WO2005093054A1 - 改変フィトクロム - Google Patents

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WO2005093054A1
WO2005093054A1 PCT/JP2004/011315 JP2004011315W WO2005093054A1 WO 2005093054 A1 WO2005093054 A1 WO 2005093054A1 JP 2004011315 W JP2004011315 W JP 2004011315W WO 2005093054 A1 WO2005093054 A1 WO 2005093054A1
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plant
gene
phytochrome
modified
phytochrome gene
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PCT/JP2004/011315
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Tomonao Matsushita
Akira Nagatani
Original Assignee
Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd.
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the present invention relates to an artificially modified phytochrome gene, a plasmid vector having the gene incorporated therein, a plant into which the gene has been introduced, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to providing a plant having characteristics such as high photosensitivity, an increase in pigment content, a prolonged flowering period, an enlarged ovary, and an enlarged stem or plant by introducing the gene. . Fine 1
  • the shade reaction is essential for the survival of plant species, but is one of the agricultural disadvantages.
  • the principle is to plant a single plant species densely, which causes the entire population to evade shade. In other words, there is a problem that the stem grows and grains such as rice and wheat become extremely vulnerable to wind and rain and flood damage.
  • Contraception is caused by a decrease in the activity of a plant-specific photoreceptor called phytochrome in the shade.
  • phytochrome works in the direction that inhibits the contraceptive reaction (stem elongation).
  • Phytochrome is a pigment with a monomer molecular weight of about 120,000, and is known to act as a photoreceptor in various light responses of plants, from seed photo-germination to photoperiod sensitivity during flowering. (Smith H. Phy toch romes and ligh tsi gna lerception by pl ants-an eme rgi ng synthesi s. Natura 407, 585-591, 2000).
  • phytochrome When phytochrome absorbs red light, it moves from the cytoplasm into the nucleus and interacts with transcription factors. It is also known to regulate the expression of various genes in the nucleus (Yam aguch i R. Eta1: J. Cell Biol (1999) 145: 437-445; Quail PH: Na) t Rev Mo 1 Cell Biol (2002) 3: 85-93).
  • the characteristics of the phytochrome molecule consist of two domains, an N-terminal region (hereinafter sometimes referred to as a signal transduction domain) and a C-terminal region, each of which retains its three-dimensional structure independently and has a unique function.
  • the N-terminal region binds to chromophores and acts on photoreception, while the C-terminal region has multiple motifs that may be involved in signal transduction. For this reason, it has been believed that the C-terminal region transmits signals to downstream factors (supervised by Shozo Wada et al .: Plant light sensing; Plant Cell Engineering Series 16, Shujunsha, 2001).
  • Phytochrome molecules are always dimerized via the C-terminal region, but their physiological significance has not been known.
  • the present invention provides a phytochrome signal transduction domain modified gene, a plasmid vector incorporating the gene, and the modified gene, whereby high photosensitivity, increased pigmentation, prolonged flowering period, enlarged ovary,
  • the main object of the present invention is to provide a plant having characteristics such as enlargement of a stem or a strain. Disclosure of the invention
  • the present inventors have concluded that the N-terminal region of the phytochrome molecule has nuclear signaling ability, that the N-terminal region is preferably dimerized for efficient signal transmission, and that the N-terminal region has It has been found that a phytochrome molecule fused with a domain involved in dimerization and a nuclear translocation signal has a photosensitivity that is 100 times or more higher than that of a full-length phytochrome molecule, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to an artificially modified phytochrome whose photosensitivity has been enhanced by genetic manipulation, a plasmid vector incorporating the gene, and a plant into which the gene has been introduced. Furthermore, the plant having the artificially modified phytochrome gene of the present invention has characteristics such as an increase in the amount of pigment contained, a prolonged flowering period, an enlarged ovary, and an enlarged stem or plant.
  • Figure 2 Signaling activity of the N-terminal region of phyB in the nucleus.
  • a, b Continuous white light (50 ⁇ mo lm_ 2 s- 1 week under Ikuo the seedlings chlorophyll levels (a) and cotyledon area (b) f w:.. . fresh weight.
  • Figure 4 G767 / R mutation inhibits phYB nuclear accumulation.
  • Figure 5 Model for the function of phyB and NG—GUS—NLS in cells.
  • phyB and NG-GUS-NLS enter the nucleus by the action of the C-terminal region (C) of phyB and NLS, respectively.
  • C C-terminal region
  • N inhibits phyB entry into the nucleus.
  • Nuclear accumulation of NG—GUS—NLS at sites is not enough to trigger a reaction.
  • dimerized phyB and N in NG-GUS-NLS signal efficiently. The signaling activity of N in phyB is inhibited by C.
  • FIG. 6 shows the plasmid used in this example.
  • the present invention provides the following modified phytochrome gene, a modified phytochrome protein encoded by the gene, and a plant into which the gene has been introduced.
  • a modified phytochrome gene containing DNA encoding the signaling domain of the phytochrome gene and DNA encoding a nuclear localization signal.
  • the modified phytochrome gene according to item 1 wherein a nuclear translocation signal is fused directly or via a peptide to the C-terminal side of the signaling domain of the phytochrome gene. 3.
  • the plant according to item 8 which is in the form of a stem, tuber, leaf, root, tuber, bud, flower, petal, ovary, fruit, pod, seed, fiber, or ovule, and the progeny thereof.
  • a method for producing a useful substance comprising cultivating the plant and its progeny according to item 8, and collecting the substance produced in the organ of the plant.
  • the transformed cells show higher photosensitivity, increased pigment content, longer flowering period, increased number of ovaries, increased ovary size, stalk of stem, compared to plants not having the phytochrome gene.
  • the modified phytochrome gene of the present invention contains a signal transduction domain and a nuclear translocation signal, and preferably further contains a domain that works for dimerization (dimerization domain).
  • the order of these ligation is not particularly limited, but it is preferable that the signal transduction domain is present on the 5 'side (N-terminal side of the expressed protein), then the nuclear translocation signal, and if necessary, further dimerization.
  • the domains should be linked. These may be directly linked to each other, or may be linked via a peptide serving as a suitable spacer.
  • the phytochrome molecule Upon receiving red light, the phytochrome molecule undergoes a structural change, moves from the cytoplasm to the nucleus, and performs signal transmission. This signal transduction is thought to be controlled by the N-terminal region of the phytochrome molecule acting in a promoting manner, and the C-terminal region inhibiting signal transduction from the N-terminal region.
  • the present inventors isolated only the N-terminal region of the phytochrome molecule, which has a chromophore binding site acting on photoreception, and fused it with a nuclear translocation signal to accumulate it in the nucleus, thereby weakening it. A construct having signal transmission activity was produced. Furthermore, it was shown that the signal transduction activity was clearly increased by fusing the dimerization domain to this construct. A detailed examination of the signaling activity of this construct showed that the photosensitivity was nearly 100-fold higher than that of normal phytochrome. It was found that the contraceptive reaction was suppressed.
  • the phytochrome gene from which the signaling domain is derived is Any of the five types of phytochrome genes (phytochromes A to E) belonging to the cytochrome family may be used, but phytochrome B, which is stable to light, is preferred.
  • the phytochrome B gene isolated from Arabidopsis thaliana is used, but its origin is not particularly limited as long as it has a photoreceptor function and photostability.
  • the introduced phytochrome gene variant may be a phytochrome gene variant derived from a plant before introduction or a variant of a related plant of the plant, and is classified as long as it functions in the plant into which the gene is introduced. It may be a phytotoxin gene variant derived from a plant having a different scientific lineage.
  • the modified phytochrome gene of the present invention can be prepared by a method for preparing a plasmid construction commonly used by those skilled in the art.
  • the Arabidopsis phytochrome B signaling domain has a size of 651 polypeptide and is encoded by the gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the signal transduction domain used as a constitutional unit of the modified phytochrome gene of the present invention those having a polypeptide of 1-45 from the N-terminus of phytochrome B can be used. It may be one obtained by further linking any of the 651 arbitrary polypeptides.
  • the polypeptide of 1-450 or 1-651 of SEQ ID NO: 1 may be derived from Arabidopsis thaliana, and a corresponding gene derived from another plant may be used.
  • Phytochrome B genes derived from plants other than Arabidopsis thaliana include, for example, phytochrome B (1-622 polypeptide) of tobacco (Nicotianatobac urn) and phytochrome B (166 polypeptide of rice) of Oryzasativa. Peptide) and the like.
  • the polypeptide encoded by the signal transduction domain of the present invention may have one or more, for example, one or several amino acids substituted, added, deleted or deleted in the domain of the phytochrome gene as long as it has signal transduction activity. It may be inserted.
  • the protein may be a protein that hybridizes with DNA encoding a signal transduction domain under stringent conditions and has a signal transduction activity.
  • stringent conditions refers to specific hybridization conditions. —A condition in which only non-specification occurs and nonspecific ⁇ -hybridization does not occur. Such conditions are usually about 1 XSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, preferably about 0.5 XSSC, 0.1% SDS, 42 ° (:). More preferably, it is about “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” However, since it is considered that the entire structure of the signal transduction domain is desirable for sufficient photoreception, 1 to 651 polypeptide is used. And most preferably 651 or more polypeptides from the N-terminus, that is, polypeptides contained in the C-terminal region, or any other peptide sequence, as long as they do not inhibit signal transduction from the signal transduction domain. .
  • a nuclear localization signal (Null Locating Signal: NLS) used in the present invention refers to a protein encoded by the modified phytochrome gene of the present invention, which is expressed in the nucleus of a cell into which the gene has been introduced.
  • Nuclear translocation signals include NLS derived from SV40 virus large T antigen, NLS derived from the adeno-associated virus VP2 N-terminus, NLS derived from nucleoplasmin, MAT 0; 3 derived from c2, NL derived from c-myc S is not particularly limited as long as it can function in plants, but is preferably a nuclear translocation signal derived from SV40.
  • a nuclear transport signal encoded in the C-terminal region of the phytochrome gene may be used.
  • the polypeptide encoded by the nuclear localization signal of the present invention may be one in which one or more, for example, one or several amino acids have been substituted, added, deleted or inserted, as long as it has nuclear localization activity. You can.
  • a protein that hybridizes with a DNA encoding a nuclear localization signal under stringent conditions and has nuclear localization activity may be used.
  • the modified phytochrome molecule of the present invention has a signal transmitting ability even if it is a monomer, it is preferably dimerized since the signal transmitting ability of the signal transduction domain is enhanced by dimerization.
  • the dimerization domain used in the present invention may be at least dimerized, and in some cases, may be a dimerized or tetramerized one.
  • the dimerization domain may be any that can be fused to a phytochrome molecule.
  • Examples of the dimerization domain include, for example, Escherichia coli ⁇ -Dark mouth nidase (] 3-g1ucur on idase: GUS), daryuthion-one S-transferase (GST), the Fc portion of an IgG molecule that is an antibody molecule, syntropin, the PDZ domain of nNOS, MyoD, and Id.
  • Escherichia coli iS-dalcuronidase is an enzyme used as a selection marker in plants, and is known to act on tetramerization and dimerization.
  • the polypeptide encoded by the dimerization domain of the present invention may have one or more, for example, one or several amino acids replaced, added, or deleted as long as it has dimerization / multimerization activity. It may be lost or introduced.
  • a protein that hybridizes with DNA encoding the dimerization domain under stringent conditions and has dimerization activity may be used. For example, when Escherichia coli i3-Darc mouth nidase is used as the dimerization domain, the presence or absence of / 3 monodalcuronidase activity is not important as long as the dimerization is performed.
  • two or more signal transduction domains which may be the same or different, are optionally coordinated polypeptides (including nuclear translocation signals)
  • a gene encoding a protein linked in tandem via the gene may be introduced into a plant and expressed.
  • the promoter to be used in the present invention is not particularly limited as long as it can function in a plant.
  • the promoter of the forceful reflex mosaic virus 35S (CaMV 3
  • Non-plant-derived promoters such as 5S), nopaline synthase (NOS), or octopine synthase (OCS) promoters, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, chalcone synthase ( CHS) Gene motors or promoters of secondary metabolic enzymes such as chalcone synthase, or promoters of storage proteins such as glycinin, etc.
  • it is the CaMV 35S promoter.
  • the terminator used in the present invention is not particularly limited as long as it can function in a plant.
  • a terminator (NO) of a nopaline synthase gene derived from a Ti-plasmid of the genus Agrobacterium is used.
  • S garlic virus GV1, GV2, etc. It is preferable that
  • the vector incorporating the modified phytochrome gene of the present invention may contain a cis-regulatory element such as an enhancer sequence.
  • kanamycin resistance gene for example, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, neomycin metastatic gene, gentamicin resistance gene
  • plant May contain a gene capable of imparting herbicide resistance. Under conditions where selection pressure is not applied, the incorporated gene may be dropped. If a herbicide-tolerant gene is allowed to coexist on a vector, the herbicide corresponding to the gene will be used during cultivation. By doing so, there is an advantage that the condition where the selection pressure is always applied can be realized.
