WO2005094837A1 - Utilisation de l’acide masticadienonique en tant qu’inhibiteur de l’adn polymerase beta - Google Patents

Utilisation de l’acide masticadienonique en tant qu’inhibiteur de l’adn polymerase beta Download PDF

Info

Publication number
WO2005094837A1
WO2005094837A1 PCT/FR2005/000701 FR2005000701W WO2005094837A1 WO 2005094837 A1 WO2005094837 A1 WO 2005094837A1 FR 2005000701 W FR2005000701 W FR 2005000701W WO 2005094837 A1 WO2005094837 A1 WO 2005094837A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medicament
use according
pol
treatment
disease
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/000701
Other languages
English (en)
Inventor
Georges Massiot
Christophe Long
Frédéric AUSSEIL
Martine Knibiehler
Yvan Canitrot
Jean-Sébastien HOFFMANN
Christophe Cazaux
Pierre Benaim
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament, Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Pierre Fabre Medicament
Publication of WO2005094837A1 publication Critical patent/WO2005094837A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/565—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol
    • A61K31/568—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone
    • A61K31/569—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, estradiol substituted in positions 10 and 13 by a chain having at least one carbon atom, e.g. androstanes, e.g. testosterone substituted in position 17 alpha, e.g. ethisterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • masticadienonic acid as an inhibitor of beta DNA polymerase
  • the subject of the present invention is the use of masticadienonic acid for the manufacture of a medicament intended for the treatment and / or prevention of conditions, in particular chosen from the group consisting of cancers, tumors and neurodegenerative diseases , by inhibition of DNA polymerase beta.
  • DNA polymerase beta (pol ⁇ ) is the smallest DNA polymerase with a molecular weight of 39kDa. It is made up of two areas. The first part, N-terminal (8kDa), contains the single-stranded DNA binding site, the 5 'recognition function of DNA breaches and the dRP lyase activity. The second, partly C-terminal (31kDa), has the catalytic activity of the enzyme. In somatic cells, pol ⁇ is an essential enzyme during development.
  • cisplatin The anti-tumor action of cisplatin is due to the formation of cisplatin adducts on DNA, generating covalent intra- or inter-strand bonds which inhibit replication of tumor DNA.
  • nephrotoxicity mutagenic and therefore potentially carcinogenic potential and strong multifactorial cell resistance.
  • the latter is due to various mechanisms such as the decrease in intracellular penetration, an increase in the expulsion of the drug out of the cell, an intracellular trapping by nucleophilic groups of the thiol type carried by gluthation or metallothionein proteins rich in cysteine, and above all an increase in the repair of cisplatin adducts on DNA.
  • pol ⁇ can replace replicative DNA polymerases (Pol ⁇ , c-, e) during the final stage of DNA resynthesis specific to the NER process, without modifying the yield of the NER but by participating in the mutagenesis induced by cisplatin observed specifically on cells overexpressing pol ⁇ .
  • pol ⁇ can also disturb DNA metabolic pathways such as recombination or genome replication.
  • a final resistance mechanism is the increase in tolerance of lesions, that is to say the ability to survive without eliminating lesions.
  • This phenomenon can be explained by a crossing of the cisplatin adducts by the replicative machinery. It has been shown that pol ⁇ is capable of specifically catalyzing this crossing at the cost of incorporating illegitimate nucleotides on the strand complementary to the lesion.
  • pol ⁇ is the one which proves to be the most suitable for overcoming cisplatin adducts during the replication of damaged DNA.
  • overexpressed pol ⁇ causes, in response to treatment with cisplatin, a general and random increase in genetic instability by competing with replicative DNA polymerases in processes in which it is not normally involved. (NER, recombination, genomic replication). Through its mutagenic action, it also contributes to this instability during the translational synthesis of cisplatin adducts.
  • Pol ⁇ constitutes an excellent target for two reasons, on the one hand as a factor of spontaneous genetic instability because of its infidelity and on the other hand as a factor of chemotherapeutic resistance because of its specific capacity to carry out synthesis translational of cisplatin adducts, even if other recently identified unfaithful DNA polymerases (pol K, ⁇ , f, i, ⁇ , ⁇ and ⁇ ) also participate in cell tolerance towards other types of damaging agents DNA. It is very important to understand that pol ⁇ allows cells to resist cisplatin by replicating the lesion, but during this process, it causes an accumulation of mutations by its infidelity, and therefore constitutes a real cause of genetic chaos for the cell.
  • a specific inhibitor of DNA polymerase ⁇ would therefore make it possible to considerably reduce the phenomenon of resistance to antitumour drugs such as cisplatin during the treatments administered to patients. As a result, this would decrease the dose of anti-tumor agent, such as cisplatin, administered. Such an agent would also make it possible to reduce the appearance of non-targeted mutations in the adducts and resulting from the overexpression of pol ⁇ .
  • the search for pol ⁇ inhibitors is very active. Indeed, pol ⁇ is now clearly defined as being an interesting therapeutic target in terms of resistance to chemotherapy in the treatment of cancers.
  • inhibitors are linoleic acid, nervonic acid (IC 5 o of 5 ⁇ M), lithocholic acid (IC 5 o of 10 ⁇ M), tormentic acid (IC 50 of 46 ⁇ M), euscaphic acid (IC 5 o 108 ⁇ M), the fomitellique acid (IC50 of 150 .mu.m), 5'-monophosphate-bredinine, the l, 4-dideoxy-l, 4- imino-D-ribitol (IC 5 0 to 28 ⁇ M), acid kohamaique (IC 50 of 8.4 ⁇ M), suramin, ⁇ -rubromycin, sulfo-quinovosyl-acyl-glycerols (IC 5 ⁇ from 8.5 to 36 ⁇ M), acid (24E) - 3 ⁇ -hydroxy-7 , 24-euphadiene-26-oique (IC 5 o of 23 ⁇ M), sculezonone-A (IC 50 of 17 ⁇ M), sculezonone-B
  • ddC dideoxycytidine
  • IC 5 o of 1 ⁇ M dideoxycytidine
  • Pistacia lentiscus is a small tree growing in the Mediterranean basin, the sap of which, known as a putty, is used as chewing gum. From the stems of Pistacia lentiscus, an active compound has been isolated which is masticadienonic acid.
  • ddC dideoxycytidine
  • the strongest sigma polymerase inhibitor is (24E) -3beta-hydroxy-7,24-euphandien-26-oique acid, while the strongest compound for inhibiting DNA polymerase beta is ursolic acid.
  • certain compounds are inhibitors of beta polymerase but have no effect on the inhibition of sigma polymerase.
  • the present invention relates to the use of masticadienonic acid of formula (I).
  • the expression “pol ⁇ ” is used, by way of simplification, to designate DNA polymerase ⁇ .
  • the expression “inhibitor of DNA polymerase beta” and similar expressions refer to a compound which makes it possible to decrease the capacity of beta polymerase, human or non-human, to synthesize a polynucleotide by compared to the synthesis which would have taken place in the absence of such an inhibitor.
  • the decrease in synthesis can either be a reduction in the length of the polynucleotide synthesized or a reduction in the number of polynucleotides synthesized during a determined period.
  • the expression “specific inhibitor of DNA polymerase beta” and similar expressions refer to a compound capable of inhibiting DNA polymerase beta without inhibiting, or by inhibiting them in a way not significant, the other DNA polymerases.
  • the expression “effective inhibitor of DNA polymerase beta” and similar expressions refer to a compound capable at low doses, that is to say for values of IC n of on the order of a micromole or ten micromoles, to inhibit beta DNA polymerase.
