥエル、テラサキプレ ート、組織培養用チャンバースライド、シャーレ、細胞培養用シャーレ、組織培養用チ ユーブ、トレイ、細胞培養用トレイ、セルファクトリー、培養バッグ、テクノポット、ローラ 一ボトル、スピンナー、ホロ一ファイバ一等があげられる。培養器と細胞との接着性を 制御するために、培養器の細胞と接触する側の表面に人工的に処理を施すこともで きる。培養器の表面を人工的に処理する例としては、コラーゲンタイプ Iコート、コラー ゲンタイプ IVコート、ゼラチンコート、ポリ一 L-リジンコート、フイブロネクチンコート、ラ ミニンコート、プロテオグリカンコート、グリコプロテインコート、マトリゲノレコート、シリコ ンコート等があげられるが、コラーゲンタイプ〖コート、コラーゲンタイプ IVコート、ゼラチ ンコート、フイブロネクチンコート、ラミニンコートが好ましく用いられる。また、プライマ リア (Falcon社製)などのように負の電荷を持つように処理することもできる。これらの 処理を施した培養器も、本発明の製造方法に用いることができる。
[0045] 11.胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法
本発明の製造方法としては、具体的には、ビタミン B12またはそれらの塩およびへ ノ^ンもしくはへパリン様作用を有する物質またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を 非凝集状態で培養して神経細胞に分化誘導し、培養物中より神経細胞を採取する 工程を包含する。
[0046] 本発明の製造方法にお!、ては、ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性 細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性 (以下、「SDIA活性」と略記する。 )を有する蛋白性因子等の特定の蛋白性因子を使用することなぐ胚性幹細胞を神 経細胞へ分ィ匕誘導させることができる。 SDIA活性を有する蛋白性因子等の特定の蛋 白性因子としては、 Secreted frizzled- related protein (以下、「SFRP」と略記する。 ) 1、 SFRP1を構成する 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたポリペプチドで胚 性幹細胞を外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞に分化誘導する活性を有するもの 等があげられる（WO03/42384)。 [0047] 胚性幹細胞を非凝集状態で培養するとは、細胞同士の接着を解除した単一細胞 状態 (single cell)で培養を開始し、継続して培養することである。また、単一細胞状態 とは、酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞がバラバラになつ た状態をいう。
[0048] 本発明の製造方法における培養では、播種した細胞が凝集せず、ェンブリオィドボ ディを形成しない。このような単一細胞状態で胚性幹細胞の培養を開始し、それを継 続して培養するには、胚性幹細胞の培養にお！ヽて通常の胚性幹細胞の継代に用い られる細胞密度よりも低 ヽ細胞密度で播種し培養することが好まし ヽ。具体的には、 酵素消化等の処理を胚性幹細胞に施し、培地を用いて単一細胞状態の細胞懸濁液 を調製し、その細胞懸濁液を、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在でき る程度に培養する。このような培養は、細胞を積極的に凝集させ疑似胚状態を再現 することで分ィ匕誘導を引き起こそうとするェンブリオボディを用いた培養方法とは異な る。ここで、培養系にお互いの細胞が接触しない状態で存在できる程度の播種用胚 性幹細胞の細胞密度としては、好ましくは数十〜数千細胞 Zcm2であり、より好ましく は 30〜300細胞 Zcm2である。
[0049] 単一細胞状態とした胚性幹細胞を得る方法としては、組織細胞培養で用いられる、 公知の酵素消化の方法が挙げられる。具体的には、前日培地交換を行い、数十％ 〜ほぼコンフルェント状態にまで増殖した胚性幹細胞を培養している培養皿力 培 地を除いた後、リン酸緩衝ィ匕生理食塩水（以下「PBS」という。）を用いて数回、好まし くは 2〜3回洗浄する。洗浄後、胚性幹細胞の入った培養皿に適当な酵素消化液（ 例えば、 lmmol/1 EDTAおよび 0.25%トリプシンを含む PBS)をカ卩え、 37°Cで数十分間、 好ましくは 5〜20分間培養する。酵素反応後、胚性幹細胞の分化誘導に用いる培地 に懸濁し、遠心分離 (例えば、 4°C、 200 X gで 5分間）を行ない、得られる細胞を再び 培地に懸濁することで単一細胞状態とした胚性幹細胞を回収することができる。