  • a repo overnight gene such as GFP, Lac-Z, etc. may be added to the vector into which the modified phytochrome gene has been incorporated, if necessary.
  • Examples of the vector into which the modified phytochrome gene of the present invention has been incorporated include plasmids, phages, phagemids, and the like that can be expressed in plant cells, such as pUC plasmid, pSC101 plasmid, and Ti-plasmid. And blue script plasmids, M13 phages, ⁇ phages, cosmids and the like.
  • a pPZP211 plasmid vector prepared based on PGV910 and pBR322 derived from Escherichia coli was used.
  • a gene encoding a protein that works for dimerization and a nuclear translocation signal gene are in an in-frame state, that is, a protein which is a product of these genes.
  • Genes that have been integrated so as to have the desired action of S can be mentioned.
  • the position at which each of these genes is incorporated is not limited, as long as the gene product performs the desired action.
  • the C-terminal region of the phytochrome molecule dimerizes the signal transduction domain and transports it to the nucleus, which is the site of signal transduction, but suppresses the activity of the signal transduction domain in the nucleus. From the function of this inhibitory signal By fusing the c-terminal region to the signaling domain, phytochrome with high photosensitivity can be obtained.
  • a modified phytochrome gene with two phytochrome B N-terminal genes and a nuclear translocation signal (Promo-Yuichi + phytochrome B signaling domain gene + phytochrome B signaling domain gene + nuclear translocation signal) ) Can be used to obtain dimerized phytochrome molecules.
  • the present inventor has found that expressing a phytochrome gene variant involved in the contraceptive reaction in a plant body significantly increases the expression level of the pigment.
  • the modified phytochrome protein of the present invention can be obtained by the following method. After transforming a host cell with the modified phytochrome gene of the present invention using the vector described in (1) by a transformation method usually used by those skilled in the art, the resulting transformant is After culturing, the modified phytochrome protein of the present invention can be separated and purified from the cultured cells or from the culture solution. In addition, known means and methods can be used in combination.
  • host cells include bacteria, preferably Escherichia coli (E.co1i) and the like.
  • eukaryotic cells include mothers (such as S acchar omy cescer evisiae), rice, maize, and the like.
  • Cells derived from monocotyledonous plants such as wheat, leguminous plants such as soybeans, endosperm, kidney beans, solanaceous plants such as tobacco, tomatoes, potatoes, and cruciferous plants such as cabbage, rapeseed, and radish, melons
  • Cells derived from dicotyledonous plants such as capriaceae plants such as capocia and cucurbitaceae, Umbelliferae plants such as carrots and celery, and asteraceous plants such as lettuce can be exemplified.
  • a method for purifying the obtained protein a method generally used for protein purification can be applied. For example, ion exchange chromatography, hydrophobic Mutual chromatography, gel filtration chromatography, reverse net chromatography, isoelectric focusing, preparative electrophoresis, isoelectric focusing, etc., and a combination of two or more methods selected from these can do.
  • the modified phytochrome protein described above may be used in an isolated state, or may be used in a state in which a gene encoding the protein is introduced into a host cell and the protein is expressed in the cell. good.
  • the part of the plant into which the gene is to be introduced includes whole plant, leaves, stems, roots, vases, growing points, plant organs such as seeds, epidermis, phloem, soft fiber, xylem, vascular bundle, etc. And plant cultured cells such as callus.
  • the gene of the present invention can be expressed using a promoter that is selectively expressed at one or more of these sites, and expressed at a specific site in a plant. Can be used to express the whole plant. For example, it is possible to prevent the expression of genetically modified protein in the edible region by specifically expressing only in stems and leaves, but not in parts such as fruits, grains and rhizomes.
  • a stage-specific promoter, an inducible promoter, or the like allows the gene of the present invention to be expressed only during a specific period.
  • a gene of the present invention by binding a gene of the present invention to a site-specifically expressed transcription factor or a sequence that responds to a transcription factor expressed for a specific gene, it can be site-specific or time-specific. It can also be expressed in a targeted manner.
  • the transgenic plant into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced can be obtained as follows.
  • the gene encoding the modified phytochrome of the present invention can be introduced into plant cells by a particle gun method (a method of direct introduction into tissue cells or cultured cells using a particle gun) into cells of a phytochrome-deficient strain.
  • a plant having the modified phytochrome gene can be obtained by regenerating a plant from the transformed cell into which the modified phytochrome gene has been introduced by a method generally used by those skilled in the art.
  • the particle gun method is useful because a gene can be directly introduced into the apical meristem of a growing plant.
  • the plasmid vector described in (1) can be used, for example, by an Agrobacterium infection method (a method of infecting plant tissue with Agrobacterium) or an electric whitening method (electrophoresis). The method can be led to plant cells by a conventionally known method such as a method (electrical introduction into protoplasts).
  • the genomic DNA of a plant virus eg, tomato mosaic virus, etc.
  • a binary vector commonly used for transformation e.g., tomato mosaic virus, etc.
  • the modified phytochrome gene of the present invention is introduced into germ cells inside the flower.
  • the seeds obtained from this plant are sown on a selective medium containing an antibiotic, whereby a transformed plant having the transgene in the whole plant can be obtained.
  • the organ with which the bacterial suspension is brought into contact is not limited to flower buds, but may be any organ or cell.
  • the modified phytochrome gene of the present invention can be introduced into the callus of a phytochrome-deficient strain to obtain a plant having the gene.
  • the method for regenerating a plant from callus is not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
  • a transgenic plant is produced using an agrobacterium to introduce the modified phytochrome gene of the present invention
  • the following method can be used.
  • specific conditions will be described using rice as an example.
  • the present invention is not limited to rice, and those skilled in the art can easily replace other parts of rice with other plants by referring to the following description. Plants can be created.
  • Ripe rice (Oryz asati va L.) seeds are placed on a small huller (No. 114, manufactured by Fujiwara Seisakusho), and 100-150 seeds from which paddy has been removed are placed in a 50 m1 disposable centrifuge tube. At this time, seeds that have turned brown are not used because they may cause mineral contamination. Then, for 1 minute with 70% ethanol, then dilute 40 ml of a seed sterilization solution (sodium sodium hypochlorite (5.0% available chlorine)) twice with sterile water, and add 2-3 drops of Tween20. Place the mixture in a centrifuge tube and shake at 150 rpm for 20 minutes on a shaker. At this time, be careful not to shake vigorously because the seeds will fj.
  • a seed sterilization solution sodium sodium hypochlorite (5.0% available chlorine)
  • the seeds, endosperm and shoots are cut off with a scalpel or with forceps, and only scutellum-derived calli are transferred to a new callus induction medium (N6C1) at 16 calli / dish.
  • N6C1 new callus induction medium
  • the callus is preferably a milky, hard callus with a diameter of 4 to 5 mm. Do not use calli with browning or sticky substances.
  • Agrobacterium glycerol restock stock transformed with a plasmid having kanamycin and hygromycin resistance genes by connecting the gene of interest to the promoter (a culture medium obtained by culturing agrobacterium in YEP medium overnight)
  • Agrobacterium grown on AB medium is scraped with a sterile scoop (small one) two or three times and placed in a 50 ml centrifuge tube with 30 ml of acetobacterium in an agrobacterium suspension medium ( AA medium).
  • AA medium agrobacterium suspension medium
  • test medium MS HF
  • idalomycin resistance If resistant, it will root and show the same growth as the wild type.
  • Non-transformants die in about one week without new roots growing. Once the plant has grown to fill the dish, remove the lid. Add water and let it acclimate for 4-5 days.
  • the medium used in the above (i) to (vi) can have the following composition.
  • the book can be easily read by referring to The Plant Jou rnal (1994) 6 (2), 2 71-282 or The Plant Jou rnal (1998) 16, 735—743. It is possible to create a transgenic plant into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced. DNA is extracted from the resulting transgenic plant according to a conventional method, this DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and Southern hybridization is performed using the modified phytochrome gene as a probe to confirm the presence or absence of gene transfer. You can do it.
  • RNA is extracted from transgenic or non-transgenic plants in accordance with a conventional method, and a probe having a sense sequence or an antisense sequence of the modified phytochrome gene is prepared. Using it, Northern hybridization can be performed to examine the state of expression of the target gene.
  • the above-described transgenic plant refers to a plant in which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced into a plant of a phytochrome-deficient strain by a genetic engineering technique and stably retained.
  • stably retained means that the plant is expressed for at least a period of time sufficient for the gene to be expressed in the modern plant into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced and a phenotype thereby appears. It means that it is retained in cells. Therefore, the modified phytochrome gene of the present invention is preferably integrated on the chromosome of the host plant, and more preferably inherited stably in the next generation.
  • transgenic plant homozygous for the gene In order to stably inherit the modified phytochrome gene of the present invention in the next generation, it is preferable to prepare a transgenic plant homozygous for the gene. Homozygous transgenic plants can be obtained, for example, by the following method.
  • T1 the transformation appearance ratio of T2 seeds obtained by self-pollination generally follows Mendel's law.
  • the transformants segregate at a 3: 1 ratio in T2 seeds.
  • T3 seed obtained by cultivating a T2 seed and self-pollinating if a transformant appears in all seeds, the T2 transformed plant is a homozygote (homozygote).
  • the T2 transformed plant can be determined to be heterozygous for the introduced modified phytochrome gene. Plants that are homozygous for the introduced modified phytochrome gene thus selected are extremely useful in the field of seed industry as a line in which a phenotype such as high photosensitivity is fixed.
  • phytochrome Since phytochrome is present in all plants and functions almost the same in different plant species, it is possible to introduce the modified phytochrome gene of the present invention into any plant species.
  • Plants into which the modified phytochrome of the present invention has been introduced include not only whole plants (all trees), but also their calli, seeds, any plant tissues, leaves, stems, tubers, roots, tubers, buds, flowers, petals, ovary , Fruits, pods, ovules, fibers and so on. Further, its progeny is also included in the plant of the present invention.
  • Plants into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced include organs such as stems, tubers, leaves, roots, tuberous roots, buds, flowers, petals, ovaries, fruits, pods, pods, seeds, fibers, ovules, etc. Remarkably different in the number, shape, growth period, coloring, properties, characteristics, etc. of the plant before the introduction of the modified phytochrome gene.
  • a plant having the modified phytochrome gene of the present invention exhibits higher photosensitivity than a plant before the introduction of the modified phytochrome gene, and as a result, a shade-reducing reaction is suppressed.
  • the high photosensitivity is about 10 times or more, preferably about 80 times or more, and more preferably about 100 times or more as compared with a plant before introducing the modified phytochrome gene of the present invention. Refers to having photosensitivity. Increased photosensitivity suppresses the shade-reducing reaction and suppresses stem elongation.
  • the flowering time tends to be about 2 to 4 times longer than that in the plant before the introduction of the modified phytochrome gene, and the flowering period (time during which ) Has been observed to be clearly prolonged compared to plants before the introduction of the modified phytochrome gene.
  • the prolonged flowering period means that the flowering period is longer than that of the plant before introduction of the modified phytochrome gene. It means that the flower period is extended by 5% or more, preferably 20% or more, and includes the case where the flower period is extended by 50% or more.
  • the density of flower buds per individual is 5% or more, preferably 20% or more, compared to the plant before the introduction of the modified phytochrome gene. It is preferably at least 50%, more preferably at least 100%, particularly preferably at least 200%.
  • the increase in flower bud density is due to the increased number of branches per plant and shorter internodes (stems), or both.
  • the transgenic plants into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced include natural pigments, saponins, polyphenols, terpenes, glycosides, antibiotics, anticancer agents, sweeteners, essential oils (herbs, etc.), fragrances, etc. Can increase the production of useful substances. Therefore, by introducing the gene of the present invention into a medicinal plant or a pigment-producing plant, a large amount of a useful substance such as a medicinal component or a natural pigment can be produced. In addition, it can promote the growth of fruits, rhizomes, tubers, etc., and can increase the yield of useful substances such as starch, oil, proteins, hydrocarbons, and cellulose contained in these.
  • these useful substances can be obtained by cultivating a transgenic plant into which the modified phytochrome gene has been introduced, and collecting a substance produced in an organ of the transgenic plant.
  • the organ of a transgenic plant refers to any organ that produces or accumulates a useful substance of interest.
  • a method for recovering a useful substance a conventionally known method may be used, and it is appropriately selected depending on a target useful substance. Since the color of flowers and leaves becomes darker and the color tone changes as the amount of pigment produced increases, the commercial value of ornamental plants can be further enhanced.
  • dwarf (miniature) ornamental plants by suppressing the growth of plant height. The plant does not elongate in height due to dense planting, and can increase the productivity of ornamental plants.
