WO2005087928A1 - ホウ酸耐性付与タンパク質及びその遺伝子 - Google Patents

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WO2005087928A1
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yeast
protein
acid resistance
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Toru Fujiwara
Akira Nozawa
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Japan Science And Technology Agency
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance

Definitions

  • the present invention relates to a boric acid tolerance-imparting protein and its gene in Arabidopsis, a recombinant vector containing the gene, a transformant into which the recombinant vector has been introduced, and a method for screening a boric acid-resistance-imparting gene.
  • Boron is one of the trace essential elements of higher plants (for example, see Non-Patent Document 1). Boron is also toxic, and overdose can hinder plant growth or cause acute poisoning in animals. Boron exists in uncharged molecular form in soil solutions. As a result, leaching is relatively easy, and deficiency is likely to occur in crops. Decreases in agricultural yield and quality due to boron deficiency have been reported in 130 varieties and in over 80 countries including Japan (see Non-Patent Document 2, for example). Also, it is known that the optimum concentration range of boron is narrower than other elements, and the difference between the concentration at which deficiency symptoms appear and the concentration at which excess symptoms appear is small.
  • the present inventors have isolated the excretion-type boron resistance protein BOR1 from the Arabidopsis thaliana model plant for the first time in the living world (for example, see Patent Document 1).
  • BOR1 is thought to be responsible for the active transport of boron to the conduit under low boron nutrient conditions (eg, see Non-Patent Document 8).
  • yeast YNL275w is known (for example, see Non-Patent Document 9).
  • boron (B) is a micronutrient essential for plants (for example, see Non-Patent Document 10) and animals (for example, see Non-Patent Document 11), but is toxic at high concentrations. (For example, see Non-Patent Documents 12 and 13).
  • Naturally occurring soils with high concentrations of boron are distributed throughout the world, and human activities such as fertilization of boron, burning fossils, and irrigation with water containing boron have created an environment of high concentrations of boron (e.g., Non-patent documents 12, 13).
  • Symptoms due to the toxicity of boron in plants include leaf chlorosis (see, for example, Non-Patent Document 13), fruit abnormalities, and Z or ⁇ skin necrosis (for example, see Non-Patent Document 14). .
  • Excess boron reduces crop yield and quality.
  • Boron toxicity is a major obstacle to agricultural production worldwide. Boron, at high concentrations, is toxic to animals and microorganisms. The lethal dose of boron is about 140 mgZkg for adults and about 270 mgZ for infants. kg (see Non-Patent Documents 15, 16).
  • Non-Patent Document 17 Long-term high levels of boron ingest cause anorexia, nausea, weight loss, and reduced libido in humans (eg, see Non-Patent Document 17).
  • an acceptable safe intake of boron has been shown to be 13 mgZ days for adults (eg, see Non-Patent Document 18).
  • Boron has been included in food preservatives because it has a bactericidal effect on microorganisms (for example, see Non-Patent Document 19).
  • boron has been used for many years as an insecticide, especially in cockroach insecticides (see, for example, Non-Patent Document 20).
  • soluble borate plays an important role in the toxicity of boron.
  • Intracellular boric acid is partially converted to borate due to the high internal pH.
  • the intracellular borate concentration increases, and a borate complex is formed with various cis-diols including intracellular molecules.
  • the small cis-diol containing molecules includes NAD +, ATP, S-Ado Met, RNA and some sugars (see, for example, Non-Patent Documents 24 and 25).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-262872
  • Non-Patent Document l Loomis, WD; Durst, RW (1992) Chemistry and biology of boron.Biofactors 3: 229-239
  • Non-Patent Document 2 Shorrocks, VM (1997) The occurrence and correction of boron deficiency.Plant and Soil 193: 121-148
  • Non-Patent Document 3 Matoh, T .; Ishigaki, K.I .; Ohno, K .; Azuma, J.I. (1993) Isolation and characterization of a boron— polysaccharide complex from radish roots.Plant Cell Physiol. 34: 639-642
  • Non-Patent Document 4 O'Neill, M.A .; Eberhard, S .; Albersheim, P .; Darvill, A.G. (2001) Requirement of borate cross— linking of cell wall rhamnogalacturonan II for
  • Non-Patent Document 5 Marschner, H. (1995) Mineral Nutritin of Higher Plants, 2nd ed. Academic Press, San Diego, CA
  • Non-Patent Document 6 Dordas, C; Chrispeels, M.J .; Brown, P.H. (2000) Permeability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from Squash roots.Plant Physiol. 124: 1349—1362
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  • Patent Document 8 Takano, J .; Noguchi, K .; Yasumori, M .; Kobayashi, M .; Gajdos, Z .;
  • Non-Patent Document 9 Zhao, R.M .; Reithmeier, R.A.F. (2001) Expression and
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  • Non-Patent Document 20 Cochran, D.G. (1995) Experientia51, 561-563.
  • Non-Patent Document 21 Lukaszewski, K.M., Blevins, D.G., & Randall, D.D. (1992) Plant Physiol. 99, 1670-1676.
  • Non-Patent Document 22 Reid R.J., Hayes J.E., Post A., Stangoulis J.C.R., & Graham R.D. (2004) Plant Cell Environ. 27, 1405-1414.
  • Non-Patent Document 23 Huel, G., Yazbeck, C, Burnel, D., Missy, P., & Kloppmann. W. (2004) Toxicol. Sci. 80, 304-309.
  • Non-Patent Document 24 Ralston, N.V.C., & Hunt, CD. (2000) FASEB J. 14, A538.
  • Non-Patent Document 25 Ricardo, A "Carrigan, M.A., Olcott, A.N., & Benner, S.A. (2004) science 303, 196.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above-mentioned problems, and conferred boric acid resistance to yeast by expressing some genes of higher plants, Arabidopsis thaliana, in yeast which is a eukaryotic model organism.
  • Five possible genes namely, AtPAB2, AtRBP47, AtRPS2OB, AtMYB13, and AtMYB68, were found, and the present invention was completed.
  • the key force of the boric acid toxicity mechanism lies in the specific inhibition of splicing, and it has been found that the gene related to the enhancement of splicing efficiency is a gene that imparts boric acid resistance, thereby completing the present invention. .
  • the present invention also provides (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, or 30.
  • DNA encoding a protein having a boric acid resistance-imparting activity
  • SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 2 2, 24, 26, 28 Or a DNA encoding a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 and having a boric acid resistance-imparting activity, and (3) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21, 23, 25, 27, or 29, or a sequence thereof, and a boric acid resistance-conferring gene DNA, or (4) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, In the base sequence shown in 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 or 29, one or several bases are deleted, substituted or added.
  • DNA encoding a protein having a boric acid resistance-imparting activity and (5) the DNA according to claim 3 and DNA that hybridizes under stringent conditions and encodes a protein having a boric acid resistance-imparting activity, and (6) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, A protein having an activity of imparting boric acid resistance consisting of the amino acid sequence represented by 22, 24, 26, 28, or 30; or (7) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, In the amino acid sequence shown in 20, 22, 24, 26, 28, or 30, one or several amino acids are deleted, substituted or added. (8) A recombinant which contains the DNA of any one of claims 15 to 15 and which can express the boric acid resistance-imparting protein.
  • a transformant is yeast.
  • (11) the transformant is a plant
  • (12) the gene library is used to delete the YNL275w gene.
  • YNL275w-disrupted yeast that does not express the yeast is transformed, the resulting transformed YNL275W-disrupted yeast is cultured in a boric acid-containing medium, and the activity of the transformed YNL275W-disrupted yeast for imparting boric acid resistance is measured and evaluated.
  • Boric acid tolerance (13) a method for screening for a boric acid resistance-conferring gene, which is characterized by (13) targeting specific inhibition of splicing by boric acid and measuring and evaluating the degree of enhancement of splicing efficiency;
  • the test substance is expressed in yeast cells, the expression of the test substance is cultured in the presence of boric acid, and the degree of improvement in the specific inhibition of boric acid splicing of the intron-containing gene in yeast is determined by splicing.
  • the method for screening for a borate tolerance-imparting gene according to claim 13, characterized in that it is measured and evaluated as the degree of increase in efficiency.
  • a plant having a tolerance to excess boron may be produced.
  • Boron-tolerant plants could contribute to crop production in areas that suffer from excess boron damage.
  • boron contained in industrial water can be reduced. If they are removed by absorbing them, they may be used for environmental purification.
  • the gene DNA of the present invention includes (A) an amino acid represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, or 30. DNA encoding a protein having a boric acid resistance-imparting activity that also provides sequence power; (B) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, or A DNA encoding a protein having the activity of conferring boric acid resistance to amino acids comprising the amino acid sequence shown in 30; (C) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 1 3, 15 , 17, 19, 21, 23, 25, 27, or 29, a boric acid resistance conferring gene DNA (derived from Arabidopsis thaliana) consisting of the sequence of the base rooster itself or a sequence similar thereto; (D) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, or 29, in which one or several bases have been deleted, substituted, or added DNA consisting of a base sequence and encoding a protein having an activity of imparting boric acid
  • a protein having an activity of imparting boric acid resistance or ⁇ ((B) Tori IJ No. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, or ⁇
  • a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added to the amino acid sequence and having a boric acid resistance-imparting activity refers to the "boric acid resistance-conferring gene” and ⁇ a gene capable of imparting a boric acid tolerance in vivo, "boric acid-resistance-conferring protein” and Ru bovine confer a boric acid tolerance in vivo protein.
  • protein having a boric acid resistance-imparting activity refers to a protein or an activity capable of imparting boric acid resistance in living organisms such as yeasts and plants, and plants and yeasts that highly express powerful proteins. Can grow even in the presence of high concentrations of boric acid.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is AtPAB2 gene
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is AtPAB2 gene.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is AtPAB2.
  • AtRBP47c' as the boric acid resistance-imparting protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • boric acid comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • the AtRPS20B gene is used as the resistance-imparting gene
  • AtRPS20B is used as the boric acid resistance-imparting protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • the AtMYBl 3 gene is used as the boric acid resistance-imparting gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7
  • AtMYB13 is represented by the salt represented by SEQ ID NO: 9.
  • AtMYB68 gene as the boric acid resistance-imparting gene consisting of the base sequence
  • AtMYB68 as the boric acid resistance-imparting protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the AtRBP45a gene is used as the gene
  • AtRBP45a is used as the boric acid resistance-imparting protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • the AtRBP45b gene is used as the boric acid resistance-imparting gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • AtRBP45b As a boric acid resistance-imparting protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, AtRBP45b, as a boric acid resistance-imparting gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15, the AtRBP45c gene, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 16 AtR BP45c is a boric acid resistance-imparting protein that also has the sequence power, and the base sequence power shown in SEQ ID NO: 17 AtRBP45d gene as the boric acid resistance-imparting gene, AtRBP45d as the boric acid resistance-imparting protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and AtRBP47a gene as the boric acid resistance-imparting gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is AtRBP47a as the boric acid resistance-imparting protein, and the boric acid resistance-imparting gene consisting of the nu
  • AtRBP47b as the boric acid resistance-imparting protein comprising the amino acid sequence
  • AtRBP47c gene as the boric acid resistance-imparting gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23, and boric acid resistance-imparting consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24
  • AtRBP47c has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25, and has boric acid resistance.
  • AtUBPla is used as the boric acid resistance-imparting protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26
  • the AtUBP lb gene is used as the boric acid resistance-imparting gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27
  • AtUBPlb is used as the boric acid resistance-imparting protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28
  • AtUBPlc gene is used as the boric acid resistance-imparting gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29, and SEQ ID NO: 30 is shown.
  • AtUB Pic can be mentioned as a boric acid resistance-imparting protein having an amino acid sequence.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, 110, preferably 115, more preferably 110, and further preferably 110 115 means an amino acid sequence in which an arbitrary number of 15 amino acids have been deleted, substituted or added.
  • base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is, for example, 120, preferably 115, more preferably 110, and still more preferably 110. It means a nucleotide sequence in which an arbitrary number of 15 bases has been deleted, substituted or added.
  • a DNA (mutated DNA) comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is known to those skilled in the art of chemical synthesis, genetic engineering techniques, mutagenesis and the like. Can also be produced by any method. Specifically, DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9 can be brought into contact with a mutagenic drug, irradiated with ultraviolet light, or genetically engineered. Mutant DNA can be obtained by introducing a mutation into these DNAs using the method described above. Site-directed mutagenesis, which is one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a method using a nucleic acid such as DNA or RNA as a probe, a colony-hybridization method, and a plaque.
  • DNA derived from a colony or plaque or a fragment of the DNA is immobilized.
  • Using a filter carry out the incubation at 65 ° C in the presence of 0.7-1. OM NaC1 at 65 ° C, and then use a 0.1- to 2-fold SSC solution (1x concentration of SSC solution).
  • the composition of the solution includes DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C. using 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate.
  • Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, etc.
  • DNAs that can hybridize under stringent conditions include DNAs having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as a probe, for example, 60% or more, preferably 60% or more. Is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more homologous DNA.
  • the method for obtaining or preparing the gene of the present invention is not particularly limited, and the nucleotide sequence information or SEQ ID NO: 2 shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9 disclosed herein is not particularly limited. Prepare appropriate probes and primers based on the amino acid sequence information shown in 4, 6, 8, and 10, and use them to screen a cDNA library in which the gene is predicted to be present.
  • the target gene can be isolated or can be prepared by chemical synthesis according to a conventional method.
  • a cDNA library is prepared from Arabidopsis thaliana from which the gene of the present invention has been isolated in accordance with a conventional method, and then an appropriate probe specific to the gene of the present invention is prepared from this library.
  • the gene of the present invention can be obtained.
  • Examples of the source of the above-mentioned cDNA include various cells or tissues derived from the above-mentioned plants, isolation of total RNA from these cells or tissues, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA and its closing, etc. Can be carried out according to a conventional method.
  • mutant gene or homologous gene of the present invention comprising the base sequence shown in any of (B) to (F) above is shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9.
  • the DNA can be isolated from other organisms by screening homologs of the DNA under appropriate conditions. In addition, it can be prepared by the above-described method for producing a mutant DNA.
  • the method for obtaining and preparing the protein of the present invention is not particularly limited, and may be a naturally-derived protein, a chemically synthesized protein, or a recombinant protein produced by a genetic recombination technique.
  • the protein of the present invention can be obtained by appropriately combining isolation and purification methods of a protein or a protein expressing such a protein.
  • the protein of the present invention is synthesized according to a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like. be able to.
  • the protein of the present invention can also be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
  • a protein is prepared by a genetic recombination technique
  • the protein of the present invention can be prepared by introducing a DNA comprising a base sequence encoding the protein into a suitable expression system.
