Verfahren zur Herstellung von partiell ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff- Nanoröhren, die Biomoleküle tragen, und deren Verwendung in Diagnose und Therapie
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von partiell ferromagnetisch gefüllten ein- oder mehrwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (carbon nanotubes, CNTs), die mit Eisen, Kobalt, Nickel oder einer Legierung daraus oder einer Legierung dieser Elemente mit Platin gefüllt sind und Biomoleküle tragen, wo- bei die Biomoleküle in der Röhre eingeschlossen und/oder mit der äußeren
Oberfläche der Röhre assoziiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Nanorohren in der Röhre zwei oder mehrere unterschiedliche Wirkstoffe beinhalten, die bei der Anwendung im Körper nacheinander freigesetzt werden. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen partiell ferromagnetisch gefüllten
Kohlenstoff-Nanoröhren in Diagnose und Therapie, insbesondere der Tumordiagnose und -therapie.
Es besteht nach wie vor ein Bedarf an diagnostischen und therapeutischen Mitteln, die in der Human- oder in der Veterinärmedizin verwendet werden können.
Aus der Literatur sind bereits Nanopartikel zur Anwendung in Diagnostik und Therapie bekannt. So werden z. B. in der Patentschrift EP 0625055 (DE 69328550 T2) fullerenartige Verbindungen mit magnetischen Molekülen, Ionen usw. versehen und insbesondere für diagnostische Bildgebungsverfahren eingesetzt. Ziel ist hierbei die Realisierung möglichst kleiner und damit su- perparamag netischer Teilchen, was für die angestrebten Kontrastmittel in diagnostischen Bildgebungsverfahren sinnvoll ist. Aufgrund des superparamag netischen Zustandes ist aber eine Energieumsetzung und damit neben der Dia- gnostik eine therapeutische Anwendung, z. B. in der Hyperthermie, nur eingeschränkt möglich.
Aus der Literatur sind auch magnetische Nanopartikel zur Anwendung in Diagnose und Therapie bekannt (vergleiche z.B. Q. A. Pankhurst et al., J. Phys.
D.: Appl. Phys. 36 (2003), R161-R181 ). Sie zeigen aber eine unregelmäßige
Geometrie und weisen in ihrer Struktur einen erheblichen Anteil von nanokri- stalliner oder amorpher Phase auf. Das beeinflusst die magnetischen Eigenschaften ungünstig. Für einen hohen Energieumsatz, z. B. für die Anwendung in der Hyperthermie wird eine möglichst große Fläche unter der Magnetisie- rungskurve angestrebt. Die bekannten magnetischen Nanopartikel sind für diese Anwendung nicht optimal und erlauben daneben auch keine gleichzeitige Beladung mit mehreren Therapeutika und/oder Diagnostika.
In diagnostischen und therapeutischen Mitteln wird darüber hinaus eine sehr enge Toleranz in den geometrischen Abmessungen und dem diagnostisch/therapeutischen Volumen der Wirkphase angestrebt. Diese Forderungen können mit den geometrisch unregelmäßigen Nanopartikeln nicht erreicht werden.
Aufgabe der Erfindung war es deshalb, universell als diagnostische und therapeutische Mittel nutzbare magnetische Verbindungen bereitzustellen, die vorteilhafterweise gleichzeitig sowohl als Diagnostika als auch als Therapeutika für die gleiche Krankheit dienen können und gegebenenfalls mehrere therapeutische Wirkstoffe tragen können oder als Depotform realisierbar sind. Aufgabe der Erfindung war es insbesondere, ein Verfahren zur Herstellung anzugeben, mit dem solche Verbindungen in ihren geometrischen Abmessungen und ihren magnetischen Eigenschaften stabil und definiert herstellbar sind.
Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen dar.
Es wurde gefunden, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren partiell ferromagnetisch, mit Eisen, Kobalt, Nickel oder einer Legierung daraus oder einer Legierung von Eisen, Kobalt, Nickel mit Platin, gefüllte Kohlenstoff-Nanoröhren, gezielt und reproduzierbar hergestellt werden können und in gewünschter Weise biochemisch funktionalisiert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Metallfüllung zu einem hohen Volumenanteil ein- oder polykristallin und weist ein Längen-Breiten-Verhältnis größer 1 auf. Bevorzugt ist die Metallfüllung in den Nanorohren nur partiell ausgebildet, um
das verbleibende Volumen für diagnostisch und/oder therapeutisch wirksame Verbindungen zur Verfügung zu haben. Eine 10 prozentige ferromagnetische Füllung ist beispielsweise schon ausreichend, um die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren in Bildgebungsverfahren, z. B. der MRI, zu verwenden. Erfindungsgemäß besitzt die ferromagnetische Füllung in der Kohlenstoff- Nanoröhre eine höhere Koerzitivfeldstärke als das gleiche ferromagnetische Material im bulk material.
Die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren können mehrwandig, aber auch einwandig sein. Die einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren sind für die er- findungsgemäße Verwendung bevorzugt und wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmalig hergestellt.
Die erfindungsgemäßen partiell ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff- Nanoröhren werden hergestellt, indem ein Substrat ganzflächig mit einer Schicht versehen wird, auf der die ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff- Nanoröhren nicht wachsen, z.B. einer Goldschicht, wobei deren Dicke in Abhängigkeit von der gewünschten Länge der Nanorohren ausgewählt ist, anschließend auf diese Schicht eine Fotolackschicht aufgebracht wird, nachfolgend mittels lithographischer Methoden ein Dotmuster in Form von Löchern, vorzugsweise zylindrischen Löchern, gleicher Größe eingebracht wird, wobei deren Durchmesser in Abhängigkeit von dem gewünschten Außendurchmesser der resultierenden Nanorohren ausgewählt ist, nun nach Belichtung und Resi- stentwicklung durch ein gerichtetes Ätzverfahren unter einem Winkel von ca. 90 ° die Schicht, auf der die ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren nicht wachsen, an den nicht mit Fotolack bedeckten Stellen so abgedünnt wird, dass Löcher in der Tiefe entstehen, die der gewünschten Länge der Nanoröh- • ren entsprechen, anschließend der Boden der Löcher mit einer katalytisch wirkenden Metallschicht beschichtet wird, nachfolgend in den Löchern mittels chemischer Gasphasenabscheidung vorwiegend (durch Pyrolyse von metallor- ganischen Verbindungen und/oder Kohlenwasserstoffen) partiell mit den ferro- magnetischen Materialien gefüllte Kohlenstoff-Nanoröhren abgeschieden werden, danach oberflächlich überstehende Anteile durch ein gerichtetes Ätzverfahren entfernt werden, anschließend die partiell mit den ferromagnetischen
Materialien gefüllten Nanorohren gegebenenfalls einer thermischen Behand- ■ lung unterzogen werden und danach die Nanorohren a) über die geöffnete Seite mit diagnostisch und/oder therapeutisch wirksamen Verbindungen befüllt, mit einem bioverträglichen und im Körper abbaubaren bzw. offenbaren Polymer oder Gel verschlossen, vom Substrat gelöst und gegegebenenfalls auf der Oberfläche mittels einer Carrier- Verbindung biofunktionalisiert werden oder b) mit einem bioverträglichen Polymer oder Gel verschlossen, vom Substrat gelöst und auf der Oberfläche mit diagnostisch und/oder therapeutisch wirksamen Verbindungen und gegebenenfalls zusätzlich mittels einer Car- rier-Verbindung biofunktionalisiert werden.