  • the present inventors have introduced the modified phytochrome gene of the present invention. It was confirmed that the amount of the pigment to be deposited was increased in the introduced plant, and the leaves and flowers were darker in color than the plant before the introduction of the modified phytochrome gene.
  • an increase in the amount of the pigment to be deposited means that the amount of the pigment has increased by about 20% or more, preferably about 30% or more compared to the plant before the introduction of the modified phytochrome gene of the present invention. Point.
  • natural pigments can be particularly efficiently obtained.
  • natural pigments include perilla, red cabbage, red radish, purple yam, safflower, gardenia, anthocyanin, carotenoid pigment, red cabbage pigment, safflower yellow pigment, purple corn pigment, cochineal pigment, purple corn pigment,
  • the plant having the modified phytochrome gene of the present invention has an increased number of stems (including the main stem, side stems, flower stems, stems, branches, etc.) per strain (increases the number of branches).
  • Each stem has a large thickness; the plant is enlarged; the leaves and flowers per plant are large; the number of ovary per plant is large and large.
  • the sunshine is less than the shade (about 10-lOOmolm-ss- 1 ). It is preferable to grow in. In this case, the sunshine condition is effective even if it is short-day condition, but it is preferable that it be continuous light condition or long-day condition.
  • the short-day condition generally means that the long period is 14 to 18 hours, preferably 8 hours light period / 16 hours dark period, Refers to 10 hours, preferably 16 hours light / 8 hours dark.
  • Continuous light conditions refer to a 24-hour light period / 0-hour period.
  • the flowering period is extended not only for potted flowers but also for cut flowers. Furthermore, transgenic plants with higher photosensitivity were produced, Increasing the expression of chromoproteins can increase the effect of sunlight by increasing the amount of saturation reaction under strong light. It also contributes to increased yield.
  • phytochrome induces the expression of genes involved in pigment synthesis and promotes the decomposition of CO, which is a factor that promotes flower bud formation.
  • the activity is increased in the transgenic plant of the present invention. Therefore, it is considered that characteristics such as an increase in the amount of pigment and an extension of the flowering period are observed.
  • the plant transformed by the introduction of the modified phytochrome gene of the present invention is not particularly limited, and can be widely applied to dicotyledonous plants, monocotyledonous plants, herbaceous plants, woody plants and the like.
  • the modified phytochrome of the present invention can be used as a high-sensitivity optical switch by utilizing the photosensitivity.
  • utilizing the feature that the structure of phytochrome B changes to an active type (P fr type) by red light and changes to an inactive type (P r type) by far-infrared light As an "off-type" optical switch, there is a method of controlling gene expression.
  • the cells were grown at 22 ° C. on a 0.6% agar plate containing a Murashige-Skoog (MS) medium supplemented with 2% (w / V) sucrose.
  • MS Murashige-Skoog
  • hypocotyls the sprouts were grown on MS agar plates without sucrose for 5 days. The relative hypocotyl length was compared to the value at each location.
  • Natl Ac was grown for 1 week under continuous white light (44 mo 1 m_ 2 s-) for Imnoblot. Chlorophyll atssii, Moch iz uk i, N. eta l., Pr oc. ad. Sc i. USA 98, 2053-2058, 2001.
  • Petiole length was measured after the longest leaf of each plant was photographed.
  • SV40NLS (Kadelon, D., et al. 1, Cell 39, 499-509, 1984) was obtained by annealing the following two oligonucleotides:
  • NES from PK I was obtained from annealing of the following oligonucleotides:
  • Transgenic Arabidopsis grown in the dark or at 44 mo lm- 2 s- 1 continuous white light can be used to grow seedlings of 20 ⁇ gml- 1 in order to visualize the nucleus and cell wall.
  • Dyed (PI) Mo 1 ec 11 1 ar Probe
  • the subcellular localization of GFP and PI fluorescence is determined by the confocal laser by FITC channel (green, GFP) and TRITC channel (red, PI).
  • FITC channel green, GFP
  • TRITC channel red, PI
  • Monoclonal antibody mBAl is specific for the N-terminal region of phyB (Shinomura, T. eta 1., Proc. Natl. Acct. Sci. USA 93, 8129- 8 1 33, 1 9 96).
  • Anti-GFP monoclonal antibody was purchased from Sigma.
  • NG and CG A transformant of Arabidopsis phyB mutant expressing either the N- or C-terminal region of phyB (hereinafter referred to as NG and CG, respectively) fused with green fluorescent protein (GFP) was prepared (Fig. 1).
  • GFP green fluorescent protein
  • CG is localized in the nucleus, (Nagy, F. eta 1., Semin. Cell Dev. Biol. 11, 505-510, 2000; Sak amo to, K. eta 1., Plant J. 10, 859-868, 1996).
  • NG was evenly distributed in the nucleus and cytoplasm (Fig. La).
  • NG-NLS and NG-GUS-NLS accumulated in the nucleus but did not form spots under light (Fig. 2a).
  • NG-NES and NG-GUS were localized only in the cytoplasm, indicating that the N-terminal region lacked nuclear translocation activity.
  • NG-GUS-NLS tetramer band was not detected.
  • the ratio for NG-NLS was 1.57, which was half the ratio for PBG or NG-GUS-NLS. Therefore, we conclude that NG-GUS-NLS of ⁇ - ⁇ may exist as a tetramer, but that NG-GUS-NLS exists as a dimer, whereas NG-NLS exists as a monomer. I concluded.
  • the N-terminal region is capable of signal transduction, even when monomeric, but requires dimerization for full activity.
  • NG—GUS—NL S was found to be capable of inducing other phyB reactions such as chlorophyll accumulation, cotyledon expansion, and inhibition of petiole elongation (Smith, H. eta 1., Nature 407, 585—591, 2
  • PBG (G767 / R) was localized mainly in the cytoplasm, even under light (Fig. 4a). This suggests that PBG (G767 / R) is less active because it cannot accumulate in the nucleus.
  • PBG with NLS (G767ZR) and PBG (G767 / R) Transgenic plants expressing one NLS were produced. This fusion protein accumulated in the nucleus as expected, but did not form spots (Fig. 4a). Hypocotyl assays clearly showed that PBG (G767 / R) —NLS was as active as PBG ( Figure 4b, c). This observation was also confirmed for other phyB responses.
  • the modified phytochrome of the present invention can significantly increase the yield of crops per unit area without using expensive chemical fertilizers and excessive amounts of pesticides by effectively inhibiting plant shade reactions.
  • plants into which the modified phytochrome gene of the present invention has been introduced exhibit characteristics such as high photosensitivity, increased pigment content, prolonged flowering period, enlarged ovaries, enlarged stems or strains, and the like.
  • phytochrome since phytochrome is present in all plants and its function is preserved across plant species, it is possible to apply the modified phytochrome of the present invention to almost all crops, By introducing the phytochrome gene into the chromosome of a plant, the introduced gene can be permanently and stably inherited.

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Abstract

本発明は､人工改変フィトクロム遺伝子、該遺伝子を組み込んだプラスミドベクター、ならびに該遺伝子を導入した植物体およびその作出方法に関する｡さらに詳しくは、該遺伝子の導入により、高光感受性、含有色素量の増加、開花期間の延長、子房の肥大、茎又は株の肥大等の特徴を有する植物を提供することに関する。

Description

改変フィトクロム 技術分野
本発明は、 人工改変フイトクロム遺伝子、 該遺伝子を組み込んだプラスミドべ クタ一、 ならびに該遺伝子を導入した植物体およびその作出方法に関する。 さら に詳しくは、 該遺伝子の導入により、 高光感受性、 含有色素量の増加、 開花期間 の延長、 子房の肥大、 茎又は株の肥明大等の特徴を有する植物を提供することに関 する。 細 1
書 背景技術
植物にとって、 光は光合成のためのエネルギー源、 および周囲の環境に適応す るための情報源として重要である。そのため植物は、他の植物の陰に入ったとき、 光合成産物を専ら茎の伸長にあて、 その陰から抜け出ようとする。 これを避陰反 応という。 避陰反応は、 植物種の存続にとっては不可欠であるが、 農業的には不 利益な要素の 1つである。 例えば、 農地面積の限られた場所では、 単一の植物種 を密植するのが原則であり、 そのため集団全体が避陰反応を引き起こす。 すなわ ち、 茎が伸長し、 イネや小麦等の穀物では、 風雨や水害に極端に弱くなつてしま うといつた問題がある。
避陰反応は、 日陰においてフィトクロムと呼ばれる植物固有の光受容体の活性 が低下することによって引き起こされる。 すなわち、 フイトクロムは避陰反応 ( 茎の伸長） を阻害する方向に働く。 フイトクロムは単量体分子量約 12万の色素 夕ンパク質であり、 種子の光発芽から花成の際の日長感受にいたるまで植物の 様々な光応答における光受容体として働くことが知られている（Sm i t h H. Phy t och rome s and l i gh t s i gna l e r c e p t i o n by p l an t s - a n eme r g i ng s y n t h e s i s. Na t ur e 407, 585- 591, 2000)。 また、 フイト クロムは赤色光を吸収すると細胞質から核内に移行し、 転写因子と相互作用する ことにより、 核内で様々な遺伝子の発現を制御することも知られている （Yam aguch i R. E t a 1 ： J. Ce l l B i o l (1999) 145 : 437-445 ； Qua i l PH ： Na t Rev Mo 1 Ce l l B i o l (2002) 3 ： 85— 93)。
フイトクロム分子の特徴は、 N末端領域 （以下、 シグナル伝達ドメインと呼ぶ ことがある） および C末端領域の 2つのドメインからなり、 それぞれが互いに独 立に立体構造を保持し、 固有の機能を持つという点にある。 N末端領域は発色団 と結合して光受容に働く一方、 C末端領域にはシグナル伝達に関与すると思われ るモチーフが複数存在する。 このため、 C末端領域がシグナルを下流の因子に伝 達すると信じられてきた （和田正三ら監修：植物の光センシング；植物細胞工学 シリーズ 16, 秀潤社， 2001)。 また、 フィトクロム分子は、 C末端領域を 介して常に二量体化しているが、 この生理学的意義についてはこれまで知られて いなかった。
これまで、 植物の光受容体であるフィトクロムを農作物において過剰に発現さ せ、 単位面積あたりの収量を高める試みがなされてきた。 しかし、 改変を施して いないフィトクロムを過剰に発現させても、 飽和反応量は増加するものの光感受 性は変化しなかった （Ro b s on， P. R. H. e t a 1. (199 6) Na t ure Bi o t e ch. 14， 995— 998·)。
本発明は、 フイトクロムのシグナル伝達ドメイン改変遺伝子、 該遺伝子を組み 込んだプラスミドベクター、および該改変遺伝子を導入することで、高光感受性、 色素沈着量の増加、 開花期間の延長、 子房の肥大、 茎又は株の肥大等の特徴を有 する植物体を提供することを主な目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 フィトクロム分子の N末端領域が核内シグナル伝達能を有する こと、 N末端領域が効率良くシグナル伝達をするために二量体ィ匕が好ましいこと、 ならびに、 N末端領域に二量体化に関与するドメインおよび核移行シグナルを融 合させたフイトクロム分子は、 全長フイトクロム分子に比べ、 100倍以上高い 光感受性を有することを見出し、 本発明を完成するに至つた。 本発明は、 遺伝子操作により光感受性が高められた人工改変フイトクロム、 該 遺伝子を組み込んだプラスミドベクタ一、 および該遺伝子を導入した植物体に関 する。 さらに、 本発明の人工改変フイトクロム遺伝子を有する植物体は、 含有色 素量の増加、 開花期間の延長、 子房の肥大、 茎又は株の肥大等の特徴を有する。 図面の簡単な説明
図 1 ； phyBの N末端及び C末端領域の細胞内局在及び生理活性
a：喑所 (Da r k) 及び連続白色光 (cW) のもとでの細胞内局在。 同一の視 野における GFP及びプロピジゥムィオダイド （P I) 像を示す。 矢印は核を表 す。 スケールバー、 10 m。
b ： phyB誘導体の図。 点線は、 N末端 (N t e r) 及び C末端 (C t e r) 領域間の境界を表す。 4つの連なった長方形は、 発色団を表す。
c :連続赤色光 （4. 9 n o 1 m— 2 s -1) のもとでの胚軸長 （h y p o c o t y 1 1 e n g t h)。 WTは、 野生型を示す。 cの下のパネルは、 mB A 1 (左) 及び抗 GFP抗体 (右) によるィムノブロッテイングを示す。 パネル下部 に総タンパク量を で示す。 2つの非特異的なバンド （星印） が観察された。 矢印は、 特異的なバンドを示す。
図 2 ；核内における p h y Bの N末端領域のシグナル伝達活性。
a、 b： phyB誘導体の細胞内局在 （a)、 及び phyB誘導体の図 （b)。 詳 細は、 図 1 a及び 1 bに同じ。
c ：連続赤色光 (4. 9 n o 1 m_2 s— のもとでの胚軸長。 cの下のパ ネルは、 mB A 1によるィムノブロッテイングを示す。
d：野生型における内在性 phyBに対する比で表された、 導入蛋白レベルの関 数で表される、 連続赤色光 （4. 9 o 1 m-2 s"1) のもとでの胚軸長。 各点の番号は、 形質転換植物の系統名を示す。
e：連続赤色光のもとでの胚軸長に対するフルエンスレート（F 1 u e n c e r a t e) —反応曲線。 eの右パネルは、 mB A 1によるィムノブロッテイングを 示す。
図 3 ； NG— GUS— NLSは、 様々な p h y B応答を引き起こすことが可能 である。
a、 b：連続白色光 (50 ^mo lm_2 s— のもとで 1週間育生した芽生え のクロロフィルレベル （a) 及び子葉面積 （b)。 f . w. ：生鮮重量。
c ：連続白色光 (44 mo 1 m_2 s—1) のもとで 3週間育生した芽生えの d：連続白色光 (80/xmo 1 m_2 s—1) のもとで 4週間育生した成熟植 物。 スケ一ルバ一、 2 cm。
図 4； G 767 /R突然変異は、 p h y Bの核への蓄積を阻害する。
a： phyB誘導体の細胞内局在。 詳細は、 図 1 aのとおり。
b： phyB誘導体の mBAlによるィムノブロッテイング。 各レーンは、 25 gの総タンパク質を含む。
c：連続赤色光のもとでの胚軸長に対するフルエンスレート（F 1 u e n c e r a t e) —反応曲線。
図 5；細胞内における p h y B及び N G— G U S— N L Sの働きに関するモデル。 phyB及び NG— GUS— NLSは、 それぞれ p h y Bの C末端領域 (C) 及 び NLSの働きによって核内に入る。 喑所では、 N末端領域 （N) は、 phyB の核内への進入を阻害する。 喑所での NG— GUS—NLSの核への蓄積は、 反 応を引き起こすのに充分ではない。 明所において、 二量体化された phyB及び NG— GUS—NLSの Nは、 効率的にシグナルを伝達する。 phyBにおいて Nのシグナル伝達活性は、 Cによって阻害される。
図 6 ；本実施例で使用したプラスミドを示す。 本発明は、 以下の改変フイトクロム遺伝子、 および該遺伝子にコードされる改 変フィトクロムタンパク質、 ならびに該遺伝子を導入した植物体を提供する。
1. フィトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインをコ一ドする DNAと核移行シ グナルをコードする DN Aを含む改変フィトクロム遺伝子。
2. フイトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインの C末端側に、 直接或いはスぺ —サ一ペプチドを介して核移行シグナルを融合させた項 1に記載の改変フィトク ロム遺伝子。 3. さらに、 二量体化に働くドメイン （二量体ィ匕ドメイン） をコードする D NA を含む項 1に記載の改変フィトクロム遺伝子。
4. 該フィトクロム遺伝子がフィトクロム B遺伝子である項 1に記載の改変フィ トクロム遺伝子。
5. 該フィトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインがフィトクロム B遺伝子の N 末端から 1〜4 5 0ポリペプチドで構成される、 項 1に記載の改変フィトクロム 退 feナ。
5. 該ニ量体化に働くドメインが、 β一ダルク口ニダーゼである項 3に記載の 改変フィトクロム遺伝子。
6. 該核移行シグナルが、 S V 4 0ウィルス由来である項 1に記載の改変フィ トクロム遺伝子。
7. 項 1に記載の改変フイトクロム遺伝子を、 発現可能に組み込んだプラスミ ドベクター。
8. 項 1から 6のいずれかに記載される遺伝子又は項 7に記載のプラスミドべ クタ一を導入した植物体およびその子孫。
9. 開花期間が延長された項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 0. 含有色素量が増加した項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 1 . 子房の数が増加した項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 2 . 茎、 塊茎、 葉、 根、 塊根、 蕾、 花、 花弁、 子房、 果実、 さや、 さく果、 種子、 線維または胚珠の形態である項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 3 . 項 8に記載の植物体およびその子孫を栽培し、 該植物体の器官内に産生さ れた物質を回収することを特徴とする有用物質の産生方法。
1 4. 以下の工程：
( 1 ) 植物中で機能し得るプロモー夕一の制御下にある項 1に記載のフィトク口 ム遺伝子を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、 植物の細胞を形質転換し、
( 2 ) 該形質転換細胞から、 該フイトクロム遺伝子を有していない植物に比べて 高光感受性、 含有色素量の増加、 開花期間の延長、 子房数の増加、 子房の肥大、 茎の S巴大、 茎又は枝数の増加、 株の肥大等から選択される少なくとも 1つの特徴 を有する植物体を再生し、 ( 3 ) 該植物体から受粉により種子を採取し、 および
( 4) 該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該 フイトクロム遺伝子を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること を含む、 該フイトクロム遺伝子についてホモ接合体である、 該フイトクロム遺伝 子を有していない植物に比べて高光感受性、含有色素量の増加、開花期間の延長、 子房数の増加、 子房の肥大、 茎の肥大、 茎又は枝数の増加、 株の肥大等から選択 される少なくとも 1つの特徴が固定された植物の作出方法。
本発明の改変フィトクロム遺伝子は、 シグナル伝達ドメインと核移行シグナル を含み、 さらに、 二量体化に働くドメイン （二量体化ドメイン） を含むのが好ま しい。 これらの連結順序は、 特に限定されないが、 シグナル伝達ドメインが 5 ' 側（発現夕ンパク質の N末端側）に存在するのが好ましく、次に核移行シグナル、 必要に応じてさらに二量体化ドメインが連結されるのがよい。 これらは相互に直 接連結されてもよく、 適当なスぺーサ一となるペプチドを介して連結されてもよ い。
本発明の限定的解釈を望むものではないが、 本発明の作用機序について、 本発 明者は以下のように考える。
フィトクロム分子は、 赤色光を受容すると構造変化を起こして細胞質から核内 に移行し、 シグナル伝達を行う。 このシグナル伝達は、 フィ卜クロム分子の N末 端領域が促進的にはたらき、 C末端領域が N末端領域からのシグナル伝達を阻害 することで制御されていると考えられる。 本発明者らは、 光受容に働く発色団の 結合サイトを有する、 フイトクロム分子の N末端領域のみを単離し、 そこに核移 行シグナルを融合させて核内に蓄積させることにより、 弱いながらもシグナル伝 達活性を有するコンストラクトを作製した。 さらに、 このコンストラクトに二量 体ィ匕ドメインを融合させることで、 シグナル伝達活性が明らかに上昇することが 示された。 このコンストラクトのシグナル伝達活性を詳細に調べた結果、 正常な フィトクロムに比べて光感受性が 1 0 0倍近くも高まっていることがわかり、 結 果として曰陰であっても活性が低下せず、避陰反応が抑制されることがわかった。
( 1 ) 人工改変フィトクロム遺伝子
本発明においてシグナル伝達ドメインの由来となるフィトクロム遺伝子は、 フ ィトクロムファミリーに属する 5種類のフィトクロム遺伝子 （フィトクロム A— E) のいずれであってもよいが、 光に対して安定なフイトクロム Bであることが 好ましい。 また、 本発明の実施例においてはシロイヌナズナから単離されたフィ トクロム B遺伝子を用いているが、 光受容体としての機能、 および光安定性を有 していれば、 その由来は特に限定されない。
導入されるフィトクロム遺伝子改変体は、 導入前の植物に由来するフィトク口 ム遺伝子改変体、 或いは該植物の類縁植物の改変体であってもよく、 遺伝子が導 入される植物において機能する限り分類学上の系統が異なる植物に由来するフィ トク口ム遺伝子改変体であってもよい。
本発明の改変フィトクロム遺伝子の作製は、 当業者によって通常用いられるプ ラスミドコンストラクションを作製する方法によって行うことができる。
シロイヌナズナのフィトクロム Bのシグナル伝達ドメインは、 6 5 1ポリぺプ チドのサイズを有し、 配列番号 1に示される遺伝子によりコードされる。 本発明 'の改変フィトクロム遺伝子の構成単位として使用されるシグナル伝達ドメインは、 フィトクロム Bの N末端より 1—4 5 0ポリペプチドのものを使用することがで きるが、 N末端から 4 5 1 - 6 5 1の任意のポリペプチドをさらに連結したもの であってもよい。 また、 配列番号 1の 1—4 5 0或いは 1—6 5 1のポリべプチ ドはシロイヌナズナに由来するものでもよく、 他の植物由来の対応する遺伝子を 用いることも可能である。 シロイヌナズナ以外の植物由来のフィトクロム B遺伝 子としては、 例えば、 タバコ （N i c o t i a n a t o b a c urn) のフィト クロム B ( 1— 6 2 2ポリペプチド）、 イネ （O r y z a s a t i v a) のフィ トクロム B ( 1 6 6 0ポリペプチド） 等があげられる。
さらに、 本発明のシグナル伝達ドメインによりコードされるポリペプチドは、 シグナル伝達活性を有する限りフィトクロム遺伝子の該ドメインにおいて、 1ま たは複数、 例えば 1または数個のアミノ酸が置換、 付加、 欠失または挿入された ものであってもよい。 さらに、 シグナル伝達ドメインをコードする D NAとスト リンジェントな条件下にハイブリダィズし、 かつ、 シグナル伝達活性を有する夕 ンパク質であってもよい。
本明細書において 「ストリンジェントな条件」 とは， 特異的なハイブリダィゼ —ションのみが起き， 非特異 β勺なハイプリダイゼ一ションが起きないような条件 をいう。 このような条件は， 通常， 「1 XSSC, 0. 1 %SDS, 37°C」 程 度であり， 好ましくは「0. 5 XSSC, 0. 1 %SDS, 42° (：」程度であり， 更に好ましくは 「0. 2XSSC, 0. 1 %SDS, 65°C」 程度である。 しかし、 十分な光受容にはシグナル伝達ドメインの全体構造が望ましいと考え られることから、 1 _651ポリペプチドであるものが最も好ましく、 シグナル 伝達ドメインからのシグナル伝達を阻害しない限り、 N末端から 651以上のポ リペプチド、 すなわち、 C末端領域に含まれるポリペプチド、 或いは他の任意の ペプチド配列を含んでいてもよい。
本発明で使用される核移行シグナル （Nuc l e a r Loc a l i z a t i on S i gna l ： NL S) とは、 本発明の改変フイトクロム遺伝子にコ一 ドされるタンパク質を、 該遺伝子を導入した細胞の核内に輸送することができる ものを指す。 核移行シグナルとしては、 S V40ウィルスラージ T抗原由来の N LS、 アデノ随伴ウィルス VP 2 N末端由来の NLS、 ヌクレオプラズミン由来 の NLS、 MAT 0；2由来の 3、 c一 my c由来の NL S等があげられ、 植物中で機能し得るものであれば特に限定されないが、 S V 40由来の核移行シ グナルであることが好ましい。 また、 フイトクロム遺伝子の C末端領域にコード される、 核移行シグナルを用レ てもよい。 さらに、 本発明の核移行シグナルによ りコードされるポリペプチド〖ま、 核移行活性を有する限り 1または複数、 例えば 1または数個のアミノ酸が置換、 付加、 欠失または挿入されたものであってもよ い。 さらに、 核移行シグナルをコードする DNAとストリンジェントな条件下に ハイブリダィズし、 かつ、 核移行活性を有するタンパク質であってもよい。 本発明の改変フィトクロム分子は、 単量体であってもシグナル伝達能を有する が、 二量体化することによってシグナル伝達ドメインのシグナル伝達能が高まる ため、 二量体化していることが好ましい。
本発明で使用される二量体ィ匕ドメインは、 少なくとも二量体化すればよく、 場 合によっては三量体化、 四量体化などの多量体ィ匕するものであってもよい。 該ニ 量体化ドメインは、 フイトクロム分子に融合し得るものであればよい。 該ニ量体 化ドメインとしては、 例えば、 大腸菌 β -ダルク口ニダ一ゼ (]3-g 1 u c u r on i d a s e : GUS)、ダル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ（GS T)、 抗体分子である I gG分子の Fc部分、 s yn t r oph i n、 nNOSの PD Zドメイン、 MyoD、 I d等があげられ、 当業者によって通常使用されている ものであれば特に限定されないが、 大腸菌 β―ダルク口ニダ一ゼであることが好 ましい。 大腸菌 iS—ダルクロニダーゼは、 植物体内での選択マ一カーとして利用 されている酵素であり、 四量体化および二量体ィ匕に働くことが知られている。 さ らに、 本発明の二量体化ドメインによりコードされるポリペプチドは、 二量体化 /多量体化活性を有する限り 1または複数、 例えば 1または数個のアミノ酸が置 換、 付加、 欠失または揷入されたものであってもよい。 さらに、 二量体化ドメイ ンをコ一ドする DNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、 かつ、 二量体化活性を有するタンパク質であってもよい。 例えば、 二量体化ドメインと して大腸菌 i3—ダルク口ニダーゼを採用した場合、 二量体化する限りにおいて /3 一ダルクロニダーゼ活性の有無は問わない。
或いは、 二量体化の代わりに、 同一であっても異なっていてもよい 2以上のシ グナル伝達ドメインを必要に応じてスぺ一サ一となるポリぺプチド （核移行シグ ナルを含む） を介してタンデムに連結したタンパク質をコードする遺伝子を植物 に導入して発現させてもよい。
本発明で使用されるプロモータ一としては、 植物中で機能し得るものであれば 特に限定されないが、例えば力リフラヮーモザィクウイルス 35S(CaMV 3
5S)、 ノパリン合成酵素 （NOS)、 またはォクトピン合成酵素 （OCS) のプ 口モータ一等の非植物に由来するプロモーター、 フエ二ルァラニンアンモニアリ ァ一ゼ （PAL) 遺伝子プロモータ一、 カルコンシンターゼ （CHS) 遺伝子プ 口モーターもしくは、 カルコン合成酵素等、 二次代謝系の酵素のプロモ一夕一、 またはグリシニン等の貯蔵夕ンパク質のプロモー夕一等の植物に由来するプロモ 一夕一があげられ、 C aMV 35 Sプロモーターであることが好ましい。 本発明で使用されるターミネータ一としては、 植物中で機能し得るものであれ ば特に限定されないが、 例えばァグロパクテリゥム属細菌 T i—プラスミド由来 のノパリン合成酵素遺伝子のターミネ一ター（NO S)、ニンニクウィルス GV1, GV 2等のウィルス由来の夕一ミネ一夕一等があげられ、 NO S夕一ミネ一夕一 であることが好ましい。
さらに、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を組み込んだベクターは、 ェンハン サー配列等のシス調節エレメントを含んでも良い。
本発明の改変フィトクロム遺伝子を組み込んだベクターが導入された、 宿主細 胞を選択するためのマーカ一遺伝子として、 例えば、 カナマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ネオマイシン而性遺伝子、 ジェンタマイシン耐性 遺伝子、 植物に除草剤耐性を付与し得る遺伝子等を含んでいてもよい。 選択圧を かけない条件下では、 組み込まれた遺伝子が脱落することもあるため、 除草剤耐 性遺伝子をべクタ一上で共存させておけば、 栽培中、 該遺伝子に対応する除草剤 を使用することにより、 常に選択圧がかかった条件を実現することができるとい う利点がある。
さらに、 該改変フイトクロム遺伝子を組み込んだベクタ一に、 必要に応じて G F P、 L a c— Z等のレポ一夕一遺伝子を付力 Πさせても良い。
本発明の改変フィトクロム遺伝子を組み込 ¾ベクターとしては、 植物細胞で発 現可能なプラスミド、 ファージ、 ファージミ ド等があげられ、 p U C系プラスミ ド、 p S C 1 0 1系プラスミド、 T i—プラスミド、 ブル一スクリプト系プラス ミド、 M l 3系ファージ、 λ系ファージ、 コスミド類等が例示される。 本発明で は、 大腸菌由来の P GV 9 1 0および p B R 3 2 2をもとに作製された p P Z P 2 1 1プラスミドベクターを使用した。 これらのベクターに本発明の改変フィト クロム遺伝子を通常の遺伝子工学的技術を用いて組み込むことにより、 本発明の 改変フィトクロム遺伝子を有するべク夕一を精築することが可能である。
本発明の目的を達成するための好ましい態様としては、 二量体化に働くタンパ ク質をコ一ドする遺伝子および核移行シグナフレ遺伝子がィンフレームの状態、 す なわちそれらの遺伝子産物であるタンパク質力 S所期の作用を奏するように組み込 まれた遺伝子が挙げられる。 これらの遺伝子は、 それらの遺伝子産物が所期の作 用を奏する限り、 それぞれが組み込まれている位置は限定されない。
また、フィトクロム分子の C末端領域は、シグナル伝達ドメインをニ量体化し、 それをシグナル伝達の場である核内に運ぶ働きをするが、 核内においてはシグナ ル伝達ドメインの活性を抑制することから、 この抑制シグナルの機能を欠損させ た c末端領域をシグナル伝達ドメインに融合させることで光感受性の高いフィト クロムを得ることも可能である。
さらに、 本発明の他の好ましい実施態様として、 上記のいずれかのプロモータ
—の下流に、 2つのフィトクロム Bの N末端遺伝子および核移行シグナルを付カロ した改変フィトクロム遺伝子 （プロモー夕一 +フィトクロム Bのシグナル伝達ド メィン遺伝子 +フイトクロム Bのシグナル伝達ドメイン遺伝子 +核移行シダナ ル） を用い、 二量体化したフイトクロム分子を得ることもできる。
蛋白質として単離したフィトクロムを、 マイクロインジェクション法を用いて 植物細胞内に注入すると、 その細胞のみに於いて色素の沈着や葉緑体の発達の促 進などが見られることが知られている（Bowl e r, C. e t a 1. (1 994) P l an t Ce l l 6, 152 9— 1541)。
本発明者は、 避陰反応に関与するフィトクロム遺伝子改変体を植物体内で発現 させることにより、 色素の発現量が著明に増大することを見出した。
(2) 人工改変フイトクロムタンパク質
本発明の改変フィトクロムタンパク質は、以下の方法により得ることができる。 本発明の改変フィトクロム遺伝子を、 （1)に記載のベクタ一を用いて、当業者 によって通常使用される形質転換の方法で、 宿主細胞を形質転換させた後、 得ら れた形質転換体を培養して、 培養細胞内あるいは培養液から本発明の改変フィト クロムタンパク質を分離および精製することができる。 また、 これらに用いられ る手段や方法は公知のものを組み合わせることができる。 宿主細胞としては、 細 菌、 好ましくは大腸菌 (E. c o 1 i) 等を例示することができ、 真核生物細胞 としては、例えば 母（S a c c h a r omy c e s c e r ev i s i a e等）、 またはイネ、 トウモロコシ、 コムギ等の単子葉植物由来の細胞、 ダイズ、 エンド ゥ、 インゲン等のマメ科植物、 タバコ、 トマト、 ジャガイモ等のナス科植物、 キ ャべッ、 ナタネ、 力ラシナ等のァブラナ科植物 、 メロン、 カポチヤ、 キユウリ 等のゥリ科植物、 ニンジン、 セロリ等のセリ科植物、 もしくはレタス等のキク科 植物等の双子葉植物由来の細胞を例示できる。
得られたタンパク質の精製方法としては、 一般的にタンパク質の精製に用いら れる方法を適用することができ、 例えば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水 相互クロマトグラフィ一、 ゲル濾過クロマトグラフィー、 逆ネ目クロマトグラフィ 一、等電点クロマトグラフィー、 分取電気泳動法、 および等電点電気泳動法等、 およびこれらから選ばれる 2つ以上の方法を組み合わせて使用することができる。 上記の改変フイトクロムタンパク質は、 単離された状態で用いてもよく、 該タ ンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、 このタンパク質を細胞内で 発現させた状態で用いても良い。
( 3 ) トランスジエニック植物
本発明において、遺伝子導入を行う植物の部位としては、植物体全体、葉、茎、 根、 花器、 生長点、 種子等の植物器官、 表皮、 師部、 柔纖戠、 木部、 維管束等の 植物組織、 カルスなどの植物培養細胞等があげられる。 本発明の遺伝子は、 これ らの部位の 1つ以上において選択的に発現するプロモータ一を用いて発現させて、 植物の特定の部位で発現させることもでき、 植物体全体で発現するプロモ一ター を用いて植物体全体に発現させることができる。 例えば、 果実、 穀物、 地下茎等 の部位には発現させず、 茎や葉だけに特異的に発現させることによって、 食用部 位において遺伝子組み換え夕ンパク質が発現しないようにすることも可能である。 さらに、 時期特異的プロモータ一、 誘導性プロモータ一等を用いることで、 特定 の期間においてのみ、本発明の遺伝子を発現させることもできる。また、同様に、 部位特異的に発現している転写因子、 特定の朿躐に対して発現する転写因子に応 答する配列に、 本発明の遺伝子を結合することで、 部位特異的又は時期特異的に 発現させることも可能である。
本発明の改変フィトクロム遺伝子を導入したトランスジエニック植物は、 以下 のようにして得られる。
本発明の改変フィトクロムをコードする遺伝子を、 フィトクロム欠損株の細胞 に、 パーティクルガン法 （パーティクルガンによる組織細胞または培養細胞への 直接導入法） 等により、 植物細胞に導入することができる。 この改変フイトクロ ム遺伝子を導入された形質転換細胞から、 当業者によつて通常行われる方法で植 物体を再生することにより、改変フィトクロム遺伝子を有する植物体が得られる。 パーティクルガン法は、 栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入するこ とが可能であり、 有用である。 また、 (1)に記載のプラスミドベクタ一を、例えば、ァグロバクテリウム菌感 染法（ァグロパクテリゥム菌を植物組織に感染させる方法)、または電気白勺導入法 (エレクトロボ一レーション法ゃプロトプラストへの電気的導入法） 等の従来公 知の方法により植物細胞に導人することができる。
ァグロパクテリゥム菌感染法の場合、 形質転換に一般的に使用されているノィ ナリーベクターのボーダー配 u間に、 植物ウィルス （例えばトマトモザイクウイ ルス等） のジエミ二ウィルスのゲノム DNAを同時に挿入し、 栽培中の植物の花 芽に該菌懸濁液を接触させる； ^けで、 本発明の改変フィトクロム遺伝子が花内部 の生殖細胞に導入される。 次に、 この植物から得られた種子を抗生物質を含む選 択培地に播くことことによって、 植物全体に導入遺伝子を持つ形質転換植物を得 ることができる。 該方法において、 菌懸濁液を接触させる器官は、 花芽に限定さ れず、 任意の器官または細胞でよい。
さらに、 フィトクロム欠損株のカルスに本発明の改変フィトクロム遺伝子を導 入し、 該遺伝子を有する植物体を得ることもできる。 カルスからの植物体の再生 方法は、 特に限定されず、 従来公知の方法によって行うことができる。
例えば、 本願発明の改変フィトクロム遺伝子の導入にァグロパクテリゥムを使 用してトランスジェニック植物を作出する場合、 以下の方法を用いることができ る。ここでは、イネを例にとって具体的な条件を説明するが、イネに限定されず、 当業者であれば以下の記載を参考に、 イネの部分を他の植物に置き換えて容易に 他のトランスジェニック植物を作出することができる。
( i) 種子滅菌とカルス誘導
イネ（Oryz a s a t i va L.) の完熟種子を小型籾すり機（藤原製作 所製 No. 114) にかけ、 籾を取り除いた種子 100〜150個を 50m 1 のデイスポーザブルの遠沈管に入れる。 このとき、 褐変化したような種子は、 コ ン夕ミネ一シヨンの原因になるので用いない。次に、 70%エタノールで 1分間、 その後、 40mlの種子滅菌用溶液（次亜塩素酸ナトリゥム （有効塩素 5. 0%) を滅菌水で 2倍に希釈し、 Twe en20を 2〜3滴加えてよく混ぜた ¾の） を 遠沈管に入れ、 シェーカーで 20分間、 150 r pmで振盪する。 このとき、 あ まり激しく振盪すると種子が fjれてしまうので、 注意する。 その後、 クリーンベンチ内でビーカーに溶液を捨て、 滅菌水を適当量加え、 3 回振り洗いをする。 ピンセットで種子をカルス誘導培地 （N6C 1) に 16種子 /シャーレで置床し、 シャーレの周りをサージカルテ一プ （Mi c r opo r e Su r g i c a l Tape ； 3 M社製 Ca t. No. 1530— 0) でシ ールして、 60 mo l/m2s、 16時間明期 Z 8時間暗期 （以下この日仮条 件を明所とする） の条件で、 25°C、 3週間培養する。
この培養期間中に種子の滅菌が不完全でコンタミネーションした場合は、 コン 夕ミネ一ションのなかった種子のみを新しい培地に移植する。 コンタミネ一ショ ンした種子に隣接する種子は移植しない方が良い。
(i i) カルスの前培養とァグロパクテリゥムの培養
誘導 3週間後の種子と胚乳と苗条 (s hoo t) 部分をメスで切り取るか、 あ るいはピンセットでもぎ取り、 胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地 (N 6 C 1 ) に 16カルス/シャーレで移植し、 サージカルテープでシールして 3曰 間、 25T、 明所で培養する。 カルスは、 乳白色の直径 4〜 5 mmの硬いカルス がよい。 褐変化したり、 粘着物質の付いたカルスは使用しないようにする。
プロモーターに目的遺伝子を接続し、 カナマイシン及びハイグロマイシン耐性 遺伝子を有するプラスミドによって形質転換されたァグロバクテリウムのグリセ ローリレストック （YEP培地でァグロパクテリゥムを一昼夜培養した培養液と 1
00%グリセロールを 1： 1の割合で混ぜ、ポルテックスで良く混合して一 8 or: で保存しておいたもの） から滅菌したつま楊枝で菌体を取り、 AB培地に塗布す る。塗布した菌体を白金耳で培地全体に広げ、 3日間、 28°C、暗闇で培養する。
(i i i) ァグロパクテリゥムの感染と共存培養
AB培地で増殖したァグロパクテリゥムを滅菌した薬さじ （小さい方） で 2〜 3回搔き取り、 50mlの遠沈管に入れた 30mlのァセトシリンゴンの入つた ァグロパクテリゥム懸濁培地 （AA培地） に懸濁する。 この場合、 あまり濃度が 高いと感染効率が落ちるため、懸濁液が薄く濁る程度 (OD600= 0. 15〜0. 2) でよい。 懸濁液を滅菌シャーレに入れ、 1シャ一レ分の前培養したカルスを メッシュ付筒 （ガラス管にナイロンメッシュを張り、 jiPl糸を巻いて軽く固定し、 最後にビニールテープで固定したもの） に入れ、 1. 5〜 2分間メッシュ付筒ご と懸濁液に浸漬する。 このとき、 時々、 筒をこま べ振ってカルスを懸濁液にな じませるようにする。
浸漬後、 メッシュ付き筒を滅菌したベーパ一タ ルの上に置いて余分な水分を 除去する。その後、共存培養培地 (N 6 C O)に 1 6カルス/シャーレで置床し、 サージカルテープでシールして 2 8 °C, 暗黒下で 3日間培養する。 3日間培養す ると、 菌体がカルスをうつすらと覆うように増殖する。
共存培養培地に置床する際に、 培地に滅菌した 意紙を敷いておくと次の操作が しゃすくなる。 濾紙の有無は、 感染効率に影響し？ ¾い。
( i v) ァグロパクテリゥムの除去と選抜
5 0 O m g/ 1でカルべニシリンを入れた滅菌フ 洗浄液を滅菌シャーレ 3個に 3 5 m 1ずつ入れる。次に、 カルスをメッシュ付筒も 1シャーレ分 ( 1 6カルス) 入れ、 洗浄液の入ったシャーレに浸漬し、 メッシュ付筒を左右に細かく振って中 のカルスを洗浄する。 3個のシャーレに順に浸漬 てカルスからァグロパクテリ ゥムを除去する。 このとき、 洗浄液の濁りがひど 場合には、 新しい洗浄液に交 換する。 メッシュ付筒を滅菌したペーパータオル D上に置き、 余分な水分を除去 する。
選抜培地 (N 6 S E) に 1 6カルス/'シャーレ" T置床し、 サージカルテープで シールして 2 5 °C, 明所で 3週間培養する。 感染させたカルスは、 全て選抜培地 に移す。 この培養期間中にァグロバクテリゥムの除去が十分でなく、 増殖してく るようであれば、もう一度洗浄して新しい培地に置床し直すか捨てるようにする。
( V ) 再分化
全てのカルスを再分化培地 (M S R E) に 9カスレスノシャーレで移植する （力 ルスあたりの栄養分を考えて、 1シャーレあたりのカルス数を減らす)。サージ力 ルテ一プでシールし、 2 5 °C、 明所で再分化してくるまで培養する。 3〜5週間 で再分化してくるが、 培地は 3週間で新しいものに換える。
(v i ) 検定と耐性個体のその後の生育
再分化固体を検定培地 （M S HF) に置床し、 Λ、イダロマイシン耐性を検定す る。 耐性であれば発根し、 野生型と同様の生育を示す。 非形質転換体は、 新しい 根が伸長せず 1週間程で枯死する。 シャーレ一杯に植物体が生育したら、 蓋をあ けて水を入れ、 4〜 5日間馴化させる。
その後、 閉鎖系温室のポットに移植する。 水は、 毎日換えないと培地にカビが 生え、 植物体に悪影響を与える。
上記 （i) 〜 （v i) に使用する培地は、 以下の組成のものを使用することが できる。
ァグロパクテリゥム培養培地
• YEP培地 (pH7. 2)
10 g/l バクトペプトン
l O gZl バクトイースト抽出物
5g/l NaC 1
• AB培地 (pH7. 2)
3g/l K2HP04
1 g/ 1 NaH2P04 · 2H20
l g/1 NH4C 1
0. 3 g/ 1 MgS04 · 7H20
0. 15 gZ 1 KC 1
0. 012g/l C aC 12 · 2H20
0. 025 g/ 1 F e S04 · 7H20
5 g/ 1 グルコース
15 g/1 ァガー 植物体培養培地
，カルス誘導培地 （N 6 C 1 ) (pH5. 8)
N6無機塩
N 6ビタミン
30 g/1 スクロース
2mg/ 1 2, 4-D
2 g/1 ge 1 r i t e (登録商標） '選抜培地 （N6 SE) (pH5. 8)
N 6無機塩類
N 6ビタミン
30 g/ 1 スクロース
2mg/ 1 2, 4一 D
2 g/l ge 1 r i t e (登録商標）
50 Omg/ 1 カルべニシリン
(C a 1 b e n i c i 1 1 i n、 フアイザ一製薬 注射用ゼォペン；ァグロバ クテリウム除菌用 500mgZmlの濃度で滅菌水に溶解し、 一20^：に保 存したもの）
5 Omg/ 1 ハイグロマイシン ,
(Hy g r omy c i n B， Bo eh r i nge r Mannhe im, Ca t No. 843555)
•ァグロパクテリゥム懸濁培地 （AA) (pH5. 8)
AA無機塩
. アミノ酸
B 5ビタミン
20 g/ 1 スクロース
2mg/ 1 2, 4一 D
0. 2mg/ 1 力イネチン
1 Omg/ 1 ァセトシリンゴン '
•再分化培地 (MSRE) (pH5. 8)
MS無機塩
MSビタミン
30 g/ 1 スクロース
30 g/1 ソルビトール 2 g/1 カザミノ酸
lmg/ 1 NAA
2mg/ 1 BAP
25 Omg/ 1 カルべニシリン （選択培地 （N 6 S E) に使用のものと同 じ）
5 Omg/ 1 ハイグロマイシン （選択培地 （N6SE) に使用のものと同 じ）
4g/l e 1 r i t e (登録商標）
•共存培養培地 (N6CO) (pH5. 2)
N6無機塩
N 6ビタミン
30 gZ 1 スクロース
l O gZl グルコース
2mg/ 1 2， 4一 D
1 Omg/ 1 ァセトシリンゴン
2 g/l ge 1 r i t e (登録商標）
•検定培地 （MSHF) (pH5. 8)
MS無機塩
MSビタミン
30 gZl スクロース
5 Omg/ 1 ハイグロマイシン （選択培地 (N6SE) に使用のものと同 じ）
8g/l ァガー
さらに、 The P l an t J ou r n a l (1994) 6 (2), 2 71 - 282や、 The P l an t J ou rna l (1998) 16， 735— 743を参考することで、 容易に本発明の改変フィトクロム遺伝子を導 入したトランスジェニック植物を作成することが可能である。 得られたトランスジエニック植物より、 常法に従って DNAを抽出し、 この D NAを適当な制限酵素で切断し、 改変フィトクロム遺伝子をプローブとして用い てサザンハイプリダイゼーションを行い、 遺伝子導入の有無を確認することがで さる。
また、 1、ランスジエニック植物や、 非トランスジエニック植物より、 常法に従 つて蛋白質を抽出し、 フィトクロムを認識する抗体を用いてウエスタンブロッテ ィングを行い、 目的蛋白質の蓄積量や状態を調べることができる。
また、 卜ランスジエニック植物や、 非トランスジエニック植物より、 常法に従 つて RNAを抽出し、 改変フイトクロム遺伝子のセンス配列、 もしくはアンチセ ンス配列を有するプローブを作製し、 これらのプロ一ブを用いてノーザンハイブ リダィゼーションを行い、 目的遺伝子の発現の状態を調べることができる。
上記のトランスジエニック植物は、 フイトクロム欠損株の植物に、 遺伝子工学 的手法により本発明の改変フィトクロム遺伝子が導入され、 かつ安定に保持され たものを指す。 ここで、 「安定に保持された」 とは、少なくとも本発明の改変フィ トクロム遺伝子が導入された当代の植物体で該遺伝子が発現し、 それによる表現 型が現れるのに充分な期間、 この植物細胞内に保持されることをいう。 したがつ て、 本発明の改変フイトクロム遺伝子は、 宿主植物の染色体上に組み込まれるこ とが好ましく、 次世代に安定的に遺伝することがより好ましい。
本発明の改変フイトクロム遺伝子を、 次世代に安定的に遺伝させるため、 該遺 伝子についてホモ接合体のトランスジエニック植物を作成することが好ましい。 ホモ接合体のトランスジエニック植物は、 例えば、 以下の方法によって得られ る。 得られたトランスジエニック植物 (T1) の、 自家受粉により得られる T2 種子の形質転換出現比率は、 通常メンデルの法則に従う。 該改変フィトクロム遺 伝子が一遺伝子座にヘテロ （he t e r ozygou s) に組み込まれた場合、 T 2種子では形質転換体は 3 ： 1の割合で分離する。 T 2種子を栽培して、 自家 受粉させて得られる T 3種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、 該 T 2形質転換植物はホモ接合体 (homozygo t e) であり、 該形質転換 植物が 3 ： 1に分離すれば、 該 T 2形質転換植物は導入された改変フィトクロム 遺伝子についてヘテロ （he t e r ozygo t e) であると決定できる。 このようにして選抜された、 導入された改変フィトクロム遺伝子についてホモ 接合体である植物は、 高い光感受性等の表現型が固定された系統として、 種子産 業の分野において極めて有用である。
フイトクロムは、 全ての植物に存在し、 異なる植物種においてもほぼ同様に機 能するため、 あらゆる植物種に本発明の改変フィトクロム遺伝子を導入すること が可能である。
本発明の改変フィトクロムを導入した植物には、植物体全体（全樹）に限らず、 そのカルス、種子、 あらゆる植物組織、 葉、 茎、 塊茎、 根、 塊根、 蕾、 花、花弁、 子房、 果実、 さや、 胚珠、 繊維などが含まれる。 更にその子孫も本発明の植物に 含まれる。
本発明の改変フィトクロム遺伝子を導入した植物体は、 茎、 塊茎、 葉、 根、 塊 根、 蕾、 花、 花弁、 子房、 果実、 さや、 さく果、 種子、 繊維、 胚珠等の器官 （組 織） の数量、 形、 生育期間、 着色、 性質、 特性等において、 該改変フィトクロム 遺伝子を導入する前の植物体と比較して顕著な違いが観察される。
例えば、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を有する植物体は、 該改変フィトク ロム遺伝子を導入する前の植物体に比べて高光感受性を示し、 その結果、 避陰反 応が抑制される。 ここで、 高光感受性とは、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を 導入する前の植物に比し、 約 1 0倍以上、 好ましくは約 8 0倍以上、 より好まし くは約 1 0 0倍以上の光感受性を有することを指す。 光感受性が高まることによ つて、 避陰反応が抑制され、 茎の伸長が抑制される。
イネ、 コムギ等においては、 避陰反応によって茎が徒長した個体は台風等の環 境的な要因によって倒伏しやすいが、 本発明の改変フィトクロム遺伝子を有する 植物体は避陰反応が抑制され、 背丈が低くなるために倒伏しにくく、 台風などに 対して極めて高い耐性を示す。
また、 改変フイトクロム遺伝子を導入した植物体では、 花成時期は該改変フィ トクロム遺伝子を導入する前の植物体に比べ、 2〜 4倍程度遅れる傾向にあり、 開花期間 （花を咲かせている時間） が該改変フイトクロム遺伝子を導入する前の 植物体に比べて明らかに延長されることが観察されている。 ここで、 開花期間が 延長されるとは、 該改変フイトクロム遺伝子を導入する前の植物体に比べて、 開 花期間が 5 %以上、 好ましくは 2 0 %以上延長されることを指し、 5 0 %以上延 長される場合も含まれる。 この特徴を利用し、 バラ科植物、 ラン科植物等の任意 の観賞用植物に遺伝子導入することで、 従来よりも長期間にわたって花を観賞す ることができる。
さらに、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を導入した植物体は、 1個体当たり の花芽の密度が該改変フィトクロム遺伝子を導入する前の植物体に比べて、 5 % 以上、 好ましくは 2 0 %以上、 より好ましくは 5 0 %以上、 さらに好ましくは 1 0 0 %以上、 特に好ましくは 2 0 0 %以上増加する。 花芽の密度の増大は、 1つ の植物当たりの枝分かれの数が増大することと節間 （茎） が短くなること或いは その両方の作用による。
さらに、 本発明の改変フィトクロム遺伝子を導入したトランスジエニック植物 は、 天然色素、 サポニン、 ポリフエノール、 テルペン類、 配糖体、 抗生物質、 抗 癌剤、甘味物質、精油（ハーブ等)、香料などの有用物質の生産量を高めることが できる。 従って、 薬用植物や、 色素産生用の植物に本発明の遺伝子を導入するこ とで、薬効成分や天然色素などの有用物質を多量に生産することができる。また、 果実ないし根茎、 塊茎などの成長を促進することが可能であり、 これらに含まれ るデンプン、 油分、 タンパク質、 炭化水素、 セルロースなどの有用物質の収穫量 を高めることもできる。
これらの有用物質は、 該改変フィトクロム遺伝子を導入したトランスジェニッ ク植物を栽培し、 該トランスジエニック植物の器官に産生される物質を回収する ことによって得られる。 ここで、 トランスジエニック植物の器官とは、 目的とす る有用物質を産生または蓄積する任意の器官を指す。 また、 有用物質を回収する 方法としては、 従来公知の方法を用いればよく、 目的とする有用物質によって適 宜選択される。 なお、 色素の産生量が高まることで、 花や葉の色が濃くなつたり 色調が変化するため、 観賞用植物においてもその商品価値をさらに高めることが できる。 また、 植物の丈の伸長を抑制することで、 矮小化 （ミニチュア化） した 観賞用植物を得ることも可能である。 該植物は、 密植により丈の伸長が起こるこ とはなく、 観賞用植物の生産性を増大させることができる。
有用物質の一例として、 本発明者らは、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を導 入された植物体では、 沈着する色素の量が増加し、 該改変フイトクロム遺伝子を 導入する前の植物体よりも、葉および花の色が濃くなることを確認した。ここで、 沈着する色素の量が増加するとは、 本発明の改変フィトクロム遺伝子を導入する 前の植物体に比べ、 約 2 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 色素量が増加した ことを指す。
したがって、 本発明の植物によれば、 上記の有用物質のなかでも、 特に天然色 素を効率的に得ることができる。天然色素としては、例えば、シソ、赤キャベツ、 ァカダイコン、 ムラサキイモ、 紅花、 クチナシ等から得られるアントシァニン、 カロテノイド色素、 赤キャベツ色素、 紅花黄色素、 紫トウモロコシ色素、 コチニ ール色素、 ムラサキトウモロコシ色素、 ブドウ果皮色素、 エルダ一ベリ一色素、 ゥコン色素、 パーム油カロテン、 ァカキャベツ色素、 ァカダイコン色素、 トウガ ラシ色素、 アナト一色素等があげられる。
上記以外にも、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を有する植物体は、 1株あた りの茎 （主茎、 側茎、 花茎、 幹、 枝等を含む） の数が増加し （分岐が増える）、 各 茎の太さも太くなる；株の肥大； 1株あたりの葉および花が大きくなる； 1株あ たりの子房の数が増え、 大きくなる等の特徴を有する。
本発明の改変フィトクロム遺伝子を有する植物を密植することにより、 該改変 フイトクロム遺伝子を導入する前の植物に比べて、 単位面積あたりの収穫量 （例 えば、 果実数等） の増加が期待される。 - 本発明の改変フイトクロム遺伝子を導入した植物を、 開花期間の延長、 色素含 有量の増加を目的として栽培する場合には、 日陰よりも日向 （1 0—l O O m o l m— s s—1程度） で栽培することが好ましい。 この場合、 日照条件は、 短日条 件であっても効果は見られるが、 連続光条件、 もしくは長日条件であることが望 ましい。 植物種によって異なるが、 一般的に短日条件とは、 喑期が 1 4〜1 8時 間、好ましくは 8時間明期 / 1 6時間暗期、長日条件とは、喑期が 7〜1 0時間、 好ましくは 1 6時間明期/ 8時間暗期を指す。 連続光条件とは、 2 4時間明期/ 0時間喑期を指す。
また、 開花期間は、 鉢植えの花のみならず、 切り花の場合でも延長される。 さらに、 より光感受性を高めたトランスジエニック植物を作製し、 改変フイト クロム蛋白質の発現量を増加させれば、 強い光の下での飽和反応量を上昇させる ことによって、 日向での効果を、 より高めることが可能であり、 光合成量を増加 させることで有用物質の収穫量の増大にも寄与する。
フイトクロムは、 色素合成に関わる遺伝子の発現を誘導すること、 花芽形成の 促進因子である C Oの分解を促進すること等が知られており、 本発明のトランス ジエニック植物においてはこれらの活性が上昇することよって、 色素量の増加、 開花期間の延長等の特徴が見られるものと考えられる。
本発明の改変フィトクロム遺伝子導入によって形質転換される植物は、 特に限 定されるものではなく、 双子葉植物、 単子葉植物、 草本性植物、 木本性植物等に ついて広く適用され得る。 例えば、 サツマィモ、 トマト、 キユウリ、 カポチヤ、 メロン、 スイカ、 タバコ、 シロイヌナズナ、 ピ一マン、 ナス、 マメ、 サトイモ、 ホウレンソゥ、 ニンジン、 イチゴ、 ジャガイモ、 セィヨウアブラナ、 イネ、 トウ モロコシ、 アルフアルファ、 コムギ、 ォォムギ、 ダイズ、 ナタネ、 ソルガム、 ュ 一カリ、 ポプラ、 ケナフ、 杜仲、 サトウキビ、 ァカザ、 ユリ、 ラン、 力一ネ一シ ヨン、 バラ、 ペチュニア、 トレニァ、 キンギヨソゥ、 シクラメン、 カスミソゥ、 ゼラニゥム、 ヒマヮリ、 シバ、 ヮタ、 マツタケ、 シィタケ、 キノコ、 チョウセン ニンジン、 柑橘類、 バナナ、 キウイ、 キヤッサバ、 サゴヤシ等が挙げられ、 夕バ コ、 イネ、 トマト、 エンドゥ、 セィヨウアブラナ、 キユウリ、 ソルガム等が好ま しい。 本発明の改変フイトクロム遺伝子を樹木細胞に導入した場合、 丈が低く、 株および幹が太レゝ個体を得られる。
また、 本発明の改変フイトクロムの光感受性を利用し、 高感度の光スィッチと して使用することが可能である。 例えば、 フイトクロム Bの構造が赤色光によつ て活性型 （P f r型） に変化し、 遠赤外光によって非活性型 （P r型） に変化す る特徴を利用して、 "オン ·オフ型"の光スィツチとして遺伝子発現を制御する方 法等があげられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例に基づき、 より詳細に説明するが、 本発明がこれら実施 例に限定されないことは言うまでもない。
植物材料、 生育条件及び測定 ' ヌルアレル phyB— 5突然変異を有する Land s be r g e r e c t a (L e r ) ェコタイフ （e c o type) Ar ab i dop s i s t ha i
1 an a植物 （Re e d, J. W. e t a 1., P l an t Ce l l 5, 147-157, 1993) を使用した。芽生えを、特に記載がなければ、
22°Cにて 2% (w/V) スクロースを添加した Mu r a s h i ge-Skoo g (MS) 培地を含む 0. 6%ァガープレート上にて生育させた。
胚軸アツセィ用として、 芽生えを、 スクロースを含まない MSァガ一プレート 上にて 5日間生育させた。 相対的な胚軸の長さを、 それぞれの喑所での値に対す る比 した。
ィムノブロット麟斤用として、 連続白色光（44 mo 1 m_2 s— のも とで 1週間生育させた。 クロロフィルアツセィを、 Moch i z uk i, N. e t a l.， P r oc. Na t l Ac ad. Sc i. USA 98， 2053-2058, 2001に記載の通りに行った。
葉柄の長さを、 各植物の最も長い葉を写真に撮った後に測定した。 白色光光源 及び赤色光光源は、 Yamaguch i, R. e t a 1., J. Ce 1 1 B i o l. 145, 437-445, 1999に記載の通りである。 データを、 各測定について平均値土 s. d. (n =25 -30) で表す。 プラスミドコンストラクシヨン
SV40NLS (Ka l de r on, D.， e t a 1., Ce l l 3 9, 499-509, 1984) を以下に示す 2つのオリゴヌクレオチドのァ ニーリングによって得た：
5 ' -GCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGATAGCCCGGGCTGCA-3 ' (配列番号 2 ) 及び 5 ' -GCCCGGGCTATCCTCCAACCTTTCTCTTCTTCTTAGGCTGCA-3， (配列番号 3 ) 上記の配列 （配列番号 2及び 3) は、 NLSアミノ酸残基 （核局在シグナル） を コ一ドする： LQPKKKRKVGG(s t op) (配列番号 4)
PK I由来の NES (We n, W. e t a 1., Ce l l 82, 4 63 -473, 1995) を、 以下のォリゴヌクレオチドのァニーリングから 得た：
5' -GAACGAGCTTGCTCTTAAGTTGGCTGGACTTGATATTAACAAGACTGGAGGATAGCCCGGGCTGCA-3 ' ( 配 列 番 号 5 ) 及 び 5' -GCCCGGGCTATCCTCCAGTCTTGTTAATATCAAGTCCAGCCAACTTAAGAGCAAGCTCGTTCTGCA-3 ' (配列番号 6)
上記の配列 （配列番号 5及び 6) は、 NESアミノ酸残基 (核外移行シグナル) をコードする： LQNELALKLAGLDINKTGG(s t op) (配列番号 7)
phyBの N及び C末端ドメインをコードする断片を、 PCRによって増幅さ せ、 PBGの PHYB部分 （Yamaguch i, R. e t a 1., J. Ce l l B i o l. 145， 437—445, 1999) をそれぞれ置 換して、 NG及びCGを得た。 これらを、 NLS又はNES及びZ又はPCRで 増幅された GUS断片をコードする配列に融合させた。 G 767/R及び C 35 7/A突然変異を、 Qu i kCh ang e S i t e -D i r e c t ed Mu t agene s i s Ki t (S t r a t a g e n e ) を使用することによつ て導入した。 全てのコンストラクトを pPZP21 lZ35S— no sT (Mo ch i zuk i, N. e t a 1. , P r o c . Na t l Ac ad. S c i. USA 98， 2053-2058, 2001 ) の恒常的力リフラ ヮーモザイクウィルス 35 Sプロモーターと No s夕一ミネ一夕一の間に挿入し た。 本実施例で使用したプラスミドを、 図 6に示す。
植物形質転換及びトランスジエニック系統の再生
Ag r ob ac t e r i um— me d i a t e d f l o r a l d i p m e t hod (C I o u g h, S. e t a 1., P l an t J. 16， 735-743, 1998) を用いて、 p h y B突然変異体を上記のプラスミ ドにより形質転換を行い、 カナマイシン 25 mg ml— 1及びクラフォラン （H o e ch s t) 166 mg ml—1を含む MS培地上にて形質転換体の選択を 行った。 各コンストラクトについて、 T 2世代においてカナマイシン耐性につい て約 3 ： 1に分離される、 少なくとも 20の独立した系統を確立した。 生理学的 な試験については、 過剰発現のレベルに基づいて数系統が選択された。 全ての実 施例について、 ホモ接合体 T 2植物の T 3自家受粉系統を使用した。 カナマイシ ン耐性は、 GFP蛍光と強く共分離した。
形質転換芽生えにおける細胞内局在の解析 暗所又は 44 mo l m— 2 s— 1 の連続白色光のもと で生育したトラ ンスジェニックシロイヌナズナの芽生えを、 核及び細胞壁を可視ィ匕するために 2 0 β g m l—1 のプロピジゥムィオダイド （P I) (Mo 1 e c 11 1 a r P r o b e社製） GF P及び P I蛍光の細胞内局在は、 F I TCチャンネル (緑色， GFP) 及び TR I TCチャンネル （赤色， P I) によって共焦点レーザー顕微 鏡 （Z e i s s LSM5 1 0) を使用することで可視ィ匕した。 黄化芽生えにつ いて〖ま、 顕微鏡観察前までのあらゆる操作を薄暗い緑色の安全光のもとで行い、 観察を開始してから一分以内に写真を撮影した。 各コンストラクトについて、 少 なくとも 20の独立したトランスジエニック系統を解析した。 芽生えのあらゆる 器官■組織において観察を行い、 それぞれの系統において同様の結果を得た。 そ こで根細胞から得られた結果を、 代表例として示す。
本実施例において解析した全てのコンストラク 1、について、 パーティクルガン 法 （p a r t i c 1 e b omb a r dme n t) によってタマネギ細胞におけ る一過的な発現をさせたところ、 同様の細胞内局在を現すことがわかった。 免疫化学的試験
大咅 15分の手順を、 Yama gu c h i, R. e t a 1., J. C e l 1 B i o l . 145, 437-445, 1 999に記載の通りに行った。 熱い SDS緩衝溶液を用いた直接タンパク質抽出 （D i r e c t p r o t e i n e x t r a c t i on) を行ったところ、 本実施例において解析された全 ての植物において同様の結果が得られた。
タンパク質レベルをィムノブロッテイングのバンドの濃さから測定した。 モノ クロ一ナル抗体 mBAlは、 phyBの N末端領域に特異的である （Sh i no mu r a, T. e t a 1. , P r o c. Na t l Ac ad. S c i . USA 93, 8 1 29-8 1 33, 1 9 96)。抗 GF Pモノクローナル抗 体は、 S i gm aから購入した。
緑色蛍光タンパク質 （GFP) を融合させた phyBの N又は C末端領域 （以 下、 それぞれ N G及び C Gと呼ぶ) のいずれかを発現するシロイヌナズナ p h y B突然変異体の形質転換体を作製した（図 1 b)。 このトランスジエニック植物の 共焦点顕微鏡観察によると、 以前に報告されたように、 CGは核に局在し、 斑点 を形成した （Nag y， F. e t a 1., S emi n. Ce l l D e v. B i o l. 11， 505- 510, 2000 ； S a k amo t o, K. e t a 1., P l an t J. 10， 859-868, 19 96)。 一方で、 NGは核及び細胞質に均等に分布した （図 l a)。
これらのパターンは、 光照射によって影響を受けなかった。 phyBが連続赤 色光のもとで、 胚軸の伸長を阻害することから （Re e d, J. W. e t a 1., P l an t Ce l l 5, 147- 157, 1993)、 連続赤色 光のもとでのこれらの系統の胚軸長の減少を測定した。
予想外に、 連続赤色光に対して、 CGを発現する植物は反応しなかったのに対 し、 NGを発現する植物は有意な反応を示した（図 1 c)。 これは NGがシグナル 伝達活性を有するが、 CGは有していないことを示唆するものである。 GFPを 有さない N末端領域 （N) が NGと同様に活性を持つことから、 これは、 GFP の影響によるものではないことがわかる （図 2b、 c)。 この観察は、 野生型のバ ックグラウンドにおいて報告された、 Nの優性阻害 （domi nan t— ne g a t i v e)活性と矛盾しない （Wa gn e r， D. e t a 1., P I a n t Ce l l 8， 859— 871， 1996)。活性の低い Nは、下流の コンポ一ネン卜をめぐつて内在性の phyBと競合することによってシグナル伝 達を阻害しうる。
細胞内における NGシグナル伝達の場を決定するため、 核移行シグナル (NL S) 又は核外移行シグナル (NES) と組み合わせて NGを発現するトランスジ エニック植物を作製した（図 2 b)。比較的小さいタンパク質はしばしば核内に受 動的に入る。 そこでそのような核内への受動的な移行を阻害するために、 β—グ ルクロニダーゼ (GUS) に融合させた NGを発現する植物も作製した。 予想通 り、 NG— NLS及び NG— GUS— NLSは、 核内に蓄積したが、 光のもとで も斑点を形成しなかった（図 2 a )。対照的に、 NG-NES及び N G— GU Sは、 細胞質にのみ局在し、 N末端領域が核移行活性を欠いていることが示された。 胚 軸アツセィにより、 NG— NLSは NG— NESよりも、 また NG— GUS— N LSは NG— GUSよりも高い phyB活性を有することが示された （図 2 c)。 したがって、 NGは核内でシグナルを伝達するということが結論付けられた。 胚軸アツセィにおいて、 NG— GUS—NLSは NG— NLSよりもさらに高 い活性を示した。 この活性の違いは、 導入タンパク質を異なるレベルで発現する いくつかの独立したトランスジエニック系統における飽和光条件下での p h y B 活性により、 さらに確かめられた（図 2d)。全長フィトクロムは二量体を形成す る性質を持つのに対し、 C末端領域から分離された N末端領域は単量体として存 在することから （Wa gn e r， D. e t a 1., P l an t Ce l l
8， 859- 871, 1996)、 GUSの phyB活性増強効果は、 GUS の多量体形成活性によるものであるかもしれない （K a t o, A. e t a
1., P l an t Ce l l Phy s i o l. 40， 586- 591, 1
999)。
この可能性を、 非変性ゲル電気、泳動によって調べた。 単量体分子量に対する測 定されたネイティブサイズの比は、 GFPに融合された全長 phyB (PBG) 及び NG— GUS— NLSについて、 それぞれ 3. 19及び 3. 26であり、 全 長フイトクロムにおける比と一致した（Wa gn e r， D. e t a 1., P 1 an t Ce l l 8， 859— 871, 1996 ； Che r ry, J. R. e t a 1., P l an t Ce l l 5， 565 - 575, 1 993)。いくつかの GUSキメラタンパク質は、二量体のみならず四量体を形成 するが （K a t o， A., e t a 1., P l an t Ce l l Phy s i o l. 40， 586- 591, 1999)、 NG— GUS— NL Sの四量 体のバンドは検出されなかった。 一方、 NG— NLSについての比は、 1. 57 であり、 PBG又は NG— GUS—NLSについての比の半分であった。 従って 我々は、 ごくー咅 βの N G— GUS—NLSが四量体として存在する可能性はある が、 NG— GUS—NLSは二量体として、 一方 NG— NLSは単量体として存 在すると結論付けた。
要約すれば、 N末端領域は、 単量体であってもシグナル伝達が可能であるが、 完全な活性には二量体化が必要である。
様々な強度の連続赤色光のもとでの phy B活性を測定するために、 NG-G US— NLS又は PBGを発現する植物で胚軸アツセィを行った（図 2 e)。ィム ノブロッティングにおいて N G-GUS-NLS植物よりも P B G植物の方がわ ずかに高い外因性タンパク質発現を示したにもかかわらず、 NG-GUS-NL Sは PBGよりもおよそ 100倍高い感受性を示した（図 2 e)。 PBGと PBG — NLSは同様の光感受性を示すことから、 この違いは NLSによるものではな い。 これらの結果は、 全長 phyBにおいて C末端領域が N末端領域のシグナル 伝達を阻害していることを示唆する。 また、 このアツセィにより、 喑所において NG— GUS— NLSは何の活性も示さないことが明らかになった（図 2 e)。こ のことは、 N末端領竑の核内への蓄積は反応を引き起こすのには十分ではないこ とを示している。 発色団結合部位に突然変異を有する N G— G U S _ N L Sが光 に対して応答しなかつたことは、 以上の結論と矛盾しない。
NG— GUS—NL Sは、 クロロフィ レの蓄積、 子葉の拡大及び葉柄の伸長阻 害等、 他の phyB反応を引き起こすことが可能であることが確認された （Sm i t h, H. e t a 1., Na t u r e 407, 585— 591, 2
0004; Ree d, J. W. e t a l.， P l an t Ce l l 5,
147-157, 1 993) (図 3 a— c：)。 全ての場合において、 NG— GU S— NLSは PBGよりも高い活性を示した。 トランスジエニック植物及び野生 型植物の形態を、 図 3 dに示す。
フィトクロムの C末端領域内でのいくつかのミスセンス突然変異は、 分光光学 的特性や二量体化能力に影響を与えることなく、 各フィトクロムの生物学的活性 を低減させる（Wa g n e r , D. e t a 1., P r oc. Na t l A c ad. S c i. USA 92, 8596— 8600， 1995)。 これ らの変異はどのようにして p h y Bの活性に影響を及ぼすのだろうか？最も重度 の変異表現型を引き起こす G 767 /R突然変異は PBGの二量体ィ匕に影響しな かったにもかかわらず （Wa gn e r， D. e t a 1., P r oc. N a t 1 Ac ad. S c i. USA 92， 8596-8600, 19 95)、 この変異を伴ラ PBGである PBG (G 767/R) を発現する植物は、 PhyB活性を示さなかった （図 4b、 c)。 PBG (G 767/R) は、 光のも とであっても主に細胞質に局在した（図 4 a)。 このことは、 PBG (G767/ R) は核内に蓄積できないために活性が低いことを示唆する。 さらにこの可能性 を検証するため、 NL Sを付加した PBG (G767ZR)、 PBG (G767/ R) 一 NLSを発現するトランスジエニック植物を作製した。 この融合タンパク 質は、予想通り、 核内に蓄積したが、斑点は形成しなかった （図 4a)。胚軸アツ セィにより、 PBG (G767/R) — NL Sが P B Gと同じくらい活性がある ことを明確に示された （図 4b、 c)。 さらにこの観察結果は、その他の phyB 応答についても確かめられた。 この結果は、 G767ZR突然変異が、 核内への 該タンパク質の蓄積を妨げることによって p h y B活性を低減させるが、 P B G (G767/R) は、 核内に局在した場合にシグナル伝達が可能であることを示 す。
上記の知見に基づき、 p h y Bの C末端領域ではなく、 N末端領域が下流の因 子にシグナルを伝達するというモデルが考えられる (図 5)。
産業上の利用の可能性
本発明の改変フィトクロムは、 植物の避陰反応を効果的に阻害することで高価 な化学肥料、 および過剰量の農薬等を用いることなく農作物の単位面積あたりの 収穫量を格段に高めることができる。 また、 本発明の改変フイトクロム遺伝子を 導入した植物体は、 高光感受性、 含有色素量の増加、 開花期間の延長、 子房の肥 大、 茎又は株の肥大等の特徴を示す。 さらに、 フイトクロムは全ての植物に存在 し、 その機能は植物種を超えて保存されていることから、 ほぼ全ての農作物に、 本発明の改変フイトクロムを応用することが可能であり、 本発明の改変フィトク ロム遺伝子を植物の染色体内に導入することで、 該導入遺伝子は半永久的に安定 に遺伝させることが可能である。

Claims

請求の範囲
1 . フィトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインをコードする D NAと核移行シ グナルをコードする D NAを含む改変フィトクロム遺伝子。
2. フイトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインの C末端側に、 直接或いはスぺ 一サ一ぺプチドを介して核移行シグナルを融合させた請求項 1に記載の改変フィ トクロム遺伝子。
3 . さらに、 二量体化に働くドメイン （二量体ィ匕ドメイン） をコードする D N A を含む請求項 1に記載の改変フィトクロム遺伝子。
4. 該フィトクロム遺伝子がフィトクロム B遺伝子である請求項 1に記載の改変 フィトクロム遺伝子。
5. 該フィトクロム遺伝子のシグナル伝達ドメインがフィトクロム B遺伝子の N 末端から 1〜4 5 0ポリペプチドで構成される、 請求項 1に記載の改変フィトク ロム遺伝子。
5. 該ニ量体化に働くドメインが、 /3—ダルク口ニダ一ゼである請求項 3に記 載の改変フイトクロム遺伝子。
6. 該核移行シグナルが、 S V 4 0ウィルス由来である請求項 1に記載の改変 フィトクロム遺伝子。
7. 請求項 1に記載の改変フイトクロム遺伝子を、 発現可能に組み込んだブラ スミドベクター。
8. 請求項 1から 6のいずれかに記載される遺伝子又は請求項 7に記載のブラ スミドベクタ一を導入した植物体およびその子孫。
9. 開花期間が延長された請求項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 0. 含有色素量が増加した請求項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 1 . 子房の数が ί曽加した請求項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 2. 茎、 塊茎、 葉、 根、 塊根、 蕾、 花、 花弁、 子房、 果実、 さや、 さく果、 種子、 線維または胚珠の形態である請求項 8に記載の植物体およびその子孫。
1 3. 請求項 8に記載の植物体およびその子孫を栽培し、 該植物体の器官内に産 生された物質を回収することを特徴とする有用物質の産生方法。
1 4. 以下の工程： ( 1 ) 植物中で機能し得るプロモ一ターの制御下にある請求項 1に記載のフィト クロム遺伝子を含む少なくとも 1つの発現ベクターで、植物の細胞を形質転換し、
( 2 ) 該形質転換細胞から、 該フイトクロム遺伝子を有していない植物に比べて 高光感受性、 含有色素量の増加、 開花期間の延長、 子房数の増加、 子房の肥大、 茎の肥大、 茎又は枝数の増加、 株の肥大等から選択される少なくとも 1つの特徴 を有する植物体を再生し、
( 3 ) 該植物体から受粉により種子を採取し、 および
( 4) 該種子を栽培して得られる植物体から受粉により得られる種子における該 フィトクロム遺伝子を検定して該核酸配列のホモ接合体を選抜すること を含む、 該フィトクロム遺伝子についてホモ接合体である、 該フィトクロム遺伝 子を有していない植物に比べて高光感受性、含有色素量の増加、開花期間の延長、 子房数の増加、 子房の肥大、 茎の肥大、 茎又は枝数の増加、 株の肥大等から選択 される少なくとも 1つの特徴が固定された植物の作出方法。
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