  • polynucleotide used in the sense of the present invention refers to a chain of at least 15 chemically linked nucleotides.
  • treatment means alleviating or curing diseases, disorders, ailments from which patients suffer.
  • Masticadienonic acid directly and specifically interferes with the single-stranded DNA binding domain of pol ⁇ .
  • Masticadienonic acid can exactly bind in the single-stranded DNA binding site of the 8-kDa N-terminal domain of pol ⁇ .
  • the inhibitor that is to say masticadienonic acid, interacts with lysines 60, 68 and 35 of pol ⁇ .
  • masticadienonic acid does not bind to the dNTP binding site of the active site of the "palm" domain, suggesting a specific competitive inhibition of masticadienonic acid due to its interaction with the binding site of Pol ⁇ with single stranded DNA.
  • the masticadienonic acid inhibitor has a specific character against Pol ⁇ .
  • the medicament is advantageously intended for the treatment and / or prevention of conditions by specific inhibition of the DNA polymerase beta.
  • the medicament according to the invention is even more advantageously intended for the treatment and or the prevention of affections by strong inhibition of DNA polymerase beta, the compound of formula (I) having in particular an IC 5 o value less than or equal to 8 ⁇ M.
  • the inhibitor of polymerase beta used in the context of the present invention advantageously has a value of IC 5 0 (inhibitory concentration "inhibitory concentration" of compound required to achieve 50% reduction of the activity of the polymerase ) of the order of a micromole.
  • Masticadienonic acid can in particular be used for the manufacture of a medicament intended for the treatment and / or prevention of diseases induced by an unwanted proliferation or development of cells.
  • the conditions which are treated and / or prevented by inhibition of the DNA polymerase beta are advantageously chosen from the group consisting of cancers, tumors and neurodegenerative diseases.
  • the medicament according to the invention can be used for the prevention and / or treatment of diseases characterized by inappropriate / excessive or uncontrolled cell development.
  • the medicament also comprises an additional anticancer agent, which is advantageously a cytostatic.
  • an additional anticancer agent which is advantageously a cytostatic.
  • Many anti-tumor or anti-cancer agents exhibit significant toxicity which limits their use and mainly the quantity of doses administered.
  • the use of masticadienonic acid, an inhibitor of pol ⁇ , in combination with an antitumor or anticancer agent makes it possible to reduce the quantity to be administered of such an agent necessary to kill cancer cells and thus makes it possible to improve the therapeutic benefits of the use of this agent.
  • the medicament according to the invention advantageously contains: a) the compound of formula (I), and b) an anticancer agent, as combination products for simultaneous, separate or spread over time use for the treatment of cancers and / or tumors.
  • the additional anticancer agent is advantageously a cytostatic agent derived from platinum, even more advantageously cisplatin, Poxaliplatin or carboplatin.
  • it is cisplatin.
  • the use of masticadienonic acid in combination with cisplatin improves the effectiveness of cisplatin as an anticancer agent.
  • the medicament is intended for the treatment of tumors chosen from the group consisting of tumors of the testicle, ovary, cervix, endometrium, ENT sphere, Esophagus, bladder, lung, breast, head and neck, gastric, colorectal, pediatric brain or epidermoid tumor and osteosarcomas
  • the medicament is intended for the treatment of cancers chosen from the group consisting of cancers of the lung, colorectal, breast, head and neck, gastric, pediatric of the brain, the testicle, the ovary, ENT, the esophagus, cervix, endometrium, bladder or epidermoid cancers and osteosarcomas.
  • the medicament is intended for the treatment of degenerative diseases chosen from the group consisting of Alzheimer's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Marchiafava-Bignami disease, Parkinson's disease , Pick's disease and Wilson's disease
  • the medicament also comprises a pharmaceutically acceptable excipient, advantageously suitable for administration by the intravenous route, by the oral route, by the intratumoral route, by the anal route, by the intramuscular route. , subcutaneously, percutaneously or intraperitoneally.
  • the medicament advantageously comprises 0.1 to 60% by weight of the compound of formula (I), relative to the total weight of the medicament.
  • the medicament comprises 0.1 to 60% by weight of the compound of formula (I) and 0.1 to 60% by weight of an anticancer agent, relative to the total weight of the medicament
  • the amount of active ingredient in the drug also depends on the route of administration chosen. So, for example, for an injectable, the quantity of active principle depends on both the active dose and the solubility / stability of the active in the formulation.
  • the formulation is generally situated at concentrations of active principle of between 1 mg / ml and 100 mg / ml, ie between 0.1% and 10%, advantageously between 5 mg / ml and 50 mg / ml, ie between 0.5% and 5%, even more advantageously between 10 mg / ml and 40 mg / ml, ie between 1% and 4%.
  • the amount of said active principle in the formulation can be between 0.1 mg / ml and 10 mg / ml, or between 0.01% and 1%, advantageously between 0.5 mg / ml and 5 mg / ml, or between 0.05% and 0.5% o, even more advantageously between 0.7 mg / ml and 3 mg / ml, or between 0.07% and 0.3%>; the percentages being given by weight of active principle relative to the total weight of the formulation. As a general rule, it is more diluted in an injectable formulation than it would be in a formulation intended for oral administration.
  • the injectable formulation will be very concentrated, which is in particular the case of a nanoparticulate formulation to be dispersed in an infusion.
  • the loaded doses are of course much greater.
  • the formulation may comprise between 1 and 60% by weight of active principle, advantageously between 5 and 50% by weight of active principle, even more advantageously between 10 and 40 % of active ingredient, even more advantageously between 10 and 20% by weight of active ingredient; the mass percentages being expressed relative to the total weight of the composition.
  • the medicament according to the invention can be administered in unit or multidose forms of administration in admixture with suitable pharmaceutical supports known to the person skilled in the art.
  • the appropriate unit forms of administration include in particular optionally scored tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions.
  • suitable multidose forms of administration include, but are not limited to, oral drops, emulsions and syrups.
  • the optimal modes of administration, the dosages and the galenical forms of the compounds and compositions according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmaceutical treatment, adapted to a patient such as for example the age or body weight of the patient, the severity of his general condition, the tolerance to treatment, the side effects observed.
  • FIG. 1 shows the results of the translational synthesis of a cisplatin adduct by pol ⁇ in the presence of masticadienonic acid.
  • the concentration of masticadienonic acid used is 20 ⁇ M.
  • the positions of the 17-mer matrix, the position of the lesion (39-mer) and the full size (60-mer) are indicated by arrows.
  • Figure 3 is shown the diagram illustrating the viability of the cells
  • the single-stranded DNA of Ml 3 (3.6 pmol, lane 1) was incubated with pol ⁇ or the 8-kDa domain (3 pmol, lane 4) and 10 pmol (lane 2) or 1 pmol (lane 3). masticadenionic acid.
  • Example 1 Method of Extraction of Masticadienonic Acid
  • the extracts of the stems of Pistachia lentiscus were prepared by maceration overnight in ethyl acetate, filtration and evaporation. These extracts were then fractionated on SPE SiO 2 Upti Clean cartridges using a gradient chloroform-methanol. The aliquots were dissolved in 100% DMSO. The fractionation was carried out by preparative chromatographies on normal or reverse C-18 phases. The pure product, namely masticadienonic acid, was dissolved in the appropriate buffers to obtain concentrations of 10 "2 M to 10 " 7 M.
  • Example 2 Effect of masticadienonic acid on pol ⁇ , on other DNA polymerases and on replicating nuclear extracts
  • an in vitro replication test in using as replication matrix an “activated” genomic DNA containing single-stranded gaps.