Als Ausgangsstoffe werden für die chemische Gasphasenabscheidung Metal- locene der Elemente Eisen, Kobalt, Nickel oder deren Gemische, Carbonyle dieser Metalle oder deren Gemische oder andere metallorganische Verbindungen dieser Elemente einzeln oder als Gemische, gegebenenfalls im Gemisch mit thermisch leicht zersetzbaren Platinverbindungen, eingesetzt.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Nanorohren weisen äußere Durchmesser zwischen 10 und 100 nm und bevorzugt eine maximale
Länge von 500 nm auf.
Es ist prinzipiell bekannt, dass ferromagnetische Kohlenstoff-Nanoröhren mittels chemischer Gasphasenabscheidung (Chemical Vapon Deposition, CVD) hergestellt werden können (A. Leonhardt et al. in „Diamond and Related Materials 3-7:790-793 (2002)"). Noch nicht beschrieben und nicht trivial ist jedoch die Herstellung von partiell ferromagnetisch gefüllten Nanorohren. Die Nanorohren der Erfindung sollen einerseits genügend ferromagnetische Füllung enthalten, um z.B. auch in der Hyperthermie eingesetzt werden zu können, ande- rerseits müssen auch die Wirkstoffe in genügender Menge einschließbar bzw. assoziierbar sein.
Bei der chemischen Gasphasenabscheidung kann das Wachstum der Nanorohren als partiell gefüllte Röhren erfindungsgemäß unter Anwendung eines
Zwei-Zonenofens realisiert werden, wobei in der ersten Niedertemperaturbereichszone die Sublimation der eingesetzten metallbeinhaltenden Verbindung realisiert wird und in der Hochtemperaturbereichszone die thermische Zersetzung der sublimierten Verbindung und des eingesetzten Kohlenwasserstoffes durchgeführt wird. Dabei werden vorteilhafterweise die Temperaturbereiche räumlich getrennt realisiert.
Bei der Verwendung von mehreren Precursoren mit sich deutlich unterscheidenden Sublimationstemperaturen kann es auch vorteilhaft sein, die Temperatur zur Zersetzung der einzelnen Ausgangsstoffe getrennt zu steuern und so von einem Zwei-Zonenofen auf einen Mehr-Zonenofen überzugehen. Die Zusammensetzung der einzelnen ferromagnetischen Komponenten in den Kohlenstoff-Nanoröhren kann dann in einfacher Weise auch durch die Temperatur zur Zersetzung der Einzelkomponenten gesteuert werden.
Es ist vorteilhaft, die Subliamtion der metallbeinhaltenden Ausgangsverbindungen im Temperaturbereich von 100 °C bis 175 °C durchzuführen. Das eigentliche Wachstum der metallgefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren erfolgt vorteilhaft in einem Temperaturbereich von 850 °C bis 1.050 °C. Hierfür werden die sublimierten Metallocene (Fe, Co, Ni), Carbonyle dieser Metalle oder metallorgani- sehe Verbindungen einzeln oder als Gemisch über ein metallbeschichtetes
Substrat (vorzugsweise Fe) transportiert.
Dem Gas kann wahlweise ein Kohlenwasserstoff zugegeben werden. Der Ort des Nanoröhren-Wachstums wird durch den Ort der katalytischen Metallpartikel auf dem vorbeschichteten Substrat bestimmt. Die Länge der gefüllten Röhren wird durch die Zeitdauer des CVD-Prozesses, der Sublimationstemperatur und damit der Konzentration der Precursoren, der Reaktionstemperatur sowie den Strömungsverhältnissen im Reaktor bestimmt. So kann z.B. zunächst das Wachstum einer leeren Kohlenstoffröhre erreicht werden, indem nur der Koh- lenwasserstoff (z. B. Acetylen) eingeleitet wird und dadurch die Röhren in den
Löchern, die mit dem Katalysator (z.B. Fe) beschichtet sind, ungefüllt wachsen und danach durch Ändern der Gasphase (Einleiten einer metallorganischen Verbindung und Beendigung der Kohlenwasserstoffzufuhr) die Röhren gefüllt weiter wachsen. Dieser Wechsel der Gasphase (z.B. Metallocen/Acetylen-
Wechsel) kann mehrfach erfolgen, so dass alternierend gefüllte und ungefüllte
Bereiche in den Nanorohren entstehen.
Um einwandige Nanorohren herzustellen, die erfindungsgemäß bevorzugt sind, werden im beschriebenen Verfahren als katalytische Metallbeschichtung auf den Böden der geätzten Löcher zwei- oder mehrkomponentige Legierungen
(vorzugsweise Fe/Mo) aufgebracht, um genügend kleine aktive Katalysatorpartikel, vorzugsweise Fe, die in der Legierung eingebettet sind, zu stabilisieren. Einwandige Nanorohren können auch hergestellt werden, indem in der Gasphase das Verhältnis von Metallkomponente zu Kohlenstoffkomponente in der Weise stark zur Seite der Metallkomponente verschoben wird, dass eine vollständige Umsetzung der Kohlenstoffkomponente in der Gasphase erfolgt.
Es hat sich weiter gezeigt, dass die hergestellten Nanorohren vor der Biofunktionalisierung thermisch behandelt werden können, damit die Kohlenstoffhülle für eine Biofunktionalisierung bzw. für die Anbindung von Carriermolekulen, die die Nanorohren zum Wirkort bringen sollen, stabil genug ist. Dazu wären ca. 3.000 °C bis 4.000 °C notwendig. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird diese thermische Behandlung jedoch als plasmachemische Behandlung in Argon oder Argon/Wasserstoff-Atmosphäre (bei ca. 800 °C bis 900 °C) durchgeführt, wodurch in der Kohlenstoffhülle eventuelle Strukturdefekte wirksam ausgeheilt werden können und dadurch ein hoher Grad an kristalliner Perfektion erreicht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ferro- magnetische Füllung, die gegebenenfalls noch Carbide oder paramagnetische
Bestandteile enthalten kann, nachträglich (aber vor der Biofunktionalisierung) thermisch behandelt und dabei derart umgewandelt, dass die Füllung ausschließlich aus den ferromagnetischen Modifikationen (in der Regel die α- Modifikationen) der Elemente Eisen, Kobalt oder Nickel besteht. Dadurch wird 20% weniger Füllung und weniger Energie für die Verwendung in diagnostischen oder/und therapeutischen Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nanorohren benötigt. Die nachträgliche thermische Umwandlung kann z.B. durch Glühen erfolgen, im Falle einer Eisenfüllung bei ca. 650 °C,kurz unterhalb der Curietemperatur. Für Nickel-Füllungen liegt die Glühtemperatur bei 350° C, bei
Kobalt-Füllung bei 1000° C. Für Legierungsfüllungen (z.B. Ni/Co) muß eine
Glühtemperatur gewählt werden, die entsprechend der Zusammensetzung der Legierung zwischen den Curietemperaturen der Einzelkomponenten liegt (hier zwischen 350 und 1000° C).
Thermische Behandlung bedeutet also im Sinne der Erfindung eine plasmachemische Behandlung zur Ausheilung von Strukturdefekten in der Kohlenstoffhülle und/oder eine thermische Behandlung der Füllung zum Erreichen einer ausschließlich ferromagnetischen Füllung.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, das gerichtete Ätzverfahren zum
Entfernen der oberflächlich überstehenden Anteile unter einem Winkel von 2 bis 45° zur Oberfläche des Substrates durchzuführen, vorzugsweise von 5 bis 15°. Vorzugsweise wird das gerichtete Ätzen mit Ionen mittels IBE (Ion Beam Etching), RIBE (Reactive Ion Beam Etching) oder CAIBE (Chemical Assisted Ion Beam Etching) durchgeführt.