[0050] 単一細胞状態に調製された胚性幹細胞は、上記 9に記載の培地および上記 10に 記載の培養器を用い、胚性幹細胞の分化誘導に適した培養法、具体的には、単層 培養法、マイクロキャリア培養法、還流培養法、軟寒天培養法等で神経細胞に分ィ匕 誘導させることができる。胚性幹細胞を神経細胞に分ィ匕誘導するには、上述の工程 を含む製造方法で適宜培地交換を行いながら培養を継続することで行うことが好まし い。
[0051] 本発明の製造方法により、胚性幹細胞は神経細胞に分化誘導され、本発明の製造 方法に供した胚性幹細胞の 5%以上、好ましくは 15%以上、より好ましくは 40%以上を神 経細胞へ分化誘導させることができる。
12.本発明の製造方法で製造された神経細胞の利用
本発明の製造方法で製造された神経細胞は、例えば神経細胞の細胞障害に基づ く疾患の治療に用いることができる。
[0052] 神経細胞の障害に基づく疾患としては、例えばアルツハイマー病、ハンチントン舞 踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、脊椎損傷、運動神経疾 患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、ダウン症候群、多発性硬化症、 筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患等があげられる。
細胞障害に基づく疾患の治療には、移植医療に利用可能な、障害を受けた細胞の 機能と同じ機能を有する細胞、障害を受けた細胞の前駆細胞、障害を受けた細胞の 機能を代償する細胞、障害を受けた細胞の再生を促進する機能を有する細胞等が 用いられる。
[0053] 移植医療の目的に用いるためには、本発明の製造方法により製造された神経細胞 を精製して使用することが好ましい。
細胞の精製方法は、公知の細胞分離精製の方法であれば 、ずれも用いることがで きるが、具体的には、アンチボディィズ [Antibodies, A Laboratory manual, Cold Sprin g Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)]、モノクローナルアンチボディィズ [Monoclo nal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)]、 7ンチボ ディイエンジ-ァリング [Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at O xford University Press (1996)]、 Int. Immunol, 10, 275, (1998)、 Exp. HematoL, 25, 9 72, (1997)等に述べられているフローサイトメーターを用いた方法、モノクローナルァ ンチボディィズ、アンチボディィエンジニアリング、 J. Immunol, 141, 2797, (1988)等 に述べられているバニング法、組織培養の技術 (第三版) ,朝倉書店（1996)等に記載 のショ糖濃度の密度差を利用した細胞分画法等をあげることができる。 [0054] 本発明により製造される神経細胞の純度を高める方法としては、上述のように、ビタ ミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物質または それらの塩を用いて胚性幹細胞を非凝集状態で培養した後、抗癌剤を含む培地中 で培養する工程があげられる。これにより、未分ィ匕な状態の細胞を除去することがで き、より純度の高い神経細胞を得ることができる。即ち、抗癌剤で処理することにより、 目的とする神経細胞以外の細胞、例えば未分ィ匕な細胞を除去することができる。
[0055] 本発明により製造される神経細胞の純度を高める方法にお!、て用いられる抗癌剤 としては、マイトマイシン C、 5—フルォロウラシル、アドリアマイシン、ァラ Cまたはメトト レキセートなどがあげられる。これら抗癌剤は、分化誘導した神経細胞よりも未分化な 状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。例えば、これら抗 癌剤を生体に用いる場合の日本薬局方記載の濃度の 100分の 1〜1倍の濃度が好ま しい。
[0056] 胚性幹細胞を分化誘導して得られた神経細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する 工程とは、具体的には、前日に培地交換を行った培養系に、適切な濃度の抗癌剤、 例えば、 1〜100 μ g/ml、好ましくは 10 μ g/mlのマイトマイシン Cを添カ卩し、 5%の二酸 化炭素を通気した COインキュベーターで、 37°Cで数時間、好ましくは 2〜3時間培養