  • the replicative extracts were prepared according to a conventional embodiment known to those skilled in the art after recovery of the cells in the exponential growth phase.
  • the rat pol ⁇ used for high throughput screening was purified.
  • the 8-kDa domain of the pol ⁇ was cloned into the plasmid pIVEX2.4d (Roche) in order to obtain the plasmid pl968 which, after sequencing and purification, was introduced into the bacterium BL21 (DE3).
  • the purification of pol K was carried out by the company GTP Tech. (Toulouse, France) after cloning the pol K cDNA of the plasmid pHSE2 (from H. Ohmori, Kyoto, Japan) in a bacculovirus system.
  • Human pol ⁇ comes from the company Trevigen (USA).
  • the 4 pol ⁇ subunits were purified from sf9 cells infected with a bacculovirus.
  • the pol ⁇ and the truncated pol ⁇ have been purified.
  • Replication tests All DNA polymerases were tested according to the same procedure.
  • Calf thymus DNA (Sigma) activated digested with DNAase I) is used as replication matrix in a final volume of 20 ⁇ l, at 37 ° C., varying the incubation time and in the presence inhibitors.
  • Human pol ⁇ (0.5 units) is added to a buffer containing 25 mM Hepes KOH pH 8.5, 10 m M MgCl 2 , 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 ⁇ M dATP, dGTP, dCTP, 0.2 ⁇ Ci [ 3 H] dTTP and 1 ⁇ g of matrix.
  • Pol ⁇ wild or truncated (0.5 units each) is used in a buffer containing 50 mM Tris pH 8.5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 ug / ml BSA, 0.75 mM MnCl 2, 5 ⁇ M of dATP, dGTP, dCTP, 0.2 ⁇ Ci [HJdTTP and l ⁇ g of matrix.
  • the conditions for human pol ⁇ (0.05 units) and pol K (1.5 units) are 50 mM Tris pH 6.5, 1 mM DTT, 0.25 mg / ml BSA, 6 mM MgCl 2 , 4, 6 ⁇ g / ml PCNA (for pol ⁇ ), lOO ⁇ M of dATP, dGTP, dCTP, 0.2 ⁇ Ci [ 3 H] dTTP and l ⁇ g of matrix. After incubation, the reaction is stopped with 10 mM EDTA and the radioactive DNA products are collected on GF / C (Wathman) glass fiber filters. The filters are then washed twice in a solution of 5% TrichloroAcetic Acid and used for counting.
  • Example 5 Masticadienonic acid binds to the 8-kDa N-terminal domain of pol ⁇
  • the fixing medium (10 ⁇ l) contains 20 mM Tris HC1, pH 7.5, 40 mM KC1, 50 ⁇ g / ml of BSA, 2 mM EDTA, 3.6 pmol of dsb Ml 3 and 3 pmol of wild or truncated pol ⁇ .
  • Masticadienonic acid at variable concentrations, is added to the fixing medium for 10 minutes at 25 ° C.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l’utilisation de l’acide masticadiénonique pour la fabrication d’un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention d’affections, notamment choisies dans le groupe constitué par les cancers, les tumeurs et les maladies neurodégénératives, par inhibition de l’ADN polymérase bêta. Le médicament peut en outre comprendre un anticancéreux supplémentaire, qui est avantageusement un cytostatique, tel que le cisplatine.

Description

Utilisation de l'acide masticadiénonique en tant qu'inhibiteur de l'ADN polymerase bêta
La présente invention a pour objet l'utilisation de l'acide masticadiénonique pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention d'affections, notamment choisies dans le groupe constitué par les cancers, les tumeurs et les maladies neurodégénératives, par inhibition de l'ADN polymerase bêta. L'ADN polymerase beta (pol β) est la plus petite ADN polymerase dotée d'un poids moléculaire de 39kDa. Elle est composée de deux domaines. Le premier en partie N-terminale (8kDa) contient le site de liaison à l'ADN simple brin, la fonction de reconnaissance en 5' de brèches dans l'ADN et l'activité dRP lyase. Le second en partie C-terminale (31kDa) possède l'activité catalytique de l'enzyme. Dans les cellules somatiques, pol β est une enzyme essentielle au cours du développement. Elle joue un rôle clef dans la réparation de l'ADN par excision de base (BER) sur de petits dommages de type alkylation ou oxydation de bases dans l'ADN, ainsi que dans la réparation de cassures simple brin dans l'ADN. Il a été montré que lorsque l'expression de cette enzyme est dérégulée, elle favorise fortement la progression tumorale. Il a de plus été démontré que, quand elle est surexprimée, pol β permet à la cellule de s'adapter à des dommages bifonctionnels sur l'ADN, formés par exemple par le cisplatine utilisé dans le traitement de nombreux cancers. Le cisplatine (N Cl2PtH6) ou CDDP (Platinol®, Bristol-Myers) est couramment utilisé seul ou en association dans le traitement de tumeurs solides de la sphère urogénitale, de la tête et du cou, de la vessie, de l'œsophage et dans les cancers du poumon. L'action antitumorale du cisplatine est due à la formation d'adduits cisplatine sur l'ADN, générant des liaisons covalentes intra- ou interbrins qui inhibent la réplication de l'ADN tumoral. Malheureusement, l'utilisation du cisplatine se heurte à trois obstacles majeurs : une néphrotoxicité, un potentiel mutagene et donc potentiellement cancérigène et une forte résistance cellulaire multifactorielle. Cette dernière est due à différents mécanismes comme la diminution de la pénétration intracellulaire, une augmentation de l'expulsion de la drogue hors de la cellule, un piégeage intracellulaire par des groupements nucléophiles de type thiols portés par le gluthation ou des protéines metallothionéines riches en cystéine, et surtout une augmentation de la réparation des adduits cisplatine sur l'ADN. La réparation de ces dommages s'effectue essentiellement par la voie constitutive d'excision d'adduits encombrants type lésions UN ou cisplatine (Νucleotide Excision Repair ou ΝER). Il a été montré que, dans un contexte tumoral, pol β peut se substituer aux ADN polymérases réplicatives (Pol δ, c- , e) lors de l'étape terminale de resynthèse d'ADN spécifique au processus NER, sans modifier le rendement du NER mais en participant à la mutagenèse induite par le cisplatine observée spécifiquement sur des cellules surexprimant pol β. De même, il a été montré que pol β peut aussi perturber des voies métaboliques de l'ADN telles la recombinaison ou la réplication du génome. Enfin, un dernier mécanisme de résistance est l'augmentation de la tolérance des lésions, c'est-à-dire la capacité à survivre sans élimination des lésions. Ce phénomène peut s'expliquer par un franchissement des adduits cisplatine par la machinerie réplicative. Il a été montré que pol β est capable de catalyser spécifiquement ce franchissement au prix d'une incorporation de nucléotides illégitimes sur le brin complémentaire à la lésion. Parmi les 14 ADN polymérases recensées à ce jour, pol β est celle qui s'avère la plus apte à s'affranchir d'adduits cisplatine lors de la réplication de l'ADN endommagé. Comme mentionné ci-dessus, pol β surexprimée entraîne, en réponse à un traitement au cisplatine, une augmentation générale et aléatoire de l'instabilité génétique en entrant en compétition avec les ADN polymérases réplicatives dans des processus dans lesquels elle n'est normalement pas impliquée (NER, recombinaison, réplication génomique). Au travers de son action mutagene, elle contribue aussi à cette instabilité lors de la synthèse translésionnelle des adduits cisplatine. Pol β constitue une excellente cible à deux titres, d'une part en tant que facteur d'instabilité génétique spontané en raison de son infidélité et d'autre part en tant que facteur de résistance chimiothérapeutique en raison de sa capacité spécifique à effectuer la synthèse translésionnelle des adduits cisplatine, même si d'autres ADN polymérases infidèles récemment identifiées (pol K, η, f, i, θ, μ et λ) participent aussi à la tolérance cellulaire vis-à-vis d'autres types d'agents endommageant l'ADN. Il est très important de comprendre que pol β permet aux cellules de résister au cisplatine en répliquant la lésion, mais qu'au cours