Als bioverträgliches und im Körper abbaubares Polymer, mit dem die hergestellten Nanorohren verschlossen werden können, kommt beispielsweise Po- lyethylenglycol, ein Copolymer aus Milchsäure und Glycolsaure, ein Copolymer aus Milchsäure, Glycolsaure und PEG oder andere strukturverwandte Polymere zum Einsatz. Die Freisetzung eines Wirkstoffes aus den Nanorohren ist von der Art des verwendeten Polymers oder Gels abhängig. Als besonders günstig haben sich dabei Hydrogele erwiesen, die Wasser als Lösungsmittel enthalten. Diese Hydrogele sind gesundheitlich unbedenklich und weisen ein günstiges thermosensitives Quellverhalten auf. So besitzt z.B. Hydroxypropylcellulose
(HPC) eine UKLT (Untere kritische Lösungstemperatur) von 44°C +/- 2°C und ist damit für den angestrebten Effekt besonders geeignet. Eine thermorever- sible Verbindung kann durch eine weitere Vernetzung mit Divinylsulfon realisiert werden, bedingt aber eine hohe Toxizität. Dieses Problem ist durch Vernetzung auf Isocyanatbasis lösbar, da im Verlaufe der Reaktion eine Urethanbindung entsteht. Erfindungsgemäß werden solche Polymere/Gele zum Verschluss der Nanorohren eingesetzt, deren Quell- und Schrumpfverhalten durch Variation des Vernetzungsgrades definiert beeinflusst werden kann. In Abhängigkeit von der Temperatur kann ein reversibel einstellbarer Quellungsgrad zwischen 100%
und >1.500% erreicht werden. Bei dieser Art der Freisetzung wird oberhalb der
UKLT das Volumen des Gels stark verkleinert, so dass eine Freisetzung des Agens durch Diffusionsvorgänge(Variante F1 ) erfolgt.
Bei Verwendung von Gelen, die oberhalb einer kritischen Temperatur das Vo- lumen extrem vergrößern, wird die Nanoröhre durch die Volumenvergrößerung irreversibel zerstört (Variante F2) und dadurch das Agens freigesetzt. Solche Gele sind z.B. Blockcopolymere auf Basis von PNIPAAm (Poly(N- isopropylacrylamide)). Die Blockcopolymere sollten mit einem modifizierten Poly(ethylenoxid) PEO-Makroinitiator durch ATRP (Atom Transfer Radical Po- lymerization) hergestellt werden. Durch geeignete Wahl der Polymerzusammensetzung und des Vernetzungsgrades kann die Temperatur der Volumenvergrößerung in ausreichend weiten Temperaturbereichen, z.B. auf 47° C eingestellt werden und so die Öffnung der Nanorohren durch die Volumenvergrößerung des Polymers erreicht werden. Weitere mögliche Materialien für die Va- rianten F1 oder F2 sind bekannt. Die Löslichkeitseigenschaften der verwendeten Gele können den zu erwartenden Umgebungsbedingungen, z.B. Gewebe, Blut oder andere Körperflüssigkeiten angepasst werden und damit die Öffnung der Nanorohren im Körper gesteuert werden.
Die Befüllung der einseitig geöffneten Nanoröhre mit einer diagnostisch und/oder therapeutisch wirksamen Verbindung kann z.B. durch die Abscheidung dieser Verbindung aus der Gasphase erfolgen. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um Metallionen enthaltende Fullerene handeln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die hergestellten und partiell mit ferromagnetischen Materialien befüllten Nanorohren, die an einem Ende noch offen sind, alternierend mit therapeutisch/diagnostisch wirksamen Verbindungen und bioverträglichen Polymeren befüllt, wobei die bioverträglichen Polymere so ausgewählt sind, dass jedes bei anderen Be- dingungen, vorzugsweise be einer anderen Temperatur im Körper abbaubar ist.
Dadurch können intrinsische Depotformen realisiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden partiell ferromagnetisch befüllte Kohlstoff-Nanoröhren des Grundtyps 1 (Abb. 6) und des Grundtyps 2 (Abb. 7) hergestellt.
Zur Herstellung des Grundtyps 1 lässt man die Nanorohren zunächst gefüllt und dann ungefüllt bis zu einer solchen Länge wachsen, dass im Verfahrensschritt a) nach Befüllung mit einem ersten Wirkstoff und Verschluss mit einem ersten Polymer/Gel (Polymer 1 ) ein weiterer Wirkstoff oder der gleiche Wirkstoff nochmals eingebracht werden kann und mit einem zweiten, z.B. bei einer niedrigeren Temperatur im Körper abbaubaren, Polymer/Gel (Polymer 2) verschlos- sen wird. Bei der therapeutischen Anwendung wird nun beispielsweise bei
42 °C das Polymer 2 entfernt und damit der Wirkstoff freigesetzt, der auf zellulärer Ebene reagieren kann. Zu einem späteren Zeitpunkt wird die Temperatur auf 47 °C erhöht und der Wirkstoff der zweiten Kammer wird freigesetzt. Handelt es sich um den gleichen Wirkstoff (z.B. um cis-Platin), so kann damit die Wirkstoffkonzentration über längere Zeit konstant gehalten werden.
Beim Grundtyp 2 (vergleiche Abb. 7) werden die Nanorohren wie oben beschrieben so hergestellt, dass die ferromagnetische Füllung mittig beinhaltet ist und beidseitig gleiche oder unterschiedliche Wirkstoffe durch Polymere/Gele, die bei unterschiedlicher Temperatur im Körper abbaubar sind, eingeschlossen sind. Da im Herstellungsprozess einseitig geschlossene Nanorohren entstehen, müssen diese an der geschlossenen Seite geöffnet werden. Vorzugsweise wird dies mit einem Argon-/Sauerstoff-Niederdruckplasma erreicht.
Das Verschließen der mit Wirkstoff befüllten Nanorohren wird bevorzugt mittels
Argon-Plasmapolymerisation von Monomeren, die temperaturempfindlich sind, vorgenommen.
Die Biofunktionalisierung der erfindungsgemäßen Nanorohren an der äußeren Oberfläche wird mit bekannten Verfahren vorgenommen. Diese sind beispielsweise in EP 0625055 ausführlich beschrieben.
Die Biofunktionalisierung kann beispielsweise über eine kovalente Substitution an die Carbonhülle bzw., wie oben beschrieben, eine verschliessbare Polymer-
kappe erfolgen. Funktionelle Gruppe bedeutet eine chemische Gruppe, die an eine spezifische Komponente binden kann und somit den Nanocontainer mit einer spezifischen Komponente assoziiert. Beispiel dafür sind monoklonale oder polyklonale Antikörper, Fab-Fragmente polyklonaler und Fab2-Fragmente monoklonaler Antikörper, fusionierte und nichtfusionierte Einzel- und Mehrket- ten-Erkennungsmotive.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Biofunktionalisierung der äußeren Oberfläche der Kohlenstoff-Nanoröhren derart vorgenommen, dass die Nanorohren außen partiell mit einem Metall versehen werden, das die gezielte Anbindung der diagnostisch und/oder therapeutisch wirksamen Verbindungen an dieser Stelle ermöglicht.
Prinzipiell ist es möglich, die ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren definiert mit zusätzlichen „Andockstellen" für Biomoleküle zu versehen. Das wird beispielsweise dadurch erreicht, dass nach Erzeugung der zylindrischen
Löcher in der Goldschicht gemäß Ausführungsbeispiel 1 als erstes nicht eine für das Wachstum der Nanorohren katalytisch wirkendes Metall abgeschieden wird, sondern ein für die Anbindung der Biomoleküle bevorzugtes Metall, z.B. Niob und erst in dem darauf folgenden Beschichtungsschritt das katalytisch wirkende Metall. Nach Entfernung des Fotolackes erfolgt auch hier gemäß
Ausführungsbeispiel 1 das Wachstum der ferromagnetisch teilgefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren. Im Darstellungsprozess erfolgt das Wachstum ausgehend von der Metallschicht unter Umsetzung dieser Metallanteile. Im späteren Ver- einzelungsprozess durch Ätzung der Goldschicht wird das Niob nicht von den ferromagnetisch und ggf. agens-gefüllten Nanorohren entfernt und steht somit zur Anbindung der Biomoleküle zur Verfügung. Bei dieser Herstellungsvariante befindet sich der partiell beschichtete Anteil gegenüber der durch das bioverträgliche Polymer verschlossenen Nanoröhrenöffnung.
Die erfindungsgemäß hergestellten und biofunktionalisierten Kohlenstoff-
Nanoröhren werden nach der Herstellung notwendigen Reinigungs- und Spülprozessen unterzogen, wobei die Nanorohren durch Permanentmagneten an der Gefäßwand gehalten werden. Danach sind sie nach galenischer Formulierung für eine Diagnostik und/oder Therapie einsatzbereit. Die Herstellungspro-
zeduren, die Aufbereitung, Funktionalisierung und galenische Formulierung erfolgen dabei stets unter sterilen Bedingungen, wie sie zur Herstellung pharmazeutischer Mittel üblich sind.
Ein wesentlicher Vorteil der Nutzung von Substraten im Herstellungsprozess der Nanorohren besteht darin, dass der Durchmesser der biofunktionalisierten
Kohlenstoff-Nanoröhren entscheidend durch den Durchmesser der Strukturätzung, die Länge der biofunktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren dagegen durch die Tiefe dieser Ätzung in die Goldschicht bestimmt bzw. mitbestimmt wird. Nur dadurch ist - im Gegensatz zu anderen Herstellungsmethoden - die Einhaltung enger Toleranzen im Endprodukt möglich.
Bei Verzicht auf eine Agens-Füllung kann prinzipiell auch auf die Verwendung von Substraten verzichtet werden und die Darstellung der ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren als „Pulver" im CVD-Reaktor erfolgen. Die Biofunktionalisierung erfolgt nach den dann zusätzlich erforderlichen chemischen Reinigungsschritten in analoger Weise.
Als diagnostische Einheiten sind im Sinne der Erfindung Biomoleküle, Elemente mit Ordnungszahlen über 50, Chromophore oder Fluorophore zu verstehen. Therapeutisch wirksame Einheiten sind gemäß der Erfindung Moleküle, die chemisch oder gentechnisch hergestellte pharmazeutische Wirkstoffe darstellen, z. B. Chemotherapeutika. Biomoleküle sind im Sinne der Erfindung vorzugsweise Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, deren Fragmente, Enzyme, Hormone oder Polysaccharide.
Bei den diagnostisch wirksamen Biomolekülen handelt es sich um Affinitätsmoleküle zur spezifischen Erkennung und Bindung an ein oder mehrere Zielmoleküle. Dies können beispielsweise Peptide oder Proteine (z.B. Antikörper, Rezeptoren, Antigene, Lektine, Avidine Oligopeptide, Lipoproteine, Glycopro- teine, Peptidhormone), Nucleinsäuren, Kohlenhydrate oder Liganden mit nied- rigem Molekulargewicht sein.
Die erfindungsgemäßen Nanorohren können an der äußeren Oberfläche ausschließlich oder zusätzlich zu den diagnostischen oder therapeutischen Ein-
heiten Carriermoleküle, z.B. kationische Lipide oder Antikörper, tragen, die den
Transport zur Targetzelle bzw. zum bevorzugten Wirkort vermitteln.
Die an der äußeren Oberfläche der Röhre assoziierten Biomoleküle und/oder Carriermoleküle können konjugiert oder direkt oder über einen Linker gebunden sein.
Gegenstand der Erfindung sind neben dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren auch die so hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren.
Die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren können vorteilhaft zur Therapie eingesetzt werden. Die Biomoleküle auf der Oberfläche der Nanoröhre erlauben es z.B., dass die Nanorohren gezielt zu einer bestimmten biologischen Einheit (Zelle, Gewebeverband bzw. Organ) im Körper transportiert werden. Beispielsweise wird eine mit Antikörpern beschichtete Nanoröhre im Körper zum entsprechenden Antigen transportiert. Gleichzeitig können die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren einen Wirkstoff, z.B. ein Antitumormittel (Doxorubicin (Handelsname Adriamycin), Paclitaxel und deren Derivate (Taxol, Taxane etc.), Vincristin, Carboplatin, Cisplatin, Epirubicin, Fluoruracil, Ifosfamid, Methotrexat, Mitomycin, Vinblastin, Irinotecan, Mitoxantron), oder Radionuklide enthalten, die somit in die gewünschte Zielregion, z.B. den Tumor transportiert werden. Die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren können auch als Depotformen fungieren, die das Arzneimittel definiert verzögert freisetzen, wobei die Depotfunktion durch verschiedene wirkstoffhaltige Abschnitte in der Röhre realisiert wird, deren Begrenzungen stufenweise abgebaut werden und damit der Wirkstoff zeitlich versetzt und dosiert freigesetzt wird. Der stufenweise Abbau kann z.B. temperaturabhängig erfolgen.
Für therapeutische Zwecke ist es mit den erfindungsgemäßen Kohlenstoff- Nanoröhren ebenfalls möglich, einen nukleinsäuer-basierten Vektor, der das therapeutische Gen oder Teile davon trägt, in die Röhre einzuschließen und dieses am gewünschten Wirkort in Kontakt mit dem Gewebe zu bringen, um die Effizienz der Gentransfektion und -expression zu steigern. Es ist auch möglich, den viralen Vektor, der das therapeutische Gen trägt, auf die Oberfläche der Kohlenstoff-Nanoröhren zu bringen. Durch externe magnetische Felder kann
dieser Träger dann am Zielort gehalten werden, um den Virus längere Zeit in
Kontakt mit dem entsprechende Gewebe zu bringen.
Ein wichtiges Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Nanorohren ist die Hyperthermie, bei der die erfindungsgemäßen Nanorohren durch ein magneti- sches Feld oder thermisch zur Wärmeaufnahme angeregt werden, die sie dann an den Krankheitsherd, z.B. den Tumor, abgeben.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, Nanorohren mit einer Länge zwischen ca. 10-20 μm in malignes Gewebe zu injizieren, so dass dort eine lokale Kon- zentration und die Wirkstofffreisetzung bzw. thermische Anregung erfolgen kann. Sind die Nanorohren erfindungsgemäß noch zusätzlich mit diagnostischen Einheiten versehen, so kann prätherapeutisch eine Tumordiagnostik (Primärtumor, Rezidiv und/oder Metastase) erfolgen. Die Nanorohren können daneben auch so biofunktionalisiert sein, dass sie von Tumorzellen verstärkt aufgenommen werden (vgl. Beispiel 2).