2
する方法があげられる。
[0057] ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であ ればいかなるものも用いることができる。具体的には、上記 9に記載の培地等をあげ ることがでさる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが 、上記 2 (2)に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞または上記 2 (3)に記載 の染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることにより、組織適合性抗原の 違 ヽによる拒絶を回避することができる。
[0058] また、上記 2 (3)に記載の体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を分ィ匕誘導すること で、体細胞を提供した個人の神経細胞を得ることができる。このような個人の細胞は、 その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個人に有功か 否かを判断する診断材料としても有用である。さら〖こ、分化誘導した細胞を長期に培 養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由 来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個人のリス クを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高!、と診断される疾患 の効果的な予防法を提供するために有用である。
[0059] 移植の方法としては、対象となる疾患に適した方法であれば!/、ずれの方法も用いる ことができ、疾患ごとにそれぞれの疾患に適した公知の方法が知られている。例えば 、疾患患者の体細胞力 上記 2 (2)または（3)の胚性幹細胞を作製し、該胚性幹細 胞から神経細胞に分化誘導させたのちに、患者の疾患部位に移植することにより疾 患を治療できる。具体的には、パーキンソン病患者に対して神経細胞を移植する方 法として、 Nature Neuroscience 2, 1137, (1999)等に記載の方法があげられる。
[0060] 以下に、本発明の実施例を示す。
実施例 1
[0061] へノ^ンとビタミン B12による ES細朐力ら神経細胞への分化誘導（1)
以下の実施例において、胚性幹細胞としては、 ES細胞 EB5 [Nature Genet., 24, 37 2, (2000)]を使用した。
EB5は、 0.1%のゼラチンでコートしたディッシュに播種し、 1%ゥシ胎児血清 (JRH Bios ciences社製)、 10% Knockout berum Replacement (Invitrogen社 )、 lmmol/1ピノレビ ン酸 (Sigma社製)、 0.1 mmol/1非必須アミノ酸 (Invitrogen社製)、 0.1 mmol/1 2-メルカ プトエタノール (ナカライテスタ社製)、 20 mg/ml blasticidin (Invivogen社製)、および 2 X 103U/ml ESGRO (Chemicon社製)を含む G- MEM (Invitrogen) (以下、「維持培地」 という。）を用いて、 5%の二酸化炭素を通気した COインキュベータ中、 37°Cで、未分
2
化状態を維持しながら継代培養した。
[0062] EB5を分化誘導する際には、 0.1%のゼラチンでコートした 24ゥエルプレートに 2.5 X 1 03個の EB5を播種し、維持培地から血清、 blasticidin,および ESGROを除いた培地 (以 下、「分ィ匕誘導培地」という。）を各ゥエルに 1 mlずつ添加し、 37°Cで 2時間インキュべ ートして細胞を接着させた。その後、種々の濃度のへノ リン (Sigma社製)またはビタミ ン B12 (cyanocobalamin、ナカライテスタ社製）を含む PBS (以下「試験溶液 1」という。 ) を 500 1添加して、 37°Cで 14日間、培地を交換せずにインキュベートした。各実験条 件は 2連で実施した。なお、以下、へノ《リンおよびビタミン B12の濃度は、試験溶液 1 における濃度を意味する。