de ce processus, elle entraîne une accumulation de mutations par son infidélité, et constitue donc une véritable cause de chaos génétique pour la cellule. Un inhibiteur spécifique de l'ADN polymerase β permettrait donc de diminuer considérablement le phénomène de résistance aux antitumoraux tels que le cisplatine au cours des traitements administrés aux patients. En conséquence, cela permettrait de diminuer la dose d'agent antitumoral, tel que le cisplatine, administrée. Un tel agent permettrait en outre de réduire l'apparition de mutations non ciblées au niveau des adduits et résultant de la surexpression de pol β. La recherche d'inhibiteurs de pol β est très active. En effet, pol β est maintenant clairement définie comme étant une cible thérapeutique intéressante en terme de résistance aux chimiothérapies dans le traitement des cancers. Quand elle est dérégulée, c'est aussi une enzyme reconnue pour son implication dans l'apparition d'un nombre important d'anomalies génomiques et nucléotiques, participant ainsi au chaos génétique et à la progression tumorale. Plus récemment, il a été proposé qu'elle puisse également constituer une cible dans un autre contexte physiopathologique, les maladies neurodégénératives. Il a été notamment démontré que l'expression de Pol bêta était augmentée dans des neurones soumis à l'action des peptides β-amyloïdes, principaux constituants des plaques séniles dans la maladie d'Alzheimer. Cette augmentation d'expression de Pol β serait à l'origine d'une réplication d'ADN non conventionnelle, ce qui conduirait au processus de neurodégénération par apoptose. A ce jour, une seule molécule inhibitrice spécifique de pol β a été décrite. Il s'agit de la prunasine. Certes, c'est une molécule intéressante dans sa spécificité (bien qu'on ne sache rien sur pol lambda, ni sur des extraits totaux), mais elle n'est pas considérée comme un inhibiteur fort (IC5o de 93μM). D'autres inhibiteurs non spécifiques de pol β ont été décrits. En effet, ils inhibent aussi d'autres ADN polymérases. Ces inhibiteurs sont l'acide linoléïque, l'acide nervonique (IC5o de 5μM), l'acide lithocholique (IC5o de lOμM), l'acide tormentique (IC50 de 46μM), l'acide euscaphique (IC5o de 108μM), l'acide fomitellique (IC50 de 150μM), la 5'-monophosphate-bredinine, le l,4-dideoxy-l,4- imino-D-ribitol (IC50 de 28μM), l'acide kohamaique (IC50 de 8,4μM), la suramine, l'α- rubromycine, les sulfo-quinovosyl-acyl-glycérols (IC5υ de 8,5 à 36μM), l'acide (24E)- 3β-hydroxy-7,24-euphadiene-26-oique (IC5o de 23 μM), la sculezonone-A (IC50 de 17μM), la sculezonone-B (IC50 de 90μM) et la solanapyrone A (IC50 de 30μM). On peut aussi citer la didéoxycytidine (ddC) (IC5o de 1 μM), qui n'est pas un inhibiteur propre de pol β, mais un terminateur de chaîne préférentiellement incorporé par pol β au cours de la synthèse d'ADN. Pistacia lentiscus (Anacardiaceae) est un petit arbre poussant dans le bassin méditerranéen dont la sève, connue comme étant un mastic, est utilisée en tant que chewing gum. Des tiges de Pistacia lentiscus, a été isolé un composé actif qui est l'acide masticadiénonique. Dans la publication, « Anti-Inflammatory Triterpenes from Pistacia terebinthus Galls », Eva M. Giner-Larza et al.,Planta Med. 2002 ; 68 :311-315, on décrit des triterpenes issus de la plante Pistacia terebinthus identifiés en tant qu'acide masticadiénonique, acide masticadiénolique et acide morolique. Cette publication enseigne que l'acide mastécadiénonique présente des propriétés anti-inflammatoires. La demande de brevet WO 02/09720 décrit des inhibiteurs d'ADN polymerase sigma. En particulier, il est précisé que les composés suivants : l'acide (24E)-3beta- hydroxy-7,24-euphandien-26-oique, l'acide ursolique, l'acide katonique et l'acide bétulinine sont des inhibiteurs de polymerase sigma et également des inhibiteurs de polymerase bêta. Il est en outre précisé que l'inhibiteur de polymerase sigma le plus fort est l'acide (24E)-3beta-hydroxy-7,24-euphandien-26-oique, alors que le composé le plus fort pour inhiber l'ADN polymerase bêta est l'acide ursolique. De plus, il est précisé que certains composés sont inhibiteurs de polymerase bêta mais ne présentent aucun effet sur l'inhibition de polymerase sigma.
La présente invention a pour objet l'utilisation de l'acide masticadiénonique de formule (I).
Figure imgf000005_0001
pour la fabrication d'un médicament destiné, par inhibition de l'ADN polymerase bêta, au traitement et/ou à la prévention d'affections. Dans le cadre de la présente invention, l'expression « pol β » est utilisée, par voie de simplification, pour désigner l'ADN polymerase β. Dans le cadre de la présente invention, l'expression « inhibiteur de l'ADN polymerase bêta » et les expressions similaires font référence à un composé qui permet de diminuer la capacité de la polymerase bêta, humaine ou non humaine, à synthétiser un polynucléotide par rapport à la synthèse qui aurait eu lieu en l'absence d'un tel inhibiteur. La diminution de la synthèse peut être soit une réduction dans la longueur du polynucléotide synthétisé soit une réduction dans le nombre de polynucléotides synthétisés pendant une durée déterminée. Dans le cadre de la présente invention, l'expression « inhibiteur spécifique de l'ADN polymerase bêta » et les expressions similaires font référence à un composé capable d'inhiber l'ADN polymerase bêta sans inhiber, ou en les inhibant d'une manière non significative, les autres ADN polymérases. Dans le cadre de la présente invention, l'expression « inhibiteur efficace de l'ADN polymerase bêta » et les expressions similaires font référence à un composé capable à des faibles doses, c'est-à-dire pour des valeurs de IC n de l'ordre du micromole ou de la dizaine de micromoles, d'inhiber l'ADN polymerase bêta. Le terme « polynucléotide » utilisé dans le sens de la présente invention se réfère à une chaîne d'au moins 15 nucléotides liés chimiquement. Dans le cadre de la présente invention, le terme « traitement » signifie atténuer ou guérir des maladies, des troubles, des affections dont souffrent les patients. L'acide masticadiénonique interfère directement et spécifiquement avec le domaine de liaison à l'ADN simple brin de pol β. L'acide masticadiénonique peut exactement se lier dans le site de fixation à l'ADN simple brin du domaine 8-kDa N- terminal de pol β. Sans vouloir se limiter à une quelconque interprétation, il est supposé que l'inhibiteur, c'est-à-dire l'acide masticadiénonique, interagit avec les lysines 60, 68 et 35 de pol β. Sous réserve de cette hypothèse, on pense que la lysine 60 interagit via un pont hydrogène avec l'acide masticadiénonique alors que les lysines 68 et 35 ont un contact ionique avec la fonction carbonyle de l'acide masticadiénonique. La distance estimée entre ces résidus lysines et l'acide masticadiénonique est de 2,86, 2,85 et 2,81Â, respectivement. De façon très intéressante, ces trois résidus sont connus pour être les trois principaux résidus interagissant avec l'ADN simple brin. En outre, il semblerait que l'acide masticadiénonique ne se lie pas au site de fixation des dNTP du site actif du domaine "paume", suggérant une inhibition compétitive spécifique de l'acide masticadiénonique due à son interaction avec le site de fixation de Pol β avec l'ADN simple brin. Ainsi, l'inhibiteur acide masticadiénonique présente un caractère spécifique contre Pol β. D'une manière surprenante, l'isomère acide isomasticadiénonique, de formule (II)
Figure imgf000007_0001
qui diffère seulement par la position de la double liaison dans le cycle B (Δ7 au de lieu de Δ8), est totalement inactif. De même, un décalage de la double liaison de cycle B vers le bas, en position Δ6, amènera un changement global de la forme de la molécule et la molécule de formule (III) sera inactive, envers pol β.