  • preparation by genetic recombination technology which can be prepared in a large amount by relatively easy operation, is preferable.
  • such a protein when preparing the protein of the present invention by a genetic recombination technique, such a protein can be recovered and purified from a cell culture by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, acid extraction, and fermentation.
  • known methods including cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography are used.
  • affinity chromatography for example, a column to which an antibody such as a monoclonal antibody against the protein of the present invention is bound, or a case where a normal peptide tag is added to the protein of the present invention.
  • purified products of these proteins can be obtained. Also book
  • a purified sample can be obtained by subjecting the cell membrane-degrading enzyme to action and then performing the above purification treatment.
  • amino acid sequence shown in the rooster sequence number 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, or 30, one or several Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1 6, 18, 20, 22, 24, 26, 28, Or a protein having an amino acid sequence homology of 60% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 20, 20, 22, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 each showing an example of a base rooster sequence encoding the amino acid rooster sequence shown in 24, 26, 28, or 30 , 23, 25, 27, or 29, a person skilled in the art can appropriately prepare or obtain the information based on the information on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 23, 25, 27, or 29.
  • the base sequence shown in IJ No. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, or 29 or a part thereof may be used.
  • the DNA can be isolated from organisms other than Arabidopsis thaliana by using the DNA as a probe by screening the homologue of the DNA under appropriate conditions. After cloning the full-length DNA of the homologous DNA, the cloned DNA is incorporated into an expression vector and expressed in an appropriate host, whereby a protein encoded by the homologous DNA can be produced.
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the gene of the present invention and can express a boric acid resistance-conferring protein. Alternatively, it can be constructed by appropriately integrating the gene of the present invention into an expression vector. Expression vectors which can be replicated autonomously in the host cell, and which can be integrated into the chromosome of the host cell are preferred.In addition, a promoter, enhancer, Those containing a control sequence such as a terminator can be suitably used. As the expression vector, an expression vector for yeast, an expression vector for plant cells, an expression vector for bacteria, an expression vector for animal cells, and the like can be used, and an expression vector for yeast and an expression vector for plant cells can be used. Recombinant vectors are preferred.
  • yeast expression vectors for yeast include, for example, pYES2 (Invitrogen), YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), Ycp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, etc. Can be shown.
  • promoters for yeast include promoters such as a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, a GAL1 promoter, a GAL10 promoter, a heat shock protein promoter, an MFa1 promoter, and a CUP1 promoter.
  • Examples of expression vectors for plant cells include Ti plasmid (Tumor inducing plasmid), pSPORTl, pT7Blue-T vector, pIG121-Hm [Plant Cell Report, 15, 809-814 (1995)], pBI121 [EMBO J. 6, 3901-3907 (1987)], and plant virus vectors such as tobacco mosaic virus, cauliflower mosaic virus, and diemi-virus.
  • Examples of promoters for plant cells include the cauliflower mosaic virus 35S promoter [Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392], the norebulose bisphosphate-potential noreboxylase sumonore subunit promoter, and the like.
  • Examples of the terminator include a nopaline synthase gene terminator.
  • the transformant of the present invention is not particularly limited as long as it is a transformant into which the above-described recombinant vector of the present invention has been introduced and which expresses a borate tolerance-imparting protein.
  • Transformed plants (cells, tissues, individuals), transformed bacteria, and transformed animals (cells, tissues, individuals) can be mentioned, and transformed yeast and transformed plants (cells, tissues, individuals) are preferred.
  • the host yeast used for the production of the transformed yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • Examples of a method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electoru-portation method, a spheroblast method, and a lithium acetate method.
  • the type of host plant (cell, tissue, individual) used for the production of the transformed plant (cell, tissue, individual) is not particularly limited, and flowers, fruit plants, vegetables, root vegetables, cereals, Ornamental plants, plants such as trees containing fruit, for example, Solanaceae, Grass, Brassicaceae, Asteraceae, It can be appropriately selected from plants belonging to the sesame family, the moxaceae family, the fuming family, the rose family, the legume family, the coconut family, and the asteraceae family, and cultured cells and tissues (such as seeds and calluses) of those plants.
  • the above-described recombinant vector of the present invention containing the gene of the present invention is used, the recombinant vector is introduced into a plant cell, and the genomic DNA of the present invention is contained in the genomic DNA in the plant cell.
  • a method of introducing gene DNA can be adopted. Transformation of a plant can be carried out by appropriately using a known method such as a leaf disk coculture method, an electoral poration method, an agroba battery method, or a particle gun method, depending on the type of the plant.
  • a method of physically or chemically increasing the permeability of a plant cell to directly incorporate the recombinant vector of the present invention into a recipient cell to produce a transformed plant can also be employed.
  • a YNL275w gene-deficient YNL275W-disrupted yeast that lacks the YNL275w gene and is not expressed is transformed by using a gene library of various plants and yeasts.
  • the transformed YNL275w disrupted yeast is cultured in a boric acid-containing medium, and the boric acid tolerance-imparting activity of the transformed YNL275W disrupted yeast is measured.
  • the “evaluation” includes the evaluation of "growth of the transformed yeast in a boric acid-containing medium" and "measurement of the degree of proliferation".
  • Saccharomyces' Celebiche 1169 strain (Winzeler, EA; Shoemaker, DD; Astromoff, A .; Liang, H .; Anderson, K .; Andre, B .; Bangham, R .; Benito, R .; Boeke, JD; Bussey, H .; Chu, AM; Connelly, C; Davis, K .; Dietrich, F .; Dow, SW; El Bakkoury, M .; Foury, F .; Friend, SH; Gentalen , E .; uiaever, G .; Hegemann, JH; Jones, T .; Laub, M .; Liao, H .; Liebundguth, N .; Lockhart, DJ; Lucau-Danila, A .; Lussier, M .;
  • the yeast used for screening is not limited to the YNL2 75w-disrupted strain, and a wild-type yeast can also be used.
  • Examples of the method of the present invention for screening for a boric acid resistance-imparting gene include a method for targeting specific inhibition of splicing by boric acid and measuring and evaluating the degree of enhancement of splicing efficiency. Then, the test substance is expressed in yeast cells, the test substance expression is cultured in the presence of boric acid, and the degree of improvement of the specific inhibition of splicing of the intron-containing gene by boric acid in the yeast is determined by the splicing efficiency. A method of measuring and evaluating the degree of enhancement can be exemplified.
  • intron-containing genes in yeast include the RPL7B gene (SEQ ID NO: 33), which is a gene encoding an essential ribosome large subunit protein in the Saccharomyces cerevisiae genome.
  • the degree of improvement in the specific inhibition of splicing by boric acid can be measured, for example, by RT-PCR. At this time, it is preferable to use the boric acid resistance conferring gene AtRBP47c 'gene as a positive control. ! / ,.
  • the use (method) of the above-described DNA of the present invention as a boric acid tolerance-imparting gene and the use (the method) of producing the above-described DNA of the present invention for producing a borate-resistant plant or yeast are provided.
  • the use of the protein of the present invention as a protein having a boric acid tolerance-imparting activity (method), and the use of the protein of the present invention for producing a borate-tolerant plant or yeast (method) Is included.
  • boric acid tolerance-imparting gene and the protein having a boric acid tolerance-imparting activity (borate tolerance-imparting protein) of the present invention in the production of boric acid-tolerant plants and yeasts is an aspect of the present invention. It is included in the form.
  • Saccharomyces 'Celepiche 1169 strain (purchased from Research Genetics) and Saccharomyces' Celepiche BY4741 strain (purchased from Research Genetics) were used.
  • Each genotype is 1169 strains MATa; his3 A l; leu2 A 0; metl5 A 0; ura3 A 0; YNL275w :: kanMX4, BY4741 strain is MATa; his3 ⁇ 1; leu2 ⁇ 0; met15 ⁇ 0; ura3 ⁇ 0.
  • the plasmids were pYES2 (purchased from Invitrogen Genetics) and pFL61 (provided by Dr.
  • yeast 1169 strain used was tested for boric acid tolerance.
  • pYES2 and pYES2 Single colony of yeast 1169 strain transformed with BORl (CDS of Arabidopsis thaliana BOR1 gene BOR1 inserted downstream of GAL1 promoter of pYES2 vector) was scraped with platinum loop and SD liquid Shake and culture in the medium until the OD value is about 1.0.
  • Yeast 1169 was transformed by the lithium acetate method using calcium / manganese proton antiporter AtCAX2 in heavy metal detoxification. Plant Biol. 4; 612-618.).
  • the transformed yeast was SD medium supplemented with 80 mM boric acid (6.7 g / l yeast nitrogen base without amino acids, 5 g / l ammonium sulfate, 20 g / l glucose, 2 g / l histidine, 2 g / l methionine, 3 g / l leucine , 20 g / l agar, pH 5.5) and cultured at 26.5 ° C. 14 days after 10 days, the yeast plasmid which formed the colonies was recovered. The recovered plasmid was re-introduced into yeast, and the reproducibility of boric acid resistance performance was confirmed.
  • each of the yeast cultures having the same 600 value was diluted with 1Z5, 1/25, 1/125, and 1/625 to prepare diluents. Each diluted solution was used as a control and the solid medium without boric acid was added to the SD solid medium without boric acid by pipetman (Gilson) by 5 / z1. Was spotted to be thin. The plate on which the yeast was spotted was cultured at 30 ° C. for about 10 days, and the growth state of the yeast was observed.
  • the cells were cultured with shaking at 30 ° C until the pH reached 0. OD value of each culture is 0.1
  • the nucleotide sequences of the six cDNA clones obtained by the screening were analyzed as follows. A sequence reaction was performed by a fluorescent dye terminator method, and the nucleotide sequence was analyzed using an ABI 310 genetic analyzer. From the obtained base sequence, TAIR
  • the gene encoded by the nucleotide sequence was identified by a BLAST search at (http: ⁇ www.arabidopsis.org /).
  • yeast 1169 strain used in this experiment was tested for boric acid tolerance.
  • Yeast 1169 was transformed with pYES2 and pYES2-BOR1.
  • p YES 2 and p YES 2—transformed using BOR 1 are those vector vectors.
  • the same URA3 as the vector PFL61 used in the Arabidopsis expression library used in the subsequent screening was retained as the selection marker. Because it is.
  • boric acid resistance should be as high as that of the cells transformed with PYES2.
  • the yeast transformed with pYES2 and pYES2—BOR1 were named "2" and "7", respectively.
  • FIG. 1 shows the boric acid tolerance performance of 46, 72, 84, 86, and 87 transformed yeasts by SpotAssy (66 was encoded as the same gene as 46 as shown below, so the result was 46 Only shall be shown).
  • Yeast 1169 strain can hardly form colonies on SD medium containing 80 mM boric acid as shown in the upper part of FIG. On the other hand, all of these transformed yeasts could form more mouths than the 1169 strain.
  • a test by liquid culture was performed. In liquid culture, as shown in FIG.
  • AtPAB2 is a gene encoding a polyadenylate binding protein
  • AtMYB13 and AtMYB68 are MYB-like transcription factors
  • AtRPS20 is a ribosomal protein
  • AtRBP47 is a gene encoding an RNA binding protein.
  • Yeast recombinant cells were converted by the lithium acetate method (Gietz and Schiestl, 1995) into an Arabidopsis thaliana cDNA library cleaved into the expression plasmid pFL61 (Minet et al, 1992) o An excreted boron transporter The lack of YNL275W (BOR1), which is more sensitive to boric acid than the corresponding wild-type strain, results in the use of strain Y01169 as a host (data not shown). Transformants were screened at 26.5 ° C. on SD solid medium (Sherman, 1991) containing 80 mM boric acid.
  • the SD medium contains 2% glucose, 0.67% amino acid-free yeast-trogen base, and 0.05% ammonium-sulfate, which are necessary for the growth of the mutant, and the amino acids (20 mg ZL His, 30 mg ZL Leu, 20 mg / L Met) and the pH was adjusted to 5.5 with Tris.
  • Agar (2% w / v) was added to form a solid medium. Colony formation of non-transformed Y01169 (A borl) cells was completely suppressed by the addition of 80 mM boric acid.
  • the plasmid was also isolated as a positive isolate and reconverted into yeast strain Y01169.
  • the resistant isolate was obtained from fluoro-orotic acid-induced plasmid loss (BoeKe, JD, LaCroute, F., & Pink, uR (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346). .), Only clones exhibiting plasmid-dependent boric acid properties were selected.
  • Table 1 shows the AtRBP47c "-related gene and the ORF sequence of RPL7B (see SEQ ID NO: 34).
  • Amplification was performed by PCR using the described primer set. The amplification product was subcloned into pGEM-T easy vector (Promega). These plasmids were treated with Notl, and the resulting ORF fragments of AtRBP45a, AtRBP47b, AtRBP47c, AtRBP47c, and AtUBP1 were cloned into the Notl site of the expression vector pFL61 (Minet et al, 1992) o ORF of RPL7B. The fragment was cloned into the Notl site of the expression vector pDR195 (Rentsch et al., 1995). pFL61 and pDR195 carry the PGK and PMA1 promoters, respectively, for expression.
  • AtUBPI 5 ; -AAAAAGCAGGCTTAATGCAG. ' ⁇ ATCAAAGGC lTATTAAG-3'
  • RPL7B 5 -AAAAAGCAGGCTTAATCiTCCACTGAAAAAATCTT-—
  • the transformant was grown to a stationary phase in an SD liquid medium, and diluted in an SD liquid medium with or without 80 mM boric acid to obtain a high-concentration boric acid. D was adjusted to 0.1 in order to check the durability of the steel.
  • RT product 16 reverse transcribed using The RT product, 1Z15, was subjected to PCR in the following cycle: 30 seconds at 94 ° C, 45. 30 seconds at C, 72. 40 to 50 times per minute at C.
  • PCR was performed with a Smart Cycler (Cepheid) using DNA polymerase ExTaq (Takara). Used in this analysis These primer sets are listed in Table 2 and published as supplementary information on the PNAS website. Amplified transcripts were separated on a 2% agarose gel and detected after staining with Etd bromine.
  • Salt tolerance analysis was performed as described above for boric acid tolerance, except that SD media containing 1.75M or 2M NaCl was used.
  • GenBank accession numbers of the sequences described in Example 2 are as follows. Arabidopsis thaliana sequence AtRBP45a, MN124872; AtRBP45b, MN101037; AtRBP4 5c, MNl 18834; AtRBP45d, MN121940; AtRBP47a, MN103848; AtRBP47b, MN112800; AtRBP47c, MN10NBP3N; AtUBPlc, MNl 12266; and Saccharomyces cerevisiae sequences RPL7A, X62627; RPL7B, Z7355.