[0063] 試験溶液 1の添加後 14日目において、光学顕微鏡を用いて直径 50 μ m以上のコロ ニーをカウントして総コロニー数を求めた。また、該コロニーのうち神経突起が観察さ れたコロニーを神経細胞コロニーとし、神経細胞誘導率を以下の式により算出した。 神経細胞誘導率（％) =神経細胞コロニー数 /総コロニー数 X 100 その結果、ビタミン B12を添カ卩した場合における総コロニー数は、ビタミン B12の濃度 によらず、へパリンの 0%添加条件と 0.01%添加条件とで差は見られなかった（図 1)。一 方、ビタミン B12を添カ卩しても、へパリンの 0%添加条件では神経細胞コロニーがほとん ど全く誘導されず、へパリンの 0.01%添加条件ではビタミン B12の濃度に依存して神経 細胞が誘導されることが明らかとなった（図 2)。
[0064] また、ビタミン B12を添加していない場合は、へノ リン濃度によらず神経細胞はほと んど全く誘導されなかった（図 3)。
以上の結果から、へノ^ンとビタミン B12を組み合わせることより、胚性幹細胞が神 経細胞へ分化誘導されることが明らかとなった。
実施例 2
[0065] へパリンとビタミン B12による ES細朐力ら神経細胞への分化誘導（2)
上記実施例 1において、試験溶液 1に代えて、 0.01%のへパリンおよび lOOnmol/1の ビタミン B12を含む PBS (以下「試験溶液 2」という。）、試験溶液 2に 0.1 μ g/mlのピオ チン [(+)-ピオチン、和光純薬社製]を含む試験溶液 3、試験溶液 2に 0.42 g/mlの K [Fe(CN) ] (ナカライテスタ製）を含む試験溶液 4、試験溶液 2に 0.081 μ g/mlのプト
4 6
レシン（Sigma社製）を含む試験溶液 5、試験溶液 2に 0.1 g/mlのピオチン、 0.42 μ g/mlの K [Fe(CN) ]および 0.081 μ g/mlのプトレシンを含む試験溶液 6、 0.01%のへパ
4 6
リン、 0.1 mg/mlのビォチン、 0.42 g/mlの K [Fe(CN) ]および 0.081 g/mlのプトレ
4 6
シンを含む試験溶液 7を使用する以外は実施例 1と同様にして、神経細胞分化誘導 率を調べた。
[0066] その結果、試験溶液 2の添加条件 (カラム 1)と比較して、試験溶液 3の添加条件 (力 ラム 2)、試験溶液 4の添加条件 (カラム 3)、試験溶液 5の添加条件 (カラム 4)、試験 溶液 6の添加条件 (カラム 5)の ヽずれにぉ ヽても神経細胞分化誘導率が上昇し、特 に、試験溶液 6の添加条件において神経細胞分ィ匕誘導率が最も上昇した（図 4)。な お、試験溶液 7の添加条件 (カラム 6)では神経細胞は誘導されな力つた（図 4)。
[0067] 以上の結果から、ピオチン、プトレシン、または鉄含有ィ匕合物の添カ卩により、へパリ ンとビタミン B12の組み合わせによる胚性幹細胞から神経細胞への分ィ匕誘導作用が 増強されることが明らかとなった。
また、分化誘導された神経細胞の性質を調べるため、神経組織マーカーである NC AM (neural cell adhesion molecule),成熟神経細胞マーカーであるクラス III βチュー ブリン、およびカテコールアミン作動性神経細胞マーカーであるチロシン水酸ィ匕酵素 (ΤΗ)に対する各種抗体による神経細胞コロニーの免疫染色を以下のようにして行つ た。
[0068] 神経細胞への分化誘導後、 24ゥエルプレートから培地を除去し、 1 mlの PBSで各ゥ エルの細胞を 1回洗浄した後、 4% (w/v)パラホルムアルデヒドを含む PBS 0.25 mlで室 温、 15分間処理した。その後、 0.5 mlの PBSで 2回洗浄後、メタノール 0.25 mlを添カロ し、— 20°Cで 15分間処理した。さらに、細胞を 0.5 mlの PBSで 2回洗浄後、 2% ( w/v)ス キムミルク (Difco社製)を含む PBSを 0.25 ml添カ卩し、室温で 2時間ブロッキングした。一 次抗体として、ゥサギ由来抗 NCAM抗体 (Chemicon社製)については 1/400、マウス由 来抗 jS III-tubulin抗体 (Tujl、 Covance社製)については 1/400、ゥサギ由来抗 TH抗 体 (Chemicon社製)につ!/、ては 1/200の倍率で 2% (w/v)スキムミルクを含む PBSを用い て希釈し、 4°Cでー晚インキュベートした。一次抗体反応後、 0.05% (w/v) Tween 20を 含む PBS 0.25 mlで 3回洗浄し、二次抗体として抗マウス IgG- HRP (DAKO社製、希釈 倍率 1/100)または抗ゥサギ IgG-HRP (DAKO社製、 1/100)を用いて室温で 1時間反 応させた。 0.05% (w/v) Tween 20を含む PBS 0.25 mlで 3回洗浄し、 TrueBlue (KPL社 製)を用いて発色させた。