Figure imgf000007_0002
Ceci montre que les distances entre les fonctions cétone et acide dépendent de la position de la double liaison et par suite, la qualité des liaisons, supposées, avec les lysines de pol β dépend de la position de la double liaison. Dans le cadre de la présente invention, le médicament est avantageusement destiné au traitement et/ou à la prévention d'affections par inhibition spécifique de l'ADN polymerase bêta. Le médicament selon l'invention est encore plus avantageusement destiné au traitement et ou à la prévention d'affections par inhibition forte de l'ADN polymerase bêta, le composé de formule (I) ayant notamment une valeur de IC5o inférieure ou égale à 8 μM. Ainsi, l'inhibiteur de polymerase bêta utilisé dans le cadre de la présente invention présente avantageusement une valeur de IC50 (concentration inhibitrice, « inhibitory concentration », du composé nécessaire pour atteindre une réduction de 50% de l'activité de la polymerase) de l'ordre du micromole. L'acide masticadiénonique devient donc à ce jour l'inhibiteur spécifique le plus efficace de la pol β (IC50=8μM), par rapport aux inhibiteurs déjà connus décrits précédemment. L'acide masticadiénonique peut notamment être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de maladies induites par une prolifération ou un développement de cellules indésiré. Les affections qui sont traitées et/ou prévenues par inhibition de l'ADN polymerase bêta sont avantageusement choisies dans le groupe constitué par les cancers, les tumeurs et les maladies neurodégénératives. En plus du traitement des cancers, le médicament selon l'invention peut être utilisé pour la prévention et/ou le traitement de maladies caractérisées par un développement de cellules inapproprié/excessif ou incontrôlé. Selon une variante avantageuse de l'invention, le médicament comprend en outre un anticancéreux supplémentaire, qui est avantageusement un cytostatique. De nombreux agents anti-tumoraux ou anticancéreux présentent une toxicité importante qui limite leur utilisation et principalement la quantité des doses administrées. L'utilisation de l'acide masticadiénonique, inhibiteur de pol β, en association avec un agent antitumoral ou anticancéreux permet de réduire la quantité à administrer d'un tel agent nécessaire pour tuer les cellules cancéreuses et permet ainsi d'améliorer les bénéfices thérapeutiques de l'utilisation de cet agent. Le médicament selon l'invention contient avantageusement : a) le composé de formule (I), et b) un anticancéreux, en tant que produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des cancers et/ou des tumeurs. Dans le cadre de la présente invention, l'anti cancéreux supplémentaire est avantageusement un cytostatique dérivé du platine, encore plus avantageusement le cisplatine, Poxaliplatine ou le carboplatine. De façon avantageuse, il s'agit du cisplatine. L'utilisation de l'acide masticadiénonique en association avec le cisplatine permet d'améliorer l'efficacité du cisplatine en tant qu'agent anticancéreux. L'acide masticadiénonique permet d'inhiber l'action de pol β vis-à-vis du cisplatine sans bloquer ses actions essentielles à la vie de la cellule, offrant une drogue peu toxique et à l'action ciblée contre la chimiorésistance. Selon une variante avantageuse de l'invention, le médicament est destiné au traitement des tumeurs choisies dans le groupe constitué par les tumeurs du testicule, de l'ovaire, du col de l'utérus, de l'endomètre, de la sphère ORL, de l'œsophage, de la vessie, du poumon, du sein, de la tête et du cou, gastriques, colorectales, pédiatriques du cerveau ou de la tumeur épidermoïde et des ostéosarcomes Selon une autre variante avantageuse de l'invention, le médicament est destiné au traitement des cancers choisis dans le groupe constitué par les cancers du poumon, colorectaux, du sein, de la tête et du cou, gastriques, pédiatriques du cerveau, du testicule, de l'ovaire, ORL, de l'œsophage, du col de l'utérus, de l'endomètre, de la vessie ou des cancers épidermoïdes et des ostéosarcomes. Selon encore une autre variante avantageuse de l'invention, le médicament est destiné au traitement des maladies dégénératives choisies dans le groupe constitué par la maladie d'Alzheimer, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Marchiafava- Bignami, la maladie de Parkinson, la maladie de Pick et la maladie de Wilson D'une manière classique, le médicament comprend en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable, avantageusement approprié pour une administration par voie intraveineuse, par voie orale, par voie intratumorale, par voie anale, par voie intramusculaire, par voie sous-cutanée, par voie percutanée ou par voie intrapéritonéale. Le médicament comprend avantageusement 0,1 à 60% en poids du composé de formule (I), par rapport au poids total du médicament. Selon une variante avantageuse de l'invention, le médicament comprend 0,1 à 60% en poids du composé de formule (I) et 0,1 à 60% en poids d'un anticancéreux, par rapport au poids total du médicament Comme l'homme de l'art le sait très bien, la quantité de principe actif dans le médicament dépend également de la voie d'administration choisie. Ainsi, par exemple, pour un injectable, la quantité de principe actif dépend à la fois de la dose active et de la solubilité/stabilité de l'actif dans la formulation. Si le principe actif est très soluble dans l'eau, on se situe généralement dans la formulation à des concentrations en principe actif comprises entre 1 mg/ml et 100 mg/ml, soit entre 0,1 % et 10%, avantageusement entre 5 mg/ml et 50 mg/ml, soit entre 0,5% et 5%, encore plus avantageusement entre 10 mg/ml et 40 mg/ml, soit entre 1% et 4%. Si le principe est très actif, la quantité en dit principe actif dans la formulation peut être comprise entre 0,1 mg/ml et 10 mg/ml, soit entre 0,01 % et 1%, avantageusement entre 0,5 mg/ml et 5 mg/ml, soit entre 0,05% et 0,5%o, encore plus avantageusement entre 0,7 mg/ml et 3 mg/ml, soit entre 0,07% et 0,3%> ; les pourcentages étant donnés en poids de principe actif par rapport au poids total de la formulation. En règle générale, on est plus dilué dans une formulation injectable qu'on ne le serait dans une formulation destinée à une administration par voie orale. Toutefois, dans certains cas, la formulation injectable sera très concentrée, ce qui est notamment le cas d'une formulation nanoparticulaire à disperser dans une perfusion. Dans le cadre de formulations pour une administration par voie orale de ces même principes actifs, les doses chargées sont bien sûr beaucoup plus importantes. Ainsi, par exemple, dans des capsules molles ou des gélules à contenu pâteux, la formulation peut comprendre entre 1 et 60% en poids de principe actif, avantageusement entre 5 et 50% en poids de principe actif, encore plus avantageusement entre 10 et 40% de principe actif, encore plus avantageusement entre 10 et 20% en poids de principe actif ; les pourcentages massiques étant exprimés par rapport au poids total de la composition. Le médicament selon l'invention peut être administré sous formes unitaires ou multidoses d'administration en mélange avec des supports pharmaceutiques adéquats connus de l'homme du métier. Pour une administration par voie orale, les formes unitaires d'administration appropriées comprennent notamment les comprimés éventuellement sécables, les gélules, les poudres, les granulés et les solutions ou suspensions orales. Pour une administration par voie orale, les formes multidoses d'administration appropriées comprennent notamment les gouttes buvables, les émulsions et les sirops. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales des composés et compositions selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique, adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés.