Ein alternativer Therapieansatz bedient sich einer magnetisch-basierten in vivo- Verbringung von Nanorohren minimaler Abmessungen, deren Länge nicht mehr als 100 nm beträgt: mit miniaturisierten Supermagneten, die gezielt, einzeln oder multiple, temporär peritumoral implementiert werden, können biofunktio- nalisierte Nanorohren, die systemisch oder in relativer Nähe zum Tumorherd in eine Körperflüssigkeit gespritzt werden, am Tumorherd aufkonzentriert werden. Die Effizienz dieses Transfers kann durch verschiedene Parameter direkt be- einflusst werden (u.a. Stärke des Magnetfeldes und Grad der Befüllung der Nanorohren). Nach erfolgter lokaler Therapie werden die miniaturisierten Supermagneten wieder explantiert.
In einer weiteren Auführungsform werden Nanorohren ex-vivo bestrahlt, wodurch das Eisen, welches die partielle Füllung der Nanorohren ausmacht, zu radioaktivem Eisen umgewandelt wird. Diese Radionuklide können anschlie- ssend als Therapeutikum, verpackt in Form einer Nanoröhre, verwendet werden.
Neben den beschriebenen Diagnose- und Therapieverfahren sind die erfindungsgemäßen ferromagnetischen Kohlenstoff-Nanoröhren auch ohne eingeschlossene oder in der äußeren Oberfläche assoziierte Biomoleküle sehr gut zur Diagnose geeignet, da sie durch die ferromagnetischen Eigenschaften magnetisch und/oder thermisch anregbar sind. Die an der Kohlenstoffoberfläche assoziierten Biomoleküle haben den Vorteil, dass eine zusätzliche Bindung an und ein Transport zum Target-Molekül erfolgen kann.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren als diagnostisches und/oder therapeutisches Mittel, insbesondere zur Tumordiagnose und -therapie. Das diagnostische und/oder therapeutische Mittel wird bereitgestellt, indem die erfindungsgemäß hergestellten physiologisch verträglichen Kohlenstoff-Nanoröhren mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen formuliert werden. Hilfsstoffe im Sinne der Erfindung sind Formulierungshilfsmittel, wie z.B. Träger, Antioxidantien, Stabili- satoren oder Puffer.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die pharmazeutischen Mittel zur i.v.-Applikation vorgesehen. Die Bereitsellung der entsprechenden Infusions- bzw. Injektionslösungen erfolgt vorzugsweise mit physiolo- gischer Kochsalzlösung. Die diagnostischen oder therapeutischen Mittel können aber auch i.m., i.p. oder oral verabreicht werden. Im Falle solider Tumore, die mit den erfindungsgemäßen CNTs behandelt werden, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, werden die CNTs peri- oder intratumoral, d.h. in den tumorbenachbarten Gewebeverband oder direkt in den Tumor, injiziert.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung, insbesondere von Harnblasen- und Prostatakarzinom, bei dem dem Probanden eine wirksame Menge, vorzugsweise 10mg bis. 500mg pro Zielläsion in Abhängigkeit von der Größe des Tumors, der erfin- dungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren verabreicht wird.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten ferromagnetisch gefüllten und biofunktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren weisen gegenüber dem Stand der Technik eine Reihe wesentlicher Vorteile auf. Sie sind insbe-
sondere in ihren geometrischen Abmessungen und ihren magnetischen Eigenschaften definiert herstellbar und können durch die Möglichkeit der kontrollierten Öffnung und Schließung zusätzlich gezielt befüllt werden. Durch die Prozessführung bei der erfindungsgemäßen Darstellung der Kohlenstoff- Nanoröhren ist weiterhin eine Beeinflussung der Anzahl der Kohlenstoffhüllen um den Kern und damit eine Anpassung der chemischen Resistenz an die gewünschten Einsatzbedingungen möglich. Erstmals werden einwandige ferromagnetisch gefüllte Kohlenstoff-Nanoröhren hergestellt. Die erfindungsgemäß hergestellten CNTs sind äußerst stabil. Im Gegensatz zu jeder anderen bisher für Nanopartikel beschriebenen Herstellungsmethode können die Nanorohren an der Außenseite partiell mit einem weiteren Metall versehen werden, was die gezielte Anbindung von Biomolekülen an diesen Stellen ermöglicht.
Im Weiteren wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung ferromagnetischer Wirkstoff-gefüllter und an der Oberfläche bio- funktionalisierter Nanorohren
Die Herstellung der erfindungsgemäßen partiell ferromagnetisch und partiell
Agens-gefüllter Nanorohren lässt sich vorteilhafterweise durch Wachstum und Manipulation der Nanomaterialien auf Substraten realisierten. Die Abbildungen 1 bis 4 zeigen die Prinzipskizze zur Herstellung. Abb. 1 zeigt ein Substrat mit 5 nm dicker Fe-Schicht auf Au und auf Fotolack. Abb. 2 zeigt das Substrat mit partiell gefüllter Nanoröhre nach dem CVD-
Wachstum. Die Ätzrichtung beim Argon-Ionen-Strahlätzen zur Entfernung der überstehenden Anteile ist durch Pfeile angegeben.
Abb. 3 zeigt das Substrat nach Kürzung, Füllung und Verschließung der Nanorohren. Abb. 4 zeigt das Endprodukt nach Ätzung der Au-Schicht und Aufbereitung der funktionalisierten Nanorohren.
Als Substrat dient ein thermisch oxidierter Siliziumwafer mit einer Oxidschichtdicke von 1 μm. Durch geeignete Beschichtungsmethoden - z.B. thermische
Verdampfung - wird auf dieses Substrat ganzflächig eine 200nm dicke Goldschicht aufgetragen. Anschließend wird eine 1 μm dicke Fotolackschicht aufgebracht. Im folgenden Prozeßschritt wird durch lithographische Methoden, z.B. Elektronenstrahllithographie, ein regelmäßiges Dotmuster realisiert. Die Einzelstrukturen weisen einen Durchmesser von 80nm bei einem Abstand von 400nm auf. Durch die Größe dieser Strukturen kann der spätere Außendurchmesser der Kohlenstoff-Nanoröhren wesentlich mitbestimmt werden. Nach der Belichtung und der erforderlichen Resistentwicklung werden die Substrate in Reinstwasser gespült und getrocknet. Durch Argon-Ionenstrahlätzen unter einem Winkel von 90° relativ zur Probenoberfläche wird die 200nm dicke Goldschicht - an den Stellen, die nicht mit Fotolack bedeckt sind - partiell abgedünnt, so dass in der Au-Schicht ca. 150nm tiefe Löcher entstehen. Durch diese Ätztiefe wird die spätere Länge der biofunktionalisierten Nanorohren bestimmt. Dieser Ätzvorgang wird bei folgenden Bedingungen durchgeführt: Ätzgas: Argon, Druck: 6x10"4 mbar, Beschleunigungsspannung: 400V, Mikrowellenlei- stung: 170 W.