  • AtRBP47c has three RNA recognition motifs (RRMs). In the Arabidopsis genome, there are 11 genes encoding three RRMs and a protein having a sequence identity score of 100 or more with the BLASTP program for AtRBP47c '.
  • FIG. 6A shows these AtR BP47c and related family proteins.
  • AtRBP47c'-related gene confers boric acid resistance.
  • the role of these genes in Arabidopsis has not yet been elucidated, but similar genes in other plant species have been characterized. Nicotiana plumbaginifolia (Bimpson, CG, Jennings, SN, Clark, GP, Thow, G., & Brown, JWS (2004) Plant J. 37, 82-91) and UBP1 (Lambermon, MH, Simpson, GG, Wieczorek Kirk, DA, Hemmings—Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J.
  • RPL7B contains two introns.
  • the size of the unspliced fragments indicates that these fragments were derived by splicing either the first or the second intron (see FIG. 7A).
  • the unspliced fragments were cloned and the DNA sequence of eight clones was determined.
  • Six and two clones contained the first and second introns, respectively. This suggested that inhibition occurred at both the first and second introns, with the first intron being more sensitive to high concentrations of boric acid than the second intron.
  • RPL7B has a paralog RPL7A (SEQ ID NO: 32) in the yeast genome.
  • RPL7A and RPL7B double disrupted mutants are lethal (Saccharomyces Genome Database: http://db.veastgenome.org), and RPL7 protein is Indicates that it is mandatory. Considering the differences in borate sensitivity to splicing in the two genes, the RPL7A-disrupted and RPL7B-disrupted mutants may have different borate tolerances.
  • Arpl7b (Y01094) showed a boric acid resistance level equivalent to that of wild-type Saccharomyces' cerepiche. The boric acid resistance of Arpl7a (Y04443) was lower than that of wild-type (FIG. 8A). The difference in boric acid resistance was also apparent in liquid culture (FIG. 8B).
  • Arpl7a 's ability to reduce boric acid resistance
  • Expression of intronless RPL7B cDNA should increase Arp 17a resistance, if it were due to a reduction in RPL7 protein levels due to inhibition of RPL7B splicing.
  • intronless RPL7B in Arpl7a Whether or not to increase borate resistance was examined.
  • the ORF sequence of RPL7B was cloned into the expression vector pDR195.
  • the plasmid was introduced into Arpl7a, and the transformant was examined for boric acid resistance.
  • intronless RPL7B expression increased the boric acid resistance of Arpl7a. This result indicates that RPL7B splicing inhibitory factor Arpl7a causes growth arrest due to high concentration of boric acid.
  • RPL7B has an atypical branch point sequence in the first intron (see Table 3).
  • Table 3 Out of 231 nuclear intron-containing genes, 28 genes containing such atypical branch point sequences were found. Of these 28 genes, an increase in the level of non-spliced fragments due to boric acid treatment was observed in 9 of the genes compared to the spliced fragments (FIG. 9).
  • These genes are ERV1, ERV41, NYV1, RPS9A, RPS9B, SRB2, YO L048C, YPR098C and YRA1.
  • Table 3 shows three consensus sequences, a 5 'splice site, a branch point, and a 3' splice site confirmed in yeast.
  • the transition point from A to G at the junction of the first intron is indicated by white letters on a black background.
  • Y refers to pyrimidine ribonucleotide (C or U).
  • AtRBP47c was isolated from Arabidopsis thaliana as a gene that confers boric acid resistance on yeast cells by complementation of yeast.
  • yeast genome there are seven genes encoding proteins with three RRMs and a sequence identity score of 100 or more with the BLASTP program for AtRBP4 7c '.
  • NAM8 was originally isolated as an inhibitor of mitochondrial splicing deficiency (Ekwall, K., Kermorgant, M., Dujardin, G.,
  • NAM8 interacts with UlsnRNA, resulting in an atypical 5 'splice site.
  • NAM8 is essential for efficient recognition of 5, splice sites when this process is impaired (Gottschalk, A., Tang, J., Puig, O., Salgado, J ., Neubauer, G., Colot, HV, Mann, M., Seraphin, B., Rosbash, M., Luhrmann, R., & Fabrizio, P.
  • AtRBP47c a related protein, has three RRMs. RNA binding activity of UBP1 of RBP45, RBP47 and N. plumbaginifolia was confirmed. All of these proteins tend to bind U-rich sequences (Lambermon, MH, Simpson, GG, Wieczorek Kirk, DA, Hemmings—Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J.
  • Example 2 is the first report to show that the key force of boric acid toxicity mechanism is specific inhibition of splicing, and that a gene associated with enhanced splicing efficiency leads to boric acid resistance. However, there should be mechanisms of toxicity other than inhibition of splicing. This is because the effects of boric acid toxicity are also observed in non-spliced prokaryotes.
  • FIG. 1 shows the results of boric acid resistance performance using yeast strain 1169.
  • Yeast 1169 strain was transformed with pYES2 "2" and pYES2-BORI "7". Each yeast was streaked on SD medium containing 0 to 100 mM boric acid. 26. The results of culturing at 5 ° C for 16 days are shown.
  • FIG. 2 is a view showing the results of growth of yeast 1169 strain in a boric acid excess medium.
  • Yeast strain 1169 was transformed with 46, 72, 84, 86 and 87. After liquid culture of each yeast, it was spotted on SD medium containing 80 mM boric acid. Spots are diluted 1Z5 from left to right. 26. The results of culturing at 5 ° C for 9 days are shown.
  • FIG. 3 shows the results of a boric acid resistance test of yeast strain 1169 in a liquid medium.
  • Yeast 1169 strains were transformed with 46, 72, 84, 86 and 87. After liquid culturing, each yeast was subcultured on SD medium containing 80 mM boric acid so that the OD value was 0.1. 30 ° C
  • FIG. 4 is a view showing the results of growth of a yeast strain BY4741 in a boric acid excess medium.
  • Yeast strain BY4 741 was transformed with 46, 72, 84, 86 and 87.
  • the yeast was spotted on an SD medium containing 100 mM boric acid. Spots are diluted 1Z5 from left to right. 26. The results of culturing at 5 ° C for 10 days are shown.
  • FIG. 5 is a view showing the results of a boric acid resistance test of yeast BY4741 strain in a liquid medium.
  • Yeast strain BY4741 was transformed with 46, 72, 84, 86, and 87. After liquid culture, each yeast was subcultured to SD medium containing 80 mM boric acid so that the OD value was 0.1.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of boric acid resistance of yeast cells that have been transformed with AtRBP47c and related genes.
  • A Phylogenetic tree of AtRBP47c'-related family genes. The dendrogram shows the relative evolution distance of AtRBP4 7c'-related family proteins and was created using the NJ method. Bars indicate the genetic distance of the 0.1 amino acid substitution Z site.
  • B Boric acid resistance in solid medium. Yeast cells are grown to an OD of 1.0, serially diluted, and then
  • FIG. 7 is a view showing the effect of boric acid on splicing.
  • A Schematic of RPL7B splicing. Three types of mRNA can be produced from RPL7B pre-mRNA by splicing. Arrowheads indicate the positions of the primers used for RT-PCR.
  • B Effect of boric acid on RPL 7B splicing. Grow yeast cells until OD reaches 1.0
  • boric acid was added to a final concentration of 80 mM. Twenty-four hours later, yeast cells were collected and total RNA was isolated. cDNA was synthesized from total RNA and used as a template for splicing by PCR. In this analysis, yeast strain BY4741 (wild type) transformed with the empty vector pFL61 or the AtRBP47c 'expression vector (AtRBP47c') was used.
  • C Effect of boric acid on splicing of RP L7A. RPL7A splicing was analyzed by RT-PCR on BY4741 transformed with PFL61.
  • FIG. 8 shows the results of boric acid resistance of RPL7A or RPL7B disrupted yeast cells.
  • A Boric acid resistance in solid medium. Grow yeast cells to an OD of 1.0 Then, 101 was added dropwise to an SD dish to which 0 or 80 mM boric acid had been added. Growth was recorded after 7 days of culture.
  • B Boric acid resistance in liquid medium. OD in yeast cells
  • Arpl7a and Arpl7b represent the RPL7A disruption mutant (Y0443) and the RPL7B disruption mutant (Y01094), respectively.
  • C Effect of RPL7B overexpression on boric acid resistance in RP L7A disrupted yeast. Yeast cells are grown to an OD of 1.0, serially diluted, and then 10 ⁇ l are added to 0 or 80 mM
  • the acid was added dropwise to the SD dish to which the acid was added. Growth was recorded after 5 days of culture. Yeast cells transformed with the empty vector PFL61 were used as controls.
  • Figure 9 shows the effect of boric acid on splicing of a gene containing an atypical branch point sequence.
  • the yeast is grown to an OD of 1.0 and then boric acid is brought to a final concentration of 80.
  • yeast strain BY4741 wild type transformed with the empty vector pFL61 or the AtRBP47c 'expression vector (AtRBP47c') was used.
  • White and black arrowheads indicate non-spliced and spliced fragments, respectively.
  • FIG. 10 shows the growth of AtRBP47c′-related gene-transformed yeast cells and the effect of salts on splicing of RPL7B.

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Abstract

　ホウ素過剰に耐性を持つ植物を作出することができる可能性がある、生物にホウ酸耐性を付与することができる遺伝子やタンパク質を提供するものである。高等植物シロイヌナズナのいくつかの遺伝子を真核生物のモデル生物である酵母で発現させることにより、酵母にホウ酸耐性を付与しうる５種類の遺伝子、すなわちＡｔＰＡＢ２，ＡｔＲＢＰ４７ｃ’，ＡｔＲＰＳ２０Ｂ，ＡｔＭＹＢ１３，及びＡｔＭＹＢ６８，ＡｔＲＢＰ４５ａ，ＡｔＲＢＰ４５ｂ，ＡｔＲＢＰ４５ｃ，ＡｔＲＢＰ４５ｄ，ＡｔＲＢＰ４７ａ，ＡｔＲＢＰ４７ｂ，ＡｔＲＢＰ４７ｃ，ＡｔＵＢＰ１ａ，ＡｔＵＢＰ１ｂ，ＡｔＵＢＰ１ｃの各遺伝子を見い出した。また、ホウ酸の毒性メカニズムの鍵が、スプライシングの特異的阻害にあり、スプライシング効率の亢進に関連する遺伝子は、ホウ酸耐性を付与する遺伝子であることを見い出した。

Description

ホウ酸耐性付与タンパク質及びその遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、シロイヌナズナにおけるホウ酸耐性付与タンパク質及びその遺伝子、該 遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、並びに ホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] ホウ素は高等植物の微量必須元素の一つである（例えば、非特許文献 1参照)。ホ ゥ素は毒性も持っており、過剰に摂取すると植物の生育が阻害されたり、動物では急 性中毒で死亡したりする。土壌溶液中でホウ素は無電荷の分子状で存在する。その ため比較的容易に溶脱し、農作物において欠乏症が発生しやすい。ホウ素欠乏症 による農業上の収量、品質の低下は 130品種、日本を含む世界 80力国以上で報告 されている（例えば、非特許文献 2参照)。また、ホウ素は他の元素と比較して至適濃 度範囲が狭 、ことが知られており、欠乏症状を示すようになる濃度と過剰症状が現わ れる濃度との差が小さい。そのため、農業においてホウ素の施肥はその量の調節が 難しいとされている。特に、過剰量のホウ素を施肥した場合、ホウ素の除去は困難で あり、その農地での作物生産に支障をきたすこととなる。また、水道水にはホウ素が含 まれているため、乾燥地で灌漑により農業を行う場合もホウ素過剰害が問題になるこ とが多い。このようにホウ素が過剰に投与された農地にカ卩え、世界にはホウ素濃度の 高い地域が広く分布しており、それらの地域を含む国々ではホウ素の過剰害への対 策が農業政策上重要な課題となっている。また、ホウ素は金属表面処理剤や漂白剤 中にも存在し、これらを用いる工場からの排水には大量のホウ素が含まれる。ヒトにお けるホウ素の致死量は 15— 20gである力 それよりも少量のホウ素でも消ィ匕器官や 神経系に様々な障害を引き起こすことが知られている。現在、工業排水に含まれるホ ゥ素量が問題になりつつある。
[0003] 最近になり植物におけるホウ素の役割が明らかにされてきた。ホウ素が細胞壁のぺ クチン質多糖を架橋することが明らかとなり（例えば、非特許文献 3参照）、この架橋 が植物の生育に必須であることが示された (例えば、非特許文献 4参照)。これが植 物におけるホウ素の生理機能に関する最初の分子レベルの知見である。その一方で 植物体でのホウ素輸送機構には不明な点が多く残されている。ホウ素は長い間、脂 質二重膜の受動拡散によって細胞内に入り、蒸散流によって植物体内を輸送される と考えられていた (例えば、非特許文献 5参照)。一方、生育に適したホウ素栄養条件 は種間や品種間で大きく異なることが知られていた。吸収や転流、利用効率の違い がその原因の可能性として挙げられていたものの、その要因となる分子は不明であつ た。近年になりチャネルを介した輸送が提唱された (例えば、非特許文献 6参照）が、 その根拠はアフリカッメガエルの卵母細胞での発現系や膜小胞を用いた in vitroの実 験にすぎず、実際の植物個体でそれらチャネル分子がホウ素輸送に関与するかは 示されていな力つた。また、ヒマヮリの根の吸収実験力も輸送体による能動輸送の存 在が示唆された (例えば、非特許文献 7参照)ものの、それを担う輸送体の同定には 至っていなかった。
[0004] 本発明者らは、生物界で初めて排出型ホウ素耐性タンパク質 BOR1をモデル植物 であるシロイヌナズナより単離した (例えば、特許文献 1参照)。 BOR1は低ホウ素栄 養条件下で導管への積極的なホウ素輸送を担うと考えられている（例えば、非特許 文献 8参照)。また、ホウ素輸送を担う耐性として BOR1以外には、酵母の YNL275 wが知られている（例えば、非特許文献 9参照)。
[0005] また、上述のように、ホウ素（B)は植物（例えば、非特許文献 10参照)及び動物（例 えば、非特許文献 11参照）に必須の微量栄養素であるが、高濃度では有毒である（ 例えば、非特許文献 12, 13参照)。自然発生する高濃度ホウ素を含む土壌は世界 中に分布し、ホウ素の施肥、化石燃焼、ホウ素を含む水を用いた灌漑等の人間の活 動が、高濃度ホウ素の環境を作り上げた (例えば、非特許文献 12, 13参照)。
[0006] 植物におけるホウ素の毒性による症状としては、葉縁の萎黄病（例えば、非特許文 献 13参照）、果物の異常及び Z又は榭皮ネクロシス (例えば、非特許文献 14参照)が 含まれる。過剰量のホウ素は、作物の収量及び質を減少させる。ホウ素の毒性は、世 界的に、農業生産の大きな障害となっている。ホウ素は、高濃度で、動物や微生物に 対して有毒である。ホウ素の致死量は、大人で約 140mgZkg、幼児で約 270mgZ kgであると推定される (例えば、非特許文献 15, 16参照)。長期間にわたり高濃度の ホウ素を摂取すると、ヒトにおいて食欲不振、嘔気、体重の減少、性欲の減退を誘因 する（例えば、非特許文献 17参照)。現在、許容できるホウ素の安全摂取量は大人 で 13mgZ日であると示されている（例えば、非特許文献 18参照)。ホウ素は微生物 に対する殺菌効果があるため、食品の保存料に含まれてきた (例えば、非特許文献 1 9参照)。さらに、ホウ素は長年、殺虫剤として、特にゴキブリ殺虫剤に使用されてきた (例えば、非特許文献 20参照)。
[0007] ここ数十年、ホウ素の毒性が認識されて以来、ホウ素の毒性の影響を調べるための 研究が行われてきた。その多くは、生理学的な研究であった。例えば、大豆の葉にお いて、 allantoate アミド加水分解酵素の活性はホウ酸によって減退する（例えば、非 特許文献 21参照）。ォオシャジクモ（Chara corallina)では、ホウ素によるリンゴ酸脱水 素酵素及びイソクェン酸脱水素酵素活性の阻害が観察された (例えば、非特許文献 22参照)。また、胎盤でのホウ素量と、ボルフオビリノ一ゲン (ポルフィリン合成の媒介 物）の合成に関与する新生児におけるデルタアミノレブリン酸脱水酵素活性との負の 相関も報告されている (例えば、非特許文献 23参照)。
[0008] 可溶ィ匕ホウ酸塩は、ホウ素の毒性に重要な役割を演じると思われている。細胞内の ホウ酸は、内部 pHが高いために部分的にホウ酸塩に転換する。高濃度ホウ酸が細 胞に提供されると、細胞内ホウ酸塩濃度が上昇し、細胞内の分子を含む各種 cis— di olとホウ酸塩複合体が形成される。分子を含むカゝかる cis— diolには、 NAD+、 ATP、 S— Ado Met、RNA及びいくつかの糖が含まれる（例えば、非特許文献 24, 25参 照)。これらの分子は、数々の酵素の補酵素及び Z又は基質として用いられているの で、ホウ酸塩の結合は、機能の欠失又は、酵素活性の改変、生化学反応の阻害や 最終的に代謝異常を誘導するようである。生化学的及び生理学的な分析、並びにホ ゥ素の毒性影響に関する推測が累積しているにもかかわらず、細胞死を誘くホウ素 の毒'性の分子メカニズムは、解明されていない。
[0009] 特許文献 1：特開 2002-262872号公報
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
酵母にホウ酸耐性を付与する遺伝子を植物に導入することにより、ホウ素過剰に耐 性を持つ植物が作出できる可能性がある。ホウ素耐性植物はホウ素過剰害に苦しむ 地域での作物増産に寄与しうると考えられる。また、これらの遺伝子を導入しホウ酸 耐性の上昇した藻類やバクテリアを用いることにより、工業用水に含まれるホウ素をそ れらに吸収させることにより除去するといつた環境浄化にも使用できる可能性がある。 本発明の課題は、ホウ素過剰に耐性を持つ植物を作出することができる可能性があ る、生物にホウ酸耐性を付与する遺伝子やタンパク質を提供することにある。また、ホ ゥ酸の毒性メカニズムを解明することにより、ホウ酸耐性を付与する遺伝子を効率よく スクリーニングする方法を提供することにある。 課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、高等植物シロイヌナズナのい くつかの遺伝子を真核生物のモデル生物である酵母で発現させることにより、酵母に ホウ酸耐性を付与しうる 5種類の遺伝子、すなわち AtPAB2, AtRBP47, AtRPS2 OB, AtMYB13,及び AtMYB68の各遺伝子を見い出し、本発明を完成するに至 つた。また、ホウ酸の毒性メカニズムの鍵力 スプライシングの特異的阻害にあり、ス プライシング効率の亢進に関連する遺伝子は、ホウ酸耐性を付与する遺伝子である ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
[0012] すなわち本発明は、（1)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与活性を有するタン ノ ク質をコードする DNAや、（2)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 2 2, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸配列力 なり、かつホウ酸耐性付与活性 を有するタンパク質をコードする DNAや、 (3)配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 , 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基酉己列若しくはその相ネ ΐ的酉己列 力 なるホウ酸耐性付与遺伝子 DNAや、（4)配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 , 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基酉己列において、 1若しくは数個 の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ酸耐性付与活 性を有するタンパク質をコードする DNAや、 (5)請求項 3記載の DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズし、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコー ドする DNAや、（6)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質 や、（7)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30 に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付 カロされたアミノ酸配列力もなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質や、（8) 請求項 1一 5のいずれか記載の DNAを含み、かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現 することができる組換えベクターや、（9)請求項 8記載の組換えベクターが導入され、 かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現する形質転換体や、 (10)形質転換体が酵母 であることを特徴とする請求項 9記載の形質転換体や、 (11)形質転換体が植物であ ることを特徴とする請求項 9記載の形質転換体や、（12)遺伝子ライブラリーを用いて 、 YNL275w遺伝子が欠損し、 YNL275wを発現しない YNL275w破壊酵母を形 質転換し、得られた形質転換 YNL275W破壊酵母をホウ酸含有培地で培養し、該形 質転換 YNL275W破壊酵母のホウ酸耐性付与活性を測定'評価することを特徴とす るホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法や、（13)ホウ酸によるスプライシング の特異的阻害を標的とし、スプライシング効率の亢進の程度を測定'評価することを 特徴とするホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法や、（14)被検物質を酵母細 胞内で発現させ、ホウ酸の存在下に、被検物質発現を培養し、酵母におけるイントロ ン含有遺伝子のホウ酸によるスプライシングの特異的阻害の改善の程度を、スプライ シング効率の亢進の程度として測定'評価することを特徴とする請求項 13記載のホウ 酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法や、 (15)酵母におけるイントロン含有遺伝 子力 サッカロミセス'セレピシェゲノム内の RPL7B遺伝子であることを特徴とする請 求項 14記載のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法や、 (16)請求項 1一 5の V、ずれか記載の DNAのホウ酸耐性付与遺伝子としての使用や、（ 17)請求項 1一 5 のいずれか記載の DNAのホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製のための使 用や、（18)請求項 6又は 7記載のタンパク質のホウ酸耐性付与活性を有するタンパ ク質としての使用や、（19)請求項 6又は 7記載のタンパク質のホウ酸耐性が付与され た植物又は酵母作製のための使用に関する。
発明の効果
本発明のホウ酸耐性を付与する遺伝子を植物に導入することにより、ホウ素過剰に 耐性を持つ植物が作出できる可能性がある。ホウ素耐性植物はホウ素過剰害に苦し む地域での作物増産に寄与しうると考えられる。また、これらの遺伝子を導入しホウ 酸耐性の上昇した藻類やバクテリアを用いることにより、工業用水に含まれるホウ素を それらに吸収させることにより除去するといつた環境浄化にも使用できる可能性があ る。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明の遺伝子 DNAとしては、（A)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与活性 を有するタンパク質をコードする DNA; (B)配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸酉己列力らなり、力つホウ酸耐'性 付与活性を有するタンパク質をコードする DNA; (C)配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 1 3, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基酉己列若しくはその相ネ甫的 配列からなる（シロイヌナズナ由来の）ホウ酸耐性付与遺伝子 DNA; (D)配列番号 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基配列 において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり 、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードする DNA;又は (E)配列番 号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基 配カゝらなるホウ酸耐性付与遺伝子 DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし 、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードする DNA;からなるホウ酸耐 性付与遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明のホウ酸耐性付与タンパク質 としては、（A)酉己歹 IJ番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 又は 30に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質;又 ίま（B)酉己歹 IJ番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又 ίま 30 に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付 カロされたアミノ酸配列力もなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質；であれ ば特に制限されず、ここで、「ホウ酸耐性付与遺伝子」とは生体にホウ酸耐性を付与 しうる遺伝子を ヽ、「ホウ酸耐性付与タンパク質」とは生体にホウ酸耐性を付与しう るタンパク質をいう。
[0015] 上記「ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質」とは、酵母、植物などの生体のホウ 酸に対する耐性を付与しうる活性を有するタンパク質を 、 、、力かるタンパク質を高 発現する植物や酵母は、高濃度ホウ酸の存在下でも生育することができる。 配列番号 1に示される塩基配列力 なるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtPAB2 遺伝子を、配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質とし ては AtPAB2を、配列番号 3に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子と しては AtRBP47c'遺伝子を、配列番号 4に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐 性付与タンパク質としては AtRBP47c'を、配列番号 5に示される塩基配列からなる ホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRPS20B遺伝子を、配列番号 6に示されるァミノ 酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtRPS20Bを、配列番号 7に示さ れる塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtMYBl 3遺伝子を、配列番 号 8に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtMYB13を 、配列番号 9に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtMYB6 8遺伝子を、配列番号 10に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質 としては AtMYB68を、配列番号 11に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺 伝子としては AtRBP45a遺伝子を、配列番号 12に示されるアミノ酸配列力もなるホ ゥ酸耐性付与タンパク質としては AtRBP45aを、配列番号 13に示される塩基配列か らなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRBP45b遺伝子を、配列番号 14に示される アミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtRBP45bを、配列番号 15 に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRBP45c遺伝子を、 配列番号 16に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtR BP45cを、配列番号 17に示される塩基配列力もなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRBP45d遺伝子を、配列番号 18に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与 タンパク質としては AtRBP45dを、配列番号 19に示される塩基配列からなるホウ酸 耐性付与遺伝子としては AtRBP47a遺伝子を、配列番号 20に示されるアミノ酸配列 力もなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtRBP47aを、配列番号 21に示される 塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRBP47b遺伝子を、配列番号 2 2に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtRBP47bを、 配列番号 23に示される塩基配列力 なるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtRBP47 c遺伝子を、配列番号 24に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質 としては AtRBP47cを、配列番号 25に示される塩基配列力もなるホウ酸耐性付与遺 伝子としては AtUBPla遺伝子を、配列番号 26に示されるアミノ酸配列力もなるホウ 酸耐性付与タンパク質としては AtUBPlaを、配列番号 27に示される塩基配列から なるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtUBP lb遺伝子を、配列番号 28に示されるァ ミノ酸配列力 なるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtUBPlbを、配列番号 29に 示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としては AtUBPlc遺伝子を、配 列番号 30に示されるアミノ酸配列力もなるホウ酸耐性付与タンパク質としては AtUB Picを、それぞれ挙げることができる。
[0017] 上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは 、例えば 1一 20個、好ましくは 1一 15個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1 一 5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味す る。また、上記「1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」と は、例えば 1一 20個、好ましくは 1一 15個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
[0018] 例えば、これら 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列か らなる DNA (変異 DNA)は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの 当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号 1, 3 , 5, 7又は 9に示される塩基配列からなる DNAに対し、変異原となる薬剤と接触作 用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これら DN Aに変異を導入することにより、変異 DNAを取得することができる。遺伝子工学的手 法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手 法であることから有用であり、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989. (以後 "モレキュラー クローニング第 2版〃と略す)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 一 38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この 変異 DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質を得ることができる。
[0019] 上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列」とは、 DNA又は RN Aなどの核酸をプローブとして使用し、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用い ることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来 の DNAまたは該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7—1. OMの Na C1存在下、 65°Cでノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1— 2倍程度の SSC溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげること ができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキュラークローユング第 2版等に記載されて V、る方法に準じて行うことができる。
[0020] 例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズすることができる DNAとしては、 プローブとして使用する DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有する DNAが挙げ ることができ、例えば 60%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さら に好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同 性を有する DNAを好適に例示することができる。
[0021] 本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなぐ本明細書中 に開示した配列番号 1, 3, 5, 7, 9に示される塩基配列情報又は配列番号 2, 4, 6, 8, 10に示されるアミノ酸配列情報に基づ 、て適当なプローブやプライマーを調製し 、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測される cDNAライブラリーをスクリ 一-ングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調 製することができる。
[0022] 具体的には、本発明の遺伝子が単離されたシロイヌナズナより、常法に従って cDN Aライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適 当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得す ることができる。上記 cDNAの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織 を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全 RNAの分離、 mRNA の分離や精製、 cDNAの取得とそのクローユングなどはいずれも常法に従って実施 することができる。本発明の遺伝子を cDNAライブラリーからスクリーニングする方法 は、例えば、モレキュラークローユング第 2版等に記載の方法等、当業者により常用さ れる方法を挙げることがでさる。 [0023] また、上記 (B)— (F)の 、ずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝 子又は相同遺伝子としては、配列番号 1, 3, 5, 7又は 9に示される塩基配列又はそ の一部を有する DNA断片を利用し、他の生物体等より、該 DNAのホモログを適当 な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異 DNAの作製方法により調製することもできる。
[0024] 本発明のタンパク質の取得'調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質 でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタン ノ ク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク 質を発現している細胞又は組織力ゝらタンパク質の単離 ·精製方法を適宜組み合わせ ることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質 を調製する場合には、例えば、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルボニル法)、 tBoc法 (t プチルォキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質 を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタ ンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合 には、該タンパク質をコードする塩基配列からなる DNAを好適な発現系に導入する ことにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易 な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい
[0025] 例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかる タンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモ-ゥムまたはエタノー ル沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィ 一、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め た公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、了フィニ ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対す るモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通 常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合し たカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本 発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後 、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
[0026] さらに、酉己列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 3 0に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付 カロされたアミノ酸配列力もなるタンパク質、又は配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 1 6, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸酉己列と 60%以上の相同'性 を有するアミノ酸配列力 なるタンパク質は、配列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 , 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示されるアミノ酸酉己列をコードする塩基酉己列 の一例をそれぞれ示す配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27,又は 29に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は 取得すること力 Sできる。 ί列えば、、酉己歹 IJ番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示される塩基配列又はその一部を有する DNAをプローブと してシロイヌナズナ以外の生物より、該 DNAのホモログを適当な条件下でスクリー- ングすることにより単離することができる。このホモログ DNAの全長 DNAをクローニン グ後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログ DNA によりコードされるタンパク質を製造することができる。
[0027] 本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつホウ酸耐性 付与タンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本 発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトす ることにより構築することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複 製可能であるものや、ある 、は宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ま しぐまた、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、ェンハンサー、ターミ ネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現べク ターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター 、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細 胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好まし 、。
[0028] 酵母用の発現ベクターとして、例えば、 pYES2 (Invitrogen)、 YEpl3 (ATCC371 15)、 YEp24 (ATCC37051)、 Ycp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を例 示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 GAL1プロモーター、 GAL10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、 MF a 1プロモーター、 CUP1プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。
[0029] 植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、 Tiプラスミド（Tumor inducing plasmid ) , pSPORTl, pT7Blue— Tベクター、 pIG121— Hm〔Plant Cell Report, 15, 809- 814(1995)〕、 pBI121〔EMBO J. 6, 3901- 3907(1987)〕などのプラスミド、あるいは タバコモザイクウィルス、カリフラワーモザイクウィルス、ジエミ-ウィルスなどの植物ゥ ィルスべクタ一等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例え ば、カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392]、ノレブロースビスフォスフェート力ノレボキシラーゼスモーノレサブユニットプロ モーター等を挙げることができ、ターミネータ一としては、例えばノパリン合成酵素遺 伝子のターミネータ一を挙げることができる。
[0030] また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、か つホウ酸耐性付与タンパク質を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質 転換酵母、形質転換植物 (細胞、組織、個体)、形質転換細菌、形質転換動物 (細胞 、組織、個体)を挙げることができるが、形質転換酵母や形質転換植物 (細胞、組織、 個体）が好ましい。
[0031] 形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス'セレビシヱ
(saccharomyces cerevisae)^ンゾサッ 7口 ^ス*ボンべ (Schizosaccharomyces pomoe 、クリュイべ口ミセス'ラクチス (Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン'プルランス (Tnchosporon pul lulans八ンュヮニオ^セス ·—グノレヒウス (¾chwanniomyces al luvius 等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例え ば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることがで きる。
[0032] 形質転換植物 (細胞、組織、個体)の作製に用いられる宿主植物 (細胞、組織、個 体)としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観 葉植物、果榭を含む榭木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、 ゴマ科、モクセィ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はァカネ科に属する植物 や、それら植物の培養細胞、組織 (種子、カルスなど)のうちから適宜選択することが できる。この形質転換植物を作製するには、本発明の遺伝子を含有した上記本発明 の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内 のゲノム DNA中に本発明の遺伝子 DNAを導入する方法を採用することができる。 植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクト口 ポレーシヨン法、ァグロバタテリゥム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用 いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本 発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する 方法を採用することもできる。
本発明のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法としては、各種植物、酵母等 の遺伝子ライブラリーを用いて、 YNL275w遺伝子が欠損し、 YNL275wを発現し な ヽ YNL275W破壊酵母を形質転換し、得られた形質転換 YNL275w破壊酵母を ホウ酸含有培地で培養し、該形質転換 YNL275W破壊酵母のホウ酸耐性付与活性 を測定'評価する方法であれば特に制限されるものではなく、ホウ酸耐性付与活性の 測定'評価としては、ホウ酸含有培地における形質転換酵母の生育'増殖の程度の 測定'評価を挙げることができる。また、 YNL275wの破壊株としては、サッカロミセス 'セレビシェ 1169株（Winzeler, E. A.; Shoemaker, D. D.; Astromoff, A.; Liang, H.; Anderson, K.; Andre, B.; Bangham, R.; Benito, R.; Boeke, J. D.; Bussey, H.; Chu, A. M.; Connelly, C; Davis, K.; Dietrich, F.; Dow, S. W.; El Bakkoury, M.; Foury, F.; Friend, S. H.; Gentalen, E.; uiaever, G.; Hegemann, J. H.; Jones, T.; Laub, M.; Liao, H.; Liebundguth, N.; Lockhart, D. J.; Lucau-Danila, A.; Lussier, M.;
M'Rabet, N.; Menard, P.; Mittmann, M.; Pai, C; Rebischung, C; Revuelta, J. L.; Riles, L.; Roberts, C. J.; Ross— MacDonald, P.; Scherens, B.; Snyder, M.;
Sookhai— Mahadeo, S.; Storms, R. K.; Veronneau, S.; Voet, M.; Volckaert, G.;
Ward, T. R.; Wysoc i, R.; Yen, G. S.; Yu, K. X.; Zimmermann, K.; Philippsen, P.; Johnston, M.; Davis, R. W. (1999) Functional characterization of the
Saccharomyces cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285: 901-906)を好適に例示することができる。スクリーニングに用いる酵母は YNL2 75wの破壊株にかぎらず、野生型のものを用いることもできる。
[0034] また、本発明のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法としては、ホウ酸による スプライシングの特異的阻害を標的とし、スプライシング効率の亢進の程度を測定 · 評価する方法を挙げることができ、例えば、被検物質を酵母細胞内で発現させ、ホウ 酸の存在下に、被検物質発現を培養し、酵母におけるイントロン含有遺伝子のホウ 酸によるスプライシングの特異的阻害の改善の程度を、スプライシング効率の亢進の 程度として測定'評価する方法を例示することができる。酵母におけるイントロン含有 遺伝子としては、サッカロミセス'セレピシェゲノム内の必須リボソームのラージサブュ ニットタンパク質をコードする遺伝子である RPL7B遺伝子 (配列番号 33)を具体的に 例示することができる。ホウ酸によるスプライシングの特異的阻害の改善の程度は、 例えば、 RT— PCRにより測定することができ、また、その際、ホウ酸耐性付与遺伝子 である AtRBP47c'遺伝子をポジティブコントロールとすることが好まし!/、。
[0035] 本発明には、上記本発明の DNAのホウ酸耐性付与遺伝子としての使用（方法)や 、上記本発明の DNAのホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製のための使用（ 方法)や、上記本発明のタンパク質のホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質として の使用（方法)や、上記本発明のタンパク質のホウ酸耐性が付与された植物又は酵 母作製のための使用（方法)が包含される。したがって、上記本発明のホウ酸耐性付 与遺伝子やホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質 (ホウ酸耐性付与タンパク質)を 、ホウ酸耐性が付与された植物や酵母の作製に用いることは本発明の実施形態に含 まれる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0036] [供試酵母及びプラスミド]
酵母としては、サッカロミセス'セレピシェ 1169株 (Research Genetics社から購入)と サッカロミセス'セレピシェ BY4741株 (Research Genetics社から購入)を用いた。それ ぞれの遺伝子型は 1169株力 MATa; his3 A l; leu2 A 0; metl5 A 0; ura3 A 0; YNL275w::kanMX4、 BY4741株が MATa; his3 Δ 1; leu2 Δ 0; met 15 Δ 0; ura3 Δ 0で ある。また、プラスミドは pYES2(Invitrogen Genetics社から購入)と pFL61(ドイツ、ホ 一ヘンハイム大学の Nicolaus von Wiren博士から供与； Minet M., Dufour M.-E., and Lacroute F. (1992) Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thaliana cDNAs. Plant J. 2; 417— 422.)を用いた。 pFL61は シロイヌナズナ発現ライブラリーを作製するために用いた。
[0037] [酵母 1169株のホウ酸耐性試験]
使用した酵母 1169株のホウ酸耐性能の検定を行った。 pYES2および pYES2— B ORl (pYES2ベクターの GAL1プロモーターの下流にシロイヌナズナのホウ素而ォ'性 遺伝子 BOR1の CDSを挿入したもの）で形質転換した酵母 1169株のシングルコロ ニーを白金耳でかきとり、 SD液体培地で OD の値が約 1. 0になるまで振とう培養し
600
た。培養液を 0、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、および lOOmMのホウ酸を含 む SD固形培地にそれぞれストリークした。 26. 5°Cで 16日間培養し各培地上で酵母 力 Sコロニーを形成することができるか否かを検定した。
[0038] [ホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング]
シロイヌナズナの発現ライブラリー（ドイツ、ホーヘンハイム大学の Nicolaus von Wiren博士 »り供与； ¾chaaf u., Catoni E., Fits Μ., Schwacke R., Schneider A., von Wiren N., and Frommer W.B. (2002) A putative role for the vacuoler
calcium/ manganese proton antiporter AtCAX2 in heavy metal detoxification. Plant Biol. 4; 612-618.)を用いて酢酸リチウム法により、酵母 1169株を形質転換した。形 質転換酵母は 80mMホウ酸を加えた SD培地（6.7g/l yeast nitrogen base without amino acids, 5g/l ammonium sulfate, 20g/l glucose, 2g/l histidine, 2g/l methionine, 3g/l leucine, 20g/l agar, pH5.5)にストリークし、 26. 5°Cで培養した。 10日力ら 14日 後、コロニーを形成した酵母力 プラスミドを回収した。回収したプラスミドは再度酵母 に導入し、ホウ酸耐性能の再現性を確認した。
[0039] [ホウ酸耐性試験]
スポットアツセィと液体培養による検定を行った。スポットアツセィは次のような手順 で行った。各酵母を SD液体培地で OD の値が 0. 5から 1. 0になるまで 30°Cで振 とう培養した。各酵母の OD の値が等しくなるように SD培地で希釈した。 OD の
600 600 値をそろえた各酵母培養液について 1Z5、 1/25, 1/125,および 1/625希釈し た希釈液を調製した。それぞれの希釈液をホウ酸を加えた SD固形培地と対照として ホウ酸を加えない SD固形培地にピペットマン（Gilson)で 5 /z 1づっ、同一の酵母に関 しては左力も右へと濃度が薄くなるようにスポットした。酵母をスポットしたプレートは 3 0°Cで約 10日間培養し、酵母の生育状況を観察した。
[0040] 液体培養による検定は以下のように行った。各酵母を SD培地で OD の値が約 1
600
. 0になるまで 30°Cで振とう培養した。それぞれの培養液を OD の値が 0. 1となるよ
600
うにホウ酸を含む SD液体培地と対照としてホウ酸を含まな ヽ SD液体培地に植え継 V、だ。 30°Cで振とう培養し、 24時間ごとに OD の値を測定した。
600
[0041] [ホウ酸耐性付与遺伝子のシークェンス]
スクリーニングにより得られた 6つの cDNAクローンの塩基配列の解析は以下のよう に行った。蛍光ダイターミネータ一法でシークェンス反応を行い、 ABI 310 genetic analyzerを用いて塩基配列を解析した。得られた塩基配列から、 TAIR
(http：〃 www.arabidopsis.org/)の BLASTサーチによりその塩基配列のコードする遺 伝子を特定した。
[0042] [ホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング結果]
まず、本実験で使用した酵母 1169株のホウ酸耐性能の検定を行った。 pYES2お よび p YES 2-BOR 1で酵母 1169を形質転換した。 p YES 2と p YES 2— BOR 1を用 いて形質転換したのはこれらのベクター力 次のスクリーニングで用いるシロイヌナズ ナ発現ライブラリーに使われているベクター PFL61と同じ URA3をセレクションマー カーとして保持しているためである。また、 SD培地では pYES— BOR1の BOR1遺伝 子の発現は誘導されな 、ので、 PYES2で形質転換したものと同程度のホウ酸耐性を 示すはずである。 pYES2および pYES2— BOR1で形質転換した酵母をそれぞれ" 2 "および" 7"と命名した。 "2"および" 7"を SD液体培地で振とう培養し、 0、 20、 30、 4 0、 50、 60、 70、 80、 90および lOOmMのホウ酸を含む SD固形培地にストリークし た。その結果、どちらのベクターで形質転換したものも 80mM以上のホウ酸を含む S D培地上ではほとんど生育できないことが明らかになった（図 1)。 [0043] ホウ酸耐性を付与する遺伝子を単離するために、本実験では酵母 1169株で発現 させることによりその酵母を 80mMのホウ酸を含む SD培地上で生育を可能にするこ とができるシロイヌナズナ遺伝子を探索することにした。そこで、シロイヌナズナの発 現ライブラリーで形質転換した約 120万の酵母を、 80mMのホウ酸を含む SD培地に ストリークした。その結果、 80mMのホウ酸に耐性を示す 46、 66、 72、 84、 86、およ び 87の 6つの形質転換酵母を得ることができた。スポットアツセィによる 46、 72、 84、 86、および 87の形質転換酵母のホウ酸耐性能を図 2に示す（66については下記の ように 46と同じ遺伝子をコードしていたので、結果は 46のみ示すこととする)。酵母 1 169株は図 2の上段で示すように 80mMのホウ酸を含む SD培地上ではほとんどコロ ニーを形成できない。一方、これらの形質転換酵母はいずれも 1169株よりも多くのコ 口-一を形成することができた。次に液体培養による試験を行った。液体培養では図 3で示すように、 46、 72、 86、 87ではホウ酸培地中で 1169株に比べ約 3倍の増殖 能を示した。しかし 84では生育速度のばらつきが大きくホウ酸耐性について 1169株 と有為差が見られな力つた。また、これらの遺伝子は酵母 BY4741株に導入した場 合にも 1169株に導入した場合と同様にホウ酸耐性を付与することができた。図 4にス ポットアツセィの結果を図 5に液体培養の結果を示す。 BY4741株に導入した場合 にはすべての形質転換酵母で、液体培養にお!ヽてもホウ酸耐性に有為差が見られ た (図 5)。
[0044] [ホウ酸耐性付与遺伝子のシークェンス]
スクリーニングにより得られた 6つの cDNAクローンの塩基配列を決定し、 BLAST サーチによりそれらのコードしている遺伝子を特定した。その結果、 46と 66は AtPA B2を、 72は AtMYB68を、 84は AtMYB13を、 86は AtRPS20Bを、 87は AtRBP 47と一致することが明らかになった。それぞれの遺伝子の配列は下記の配列表に示 す。 AtPAB2はポリアデ-ル酸結合タンパク質を、 AtMYB13と AtMYB68は MYB 様転写因子を、 AtRPS20はリボソームタンパク質を、 AtRBP47は RNA結合タンパ ク質をコードする遺伝子である。
実施例 2
[0045] [酵母株及びスクリーニング] 本研究には、サッカロミセス'セレピシェ株 BY4741 (MATa his3Dl leu2D0 m etl5D0 ura3D0) , Y01169 (MATa his3Dl Leu2D0 metl5DO ura3DO Y NL275W: : kanMX4)、 Y04443 (MATa his 3D 1 leu2D0 metl5DO ura3DO YGL076C : : kanMX4)、及び Y01094 (MATa his 3D 1 leu2D0 metl5DO ur a3DO YPL198W:： kanMX4)を用いた。 Y01169、 Y04443、 Y01094株は揷 入性変異誘発（insertional mutagenesis)により BY4741から構築し（Winzeler et al, 1999)、 EUROSCARFより入手した。
[0046] 酵母コンビタント細胞は、酢酸リチウム法で (Gietz and Schiestl, 1995)、発現プラス ミド pFL61にクローユングされたシロイヌナズナ cDNAライブラリーと転換した（Minet et al, 1992) o排出型のホウ素トランスポーターであり、対応する野生型株と比較して ホウ酸に感受性を有する YNL275W (以下 BOR1)が欠如しているため、 Y01169 株は宿主として用いられる（データは示されていない）。形質転換体は、 80mMのホ ゥ酸を含む SD固形培地（Sherman, 1991)で、 26. 5°Cでスクリーニングした。 SD培 地は、変異体の成長に必要な 2%グルコース、 0. 67%アミノ酸不含酵母-トロゲン ベース、及び 0. 05%硫酸アンモ-ゥム、変異体の生育に必要なアミノ酸（20mgZL の His、 30mgZLの Leu、 20mg/Lの Met)を含み、 pHは Trisで 5. 5に調整した。 固形の培地を形成するために、寒天（2%w/v)を添加した。非形質転換 Y01169 ( A borl)細胞のコロニー形成は、 80mMのホウ酸の添カ卩によって、完全に抑制され た。転換細胞のうち、 26. 5°Cでの 2週間のインキュベーション後に 80mMのホウ酸を 含む培地でコロニーを形成した細胞を選択し、 80mMのホウ酸の存在下でその生育 を検査して、耐性を確認した。表現型がプラスミドによって付与されていることを確認 するために、プラスミドを陽性単離物（positive isolate)力も単離し、酵母株 Y01169 へと再転換した。耐性分離物は、フルォロォロト酸誘導プラスミドロス (fluoro- orotic acid— induced plasmid lossノ 行 ヽ (BoeKe, J.D., LaCroute, F., & Pink, u.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.)、プラスミド依存性のホウ酸而性を示すクローンだ けを選択した。
[0047] [プラスミドの構築]
AtRBP47c ' '関連遺伝子及び RPL7Bの ORF配列（配列番号 34参照）を、表 1 記載のプライマーセットを用いて、 PCRにより増幅した。増幅産物は、 pGEM-T easy ベクターにサブクローニングした（Promega社製）。これらのプラスミドを Notlで処理し、 結果として生じる AtRBP45a、 AtRBP47b、 AtRBP47c、 AtRBP47c，及び AtU BP1の ORF断片を、発現ベクター pFL61の Notl部位内にクローニングした（Minet et al, 1992) oまた RPL7Bの ORF断片は、発現ベクター pDR195の Notl部位にクロー- ングした（Rentsch et al., 1995)。 pFL61及び pDR195は、発現のためにそれぞれ PGK 及び PMA1プロモーターを保有して ヽる。
[表 1] ene Primer sequences
AtRBP45a 5'-AAAAAGCAGGCTTAAJ，GCAGCAACCACCGTCAAACGCC 3'
5 *-AGAAAGCTGGGTTTCACTGACG l rGCTCCTGATAGTT-3'
AtRBP47a 5，-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACACCAAACAACAACGGT-3 '
5 -AGAAAGCTGGGTTTCAAGAAOCTCCCGGGAC rGCAGC-3'
AtRBP47b 5'-AAAAAGCAGGCTTAATGCAGACAACCAACGGCTCAGAT-3'
5 , -AGAAAG CTGGGTTTCAATrCTCCCCATGATAGTTGlT-3 '
AtRBP47c ' - AA^A AGCAGGCTTAAI GGCAGACGTCAAGATTC A ATCC-3 '
5 ' -AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTI G I 'l'GCTGATGACC-3
AtRBP47c' 5，-AAAAAGCAGGCTTAATGGCAGACGTCAAGGTTCAATCC-3，
5'-AGAAAGCTGGGTTTCAGCTAACTTGTTGCTGATGACC-3'
AtUBPI 5 ;-AAAAAGCAGGCTTAATGCAG.'\ATCAAAGGC lTATTAAG-3'
5 '-AGAAAGCTGGGTTTTACTGATAGTACATGAGCTGCTG-3'
RPL7B 5，-AAAAAGCAGGCTTAATCiTCCACTGAAAAAATCTT-—
5，-AGAAAGCTGGGTTTTAGTTCATAGCCT AACCA-3' [0049] [ホウ酸耐性分析]
AtRBP47c '，関連ファミリー遺伝子のホウ酸耐性を分析するために、発現プラスミ ドをサッカロミセス'セレピシェ株 BY4741に導入した。コントロールとして、挿入のな い空ベクターも、 BY4741に導入した。形質変換体を、 SD液体培地で定常期まで生 育させ、培養物の細胞密度を、 OD = 1. 0に調整した。細胞密度を調整した培養
600
物を、 SD液体培地で 1Z5、 1/25, 1Z125及び 1Z625に希釈し、希釈した培養 液を 10 μ 1、 80mMのホウ酸含有若しくは非含有の SD培地に滴下し、 30°Cで 7日間 インキュベートした。
[0050] 培養液内の分析をするために、形質変換体を SD液体培地で定常期まで生育させ 、 SD液体培地に、 80mMのホウ酸含有若しくは非含有液体培地に希釈し、高濃度 ホウ酸の耐性能を検査するために D を 0. 1に調整した。
600
Δ rpl7a (Y04443)変異体及び Δ rpl7b (Y01094)変異体のホウ酸而性を分析す るために、 2%グルコース、 0. 67%アミノ酸不含酵母-トロゲンベース及び 0. 05% の硫酸アンモ-ゥムを含む SD培地を使用し Trisで ρΗを 5. 5に調整し、必要なァミノ 酸（20mgZLの His、 30mgZLの Leu、 20mgZLの Met及び 20mgZLの Ura)を 追カロした。変異体は、 EUROSCARFより入手した。ホウ酸耐性における RPL7Bの 役割をさらに調べるために、 RPL7Bを酵母株 Y04443で過剰発現させた。ホウ酸耐 性分析は、上記の通り行った。
[0051] [RT— PCRによる非スプライシング転写物の検出]
酵母細胞を、 SD液体培地で対数期 (OD = 0. 5— 1. 0)まで生育し、ホウ酸を最
600
終濃度で 80mM添加した。 30°Cで 24時間インキュベートした後、 1mlのサンプルを 取り出し、細胞を遠心分離により回収し、液体窒素内で凍結し、使用するまで - 80°C で保存した。
[0052] 全 RNAは、 RNeasy Mini Kit (Qiagen社製）を使用して酵母細胞より抽出し、 1 μ gの 全 RNAを MuLV逆転写酵素（Applied Biosystem社製）及びオリゴ（dT) プライマ
16 一を使用して逆転写した。 RT産物の 1Z15を、次のサイクルで PCRを行った： 94°C で 30秒、、 45。Cで 30秒、、 72。Cで 1分間を 40— 50回。 PCRは、 Smart Cycler (Cepheid 社製)で、 DNAポリメラーゼ ExTaq (Takara社製)を使用して行った。この分析で使用 したプライマーセットは、表 2に記載され、 PNASのウェブサイトで補足情報として発 表されている。増幅した転写物を、 2%ァガロースゲル上で分離し、 Etd臭素で染色 後検出した。
[表 2]
Gene Primer sequences
SNR 17A ,V-AATCTGTGTCC;ACCnACTI'C:-3，（Forward)
5 -AGAAGTACATAGGA'rGGG l C-3' (Reverse)
SNR 17B 5 ' - AAAAATTGTCG ACGTACTTC-3 ' (Forward)
5'-AAAGOAAGTTATCACAATTG-3? (Reverse)
YBR230C 5'-CCAGCATCTATriTCTGCAAC-3J (Fomartl)
5'-CGTATCTGGAGTAGTATTTC-3' (Reverse)
VMAtO 5 -GCAAGGTATACAAAGCAGAA-3' (Forward)
5， -TCATCCTTTTTCTTCTCTGC-3 · (Reverse)
SEC27 5'-GACACGATGAAGTTGGATAT-3' (ForwaTd)
5， -TGACTGTCAAATCATCACTG-3， (Reverse)
YNL050C 5，-CAGTATAAAAATGTCTGAAT-3， (Forward)
5 ' -TG GTTG ATTATTTCTTCTTC-3 ' (Reverse)
RPL7B 5，-ATCAACGTCATAAl G'i'CCAC-3，（Forward)
5,-TACCAGAGTTGATTCTTGTC-3J (Reverse) MUDl 5，-ACCTAAAGAAACCATGTCAG-3' (rorward)
5'-TATCAAGGTTGTAC〔； TTTCG-3 ' (Reverse) SNC1 5，-ATGTACAGTCTAAGTCAAGG-.V (Forward)
5 -GACTAAACTGAACAGCAATO-3' (Reverse) POPS 5, -GAGAATGGCAATATTTCAAG-y (Forward)
5 ^TGTTCTTCTTCTTCCAT AC-3' (Reverse) ARP2 5 ' -TGGACCCACATAATCCAATT- ' (Forward)
5'-TTTCGA.^CATTACCTCACAC-3" (Reverse) CNBl 5，-GTGGATGGTCTTTTAGAAGA-3， (Forward)
5'-AACTCCTCGAAACTTAAACCT-3' (Reverse) RPS22B 5 -TATTG AG ACCTTCTTCCAAG-3 ' (Forward)
5，-AAGATTTTACCGGAAACGTG-3，（Reverse) YML025C S'-GACGATAAAAAGAAATTTGGTG- 3' (Forward)
5:-CTCAAAGCGTTGTTCAAAG- 3， (Reverse) TUB3 ' -GAG AG AGGTCATTAGTATTA 31 (Forward)
5，-TTTTCTAATAACAGGGAACC-3' (Reverse)
STO 1 5^GTTT,\ATAG/V\AAAG.\AOAGGA(J-3' ( Forward)
5 -TACfTTCATCAACl AAAAACAI GG-ir (Reverse) KP 10A 5 ' -ACi TGTCCCAAGTGTTCAA-3， (Forward )
5;-ACCCTrACCACCGAA'rnx:-3，（Reverse) SAK 1 5 -σΓΓΟϋΟΑΓΑΤΠΊ ϋθη^Ο-3 ' (Forward)
5，-AAAGGAACGTCCTTCAATTC-3，（Reverse) PMI40 5?-AACAAGCTGTTCAGGTTAGA-3' (Forsvard)
5 ' -GGTTTGTGATTATCATCAGG-3， (Reverse) RPL7A 5 AATTAAAGATCACAATGGCCG- 3' (Forward)
57 -CTTGGTAACTTTGACG A ATG-3 ' (Reverse) YBL091C-A 5'-CAGAAAAGCTGGTGTTCAAG-3; (Forward)
5'-TGATTCTGCATCGTGGTTTC-3? (Rcvcisc) RPL19A 5 ' -TTG ATTAAG A ACTCC AAAGC-3 ' (Fom arc!)
5， -TClTCTCAAGACACGTAATC-3， (Reverse) PCH2 5，-AGATGAGGTTGAAGCAATAG-3，（Forwar
5，-CAAGGGCAAT TCCT ATTG-3' (Reverse)
RPS9B TAAGACT,\AGCAACAATCiCC-3' (Forward)
5 -AAACCCAACTI GTA iA TTC-3， Reverse)
YBK 3DC i ATCTCATAATATGTCTGC^' (Forward)
-TTG n'CJCTAA iACTGTAGAG-3， Reverse)
YDR381C-A
Figure imgf000027_0001
-CTCCTCCTATCTAA.AAAACC-3 ' (Reverse)
Y A1 -AAGAAGAGTTGGX\AGCAAG-3' (Forward)
-CACCGTTTTTGAATGTGATG- (Rev
UBC8 '- AGCGTAATACGAAAGATGAG- 3， (Forward)
，- AGCTTCGTTATTCAAGGGAT-3， (Reverse)
MND1 ， -GTATCATAAA CATTCAACAATG-3 ' (Forward)
-CGGATCTGTTGTTTATTCTC-3' (Reverse)
MER3 -AAACAAAGTTTGATCGCCTC-3， Forward)
，- TCGTGCTCAAACATTTCTTC-3， Reverse)
ERVl '-AAAATGACGC.ATAATCCACC-3' (Forward)
-TTCAAAGTCTTTAGCACACC-3' (Reverse)
SRB2 5，-CAATCCAI CATGGGAAAATC-3' (Forward)
. '-CTTGGACGACAAAATAOTGT ^V (Reverse) MOB I 5 '-AGGACTTCA ATTTCCATGTC 3 ' (Forward)
S'-AGTGTCATCTCCACAATTTG-.V (Reverse) RPS21A -GAAAACGATAAGGGCCAATM (Forward)
5，-CGTTCTTTAACAAACCATCG-3，（Reverse) NYV1 5'-TACCAAATGAAACGCTTTAATG- (Forward)
5 ' -TC1TCATG C AAAG AGTCTAG -3 ' (Reverse) YLR211C 5，-ATGGAATGAGTACTTTAGCG-:V (Forward)
5 ' -CTTCATTTCCG AGTTTTTG G -3 ' (Reverse) TAD3 5 ' - AATAGAAAATCGGCTTCTGC-3 ' (Forward)
5 -TATn"GATCAlTGGGGTTGC-3; (Reverse) ERV41 5 -GArrrGAAGACATn GATGCG-3T (Forward)
5 -TCGCCACTAACTCTATTTAC-3' (Reverse) SPO l 5'-ACCATTTCAOGTACAATGTC- ' (Forward)
S'-CTTCGGAAATATCGAAn CC-ri (Reverse)
YOL04 C 5 ' -CTG AAACG ATACCAACAATG-3- (Forward)
5 -TTTGTGGTITAGGCAATACC-3 (Reverse)
RPS9A 5■ - ATACAAAAGTATACAACATGCC- ' (Forward)
5 ' -T TCCAAGAAATCTTCGACC- ' (Reverse)
CIN2 5'-ClTTACTGCGAAGAXAAAGG-3 ' (Forward)
5 ' -GCCACTATAATCTGTTGTTG-3 ' (Reverse)
YPR098C 5'-TCAAAACTACGGCTCATTTG-3' (Forward)
5'-TGAACAAAAGACTCAATCCG-3' (Reverse)
[0054] [塩耐性分析]
塩耐性分析は、 1. 75M又は 2Mの NaClを含む SD培地を使用した以外は、上記 のホウ酸耐性分析の通りに行った。
[0055] [ァクセッション番号]
実施例 2に記載の配列の、 GenBankァクセッション番号は、以下の通りである。シ ロイヌナズナ配列 AtRBP45a, MN 124872； AtRBP45b , MN101037 ;AtRBP4 5c, MNl 18834 ;AtRBP45d, MN121940 ;AtRBP47a, MN103848 ;AtRBP 47b, MN 112800 ; AtRBP47c , MN103642 ;AtRBP47c' , MN103643 ;AtU BPla, MN104285 ; AtUBPlb, MN101598 ;AtUBPlc, MNl 12266 ;及び サッカロミセス.セレピシェ配列 RPL7A, X62627 ;RPL7B、 Z7355。
[0056] [酵母に高濃度ホウ酸耐性を付与するシロイヌナズナ cDNAクローンの単離結果] サッカロミセス.セレピシェ株 Y01169株をシロイヌナズナ cDNA発現ライブラリー（ Minet, M., Dufour, M.-E., & Lacroute, F. (1992) Plant J. 2, 417- 422.)で形質転換 し、これら形質変換体を 80mMのホウ酸を含むディッシュで選択した。この濃度のホ ゥ酸は、 26. 5°Cでの 2週間のインキュベーション後も、 Y01169細胞のコロニー形成 を完全に抑制した。このスクリーニングで、ホウ酸耐性の亢進を示した酵母のいくつか のコロニーを単離した。 cDNAクローンの 1つが、 RNA結合タンパク質である AtRBP 47c'をコードすることを示した。
[0057] [シロイヌナズナ由来の AtRBP47c'関連遺伝子の発現は、酵母にホウ酸耐性を付 与する]
AtRBP47c，は、 3個の RNA認識モチーフ（RRM)を有する。シロイヌナズナゲノム には、 3個の RRM、及び AtRBP47c'に対して BLASTPプログラムで 100以上の配 列同一性スコアを有するタンパク質をコードする遺伝子が 11種類ある。これらの AtR BP47c，関連ファミリータンパク質の系統榭を図 6Aに示す。
[0058] これらのシロイヌナズナ遺伝子の発現が、酵母にホウ酸耐性を付与するか否かを調 ベるために、 6種類の遺伝子に対応する ORF配列（AtRBP45a、 AtRBP47a、 AtR BP47b、 AtRBP47c、 AtRBP47c，及び AtUBPla)を、発現ベクター pFL61にクロ 一ユングした。プラスミドを酵母株 BY4741に導入し、これらの形質変換体のホウ酸 耐性を調べた。図 6Bに示すように、 6種類のコンストラクト全て力 様々な範囲で、 80 mMホウ酸含有 SD培地で生育する能力を酵母株に付与した。これらの形質変換体 のホウ酸耐性レベルを比較するために、ホウ酸の存在下での生育率を、液体培養で 分析した。全ての形質変換体は、コントロールよりも早い生育率を示した。グラフの中 で、 AtRBP47c，を発現するものがもっとも早 、生育率を示した（図 6C)。
[0059] [ホウ酸処理は、酵母にお!、て RPL7Bのスプライシングを阻害するが、 RPL7Aのス プライシングは阻害しな 、]
本発明者らは、 AtRBP47c'関連遺伝子の過剰発現がホウ酸耐性を付与すること を見い出した。シロイヌナズナのこれらの遺伝子の役割はまだ解明されて 、な 、が、 他の植物種の類似の遺伝子が特徴づけられた。ニコチアナ ·プルギニフォリア（ Nicotiana plumbaginifolia RBP45 (bimpson, C.G., Jennings, S.N., Clark, G.P., Thow, G.， & Brown, J.W.S. (2004) Plant J. 37, 82- 91)及び UBP1 (Lambermon, M.H., Simpson, G.G., Wieczorek Kirk, D.A., Hemmings— Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J. 19,1638- 1649)がスプライシング効率を亢進するこ とが示されている。そこで、 RT— PCRにより任意に選択したサッカロミセス'セレピシェ の 20種類のイントロン含有遺伝子で、スプライシングに対するホウ酸の影響を調べる ことにした。サッカロミセス 'セレビシェゲノム内の 6317種類の核遺伝子の内、 231種 類の遺伝子だけがイントロンを含む（Munich Information Center for Protein
Sequences: http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast)。調べた 20種類の遺伝子のうち、 蓄積された非スプライシング断片とスプライシング断片とを比較すると、ホウ酸処理に よる非スプライシング断片の増加は、必須リボソームのラージサブユニットタンパク質 をコードする遺伝子である RPL7Bで観察された。これは、ホウ酸で処理した酵母に お!、て RPL7Bのスプライシングが阻害されて!、たことを示唆して!/、る（図 7B)。
[0060] RPL7Bは 2個のイントロンを含んでいる。非スプライシング断片のサイズは、これら の断片が、第 1又は第 2いずれかのイントロンのスプライシングによって派生している ことを示している（図 7A参照)。どのイントロンが、ホウ酸に対しより感受性があるかを 調べるために、非スプライシング断片をクローユングし、 8個のクローンの DNA配列を 決定した。 6個及び 2個のクローンがそれぞれ第 1及び第 2のイントロンを含んでいた 。これは、阻害が第 1及び第 2のイントロンの両方で生じ、第 1イントロンが第 2イントロ ンよりも、高濃度ホウ酸に対し感受性があることを示唆した。これらの結果は、 2個のィ ントロンのうち 1個が正しくスプライシングされたこと、すなわち、これらの非スプライシ ング断片がゲノム DNAの汚染によって派生したものではなぐ RNAの逆転写反応に よるちのであることち示して 、る。
[0061] さらにホウ酸による RPL7Bのスプライシング阻害は、 AtRBP47c'を発現する酵母 では観察されな力つた（図 7B)。この結果は、 AtRBP47c'が、高濃度ホウ酸の存在 下で、 RPL7Bのスプライシング効率を上昇させることを示唆している。スプライシング 効率の亢進が、酵母におけるホウ酸耐性の原因である可能性もある。
[0062] RPL7Bは酵母ゲノムにパラログ RPL7A (配列番号 32)を有する。 RPL7A遺伝子
(配列番号 31)は、 RPL7B遺伝子のように 2個のイントロンを有する。 RPL7Aのスプ ライシングに対するホウ酸の影響を調べた。 RPL7Bの場合と異なり、ホウ酸によるス プライシング阻害は観察されな力つた（図 7C)。
[0063] [酵母における RPL7Aの破壊によりホウ酸耐性が減少する]
RPL7A及び RPL7B二重破壊された変異体は致死性であり（Saccharomyces Genome Database: http://db.veastgenome.org)、 RPL7タンパク質が酵母の生育に 必須であることを示して 、る。 2つの遺伝子におけるスプライシングに対するホウ酸感 受性の相違を考慮すると、 RPL7A破壊変異体と RPL7B破壊変異体のホウ酸耐性 が異なる可能性がある。 Arpl7b (Y01094)は、野生型サッカロミセス'セレピシェと 同等のホウ酸耐性レベルを示した力 Arpl7a (Y04443)のホウ酸耐性は、野生型よ りも低力つた（図 8A)。ホウ酸耐性の相違は、液体培養でも明らかであった（図 8B)。 これらの結果は、ホウ酸による RPL7Bスプライシング阻害は、 Arpl7aのホウ酸耐性 の減少によるものであることを示唆している。
[0064] [RPL7A破壊酵母におけるイントロンレス RPL7Bの発現によりホウ酸耐性が上昇す る]
Arpl7aのホウ酸耐性の減少力 RPL7Bスプライシング阻害による RPL7タンパク 質レベルの減少によるものだとすれば、イントロンレス RPL7BcDNAの発現は、 Arp 17aの耐性を上昇させるはずである。
Arpl7aにおけるイントロンレス RPL7Bの発現力 ホウ酸耐性を上昇させるかどうか を調べた。 RPL7Bの ORF配列を、発現ベクター pDR195にクローユングした。次にプ ラスミドを Arpl7aに導入し、形質変換体のホウ酸耐性を調べた。図 8Cに示すように 、イントロンレス RPL7Bの発現は、 Arpl7aのホウ酸耐性を上昇させた。この結果は、 RPL7Bスプライシングの阻害力 Arpl7aの高濃度ホウ酸による生育休止の原因で あることを示している。
[0065] [ホウ酸処理による、非典型的分岐点配列（noncanonical branchpoint sequnce)を含 む遺伝子におけるスプライシング阻害の分析結果]
RPL7Bは、第 1イントロンに非典型的分岐点配列を有する（表 3参照)。 231種類の 核イントロン含有遺伝子の内、このような非典型的分岐点配列を含む遺伝子を 28種 類見い出した。この 28種類の遺伝子の内、スプライシング断片と比較して、ホウ酸処 理による非スプライシング断片のレベルの上昇は、 9種類の遺伝子で観察された（図 9)。これらの遺伝子は、 ERV1、 ERV41、 NYV1、 RPS9A、 RPS9B、 SRB2、 YO L048C、 YPR098C及び YRA1である。
[0066] [表 3] 5' splice site Branchpoint 3' splice site
Consensus sequence GUAUGU UACUAAC YAG
First intron GUAUGU U國 CUAAC UAG
Second intron GUAUGU UACUAAC UAG
[0067] 表 3には、酵母において確認された 3個のコンセンサス配列、 5'スプライス部位、分 岐点及び 3'スプライス部位が示されている。第 1イントロンの分岐点での Aから Gへの トランジシヨン点を、黒地に白い文字で示す。 Yは、ピリミジンリボヌクレオチド（C又は U)を指す。
[0068] ホウ酸による、これらの遺伝子のスプライシング阻害に対する AtRBP47c'の過剰 発現の影響を分析した。図 9に示すように、 NYV1及び SRB2のスプライシング阻害 のレベルは、 AtRBP47c'を発現する酵母で障害された。 NYV1及び SRB2は、そ れぞれ V— SNAREタンパク質及び RNAポリメラーゼ IIホロ酵素タンパク質をコードし ている。これらの結果は、 AtRBP47c'の過剰発現が酵母にホウ酸耐性を付与するメ 力-ズムは、スプライシング効率の亢進であることを強く示唆して 、る。
[0069] [塩処理による影響は、ホウ酸処理による影響と異なる]
スプライシング因子遺伝子の過剰発現は、酵母及び Z又は植物に塩耐性を付与 する（Forment, J., Naranjo, M.A., Roldan, M., Serrano, R.， & Vicente, O. (2002) Plant J. 30,511—519., 2002; Serrano, R., Gaxiola, R., Rios, G., Forment, J., Vicente, O" & Ros, R. (2003) Monatsh. Chem. 134, 1445-1464.)。 AtRBP47c，関 連遺伝子も、酵母に塩耐性を付与するか否かを調べた。本研究で検査した 6種類の AtRBP47c'関連遺伝子全てで、酵母における塩耐性が上昇しなカゝつた（図 10A)。 さらに、高濃度の塩 (high salt)に曝された細胞では RPL7Bのスプライシング阻害は 観察されなかった（図 10B)。これらの結果は、 AtRBP47c'関連遺伝子が塩耐性で は機能せず、 RPL7Bスプライシングの阻害がホウ酸処理に独特なものであるかのよ うである。
[0070] [考察] AtRBP47c'は、酵母の補完によって酵母細胞にホウ酸耐性を付与する遺伝子と してシロイヌナズナから単離した。酵母ゲノムにおいて、 3個の RRM、及び AtRBP4 7c'に対して BLASTPプログラムで 100以上の配列同一性スコアを有するタンパク 質をコードする遺伝子が 7種類ある。これらの遺伝子のうち、 AtRBP47c'にもつとも 類似した遺伝子は、 NAM8である。 NAM8は、本来ミトコンドリアのスプライシング欠 如の抑制剤として単離されたが（Ekwall, K., Kermorgant, M., Dujardin, G.，
Groudinsky, O., & Slonimski, P.P. (1992) Mol. Gene. Genet.233, 136- 144.)、その 後の分析により、 NAM8が UlsnRNAと相互作用し、非典型的な 5'スプライス部位 の存在によって、このプロセスが障害されている場合に、 NAM8が 5，スプライス部位 の効率的な認識に必須であることを示した（Gottschalk, A., Tang, J., Puig, O., Salgado, J., Neubauer, G., Colot, H.V., Mann, M., Seraphin, B., Rosbash, M., Luhrmann, R., & Fabrizio, P. (1998) RNA 4, 374—393.; Puig, 0., Gottschalk, A., Fabrizio, P., & Seraphin, B. (1999) Gene. Dev.13, 569-580.) 0これらの観察結果より 、 AtRBP47c'がホウ酸耐性において NAM8と同様の役割をすると仮定した。しかし 、 NAM8の過剰発現は、酵母にホウ酸耐性を付与せず、 NAM8破壊変異体は、野 生型と同様、ホウ酸耐性を示し、 AAtRBP47c'が、スプライシングプロセスの他の段 階及び Z又はホウ酸耐性の他の反応（1又は複数）に関与している可能性を示した。 本研究において、酵母内で任意に選択した 20種類の遺伝子で、ホウ酸力 ¾PL7B のスプライシングを阻害することができることを見い出した（図 7B)。この遺伝子の第 1 イントロンの DNA配列分析により、第 1イントロンが分岐点のコンセンサス配列にトラ ンジシヨンを有することが明らかになった。表 1に示すように、分岐点コンセンサス配 列における 2番目の Aは、 RPL7Bの第 1イントロンで Gに転換されている。分岐点架 橋タンパク質（Branchpoint bridging protein (BBP)の分岐点への結合は、スプライシ ングの進行における重要なステップである（Abovich and Rosbash, 1997) 0 BBPと分 岐点配列間の親和性は、スプライシング効率の重要な要因であることが知られて 、る (Champion-Arnaud, et al.， 1995)。特に、このような、分岐点配列の第 2ヌクレオチド における Aから Gへの転換は、 BBPとの親和性を約 10%減少させることが報告され ている（Berglund, J.A., Chua, K., Abovich, N" Reed, R" & Rosbash, M. (1997) Cell 89, 781-787.) oしたがって、 RPL7Bは、スプライシング効率の低い遺伝子の一つで あるようである。
[0071] Hela細胞のインビトロスプライシングシステムにおいて、スプライシングの第 2ステツ プカ ホウ酸処理によって阻害されていることが報告されている（Shomron, N.， & Ast, G. (2003) FEBS Lett. 552, 219-224.)。スプライシングの第 2ステップは、処理された ェクソンの 3，末端力 次のエタソンの 5，末端に結紮するプロセスである。ホウ酸が、 ci s— diolとリボースで結合すること（Ralston, N.V.C., & Hunt, CD. (2000) FASEB J. 14, A538.; Nicholas et al, 2001; Ricardo, A., Carrigan, M.A., Olcott, A.N., & Benner, S.A. (2004) Science303, 196.)を考慮すると、スプライシングの第 2ステップに おける結紮反応は、ホウ酸のエタソンの 3 '末端への結合により阻害されているようで ある。上記 Shomron and Ast (2003) は、 5つの異なる mRNA前駆物質が同様の阻害 を示したため、第 2ステップにおけるホウ酸によるスプライシング阻害が一般的な現象 であると考えられると報告している。その場合、酵母におけるスプライシング阻害は、 同様に全てのイントロンで起きるはずである。しかし、本研究の最初のステップで検査 した 20種類の遺伝子のうち、阻害が観察された遺伝子は、 RPL7Bだけであった（図 7B)。
[0072] この特異的な阻害は以下のように説明することができる。第 2ステップにおけるホウ 酸によるスプライシング阻害は、酵母の全てのイントロン含有遺伝子で起きる。このス テツプにおいて、イントロン含有スプライシング媒介物は、スプライシングが通常に進 行した場合に即座に減少しなければならないところ、累積する。媒介物の累積は、通 常の代謝回転を阻害する。このような場合、スプライシング効率の低いイントロンを有 する遺伝子は、ホウ酸によるスプライシング阻害に対する感受性が強いようである。こ のような遺伝子の 1つの例として、 RPL7Bのような、非典型的分岐点配列を含む遺 伝子が挙げられる。この推測を、同じ特徴を持つ他の遺伝子で、高濃度ホウ酸による スプライシング阻害を分析して、確かめた（図 9)。この分析で、高濃度ホウ酸処理は、 RPL7B以外の非典型的分岐点配列を含む 9種類の遺伝子でスプライシングを阻害 することを見い出した。この結果は、ホウ酸の毒性のメカニズムの 1つが、スプライシン グ効率の低いイントロンを有する遺伝子のスプライシング阻害であることを明確に示し た。さら〖こ、これら 9種類の遺伝子の内、 2種類の遺伝子のスプライシング阻害力 At RBP47c'の過剰発現により障害されていることを見い出した（図 9)。この結果は、 At RBP47c'の過剰発現によるホウ酸耐性力 高濃度ホウ酸処理中にスプライシングが 阻害されている複数の遺伝子の一部の遺伝子のスプライシング効率の亢進によって 達成されるカゝもしれないことを示唆している。したがって、限定された数の遺伝子のス プライシング阻害は、生育阻害の原因である力もしれな 、。
[0073] AtRBP47c，関連タンパク質は、 3個の RRMを有する。 RBP45、 RBP47及び N. plumbaginifolia の UBP1の RNA結合活性が確認された。これらのタンパク質全てが 、 U— rich配列と結合する傾向にある (Lambermon, M.H., Simpson, G.G., Wieczorek Kirk, D.A., Hemmings— Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J.
19, 1638-1649.： Lorkovi?, Z.J., Wieczorek Kirk, D.A., Klahre, U.,
Hemmings- Mieszczak, M., & Filipowicz, W. (2000). RNA 6, 1610—1624.)。さらに、 N. plumbaginifoliaの RBP45の欠失分析は、 RNAとの相互作用に少なくとも 2個の RR Mが必要であることを示した（Lorkovic et al.， 2000)。 RRMが RNA結合に関与して V、ると思われてきた力 一定のタンパク質の RRMが他のタンパク質との相互作用に 参画していることが示された（Kielkopf, CI., Lucke, S., & Green, M.R. (2004) Gene Dev. 18, 1513-1526.)。特に、 3個の RRMを含むスプライシング因子である酵母 U2 AF65は、 3番目の RRMが BBPに結合することが報告されている（Rain, J.C., Rafi, Z.，
Rhani, Z.， Legrain, P., & Kramer, A. (1998) RNA 4, 551-565.)。これらの結果は、 A tRBP47c'力 ¾BPとも相互作用する可能性を示唆している。さらに RBP7Bの第 1ィ ントロン及び SRB2イントロン配列の分析は、分岐点の 3，末端側に U— rich配列があ ることを明らかにした。これらの結果を合わせると、 AtRBP47c'は BBPと結合して、 BBPと分岐点の相互作用を安定ィ匕し、分岐点の U— rich配列を安定ィ匕すると仮定し た。その結果、スプライシング効率が増加する。
[0074] スプライシングが、塩ストレスによって阻害されることが報告されている。さらに、 SR タンパク質等の複数のスプライシング因子の過剰生産力 S、酵母や植物における塩耐 性を増加することも報告されている（Forment, J., Naranjo, M.A., Roldan, M., Serrano, R., & Vicente, O. (2002) Plant J. 30,511—519." 2002; Serrano, R., Gaxiola, R.， Rios, G.， Forment, J., Vicente, O., & Ros, R. (2003) Monatsh. Chem. 134, 1445-1464.)。本研究においては、 AtRBP47c'関連遺伝子の過剰発現は、酵母に 塩耐性を付与せず（図 10A)、 RPL7Bのスプライシング阻害は、塩処理後に検出さ れなかった（図 10B)。これらの結果は、スプライシング阻害のメカニズムは、塩処理と ホウ酸処理とでは異なることを示唆して 、る。
[0075] 実施例 2は、ホウ酸の毒性メカニズムの鍵力 スプライシングの特異的阻害であり、 スプライシング効率の亢進に関連する遺伝子は、ホウ酸耐性を導くことを示す最初の 報告である。しかし、スプライシングの阻害以外の毒性のメカニズムが存在するはず である。なぜなら、ホウ酸の毒性の影響が、スプライシングを行わない原核生物でも 観察されるからである。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]酵母 1169株を用いたホウ酸耐性能の結果を示す図である。酵母 1169株を pY ES2"2"および pYES2— BORI"7"で形質転換した。それぞれの酵母を 0から 100m Mのホウ酸を含む SD培地にストリークした。 26. 5°Cで 16日間培養した結果を示す。
[図 2]ホウ酸過剰培地での酵母 1169株の生育の結果を示す図である。酵母 1169株 を 46, 72, 84, 86および 87で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、 80m Mのホウ酸を含む SD培地にスポットした。スポットは左から右に 1Z5づっ希釈してい る。 26. 5°Cで 9日間培養した結果を示す。
[図 3]液体培地での酵母 1169株のホウ酸耐性試験の結果を示す図である。酵母 11 69株を 46, 72, 84, 86および 87で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、 OD の値が 0. 1となるように 80mMのホウ酸を含む SD培地に植え継いだ。 30°C
600
で 4日間培養し、 OD の値を測定した。実験は 3回行った。平均値と標準偏差のグ
600
ラフで示す。
[図 4]ホウ酸過剰培地での酵母 BY4741株の生育の結果を示す図である。酵母 BY4 741株を 46, 72, 84, 86および 87で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後 、 lOOmMのホウ酸を含む SD培地にスポットした。スポットは左から右に 1Z5づっ希 釈している。 26. 5°Cで 10日間培養した結果を示す。 [図 5]液体培地での酵母 BY4741株のホウ酸耐性試験の結果を示す図である。酵母 BY4741株を 46、 72, 84、 86,および 87で形質転換した。それぞれの酵母を液体 培養後、 OD の値が 0. 1となるように 80mMのホウ酸を含む SD培地に植え継いだ
600
。 30°Cで 4日間培養し、 OD の値を測定した。実験は 3回行った。平均値と標準偏
600
差をグラフで示す。
[図 6]AtRBP47c，関連遺伝子軽質転換酵母細胞のホウ酸耐性の結果を示す図で ある。（A)AtRBP47c'関連ファミリー遺伝子の系統樹。デンドログラムは、 AtRBP4 7c'関連ファミリータンパク質の、相対的な進化距離を示し、 NJ法を用いて作成した。 バーは、 0. 1アミノ酸置換 Z部位の遺伝的距離を示す。（B)固形培地におけるホウ 酸耐性。酵母細胞を OD が 1. 0になるまで生育し、連続的に希釈し、次に 10 1を
600
0又は 80mMのホウ酸を添カ卩した SD皿に滴下した。生育は、 10日間の培養後記録 した。空ベクター pFL61で転換した酵母細胞を、コントロールとして用いた。（C)液体 培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞を OD が 1. 0になるまで生育し、 0又は 80m
600
Mのホウ酸を添加した SD培地内で OD が 0. 1になるまで希釈した。希釈した酵母
600
細胞を、 30°Cで培養し、希釈後の記載された時間 OD の値を記録した。縦のバー
600
は、 3回の測定の平均値士平均値の標準偏差を示す。
[図 7]スプライシングにおけるホウ酸の影響を示す図である。（A)RPL7Bのスプライシ ングの略図。 3種類の mRNAを、スプライシングによって RPL7Bの pre— mRNAから 産出できる。矢頭は、 RT— PCRに使用したプライマーの位置を指している。 (B)RPL 7Bのスプライシングに対するホウ酸の影響。酵母細胞を OD が 1. 0になるまで生
600
育し、最終濃度が 80mMとなるようホウ酸を添加した。 24時間後、酵母細胞を回収し 、全 RNAを単離した。 cDNAは、全 RNAから合成し、 PCRによるスプライシング分 祈のテンプレートとして用いた。この分析では、空ベクター pFL61で転換した酵母株 B Y4741 (野生型）又は AtRBP47c'発現ベクター（AtRBP47c' )を用いた。（C)RP L7Aのスプライシングに対するホウ酸の影響。 RPL7Aのスプライシングを PFL61で 転換した BY4741で、 RT— PCRにより分析した。
[図 8]RPL7A又は RPL7B破壊酵母細胞のホウ酸耐性の結果を示す図である。（A) 固形培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞を OD が 1. 0になるまで生育し、連続的 に希釈し、次に 10 1を 0又は 80mMのホウ酸を添カ卩した SD皿に滴下した。生育は 、 7日間の培養後記録した。 (B)液体培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞を OD が
600
1. 0になるまで生育し、 0又は 80mMのホウ酸を添カ卩した SD培地内で OD が 0. 1
600 になるまで希釈した。希釈した酵母細胞を、希釈後 30°Cで 21時間（SD)及び 60時 間（SD+80mMのホウ酸）培養し、その後 OD の値を記録した。縦のバーは、 3回
600
の測定の平均値士平均値の標準偏差を示す。 Arpl7a及び Arpl7bは、それぞれ、 RPL7A破壊変異体 (Y0443)及び RPL7B破壊変異体 (Y01094)を表す。（C)RP L7A破壊酵母におけるホウ酸耐性に対する RPL7Bの過剰発現の影響。酵母細胞 を OD が 1. 0になるまで生育し、連続的に希釈し、次に 10 μ 1を 0又は 80mMのホ
600
ゥ酸を添加した SD皿に滴下した。生育は、 5日間の培養後記録した。空ベクター PFL61で転換した酵母細胞を、コントロールとして用いた。
圆 9]非典型的分岐点配列を含む遺伝子のスプライシングに対するホウ酸の影響を 示す図である。 酵母を OD が 1. 0になるまで生育し、次にホウ酸を最終濃度が 80
600
mMとなるよう添加した。 24時間後、酵母細胞を回収し、全 RNAを単離し、 PCRによ るスプライシング分析のテンプレートとして用いた。この分析では、空ベクター pFL61 で転換した酵母株 BY4741 (野生型）又は AtRBP47c'発現ベクター（AtRBP47c' )を用いた。白と黒の矢頭は、それぞれ、非スプライス断片、スプライス断片を指す。
[図 10]AtRBP47c'関連遺伝子転換酵母細胞の生育と、 RPL7Bのスプライシングに 対する塩の影響を示す図である。（A)固形培地における塩耐性。酵母細胞を OD
600 が 1. 0になるまで生育し、連続的に希釈し、次に 10 1を 0、 1. 75又は 2Mの NaCL を含む SD皿に滴下した。生育を培養 7日後に記録した。空ベクター pFL61で転換し た酵母細胞を、コントロールとして用いた。（B)RPL7Bのスプライシングに対する塩 の影響。酵母細胞を OD が 1. 0になるまで生育し、最終濃度がそれぞれ 2M又は 8
600
OmMとなるよう、 NaCl又はホウ酸を添カ卩した。 24時間後、酵母細胞を回収し、全 R NAを単離した。 cDNAを全 RNAより合成し、 PCRによるスプライシング分析のテン プレートとして使用した。

Claims

請求の範囲
[I] 酉己列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示さ れるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードする DNA
[2] 酉己列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示さ れるアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードする DNA0
[3] 配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示され る塩基配列若しくはその相補的配列力 なるホウ酸耐性付与遺伝子 DNA。
[4] 配列番号 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,又は 29に示され る塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配 列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[5] 請求項 3記載の DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつホウ酸耐性 付与活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[6] 酉己列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示さ れるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質。
[7] 酉己列番号 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,又は 30に示さ れるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され たアミノ酸配列力もなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質。
[8] 請求項 1一 5のいずれか記載の DNAを含み、かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現 することができる糸且換えベクター。
[9] 請求項 8記載の組換えベクターが導入され、かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現 する形質転換体。
[10] 形質転換体が酵母であることを特徴とする請求項 9記載の形質転換体。
[I I] 形質転換体が植物であることを特徴とする請求項 9記載の形質転換体。
[12] 遺伝子ライブラリーを用いて、 YNL275w遺伝子が欠損し、 YNL275wを発現しな Vヽ YNL275W破壊酵母を形質転換し、得られた形質転換 YNL275W破壊酵母をホ ゥ酸含有培地で培養し、該形質転換 YNL275W破壊酵母のホウ酸耐性付与活性を 測定'評価することを特徴とするホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法。
[13] ホウ酸によるスプライシングの特異的阻害を標的とし、スプライシング効率の亢進の 程度を測定'評価することを特徴とするホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法
[14] 被検物質を酵母細胞内で発現させ、ホウ酸の存在下に、被検物質発現を培養し、酵 母におけるイントロン含有遺伝子のホウ酸によるスプライシングの特異的阻害の改善 の程度を、スプライシング効率の亢進の程度として測定'評価することを特徴とする請 求項 13記載のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法。
[15] 酵母におけるイントロン含有遺伝子が、サッカロミセス'セレピシェゲノム内の RPL7B 遺伝子であることを特徴とする請求項 14記載のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリー- ング方法。
[16] 請求項 1一 5のいずれか記載の DNAのホウ酸耐性付与遺伝子としての使用。
[17] 請求項 1一 5の 、ずれか記載の DNAのホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製 のための使用。
[18] 請求項 6又は 7記載のタンパク質のホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質としての 使用。
[19] 請求項 6又は 7記載のタンパク質のホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製のた めの使用。
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