Les exemples et les figures suivants illustrent la présente invention et ils ne sont pas limitatifs. Sur la figure 1, sont représentés deux diagrammes qui illustrent l'effet de l'acide masticadiénonique sur pol β, pol δ, pol K, pol λ et sur des extraits nucléaires. Dans ces diagrammes, 100% représente l'activité du contrôle sans l'acide masticadiénonique. Sur la figure 2, sont représentés les résultats de la synthèse translésionnelle d'un adduit cisplatine par pol β en présence d'acide masticadiénonique. La concentration d'acide masticadiénonique utilisée est de 20 μM. Les positions de la matrice 17-mer, de la position de la lésion (39-mer) et du pleine taille (60-mer) sont indiquées par des flèches. Sur la figure 3, est représenté le diagramme illustrant la viabilité des cellules
2008 C13*5,25 en présence de cisplatine et d'acide masticadiénonique. Sur la figure 4, sont représentés les résultats du test de retard de mobilité sur gel d'un ADN simple brin de la pol β pleine taille (A) ou du domaine 8-kDa de pol β (B).
Les expériences ont été réalisées en présence ou en absence d'acide masticadénionique.
L'ADN simple brin de Ml 3 (3,6 pmol, piste 1) a été incubé avec pol β ou le domaine 8- kDa (3 pmol, piste 4) et 10 pmol (piste 2) ou 1 pmol (piste 3) d'acide masticadénionique.
Exemple 1 : Procédé d'extraction de l'acide masticadiénonique Les extraits des tiges de Pistachia lentiscus ont été préparés par macération toute une nuit dans de l'éthyle acétate, filtration et évaporation. Ces extraits ont ensuite été fractionnés sur des cartouches SPE SiO2 Upti Clean en utilisant un gradient chloroforme-méthanol. Les aliquots ont été dissous dans du DMSO 100%. Le fractionnement a été réalisé par chromatographies préparatives sur phases normales ou inverses C-18. Le produit pur, à savoir l'acide masticadiénonique, a été dissous dans les tampons appropriés pour obtenir des concentrations de 10"2 M à 10"7 M.
Exemple 2 : Effet de l'acide masticadiénonique sur pol β, sur d'autres ADN polymérases et sur des extraits nucléaires réplicatifs Pour déterminer l'efficacité de l'inhibiteur acide masticadiénonique sur pol β, nous avons utilisé un test de réplication in vitro en utilisant comme matrice de réplication un ADN génomique « activé » contenant des brèches simple brins. En ce qui concerne la spécificité, nous avons comparé l'efficacité de l'inhibiteur sur pol β avec celle relative à des extraits nucléaires totaux de cellules Hela contenant toutes les autres ADN polymérases nucléaires humaines. Par ailleurs, nous avons aussi testé la principale ADN polymerase réplicative pol δ ainsi que les ADN polymérases mutagènes pol K et pol λ Les cellules Hela (ATCC) sont cultivées en suspension dans un milieu RPMI1640. Les extraits réplicatifs ont été préparés selon un mode de réalisation classique connu de l'homme du métier après récupération des cellules en phase exponentielle de croissance. La pol β de rat utilisée pour le criblage à haut débit a été purifiée. Le domaine 8- kDa de la pol β a été clone dans le plasmide pIVEX2.4d (Roche) afin d'obtenir le plasmide pl968 qui, après séquençage et purification, a été introduit dans la bactérie BL21(DE3). La purification de la pol K a été réalisée par la société GTP Tech. (Toulouse, France) après avoir clone l'ADNc de pol K du plasmide pHSE2 (provenant de chez H. Ohmori, Kyoto, Japon) dans un système bacculovirus. La pol β humaine provient de la société Trevigen (USA). Les 4 sous-unités de la pol δ ont été purifiées à partir de cellules sf9 infectées par un bacculovirus. La pol λ et la pol λ tronquée ont été purifiées. Essais de réplication Toutes les ADN polymérases ont été testées selon la même procédure. De l'ADN de thymus de veau (Sigma) activé (digéré à la l'ADNase I) est utilisé comme matrice de réplication dans un volume final de 20μl, à 37°C, en faisant varier le temps d'incubation et en présence d'inhibiteurs. La pol β humaine (0,5 unités) est ajoutée à un tampon contenant 25 mM Hepes KOH pH 8,5, 10m M MgCl2, 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 μM de dATP, dGTP, dCTP, 0,2 μCi [3H]dTTP et 1 μg de matrice. La pol λ sauvage ou tronquée (0,5 unité de chaque) est utilisée dans un tampon contenant 50 mM Tris pH 8,5, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 μg/ml BSA, 0,75 mM MnCl2, 5 μM de dATP, dGTP, dCTP, 0,2 μCi [ HJdTTP et lμg de matrice. Les conditions pour la pol δ humaine (0,05 unités) et pol K (1,5 unités) sont 50 mM Tris pH 6,5, 1 mM DTT, 0,25 mg/ml BSA, 6 mM MgCl2, 4,6 μg/ml PCNA (pour pol δ), lOOμM de dATP, dGTP, dCTP, 0,2 μCi [3H]dTTP et lμg de matrice. Après l'incubation, la réaction est stoppée avec de l'EDTA 10 mM et les produits d'ADN radioactifs sont collectés sur des filtres en fibre de verre GF/C (Wathman). Les filtres sont ensuite lavés deux fois dans une solution d'Acide TrichloroAcétique 5% et utilisés pour le comptage. Les valeurs d'inhibitions (EC5o) sont calculées à l'aide du logiciel GraphPad Prism. Les résultats sont résumés sur la figure 1. Légende : (1A) (1B) " Pol β IC50=8μM B Pol λ IC50=80μM A Pol δ IC50=60mM A ΔPol λ IC50=748mM • Pol K IC50=269μM →~ Pol β IC50=8μM -"- Hela ext. IC50= 115 μM L'acide masticadiénonique inhibe pol β avec une IC o de 8μM. Inversement, les extraits nucléaires des cellules Hela sont beaucoup moins sensibles puisqu'ils sont 14,4 fois moins inhibés que pol β. Ces résultats montrent la spécificité de l'acide masticadiénonique sur pol β en regard de la machinerie réplicative extraite de noyaux cellulaires. Il a aussi été montré que la pol δ, en présence du co-facteur de réplication PCNA, est totalement insensible à l'acide masticadiénonique. Ceci montre que seul l'acide masticadiénonique est spécifique de pol β. Nous avons aussi analysé le degré de spécificité de cet inhibiteur sur la pol \ une polymerase mutagene de la famille X, très proche de pol β. L'acide masticadiénonique n'inhibe pas pol λ, de façon significative, renforçant sa spécificité pour pol β. Il en est de même pour la pol K. La valeur IC50 relativement modeste laisse envisager une toxicité faible (la cible est une protéine essentielle à la vie de la cellule) tout en préservant le caractère spécifique de l'action pharmacologique (ciblée sur la synthèse translésion d'adduits pontants).