[0069] その結果、いずれの神経細胞コロニーも、 NCAM、 β III- tubulin、および THに関し て陽性であったことから、カテコールアミン作動性神経細胞が誘導されたことが明らか となった。
実施例 3 [0070] へノ^ンとビタミン B12による ES細朐力ら神経細胞への分化誘導（3)
上記実施例 1において、 0.1%のゼラチンでコートした 24ゥエルプレートの代りに 0.005 %のポリ- L-オノレニチン（SIGMA社製）および 50 μ g/mlのフイブロネクチン（Invitrogen 社製）でコートした 8ゥエルプレートを用い、試験溶液 1に代えて、 PBS、 0.01%のへパリ ンおよび 10nmol/lのビタミン B12を含む PBS (以下「試験溶液 8」という。）、 0.01%のへ ノ《リンおよび lOOOnmol/1のビタミン B12を含む PBS (以下「試験溶液 9」という。）、 0.01% のへパリン、 10nmol/lのビタミン B12、 0.3 μ g/mlのビォチン、 3 μ mol/1の K [Fe(CN) ] (
4 6 ナカライテスタ社製)および 1.6 μ g/mlのプトレシンを含む PBS (以下「試験溶液 10」と いう。）を使用する以外は実施例 1と同様にして、 EB5を分化誘導した。
[0071] 分化誘導開始より 14日後の細胞から SV Total RNA Isolation System (Promega社 製)を用いて、トータル RNAを回収した。回収したトータル RNAから SuperScriptTM II R Nase H Reverse Transcriptase (Invitrogen社^)と oligo(dT) primer (Invitrogen千土
12-18
製)を用いて cDNAを調製した。中脳のドーパミン作動性神経細胞のマーカーである N urrl遺伝子の転写産物の検出には、配列番号 1および配列番号 2で表される塩基配 列を有する DNAをプライマーとして用い、また TH遺伝子の転写産物の検出には、配 列番号 3および配列番号 4で表される塩基配列を有する DNAをプライマーとして用い た。また、コントロールとして、グリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) 遺伝子の転写産物の検出には配列番号 5および配列番号 6で表される塩基配列を 有する DNAをプライマーとして用いた。 PCR反応は GeneAmp PCR system 9700Ex (ァ プライドバイオシステムズ社製）を使用し、 Ex Taq (Takara社製)を用いていずれも 94 °Cで 30秒間、 60°Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間の反応を 30サイクル行った。反応液をァ ガロースゲル電気泳動法およびェチジゥムブロマイド染色法により解析した。
[0072] その結果、試験溶液 8、 9、 10の添加条件ではいずれも、 Nurrlおよび TH遺伝子が 検出されたことから、ドーノ ミン作動性神経細胞が誘導されたことが明らかとなった。 なお、 PBS添加条件では Nurrlおよび TH遺伝子は検出されなかった。
また、本実験条件で分化誘導した神経細胞のドーパミン産生量を測定するため、該 細胞を以下の実験に供した。
[0073] 誘導開始より 14日後の細胞を PBSで 3回洗浄し、 G-MEM培地 (Invitrogen社製)をカロ え 37°Cで 24時間インキュベートした。上清を回収し、終濃度 0.1 mmo/1の EDTAおよび 終濃度 0.1 mol/1の過塩素酸を添加した。 4°C、 15000 rpmで 15分間遠心分離し、上清 を 0.22 mmのフィルター (Millipore社製、 SLGV013NL)を通し、測定試料を調製した。 T SK-GEL SUPERODS (Tosoh社製）カラムを用い、カラムオーブン設定温度 40°Cで、 5 mmol/1オクタンスルホン酸ナトリウムおよび 0.1 mmol/1 EDTA' 2Naを添カ卩した 100 mm 。1/1クェン酸緩衝液:メタノール (97:3)溶液を溶離液として、流速 1.2 ml/分で測定試料 を解析した。検出は電気化学検出器 (Tosoh社製、 EC8020)を使用した。標準試料と して市販のドーパミン (ナカライテスタ社製、 Cat. 14212-71)を同様に分析し、各試料 を分析して得られるピーク面積比力 ドーパミンを定量した。
[0074] その結果、試験溶液 8 (カラム 2)、 9 (カラム 3)、 10 (カラム 4)の添加条件では ヽず れも、ドーパミンが検出されたことから、ドーパミン作動性神経細胞が誘導されたこと が明ら力となった（図 5)。なお、 PBS添加条件 (カラム 1)ではドーパミンは検出されな かった（図 5)。
産業上の利用可能性
[0075] 本発明により、胚性幹細胞の分化誘導による神経細胞の製造方法、胚性幹細胞を 神経細胞に分化誘導する方法、当該製造方法もしくは分化誘導方法に使用される 培地、または胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高める方法が提供 される。
配列表フリ' —テキスト
[0076] 配列番号 1 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 2 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 3 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 4 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 5 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 6 -人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
[I] ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物質 またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養して神経細胞に分化誘 導し、該培養物より神経細胞を採取する工程を含む、神経細胞の製造方法。
[2] 神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である請求項 1に記載の製造方法。
[3] カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である請求項 2に記 載の製造方法。
[4] 無血清培地中で分化誘導することを特徴とする請求項 1〜3のいずれか 1項に記載 の製造方法。
[5] ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に 分化誘導する活性を利用しないで分化誘導することを特徴とする、請求項 4に記載 の製造方法。
[6] 無血清培地が、ピオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ば れる 1種以上の化合物を含有する無血清培地である、請求項 4または 5に記載の製 造方法。
[7] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の製造方法に使用される、胚性幹細胞を神経 細胞に分化誘導する活性を有する培地。
[8] ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物質 またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養する工程を含む、胚性幹 細胞を神経細胞に分化誘導する方法。
[9] 神経細胞がカテコールアミン作動性神経細胞である請求項 8に記載の方法。
[10] カテコールアミン作動性神経細胞がドーパミン作動性神経細胞である請求項 9に記 載の方法。
[II] 無血清培地中で分ィ匕誘導することを特徴とする請求項 8〜10のいずれか 1項に記 載の方法。
[12] ストローマ細胞が有する、胚性幹細胞を外胚葉性細胞または外胚葉由来の細胞に 分化誘導する活性を利用しな ヽで分化誘導することを特徴とする、請求項 11に記載 の方法。
[13] 無血清培地が、ピオチンまたはその塩、ポリアミン、および鉄含有化合物から選ば れる 1種以上の化合物を含有する無血清培地である、請求項 11または 12に記載の 方法。
[14] 請求項 8〜 13のいずれか 1項に記載の方法に使用される、胚性幹細胞を神経細胞 に分化誘導する活性を有する培地。
[15] ビタミン B12またはそれらの塩およびへパリンもしくはへパリン様作用を有する物質 またはそれらの塩を用い、胚性幹細胞を非凝集状態で培養した後、抗癌剤を含む培 地中で培養する工程を含む、胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞の純度を高 める方法。
[16] 抗癌剤が、マイトマイシン C、 5-フルォロウラシル、アドリアマイシン、ァラ Cおよびメト トレキセートからなる群より選ばれる抗癌剤である、請求項 15に記載の方法。
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