WO2005118631A1 - 新規タンパク質複合体およびその用途 - Google Patents

新規タンパク質複合体およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2005118631A1
WO2005118631A1 PCT/JP2005/010538 JP2005010538W WO2005118631A1 WO 2005118631 A1 WO2005118631 A1 WO 2005118631A1 JP 2005010538 W JP2005010538 W JP 2005010538W WO 2005118631 A1 WO2005118631 A1 WO 2005118631A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
protein
salt
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/010538
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eiji Sunahara
Takafumi Ishii
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to AT05748510T priority Critical patent/ATE465175T1/de
Priority to JP2006514156A priority patent/JPWO2005118631A1/ja
Priority to US11/628,410 priority patent/US20090087423A1/en
Priority to DE602005020786T priority patent/DE602005020786D1/de
Priority to EP05748510A priority patent/EP1760087B1/en
Publication of WO2005118631A1 publication Critical patent/WO2005118631A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to novel binding proteins and the like. More specifically, a complex of SemaphoriMB, Semaphorin4B-ML Semapliorin4B-M2 or SemaphoriMB-M3, and a protein capable of binding to the protein, an antibody against the complex, an antibody inhibiting or promoting the formation of the complex, An antibody that promotes or inhibits dissociation of the complex; a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the formation of the complex; a compound or a salt thereof that promotes or inhibits dissociation of the complex; The present invention relates to a compound or a salt thereof, a prophylactic / therapeutic agent for cancer or a neurodegenerative disease, a diagnostic agent, etc. Background art
  • SEMA4B Gene Semaphorin4B (WO 00/012708, WO 00/078961) (hereinafter sometimes abbreviated as SEMA4B), SEMA4B-Ml, SEMA4B-M2 or SEMA4B-M3 (hereinafter, these three types of genes are collectively referred to as SEMA4B-Ms) encodes a single transmembrane protein expressed on the plasma membrane of cancer cells and is highly expressed in human cancer tissues such as lung, ovarian and knee cancers. Since these antisense oligonucleotides induce apoptosis in cancer cells, SEMA4B and SEMA4B-Ms may be involved in the survival of cancer cells through suppression of apoptosis. It has been reported (W02004 / 058817).
  • SEMA4B has been reported as one of the genes whose expression increases under hypoxic conditions (TO 02/46465). It has been reported that hundreds of nucleotide sequences including SEMA4B and the like based on gene chip analysis can be used for diagnosing lung cancer or searching for compounds for treating lung cancer (W002 / 86443). It has been reported that N0V7, which has 93% homology at the amino acid level with SEMA4B, is upregulated in cancer (W002 / 06329).
  • Human Discs large homolog 1 (DLG1, GenBank marauder—004087 ⁇ 1) is a B lymphoblast cell It is a gene cloned from a derived library and is a human homolog of the tumor suppressor gene dig in Drosophila (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9818-9822, 1994).
  • the human Discs large homolog 3 (DLG3, GenBank NM_021120.1) is a gene cloned from a fetal cerebral library and, like DLG1, is a human homolog of the tumor suppressor gene dig in Drosophila (Oncogene 14, 2425-2433, 1997).
  • DLG1 and DLG3 are involved in cell proliferation by binding to T0PK (PBK), a serine Z-threonine kinase that is activated during mitosis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5167-5172, 2000). Disclosure of the invention x
  • Targets a protein complex that is specifically expressed in cancer cells and nerve cells, and is a safe cancer prevention and treatment agent that induces cancer cell growth inhibition, and a safe and superior nerve that suppresses nerve cell death. Prevention and treatment of degenerative diseases.
  • SEMA4B or SEMA4B-Ms By modulating anti-apoptotic signals mediated by SEMA4B or SEMA4B-Ms, kill cancer cells and induce antitumor effects, or suppress neuronal cell death to prevent and treat neurodegenerative diseases
  • SEMA4B or SEMA4B-Ms intracellular binding proteins or intracellular signaling pathways at this time.
  • DLG1 and DLG3 which are suggested to function as tumor suppressor genes, are considered to be SEMA4B or SEMA4B-Ms.
  • the binding to the intracellular region is determined by the yeast two-hybrid method (Trends in Genet. 10, 286-292, 1994; Annu. Rev. Genet.
  • the present invention provides:
  • a partial peptide of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is the first peptide of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • the conjugate according to the above (1), which is a peptide having an amino acid sequence of the 3rd to 3rd amino acids (1e)
  • a partial peptide of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is represented by the 81st to 353rd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • the protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (1).
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to any of (3) to (7) above,
  • a partial peptide of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is represented by the 81st to 353rd amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • the partial peptide of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 ( 16) Screening method described Law,
  • a compound comprising: (a) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof or a salt thereof; A compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or (and) SEQ ID NO: 29, or a compound which inhibits binding to a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • (17c) a compound comprising (a) a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; No. 27 or (and) a compound having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, or a compound which promotes binding to a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • a medicament comprising the compound of the above (17b) or a salt thereof, (17e) a medicament comprising the compound according to (17c) or a salt thereof, (17f) a cancer cell apoptosis promoter, a cancer cell growth inhibitor or a cancer prevention-treatment agent.
  • the medicine according to (17e) which is an inhibitor of neuronal apoptosis or an agent for preventing or treating a neurodegenerative disease,
  • a cancer cell apoptosis promoter, a cancer cell growth inhibitor or a cancer prevention / treatment agent comprising the compound or salt thereof according to (18) above,
  • An apoptosis inhibitor for neurons or a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases comprising the compound according to (20) or a salt thereof,
  • An apoptosis-promoting agent for cancer cells, a cancer cell growth inhibitor or a cancer prevention / treatment agent comprising the compound or salt thereof according to (24) above,
  • (26) (a) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a salt thereof; and (b) SEQ ID NO: 27 or (And) a compound that inhibits the dissociation of a complex containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 or a complex containing a partial peptide or a salt thereof, or a compound thereof salt, .
  • An apoptosis inhibitor for neurons or a prophylactic / therapeutic agent for neurodegenerative diseases comprising the compound according to (26) or a salt thereof,
  • (31) (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; and (b) SEQ ID NO: 27 or It promotes the dissociation of a complex containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, or a complex containing a partial peptide or a salt thereof.
  • Apoptosis-promoting method for cancer cells or a method for inhibiting the growth of cancer cells
  • (33) (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a partial peptide thereof, or a salt thereof; and (b) SEQ ID NO: 27 or It inhibits the dissociation of a complex containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 or a complex containing the partial peptide or a salt thereof.
  • a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 for producing a prophylactic or therapeutic agent for cancer;
  • B a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • Use of substances that inhibit binding eg, compounds or their salts, antibodies);
  • (37) (a) an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 for producing a neuronal apoptosis inhibitor or a prophylactic / therapeutic agent for degenerative degenerative disease; (B) contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29; Use of substances that promote binding to proteins or their partial peptides or their salts (eg, compounds or their salts, antibodies);
  • a substance eg, compound or salt thereof
  • a complex containing the salt thereof or (b) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, or a partial peptide thereof, or a salt thereof Use of substances that promote body dissociation (eg, compounds or their salts, antibodies);
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter, DLG1 Protein or DLG3 protein) is immobilized on a solid phase (eg, EIA plate) using an antibody against the DLG1 protein or DLG3 protein, or the DLG1 protein or DLG3 protein is tagged with a Tag protein (eg, His -Tag, GST (Daltathione-S-transferase) etc.), then immobilized on a solid phase, and then (i) labeled with a labeling agent (eg, biotin, etc.).
  • a labeling agent eg, biotin, etc.
  • SEMA4B protein A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence or its partial peptide or a salt thereof (hereinafter, SEMA4B protein) (eg, The amount of binding when a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26) is brought into contact with the immobilized DLG1 or DLG3 protein; ii) The amount of SEMA4B protein and test compound labeled with a labeling agent (eg, biotin) and the test compound were simultaneously contacted with the immobilized DLG1 protein or DLG3 protein, and the amount was measured. In the case of (ii), the binding amount is about 20% or less compared to the case of (i) above.
  • SEMA4B protein an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence or its partial peptide or a salt thereof
  • a test compound that reduces the above, preferably 30% or more, and more preferably about 50% or more, as a compound that inhibits the binding between SEMA4B protein and DLG1 protein or DLG3 protein, has the activity in the case of (ii) above.
  • the screening method according to the above (16) which is selected as a compound that promotes
  • a partial peptide having a binding activity to SEMA4B protein is preferably used (eg, represented by SEQ ID NO: 27 A peptide having an amino acid sequence of amino acids 142 to 310 in the amino acid sequence, a peptide having an amino acid sequence of amino acids 81 to 353 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, etc.
  • SEQ ID NO: 27 A peptide having an amino acid sequence of amino acids 142 to 310 in the amino acid sequence, a peptide having an amino acid sequence of amino acids 81 to 353 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, etc.
  • nickel is used for His-Tag
  • daltathione is used for GST.
  • SEMA4B protein a protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 labeled with a labeling agent (eg, biotin) Or a salt thereof (hereinafter referred to as SEMA4B protein) (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26)) and a solid phase labeled with avidin (E.g., a plate).
  • a labeling agent eg, biotin
  • SEMA4B protein eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26)
  • avidin E.g., a plate
  • a test compound that increases by at least 50%, more preferably at least about 50% is selected as a compound that promotes the binding between SEMA4B protein and DLG1 protein or DLG3 protein.
  • a partial peptide of the DLG1 or DLG3 protein is used as the DLG1 protein or DLG3 protein, a partial peptide having a binding activity to SEMA4B protein (eg, an amino acid represented by SEQ ID NO: 27)
  • SEMA4B protein eg, an amino acid represented by SEQ ID NO: 27
  • SEMA4B protein a partial peptide thereof or a salt thereof
  • SEMA4B protein eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc.)
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, a partial peptide thereof, or a salt thereof hereinafter, DLG1 protein) Or DLG3 protein
  • the binding amount in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more as compared with the case (i), More preferably, a test compound that reduces about 50% or more is a compound that inhibits the binding between the SEMA4B protein and the DLG1 protein or the DLG3 protein, and the activity in the case (ii) is higher than that in the case (i). , A test compound that increases about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, is selected as a compound that promotes the binding between SEMA4B protein and DLG1 protein or DLG3 protein.
  • the DLG1 protein or DLG3 protein may be a protein fused with a Tag protein, in which case, the DLG1 protein or DLG3 protein may be detected and quantified with an antibody against the protein, For Tag protein May be detected and quantified using antibodies that
  • SEMA4B protein Partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26) and a chimeric protein obtained by fusing a repo overnight-gene binding domain And a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • DLG1 protein or DLG3 protein fused with a reporter gene transcription activation domain fused to a DNA encoding a chimeric protein (eg, Saccharomyces cerevi siae, more preferably S.
  • the yeast strain expresses the phenotype of the histidine synthesis gene HI S3, and the yeast strain is cultured for a certain period of time in the presence of the test compound to reduce the yeast strain's / 3-galactosidase activity or to reduce the yeast strain.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter, DLG1 Protein or DLG3 protein) is immobilized on a solid phase (eg, EIA plate) using an antibody against the DLG1 protein or DLG3 protein, or the DLG1 protein or DLG3 protein is
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter, SEMA4B protein) (eg, a portion corresponding to a cytoplasmic domain)
  • SEMA4B protein a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof
  • SEMA4B protein eg, a portion corresponding to a cytoplasmic domain
  • a peptide eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26
  • is immobilized on a DLG1 protein The amount of binding when contacting protein or DLG3 protein, and (ii) Simultaneously contacting SEMA4B protein and test compound labeled with a labeling agent (eg, biotin) and the immobilized DLG1 protein or DLG3 protein
  • the binding amount in the case (ii) is measured and compared,
  • a partial peptide having binding activity to SEMA4B protein is preferably used (eg, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27).
  • SEMA4B protein a partial peptide or a salt thereof (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26)) was labeled with avidin Immobilized on a solid phase (eg, a plate), and then (i) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29; Alternatively, the amount of binding when a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, DLG1 protein or DLG3 protein) is brought into contact with the immobilized SEMA4B protein, and (ii) the amount of DLG1 protein or D The amount of binding when the LG3 protein and the test compound are simultaneously contacted
  • DLG1 protein or DLG3 protein a partial peptide or a salt thereof
  • the activity in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably The screening method according to the above (22), wherein a test compound that increases about 50% or more is selected as a compound that inhibits dissociation of a complex between the SEMA4B protein and the DLG1 protein or the DLG3 protein (wherein When a partial peptide of the protein is used as the DLG1 protein or DLG3 protein, a partial peptide having a binding activity to SEMA4B protein (eg, SEQ ID NO: A peptide having the amino acid sequence of the 14th to 31st amino acids of the amino acid sequence represented by 27; the 8th to 35th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29; Such as a peptide having an amino acid sequence).
  • SEMA4B A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, SEMA4B) Protein) (eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26)), SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 2
  • DLG1 protein or DLG3 protein The amount of binding when a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter, DLG1 protein or DLG3 protein) containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 9 is contacted; ii) measuring the binding amount when the DLG1 protein or DLG3 protein and the test compound are simultaneously contacted with the immobilized SEMA4B protein, In comparison, the test compound that reduces the amount of binding in the case of (ii) above by about 20% or more,
  • the DLG1 protein or DLG3 protein may be a protein fused with a Tag protein, and in that case, the DLG1 protein or DLG3 protein may be detected and quantified with an antibody against the protein. , Or may be detected and quantified with an antibody against the Tag protein),
  • D encoding a chimeric protein obtained by fusing a reporter-gene binding domain to a partial peptide (eg, a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26) corresponding to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein NA, and (b) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, or a partial peptide thereof or a salt thereof (Hereinafter referred to as DLG1 protein or DLG3 protein) and a DNA encoding a chimeric protein obtained by fusing a reporter gene transcription activation domain to an enzyme (eg, Saccharomyces cerevisiae, more preferably S.
  • an enzyme eg, Saccharomyces cerevisiae, more preferably S.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 may be referred to as SEMA4B protein.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is referred to as DLG1 protein.
  • An amino acid sequence containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 The protein is called DLG3 protein.
  • the SEMA4B protein, DLG1 protein and]) LG3 protein may be collectively referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention.
  • the protein of the present invention can be used for cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, pigs, sheep, sheep, monkeys, etc.) (eg, liver cells, spleen cells, nerve cells) , Glial cells, knee i3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells ( Examples: macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), erythrocytes, megakaryocytes, synovial cells, chond
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide notation.
  • Proteins of the present invention C-terminal, carboxyl group (-C00H), carboxylate (-C00-), amide (- hide 2) or an ester (- C00R) may be either.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl
  • alkyl groups such as n- butyl, for example, C 3, such as cyclohexyl cyclopentyl, cyclohexylene - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, alpha - C 6, such as naphthyl - 12
  • Ariru group e.g., benzyl, phenylene Lou CM ⁇ such phenethyl C 7 such as flying one Nafuchiru C
  • Bok 2 alkyl group such as alkyl group or ⁇ - naphthylmethyl - 14
  • Ararukiru groups such as pivaloyl Ruo carboxymethyl group is used.
  • the protein of the present invention has a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the amino acid residue at the ⁇ -terminal is protected by a protecting group (eg, an acyl group of an alkanol such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group eg, an acyl group of an alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substitution on the side chain of amino acid in the molecule for example, OH, _SH, amino group, imidazole) Group, indole group, guanidino group, etc.
  • a suitable protecting group for example, CHJ-acyl group such as alkanol group such as formyl group, acetyl group, etc.
  • Complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
  • SEMA4B protein examples include a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10. Are used.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is at least 95%, preferably at least about 98%, preferably at least about 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1
  • a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes, for example, an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 4 And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Can be
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, 'a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 7; And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 includes amino acid having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 And the like.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferable.
  • Substantially homogenous indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. It is preferable that the above activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • SEMA4B protein examples include (i) one or two of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 An amino acid sequence in which the above (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) amino acids have been deleted, (Ii) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 (for example, about 1 to 100, preferably 1 to 3 An amino acid sequence to which about 0, preferably about 1 to 10, and more preferably (1 to 5) amino acids have been added; (iii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 contains 1 or more (eg, about 1 to 10 °, preferably about 0.1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10 (Iv) SEQ ID NO: 1, SEQ ID
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • SEMA4B protein examples include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and an amino acid represented by SEQ ID NO: 7 And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the partial peptide of the SEMA4B protein may be any of the aforementioned partial peptides of the SEMMB protein, preferably those having the same properties as the SEMA4B protein.
  • a peptide having a sequence is used.
  • a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc. can give. .
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29 and about 7 amino acids.
  • the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29 is represented by, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29
  • a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 or having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 is preferable. .
  • Substantially homogenous indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) homogeneous. It is preferable that the above activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the DLG1 protein include: (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30; An amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids have been deleted, more preferably about 1 to 5 amino acids, and (ii) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 (for example, An amino acid sequence to which about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about (1 to 5) amino acids have been added; (iii) One or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 27 (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10) (1-5) amino acid sequence having the amino acid inserted therein; (iv) 1 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 Or two or more (for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a
  • Examples of the DLG3 protein include: (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30; An amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids have been deleted, more preferably a number (1 to 5) amino acids, and (ii) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 (for example, An amino acid sequence to which about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about (1 to 5) amino acids have been added; (iii) The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 has one or two or more amino acids (e.g., 1 to about 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 10). An amino acid sequence in which several (1-5) amino acids have been inserted,
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably And so-called mutin such as a protein containing an amino acid sequence in which a number (1 to 5) of amino acids are substituted with another amino acid, or (V) an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • DLG1 protein examples include, for example, protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, and the like.
  • DLG3 protein examples include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, and the like.
  • the partial peptide of the DLG1 protein or the DLG3 protein is the above-mentioned partial peptide of the DLG1 protein or the DLG3 protein, and is preferably any one having the same properties as the above-described DLG1 protein or the DLG3 protein. May be.
  • the constituent amino acid sequences of the DLG1 protein or the DLG3 protein For example, at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, of the constituent amino acid sequences of the DLG1 protein or the DLG3 protein, Most preferably, a peptide having an amino acid sequence of 200 or more is used.
  • the partial peptide of the DLG1 protein include a partial peptide having the amino acid sequence of the 142nd to 310th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27. .
  • partial peptide of the DLG3 protein include a partial peptide having the 81st to 353rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, and the like.
  • the partial peptide of the protein of the present invention (the partial peptide used in the present invention) has one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably a number (1 to 5)) in its amino acid sequence.
  • Amino acids or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence.
  • Is added or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • An amino acid is inserted, or one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. May be substituted.
  • the partial peptide used in the present invention may be either.
  • the partial peptides used in the present invention include, as in the case of the above-described protein of the present invention, those having a carbonyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, and the amino acid residue at the N-terminal.
  • the amino group of a group eg, methionine residue
  • the glutamine residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyro-glutamine-oxidized
  • Also included are those in which the substituent is protected with an appropriate protecting group, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which a sugar chain is bound.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • the salt of the protein of the present invention or its partial peptide is physiologically acceptable.
  • Salts with acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced according to the following Reference Examples, or from the above-described human or warm-blooded animal cell or tissue by a protein purification method known per se, It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the protein. Also, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography. .
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethyl resin.
  • an amino acid having a suitably protected amino group and side chain functional group is condensed on the resin according to the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • a protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or partial peptide or an amide thereof. get.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HO OB t), or the protected amino acid may be preformed as a symmetric anhydride or HOB t ester or HO OB t ester. Can be added to the resin after activation.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOB t, HO OB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. .
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C11Z, Br-Z, a Damantyloxycarponyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • Carboxyl groups can be, for example, alkyl esterified (e.g., linear, branched or cyclic alkyls such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl).
  • alkyl esterified e.g., linear, branched or cyclic alkyls such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl.
  • Esterification aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification eg, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower group such as an acetyl group (an aralkyl group such as a CH alkanoyl group or a benzoyl group), a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycalponyl group or an ethoxycarbonyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B zl, C l 2 - B zl, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t- butyl are used.
  • a protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and ester with H ⁇ Bt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Cyanomethyl alcohol eg, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and ester with H ⁇ Bt.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • Trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or this Acid treatment with a mixed solution thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia are also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 20 ° C. to 40 ° C.
  • anisole for example, anisole, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethyl sulfol
  • a force-thione scavenger such as feed, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2,2-ethanedithiol, 1
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, a lipoxyl group of a carpoxy terminal amino acid is amidated and protected, and then a peptide (protein) chain is added to a desired chain on the amino group side. After lengthening the protein chain, the protein or partial peptide from which only the N-terminal ⁇ -amino group protecting group of the peptide chain has been removed and the protein or partial protein from which only the C. terminal carboxyl group protecting group has been removed. A peptide is produced and these proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain a desired protein or peptide amide.
  • the carboxy-terminal amino acid can be condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester
  • the desired protein or peptide ester can be obtained in the same manner as the protein or peptide amide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to form the target peptide. Can be manufactured. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following (i) to (V). .
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell and tissue-derived cDNA, the above-described cell and tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • DNA encoding the SEMA4B protein examples include, for example,
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, preferably about 98% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 99% or more is preferably used.
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and 99 DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 9% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringency conditions include, for example, 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA containing a base sequence or the like is used.
  • Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions include, for example, a homology of 99.9% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • DNA containing a nucleotide sequence having a property is used.
  • Eighth hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • a commercially available library When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to The conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA or a sequence containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by No. 3 is represented by
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is represented by SEQ ID NO: 5
  • a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Examples thereof include: a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9; and
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 10 Contains the sequence Examples of the DNA encoding the protein include a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:
  • Examples of the DNA encoding the DLG1 protein include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 under highly stringent conditions. And a DNA encoding a protein having substantially the same properties as a protein having a base sequence that hybridizes with the amino acid sequence and having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27.
  • Examples of the DNA encoding the DLG3 protein include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30 under the stringent conditions. DNAs encoding a protein containing a base sequence that hybridizes and having substantially the same properties as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 can be mentioned.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30 DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more with the base sequence, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used. .
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions. High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70, preferably about 60 to 70 mM. The condition of ⁇ 65 ° C is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, and the like.
  • a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 30 or the like is used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells and tissues described above, cDNA library derived from the cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the SEMA4B protein include, for example, DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11, Or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: .2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11, and is substantially similar to the SEMA4B protein.
  • DNA containing a part of DNA encoding a protein having the same activity can be used.
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11 has the same significance as described above.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the DLG1 protein include, for example, a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, or the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 and high stringent Containing a part of DNA encoding a protein having an activity substantially the same as that of a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, which contains a nucleotide sequence that hybridizes under simple conditions. A or the like is used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the DLG3 protein include, for example, a DNA having a part of a DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 30 or a base represented by SEQ ID NO: 30 D, which encodes a protein having a nucleotide sequence that hybridizes and hybridizes under stringent conditions with the sequence and having substantially the same properties as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 DNA containing a part of NA is used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 30 has the same significance as described above.
  • a clone of a DNA that completely encodes the protein of the present invention and its partial peptide (hereinafter, in the description of the cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply referred to as the protein of the present invention).
  • a DNA amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or a DNA integrated into an appropriate vector is used for the present invention. Selection can be performed by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the protein or labeled with a synthetic DNA.
  • the hybridization method can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted by ODA-LA using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Bio Inc.), Mutan TM -K (Takara Bio Inc.), or the like. It can be carried out according to a method known per se such as a PCR method, a gapped duplex method, a Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA has an ATG as a translation initiation codon at the 5 'end, and Further, it may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon on the 3 ′ terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured. .
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • SH19 pSHl 5
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pA1-11, pXT1, ⁇ Rc / CMV, pRc / RSV, pcD NA I / Neo is used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, it is preferable to use CMV (cytomegalovirus) promoter, SR promoter and the like.
  • the host When the host is Eshierihia genus bacterium, trp promoter terpolymers, lac promoter evening one, re cA promoter one, AP L promoter one evening one, l pp promoter, T 7 promoter, if the host is Ru der Bacillus
  • the host When the host is yeast, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable when the host is a yeast, such as SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further include an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • a selection marker for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, dh fr And sometimes abbreviated) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp f), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r And G418 resistance).
  • dh fr gene is used as a selection marker using dh fr gene-deficient Chinese hamster cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a genus Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the enzyme is amylase signal sequence, subtilisin, signal sequence, etc. If the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an a-interferon signal sequence, an antibody molecule, a signal sequence, etc. Available.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12-DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103- [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978), HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 CGenetics, 39 Vol. 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)], etc. are used as Bacillus spp. .
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, ⁇ 87-11A, DKD-5D, 20B—12, and Schi. Zosaccharomyces pombe NCY. C 1913, NCYC2036, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from night larvae of moth larvae (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Triclioplusia ni, and egg derived from egg of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, LL. Et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloid cells, mouse ATDC 5 cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Bacillus sp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, vol. 168, 111 (1979).
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to the law.
  • a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon medium necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like.
  • Inorganic or organic substances examples include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferred.
  • a drug such as 3j3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • a medium for example, Burkholder's minimum medium (Burkholder) CBostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 ( 1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A solution to which an additive such as 10% serum or the like is appropriately added is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, Vol.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-1000 TM .
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Methods that mainly use the difference in molecular weight of DNA methods that use charge differences such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, and hydrophobic methods such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using the difference in gender, a method using the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • SEMA4B protein or its partial peptide or its salt simply SEMA4B protein, DLG1 protein or its partial peptide or its salt, simply DLG1 protein, DLG3 protein or its partial peptide or its salt, simply DLG3 Abbreviated as protein.
  • a complex containing SEMA4B protein and DLG1 protein preferably, a complex in which SEMA4B protein and DLG1 protein are bound
  • a complex containing SEMA4B protein and DLG3 protein preferably, SEMA4B protein and DLG3
  • a complex containing SEMA4B, DLG1 and DLG3 proteins preferably, a complex to which SEMA4B, DLG1 and DLG3 proteins are bound
  • the complex of the present invention may contain, in addition to the SEMA4B protein, DLG1 protein or DLG3 protein, proteins, peptides, RNA, nucleic acids, lipids, saccharides, amide groups, phosphate groups, and the like other than those described above.
  • SEMA4B protein, DLG1 protein and DLG3 protein may be amidated, may contain phosphorylated amino acids, and may contain lipid (eg, myristic acid) binding amino acids And it is not limited by any post-translational modification.
  • Examples of the region subjected to post-translational modification include a region corresponding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and the like.
  • Examples of the complex of the present invention include, for example, (1) a cytoplasmic domain of SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26) and DLG1 protein (preferably SEMA4B protein). (2) a cytoplasmic domain of SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26) and a DLG3 protein (preferably, (3).
  • a cytoplasmic domain of the SEMA4B protein eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc.
  • DLG1 Protein preferably a region having binding activity to SEMA4B protein
  • DLG3 protein preferably a region having binding activity to SEMA4B protein
  • Examples of a region of the DLG1 protein having a binding activity to the SEMA4B protein include, for example, the 142nd to 310th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27.
  • Examples of the region of the DLG3 protein having a binding activity to the SEMA4B protein include, for example, the 81st to 35th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29.
  • an antibody against the protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be simply abbreviated as the protein of the present invention in the description of the antibody
  • an antibody against the complex of the present invention hereinafter, referred to as the antibody.
  • the antibody of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention or the complex of the present invention.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that inhibits formation of the complex of the present invention, an antibody that promotes formation of the complex of the present invention, an antibody that promotes dissociation of the complex of the present invention, and a complex of the present invention. Also included are antibodies that inhibit the dissociation of. Such antibodies include antibodies against SEMA4B protein, DLG1 protein or DLG3 protein, An antibody against the SEMA4B protein described in 4/588817 is preferably used.
  • antibodies against SEMA4B protein include:
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence from position 402 to position 412, or an amino acid sequence having Cys added to its C-terminal,
  • the antibody of the present invention is produced by using the protein of the present invention or the complex of the present invention or a part thereof as an antigen (hereinafter sometimes abbreviated as an antigen protein) according to a known method for producing an antibody or antiserum. can do.
  • the antigen protein is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody upon administration, itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the warm-blooded animals used include, for example, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • Fusion operations are known in the art, for example, It can be performed according to the method of Lustein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • Anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substances or enzymes (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse) or protein A, and monoclonal antibody bound to solid phase is detected Monoclonal antibody bound to solid phase by adding hybridoma culture supernatant to solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding proteins labeled with radioactive substances, enzymes, etc. And the like.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or Hypri A serum-free culture medium for doma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the culture supernatant of the hybridoma can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and binding is dissociated to obtain antibodies)
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and binding is dissociated to obtain antibodies
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by the antibody against hapten immunized by cross-linking with the carrier. If efficient, any kind of cross-linking may be used in any ratio.For example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ psilogloproline, hemocyanin, etc. may be used at a weight ratio of about A method of coupling at a rate of 1. to 20 and preferably about 1 to 5 is used. Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given about every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention
  • the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention hereinafter referred to as D
  • D The use of the antibody of the present invention and the complex of the present invention will be described.
  • SEMA4B protein is upregulated in cancer tissues, and when the function (activity, expression, etc.) of SEMA4B protein is inhibited, cancer cells undergo apoptosis.
  • DLG1 protein or DLG3 protein is thought to bind to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein and play a role in SEMA4B protein.
  • substances that inhibit the formation of the complex of the present invention for example, (1) binding of SEMA4B protein to DLG1 protein, or (2) binding of SEMA4B protein to DLG3 protein
  • substances that inhibit binding have an apoptosis-inducing effect on cancer cells, and include, for example, cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver) Cancer, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, ovary, thyroid, kidney, brain, blood, etc.)
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver
  • Cancer biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, ovary, thyroid, kidney, brain, blood, etc.
  • a substance that promotes the formation of the complex of the present invention eg, a compound or a salt thereof, an antibody
  • a substance that promotes the formation of the complex of the present invention for example, (1) binding of SEMA4B protein to DLG1 protein, or (2) binding of SEMMB protein to DLG3 protein
  • Substances that promote binding eg, compounds or their salts, antibodies
  • have an inhibitory effect on neuronal apoptosis such as neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic disease) It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease, etc., and an agent for inhibiting (suppressing) apoptosis of nerve cells.
  • a substance that promotes dissociation of the complex of the present invention eg, compound or salt thereof, antibody
  • a substance that promotes dissociation of the complex of the present invention eg, compound or salt thereof, antibody
  • It has an apoptosis-inducing effect for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovary
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovary
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uter
  • a substance that inhibits dissociation of the complex of the present invention eg, a compound or a salt thereof, an antibody
  • a substance that inhibits dissociation of the complex of the present invention eg, a compound or a salt thereof, an antibody
  • a complex of SEMA4B protein and DLG1 protein e.g., a complex of SEMA4B protein and DLG1 protein
  • Substances that inhibit body dissociation eg, compounds or their salts, antibodies
  • have an inhibitory effect on neuronal apoptosis and include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc., and an agent for inhibiting (suppressing) apoptosis of nerve cells.
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (famili
  • the protein of the present invention is a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the binding of the above (1) to (2) or a compound that promotes or inhibits the dissociation of the complex of the above (3) to (4) Or, it is useful as a reagent for screening a salt thereof. That is, the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the binding of the above (1) to (2), or a method of the above (3) to (4), characterized by using the protein of the present invention. A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits dissociation of a complex is provided.
  • the protein of the present invention is used in the screening method of the present invention, and a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the SEMA4B protein may be used.
  • the screening method of the present invention relates to a method for producing a cell capable of producing the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with a DNA encoding the protein of the present invention (eg, yeast, animal cells, etc.) )) May be used.
  • the cells include (a) DNA encoding SEMA4B protein (eg, DNA encoding a peptide corresponding to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein) and (b) DDNA encoding DLGl protein or DLG3 protein. Transformed with NA A transformant is used.
  • the DLG1 or DLG3 protein is immobilized on a solid phase (eg, an EIA plate) using an antibody against the DLG1 or DLG3 protein, or the DLG1 or DLG3 protein is tagged with a Tag protein (eg, His-Tag). , GST (daltathione-S-transferase) etc.) and then immobilized on a solid phase.
  • a solid phase eg, an EIA plate
  • a Tag protein eg, His-Tag
  • GST didaltathione-S-transferase
  • a partial peptide of the protein is used as the DLG1 protein or DLG3 protein
  • a partial peptide having a binding activity to the SEMA4B protein eg, the 14th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27
  • nickel is used for His-Tag
  • daltathione is used for GST.
  • a SEMA4B protein labeled with a labeling agent eg, biotin
  • a labeling agent eg, biotin
  • SEMA4B protein labeled with a labeling agent eg, biotin
  • a labeling agent eg, biotin
  • the amount of binding is measured by a known method, for example, using a commercially available kit for detecting a solid phase-immobilized SEMA4B protein or a labeling agent (eg, biotin) or an antibody against the SEMA4B protein.
  • a labeling agent eg, biotin
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the binding amount in the case (ii) is about 20 times smaller than that in the case (i). % Or less, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, with a compound that inhibits the binding of SEMA4B protein to DLG1 or DLG3 protein (hereinafter abbreviated as a binding inhibitor).
  • a test compound which increases the activity in the case of (ii) above by about 20% or more, preferably by 30% or more, more preferably by about 50% or more as compared with the case of the above (i). Is selected as a compound that promotes the binding between the SEMA4B protein and the DLG1 protein or the DLG3 protein (hereinafter sometimes abbreviated as a binding promoter).
  • a compound that promotes the dissociation of the complex between the SEMA4B protein and the DLG1 or DLG3 protein hereinafter sometimes abbreviated as a dissociation accelerator
  • the compound in the case of the above (ii) whose activity in the above (ii) is In comparison, a test compound that increases the amount by about 20% or more, preferably 30% or more, and more preferably about 50% or more by a compound that inhibits the dissociation of the complex between the SEMA4B protein and the DLG1 or DLG3 protein ( Hereinafter, it may be abbreviated as dissociation inhibitor.)
  • a SEMA4B protein eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc.)
  • a SEMA4B protein is immobilized on a solid phase, and the DLG1 protein or The DLG3 protein may be contacted and the amount of binding may be measured in the same manner.
  • SEMA4B protein eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the SEMA4B protein (eg, a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26)
  • a SEMA4B protein labeled with a labeling agent eg, biotin
  • a solid phase eg, a plate
  • the immobilized SEMA4B protein eg, a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein (eg, a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, etc.)
  • immobilized SEMA4B protein eg, partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of SEMA4B protein (eg, amino acid represented by SEQ ID NO: 26) Acid sequence, etc.
  • DLG1 protein or DLG3 protein The quality and the amount of binding when the test compound is contacted at the same time are measured and compared. The binding amount is measured by a known method, for example, the immobilized DLG1 protein or DLG3 protein is measured using an antibody against the protein.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the DLG1 protein or DLG3 protein may be a protein fused with a Tag protein, and in that case, the DLG1 protein or DLG3 protein may be detected, quantified, and quantified with an antibody against the protein. Alternatively, detection and quantification may be performed using an antibody against the Tag protein.
  • a test compound that reduces the amount of binding in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, and more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii) inhibits binding.
  • it promotes the binding of a test compound that increases the activity in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii). And choose the agent.
  • a test compound that reduces the amount of binding in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii).
  • a dissociation accelerator a test in which the activity in the case of (iv) above is increased by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of (iii) above.
  • Compounds are selected as dissociation inhibitors.
  • a chimeric protein obtained by fusing a repo all-in-one gene binding domain to a partial peptide corresponding to the cytoplasmic domain of the SEMA4B protein (eg, a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26).
  • DNA encoding the DNA encoding the DNA and (b) a chimeric protein obtained by fusing a reporter gene transcription activation domain to the DLG1 protein or DLG3 protein in yeast (eg, Saccharomyces cerevisiae, more preferably S. cerevisiae Y190 strain).
  • the action of the single hybrid causes the reporter gene / 3 / 3-galactosida
  • the phenotype of the Hase3 gene and the histidine synthesis gene HIS3 is expressed.
  • This yeast strain is cultured for a certain period of time in the presence of the test compound, and a test compound that reduces the yeast strain's -galactosidase activity or converts the yeast strain to histidine-requiring is selected as a binding inhibitor or dissociation promoter. I do.
  • the yeast strain can be cultured in the same manner as the culture of the above-described transformant whose host is yeast.
  • the activity of 3 / 3-galactosidase is determined by X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside), ONPG (o-nitrophenyl j3 -D-galactopyranoside) or CPRG ( Clorophenyl red-i3-D-galactopyranoside can be used as a substrate according to a known method. Expression of the HIS3 phenotype can be measured by culturing the yeast in a minimal medium lacking histidine.
  • cytotoxic compounds and compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product are excluded as false positive compounds.
  • a repo overnight gene eg, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene, luciferase gene, etc.
  • the transcriptional regulatory region of the reporter gene binds, for example, a GAL1 transcription activation sequence (UAS) downstream of a promoter that functions in animal cells (eg, a minimal promoter (TATA box) derived from the adenovirus Elb).
  • UAS GAL1 transcription activation sequence
  • TATA box minimal promoter
  • the animal cell strain can be cultured in the same manner as the culture of the above-mentioned transformant whose host is an animal cell.
  • the activity of a reporter gene product eg, CAT, luciferase, etc.
  • CAT luciferase
  • cytotoxic compounds and compounds that inhibit the activity of the reporter gene product itself due to interaction with the reporter gene product and the like are excluded as false positive compounds.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the screening kit of the present invention contains a DLG1 protein or a DLG3 protein, and may further contain a SEMA4B protein (eg, a partial peptide corresponding to a cytoplasmic domain).
  • the screening kit of the present invention comprises a cell capable of producing the protein of the present invention (preferably, a transformant transformed with a DNA encoding the protein of the present invention (eg, yeast, animal cells). Cells))).
  • the cell may be a transformant transformed with DNA encoding a DLG1 protein or DLG3 protein and DNA encoding a SEMA4B protein (eg, a partial peptide corresponding to a cytoplasmic domain).
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be any of the above test compounds (eg, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract) , Plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.).
  • test compounds eg, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • Compounds that inhibit the binding of SEMA4B protein to DLG1 protein or DLG3 protein include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney) Cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney
  • Cancer bladder cancer
  • uterine cancer testis cancer
  • ovarian cancer thyroid cancer
  • Compounds that promote the binding of SEMA4B protein to DLG1 protein or DLG3 protein include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease) Is useful as a prophylactic or therapeutic agent, or as a neuronal apoptosis inhibitor (suppression) agent
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease) Is useful as a prophylactic or therapeutic agent, or as a neuronal apoptosis inhibitor (suppression) agent
  • Compounds that promote the dissociation of the complex between SEMA4B protein and DLG1 protein or DLG3 protein include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract) Cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or as a remedy or apoptosis of cancer cells Useful as an accelerator.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract
  • Cancer spleen cancer
  • renal cancer bladder cancer
  • uterine cancer testicular cancer
  • ovarian cancer thyroid cancer
  • knee cancer brain tumor, blood tumor, etc.
  • apoptosis of cancer cells Useful as an accelerator.
  • Compounds that inhibit the dissociation of the complex between SEMA4B protein and DLG1 or DLG3 protein include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.) It is useful as a prophylactic or therapeutic agent, or as an inhibitor of neuronal apoptosis (suppression).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, joints Includes dosage forms such as internal injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants is used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyetylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)) and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyetylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially It is preferable that the compound contains 5 to 100 mg for an injection and 10 to 25 mg for the other dosage forms.
  • compositions does not cause any undesired interaction due to blending with the above-mentioned compounds.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or warm-blooded animals (eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys). , Chimpanzees, etc.) orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, monkeys.
  • Chimpanzees, etc. orally or parenterally.
  • the dose of the compound (preferably, a binding inhibitor or a dissociation promoter) or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route, and the like.
  • the compound may be used for the purpose of treating breast cancer.
  • the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.1 to 10 O mg, preferably about 1.0 to 50 mg per day. Preferably about 1.0 to 20 mg is administered .
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult ( (As a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof may be administered in an amount of about 0.01 to 3 O mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 mg per day. Conveniently, 11 O mg is administered to the cancerous lesion by injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention or the complex of the present invention, the amount of the protein of the present invention or the complex of the present invention in a test solution, particularly sandwich immunization, It can be used for quantification by a measuring method.
  • the antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution and a labeled complex of the protein of the present invention or a complex of the present invention, and the labeled protein of the present invention bound to the antibody is reacted.
  • the two kinds of antibodies are antibodies that recognize different sites of the protein of the present invention or the complex of the present invention.
  • the complex of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention or the complex of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and detection by tissue staining or the like can be performed. You can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention or the complex of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antigen in the test solution (for example, the amount of the protein) )
  • the amount of antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to (1) is detected by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. If so, any measurement method may be used. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], [ “c] and the like.
  • the enzyme large preferably stable and specific activity, e.g., / Examples include 3-galactosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, or the like is used.
  • luminescent substance for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin, etc.
  • a biotin-avidin system may be used for binding an antibody or an antigen to a labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, but a mixture of two or more kinds of antibodies for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is the same as that of the protein of the present invention or the complex of the present invention. Antibodies with different binding sites are preferably used.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the complex formed by the C-terminal part of the SEMA4B protein.
  • the antibody to be used is preferably an antibody that recognizes a complex other than the site, for example, a complex formed by the N-terminal of the SEMA4B protein.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry method.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen After reacting competitively, the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody (B / F separation), and the amount of B or F labeling is measured. Quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody to the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of the antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein of the present invention or the complex of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • cancer Eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor , Hematologic tumors, etc.
  • cancer Eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor , Hematologic tumors, etc.
  • a decrease in the concentration of the complex of the present invention is detected by quantifying the concentration of the complex of the present invention using the antibody of the present invention, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.) or can be diagnosed as having a high likelihood of contracting in the future.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic Alzheimer's disease, etc.) or can be diagnosed as having a high likelihood of contracting in the future.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the complex of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detection of the complex of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the complex of the present invention in test cells, etc. can be used for the preparation of an antibody column used for purifying the complex of the present invention.
  • the antibody of the present invention has an apoptosis-promoting action when inhibiting the formation of the complex of the present invention, and includes, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, Biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, testes, ovary, thyroid, knee B, brain, blood, etc.) It can also be used as an accelerator.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, Biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, testes, ovary, thyroid, knee B, brain, blood, etc.
  • the antibody of the present invention when it promotes the formation of the complex of the present invention, it has an apoptotic inhibitory effect. It can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for sporadic Alzheimer's disease, etc., and as an inhibitor of neuronal apoptosis (suppression).
  • the antibody of the present invention has an apoptosis-promoting action.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer
  • liver cancer biliary tract cancer
  • spleen cancer renal cancer
  • bladder cancer uterine cancer
  • testis cancer ovarian cancer
  • thyroid cancer renal cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • apoptosis promoter It can also be used as a cancer cell apoptosis promoter.
  • the antibody of the present invention when it inhibits the dissociation of the complex of the present invention, it has an apoptosis-suppressing action, for example, a neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease). , Sporadic Alzheimer's disease, etc.), and as an agent for inhibiting (suppressing) apoptosis of nerve cells.
  • a neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease (familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease). , Sporadic Alzheimer's disease, etc.
  • the prophylactic / therapeutic agents and promoters for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention have low toxicity, and can be used as they are as liquids or as pharmaceutical compositions in appropriate dosage forms in humans or mammals (eg, rat, rabbit, etc.). It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous, etc.) to cattle, sheep, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc.). It can also be administered as a vaccine according to the usual methods.
  • the antibody of the present invention may be administered as it is, or may be administered as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, etc. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid used for usual injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing budose sugar and other adjuvants and the like are used.
  • propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)] or the like
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a dissolution aid.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration may be prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, and capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to match the dosage of the active ingredient.
  • Such dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • Can be The content of the antibody is usually about 5 to 50 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 10 mg for injection, and about 10 to 250 mg for other dosage forms. .
  • the dosage of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent or modulator containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, it is used for treatment and prevention of adult breast cancer.
  • a single dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01 to 2 Omg / kg body weight, preferably about 0.1 to 1 OmgZkg body weight, and more preferably 0.1 to 5 mg / kg body weight. It is convenient to administer about kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids may have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • EGTA Ethylene glycol-bis- (beta aminoethyl ether tetraacetic acid
  • a 1 Alanine
  • Th r Threonine
  • Tr p Tribute fan
  • TC thiazolidine-1 (R) monolithic lipoxamide group
  • the nucleotide sequence of DNA containing the full length gene encoding SEMA4B is shown.
  • SEMA4B indicates the nucleotide sequence of DNA including the full length gene encoding Ml. [SEQ ID NO: 7]
  • S EMA4B indicates the nucleotide sequence of DNA including the full length gene encoding M2. [SEQ ID NO: 10]
  • SEMA4B shows the amino acid sequence of M3.
  • SEMA4B indicates the base sequence of DNA containing the full length gene encoding M3.
  • SEMA4B indicates the base sequence of DNA containing the full length gene encoding M3.
  • [SEQ ID NO: 25] 7 shows the amino acid sequence of peptide 4 used in Reference Example 8.
  • RNA total RNA extracted from 4 cases of lung cancer tissues and 5 cases of normal lung tissues was used as a material, and ol igonucleotide microarray (Human Genome Gene expression analysis was performed using U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; The experiment method was in accordance with Aiiymetrix's Experiment Guide (Expression analys is technical manual).
  • Semaphorin 4B Semaphorin 4B
  • Semaphorin 4B-M3 Semaphorin 4B-M3
  • human non-small cell lung cancer cell line NCI-H1703 purchased from American Type Culture Collection (ATCC) was added to RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES) (Invitrogen) with 10% fetal bovine serum (ATCC). The cells were suspended in the added medium, and seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 10,000 cells / well (medium volume: 0.1 ml). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides were transfected.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • an antisense oligonucleotide that hybridizes to the 3 ′ untranslated region sequence of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10
  • a phosphorothioated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC, and used for an introduction experiment (hereinafter abbreviated as antisense oligonucleotide).
  • antisense oligonucleotide As a control, the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 is the same.
  • control oligonucleotide purified by HPLC
  • Antisense oligonucleotides or control oligonucleotides diluted with Opti-MEM were diluted 5-fold with Opti-MEM (Invitrogeii) and left at room temperature for 5 minutes. : 3 (volume ratio), and added to the plate at a rate of 40 L / well. The final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 250 nM. After further culturing under the above conditions for 3 days, the apoptosis-inducing activity of the above two oligonucleotides was measured using a Cell Death Detection ELISA kit (Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
  • the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) showed about 1.6 times the apoptosis-inducing activity as compared to the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and a statistically significant difference ( P ⁇ 0.01) (Table 3)
  • Apoptosis induction activity A 4 92 / mean standard deviation
  • Antisense talent Rigonucle talent 0.5 3 8 0. 0 3 5
  • the NCI-H1703 human non-small cell lung cancer cell line used in Reference Example 2 was suspended in the same medium as in Reference Example 2, and a 24-well flat bottom tissue culture was performed at a cell density of 60,000 cells / well (medium volume: 0.6 ml). Plates (BD Falcon) were seeded. After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, an antisense oligonucleotide was transduced according to the method of Reference Example 2.
  • oligonucleotide 240 xL per square well, two types of antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) and two types of control oligonucleotides (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 14).
  • the oligonucleotide of column number: 16) was used.
  • antisense oligonucleotides and control oligonucleotides derived from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 they are represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 15 After designing an antisense oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) that hybridizes to the 3 'untranslated region sequence of a protein having an amino acid sequence, synthesize a phosphorothioated oligonucleotide, purify it by HPLC, and conduct an introduction experiment. It was used for.
  • the reverse sequence (SEQ ID NO: 16) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used.
  • RNeasy registered trademark
  • Mini Total NA Kit QIAGEN
  • SEMA4B was prepared using two types of primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • the expression copy numbers of SEMA4B-Ml, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes were measured.
  • the expression amount of the / 3-actin gene contained in the same amount of type III cDNA was measured using TadMan j3-act in Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
  • the non-transfection group When distilled water was used instead of the oligonucleotide solution (hereinafter referred to as the non-transfection group), the sum of the SEMA4B, SEMA4B-MK, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 gene expression amounts was the / 3-actin gene expression amount Of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) administration groups were 0.98% and 1.1%, respectively. Significantly reduced (P ⁇ 0.05) gene expression was observed.
  • control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) administration groups showed 4.1% and 3.4%, respectively, which were statistically significant compared to the non-transfection group. No decrease was observed.
  • a PCR reaction was performed using two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20).
  • the reaction solution (50xl) was composed of the above cDNA of II, 2.5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), 1.OM primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20), 200 zM dNTPs,
  • the composition contained 25 12x GC Buffer I (Takara Bio).
  • the PCR reaction was repeated at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, 72 ° C for 4 minutes for 30 cycles, and an extension reaction was performed at 72 ° C for 5 minutes.
  • 5 U of Ex Tad DNA Polymerase (Takara Bio) was added and incubated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the resulting PCR reaction product was purified using PCR Purification Kit (QIAGEN). This was subcloned into the plasmid vector pCR4-TOP0 (Invitrogen) according to the prescription of the T0P0TA PCR Cloning Kit (Invitrogen). After introducing this into E.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 represent the nucleotide sequences at positions 13 to 249 and 2761 to 3778 of the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. NM_198925 gene).
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 9 And SEQ ID NO: 12.
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 was completely identical to the SEMA4B protein encoded by the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. _198925 gene).
  • the protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is SEMA4B_M1
  • the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 7)
  • SEMA4B-M2 the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • SEMA4B-M3 a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 was named SEMA4B-M3, respectively.
  • the 90th g of the base sequence of layer A (SEQ ID NO: 2) encoding SEMA4B is a, and the 111th g is a
  • the 623th g is substituted with t, and the 623th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
  • the 150th g of the base sequence of the DNA encoding SEMA4B is a
  • the 489th g is a
  • 528 The 1st c is replaced by t
  • the 1266th t is replaced by c
  • the 1588th c is replaced by a
  • the 2343th a is replaced by g
  • the 489th substitution is accompanied by an amino acid substitution. .
  • Lys at position 364 in the amino acid sequence of SEMA4B is substituted with Asn.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B-M3 (SEQ ID NO: 11)
  • the g nucleotide at the 1092th position in the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B (SEQ ID NO: 2) has been replaced with t, resulting in an amino acid substitution. Is accompanied.
  • the plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 was SEMA4B / PCR4-T0P0
  • the plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was SEMA4B-M1 / PCR4-T0P0
  • the plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 was named SEMA4B-M2 / PCR4-T0P0
  • the plasmid was named SEMA4B-M3 / PCR4-TOP0.
  • the transformant in which the plasmid SEMA4B / PCR4-T0P0 was introduced was transformed into Escherichia col i T0P10 / SEMA4B / PCR4-T0P0, and the transformant in which the plasmid SEMA4B-Ml / pCR4-T0P0 was introduced was transformed into Escherichia col i T0P10 / SEMA4B.
  • Escherichia coli T0P10 / SEMA4B-M2 / pCR4-T0P0 and plasmid SEMA4B-M3 / pCR4-T0P0 were introduced into the transformants in which -Ml / pCR4-T0P0 and plasmid SEMA4B-M2 / pCR4-T0P0 were introduced.
  • the transformant was named Esche richia coli TOP10 / SEMA4B-M3 / pCR4-TOPO.
  • RNA Human colorectal cancer cell line C0CMK Human non-small cell lung cancer cell line VMRC-LCD and human prostate cancer cell line PC3 were purchased from JCRB. These cell lines may be used in Reference Examples 9 and thereafter.
  • Total RNA was prepared from 91 of the above cell lines using the RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN). Using this total RNA as type II, cDNA was prepared by reverse transcription reaction using random primers and quantitative PCR was performed to obtain the SEMA4B gene (SEQ ID NO: 2) and the SEMA4B-Ml gene (SEQ ID NO: 5). The expression levels of the SEMA4B-M2 gene (SEQ ID NO: 8) and the SEMA4B-M3 gene (SEQ ID NO: 11) were examined.
  • the PCR reaction was performed using the cDNA obtained from 3 to 4 ng of the total RNA as the ⁇ type under the same conditions as in Reference Example 3, and the SEMA4B, SEMA4B-Ml, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes were The expression copy number was calculated.
  • the copy number of the 3-actin gene was calculated using TaqMan Human j3-act in Control Reagents (Applied Biosystems) as described above and included in 1 ng of total RNA and used as an internal standard.
  • Tables 4 and 5 show the relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the whole gene with the expression level of the 3-actin gene.
  • Plasmid SEMA4B / PCR4-T0P0 obtained in Reference Example was used as type III, and the SEMA4B gene was Amplified.
  • the composition of the reaction solution used was SEMA4B / PCR4-TOPO 2ng as type II, 2.5 U of Piu Turbo Hotstart Bandage Polymerase (STMTAGENE), and two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21) was added to each lM, dNTPs to 200M, and 10x Pfu Buffer to make a liquid volume of 501.
  • the PCR reaction was repeated 25 times at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes.
  • the PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN), and then treated with restriction enzymes XbaI and EcoRI. Plasmid p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) was also treated with Xbal and Eco RI. Each DNA fragment was purified using a PCR Purification Kit, and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio). After introducing the reaction mixture into the E. coli T0P10, the transformed E. coli was selected on LB agar medium containing ampicillin, and the individual clones were analyzed. As a result, cDNA corresponding to the SEMA4B gene (SEQ ID NO: 2) was obtained. Plasmid pCMV-14-SEMA4B containing the fragment was obtained. Reference Example 7
  • An expression vector for animal cells that expresses a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-terminus of SEMA4B protein was constructed. Selection of transformed E. coli was performed according to the method described in Reference Example 6, except that the primer pair used when amplifying the SEMA4B gene by PCR was changed to another primer pair (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). I went. As a result, a plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG containing a cDNA fragment encoding a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-terminus of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was obtained. Reference example 8.
  • SEMA4B protein SEQ ID NO: 1
  • SEMA4B-Ml protein SEQ ID NO: 4
  • SEMA4B-M2 protein SEQ ID NO: 7
  • SEMA4B-M3 protein SEQ ID NO: 10
  • amino acid sequence of peptide 1 is a SEMA4B protein This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence from the 402th to the 412th amino acid sequence of (SEQ ID NO: 1).
  • amino acid sequence of peptide 4 [Ser-Arg-Val-Phe-Tr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys (SEQ ID NO: 25)] is This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminal of the amino acid sequence from the 797th position to the 809th position of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1).
  • Each peptide of peptide 1, peptide 2, peptide 3 and peptide 4 is conjugated with keyhole lysin as a carrier protein by using mosaicin (KLH) as a carrier protein.
  • KLH mosaicin
  • Polyclonal antibodies were made.
  • the immunized animal was a male male male egret KBL: JW (11-week-old, Oriental yeast), the first sensitization was a complete Freund's adjuvant (Diico) suspension, and the second and subsequent times were incomplete Freund's adjuvant (Diico) A suspension was used.
  • the sensitization was performed by subcutaneous injection on the back. One sensitization was performed using 0.5 mg of each antigen, and was repeated three times every 14 days after the first sensitization.
  • the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was detected using the purified peptide antibody prepared in Reference Example 8.
  • NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 10 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and seeded on a 10 cm diameter petri dish. .
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C under 5% carbon dioxide gas.
  • the plasmid pCMV-14-SEMA4B6ig prepared in Reference Example 6 was mixed with Plus reagent (Invitrogen) and OPTI-MEMI (Invitrogen), left at room temperature for 15 minutes, and then transferred to LipoiectAMINE transfection.
  • Reagents (Invitrogen) and OPTI-MEM I were added, and left at room temperature for 15 minutes. This mixture was dropped into the culture solution to continue the culture. Two days after the introduction of the expression plasmid, the cells were washed with ice-cold PBS, and ice-cooled RIPA buffer (50 Tris' hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1%). 1% SDS, 1% dexocholic acid, Co-immediate tablet (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail 1-2 (Sigma)] and 1 ml were added, and left at 4 ° C for 30 minutes.
  • RIPA buffer 50 Tris' hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1%).
  • the RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15, OOOrpm for 20 minutes was used as a cell-free extract.
  • This cell-free extract and sample buffer for 2x SDS-PAGE 125 mM Tris' HCl buffer, pH 6.8, 40% glycerol, 4% SDS, 0.04% bromophenol blue and 5% 2-mercaptoethanol
  • IOI was then subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel.
  • the separated proteins were applied to a clear blot P membrane (ATT0) according to a conventional method.
  • a blocking solution 50 ⁇ Tris ⁇ HCl buffer, ⁇ 7.5, 500 ⁇ sodium chloride, 0.1% Tween 20, 5% skim milk.
  • the peptide antibody AS-2531, AS-2532, AS-2591 or AS-2592 prepared in Reference Example 8 was diluted with a blocking solution to a concentration of 3 g / ml, and reacted at 4 overnight. I let it. Subsequently, it was left at room temperature for 1 hour in an HRP-labeled anti-Peacock IgG antibody (Amersham-Bioscience) diluted 50,000 or 100,000 with a blocking solution.
  • EMA4B protein was detected using ECL plus (Afflersham-Bioscience) according to the attached protocol.
  • a cell-free extract was prepared in the same manner as in Reference Example 9.
  • a cell-free extract 400 n1 was added to a 50 PL 1 suspension of Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) in an equal volume of RIPA buffer, and the peptide antibody AS described in Reference Example 8 was added.
  • mice anti-FLAG M2 antibody (Sigma) diluted with a blocking solution to 0.2 g / ml or 0.1 g / ml was used as the primary antibody, and an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Sigma) was used. Amer sham-Bioscience) diluted 250,000 times or 50,000 times with blocking solution as secondary antibody Using.
  • Lung cancer cell lines NCI-H2228, NCI-H165K NCI-H358, NCI-H23 and NCI-H1703; ovarian cancer cell lines SK0V-3 and T0V-21G; prostate cancer cell line DU145; and ⁇ cancer cell line PANC-1 was cultured in two Petri dishes having a diameter of 10 cm. One plate of each dish was dispersed with trypsin * EDTA (Invitrogen), and the number of cells was counted. Based on the number of cells counted, add 1 ml of ice-cold RIPA buffer (as described in Reference Example 9) to 5 X cells to one remaining Petri dish and add at 30 ° C at 4 ° C. Left for minutes.
  • the RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15, OOO rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract.
  • Size X ProteinG Imiiiunoprecipi tat ioii Kit Pierce
  • a resin prepared by cross-linking the peptide antibody AS-2531 described in Reference Example 8 with Protein in G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) Resuspended in volume of RIPA buffer.
  • the cell-free extract 4001 described above was added to the suspension 301, and the mixture was stirred at 4 ° C.
  • NEMA-H2228, NCI-H358, NCI-H23, SK0V-3, ⁇ 5, and PANC-1 are derived from the SEMA4B protein in the vicinity of molecular weight lOOkD in each cell line. Specific bands were observed. This revealed that the SEMA4B protein was highly expressed in the above six cancer cell lines.
  • NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 2 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), lmM sodium pyruvate and 25 mM HEPES. After turbidity and seeding on a 6-well plate, the cells were cultured at 37 under a 5% carbon dioxide gas stream.
  • Cells were harvested from the wells where one to three cells grew and formed colonies, and were seeded in an amount equal to 2 wells of a 48-well plate. After culturing was continued until the cell density became 50% or more, the sample buffer for SDS-PAGE described in Reference Example 10 was added to 1 ⁇ l of cells to prepare a cell lysate. After heat treatment at 95 ° C for 5 minutes, was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. According to the method described in Reference Example 9, Western blotting was performed using the peptide antibody AS-2532 to search for stably expressing cells that constitutively express the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1).
  • the cells recovered from the other well were diluted to 0.7 cells per well, and then seeded on a 96-well plate.
  • the culture was continued at 37 ° C. under a 5% carbon dioxide gas flow while changing the G418 selection medium every 3 or 4 days until the cell density reached about 50%.
  • seed the cells equally in 2 wells of a 48-well plate continue culturing until the cell density reaches 50% or more, and use the cell lysate prepared from 1-well cells as described above for Western blotting. Ting was done.
  • a clone that highly expressed the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was selected to obtain a SEMMB stable expression cell line SEMA4B / H358.
  • Reference Example 1 3 Localization of SEMA4B protein (Piotin labeling)
  • the human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228 and NCI-11358, and SEMA4B / H358 described in Reference Example 12 were each seeded on a Petri dish having a diameter of 10 cm, and cultured until a subconfluent. After washing each cell with PBS, PBS containing 0.5% BSA and 5 mM EDTA was added, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes to disperse the cells. Next, use Buffer A [HBSS (Hanks' Balanced Salt Solut ions. Invitrogen) containing 2% fetal calf serum (JRH) and 0.1% sodium azide] at 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • HBSS Hors' Balanced Salt Solut ions. Invitrogen
  • JRH fetal calf serum
  • the cells were suspended to a final concentration, to which AS-2532 or non-immune mouse herb IgG (Jackson) was added to a final concentration of 10 ig / ml, and left on ice for 3 hours. After washing the cells with Buffer A, the cells were suspended in Buffer A containing 10 ig / ml of Alexa488-labeled anti-Peacock IgG antibody (Molecular Probes), and left on ice for 2 hours. After washing with buffer A again, analysis was performed using FACScan (BD Biosciences).
  • NCI-H358 was suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), lmM sodium pyruvate and 25 mM HEPES, and a cell density of 8 ⁇ 10 3 cells / well (to achieve a medium volume) NCI-H358 was seeded on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate (BD Falcon) and cultured overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream, while the antisense oligonucleotide (sequence described in Reference Example 2) was used. No.
  • control oligonucleotide SEQ ID NO: 14
  • 0PTI-MEMI Invitrogen
  • Plus reagent Invitrogen
  • Add 0.4 xl of LipoiectAMINE transfection reagent Invitrogen
  • OPTI-MEM I OPTI-MEM I
  • apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotides was measured according to the protocol attached to ELISA TM (Roche Diagnostics) and Caspase-Glo 3/7 assay (Promega).
  • the antisense oligonucleotide was 1.42 times and 1.77 times more apoptotic, respectively, than the control oligonucleotide used as a negative control in both Cell Death Detection ELISA and Caspase ⁇ Glo 3/7 assay. It showed inducible activity and showed a statistically significant difference (P ⁇ 0.01) (Tables 6 and 7).
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), sodium ⁇ sodium pyruvate and 25 mM HEPES was used as NCI-H2228.
  • ACL-4 medium (ATCC) containing 10% FBS was used for NCI-H1651.
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (Disha) and 25niMHEPES was used.
  • Each cell was suspended in the culture medium of their respective, 7.5 ⁇ 10 3 cells per Ueru (NCI-H2228), 7.5X10 3 pieces (NCI-H1651) and 5X10 cell density (medium solution three (NCI H23)
  • the cells were seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) in an amount of 125 1) and cultured overnight at 37 t in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • 0.135 zg of each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) and the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) described in Reference Example 2 was diluted with 0PTI-MEM I (Invitrogen), and the Plus reagent (Invitrogen) was used. 0.75 1 And left at room temperature for 15 minutes. LipofectAMINE Transfection Reagent (Invitrogen) 0. diluted with OPTI-MEM I was added, and left at room temperature for 15 minutes. The whole amount of the mixture was added to the culture solution of each cell, and the culture was continued for 3 days. Then, the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotide was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
  • the antisense oligonucleotide was 1.58 times (NCI-H2228), 1.21 times (NCI-H1651) and 1.25 times (NCI-H23 ), And the risk factors were calculated as P ⁇ 0.05 (NCI-H2228), P ⁇ 0.05 (NCI-H1651) and P ⁇ 0.0UNCI-H23), indicating a statistically significant difference. (Table 8, Table 9 and Table 10).
  • Antisense Sense Rigonucleide 1.390 0. 1 04 (SEQ ID NO: 13)
  • Apoptosis induction activity (A mean standard deviation
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI-H2228 was treated with the perforated peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 obtained in Reference Example 8, and the apoptosis-inducing activity of these perforated peptide antibodies was measured.
  • NCI-H2228 is suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JM), 1 sodium pyruvate and 25 mM HEPES to achieve a cell density of 4 ⁇ 10 3 cells / well.
  • the cells were seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) coated with type I collagen, and cultured at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • the heron peptide antibodies AS-2531, AS-2532, and the non-immune mouse herb IgG (Jackson) obtained in Reference Example 8 were diluted with PBS, and the final concentration of each antibody was 15 xg / inl, 45 g / ml and 150 g / ml.
  • SEMA4B protein SEMA4B-Ml protein
  • SEMA4B-M2 protein SEMA4B-M3 protein
  • a cDNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 was amplified from the plasmid pCMV-14-SEMA4B obtained in Reference Example 6 by PCR.
  • the obtained cDNA was recombinantly introduced into a yeast expression vector pGBT.Q.
  • pGBT.Q is a derivative closely related to pGBT.C (Nat. Genet. 12, 72-77, 1996), in which the polylinker is modified at one position and the Ml3 primer for sequence is inserted. .
  • This new construct was selected directly in the yeast strain PNY200 with or without the ability to synthesize tributofan (genotype of this strain: MAT a tr 1-901 leu2-3, 112 ura3-52 his3-200 ade2 gal4A gal80A).
  • the bait protein was produced as a fusion protein linked to the C-terminal side of the DNA binding domain (amino acids 1 to 147) of the transcription factor Gal4 protein (GenBank NPJ 15076).
  • the play library was prepared using the yeast strain BK100 (genotype of this strain: MATa trpl-901 leu2-3, 11.2 ura3-52 his3-200 gal4 ⁇ gal80 ⁇ LYS2:: GAL-HI S3 GAL2-ADE2 met2:: GAL7- lacZ) and selected for their ability to synthesize leucine.
  • the protein encoded by each cDNA was produced as a fusion protein linked to the C-terminal end of the transcription promoting domain (amino acids 768 to 881) of the transcription factor Gal4 protein (GenBank NPJ15076).
  • PNY200 cells expressing the bait protein were conjugated to BK100 cells (conjugated MATa) expressing the prey protein in the play library.
  • the resulting diploid yeast cells expressing the prey protein interacting with the beta protein were selected for their ability to synthesize tributofan, leucine, histidine and adenine.
  • DNA is prepared from each clone and electroporated.
  • E. coli strain KC8 was then transformed and cells were selected on ampicillin-containing medium without tributofan (for selection of plasmids in the plasmid) or without leucine (for selection of plasmids in the play library).
  • DNA for both plasmids was prepared and sequenced by the dideoxynucleotide 'chain termination method. The identity of the byte cDNA insert was confirmed and the cDNA inserts obtained from the prey library plasmids were identified using the BLAST program, which checks against known nucleotide and protein sequences overnight.
  • a cDNA fragment encoding the 142nd to 310th amino acid sequence of DLG1 (SEQ ID NO: 27) was obtained from a human cerebral cDNA library.
  • a cDNA fragment encoding the 81st to 353rd amino acid sequence of DLG3 (SEQ ID NO: 29) was obtained.
  • a substance that inhibits binding to a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 or a partial peptide thereof or a salt thereof includes, for example, cancer (eg, colon cancer) , Breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, ovarian cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • substances that promote the above binding include, for example, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease (eg, familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic A) It is useful as a prophylactic and therapeutic agent such as Ruzheimer's disease).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease (eg, familial Alzheimer's disease, juvenile Alzheimer's disease, sporadic A) It is useful as a prophylactic and therapeutic agent such as Ruzheimer's disease).
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be used for preventing cancer, neurodegenerative disease, etc. ⁇ Useful for screening therapeutic agents.

Abstract

本発明は、新規結合タンパク質、癌または神経変性疾患の予防・治療剤などを提供する。具体的には、（a）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（b）配列番号：２７または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質は、例えば、癌などの予防・治療剤として、上記結合を促進する物質は、例えば神経変性疾患などの予防・治療剤として有用である。

Description

明細書
新規タンパク質複合体およびその用途 技術分野
本発明は、 新規結合タンパク質などに関する。 さらに詳しくは、 SemaphoriMB 、 Semaphorin4B-ML Semapliorin4B- M2または SemaphoriMB- M3と、該タンパク質と 結合しうるタンパク質との複合体、 該複合体に対する抗体、 該複合体の形成を阻 害または促進する抗体、 該複合体の解離を促進または阻害する抗体、 該複合体の 形成を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング、 該複合体の解 離を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング、 該スクリ一ニン グで得られうる化合物またはその塩、 癌または神経変性疾患の予防 ·治療剤、 診 断薬などに関する。 背景技術
遺伝子 Semaphorin4B (WO 00/012708号公報、 W0 00/078961号公報） （以下、 SEMA4B と略称することもある） 、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2または SEMA4B- M3 (以下、 これら 3種類の遺伝子を総称して SEMA4B- Msと略することもある） は、 癌細胞の細胞質膜 上に発現している 1回膜貫通型タンパク質をコードし、肺癌、卵巣癌、膝臓癌など のヒト癌組織で高発現しており、 これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは癌 細胞のァ.ポト一シスを誘発することから、 SEMA4Bおよび SEMA4B- Msは、 癌細胞の アポトーシス抑制を介して生存維持に関与していることが報告されている （ W02004/058817号公報） 。
また、 SEMA4Bは低酸素条件下で発現が上昇する遺伝子のひとつとして報告され ている （TO 02/46465号公報） 。 ジーンチップ解析に基づき SEMA4Bなどを含む数百 種の塩基配列が、 肺癌の診断または肺癌を治療する化合物の探索などに使用でき ると報告されている （W0 02/86443号公報） 。 SEMA4Bとアミノ酸レベルで 93%の相 同性を有する N0V7は、癌で発現亢進していることが報告されている （W0 02/06329 号公報） 。
ヒト Discs large homolog 1 (DLG1、 GenBank匪—004087· 1) は Bリンパ芽球細胞 由来のライブラリーからクローニングされた遺伝子であり、 ショウジヨウバエに おける癌抑制遺伝子 digのヒトホモログである （Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 91 巻、 9818- 9822頁、 1994年） 。 、 ヒト Discs large homolog 3 (DLG3、 GenBank NM_021120. 1) は、 胎児大脳由来 のライブラリ一からクローニングされた遺伝子であり、 DLG1と同様、 ショウジョ ゥバエにおける癌抑制遺伝子 digのヒトホモログである （Oncogene 14巻、 2425- 2433頁、 1997年） 。
DLG1および DLG3の生理的役割に関しては、癌抑制遺伝子 APCと複合体を形成し ;3 カテニンの分解を促進することによって細胞増殖を抑制することが報告されてい る (Oncogene 19巻、 365- 372頁、 2000年； Int. J. Cancer 86巻、 480- 488頁、 2000 年） 。 また、 DLG1に関しては有糸分裂期に活性化されるセリン Zスレオニンキナ —ゼである T0PK (PBK)に結合することにより細胞増殖に関与する可能性も指摘さ れている (Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 97巻、 5167- 5172頁、 2000年） 。 発明の開示 x
癌細胞や神経細胞に特異的に発現するタンパク質複合体を標的とし、 癌細胞の 増殖阻害を誘導する安全な癌の予防 ·治療剤、 および神経細胞の細胞死を抑制す る安全で優れた神経変性疾患の予防 ·治療剤が切望されている。
SEMA4Bまたは SEMA4B- Msが介在する抗アポトーシスシグナルを調節することに より、 癌細胞を死滅させ抗腫瘍効果を導き出す、 または、 神経細胞の細胞死を抑 制し神経変性疾患の予防 ·治療に役立てることが期待できるものの、 SEMA4Bまた は SEMA4B- Msの細胞内結合タンパク質または細胞内情報伝達経路に関する詳細な 報告は現時点では殆どなされていない。
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌抑制遺 伝子として機能している可能性が示唆されている DLG1および DLG3が、 SEMA4Bまた は SEMA4B- Msの細胞内領域と結合することを酵母ツーハイブリッド法 （Trends in Genet. 10巻、 286- 292頁、 1994年； Annu. Rev. Genet. 31巻、 663-704頁、 1997 年； The Yeast Two-Hybrid System, Oxford Univers i ty Press, Bartel and Fields, 1997年） を用いて見出し、 さらに、 SEMA4B依存性または SEMA4B- Ms依存性抗ァポト 一シスシグナルを調節する活性の評価方法を見出し、 これらの知見に基づき検討 を重ね、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 、
( 1 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体、
( l a ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 、 および（b)配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有する複合体、
( l b ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 、 および（b)配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有する複合体、
( 1 c ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 、 (b)配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 およ び（c)配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有 する複合体、
( I d ) 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、 配列番号： 2 7で表され るアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド である上記 （1 ) 記載の複合体、 (1 e) 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、 配列番号： 29で表され るアミノ酸配列の第 81番目〜第 353番目のアミノ酸配列を有するぺプチ、ドで ある上記 （1) 記載の複合体、
(2) 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記
(1) 記載の複合体、
(2 a) 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質である上記 （1) 記載の複合体、
(2 b) 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質が、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列 番号： 10で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である上記 （1) 記載の 複合体、 .
(3) 上記 （1) 記載の複合体に対する抗体、
(3 a) 上記 （1) 記載の複合体またはその部分に対する抗体、
(4) 上 し (1) 記載の複合体の形成を阻害する抗体、
(5) 上記 (1) 記載の複合体の解離を促進する抗体、
(6) 上記 (1) 記載の複合体の形成を促進する抗体、
(7) 上記 (1) 記載の複合体の解離を阻害する抗体、
(8) 上記 (4) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(9) 上記 (5) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(10) 上記 （6) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(11) 上記 （7) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(12) 癌細胞のアポト一シス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 -治 療剤である上記 （8) または （9) 記載の医薬、
(13) 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤であ る上記 （10) または （1 1) 記載の医薬、 (14) 上記 （3) 〜 （7) のいずれかに記載の抗体を含有してなる診断薬、
(15) 癌または神経変性疾患の診断薬である上記 （14) 記載の診断薬、
(16) (a)配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 27または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕ンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（a)記載のタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のス クリーニング方法、
(16 a) 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 産生する能力を有する細胞を用いることを特徴とする上記 （16) 記載のスクリ 一二ング方法、
(16 b) 配列番号： 27または配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞を用いることを特徴とする上記 (16) 記載のスクリーニング方法、
(16 c) 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、 配列番号： 27で表さ れるアミノ酸配列の第 142番目〜第 310番目のアミノ酸配列を有するぺプチ ドである上記 （16) 記載のスクリーニング方法、
(16 d) 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、 配列番号： 29で表さ れるアミノ酸配列の第 81番目〜第 353番目のアミノ酸配列を有するペプチド である上記 （16) 記載のスクリーニング方法、
(16 e) 配列番号： 26で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドが、 配列番号： 26で表さ れるアミノ酸配列を有するペプチドである上記 （16) 記載のスクリーニング方 法、
( 1 7 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 上記（a)記載のタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜、
( 1 7 a ) 上記 （1 6 ) 記載のスクリーニング方法または上記 （1 7 ) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 （a) 配列番号： 2 6で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9 で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害または促進す る化合物またはその塩、
( 1 7 b ) 化合物が、 （a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド またはその塩と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する化合物である、 上記 ( 1 7 a ) 記載の化合物またはその塩、
( 1 7 c ) 化合物が、 （a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物である、 上記 ( 1 7 a ) 記載の化合物またはその塩、
( 1 7 d ) 上記 （1 7 b ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 ( 1 7 e ) 上記 （1 7 c ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 ( 1 7 f ) 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防- 治療剤である上記 （1 7 d ) 記載の医薬、 、 ( 1 7 g ) 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤で ある上記 （1 7 e ) 記載の医薬、
( 1 8 ) (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩、
( 1 9 ) 上記 （1 8 ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポト 一シス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 ·治療剤、
( 2 0 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩、
( 2 1 ) 上記 （2 0 ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる神経細胞のアポ トーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤、
( 2 2 ) .(a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（a)記載のタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進または阻害する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法、
( 2 3 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩、 および（b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記（a)記載のタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進または阻害する化合物 またはその塩のスクリーニング用キット、
( 2 4 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進する化合物またはその 塩、
( 2 5 ) 上記 （2 4 ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポト ' 一シス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 ·治療剤、
( 2 6 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその 部分べプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を阻害する化合物またはその 塩、 .
( 2 7 ) 上記 （2 6 ) 記載の化合物またはその塩を含有してなる神経細胞のアポ トーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤、
( 2 8 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進 法または癌細胞の増殖阻害法、
(2 9 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の予防 ·治療法、 ( 3 0 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と ）配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩との結合を促進することを特徴とする神経細胞のアポトーシス阻 害法または神経変性疾患の予防 ·治療法、
( 3 1 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進することを特徴とする癌細胞のァ ポトーシス促進法または癌細胞の増殖阻害法、
( 3 2 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進することを特徴とする癌の予防 · 治療法、
( 3 3 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を含有する複合体の解離を阻害することを特徴とする神経細胞の アポトーシス阻害法または神経変性疾患の予防 ·治療法、
( 3 4 ) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩を用いることを特徴とする、 癌または神経変性疾患の予防 ·治 療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 、
( 3 5 ) 癌細胞のアポト一シス促進剤または癌細胞の増殖阻害剤を製造するため の、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（b)配 列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩との結合を阻害する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） の使用、
( 3 6 ) 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕 ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） の使用、
( 3 7 ) 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神释変性疾患の予防 ·治療剤を製 造するための、 （a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同 一もしぐは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩との結合を促進する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体 ) の使用、
( 3 8 ) 癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖阻害剤を製造するため の、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（b)配 列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩を含有する複合体の解離を促進する物質 （例、 化合物またはその塩） の使 用、 ( 3 9 ) 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進 する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） の使用、
( 4 0 ) 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤を製 造するための、 （a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を阻害する物質 （例、 化合物また はその塩、 抗体） の使用などを提供する。
さらに、 本発明は、
( 4 1 ) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質） を、 DLG1タン パク質または DLG3タンパク質に対する抗体を用いて、 固相 （例、 EIAプレート） に 固定化するか、 または、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を、 Tagタンパク質 (例、 Hi s- Tag、 GST (ダルタチオン- S -トランスフェラーゼ） 等） と融合させた後 、 固相に固定化し、 次いで、 （i) 標識剤 （例、 ピオチンなど） で標識した配列番 号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 SEMA4Bタン パク質） （例、 細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど） ） を、 固相化した DLG1タンパク 質または DLG3タンパク質に接触させる場合の結合量と、 （i i) 標識剤 （例、 ピオ チンなど） で標識した SEMA4Bタンパク質および試験化合物を、 固相化した DLG1夕 ンパク質または DLG3タンパク質に同時に接触させる場合の結合量とを測定し、 比 較し、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の場合に比べて、'約 2 0 %以 上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化合物 を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を阻害す る化合物として、 上記 （i i) の場合における活性が上記 （i) の場合に比べて、、約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試 験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合 を促進する化合物として選択することを特徴とする上記 （1 6 ) 記載のスクリー ニング方法
(ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質として、 該タンパク質の部分べ フ°チドを用いる場合には、 好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する部 分ペプチド （例、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸 配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど） などが 用いられる。 Tag付きタンパク質の固相への固定に際しては、 Hi s- Tagであれば二 ッケル、 GSTであればダルタチオンが用いられる） 、
( 4 2 ) 標識剤 （例、 ピオチンなど） で標識された配列番号： 2 6で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 SEMA4Bタンパク質） （例、 細胞質 側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配 列を有するペプチドなど） ） を、 アビジンで標識された固相 （例、 プレート） に 固定化し.、 次いで、 （i) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 ) を、 固相化した SEMA4Bタンパク質に接触させる場合の結合量と、 （i i) DLG1夕 ンパク質または DLG3タンパク質および試験ィヒ合物を、 固相化した SEMA4Bタンパク 質に同時に接触させる場合の結合量とを測定し、 比較し、 上記 （i i) の場合にお ける結合量が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1 タンパク質または DLG3タンパク質との結合を阻害する化合物として、 上記 （i i) の場合における活性が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク 質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を促進する化合物として選択 することを特徴とする上記 （1 6 ) 記載のスクリーニング方法 - (ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質として、 該タンパク質の部分べ プチドを用いる場合には、 好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する部 分ペプチド （例、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸 配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど） などが 用いられる。 ) 、 . ( 4 3 ) ( i ) 固相化した配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩 （以下、 SEMA4Bタンパク質） （例、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側ド メインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を 有するペプチドなど） など） に、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3夕 ンパク質）を接触させる場合の結合量と、 （i i)固相化した SEMA4Bタンパク質に、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質および試験化合物を同時に接触させる場合 の結合量とを、 測定し、 比較し、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の 場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 % 以上減少させる試験化合物を SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タン パク質との結合を阻害する化合物として、 上記 （i i) の場合における活性が上記 ( i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは 約 5 0 %以上増加させる試験化合物を SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を促進する化合物として選択することを特徴とする上記 ( 1 6 ) 記載のスクリーニング方法
(ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質は、 Tagタンパク質と融合させた タンパク質を用いてもよく、 その際には、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 を、該タンパク質に対する抗体で検出、定量してもよく、 また Tagタンパク質に対 する抗体で検出、 定量してもよい） 、
( 4 4 ) (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
(以下、 SEMA4Bタンパク質） の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなど） にレポ一夕 —遺伝子結合ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードする D NA、 およ び ） 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質） にレポーター遺 伝子転写活性化ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードする D N Aを酵 母 （例、 Saccharomyces cerevi s iae、 より好ましくは S. cerevi s iae Y190株） に おいて同時に発現させると、 ツーハイブリッドの作用により、 レポーター遺伝子 である /3—ガラクトシダーゼ遺伝子およびヒスチジン合成系遺伝子 HI S3の表現型 が発現し、 この酵母株を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 酵母株の /3—ガ ラクトシダ一ゼ活性を減少させるか、 または酵母株をヒスチジン要求性に転換さ せる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質と の結合を阻害する化合物として選択することを特徴とする上記 （1 6 ) 記載のス クリーニング方法、
( 4 5 ) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質） を、 DLG1タン パク質または DLG3タンパク質に対する抗体を用いて、 固相 （例、 EIAプレート） に 固定化するか、 または、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を、 Tagタンパク質
(例、 Hi s-Tag, GST (ダルタチオン- S-トランスフェラ一ゼ） 等） と融合させた後 、 固相に固定化し、 次いで、 （i) 標識剤 （例、 ピオチンなど） で標識した配列番 号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 SEMA4Bタン パク質） （例、 細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど） ） を、 固相化した DLG1タンパク 質または DLG3タンパク質に接触させる場合の結合量と、 （i i) 標識剤 （例、 ピオ チンなど） で標識した SEMA4Bタンパク質および試験化合物を、 固相化した DLG1夕 ンパク質または DLG3タンパク質に同時に接触させる場合の結合量とを測定し、、 比 較し、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以 上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化合物 を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離 を促進する化合物として、 上記 （i i) の場合における活性が上記 （i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加 させる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 との複合体の解離を阻害する化合物として選択することを特徴とする上記 （2 2 ) 記載のスクリーニング方法
(ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質として、 該タンパク質の部分べ プチドを用いる場合には、 好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する部 分ペプチド （例、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸 配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど） などが 用いられる。 Tag付きタンパク質の固相への固定に際しては、 Hi s-Tagであれば二 ッケル、 GSTであればダルタチオンが用いられる） 、
( 4 6 ) 標識剤 （例、 ピオチンなど） で標識された配列番号： 2 6で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 SEMA4Bタンパク質） （例、 細胞質 側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配 列を有するペプチドなど） ） を、 アビジンで標識された固相 （例、 プレート） に 固定化し、 次いで、 （i) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 ) を、 固相化した SEMA4Bタンパク質に接触させる場合の結合量と、 （i i) DLG1夕 ンパク質または DLG3タンパク質および試験化合物を、 固相化した SEMA4Bタンパク 質に同時に接触させる場合の結合量とを測定し、 比較し、 上記 （i i) の場合にお ける結合量が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1 タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離を促進する化合物として、、上 記 （i i) の場合における活性が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好まし くは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物を、 SEMA4B タンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離を阻害する 化合物として選択することを特徴とする上記 （2 2 ) 記載のスクリーニング方法 (ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質として、 該タンパク質の部分べ プチドを用いる場合には、 好ましくは SEMA4B夕ンパク質との結合活性を有する部 分ペプチド （例、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸 配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど） などが 用いられる。 ） 、
( 4 7 ) ( i ) 固相化した配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド またはその塩 （以下、 SEMA4Bタンパク質） （例、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側ド メインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を 有するペプチドなど） など） に、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タ ンパク質）を接触させる場合の結合量と、 （i i)固相化した SEMA4Bタンパク質に、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質および試験化合物を同時に接触させる場合 の結合量とを、 測定し、 比較し、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の 場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 % 以上減少させる試験化合物を SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タン パク質との複合体の解離を促進する化合物として、 上記 （i i) の場合における活 性が上記 （ i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好 ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物'を SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク 質または DLG3タンパク質との複合体の解離を阻害する化合物として選択すること を特徴とする上記 （2 2 ) 記載のスクリーニング方法
(ここで、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質は、 Tagタンパク質と融合させた タンパク質を用いてもよく、 その際には、 DLG1タンパク質または DLG3タンパ夕質 を、該タンパク質に対する抗体で検出、定量してもよく、 また Tagタンパク質に対 する抗体で検出、 定量してもよい） 、
( 4 8 ) (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩
(以下、 SEMA4Bタンパク質） の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなど） にレポータ —遺伝子結合ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードする D NA、 およ び（b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチ ドまたはその塩 （以下、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質） にレポーター遺 伝子転写活性化ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードする D NAを酵 母 （例、 Saccharomyces cerevisiae, より好ましくは S. cerevis iae Y190株） に おいて同時に発現させると、 ツーハイブリッドの作用により、 レポ一夕一遺伝子 ' である /3—ガラクトシダーゼ遺伝子およびヒスチジン合成系遺伝子 HIS3の表現型 ' が発現し、 この酵母株を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 酵母株の /3—ガ ラクトシダーゼ活性を減少させるか、 または酵母株をヒスチジン要求性に転換さ せる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質と の複合体の解離を促進する化合物として選択することを特徴とする上記 （1 6 ) 記載のスクリーニング方法を提供する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質を、 SEMA4B夕ンパク質と称することもある。 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質を、 DLG1タンパク質と称する。 配列番号： 2 9で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパ ク質を、 DLG3タンパク質と称する。
SEMA4Bタンパク質、 DLG1タンパク質および]) LG3タンパク質を、 まとめて、 本発 明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と略称することもある。 ， 本発明のタンパク質は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウ ス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細 胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 i3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞 、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T 細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 赤血球、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前,駆細胞、 幹細胞もし くは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質 、 延髄、 小脳） 、' 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆の う、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管 心臓、 胸 腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格 筋、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、 MEL， Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI-3 , HL-60, JOSK-1, K562, ML- 1, MOLT- 3， MOLT - 4， MOLT- 10, CCRF-CEM, TALL- 1， Jurkat , CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT- 78， HUT- 102 , H9, U937, THP-1 , HEL ， JK-1, CMK, K0-812, MEG- 01など） などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 本発明のタンパク質 は、 C末端がカルボキシル基 (-C00H)、カルボキシレート（-C00—)、アミド (-隱2 ) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3—8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチル などの C 6—12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C Mァ ルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー C卜2アルキル基など の C 7— 14ァラルキル基、 ピバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレート ) を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているも のも、 本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上 記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 Ν末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノ ィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成 する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 （例えば一 OH、 _ S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インド —ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基 などの アルカノィル基などの C HJァシル基など） で保護されているもの、 あ るいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ る。
以下のアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Bas ic Local Al ignment Search Tool ) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；マトリクス =BL0SUM62； フィルタリング =0FF) にて計算することができる。
SEMA4Bタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号 ： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有する夕ンパク質などが用いられる。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8 %以上 、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。 、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては 、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、' 前記の配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミ.ノ酸配列として は、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する ァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学 的に） 同質であることを示す。 上記活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好 ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好まし いが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていて もよい。
また、 SEMA4Bタンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4 、 配列番号：' 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 (例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 （i i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (例えば 1〜1 0◦個程度、 好ましくは.1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個 程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列 、 (iv) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： Ίまたは配列畚号： 1 0で表 されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または（V)それらを 組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンも含ま れる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入 、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
SEMA4Bタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列 番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
SEMA4B夕ンパク質の部分べプチドとしては、 前記した SEMMB夕ンパク質の部分 ペプチドであって、 好ましくは、 SEMA4Bタンパク質と同様の性質を有するもので あればいずれのものでもよい。
例えば、 SEMA4Bタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個 以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用い られる。
具体的には、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなどが あげられる。 .
配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列としては、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミ ノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以 上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ る。
配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 7 または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有し、 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理学 的に） 同質であることを示す。 上記活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好 ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好まし いが、 これらの活性の程度、 タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていて もよい。
DLG1タンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配 列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度 、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列に 1また は 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミ ノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （ 例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1 〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸 配列、 または（V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質など のいわゆるムテインも含まれる。
DLG3タンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配 列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度 、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列に 1また は 2個以上 （例えば 1 ~ 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミ ノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （ 例えば 1〜； 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜 1 0個程 度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1 〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸 配列、 または（V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質など のいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入 、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
DLG1タンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 2 7で表されるァミノ 酸配列を含有する夕ンパク質などが挙げられる。
DLG3タンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 2 9で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
DLG1タンパク質または DLG3タンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した DLG1 タンパク質または DLG3タンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記し た DLG1タンパク質または DLG3タンパク質と同様の性質を有するものであればいず れのものでもよい。
例えば、 DLG1夕ンパク質または DLG3夕ンパク質の構成ァミノ酸配列のうち少な くとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有する ペプチドなどが用いられる。 DLG1タンパク質の部分ペプチドの具体例としては、 配列番号： 2 7で表される アミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目のアミノ酸配列を有する部分べプチ ドなどが挙げられる。 .
DLG3タンパク質の部分ペプチドの具体例としては、 配列番号： 2 9で表される アミノ酸配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド などが挙げられる。
また、 本発明のタンパク質の部分ペプチド （本発明で用いられる部分ペプチド ) は、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸 配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 その アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 ま たは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜1 0個程度、 よ り好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸 で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （-C00H) 、 カルボキシレート （- C00— ) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れ であってもよい。
さらに.、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した、 本発明のタンパク 質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有して いるもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で 保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロ グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合べ プチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 生理学的に許容さ れる酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては 、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるい は有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク 酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼ ンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩は、 後述の参考例 に従って、 または前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタン パク質の精製方法によって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 ま た、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ 卜グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。 . .
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそのアミド体 の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのよう な樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール 樹脂、 4 メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチ ルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' ， 4 ' —ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ル _ F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを 挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当 に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の各種縮 合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質または部 分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子 内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部分ペプチド またはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N， ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' — ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t， HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド, N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約ー2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないように することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ 力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシカル ポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。 カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2ーァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一 ニトロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （CH アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ピラニル基、 t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z l、 C l 2— B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t—ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum、 Bo c、 T r t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N ーヒドロキシフタルイミド、 H〇B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイ ド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2一エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され 、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 ,. 2—エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミ ド化して保護した後 、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプ チド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ぺプ チドと C.末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺ プチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶 媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得 られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗 タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望の夕ンパク質またはぺプチドのアミド体を得ることがで きる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸のひ一力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断する ことによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相 合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用いられる部 分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合させ 、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを 製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下 の （i ) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。 .
( i ) M. Bodanszky および M. A. Ondet t i , ペプチド · シンセシス（Pept ide Synthes is) , Interscience Publ ishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ-ペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年)
(i i i) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv)矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 （1977年）
(v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグラ フィ一 · .液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発明 のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 好ましくは D NAである。 D NAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由 来の c D NAライブラリ一、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total R N Aまたは m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する) によって増幅することもできる。
SEMA4Bタンパク質をコードする D N Aとしては、 例えば、
(i)配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 2で 表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配 列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質 的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(i i) 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 5 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(i i i)配列番号： 8で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 8 で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(iv) 配列番号： 1 1で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N Aであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8以上、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 5で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブ リダィズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1 1で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。 塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Bas ic Local Al ignment Search Tool) を用レ、 以下 の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコア = 1 ；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
八イブリダィゼ一ションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行な.うことができる 。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 1 9〜 4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が最も好ましい。
より具体的には、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D NAまたは配列番号： 3で表される塩基配列を含有する D NAなどが、 （i i) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NA としては、 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する D NAまたは配'列番号： 6で表される塩基配列を含有する D NAなどが、 （i i i)配列番号： 7で表される アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 8 で表される塩基配列を含有する D NAまたは配列番号： 9で表される塩基配列を 含有する D NAなどが、 （iv) 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 1 1で表される塩基配列 を含有する D NAまたは配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D NAな どが用いられる。 、 DLG1タンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2 8で表さ れる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 2 8で表される塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 配列番号 ： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有 するタンパク質をコードする D N Aなどが挙げられる。
DLG3タンパク質をコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 3 0で表さ れる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 0で表される塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を含有し、 配列番号 ： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有 するタンパク質をコードする D N Aなどが挙げられる。
配列番号： 2 8または配列番号： 3 0で表される塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2 8 または配列番号： 3 0で表される塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 % 以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional Center for Biotechnology Informat ion Basic Local Al ignment Search Tool) を用レ、 以下 の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；フィルタリング =0N；マッチスコア = 1 ；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる 。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 、 好ましくは約 6 0 〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65 の 場合が最も好ましい。
具体的には、 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を コードする DNAとしては、 配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコー ドする DNAとしては、 配列番号： 30で表される塩基配列を含有する DNAな どが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DNA ) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を 含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細胞 -組 織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
SEMA4Bタンパク質の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 11で表される塩基配 列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： .2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 SEMA4Bタンパク質と実質 的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DNAの一部分を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 11で表される 塩基配列とハイブリダィズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
DLG1タンパク質の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番 号： 28で表される塩基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または 配列番号： 28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする塩基配列を含有し、 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一 部分を含有する DN Aなどが用いられる。 DLG3タンパク質の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 3 0で表される塩基配列を含有する D NAの一部分を有する D NA、 または 配列番号： 3 0で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ、リ ダイズする塩基配列を含有し、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NAの一 部分を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2 8または配列番号： 3 0で表される塩基配列とハイブリダィズで きる D NAは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダィゼーシヨンの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同. 様のものが用いられる。
本発明のタンパク質およびその部分ペプチド （以下、 これらをコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク 質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAのクロ一ニングの手段とし ては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 D NAプ ライマ一を用いて P C R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込 んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする D N A断片 もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼーションによって 選別する.ことができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキユラ 一 ·クローニンク (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また 、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って 行なうことができる。
D NAの塩基配列の変換は、 P C R、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (Takara Bio (株) ) 、 Mutan™-K (Takara Bio (株) ) 等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに 準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質を'コードする D N Aは目的によりそのまま、 まだ は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 D NAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての A T Gを有し、 ま た 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダプターを用いて付加することもできる。 ， 本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。 .
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322, pBR32 5， pUC 12， pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10, pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH19， pSHl 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス ， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 p A 1 - 1 1、 pXT 1、 ρ Rc/CMV、 pRc/RSV、 p c D NA I /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモータ一であればいかなるものでもよい。 例えば、 .動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモータ一、 SV40プロモ一夕一、 LTRプ 口モータ—、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモー夕一、 SRひプロモ —ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ ター、 l a cプロモー夕一、 r e cAプロモータ一、 APLプロモ一 夕一、 l ppプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SP01プロモータ一、 SP02プロモータ一、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモ一夕一 、 GAPプロモーター、 ADHプロモータ一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある) 遺伝子 〔メソトレキセート (MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp fと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル配列 、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合 は、 M Fa 'シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞であ る場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 a—インターフェロン ·シグナル配 列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Aを含有する ベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) K12 - DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60巻， 160 (1968)〕 ， JM 1 03 -[Nucleic Acids Research, 9巻， 309 (1981)〕 , J A 22 1 Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 , HB 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 , C 600 CGenetics, 39巻， 440 (1954)〕 などが用いら れる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis ) M I 1 14 [Gene, 24巻， 255 (1983)〕， 207 - 21 (Journal of Biochemistry, 95 巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R— , ΝΑ87 - 11 A, DKD- 5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schi.zosaccharomyces pombe) NCY C 1913, NCYC2036、 ピキア パス卜リス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが AcNPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Triclioplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bonibyx mori N細胞； BmN細胞 ) などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711 ) 、 S f 21細胞 (以上、 Vaughn, L L.ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) など が用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d.h f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエ口一マ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻, 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことがで きる。 .
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 168 巻， 111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、 Methods inEnzymology, 194巻, 182-187 (1991) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻, 1929 (1978) などに記載の方法に従って行 なうことができる。
昆 虫 細 胞 ま た は昆 虫 を 形質 転換す る に は 、 例 え ば、 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻, 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする D NAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。 、 宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、. 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Mi l ler) ， Journal of Experiments in Molecular Genet ics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい 。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 j3—ィ ンドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜4 0でで約 6〜2 4時間行な レ、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダ一 (Burkholder) 最小培地 CBost ian, K. L. ら、 Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 77巻, 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bi t ter, G. A. ら、 Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 81巻， 5330 (1984)〕 が挙げられる。 培地の p H は約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 °C〜 3 5でで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Med ium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜5日間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 、 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜2 0 %の胎児牛血清を含む M E M培地 [Sc ience, 122巻， 501 (1952) ] , D M E M 培地 [Virology, 8巻, 396 (1959) ] , R P M I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Medical Associat ion 199巻， 519 (1967) ] , 1 9 9培地 [Proceeding of the Soc iety for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 〜4 0 で約1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X - 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が 分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上 清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ.卜 リブシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ一 ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウェスタンブロッテイングなどにより測定することができる。 以下、 SEMA4B夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を、単に SEMA4B タンパク質と、 DLG1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、 単に DLG1タンパク質と、 DLG3タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を、 単に DLG3タンパク質とそれぞれ略記する。
(1) SEMA4Bタンパク質および DLG1タンパク質を含有する複合体 （好ましくは、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質が結合した複合体） 、 （2) SEMA4Bタンパク質 および DLG3タンパク質を含有する複合体 （好ましくは、 SEMA4Bタンパク質と DLG3 タンパク質が結合した複合体） 、 （3) SEMA4Bタンパク質、 DLG1タンパク質および DLG3タンパク質を含有する複合体 （好ましくは、 SEMA4Bタンパク質、 DLG1タンパ ク質および DLG3タンパク質が結合した複合体） などを、 まとめて本発明の複合体 と略称することもある。
本発明の複合体は、 SEMA4Bタンパク質、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 に加え、 上記以外のタンパク質、 ペプチド、 RNA、 核酸、 脂質、 糖類、 アミド基、 リン酸基などを含んでいてもよい。 例えば、 SEMA4Bタンパク質、 DLG1タンパク質 および DLG3タンパク質は、 アミド化されていてもよく、 リン酸化されたアミノ酸 を含んでいてもよく、 脂質 （例、 ミリスチン酸など） 結合アミノ酸を含んでいて もよく、 いかなる翻訳後修飾を受けていても限定されない。 翻訳後修飾を受ける 領域として、 例えば、 配列番号： 2 6で表わされるアミノ酸配列に相当する領域 などが挙げられる。 、 本発明の複合体としては、 例え 、 ( 1) SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメイン (例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど） と DLG1夕 ンパク質 （好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する領域） とが結合し ている複合体、 （2) SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメイン （例、 配列番号： 2 6 で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど） と DLG3タンパク質 （好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する領域） とが結合している複合体、 （3) . SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメイン （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸 配列を有するペプチドなど） 、 DLG1タンパク質 （好ましくは SEMA4Bタンパク質と の結合活性を有する領域） および DLG3夕ンパク質 （好ましくは SEMA4B夕ンパク質 との結合活性を有する領域） が結合している複合体などが挙げられる。
DLG1タンパク質の、 SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する領域としては、 例 えば、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目が 挙げられる。
DLG3タンパク質の、 SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する領域としては、 例 えば、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目が挙 げられる。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説 明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対す る抗体、 および本発明の複合体に対する抗体 （以下、 まとめて本発明の抗体と略 称することもある） は、 本発明のタンパク質または本発明の複合体を認識し得る 抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい 。
さらに、 本発明の抗体には、 本発明の複合体の形成を阻害する抗体、 本発明の 複合体の形成を促進する抗体、 本発明の複合体の解離を促進する抗体、 本発明の 複合体の解離を阻害する抗体も含まれる。 このような抗体としては、 SEMA4Bタン パク質、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質に対する抗体、 特に、 WO 2 0 0 4 / 5 8 8 1 7に記載されている SEMA4Bタンパク質に対する抗体などが好ましく 用いられる。
より具体的には、 SEMA4Bタンパク質に対する抗体としては、 、
( 1 )配列番号： 1の 402番目から 412番目までのアミノ酸配列、 またはその C末端 に Cysを付加したアミノ酸配列、
( 2 ) 配列番号： 1の 582番目から 596番目までのアミノ酸配列、
( 3 )配列番号： 1の 781番目から 794番目までのアミノ酸配列、 またはその C末端 に Cysを付加したアミノ酸配列、 または
( 4 )配列番号： 1の 797番目から 809番目までのアミノ酸配列、 またはその C末端 に Cysを付加したアミノ酸配列などを認識する抗体などが用いられる。
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質または本発明の複合体もしくはその一部 を抗原 （以下、 抗原タンパク質と略することもある） として用い、 自体公知の抗 体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
抗原タンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ 自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高め るため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを投与し てもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用い られる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好まし く用いられる。
モノク口一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化夕 ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミ ルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)] に従い実施することができる。 融 合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコ一ル （PEG) やセンダイウイ ルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。 ' 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 S P 2/0, AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°C で 1 ~ 10分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎仔血清を含む RPMI 164 0培地、 1〜10%の牛胎仔血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) ある いはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） など を用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37°Cで ある。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養 は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体 価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 ( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、、ィ オン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から抗原タンパク質に対 する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造することが できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアーダンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1.〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイン卜アジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。 抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで さる。
以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べプチ ドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発明 の抗体、 および本発明の複合体などの用途を説明する。
〔1〕 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
SEMA4Bタンパク質は癌組織で発現が亢進しており、 さらに、 SEMA4Bタンパク質 の機能 （活性、 発現など） を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。
また、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質は、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側 ドメインに結合し、 SEMA4Bタンパク質の機能を担っていると考えられる。
従って、 本発明の複合体の形成を阻害する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗 体） 、 例えば、 （1) SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質との結合、 または （2) SEMA4Bタンパク質と DLG3タンパク質との結合を阻害する物質 （例、 化合物または その塩、 抗体） は、 癌細胞のアポトーシス誘導作用を有し、 例えば、 癌 （例、 大 腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤などとして使用することがで きる。
本発明の複合体の形成を促進する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） 、 例 えば、 （1) SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質との結合、 または （2) SEMMB夕 ンパク質と DLG3タンパク質との結合を促進する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体）は、神経細胞のアポトーシス抑制作用を有し、例えば、神経変性疾患（例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性 アルツハイマー病など） などの予防 ·治療剤、 神経細胞のアポトーシス阻害 （抑 制） 剤などとして使用することができる。
本発明の複合体の解離を促進する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） 、 例 えば、 （3) SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質との複合体、 または （4) SEMA4B タンパク質と DLG3タンパク質との複合体の解離を促進する物質 （例、 化合物また はその塩、 抗体） は、 癌細胞のアポトーシス誘導作用を有し、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤、 癌細胞のアポト一シス促進剤などとして使用することがで きる。
本発明の複合体の解離を阻害する物質 （例、 化合物またはその塩、 抗体） 、 例 えば、 （3) SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質との複合体、 または （4) SEMA4B タンパク質と DLG3タンパク質との複合体の解離を阻害する物質 （例、 化合物また はその塩、 抗体） は、 神経細胞のアポ卜一シス抑制作用を有し、 例えば、 神経変 性疾患 （例、 アルツハイマー病 (家族性アルツハイマー病、 若年性ァルツハイマ —病、 孤発性アルツハイマー病など） などの予防'治療剤、 神経細胞のアポトー シス阻害 （抑制） 剤などとして使用することができる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 上記 （1) 〜 （2) の結合を阻害または促 進する化合物またはその塩、 または上記 （3) 〜 （4) の複合体の解離を促進また は阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。 すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする、 上記 （1 ) 〜 （2) の結合を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法 または上記 （3) 〜 （4) の複合体の解離を促進または阻害する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法には、 本発明のタンパク質が用いられ、 さらには 、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメインに相当するペプチドが用いられてもよい 。 また、 本発明のスクリーニング方法は、 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞 （好ましくは、 本発明のタンパク質をコードする D NAで形質転換さ れた形質転換体 （例、 酵母、 動物細胞などの細胞など） ） が用いられてもよい。 該細胞としては、例えば、 （a) SEMA4Bタンパク質をコードする D NA (例、 SEMA4B 夕ンパク質の細胞質側ドメインに相当するペプチドをコードする D N A) および (b)DLGlタンパク質または DLG3タンパク質をコードする D NAで形質転換された 形質転換体が用いられる。
〔1 a〕 In vi tro結合試験によるスクリーニング
DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク 質に対する抗体を用いて、固相（例、 EIAプレート）に固定化するか、 または、 DLG1 タンパク質または DLG3タンパク質を、 Tagタンパク質 （例、 His- Tag、 GST (ダルタ チオン- S-トランスフェラーゼ） 等） と融合させた後、 固相に固定化する。
DLG1タンパク質または DLG3タンパク質として、 該タンパク質の部分ペプチドを 用いる場合には、 好ましくは SEMA4Bタンパク質との結合活性を有する部分べプチ ド （例、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列の第 1 4 2番目〜第 3 1 0番目 のアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列の第 8 1番目〜第 3 5 3番目のアミノ酸配列を有するペプチドなど） などが用いられ る。
Tag付きタンパク質の固相への固定に際しては、 His-Tagであればニッケル、 GST であればダルタチオンが用いられる。
(i) 標識剤 （例、 ピオチンなど） で標識した SEMA4Bタンパク質.（例、 細胞質側 ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列 を有するペプチドなど） ） を、 固相化した DLG1タンパク質または DLG3タンパク質 に接触させる場合の結合量と、 （i i)標識剤（例、ピオチンなど）で標識した SEMA4B タンパク質 （例、 細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチドなど） ） および試験化合物を、 固相 化した DLG1タンパク質または DLG3タンパク質に同時に接触させる場合の結合量と を測定し、 比較する。
結合量は、 公知の方法、 例えば、 固相化された SEMA4Bタンパク質を、 標識剤 （ 例、 ピオチンなど） を検出する市販のキットまたは SEMA4Bタンパク質に対する抗 体を用いて、 測定する。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
例えば、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化 合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を阻 害する化合物 （以下、 結合阻害剤と略記する場合がある） として、 上記 （i i) の 場合における活性が上記（i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、好ましくは 3 0 % 以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質 と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を促進する化合物 （以下、 結合 促進剤と略記する場合がある） として選択する。
また、 例えば、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる 試験化合物を、 SEMA4Bタンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複 合体の解離を促進する化合物（以下、解離促進剤と略記する場合がある）として、 上記 （i i) の場合における活性が上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ま しくは 3 0 %以上、より好ましくは約 5 0 %以上増加させる試験化合物を、 SEMA4B タンパク質と DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離を阻害する 化合物 （以下、 解離阻害剤と略記する場合がある.） として選択する。
また、 SEMA4Bタンパク質 （例、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメインに相当す る部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチド など） など） を固相に固定化し、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を接触さ せ、 同様に結合量を測定してもよい。 SEMA4Bタンパク質 （例、 SEMA4Bタンパク質 の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるァ ミノ酸配列を有するペプチドなど） など） を固相へ固定化する際には、 標識剤 （ 例、 ピオチンなど） で標識された SEMA4Bタンパク質、 およびアビジンで標識され た固相 （例、 プレート） が好ましく用いられる。
(i i i) 固相化した SEMA4Bタンパク質（例、 SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメイ ンに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を有す るペプチドなど） など） に、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を接触させる 場合の結合量と、 （iv) 固相化した SEMA4Bタンパク質 （例、 SEMA4Bタンパク質の 細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号： 2 6で表されるアミ ノ酸配列を有するペプチドなど） など） に、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク 質および試験化合物を同時に接触させる場合の結合量とを、 測定し、 比較する。 結合量は、 公知の方法、 例えば、 固相化された DLG1タンパク質または DLG3タン パク質を、 該タンパク質に対する抗体を用いて、 測定する。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
この方法において、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質は、 Tagタンパク質と 融合させたタンパク質を用いてもよく、 その際には、 DLG1タンパク質または DLG3 タンパク質を、該タンパク質に対する抗体で検出、定,量してもよく、 また Tagタン パク質に対する抗体で検出、 定量してもよい。
例えば、 上記 （iv) の場合における結合量が上記 （i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験 化合物を結合阻害剤として、 上記 （iv) の場合における活性が上記 （i i i) の場合 に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上 増加させる試験化合物を結合促進剤と 'して選択する。
また、 上記 （iv) の場合における結合量が上記 (i i i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上減少させる試験化 合物を解離促進剤として、 上記 （iv) の場合における活性が上記 （i i i) の場合に 比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上増 力 Πさせる試験化合物を解離阻害剤として選択する。
〔1 b〕 ツーハイプリッド法によるスクリーニング
〔1 b— 1〕 酵母ッ一ハイプリッド法によるスクリーニング
(a) SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列 番号： 2 6で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなど） にレポ一夕一遺 伝子結合ドメインを融合させたキメラタンパク質をコードする D NA、および（b ) DLG1タンパク質または DLG3タンパク質にレポーター遺伝子転写活性化ドメイン を融合させたキメラタンパク質をコードする D N Aを酵母 （例、 Saccharomyces cerevis iae, より好ましくは S. cerevisiae Y190株) において同時に発現させる と、 ッ一ハイブリツドの作用により、 レポ一ター遺伝子である /3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子およびヒスチジン合成系遺伝子 HIS3の表現型が発現する。 この酵母株 を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 酵母株の —ガラクトシダーゼ活性を 減少させるか、 または酵母株をヒスチジン要求性に転換させる試験化合物を、 結 合阻害剤または解離促進剤として選択する。
該酵母株は、 上記した宿主が酵母である形質転換体の培養と同様に培養できる 。 /3—ガラクトシダ一ゼの活性は、 X- Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranos ide) 、 ONPG (o-ni trophenyl j3 -D-galactopyranos ide) また は CPRG (c lorophenyl red- i3 -D-galactopyranos ide) を基質として公知の方法に 従って測定することができる。 HIS3表現型の発現は、 ヒスチジン欠損の最小培地 で酵母を培養することにより測定することができる。
選択された化合物のうち、 細胞毒性のある化合物、 およびレポ一夕一遺伝子産 物との相互作用などでレポーター遺伝子産物自身の活性を阻害する化合物などは 、 擬陽性化合物として除外する。
〔 1 b— 2〕 動物細胞ツーハイブリッド法によるスクリーニング
動物細胞 （例、 CH0細胞など） にレポ一夕一遺伝子 （例、 クロラムフエ二コール ァセチルトランスフェラーゼ （CAT) 遺伝子、 ホ夕ルルシフェラーゼ遺伝子など） を導入する。 レポーター遺伝子の転写調節領域は、 例えば動物細胞で機能するプ ロモ—ター （例、 アデノウイルス Elb由来の最小プロモーター （TATA box) など） の下流に、 例えば GAL1の転写活性化配列 （UAS) を結合したものを用い、 酵母ツー ハイプリッドシステムの GAL4- GAL1の転写調節系を動物細胞内に導入し、動物細胞 内でレポーター遺伝子の発現が誘導されるようにする。得られる細胞に対し、 （a ) SEMA4Bタンパク質の細胞質側ドメインに相当する部分ペプチド （例、 配列番号 ： 2 6で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチド） に GAL4-DNA結合ドメイン を融合させたキメラタンパク質をコードする D NA、 および 00 DLG1タンパク質 または DLG3タンパク質に単純へルぺスウィルス由来 VP16タンパク質を融合させた キメラタンパク質をコードする D NAを同時に発現させると、 ツーハイプリッド の作用により、 レポ一ター遺伝子が発現する動物細胞株が得られる。 この細胞株 を試験化合物の存在下、 一定時間培養し、 レポーター遺伝子産物の活性を測定し 、 活性を減少させる化合物を、 結合阻害剤または解離促進剤として選択する。 該動物細胞株は、 上記した宿主が動物細胞である形質転換体の培養と同様に培 養できる。 レポーター遺伝子産物 （例、 CAT, ルシフェラ一ゼなど） の活性は、 公 知の方法に従って、 市販のキットを用いて測定できる。
選択された化合物のうち、 細胞毒性のある化合物、 およびレポーター遺伝子産 物との相互作用などでレポ一タ一遺伝子産物自身の活性を阻害する化合物などは 、 擬陽性化合物として除外する。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
本発明のスクリーニング用キットは、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質を 含有し、 さらに SEMA4Bタンパク質 （例、 細胞質側ドメインに相当する部分べプチ ドなど） を含有していてもよい。 また、 本発明のスクリーニング用キットは、 本 発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞 （好ましくは、 本発明のタンパク 質をコードする D NAで形質転換された形質転換体 （例、 酵母、 動物細胞などの 細胞） ） を含有する。 該細胞は、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質をコード する D NA、 および SEMA4Bタンパク質 （例、 細胞質側ドメインに相当する部分べ プチドなど） をコードする D NAで形質転換された形質転換体であってもよい。 本発明のスクリ一二ング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記試験化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出 液、 血漿など） から選ばれた化合物であり、 例えば、 SEMA4Bタンパク質と、 DLG1 タンパク質または DLG3タンパク質との結合を阻害または促進する化合物、 または SEMA4Bタンパク質と、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離を 促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
SEMA4Bタンパク質と、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との結合を阻害す る化合物は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として、 または癌細胞のァ ポトーシス促進剤として有用である。
SEMA4B夕ンパク質と、 DLG1タンパク質または DLG3夕ンパク質との結合を促進す る化合物は、 例えば、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病 （家族性ァルツハイ マー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） などの予防， 治療剤として、 または神経細胞のアポトーシス阻害 （抑制） 剤として有用である
SEMA4B夕ンパク質と、 DLG1タンパク質または DLG3夕ンパク質との複合体の解離 を促進する化合物は、 例えば、癌（例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状 腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として、 または癌細 胞のアポト一シス促進剤として有用である。
SEMA4Bタンパク質と、 DLG1タンパク質または DLG3タンパク質との複合体の解離 を阻害する化合物は、 例えば、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病 （家族性ァ ルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など) など の予防 '治療剤として、 または神経細胞のアポトーシス阻害 （抑制） 剤として有 用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例 えば、 上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油 性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液として は、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いら れ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコー ル （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール) 、 非イオン界面活性 剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyet ylene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば 、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記化合物またはその塩を通常 の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記化合物が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用を 生じない.限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投 与することができる。
該化合物 （好ましくは結合阻害剤または解離促進剤） またはその塩の投与量は 、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば 、 乳癌の治療の目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜1 0 O m g 、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する 。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で該化合物を注射 剤の形で通常成人 （体重 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物 またはその塩を約 0 . 0 1〜3 O m g、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g、 より好 ましくは約 0 . 1〜1 O m gを癌病変部に注射により投与するのが好都合である 。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる
〔2〕 本発明の複合体の定量
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質または本発明の複合体を特異的に認識す ることができるので、 被検液中の本発明のタンパク質または本発明の複合体の定 量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質または本発 明の複合体とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタン パク質または本発明の複合体の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発 明のタンパク質または本発明の複合体の定量法、 および
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質または本発明の複合 体の定量法を提供する。
上記 （i i) の定量法においては、 2種類の抗体が本発明のタンパク質または本 発明の複合体の異なる部位を認識する抗体であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質または本発明の複合体に対するモノクローナル抗体 (以下、 本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある） を用い本発明の複合 体の定量を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これら の目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、 また、抗体分子の F (ab' ) 2 、 Fab' 、 あるいは Fab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質または本発明の複合体の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量 ) に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手 段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線よ り算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリ一、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる が、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔"c〕 などが用いられる。 上記酵素としては 、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダーゼ、 β— ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フル ォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いるこ ともできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラ.ス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明の複合体量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆 の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよ い。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用 いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目 的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質または本発明の複合体の測 定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体 は、 本発明のタンパク質または本発明の複合体の結合する部位が相異なる抗体が 好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 SEMA4Bタンパク質の C端部によって形成 されている複合体部分を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましく はその部位以外、 例えば SEMA4Bタンパク質の N端部によって形成されている複合 体部分を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、. 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZ F分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一な どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の複合体の測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照 することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGY 」 Vol. 70 (Immunochemical Techniaues (Part A) )、 同書 Vol. 73 (I匪画 chemical Techniaues (Part B) ) , 同書 Vol. 74 (I匪 unochemical Techniques (Part C) )、 同 書 Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D: Selected Immunoassays) ) 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E:Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) 、 同 書 Vol. 121 (I匪画 chemical Techniaues (Part I :Hybr idoia Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 または本発明の複合体を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質または本発明の複合体の 濃度を定量することによって、 本発明のタンパク質または本発明の複合体の濃度 の増加が検出された場合、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道 癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などである、 または将来罹患する可 能性が高いと診断することができる。 一方、 本発明の抗体を用いて本発明の複合 体の濃度を定量することによって、 本発明の複合体の濃度の低下が検出された場 合、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病 （家族性アルツハイマー病、 若 年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） などである、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質または本発明の複合体を検出するために使用することができる。 また、 本発 明の複合体を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本 発明の複合体の検出、 被検細胞内における本発明の複合体の挙動の分析などのた めに使用することができる。
〔3〕 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 本発明の複合体の形成を阻害する場合にはアポトーシス促進 作用を有し、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膝 B蔵癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤として、 また、 癌細胞のアポ トーシス促進剤として使用することもできる。
一方、 本発明の抗体が、 本発明の複合体の形成を促進する場合にはアポトーシ ス抑制作用を有し、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病 (家族性ァルツ ハイマ一病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） などの予 防 ·治療剤として、 また、 神経細胞のアポトーシス阻害 （抑制） 剤として使用す ることもできる。
また、 本発明の抗体は、 本発明の複合体の解離を促進する場合にはアポト一シ ス促進作用を有し、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃 癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺 癌、 臈臓癌、 脳腫瘍、 血夜腫瘍など） などの予防 ·治療剤として、 また、 癌細胞 のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
一方、 .本発明の抗体が、 本発明の複合体の解離を阻害する場合にはアポトーシ ス抑制作用を有し、 例えば神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病 （家族性ァルツ ハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性アルツハイマー病など） などの予 防 -治療剤として、 また、 神経細胞のアポトーシス阻害 （抑制） 剤として使用す ることもできる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤、 促進剤は低毒性であり、 そ のまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 (例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して 経口的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができ る。 ワクチンとして定法に従って投与することもできる。 本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体および その塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ つても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形とし て提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製で きる。 注射剤の調製方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通 常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化する ことによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethyl ene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 等 と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶 解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調 製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直腸投与に用 いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによ つて調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （ 糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このよ うな組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担 体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤として は、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜50 Omg程度、 とりわけ注射剤では 5〜10 Omg程度、 その他の剤形では 10〜250mg程 度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤、 調節剤の投与量は、 投与対象、 対 象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の治療 •予防のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0. 01〜 2 Omg/k g体重程度、好ましくは 0. 1〜1 OmgZk g体重程度、 さらに好 ましくは 0. l〜5mg/k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、好ましくは 1日 1 〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合 には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提 供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における 慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
EGTA ：エチレングリコール-ビス - (ベータアミノエチルエーテル 四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ：グリシン
A 1 ：ァラニン
Va 1 ：バリン
Le u ： ロイシン
l i e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
C y s ：システィン
Me t. ：メチォニン
G 1 u ：ダル夕ミン酸
As p ：ァスパラギン酸
Ly s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ： ヒスチジン
Ph e ： フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
Tr p ： トリブトファン
P r o ：プロリン As n ：ァスパラギン
G i n, ：グルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシスティン (selenocysteine)
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
P h ：フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 (R) 一力ルポキサミド基
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
Cl2-Bzl : 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルポニル
C 1 -Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r— Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
Bo c. ： t—ブトキシカルボニル
DNP ：ジニ卜口フエニル
T r t ： 卜リチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t ： 1ーヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t : 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2， 3—べンゾ卜リアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルボキシイミド
DCC ： N， N' —ジシクロへキシルカルポジイミド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
SEMA4Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する SEMA4Bをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
S EMA4 Bをコ一ドする全長遺伝子を含む DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
SEMA4B-M 1のアミノ酸配列を示す。
, 〔配列番号： 5〕
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有する SEMA4B— Mlをコードす る DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
SEMA4B— Mlをコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 7〕
S EMA4 B— M 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する SEMA 4 B—M 2をコードす る DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
S EMA4B— M2をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 10〕
SEMA4B— M3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する SEMA4B— M3をコード する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕 SEMA4B— M3をコ一ドする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 3〕
参考例 2、 参考例 3、 参考例 15および参考例 16で用いられたアンチセンス オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
参考例 2、 参考例 3、 参考例 1 5および参考例 16で用いられたオリゴヌクレ ォチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 5〕
参考例 3で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
参考例 3で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
参考例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
参考例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 9〕
参考例 4、 参考例 6および参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す 〔配列番号： 20〕
参考例 4および参考例 Ίで用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
参考例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
参考例 8で用いられたペプチド 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
参考例 8で用いられたペプチド 2のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
参考例 8で用いられたぺプチド 3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕 参考例 8で用いられたべプチド 4のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
SEMA4B、 SEMA4B— Ml、 S EMA 4 B— M 2および S EMA 4 B 一 M3のアミノ酸配列中、 第 739番目〜第 837番目のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 27〕
D L G 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 28〕
DLG 1をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
DLG 3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 30〕
DLG 3をコードする DN Aの塩基配列を示す。 後述 の 参考例 4 で 得 ら れ た 形 質 転 換体 Escherichia coli T0P10/SEMA4B-M1/PCR4- T0P0は、 2003年 3月 4日から.茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センタ一に、 寄託番号 FERM BP- 8316として寄託されている。
後述 の 参考例 4 で 得 ら れ た 形 質 転換体 Escherichia coli T0P10/SEMA4B- M2/pCR4 - T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センターに、 寄託番号 FERM BP- 8317として寄託されている。
後述 の 参考例 4 で 得 ら れ た 形 質 転 換体 Escherichia coli T0P10/SEMA4B-M3/pCR4-T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センターに、 寄託番号 FERM BP- 8318として寄託されている。 以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明 はそれに限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 Molecular cloning, 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989年に記載の方法 に準じて行った。 参考例 1
遺伝子発現解析
肺がん組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、 肺がん 組織 4例、 正常肺組織 5例から抽出された total RNA (表 1 ) を材料とし、 ol igonucleot ide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Af fymetrix¾) を用いて遺伝子発現解析を行った。 実験方法は、 Aiiymetrix社の 実験手引き書 （Express ion analys is technical manual) に従った。
その結果、 肺がん組織 3例 (lot. 0011-192-01285, lot. 00H- 192- 01293および lot. 0011-192-01297) において、 Semaphorin 4B (SEMA4B) および後述の参考例 4 記載の Semaphorin 4B-M1 (SEMA4B-M1) 、 Semaphorin 4B-M2 (SEMA4B-M2) ならび に Semaphorin 4B-M3 (SEMA4B-M3) 遺伝子の発現亢進が検出された （表 2 ) 。
〔表 1〕
RNAを抽出した組織 販売元
肺がん組織 (lot. 0009- -192-00122) BioCl inical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01285) BioCl inical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01293) BioCl inical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01297) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0009-192-00150) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0009- -192-00168) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01283) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01285) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01297) BioCl inical Partners 社
〔表 2〕 組織 遺伝子発現量
肺がん組織 (lot. 0009-192-00122) ND 肺がん組織 (lot. 0011- -192-01285) 10
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01293) 9. 5
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01297) 1. 9
正常肺組織 (lot. 0009- -192-00150) ND
正常肺組織 (lot. 0009- ■192-00168) ND
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01283) ND
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01285) ND
正常肺組織 (lot. 0011- ■192-01297) ND
遺伝子発現量は、 ol igonucleot ide microarrayで発現が検出された
全遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。
ND; not detected 参考例 2
ヒ卜肺癌細胞株のアポトーシス誘発
SEMA4Bおよび後述の参考例 4記載の SEMA4B- Ml、. SEMA4B- M2ならびに SEMA4B - M3 遺伝子の発現を抑制することにより、 ヒト肺がん細胞株のアポトーシスが誘発さ れるか否かを調べた。
まず、 アメリカンタイプカルチヤ一コレクション （ATCC) より購入したヒト非 小細胞肺がん細胞株 NCI- H1703を、 RPMI- 1640培地 （25mM HEPES含有） （Invi trogen 社） に牛胎仔血清 （ATCC) を 10%加えた培地で懸濁し、 1ゥエル当たり 1万個の細 胞密度（培地液量 0. lml) で 96穴平底組織培養プレート （BDファルコン社） に播種 した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、 アンチセンスオリゴヌクレオ チドをトランスフエクションした。
具体的には、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の 3 '非翻訳領域配列にハイブリダ ィズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （配列番号： 1 3 ) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製して導入実験に用い た （以下、 アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する） 。 コントロールとしては 、 配列番号： 1 3で示される塩基配列のリバース配列 （配列番号： 1 4 ) を同様 に phosphorothioate化し、 HPLC精製して用いた (以下、 コントロールオリゴヌク レオチドと略する） 。
Opti-MEM (Invitrogen社） で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは コントロールオリゴヌクレオチドを、 Opti- MEM (Invitrogeii社）で 5倍に希釈し室 温で 5分間放置したオリゴフエクトァミン （Invitrogen社） と 8:3の割合 （容量比 ) で混合し、 1ゥエル当たり 40 Lの割合でプレートに添加した。 オリゴヌクレオ チドの終濃度は 250nMとなるよう調整した。 上記の条件で更に 3日間培養した後、 Cell Death Detection ELISA キット (Roche Diagnostics社) を用いて添付プ 口トコールに従い、上記の 2種類のオリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を 測定した。
その結果、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3) はコント口一 ルオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 4) に比べて約 1.6倍のアポトーシス誘導活 性を示し、 統計学的に有意な差 （P≤0.01) を示した （表 3)
〔表 3〕
アポ卜一シス誘導活性
Figure imgf000069_0001
— A492/ 平均値 標準偏差
ブランク 0. 2 1 2 0. 0 3 2
コント口ール才リゴヌクレ才チド 0. 4 1 0 0. 0 1 7
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 5 3 8 0. 0 3 5
(配列番号： 1 3) 参考例 3
SEMA4Bアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現量の低下
ァンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、 SEMA4Bおよび後述の参考例 4記 載の SEMA4B- Ml SEMA4B- M2ならびに SEMA4B- M3遺伝子の発現量が低下するか否か調 ベた。
参考例 2で用いたヒト非小細胞肺がん細胞株 NCI- H1703を参考例 2と同じ培地 に懸濁し、 1ゥエル当たり 6万個の細胞密度（培地液量 0.6ml)で 24穴平底組織培養 プレート （BDファルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養し た後、 参考例 2の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチドを卜ランスフエ クシヨンした。 但し、 オリゴヌクレオチドの添加量は 1ゥエル当たり 240 xLとし、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして 2種類（配列番号： 1 3および配列番号： 1 5 ) 、 コントロールオリゴヌクレオチドとして 2種類（配列番号： 1 4および配 列番号： 1 6 ) のオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号： 1 5および配列番号： 1 6に由来するアンチセンスオリゴヌクレオ チドおよびコントロールオリゴヌクレオチドに関しては、 配列番号： 1、 配列番 号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を有するタ ンパク質の 3 '非翻訳領域配列にハイプリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオ チド配列 （配列番号： 1 5 ) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチド を合成し、 HPLC精製して導入実験に用いた。 配列番号： 1 5で示される塩基配列 のリバース配列 (配列番号： 1 6 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製し て用いた。
トランスフエクシヨン後、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24時間培養を継続した後 に RNeasy (登録商標) Mini Total NA Ki t (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを抽 出した。 約 300ngのトータル RNAを铸型として、 TadMan Reverse Transcript ion Reagents (Appl ied Biosystems社） を用いて添付プロトコ一ルに従い逆転写反応 した。 トータル RNAにして 7〜9ngに相当する cDNAを錶型とし、 2種類のプライマー (配列番号： 1 7および配列番号： 1 8 ) と SYBR Green PCR Master Mix (Appl ied Biosystems社） を用いて SEMA4B、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B-M2および SEMA4B-M3遺伝子の 発現コピー数を測定した。同量の錡型 cDNA中に含まれる /3 -ァクチン遺伝子発現量 を TadMan j3 -act in Control Reagents (Appl ied Biosys tems社) を用いて測定し 内部標準とした。
オリゴヌクレオチド溶液の代わりに蒸留水を用いた場合 （以下、 非トランスフ ェクシヨン群と略する） では、 SEMA4B、 SEMA4B-MK SEMA4B- M2および SEMA4B - M3 遺伝子発現量の総和は /3 -ァクチン遺伝子発現量の 6. 6%であったのに対し、 アン チセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3および配列番号： 1 5 ) 投与群で は 0. 98%および 1. 1 %であり、 統計学的に有意 （P≤0. 05) な遺伝子の発現量低下 が認められた。
一方、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 4および配列番号： 1 6 ) 投与群では 4. 1 %および 3. 4%であり、 非トランスフエクシヨン群と比べて統 計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これより、 SEMA4B、 SEMA4B-ML SEMA4B-M2および SEMA4B- M3遺伝子の発現抑制と アポトーシス誘導とは相関することがわかった。 参考例 4
SEMA4B、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2および SEMA4B- M3をコードする cDNAのクローニング と塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株 （A549) 由来の Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社） を鍀型と し、 2種のプライマー （配列番号： 1 9および配列番号： 2 0 ) を用いて PCR反応 を行った。 該反応液 50 x lは、 I Iの上記 cDNA、 2. 5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 、 各 1. O Mのプライマー （配列番号： 1 9および配 列番号： 2 0 ) 、 200 zM dNTPs, および 25 1 2x GC Buffer I (Takara Bio社） を含む組成とした。 PCR反応は、 95で · 1分の後、 95°C · 1分、 60°C · 1分、 72°C · 4 分を 30サイクル繰り返し、 さらに 72°C · 5分間伸長反応を行った。 PCR反応産物の 3 ' 端に dATPを付加するため、 5Uの Ex Tad DNA Polymerase (Takara Bio社） を添加 して 72°C · 7分間保温した。得られた PCR反応産物は、 PCR Purif icat ion Ki t (QIAGEN 社） を用いて精製した。 これを T0P0 TA PCRクローニングキット （Invi trogen社） の処方に従いプラスミドベクター pCR4- T0P0 (Invitrogen社）へサブクローニング した。 これを大腸菌 TOP10に導入後、アンピシリンを含む LB寒天培地中で cDNAを持 つクローンを選択した。 個々のクローンについて塩基配列を解析した結果、 配列 番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 および配列番号： 1 1で表される cDNA の塩基配列がそれぞれ得られた。
SEMA4B遺伝子 （GeneBank Accession No. NM_198925遺伝子） の塩基配列の 13〜 249番目および 2761〜3778番目の塩基配列を、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列 番号： 8および配列番号： 1 1で表される塩基配列の 5' 端および 3' 端にそれぞ れ付加した塩基配列をそれぞれ配列番号： 3、 配列番号： 6、 配列番号： 9およ び配列番号： 1 2に示す。
配列番号： 2で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 ) は SEMA4B遺伝子（GeneBank Accession No. 匪 _198925遺伝子） がコードする SEMA4B タンパク質と完全に一致した。
配列番号： 5で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 4 ) を含有するタンパク質を SEMA4B_M1、配列番号： 8で表される塩基配列がコードす るアミノ酸配列 （配列番号： 7 ) を含有するタンパク質を SEMA4B- M2、 配列番号： 1 1で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) を含有す る夕ンパク質を SEMA4B- M3とそれぞれ命名した。
SEMA4B-M1のアミノ酸配列 （配列番号： 4 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列番 号 ·· 1 ) の 208番目の Serが l ieに置換されている。
SEMA4B-M 1をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 5 ) では、 SEMA4Bをコード する層 Aの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 90番目の gが aに、 111番目の gが aに、 623 番目の gが tにそれぞれ置換されており、 623番目の置換がァミノ酸置換を伴ってい る。
SEMA4B-M2のアミノ酸配列 （配列番号： 7 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列番 号： 1 ) の 163番目の Metが l ieに置換されている。
SEMA4B- M2をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 8 ) では、 SEMA4Bをコード する DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 150番目の gが aに、 489番目の gが aに、 528 番目の cが tに、 1266番目の tが cに、 1588番目の cが aに、 2343番目の aが gにそれぞ れ置換されており、 489番目の置換がァミノ酸置換を伴つている。
SEMA4B- M3のアミノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列 番号： 1 ) の 364番目の Lysが Asnに置換されている。
SEMA4B- M3をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 1 1 ) では、 SEMA4Bをコー ドする D NAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 1092番目の gが tに置換されており、 アミノ酸置換を伴っている。
配列番号 ： 2で表される塩基配列を有する DNAを有するプラスミ ドを SEMA4B/PCR4-T0P0,配列番号： 5で表される塩基配列を有する DNAを有するプラス ミドを SEMA4B- M1/PCR4- T0P0、 配列番号： 8で表される塩基配列を有する DNAを有 するプラスミドを SEMA4B-M2/PCR4- T0P0、配列番号： 1 1で表される塩基配列を有 する DNAを有するプラスミドを SEMA4B- M3/PCR4- T0P0とそれぞれ名付けた。
さらに、 プラスミド SEMA4B/PCR4- T0P0が導入された形質転換体を Escherichia col i T0P10/SEMA4B/PCR4-T0P0, プラスミド SEMA4B- Ml/pCR4-T0P0が導入された形 質転換体を Escherichia col i T0P10/SEMA4B-Ml/pCR4-T0P0、 プラスミ ド SEMA4B-M2/pCR4-T0P0が導入 さ れた形質転換体 を Escherichia col i T0P10/SEMA4B- M2/pCR4-T0P0、 プラスミド SEMA4B- M3/pCR4- T0P0が導入された形質 転換体を Es che rich i a col i TOP10/SEMA4B- M3/pCR4- TOPOとそれぞれ命名した。 参考例 5
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株 SK- N- MC、 SK-N-AS, SK- N- BE、 SK- N- DZ、 SK-N-FI 、 SK- N- SH、 D341Med、 Daoy、 DBT G-05MG, U-118 MG、 U-87 MG、 CCF-STTGlおよび SW 1088；ヒト乳癌細胞株 HCC1937、 ZR- 75- 1、 AU565, MCF-7および MM- MB- 231；ヒ ト大腸癌細胞株 Caco - 2、 COL020K COLO 205、 COLO 320DM, HCT-δ, HT-29、 LoVo 、 LS123, S丽- Cl、 SK - CO - 1、 SW 403, SW 48、 SW480, SW 620、 SW 837および SW 948 ；ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293;ヒト小細胞肺癌細胞株 NCI- H187、NCI- H378、NCI- H526 、 NCI - H889、 NCI-H1672, NCI-H1836, NCI-H2227, NCI- N417および SHP- 77；ヒト非 小細胞肺癌細胞株 A549、 NCI-H23, NCI-H226, NCI- H358、 NCI- H460、 NCI-H522, NCI-H66L NCI-H810, NCI-H1155, NCI- H1299、 NCI-H1395 NCI- H1417、 NCI-H1435 、 NCI-H158L NCI-H165K NCI-H1703, NCI-H1793, NCI-H1963, NCI-H2073, NCI-H2085 、 NCI-H2106, NCI- H2228、 NCI-H2342および NCI- H2347；ヒト卵巣癌細胞株 ES- 2、 Caov-3, MDAH2774, NIH:0VCAR3、 0V- 90、 SK-0V-3, ：[(^-1120ぉょび^^-2 ；ヒト 膝臓癌細胞株 PA C- 1、 MIA - PaCa- 2、 AsPC-K BxPC - 3、 Capan- 1および Capan - 2； ヒ ト前立腺癌細胞株 DU145；ヒト網膜芽腫細胞株 WERI-Rb- 1および Y79；ヒト精巣癌細 胞株 Cates-ΙΒの 86株は、 ATCCより購入した。 ヒト正常気道上皮細胞 SAECおよびヒ ト正常前立腺上皮細胞 HPrECは、 Clonet ics社より購入した。 ヒト大腸癌細胞株 C0CMK ヒト非小細胞肺癌細胞株 VMRC- LCDおよびヒト前立腺癌細胞株 PC3は、 JCRB より購入した。 これら細胞株は参考例 9以降の参考例でも用いることがある。 上記細胞株 91株より RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを調製した。 このトータル RNAを鎳型としてランダムプライマーを用いた逆転 写反応で cDNAを調製し、定量的 PCR反応を行うことにより、 SEMA4B遺伝子（配列番 号： 2 ) 、 SEMA4B- Ml遺伝子 （配列番号： 5 ) 、 SEMA4B-M2遺伝子 （配列番号： 8 ) および SEMA4B- M3遺伝子 （配列番号： 1 1 ) の発現量を検討した。
該 PCR反応は、 上記トータル RNA 3〜4ngより得られた cDNAを錶型として使用し、 参考例 3と同一条件で PCR反応を行い、 SEMA4B、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2および SEMA4B- M3遺伝子の発現コピー数を算出した。 並行して TaqMan Human j3 -act in Control Reagents (Appl ied Biosystems社） を用いて上記! ^一タル RNA 1 ngに含 まれる) 3 -ァクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、 3 -ァクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現 率を表 4および表 5に示す。
上記遺伝子発現量の総量が β -了クチン遺伝子発現量の 1 %を超える癌細胞株が 17株見出され、 上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。 〔表 4〕
% of % of % of
細胞株 β -actin 細胞株 β -actin 細胞株 β -actin
S -N-MC 0.02 COLO 201 0.66 NCI-H889 0.07
SK-N-AS 0.07 COLO 205 0.40 NCI-H1 672 0.10
SK-N-BE ' 0.04 COLO 320DM 0.12 NCHH1 836 0.08
SK-N-DZ 0.05 HCT-8 0.36 NC卜 H2227 0.15
SK-N-FI 0.20 HT-29 0.52 NCI-N417 0.04
SK-N-SH 0.1 1 LoVo 0.58 SHP-77 0.16
D341 Med 0.05 LS123 0.04 A549 0.35
Daoy 0.08 SNU-C1 0.52 NCI-H23 0.98
DBTRG - 05MG 0.01 SK-CO-1 0.45 NCI-H226 0.04
U-1 18 MG 0.01 SW 403 0.31 NCI-H358 1.09
U-87 MG 0.20 SW 48 0.06 NCI-H460 0.08 CCF-STTG1 0.23 SW 480 0.03 NCI-H522 0.05
SW 1088 0.06 SW 620 0.12 NCI-H661 0.05
HCC1937 0.17 SW 837 0.59 NCI-H810 0.03
ZR-75-1 0.30 SW 948 0.18 NC卜 H1 155 0.07
AU565 0.06 HEK293 0.05 NCI-H1299 0.10
MCF-7 0.06 SAEC 1.73 NC卜 H1395 0.39
MDA-MB-231 0.06 NC卜 H187 0.38 NCHH1417 0.21
Caco-2 0.04 NCI-H378 0.17 NCI-H1435 0.26
COCM1 0.10 NCI-H526 0.14 NCHH1581 0.16
〔表 5〕
% of % of % of 細胞株 β一 actin 細胞株 β -actin 細胞株 j3 -actin
NCHH1651 1.03 ES-2 0.02 BxPC-3 0.17
NCI - H 1703 0.21 Caov-3 0.13 Capan-1 0.07
NCI-H1793 0.29 MDAH2774 0.37 Capan-2 0.27
NCI-H1963 0.12 NIH:OVCAR3 0.14 HPrEC 2.87
NC卜 H2073 0.15 OV-90 0.23 DU 145 3.05
NCI-H2085 0.02 SK-OV-3 2.44 PC3 0.43
NCI-H2106 0.07 TOV-1 12D 0.06 WERI-Rb-1 0.90
NC卜 H2228 1.89 TOV-21 G 1.00 Y79 0.06
NCI-H2342 0.18 PANIC - 1 1.88 Gates-I B 0.01
NC卜 H2347 0.24 MIA-PaCa-2 0.02
VMRC-LCD 0.09 AsPC-1 0.24
参考例 6
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現べクタ一の構築
参考例 で得たプラスミド SEMA4B/PCR4- T0P0を錶型とし、 PCRで SEMA4B遺伝子を 増幅した。 該反応における反応液の組成は SEMA4B/PCR4- TOPO 2ngを錡型として使 用し、 Piu Turbo Hotstart 匪 Polymerase (STMTAGENE社) を 2.5U、 2種類のプ ライマ一 （配列番号： 19および配列番号： 21) を各 l M、 dNTPsを 200 M、 お よび 10x Pfu Bufferを 加え、 50 1の液量とした。 PCR反応は、 95で · 1分の 後、 95°C · 1分、 60 · 1分、 72°C ·4分のサイクルを 25回繰り返し行った。次に PCR Purification Kit (QIAGEN社) にて該 PCR反応産物を精製した後、 制限酵素 Xba I および Eco RIにて処理した。 プラスミド p3xFLAG-CMV- 14 (Sigma社） も Xbalおよ び Eco RIにて処理した。 それぞれの DNA断片は PCR Purification Kitにて精製し、 DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Bio社） を用いてライゲーシヨン反応を行った 。ライゲ一シヨン反応液を大腸菌 T0P10に導入した後、形質転換された大腸菌をァ ンピシリンを含む LB寒天培地中で選択し個々のクローンを解析した結果、 SEMA4B 遺伝子 （配列番号： 2) に相当する cDNA断片を含むプラスミド pCMV- 14- SEMA4B を得た。 参考例 7
組換え型タグ付き完全長タンパク質の動物細胞用発現べクタ一の構築
SEMA4Bタンパク質の C末端に 3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する動物 細胞用発現ベクターを構築した。 SEMA4B遺伝子を PCRで増幅する時に用いるプライ マーペアを、 別のプライマーペア （配列番号： 19および配列番号： 20) に変 更したこと以外は参考例 6記載の方法に従い、 形質転換した大腸菌の選別を行つ た。 その結果、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) の C末端に 3xFLAGタグが融合 したタンパク質をコードする cDNA断片を含むプラスミド pCMV- 14- SEMA4B- 3xFLAG を得た。 参考例 8 .
ペプチド抗体の作製と精製
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) 、 SEMA4B- Mlタンパク質 （配列番号： 4) 、 SEMA4B-M2タンパク質 （配列番号： 7) および SEMA4B-M3タンパク質 （配列番号： 10) のアミノ酸配列に基づき、 12〜15アミノ酸からなる以下の 4種のペプチド （ ペプチド 1〜4 ) を Fmoc固相合成法により合成した。
ペ プ チ ド 1 の ア ミ ノ 酸 配 列 （： Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-I le-Asn-Ser-Ser-Cys (配列番号： 2 2 )〕は、 SEMA4B タンパク質（配列番号： 1 ) の 402番目から 412番目までのアミノ酸配列の C末端に 、 Cysを付加した配列である。
ペ プ チ ド 2 の ア ミ ノ 酸 配 列 〔 Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-P e-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys (配列番号： 2
3 ) 〕 のアミノ酸配列は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 582番目から 596 番目までの配列である。
ペ プ チ ド 3 の ア ミ ノ 酸 配 列 〔
Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys (配列番号： 2
4 ) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 781番目から 794番目までのアミ ノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配列である。
ペ プ チ ド 4 の ア ミ ノ 酸 配 列 〔 Ser-Arg-Val-Phe-T r-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys (配列番号： 2 5 ) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 797番目から 809番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 Cysを付加した配列である。
上記ペプチド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3およびペプチド 4のそれぞれのぺプ チドに、キーホールリンぺッ卜へモシァニン (KLH) をキャリアータンパク質とし て結合さ.せ抗原とし、 以下のように、 ゥサギポリクローナル抗体を作製した。 免疫動物は雄性ゥサギ KBL : JW (11週齢、 オリエンタル酵母） 一羽を用い、 初回 感作は完全フロインドアジュバンド （Di ico社） 懸濁液、 2回目以降は不完全フロ インドアジュバンド （Diico社）懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い 、 1回の感作には各抗原 0. 5mgを用い、 初回感作後 14日毎に 3回繰り返した。 初回 感作後 52日目に麻酔下頸動脈採血を行い、 血清約 50mlを得た。 このようにして得 られた血清を硫酸アンモニゥム塩析法により濃縮し、得られた粗 IgG画分全量をプ 口ティン Aァフィ二ティーカラム 1^111-8103(^ 611じ6社） により精製し、 ぺプ チド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3またはペプチド 4を免疫したゥサギから、 それ ぞれ約 103mg、 約 76mg、 約 112mgおよび約 122mgの精製 IgGを得た。 さらに、 各々の 免疫源ペプチドを固定化したカラムに結合する IgG画分を取得した。固定化には各 ペプチドの C末端の Cysを利用し、 ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム （ Amersham- Bioscience社）にカップリングした。カラムからの溶出には 8M尿素/リ ン酸緩衝化生理食塩水 （PBS) を用いた。 溶出液を PBSに対して透析して尿素を除 いた後、 限外濃縮、 フィル夕一ろ過滅菌することにより、 ペプチド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3およびペプチド 4に対するァフィ二ティー精製抗体 AS- 2531、 AS - 2532、 AS- 2591および AS- 2592を、 約 15mg、 約 126mg、 約 17mgおよび約 35nigずつ 取得した。 参考例 9
ゥサギペプチド抗体を用いたウェスタンプロッティング '
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の検出は、 参考例 8で作製した精製べプチ ド抗体を用いて行った。 ヒト非小細胞肺癌由来 NCI- H358細胞 1. 5 X 個を 10%牛 胎仔血清（JRH社）を含む RPMI- 1640培地（Invi trogen社） 10 mlに懸濁し、直径 10cm のペトリディッシュに播種した。 5 %炭酸ガス気 下、 37°Cで一晩培養した。参考 例 6で作製したプラスミド pCMV-14- SEMA4B 6 i g と Plus試薬 （Invi t rogen社） および OPTI- MEM I ( Invi trogen社） とを混合し、 室温で 15分間放置した後、 LipoiectAMINEトランスフエクシヨン試薬 （Invi trogen社） および OPTI- MEM Iを添 加し、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液を培養液に滴下して培養を継続 した。 発現プラスミド導入 2日後に細胞を氷冷した PBSで洗浄し、 氷冷した RIPA緩 衝液〔50 トリス'塩酸緩衝液、 pH 7. 5、 150 mM塩化ナトリウム、 l %Tri ton X- 100 、 0. 1 %SDS、 1 %デォキシコール酸、 Co即 leteタブレット (Roche Diagnos t ics社 ) 、 Phosphatase Inhibi tor Cocktai l-2 (Sigma社) 〕 1mlを添加し 4°Cで 30分間放 置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15， OOOrpmで 20分間遠心分離した上澄液を無細 胞抽出液とした。この無細胞抽出液および 2倍濃度 SDS- PAGE用サンプルバッファー (125mM トリス '塩酸緩衝液、 pH6. 8、 40%グリセロール、 4%SDS、 0. 04%ブロモ フエノールブルーおよび 5% 2 -メルカプトエタノール〕 を等容量で混合し、 95 で 5分間加熱した後、 IO Iを 10%アクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 泳 動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロット P膜（ATT0社） に転写した後 、 ブロッキング溶液 〔50πιΜトリス ·塩酸緩衝液、 ρΗ 7. 5、 500 πιΜ塩化ナトリウム 、 0. 1 % Tween 20, 5%スキムミルク〕 中に 1時間室温放置した。 次に、 参考例 8 で作製したペプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS- 2591または AS- 2592を、 3 g/ml の濃度となるようブロッキング溶液で希釈し、 4でにて一晩反応させた。 続いて、 ブロッキング溶液で 5万倍または 10万倍に希釈した HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 （ Amersham-Bioscience社） 中で 1時間室温放置した。 検出には ECL plus ( Afflersham- Bioscience社）を用い、添付プロトコ一ルに従レ EMA4Bタンパク質を検 出した。
AS - 2531を除き、 AS- 2532、 AS - 2591および AS- 2592のいずれを用いた場合でも、 分子量 lOOkD近傍の位置に SEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンドが認めら れた。 参考例 1 0
ゥサギペプチド抗体を用いた免疫沈降
参考例 8で作製した精製べプチド抗体を用いて.、 SEMA4Bタンパク質の免疫沈降 を非変性状態にて行った。
参考例 7で得たプラスミド pCMV- 14- SEMA4B-3xFLAGを用いて、参考例 9と同様の 操作で無細胞抽出液を調製した。 Protein G-Sepharose 4FF (Amer sham-Biosc ience 社） を等容量の RIPA緩衝液で懸濁した懸濁液 50 PL 1に無細胞抽出液 400 n 1を加え、 さらに参考例 8記載のペプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS- 2591または AS- 2592の いずれか一つを 5 加えた混合液を調製し、 4°Cにて一晩撹拌した。 Protein G - Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗浄後、 50 A 1 の SDS- PAGE用サンプ ルバッファー 〔62. 5 卜リス '塩酸緩衝液、 pH6. 8、 20%グリセロール、 2% SDS 、 0. 02%ブロモフエノールブルーおよび 2. 5 % 2 -メルカプトエタノール〕 に懸濁 し、 95°Cで 5分間加熱した後、 5 Uまたは を 10 %アクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。検出は参考例 9記載の方法に準拠した。但し、マウス抗 FLAG M2 抗体（S i gma社）をブロッキング溶液で 0. 2 g/mlまたは 0. 1 g/mlとなるように希 釈したものを一次抗体として、 HRP標識抗マウス IgG抗体 （Amer sham- Bioscience 社） をブロッキング溶液で 2. 5万倍または 5万倍に希釈したものを二次抗体として 用いた。
ペプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS-2591および AS- 2592のいずれを用いて免疫 沈降を行った場合にも、分子量 lOOkD近傍に SEMA4Bタンパク質に由来する特異的な バンドが認められた。
これより、 ペプチド抗体 AS- 2531、 AS-2532, AS- 2591および AS- 2592は、 未変性 の SEMA4B夕ンパク質と結合することが明らかとなった。 参考例 1 1
癌細胞株における SEMA4B夕ンパク質の発現検討
肺癌細胞株 NCI - H2228、 NCI-H165 K NCI - H358、 NCI- H23ならびに NCI - H1703；卵 巣癌細胞株 SK0V- 3ならびに T0V-21G；前立腺癌細胞株 DU145；および塍癌細胞株 PANC- 1を、直径 10cmのペトリディッシュ 2枚で培養した。各々の細胞についてぺト リディッシュ 1枚分をトリプシン * EDTA (Invi trogen社） で分散し、 細胞数を計測 した。計測した細胞数を基にして、 5 X 個の細胞に対して 1 mlの割合で氷冷 RIPA 緩衝液 （参考例 9に記載） を残りのペトリディッシュ 1枚に添加し > 4°Cで 30分間 放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15, OOOrpmで 20分間遠心分離した上澄液を無 細胞抽出液とした。 一方、 Size X ProteinG Imiiiunoprecipi tat ioii Ki t (Pierce 社） の添付プロトコールに従い参考例 8記載のぺプチド抗体 AS- 2531を Prote inG-Sepharose 4FF (Amersham- Bioscience社) に架橋した樹脂を用意し、 等 容量の RIPA緩衝液で懸濁した。この懸濁液 30 1に前述の無細胞抽出液 400 1を加 え、 4°Cにてー晚撹拌を行った。 Prote inG- Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液 にて洗浄後、 参考例 1 0記載の SDS- PAGE用サンプルバッファ一 30 /^ 1に懸濁し 95 °Cで 5分間加熱した後、 20 i lを 10%アクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 検出はペプチド抗体 AS- 2532を用いて参考例 9記載の方法に準じて行った。
上記 9種類の細胞株の中で、 NCI- H2228、 NCI-H358, NCI-H23, SK0V-3, 麵 5お よび PANC- 1の各細胞株において、分子量 lOOkD近傍に、 SEMA4Bタンパク質に由来す る特異的なバンドが認められた。 これより、 SEMA4Bタンパク質が、 上記 6種類の癌 細胞株で高発現していることが明らかとなった。 参考例 1 2
組換え型完全長夕ンパク質安定発現細胞株の樹立
ヒト非小細胞肺がん由来 NCI- H358細胞 2. 0 X 105個を 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 lmMピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI-1640培地 （Invi trogen社 ) 2 mlに懸濁し、 6ゥエルプレートに播種した後、 5 %炭酸ガス気流下、 37でで一 晚培養した。 一方、 0ΡΠ- MEM I (Invi t rogen社） で希釈した参考例 6記載のブラ スミド pCMV- 14-SEMA4B を Plus試薬 （Invi trogen社） と混合し室温で 15 分間放置した後、 OPT I -MEM I で希釈した LipoiectAMINEトランスフエクシヨン試 薬 （Invi trogen社） 4 μ 1を添加し、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液を 培養液に滴下してさらに 1日培養を継続した後、 トリプシン * EDTA (Invi trogen 社） で細胞を分散し、 上記の培養培地に G418 (プロメガ社） を 400 g/mlとなるよ うに加えた培地で 10倍に希釈して 24ゥエルプレートに播種した。 3日または 4日ご とに G418を含む上記培地（G418選択培地） を交換しながら 5%炭酸ガス気流下、 37 °Cで培養を継続した。 1個〜 3個の細胞が増殖しコロニーを形成したゥエルから細 胞を回収し、 48ゥエルプレートの 2ゥエルに等しく.播種した。細胞密度が 50%以上 になるまで培養を継続した後、 1ゥエル分の細胞に参考例 1 0記載の SDS- PAGE用サ ンプルバッファ一 を加え、細胞溶解液を調製した。 95°Cで 5分間加熱処理し た後、 を 10%アクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 参考例 9で記載し た方法に準じ、 ペプチド抗体 AS- 2532を用いてウェスタンプロッティングを行い、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) を構成的に発現する安定発現細胞を探索した 。もう一方のゥエルから回収した細胞を、 1ゥエルあたり 0. 7個となるように希釈 後、 96ゥエルプレートに播種した。 G418選択培地を 3日あるいは 4日ごとに交換し ながら細胞密度が 50%程度になるまで、 5 %炭酸ガス気流下、 37°Cで培養を継続し た。再び、 48ゥエルプレートの 2ゥエルに等しく播種し、細胞密度が 50%以上にな るまで培養を継続し、 1ゥエル分の細胞から調製した細胞溶解液を用いて、 上記 と同様にウェスタンブロッテイングを行った。 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) を最も高発現するクローンを選び、 SEMMB安定発現細胞株 SEMA4B/H358を得た。 参考例 1 3 SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （ピオチン標識）
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228ならびに NCI-H358、および参考例 1 2で作製 した組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株（SEMA4B/H358) を用いて、細胞 表層上に露出しているタンパク質を Cel lular Label ing and Inununoprecipi tat ion Ki t (Roche Diagnost ics社） を用いてピオチン標識した。 続いて、 参考例 9の方 法に従い調製した無細胞抽出液 lmlと参考例 8で作製したぺプチド抗体 AS- 2591 5 gとを用いて、 参考例 1 0の方法に従って免疫沈降し SDS- PAGEを行った。 HRP 標識したストレプトアビジン（Amersham- Bioscience社）を用いて検出したところ 、 分子量 lOO k D近傍に SEMA4Bタンパク質に由来するバンドが認められ、 SEMA4B タンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B-M2タンパク質および SEMA4B-M3タンパ ク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。 参考例 1
SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （FACS解析）
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228ならびに NCI- 11358、および参考例 1 2に記載 した SEMA4B/H358を、直径 10cmのペトリディッシュにそれぞれ播種し、サブコンフ ルェントになるまで培養した。 各細胞を PBSで洗浄後、 0. 5 %BSAおよび 5mM EDTA を含む PBSを加え室温で 15分間放置し、 細胞を分散した。 次に、 緩衝液 A〔2%牛胎 仔血清 (JRH社)および 0. 1 %アジ化ナトリウムを含む HBSS (Hanks ' Balanced Sal t Solut ions. Invi trogen社） 〕 で 4X 106個/ mlの濃度になるように細胞を懸濁し、 終濃度 10 i g/mlとなるよう AS- 2532または非免疫ゥサギ IgG (Jackson社） を加え、 氷中に 3時間放置した。 緩衝液 Aで細胞を洗浄後、 10 i g/mlの Alexa488標識抗ゥサ ギ IgG抗体 （Molecular Probes社） を含む緩衝液 Aで懸濁し、 氷上にて 2時間放置し た。 緩衝液 Aで再び洗浄後、 FACScan (BDバイオサイエンス社） にて解析した。 そ の結果、 いずれの細胞においてもゥサギペプチド抗体 AS- 2532特異的に染色され、 SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B- M2タンパク質および SEMA4B - M3 タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。 参考例 1 5 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H358の アポトーシス誘導
参考例 2に記載の NCI- H1703以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチ センスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討し た。
10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 lmM ピルビン酸ナトリウムおよび 25mMHEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） で NCI- H358を懸濁し、 1ゥエル当たり 8X103個の 細胞密度（培地液量 となるよう、 NCI-H358を 96穴平底組織培養プレート （ BDファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した。 一方、 参 考例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 13) およびコント ロールオリゴヌクレオチド (配列番号: 14)各 0.06 gを 0PTI - MEMI (Invitrogen 社） で希釈し、 Plus試薬 （Invitrogen社） 0.5 1と混合した後、 室温で 15分間放 置した。 OPTI- MEM I で希釈した LipoiectAMINEトランスフエクシヨン試薬 （ Invitrogen社） 0.4 xlを加え、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液全量を NCI- H35.8の培養液に添加し 3日間培養を継続.した後、 Cell Death Detection EL ISA™ (Roche Diagnostics社） および Caspase- Glo 3/7 assay (Promega社） の 添付プロトコールに従い、 上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測 定した。
その結果、 NCI- H358においては、 Cell Death Detection ELISA および Caspase^Glo 3/7 assayともに、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象とし て用いたコン卜ロールオリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ 1.42倍および 1.77倍 のアポトーシス誘導活性を示し、 統計学的に有意な差 （P≤0.01) を示した （表 6 および表 7) 。
〔表 6〕
アポ卜一シス誘導活性
Figure imgf000083_0001
o 5— A492) 平均値
ブランク 0. 21 7 0. 007
コント口ール才リゴヌクレオチド 0. 330 0. 041 (配列番号： 1 4)
ンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 467 0. 029
(配列番号： 1 3)
〔表 7〕
アポ卜一シス誘導活性 （C P S)
平均値 *1ポ1
ブランク 7625 235
コント口ール才リゴヌクレ才チド 8727 1 88
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 1 5452 570
(配列番号： 1 3) 参考例 16
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228 、 NCI- H1651および NCI- H23のアポトーシス誘導
NCI-H1703 (参考例 2) および NCI- H358 (参考例 15) 以外のヒト非小細胞肺癌 細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが 誘発されるか否かを検討した。
NCI- H2228には、 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ΙπιΜ ピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 (Invitrogen社) を用いた。 NCI- H1651には、 10 %FBSを含む ACL- 4培地 (ATCC) を用いた。 NCI- H23には、 10%牛胎仔血清 (皿社 ) および 25niMHEPESを含む RPMI-1640培地 （Invitrogen社） を用いた。 各細胞をそ れぞれの培地に懸濁し、 1ゥエル当たり 7.5X103個 (NCI-H2228) 、 7.5X103個 ( NCI-H1651) および 5X103個 (NCI- H23)の細胞密度 (培地液量 125 1) となるよう 96穴平底組織培養プレート （BDファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37 tで一晩培養した。 一方、 参考例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配 列番号： 13)およびコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号： 14)各 0.135 zgを 0PTI- MEM I (Invitrogen社) で希釈し、 Plus試薬 (Invitrogen社) 0.75 1 と混合した後、 室温で 15分間放置した。 OPTI-MEM I で希釈した LipofectAMINEト ランスフエクシヨン試薬 （Invitrogen社） 0. を加え、 さらに室温で 15分間放 置した。 この混合液全量を各細胞の培養液に添加し 3日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社）の添付プロトコールに従い上記 オリゴヌクレオチドのアポト一シス誘導活性を測定した。
その結果、 いずれの細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰 性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ 1.58倍 （ NCI-H2228)、 1.21倍 (NCI-H1651) および 1.25倍 (NCI- H23)のアポト一シス誘導活 性を示し、 危険率は P≤0.05 (NCI-H2228) 、 P≤0.05 (NCI-H1651) および P≤ 0.0UNCI-H23)と算出され、 統計学的に有意な差を示した（表 8、 表 9および表 1 0)。
〔表 8〕
アポ卜一シス誘導活性 （A4。5— A49 a)
平均値 標準偏差
ブランク 0. 31 2 0. 009
コント口ール才リゴヌクレ才チド 0. 526 0. 043
(配列番号： 〗 4 )
7ンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 829 0. 1 23
(配列番号： 1 3)
〔表 9〕
アポ! ^一シス誘導活性 （A4Q5— A49
2)
平均値 標準偏差
ブランク 0. 523 0. 091
コント口ール才リゴヌクレオチド 1. 1 52 0. 1 01
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 1. 390 0. 1 04 (配列番号： 1 3)
〔表 10〕
アポ卜一シス誘導活性 （A 平均値 標準偏差
ブランク 0. 678 0. 028
コント口ール才リゴヌクレ才チド 1. 081 0. 050
(配列番号： 1 4)
7ンチセンス才リゴヌクレ才チド 1. 351 0. 058
(配列番号： 1 3) 参考例 17
ゥサギペプチド抗体を用いたアポトーシス誘発
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228を参考例 8で取得したゥサギぺプチド抗体 AS- 2531および AS- 2532で処理し、 これらゥサギペプチド抗体のアポトーシス誘導 活性を測定した。
NCI- H2228を、 10%牛胎仔血清（JM社）、 1謹 ピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） に懸濁し、 1ゥエル当たり 4X 103個 の細胞密度になるよう I型コラーゲンをコートした 96穴平底組織培養プレート（BD ファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晚培養した。 参考例 8で 取得したゥサギぺプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、および非免疫ゥサギ IgG (Jackson 社）を PBSで希釈し、各抗体について終濃度が 15 xg/inl、 45 g/mlおよび 150 g/ml となるよう培養液にそれぞれ添加した。 さらに 5日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics社） の添付プロトコールに従い、 上記ゥサギぺプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、 45 zg/inlおよび の AS- 2531存在下では、同濃度の非免疫ゥサ ギ IgGに比べ、 1.26倍および 1.31倍のアポトーシス誘導活性を示した （P≤0.05お よび P≤0.01)。また、 150 g/inlの AS- 2532存在下では、同濃度の非免疫ゥサギ IgG に比べ、 1. 27倍のアポトーシス誘導活性を示した （P≤0. 01) 。
このように、 SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B-M2タンパク質 および SEMA4B-M3タンパク質は、ヒト肺癌細胞の生存維持に重要な働きをしている ことが明らかとなった。 実施例 1
以下は、 公知の酵母ツーハイプリッド法 (The Yeast Two-Hybrid System, Oxford Univers i ty Press, Bartel and Fields, 1997年等）に準じて行った。
配列番号： 2 6で示されるアミノ酸配列からなるペイトタンパク質をコードす る cDNAは、上記参考例 6で得られたプラスミド pCMV-14- SEMA4Bから PCR法を用いて 増幅した。 得られた cDNAを組み換えによって酵母の発現ベクター pGBT. Qに導入し た。 pGBT. Qは pGBT. Cに近縁の誘導体 （Nat. Genet. 12巻、 72-77頁、 1996年）であ り、ポリリンカ一部位を修飾してシークェンス用 Ml 3プライマーを挿入したもので ある。 この新しいコンストラクトを、 トリブトファン合成能力の有無により、 酵 母の PNY200 株中で直接選択した（この株の遺伝型: MAT a tr 1-901 leu2-3, 112 ura3-52 his3-200 ade2 gal4A gal80A) 。 この酵母細胞中で、 ベイトタンパク 質は、 転写因子 Gal4 タンパク質 （GenBank NPJ 15076) の DNA結合ドメイン （ァ ミノ酸 1番目〜 147番目） の C末端側に結合した融合タンパク質として産生された。 プレイライブラリーを、 酵母の BK100株 （この株の遺伝型： MATa trpl-901 leu2-3, 11.2 ura3-52 his3-200 gal4 Δ gal80 Δ LYS2 : : GAL-HI S3 GAL2-ADE2 met2 : :GAL7-lacZ ) に形質転換し、 ロイシン合成能力の有無によって選択した。 この酵母細胞中では、各 cDNAがコードするタンパク質は転写因子 Gal4タンパク質 (GenBank NPJ15076) の転写促進ドメイン （アミノ酸 768番目〜 881番目） の C末 端側に結合した融合タンパク質として産生された。 次いで、 ベイトタンパク質を 発現する PNY200細胞 （接合型 ΜΑΤ α ) を、 プレイライブラリ一中のプレイタンパ ク質を発現する BK100細胞 （接合型 MATa) と接合させた。 その結果得られる、 ベ ィ卜タンパク質と相互作用するプレイタンパク質を発現する二倍体の酵母細胞を 、 トリブトファン、 ロイシン、 ヒスチジンおよびアデニンの合成能力によって選 択した。それぞれのクローンから DNAを調製し、エレクトロポレーシヨン法によつ て大腸菌の KC8株に形質転換し、 次いで細胞を、 トリブトファンを含まない（ペイ トプラスミド選択用） 、 またはロイシンを含まない （プレイライブラリーのブラ スミド選択用）アンピシリン含有培地上で選択した。両プラスミドの DNAを調製し 、 ジデォキシヌクレオチド 'チェーンターミネ一シヨン法で配列を決定した。 ベ イト cDNAインサートの同一性を確認し、 プレイライブラリーのプラスミドから得 られる cDNAィンサートを、 公知のヌクレオチドおよび夕ンパク質デ一夕べ一スと 照合調査する BLASTプログラムを使用して同定した。
結果を以下に記載する。 '
ヒト乳癌細胞株とヒト前立腺癌細胞株の混合 cDNAライブラリーより、 DLG1 (配 列番号： 2 7 ) の 142番目〜 310番目のアミノ酸配列をコードする cDNA断片を得た ヒト大脳由来 cDNAライブラリーより、 DLG3 (配列番号： 2 9 ) の 81番目〜 353 番目のアミノ酸配列をコードする cDNA断片を得た。 産業上の利用可能性
(a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と （b ) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 卵巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） などの予 防 -治療剤として、 上記結合を促進する物質は、 例えば神経変性疾患 （例、 アル ッハイマー病 （例、 家族性アルツハイマー病、 若年性アルツハイマー病、 孤発性 アルツハイマー病など） など） などの予防 ·治療剤として有用である。
配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩は、 癌、 神経変性疾患などの予防 ·治療剤のスクリーニングに有用で ある。

Claims

請求の範囲
1 . (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 お ょぴ （b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはそ の部分べプチドまたはその塩を含有する複合体。
2 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7 または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項 1記載の複合体。
3 . 請求項 1記載の複合体に対する抗体。
4 . 請求項 1記載の複合体の形成を阻害する抗体。
5 . 請求項 1記載の複合体の解離を促進する抗体。
6 . 請求項 1記載の複合体の形成を促進する抗体。. .
7 . 請求項 1記載の複合体の解離を阻害する抗体。
,
8 . 請求項 4記載の抗体を含有してなる医薬。
9 . 請求項 5記載の抗体を含有してなる医薬。
1 0 . 請求項 6記載の抗体を含有してなる医薬。
1 1 . 請求項 7記載の抗体を含有してなる医薬。
1 2 . 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 .治療 剤である請求項 8または 9記載の医薬。
.1 3 . 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤である 請求項 1 0または 1 1記載の医薬。
1 4 . 請求項 3〜7のいずれかに記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 5 . 癌または神経変性疾患の診断薬である請求項 1 4記載の診断薬。
1 6 . (a) 配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩、 および （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上記（a)記載のタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩のス クリーニング方法。
1 7 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 上記（a)記載のタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害または促進する化合物またはその塩の スクリーニング用キッ卜。
1 8 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド.またはその塩と
(b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩。
1 9 . 請求項 1 8記載の化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシ ス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 ·治療剤。
2 0 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と (b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩との結合を促進する化合物またはその塩。
2 1 . 請求項 2 0記載の化合物またはその塩を含有してなる神経細胞のアポトー シス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤。
2 2 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（a)記載のタンパク質もし くはその部分ペプチドまたはその塩と上記（b)記載のタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進または阻害する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法。
2 3 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 上記（a)記載のタンパク質も しくはその部分ペプチドまたはその塩と上記（ 記載のタンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進または阻害する化合物 またはその塩のスクリーニング用キット。
2 4 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と (b) 配列番号： 2 .7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進する化合物またはその塩。 2 5 . 請求項 2 4記載の化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポト一シ ス促進剤、 癌細胞の増殖阻害剤または癌の予防 ·治療剤。
2 6 . (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と (b) 配列番号： 2 7または （および） 配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を阻害する化合物またはその塩。 2 7 . 請求項 2 6記載の化合物またはその塩を含有してなる神経細胞のアポトー シス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤。
2 8 . (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と
(b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進法 または癌細胞の増殖阻害法。
2 9 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と
(b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の予防 ·治療法。
3 0 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と
(b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド またはその塩との結合を促進することを特徴とする神経細胞のアポトーシス阻害 法または神経変性疾患の予防 ·治療法。
3 1 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩と (b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表さ.れるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチド またはその塩を含有する複合体の解離を促進することを特徴とする癌細胞のアポ ト一シス促進法または癌細胞の増殖阻害法。
3 2 . (a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と (b)配列齊号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩を含有する複合体の解離を促進することを特徴とする癌の予防 ·治 療法。
3 3 . (a) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と
(b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩を含有する複合体の解離を阻害することを特徴とする神経細胞のァ ポトーシス阻害法または神経変性疾患の予防 ·治療法。
3 4 . 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする、 癌または神経変性疾患の予防 ·治療 作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
3 5 .癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖阻害剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（b)配列番 号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその 塩との結合を阻害する物質の使用。
3 6 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分ペプチドまたはその塩と （b)配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質の使用。 3 7 . 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤を製造 するための、 （a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩との結合を促進する物質の使用。
3 8 .癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖阻害剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と（b)配列番 号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩を含有する複合体の解離を促進する物質の使用。
3 9 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくは その部分ペプチドまたはその塩と （b) 配列番号： 2 7または配列番号 ·. 2 9で表 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する複合体の解離を促進す る物質の塩の使用。
4 0 . 神経細胞のアポトーシス阻害剤または神経変性疾患の予防 ·治療剤を製造 するための、 （a)配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩と （b) 配列番号： 2 7または配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を含有する複合体の解離を阻害する物質の使用.。
PCT/JP2005/010538 2004-06-03 2005-06-02 新規タンパク質複合体およびその用途 WO2005118631A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT05748510T ATE465175T1 (de) 2004-06-03 2005-06-02 Neuer proteinkomplex und anwendungen davon
JP2006514156A JPWO2005118631A1 (ja) 2004-06-03 2005-06-02 新規タンパク質複合体およびその用途
US11/628,410 US20090087423A1 (en) 2004-06-03 2005-06-02 Novel protein complex and use thereof
DE602005020786T DE602005020786D1 (de) 2004-06-03 2005-06-02 Neuer proteinkomplex und anwendungen davon
EP05748510A EP1760087B1 (en) 2004-06-03 2005-06-02 Novel protein complex and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-165407 2004-06-03
JP2004165407 2004-06-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005118631A1 true WO2005118631A1 (ja) 2005-12-15

Family

ID=35462884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/010538 WO2005118631A1 (ja) 2004-06-03 2005-06-02 新規タンパク質複合体およびその用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20090087423A1 (ja)
EP (1) EP1760087B1 (ja)
JP (1) JPWO2005118631A1 (ja)
AT (1) ATE465175T1 (ja)
DE (1) DE602005020786D1 (ja)
WO (1) WO2005118631A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007319121A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Toyobo Co Ltd ヒトパピローマウイルスの検出法及びタイピング方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11879000B2 (en) 2019-11-15 2024-01-23 National Guard Health Affairs Purification and identification of a protein complex containing b-cell lymphoma protein (BCL10)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012708A2 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2002006329A2 (en) 2000-07-18 2002-01-24 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
WO2002046465A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for identification of genes involved in specific diseases
WO2002086443A2 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2004058817A1 (ja) 2002-12-26 2004-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited 新規タンパク質およびその用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012708A2 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2002006329A2 (en) 2000-07-18 2002-01-24 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
WO2002046465A2 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for identification of genes involved in specific diseases
WO2002086443A2 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
WO2004058817A1 (ja) 2002-12-26 2004-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited 新規タンパク質およびその用途

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURKHARDT C. ET AL: "Semaphorin 4B interacts with the post-synaptic density protein PSD-95/SAP90 and is recruited to synapses through a C-terminal PDZ-binding motif.", FEBS LETT., vol. 579, no. 17, 2005, pages 3821 - 3828, XP004961978 *
BURKHARDT ET AL., FEBS LETTERS, vol. 579, 2005, pages 3821 - 3828
CLARK ET AL., GENOME RESEARCH, vol. 13, 2003, pages 2265 - 2270
CLARK H.F. ET AL: "The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment.", GENOME RES., vol. 13, no. 10, 2003, pages 2265 - 2270, XP001189293 *
DROSOPHILA, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 91, pages 9818 - 9822
INAGAKI ET AL., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, 2001, pages 9174 - 9181
INAGAKI S. ET AL: "Sema4c, a transmembrane semaphorin, interacts with a post-synaptic density protein, PSD-95.", J.BIOL CHEM., vol. 276, no. 12, 2001, pages 9174 - 9181, XP002991765 *
LIM ET AL., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, 2002, pages 21697 - 21711
LIM I.A. ET AL: "Selectivity and promiscuity of the first and second PDZ domains of PSD-95 and synapse-associated protein 102.", J BIOL CHEM., vol. 277, no. 24, 2002, pages 21697 - 21698, XP002991766 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007319121A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Toyobo Co Ltd ヒトパピローマウイルスの検出法及びタイピング方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1760087B1 (en) 2010-04-21
EP1760087A1 (en) 2007-03-07
EP1760087A4 (en) 2007-07-11
DE602005020786D1 (de) 2010-06-02
US20090087423A1 (en) 2009-04-02
JPWO2005118631A1 (ja) 2008-05-29
ATE465175T1 (de) 2010-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006098465A1 (ja) 癌の予防・治療剤
WO2001016309A1 (fr) Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant
JP4201712B2 (ja) Ｇｉｐ、グッドパスチャー抗原結合タンパク質と相互作用する転写因子活性を備えたポリペプチドのファミリー
WO2005118631A1 (ja) 新規タンパク質複合体およびその用途
US20050176632A1 (en) Angiogenesis inhibitors
WO2001083545A1 (fr) Nouvelle proteine et son utilisation
JP4530631B2 (ja) 新規タンパク質および癌の予防・治療剤
WO2005030805A1 (ja) 新規タンパク質複合体およびその用途
JP4429410B2 (ja) 新規生理活性物質、その製造法および用途
US20070275888A1 (en) Preventive/Remedy for Cancer
US20060110393A1 (en) Novel proteins and use thereof
US7723496B2 (en) Preventives/remedies for cancer
WO2002033071A1 (fr) Polypeptides analogues a la survivine et leurs adn
JP3472854B2 (ja) 新規タンパク質およびその用途
JP2005120082A (ja) 新規タンパク質複合体およびその用途
WO2004002514A1 (ja) 癌の予防・治療剤
JPH10276786A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2004039407A1 (ja) アポトーシス誘導剤
JP2002335964A (ja) 新規タンパク質およびその用途
JP2004105171A (ja) 癌の予防・治療剤
JP2003111594A (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
WO2004058969A1 (ja) がんの予防・治療剤
JP2004290177A (ja) 新規タンパク質およびその用途
JP2003289876A (ja) がんの予防および／または治療剤
WO2002050265A1 (fr) Nouvelles proteines transmembranaires du type recepteur et adn correspondants

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006514156

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005748510

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005748510

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11628410

Country of ref document: US