Exemple 3 : Effet de l'acide masticadiénonique sur la synthèse translésionnelle des adduits cisplatine
Nous avons examiné l'effet de l'acide masticadiénonique sur l'extension par pol β d'une matrice de 60 nucléotides (SEQ ID No.l) contenant un adduit cisplatine hybridée à une matrice de 17 nucléotides 5' phosphorylée (SEQ ID No.2). Les ADN polymérases réplicatives ne sont pas capables de répliquer au-delà de l'adduit alors que pol β est la seule polymerase connue pour répliquer ces lésions et donc permettre d'obtention d' un produit de synthèse pleine taille. Nous avons déterminé la concentration minimale (20 μM) qui inhibe la synthèse translésionnelle de l'adduit platine sans affecter la synthèse d'un ADN non endommagé. Essais de synthèse translésionnelle d'adduits Cisplatine. La matrice d'oligonucléotide de 60-mer non modifiée ou portant l'adduit cisplatine a été préparée selon un procédé connu de l'homme du métier et hybridée à une amorce 17-mer marquée au P en 5'. Les réactions sont réalisées. A la fin de la réaction, les échantillons sont dénaturés pendant 10 minutes à 70°C et résolus sur un gel de polyacrylamide 15%, 7M urée, 30% formamide. Les résultats sont résumés sur la figure 2 (AM= acide masticadiénonique).
Exemple 4 : Résistance cellulaire au Cisplatine en présence des inhibiteurs
L'acide masticadiénonique inhibant de façon assez sensible la synthèse translésionnelle d'adduits cisplatine, nous avons étudié son impact sur la résistance de cellules tumorales ovariennes humaines 2008 Cl 3*5,25 cellules tumorales, pour lesquelles il a été montré que la résistance associée à l'agent cisplatine résultait de la surexpression de Pol β et de sa forte capacité translésionnelle. Les cellules 2008 et 2008 013*5.25 ont été cultivées dans du milieu RPMI1640. La cyto toxicité est déterminée par tests de clonogénie. Pour les tests de réversion de résistance au cisplatine, les cellules sont traitées tout le long de l'expérience avec les inhibiteurs à une dose permettant 80% de la survie cellulaire (LD20), le cisplatine étant administré 24 h après ensemencement pendant 1 h. Nous avons réalisé des tests de prolifération et de survie cellulaire en incubant ces cellules avec une gamme de cisplatine et l'acide masticadiénonique à une dose correspondant à 80% de survie. L'acide masticadiénonique n'a aucun effet sur la sensibilité de la lignée cellulaire parentale 2008 (cellules saines) en présence de cisplatine. Par contre, il permet de diminuer la survie de cellules 2008 C13*5,25 en présence de cisplatine. Les résultats sont résumés sur la figure 3. Légende : -"— 2008 C13*5,25 —A — 2008 C13*5,25 + acide masticadiénonique 20μM
Exemple 5 : L'acide masticadiénonique se lie au domaine 8-kDa N-terminal de pol β
Pour déterminer le site de fixation de l'acide masticadiénonique sur la pol β, nous avons analysé par gel retard la fixation pol β sur de l'ADN simple brin du phage Ml 3 en présence d'acide masticadiénonique. Essais de retard sur gel. Les essais de retard sur gel ont été réalisés selon un procédé classique. Le milieu de fixation (lOμl) contient 20mM Tris HC1, pH 7,5, 40 mM KC1, 50 μg/ml de BSA, 2mM EDTA, 3,6 pmol d'ADNsb Ml 3 et 3 pmol de pol β sauvage ou tronquée. L'acide masticadiénonique, à des concentrations variables, est ajouté au milieu de fixation pendant 10 minutes à 25°C. Les échantillons migrent ensuite sur gel d'agarose 0,8% pendant toute une nuit à 30V dans du tampon Tris acétate 0,1 M, pH 8,3 et 5mM EDTA. Un retard est observé avec la pol β pleine taille (39 kDa), faiblement avec le domaine 8-kDa. Quand l'acide masticadiénonique est utilisé en excès par rapport au fragment 8-kDa, cela perturbe la liaison entre l'ADN simple brin et le domaine 8-kDa.
A l'inverse, quand l'acide masticadiénonique est utilisé à faible concentration, la liaison
ADN/8-kDa n'est pas du tout perturbée. Par ailleurs, comme contrôle négatif, nous avons montré que l'acide masticadiénonique ne perturbe pas la liaison entre de l'ADN simple brin et une autre protéine connue pour interagir avec l'ADN simple brin, la protéine de réplication A (RPA). Ces résultats montrent que l'acide masticadiénonique interfère directement et spécifiquement avec le domaine de liaison à l'ADN simple brin de pol β. Les résultats sont résumés sur la figure 4.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de l'acide masticadiénonique de formule (I).
Figure imgf000017_0001
pour la fabrication d'un médicament destiné, par inhibition de l'ADN polymerase bêta, au traitement et/ou à la prévention d'affections.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement et/ou à la prévention d'affections par inhibition spécifique de l'ADN polymerase bêta.
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement et/ou à la prévention d'affections par inhibition forte de l'ADN polymerase bêta, le composé de formule (I) ayant notamment une valeur de IC50 inférieure ou égale à 8 μM.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les affections sont choisies dans le groupe constitué par les cancers, les tumeurs et les maladies neurodégénératives. -
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament comprend un anticancéreux supplémentaire, avantageusement un cytostatique.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le médicament contient : c) le composé de formule (I), et d) un anticancéreux, en tant que produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des cancers et/ou des tumeurs.
7. Utilisation selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que l'anti cancéreux supplémentaire est un cytostatique dérivé du platine, avantageusement le cisplatine, l'oxaliplatine ou le carboplatine.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement des tumeurs choisies dans le groupe constitué par les tumeurs du testicule, de l'ovaire, du col de l'utérus, de l'endomètre, de la sphère ORL, de l'œsophage, de la vessie, du poumon, du sein, de la tête et du cou, gastriques, colorectales, pédiatriques du cerveau ou de la tumeur épidermoïde et des ostéosarcomes.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement des cancers choisis dans le groupe constitué par les cancers du poumon, colorectaux, du sein, de la tête et du cou, gastriques, pédiatriques du cerveau, du testicule, de l'ovaire, ORL, de l'œsophage, du col de l'utérus, de l'endomètre, de la vessie ou des cancers épidermoïdes et des ostéosarcomes.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement des maladies dégénératives choisies dans le groupe constitué par la maladie d'Alzheimer, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Marchiafava-Bignami, la maladie de Parkinson, la maladie de Pick et la maladie de Wilson.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament comprend en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable, avantageusement approprié pour une administration par voie intraveineuse, par voie orale, par voie intratumorale, par voie anale, par voie intramusculaire, par voie sous-cutanée, par voie percutanée ou par voie intrapéritonéale.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le médicament comprend 0,1 à 60% en poids du composé de formule (I), par rapport au poids total du médicament.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que le médicament comprend 0,1 à 60% en poids du composé de formule (I) et 0,1 à 60% en poids d'un anticancéreux, par rapport au poids total du médicament.