Im Folgeschritt werden die geätzten Substrate mit dem noch vorhandenen Fotolack einer weiteren Beschichtung unterzogen. Durch Elektronenstrahlver- dampfung wird eine ca. 5nm dicke Eisenschicht abgeschieden und das beschichtete Substrat nachfolgend in Aceton (15 min) behandelt. Hierbei erfolgt ein Ablösen des Fotolackes und damit ein Abheben der auf dem Fotolack abgeschiedenen Fe-Schichtanteile. Die katalytisch wirkenden Fe-Anteile befinden sich nunmehr nur in den tiefergeätzten Au-Bereichen. Vor Beginn der eigentlichen Herstellung der Nanorohren ist es vorteilhaft eine Reinigung des vorstrukturierten Substrates in einem Wasserstoffplasma durch- zuführen.
Das vorstrukturierte Substrat wird nun in die Reaktionszone eines Chemical- VapourDeposition(CVD)-Reaktors auf 900°C aufgewärmt. Der verwendete CVD-Reaktor gestattet es, die Temperatur in mehreren Zonen unabhängig voneinander definiert einzustellen und den Wachstumsprozeß unter Schutzgas- oder Vakuumbedingungen durchzuführen. Für die Herstellung der partiell ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren wird als Ausgangsstoff Fer- rocene (0,3 g in einem Tiegel) eingesetzt. Dieser Precursor wird bei einer Temperatur von 180°C außerhalb der eigentlichen Reaktionszone sublimiert. Als Trägergas, das den sublimierte Precursor in die eigentliche Reaktionszone
transportiert, wird Argon eingesetzt. Das hier eingesetzte Metallocen ist sowohl
Quelle des ferromagnetischen Materials als auch Quelle des Kohlenstoffes für die Hülle. Unter den realisierten Bedingungen werden innerhalb der ersten 3 min, vorzugsweise innerhalb von 1 min, ca. 50 nm lange, vollständig Fe- gefüllte Kohlenstoffröhren abgeschieden. Zur Realisierung im Endergebnis nur partiell gefüllter Nanorohren wird nunmehr die Temperatur der Metallprecurso- ren von 180° C sehr schnell auf eine Temperatur <100° C vermindertund ein gasförmiger Kohlenwasserstoff (Acetylen) in den Reaktor eingeleitet. Dadurch wird erreicht, dass sich nach kurzer Zeit nur noch der Kohlenwasserstoff in der Gasphase befindet und so die Nanorohren nur noch ungefüllt weiter wachsen, da kein weiteres Füllmaterial aus der Gasphase angeboten wird.
Infolge geringer Temperaturschwankungen, unterschiedlicher Strömungsverhältnisse und/oder Schwankungen der Precursoren-Konzentration können die hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren eine Variation in der Länge aufweisen. Zur Herstellung gleichlanger partiell gefüllter Kohlenstoff-Nanoröhren werden diese im nachfolgenden Technologieschritt einem gerichteten Ätzprozess unterworfen. Durch Argon-Ionenstrahlätzen unter einem Winkel von 8° relativ zur Probenoberfläche werden die oberhalb der ungeätzten Au-Oberfläche liegenden Anteile entfernt. Dieser Ätzvorgang wird bei folgenden Bedingungen durchgeführt: Ätzgas: Ar- gon, Druck: 6x10"4 mbar, Beschleunigungsspannung: 400V, Mikrowellenleistung: 170 W.
Die partiell ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren sind somit auf der dem Substrat abgewandten Seite geöffnet und können mit einem ersten Agens, z.B. einem Therapeutikum partiell weiter gefüllt werden. Die Länge der Agens- Füllung beträgt z.B. 20nm. Zum definierten Abschluß des Agens wird der noch ungefüllte Teil der Kohlenstoff-Nanoröhre mit einem bioverträglichen Polymer gefüllt, das bei einer bestimmten Temperatur im Körper abbaubar ist. Dieses bioverträgliche Polymer ist z.B. bei 42,5°C abbaubar. Bei Bedarf können weitere Abschnitte mit abwechselnden Anteilen von Agens und bioverträglichem Polymer realisiert werden. Hierbei ist der Schmelzpunkt des bioverträglichen
Polymers jeweils um 1 °C zu vermindern, so dass bei der späteren therapeutischen Anwendung die Freisetzung des Therapeutikums durch die Änderung der Temperatur gesteuert werden kann. Die Änderung der Temperatur kann
dabei über die in der ferromagnetischen Füllung umgesetzten Energie leicht gesteuert werden.
Die bioverträglichen Polymere sind also so zu wählen, dass zunächst bei der geringsten Temperatur das Polymer abgebaut wird, das die Röhre verschließt und danach bei stufenweiser Temperaturerhöhung die weiteren Polymere stu- fenweise abgebaut werden, so dass ein Wirkstoff nach dem anderen freigesetzt wird. Befindet sich in den einzelnen Abschnitten der Röhre der gleiche Wirkstoff, so lässt sich auf diese Weise eine verzögerte Freisetzung (Depotform, sustained release) realisieren. Nach Realisierung der angestrebten Füllungen werden die funktionalisierten Kohlenstoff-Nanoröhren vom Substrat getrennt. Hierzu wird das auf dem Substrat befindliche Gold in einer Lösung (bestehend aus 0,06 mol/l KJ, 0,09 mol/l J2 und 0,005 mol/l Alkohol) für 10 min behandelt. Ähnlich einem „lift-off '-Prozeß wird das unter den funktionalisierten Nanorohren befindliche Gold entfernt und den Nanorohren dadurch der Halt entzogen. Die Nanorohren befinden sich nunmehr in der Ätzlösung. Da die partiell gefüllten Nanorohren ferromagnetische Eigenschaften besitzen, können sie durch einen Permanentmagneten problemlos an der Gefäßwand festgehalten werden. In diesem Zustand ist eine Spülung mit Wasser zur Entfernung der Ätzmittelreste möglich. Durch die Anwendung von Permanent- oder Elektromagneten erfolgt gleichzeitig eine Tren- nung der ferromagnetisch gefüllten von den nicht ausreichend ferromagnetisch gefüllten Nanorohren. Die nicht ausreichend gefüllten Röhren werden mit dem Wasser abtransportiert. Die Entfernung der Ätzmittelreste kann selbstverständlich auch durch Standspülungen unter Anwendung von Ultraschall erfolgen. Dabei ist es vorteilhaft dem Wasser ein Volumenanteil von mindestens 1 % Al- kohol zuzusetzen. Hierdurch wird die Realisierung der Wasser/Nanotube-
Suspension wesentlich erleichtert.
In einem nachfolgenden Arbeitsgang erfolgt die Biofunktionalisierung der äußeren Oberfläche der Röhren in Lösung. Analog der in der Literatur beschriebenen Möglichkeiten zur Funktionalisierung von Kohlenstoff-Nanoröhren (Zheng et al. (2003), Nature Materials 2: 338-342) können einzelne Kohlenstoff-
Nanoröhren beispielsweise mit einzelsträngigen (ssDNA) und therapeutisch wirksamen DNA-Molekülen via „π-stacking" gebunden werden. Die Bindung eines ssDNA-Moleküls kommt über verschiedene Mechanismen zustande und kann partiell oder über die vollständige Länge dieser Struktur erfolgen, wobei
bespielhaft eine helikale Verpackung mit links- und rechtsgedrehten „turns" und eine einfache Oberflächenadsorption genannt seien. Eine solche Dispersion funktionalisiert die Kohlenstoff-Nanoröhre per se, da die Hybride aufgrund der Phosphatgruppe des ssDNA-Moleküls negativ geladen sind. Diese Dispersion kann beispielhaft auch mit kurzen doppelsträngigen DNA- Molekülen (dsDNA), siRNA-Konstrukten oder RNA-Molekülen erfolgen.
In diesen Fällen dient die Kohlenstoff-Nanoröhre als kombinierte Carrier- Shuttle-Funktionseinheit für den Transport von therapeutisch wirksamen Substanzen an einen Wirkort im Körper eines Lebewesens. Eine solche Struktureinheit kann zudem mit Hilfe eines zusätzlichen Carriers, beispielsweise eines kationischen Lipides, umhüllt und verbracht werden.
Beispiel 2
Svstemische Behandlung eines fortgeschrittenen Prostatakarzinoms (PCa) Im Rahmen der Behandlung einer fortgeschrittenen Tumorerkrankung, beispielsweise eines diffus metastasierten Prostatakarzinoms, werden nach konventioneller diagnostischer Lokalisierung der Metastasenherde partiell Nanorohren peritumoral bzw. intratumoral in das maligne Gewebe injiziert. Bei Verwendung von „langen" Nanorohren mit einer Länge von ca. 10-20 μm, die eine lokale Konzentration im Zielgewebe garantiert (keine freie Diffusion möglich), erfolgt eine thermische Anregung bzw. Freisetzung der in oder an der Nanoröhre ein- bzw. angebrachten antitumoralen Wirkstoffe. Dazu kann beispielweise eine Markierung der Nanorohren mit Cholin erfolgen, was zu einer relativ vermehrten Aufnahme durch die Tumorzellen (im Vergleich zu den umgebenden, nichtmalignen Zellen) führt. Diese Markierungen sind zudem beispielsweise mittels PET-Computertomografie für eine additive prätherapeutische Metastasendiagnostik geeignet. Die Metastasenherde sind ab einer Größe von wenigen Millimetern auf diese Weise darstellbar, und können nachfolgend sofort behandelt werden.
Beispiel 3
Lokale Behandlung eines Harnblasenkarzinoms (BCa) Mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren wird eine In- stillationstherapie der Harnblase eines an einem Harnblasenkarzinom erkrankten Patienten durchgeführt. Unter Verwendung eines hochpräzisen und von außen an die Harnblasenwand angelegten Magnetfeldes werden die ferromagnetisch gefüllten Kohlenstoff-Nanoröhren gemäß Beispiel 1 an den Resektionsort eines oberflächlichen Harnblasentumorareals konzentriert. Unter thermischer Anregung wird in einem nachfolgenden Schritt der Wirkstoff im Resektionsbett des Tumors freigesetzt. Abb. 5 zeigt die klinisch lokale Therapie gegen oberflächliche Tumoren der menschlichen Harnblase (Blasenkarzinom, BCa) unter Verwendung der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren, die mit Antisense-DNA- Konstrukten beschichtet sind. Der Tumor wird mittels Elektroresektion entfernt. Die Resektionsränder (Abset- zungsränder nach Entfernung der Tumormasse) werden nach entsprechender
Lagerung der Harnblase ein- oder zweizeitig mit einer konzentrierten, definierten Lösung überschichtet und inkubiert. Diese Behandlungsform kann im Rahmen von Nachresektionen (sekundäre transurethrale Blasentumorresektion, TUR-B, bzw. bei zystoskopischer Nachkontrolle wiederholt bzw. modifiziert werden. Sie kann zudem auch mit konservativen lokalen Chemotherapien (Mi- tomycin-C, Bacillus-Calmette-Guerin) kombiniert werden. Dabei können diese Wirkstoffe sowohl in der Nanoröhre implementiert sein und gerichtet freigesetzt werden als auch in Form einer äusseren Komplexierung mit den Nanorohren Anwendung finden.
Beispiel 4
Hvperthermische Tumorbehandlung
Die gemäß Beispiel 1 hergestellten Kohlenstoff-Nanoröhren werden nach Ap- plikation und Targeting an ein Harnblasenkarzinom (BCa) durch externe Bestrahlung zur Wärmeaufnahme angeregt. Ihre Lokalisiserung bedingt eine lokale Aufheizung des Tumorgewebes und damit einen therapieeffizienten und selektiven Untergang von Tumorzellen.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Kohlenstoff-Nanoröhren zur Diagnose (Ortung) dieses Tumors dienen, wenn sie entsprechende Diagnoseeinheiten tragen. Dadurch ist eine zeitliche und dosierbare Kombination von Tumordiagnose und Tumorbehandlung möglich.
Beispiel 5
Intrazellulärer Nachweis von CNT-Clustern
Adhärent wachsende humane Harnblasenkarzinomzellen (EJ28-Zellinie) wurden 2 h mit einem Gemisch aus partiell ferromagnetisch gefüllten CNTs ohne Wirkstoff und einem kationischen Lipid inkubiert, anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mittels Trypsin-EDTA-Verdau von Kulturgefäß abgelöst, zentrifugiert und nach Standardprotokollen in Harz eingebettet. Die transmissionselektronenmikropskopische Untersuchung (oben) von 55nm- Dünnschnitten zeigen eine Internalisierung der CNT ins Zytoplasma der Zellen. Anhand der im Transmissionselektronenmikroskop an, in die Tumorzelle aufgenommenen und -durch die Präparation- quergeschnittenen Nanorohren, durchgeführten EDX-Analyse wird eindeutig belegt, dass die lokalisierten Stru- turen mit Eisen gefüllt sind. Neben den charakteristischen Linien Fe-L und Fe-K wird als weitere Hauptkomponente nur Kohlenstoff nachgewiesen. Abb. 10 zeigt eine TEM-Aufnahme und ein EDX-Spektrum einer Fe-gefüllten
Kohlenstoffnanoröhre in einer EJ28-Tumorzelle (vor der Hyperthermie- behandlung).
Beispiel 6
Durchflußzvtometrie (FACS-Analvse im FSC-SSC-Dotblot: FACScan. Becton Dickinson) an PC-3 Prostatakarzinomzellen nach Inkubation mit CNT's (vgl. Abb. 11).
Eine CNT-Lösung (ohne Zellen, links) ist mittels FACS charakterisierbar (Dar- Stellung des Gesamtergebnis für 2x10E4 untersuchte Zellen), wobei die nachweisbaren Partikel eine große Streubreite an Granularität aufweisen, was auf eine signifikante Adhäsion bzw. Clusterbildung der CNT hinweist. Vergleicht man unbehandelte Zellen (Mitte) mit den gleichen Zellen, welche 2 h mit einer CNT-Lösung inkubiert und wie im Beispiel 5 weiterbehandelt (Trypsinisierung
und Zeπtrifugation) worden sind (rechte Seite), so erkennt man eine deutliche
Zunahme der relativen Granularität bei der Mehrheit der analysierten Zellen. Dies ist ein unabhängiger Nachweis, dass eine Assoziation der CNT mit Zellen in vitro stattfindet. Diese FSC-SSC-Analyse kann jedoch nicht zwischen extrazellulärer Adhäsion der CNTs an die Zellmembran bzw. eine Lokalisation in der Zellmembran und einer zytoplasmatischen Lokalisation unterscheiden. Der
Nachweis der Aufnahme ferromagnetisch gefüllter Kohlenstoff-nanoröhren in die Tumorzellen wurde durch TEM-Untersuchungen erbracht.
Beispiel 7
Magnetisierungskurven eines Tumorzellen-CNT-Gemisches Die EJ28-Zellen wurden für 2 h in Petrischalen mit CNT-Lipid-Gemischen gemäß Beispiel 5 inkubiert, anschliessend zweifach mit PBS gewaschen und nach Trypsin-Verdau als Zellpellett bis zur Messung gelagert.
Abbildung 8 zeigt Magnetisierungskurven von Fe-gefüllten Kohlenstoffnanoröh- ren, transferiert in Tumorzellen, wobei diese Zellen aus behandeltem Gewebe rückgewonnen wurden. Die Magnetisierungskurven zeigen ein typisches ferro- magnetisches Verhalten der in den Zellen aufgenommenen Fe-gefüllten Koh- lenstoffnanoröhren. Eine ausgeprägte Anisotropie kann durch die Messungen nicht nachgewiesen werden. Das ist aufgrund der fehlenden Vorzugsorientierung in Zellen auch nicht zu erwarten. Die Höhe der Sättigungsmagnetisierung ist eindeutig von der transferierten Menge α-Eisens in den gefüllten Kohlen- stoffnanoröhren abhängig. Eine Korrelation der nachgewiesenen elementar- magnetischen Einheiten (emu), die in direktem Zusammenhang zur Masse des in die Zellen aufgenommenen α-Eisens steht, beweist, dass für eine erfolgreiche Hyperthermie genügend Eisen in die Zellen aufgenommen wurde. Es bedeuten: μ0H = angelegte magnetische Induktion m = magnetisches Moment
Beispiel 8
Anwendungsbeispiel für erfindungsgemäße CNTs mit zwei unterschiedlichen Wirkstoffen im Inneren
Mit einer standardisierten Messzelle, die sowohl eine magnetische und daraus resultierende Wärmemanipulation von außen erlaubt als auch eine lokaie Kon- trolle der Wärmeentwicklung (Prinzip der Messkammer am Beispiel einer CNT-
Behandlung von Tumorzellen, vergl. Abb. 9) im Inneren der Kammer ist die Therapiewirkung einer CNT-Behandlung nachweisbar und optimierbar. Diese Messungen lassen sich sowohl auf Gewebeebene (frisch gewonnene und in eine physiologische Lösung eingelegten Gewebedickschnitte) als auch an ex- plantierten Organen durchführen und werden nachfolgend an einem Beispiel aufgezeigt:
Ein PCa-Xenotransplantattumor menschlichen Ursprungs (PC3-Zellen) wurde als solider Tumor aus der Nacktmaus explantiert. Daraus wurden Gewebegrob- schnitte mit einer Dicke von 5 mm gewonnen und in die Lösung der Messkammer überführt. Nach Fixierung des Gewebeschnittes in der Messkammer erfolgte eine intratumorale Injektion einer CNT-Lösung (insgesamt 100μg CNT, an 6 unterschiedlichen Injektionsstellen, verteilt über die Gewebeschnittfläche) wie im Grundtyp 1 beschrieben, d.h. mit zwei unterschiedlichen Polymeren ver- schlössen und mit Carboplatin sowie mit einem Nukleinsäurekontrukt nichthumanem Ursprungs befüllt.
Durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes wurden anschließend die markierten Injektionsstellen (markiert und mit Wärmesensoren gekoppelt durch kon- taktfreies Heizen der CNTs auf eine Temperatur von 44°C (mittlere Temperatur im 3 mm Radius um die Injektionsstelle bzw. Messfühlerlokalisation) erhitzt. Beim Erreichen dieser Temperatur kam es zu einer Konformitätsänderung des Polymer/Gels 1 mit nachfolgender Freisetzung/Exposition von Carboplatin. Die lokale antitumorale Wirkung des Therapeutikums wurde durch Vergleichunter- suchungen mit einem Placebo (Füllung mit einem ungiftigen Polymer) anhand eines histologischen (TUNEL-Assay zur Spätapoptosedetektion) und patho- morphologischer Nachweis von Apoptosen/Nekrosen im Gewebeschnitt im Zeitraum 24-96 h nach Freisetzung des Therapeutikums bzw. per FACS- Analyse (Annexin-V-Pl-Analyse zum Nachweis von früher und später Apoptose
sowie von Nekrosen) erbracht. Desweiteren wurden einige Schnitte eine halbe
Stunde nach Freisetzung von Carboplatin und dem kontaktfreien Heizen auf 48°C erhitzt, dem Schmelzpunkt des zweiten Polymers (nachfolgend CNT- basiert geheizte Gewebeprobe genannt). Der Nachweis der Freisetzung von Nukieiπsäurefragmenten, die beispielhaft die Füllung mit dem zweiten Thera- peutikum darstellten, erfolgte durch spezifischen PCR-Nachweis des nichthumanen Fragmentes (Luziferasegenfragment), wobei als Kontrollen zwei unterschiedliche Gewebeproben dienten, die einerseits mit der gleichen Menge an CNT befüllt, aber nicht geheizt worden waren (Negativkontrolle 1) als auch andererseits Gewebeproben ohne CNT-Injektion, jedoch mit Magnetfeldbehand- lung wie CNT-injizierte Probe (Negativkontrolle 2). Dabei konnte eindeutig und ausschließlich für die zweifach, CNT-basiert geheizte Gewebeprobe nachgewiesen werden, dass nach der Carboplatin-Freisetzung außerdem bei einer lokal detektierten Temperatur von 48°C eine Freisetzung von Luziferase-DNA- Fragmenten in das injizierte Gewebe erfolgte.
Beispiel 9
Weiteres Anwendungsbeispiel der CNTs gemäß Beispiel 8
Eine narkotisierte Nacktmaus, die subkutan einen PCa-Xenotransplantatumor (PC3-Zellen, wie im Beispiel 8) von 1 cm Maximaldurchmesser getragen hatte, wird in der Messkammer gemäß Abb. 9 fixiert. Nach Injektion von CNT gemäß Beispiel 8 (Gesamtdosis 200μg) über die Schwanzvene wird nach 2 h ein äußeres Magnetfeld angelegt. In einem Magnetfeld von 15 kA/m wurde eine Frequenz von 40kHz realisiert. Nach einer in Vorversuchen optimierten Magnet- feldinkubation des gesamten Tierkörpers, wobei im Tumorrandbereich mehrerer Temperatursonden implementiert worden waren, über die eine lokale Temperaturmessung erfolgte, wurde die Zieltemperatur von 44°C in peritumoralen Arealen nachgewiesen, wobei die Maus anschließend und ohne weitere Magnetfeldeinwirkung noch 2 weitere Stunden unter Narkose gehalten wurde. Anschließend erfolgte in den Zeiträumen 24/48/72 eine
Teilgewebeentnahme. TEM-Untersuchungen der äußeren Tumorränder des Tumor belegten die Anreicherung von CNT an, in und zwischen Tumorzellen. Unter histologischer Kontrolle (H&E-Färbung) konnte in den äußeren Gewebearealen zudem therapieinduzierte antiproliferative Effekte (Apoptoseinduktion) nachgewiesen werden. Eine zweite Maus wurde wie oben
den. Eine zweite Maus wurde wie oben beschrieben identisch behandelt, nur erfolgte nach dem Erreichen der Zieltemperatur 1 (44°C) eine Weiterbehandlung im Magnetfeld bis zum erreichen der Zieltemperatur 2 (48°C). Die dadurch freigesetzten Nukleinsäurefragmente konnten über eine nichtradioaktive Markierung im Gewebeverband sichtbar gemacht werden. Diese Resultate bestä- tigten die Machbarkeit der lokalen und CNT-induzierten Hyperthermie in Kombination mit Chemotherapie sowie deren therapeutische Effizienz.