PCT/FR2005/000701 2004-03-23 2005-03-23 Utilisation de l’acide masticadienonique en tant qu’inhibiteur de l’adn polymerase beta WO2005094837A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0402972 2004-03-23
FR0402972A FR2867980B1 (fr) 2004-03-23 2004-03-23 Utilisation de l'acide masticadienonique en tant qu'inhibiteur de l'adn polymerase beta

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005094837A1 true WO2005094837A1 (fr) 2005-10-13

Family

ID=34944453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2005/000701 WO2005094837A1 (fr) 2004-03-23 2005-03-23 Utilisation de l’acide masticadienonique en tant qu’inhibiteur de l’adn polymerase beta

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2867980B1 (fr)
WO (1) WO2005094837A1 (fr)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012032523A2 (fr) 2010-09-07 2012-03-15 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des extraits acides de résine de lentisque
WO2017051423A1 (fr) 2015-09-24 2017-03-30 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des triterpénoïdes
WO2018047175A1 (fr) 2016-09-08 2018-03-15 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des triterpénoïdes et leurs utilisations pour traiter une neuropathie optique
CN108715845A (zh) * 2018-05-15 2018-10-30 郑州大学 一种食管上皮组织polβ特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法
US10751347B2 (en) 2016-09-08 2020-08-25 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum and uses thereof for treating optic neuropathy
US11083736B2 (en) 2015-09-24 2021-08-10 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092712A1 (fr) * 2002-05-01 2003-11-13 Lavipharm S.A. Utilisation du mastic et de ses composants dans le controle des infections microbiennes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092712A1 (fr) * 2002-05-01 2003-11-13 Lavipharm S.A. Utilisation du mastic et de ses composants dans le controle des infections microbiennes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRECHET M ET AL: "DNA polymerase beta imbalance increases apoptosis and mutagenesis induced by oxidative stress", FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 505, no. 2, 14 September 2001 (2001-09-14), pages 229 - 232, XP004305707, ISSN: 0014-5793 *
GINER-LARZA EVA M ET AL: "Anti-inflammatory triterpenes from Pistacia terebinthus galls", PLANTA MEDICA, vol. 68, no. 4, April 2002 (2002-04-01), pages 311 - 315, XP009038214, ISSN: 0032-0943 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10561670B2 (en) 2010-09-07 2020-02-18 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum
US9770456B2 (en) 2010-09-07 2017-09-26 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum
EP3581177A3 (fr) * 2010-09-07 2020-02-26 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des extraits acides de résine de lentisque
EP3581177A2 (fr) 2010-09-07 2019-12-18 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des extraits acides de résine de lentisque
US10159680B2 (en) 2010-09-07 2018-12-25 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum
WO2012032523A2 (fr) 2010-09-07 2012-03-15 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des extraits acides de résine de lentisque
KR101910781B1 (ko) * 2010-09-07 2018-10-22 레제네라 파마 리미티드 매스틱 검의 산성 추출물을 포함하는 조성물
EP2613777A4 (fr) * 2010-09-07 2015-08-12 Regenera Pharma Ltd Compositions comprenant des extraits acides de résine de lentisque
US9271949B2 (en) 2010-09-07 2016-03-01 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum
US10285996B2 (en) 2015-09-24 2019-05-14 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids
JP2018528973A (ja) * 2015-09-24 2018-10-04 レジネラ ファーマ リミテッド トリテルペノイドを含む組成物
WO2017051423A1 (fr) 2015-09-24 2017-03-30 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des triterpénoïdes
US11173164B2 (en) 2015-09-24 2021-11-16 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids
IL258279B (en) * 2015-09-24 2022-09-01 Regenera Pharma Ltd Preparations containing triterpenoids
US10588911B2 (en) 2015-09-24 2020-03-17 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids
JP7031867B2 (ja) 2015-09-24 2022-03-08 レジネラ ファーマ リミテッド トリテルペノイドを含む組成物
US11083736B2 (en) 2015-09-24 2021-08-10 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids
WO2018047175A1 (fr) 2016-09-08 2018-03-15 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprenant des triterpénoïdes et leurs utilisations pour traiter une neuropathie optique
US11207333B2 (en) 2016-09-08 2021-12-28 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising triterpenoids and uses thereof for treating optic neuropathy
US10751347B2 (en) 2016-09-08 2020-08-25 Regenera Pharma Ltd. Compositions comprising acidic extracts of mastic gum and uses thereof for treating optic neuropathy
CN108715845B (zh) * 2018-05-15 2021-09-24 郑州大学 一种食管上皮组织polβ特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法
CN108715845A (zh) * 2018-05-15 2018-10-30 郑州大学 一种食管上皮组织polβ特异性敲除小鼠食管癌前病变模型的构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR2867980B1 (fr) 2006-07-14
FR2867980A1 (fr) 2005-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005094837A1 (fr) Utilisation de l’acide masticadienonique en tant qu’inhibiteur de l’adn polymerase beta
EP2576596B1 (fr) Peptide en tant que médicament, en particulier pour le traitement du cancer
Sandau et al. The balance between nitric oxide and superoxide determines apoptotic and necrotic death of rat mesangial cells.
WO2011128561A1 (fr) Protéine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
WO2006087242A2 (fr) Peptides inhibiteurs intracellulaires et animaux transgeniques les exprimant
Barnes et al. Ionotropic glutamate receptor biology: effect on synaptic connectivity and function in neurological disease
Zaki et al. N-acetylcysteine versus progesterone on the cisplatin-induced peripheral neurotoxicity
EP1206257B1 (fr) Utilisation d'acides amines pour la fabrication de medicaments destines au traitement des insulino-resistances
WO2013004436A1 (fr) Compositions pour le traitement ou la prévention du cancer de la prostate à base d'extrait de graines de brocoli
Ogita et al. Possible modulation by glutathione of glutamatergic neurotransmission
Cardinaal et al. Histological effects of co-administration of an ACTH (4–9) analogue, ORG 2766, on cisplatin ototoxicity in the albino guinea pig
WO2005039589A2 (fr) Modulateurs des canaux cftr
FR2763845A1 (fr) Produits anti-cancereux pour le traitement de la mucoviscidose
Vandenberghe et al. Early events in glutamate receptor trafficking
JP7023518B2 (ja) 分泌障害の処置のための方法および組成物
EP1638559B1 (fr) Utilisation de pyrazolopyridines pour le traitement de deficits cognitifs
El-Yazbi et al. Impact of caveolin-1 knockout on NANC relaxation in circular muscles of the mouse small intestine compared with longitudinal muscles
EP1594498B1 (fr) Utilisation de l'étazolate pour le traitement de pathologies neurodegeneratives oculaires
TW404951B (en) Effector proteins of rapamycin
Bosc et al. Effects of endothelin-3 on intestinal ion transport
EP1931701A1 (fr) Agent et préparations l'incluant pour l'inhibition de lipases et/ou de phospholipases dans les fluides corporels, les cellules et les tissus
EP2755650B1 (fr) Utilisation de la 3-(r)-[3-(2-methoxyphenylthio)-2-(s)-methyl-propyl]amino-3,4-dihydro-2h-1,5-benzoxathiepine pour le traitement du cancer et en particulier pour la prevention et/ou le traitement des metastases cancereuses
WO2016094518A2 (fr) Nouveaux peptides cycliques et leurs procédés d'utilisation
KR100507814B1 (ko) 메타쉐쿼이아의 잎으로부터 분리된디하이드로히노키플라본 또는 이의 약제학적으로 허용되는염을 활성성분으로 하는 항암제
JP2023135605A (ja) 生理活性ペプチドとしてのプレプロオレキシン、その断片、およびそれらの変異型

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase