WO2005085437A1

WO2005085437A1 - 変異バチルス属細菌

Info

Publication number: WO2005085437A1
Application number: PCT/JP2005/003756
Authority: WO
Inventors: Keiji Endo; Katsuya Ozaki
Original assignee: Kao Corporation
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2005-03-04
Publication date: 2005-09-15
Also published as: DK1721973T3; EP1721973A4; EP1721973A1; CN1930289A; US20090170154A1; DE602005021757D1; US7855065B2; EP1721973B1; CN1930289B

Abstract

　タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする変異バチルス属細菌、また当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供する。　ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌、当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法。

Description

変異バチルス属細菌

技術分野

[0001] 本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。

背景技術

[0002] 微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種ィ匕成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている

[0003] こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。一方、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、特に最近では、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。遺伝子組換え技術を用いた生産菌育種の方法として、遺伝子の発現を調節する転写因子、特に RNAポリメラーゼのシグマ因子を増強する例が知られており、例えば、シユードモナス ·フルオレセンス (Pseudomonas fluorescens)にお!/、て、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子 (ノヽウスキーピングシグマ因子）をコードする m^D遺伝子のコピー数を増加させることにより pyoluteorinや 2 , 4 diacetylphloroglucinol等の抗生物質の生産量を増加させた報告例（例えば、非特許文献 1参照）や、コリネパクテリゥム，グルタミカム（Corvnebacterium glut amicus)にお!/、てハウスキーピングな^ kA遺伝子を過剰発現させることにより Lーリジンの発酵生産量を増加させた報告例 (例えば、特許文献 1参照)などがある。

[0004] し力しながら、これらはいずれも栄養増殖期に於いてハウスキーピングシグマ因子遺伝子の発現を増強するものであった。また、枯草菌 (Bacillus subtilis)をはじめとするバチルス属細菌においては、シグマ因子を増強することによって有用物質の生産量を増加させると、う報告はこれまでにな、。

特許文献 1：国際公開第 2003Z054179号パンフレット

非特許文献 1 :J. Bacteriol. , 177, 5387, (1995)

発明の開示

[0005] 本発明は、 dsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなる DNAを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌を提供するものである。

[0006] また本発明は、当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供するものである。

[0007] また本発明は、 ^kA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなる DNAを、バチルス属細菌のゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築することを特徴とする変異バチルス属細菌の構築方法を提供するものである。

図面の簡単な説明

[0008] [図 1]胞子形成過程における逐次的シグマ因子の活性ィ匕を示した模式図である。

[図 2]本発明 sigA遺伝子の構築例を示した概念図である。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする変異バチルス属細菌、また当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。

[0010] バチルス属細菌は、 RNAポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子力シグマ因子以外の複数サブユニットから成る RNAポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによつて、ゲノム上に数千個存在する遺伝子にっヽて、状況に応じた遺伝子の発現制御を行って！/ヽると考えられてヽる。例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については 17個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子 (ハウスキーピングシグマ因子)である SigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子 SigH、 SigF, SigE、 SigG、 SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子 SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子 SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子 SigBや ECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在; ^知られている ( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to し ells, Edited by A. L. Sonenshein, American Societ y for Microbiology, pp289, (2002) )。

これらの中で、胞子形成過程を制御するシグマ因子は、図 1に示す様に胞子形成過程の進行に伴って順次発現'活性化されることが知られている。即ち、枯草菌が栄養飢餓状態に陥ると、まずリン酸リレー系と呼ばれる複数のタンパク質間での多段階リン酸伝達系を経て胞子形成開始制御因子である SpoOAのリン酸化が引き起こされる（Cell, 64, 545, (1991) )。リン酸ィ匕 SpoOA(SpoOA— P)の濃度上昇に伴 V、、 SigHの構造遺伝子 (sieH)の発現を抑制して!/、るリプレッサー AbrBの誘導が抑制され、結果的に^ iの転写が SigA依存的に誘導される (J. Bacteriol. , 173 , 521, (1991) )。 SigHが活性化された後、非対象隔膜形成により枯草菌の細胞質は母細胞側と娘細胞側に分割され、次ヽで娘細胞側で SpoOA— Pと SigHが共役して SigFの構造遺伝子 (sieF)を含むオペロン (s。oIIAA— s。oIIAB— sieF)の転写を誘導し（Gene, 101, 113, (1991) )、母細胞側では SpoOA— Pと SigAが共役して SigE前駆体の構造遺伝子 (sigE)を含むオペロン (spoIIGA-sigE)の転写を誘導する（J. Bacteriol. , 169, 3329, (1987) )。 SigFはアンチシグマ因子 SpoIIAB及びアンチアンチ—シグマ因子 SpoIIAA、更に SpoIIAAの脱リン酸化酵素である SpoIIEにより活性化を制御されており（Genes Cells, 1, 881 (1 996) )、活性ィ匕した SigFはシグナル伝達タンパクである SpoIIRの構造遺伝子 IR)の転写を誘導する。娘細胞側から分泌された SpoIIRは母細胞側の非対象隔膜に局在する SigE前駆体活性ィ匕プロテアーゼである SpoIIGAを活性ィ匕し、これによつて SigEの活性化が起こると考えられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 92, 2012, (1995) )。

[0012] 更に娘細胞側では SigFが SigGの構造遺伝子 (sigG)の転写を誘導し、母細胞側では SigEが SigKの構造遺伝子 (sigK)の転写を誘導するが、娘細胞側での SigGの活性ィ匕は母細胞側での SigEの活性ィ匕の後に起こり、母細胞側で SigKの活性ィ匕はこの後に起こる（Mol. Microbiol. , 31, 1285, (1999) )。

[0013] 栄養増殖期には主として SigAが RNAポリメラーゼコア複合体と会合して、 SigAが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導している力上記の様な機構により、胞子形成期に入って他のシグマ因子が活性化されると、 RNA ポリメラーゼコア複合体と会合するシグマ因子の置換が起こり、 SigAと会合する RN Aポリメラーゼの量は相対的に低下することが報告されている (J. Bacteriol. , 17 9, 4969, (1999) )。この為、胞子形成期以降、 SigAにより認識されるプロモーター力の転写量は相対的に低下するものと考えられる。

[0014] 斯カる状況の下、本発明者らは、胞子形成期において特異的に認識、発現されるプロモーター配列を、主に栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子である SigAの遺伝子に連結させることにより、 SigAの遺伝子の発現を栄養増殖期後の胞子形成期において増強することができ、当該シグマ因子と RNAポリメラーゼコア複合体との結合量を増加させ、これによつて胞子形成期以降の異種タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上が図れることを見出した。

[0015] 本発明の微生物によれば、該異種タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができる。

[0016] 本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、 Lipman— Pearson法（ Science, 227, 1435, (1985) )によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェア Genetyx— Win (ソフトウェア開発）のホモロジ一解析 (Search ho mology)プログラムを用いて、 Unit size to compare (ktup)を 2として解析を行うこと〖こより算出される。

[0017] 本発明の変異バチルス属細菌は、 skA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなる DNAを、そのゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築したものである。 [0018] 斯カる変異バチルス属細菌を構築するための親微生物としては、胞子形成を行うことを特徴とするバチルス属細菌であれば、その由来は限定されず、野生型のものでも変異を施したものでもよヽ。中でも本発明にお、て用いられるバチルス属細菌の好ましい例は、全ゲノム情報が明らかにされている、枯苣菌（Bacillus subtilis)、バチルス 'セレウス（Bacillus cereus)、バチルス'ノヽロドランス（Bacillus halodulans)などが挙げられ、特に、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から枯草菌が好ましい。

[0019] 枯草菌の sA遺伝子とは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をいい、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、更に好ましくは 95% 以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を示す。

[0020] 斯かる^ kA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、胞子形成期特異的に認識、転写されるプロモーター配列を連結するが、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としては、天然由来のものでも、天然由来を改変したものでも、或いは化学合成したものでも良い。

[0021] 例えば枯草菌においては、以下（1)一（6)の何れかの特徴をもつプロモーター配列が挙げられる。

(1) SpoOA— P濃度の上昇に伴って AbrBによる転写抑制が解除され、且つ SigA にて認識、転写されるプロモーター配列

(2) SigHにて認識、転写されるプロモーター配列

(3) SigFにて認識、転写されるプロモーター配列

(4) SigEにて認識、転写されるプロモーター配列

(5) SigGにて認識、転写されるプロモーター配列

(6) SigKにて認識、転写されるプロモーター配列

[0022] 一般に、シグマ因子は転写開始点の上流 10塩基及び 35塩基付近に存在する数塩基の配列を認識して結合するとされており、それぞれ- 10領域、—35領域と呼ばれている。両領域の配列、両領域間の距離は、シグマ因子毎にそれぞれ共通な特徴を持つことが知られており、コンセンサス配列と呼ばれている。従って、前記（1)一（6) のプロモーター配列には、（l ' ) SpoOA— P濃度の上昇に伴って AbrBによる転写抑制が解除され、且つ SigAのコンセンサス配列を含む配列、（2，）SigHのコンセンサス配列を含む配列、（3，）SigFのコンセンサス配列を含む配列、（4，）SigEのコンセンサス配列を含む配列、（5，） SigGのコンセンサス配列を含む配列、（6， ) SigKのコンセンサス配列を含む配列等が例示できる。

これまでに報告されている枯草菌各シグマ因子のコンセンサス配列を表 1に示す。

[0023] [表 1]

[0024] (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells,

Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiolog y, pp289, (2002) )

配列中、 Rは Aまたは G、 Wは Aまたは T、 Nは任意の塩基をそれぞれ示す。また大文字は保存性が高く、小文字は保存性が低、ことを表す。

[0025] また、これまでに報告されて、る AbrBの認識結合配列は、 WaWWtttWCAAaaa aW (Wは Aまたは Tを示す。また大文字は保存性が高ぐ小文字は保存性が低いことを示す）で表される（J. Bacteriol. , 177, 6999, (1995) )。

以上の様に、本発明に於ける胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモータ一配列とは、前記（1)一（6)、或いは（1 ' )一（6 ' )の何れかの特徴を有するものである。 [0026] (1)または（ )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 2に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（2 )または（2' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 3に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（3) または（3 ' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 4に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（4)または (4' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 5に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（5)または（5 ' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 6に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（6)または（6 ' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 7に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられる。

[0027] 尚、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、 Nature, 390, 249— 256, (19 97)で報告され、 JAF AN : Japan Functional Analysis Network for Bacill us subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http:ZZbacillus. genome, ad. jpZ、 2003年 6月 17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。

[0028] [表 2]

[0029] (Bacillus subtilis and other gram— positive bacteria ; biochemistry. physiology, and molecular genetics, Edited by A. L. Sonenshein , American Society for Microbiology, pp757, (1993)、 J. Bacteriol. , 177, 6999, (1995) )

表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。

[0030] [表 3]

[0031] (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells,

Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiolog y, pp289, (2002) )

[0032] [表 4] 遗伝子名遺伝子番号

aach BG10295

bofC BG1 191 7

gerAA BG10385

gpr BG10438

katX BG1 1945

sspN BG14179

spoIIQ BG1 1978

spoIIR BG10937

spoIIIG BG10236

spoIVB BG1031 1

ywhE BG12459

yhcN BG1 1592

lonB BG1 1077

[0033] (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells,

Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiolog y, pp289, (2002) )

[0034] [表 5]

遗伝子名遺伝子番号

spoIIP BG10439

spoIID BG10766

spoIIM BG10768

bofA BG10087

spoIIIAA BG 10540

spoIIID BG 10408

spoIVFA BG10331

cotE BG 10494

cotJA BG1 1799

dacB BG10527

spoIVA BG10275

spoIVCB BG10459

spo VB BG10778

spo VD BG 10222

spo VE BG10226

spoVK BG1 1039

spoVM BG10776

spoVR BG10182

spo VID BG 10346

glgB BG 10907

mmgA BG1 1319

phoB BG10697

yknT BG12251

yte V BG12339

safA BG13781

yaaH BG10080

cwlD BG1 1514

cwlJ BG1 1 172

yjmC BG13206

yfhS BG 12892

yoaW BG 13493

(Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiolog y， pp289, (2002) )

表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。 [0036] [表 6]

[0037] (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells,

Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiolog y, pp289， (2002) )

[¾7]

[0039] (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives： From Genes to Cells,

[0040] 以上の様に、本発明に於いて用いられる胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としての好適な例としては、前記（1)一（6)、或いは（1 ' )一（6' )の何れかの特徴をもつプロモーターが挙げられる。一方、枯草菌において、 SigEは R NAポリメラーゼに対して SigAより高い親和性を示すとの報告例もあることから (J. B acteriol. , 179, 4969, (1999) )、より好適には、 SigE力 S活' |4ィ匕する以前に転写が活性ィ匕するプロモーターを利用することが好ましい。より好ましい当該プロモーター配列としては、 SpoOA— P濃度の上昇に伴って AbrBによる転写抑制が解除され、且つ SigAにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（1)又は（ )に相当）、又は SigHにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（2)又は（2' )に相当）が挙げられる。

[0041] 前記（1)又は（1 ' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 1に示した枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーター配列が挙げられ、中でも特に好適な例としては、枯草菌の^ kHのプロモーター配列が挙げられる。枯草菌の^ kHのプロモーター配列は、配列番号 2に示す塩基配列における塩基番号 987— 1027の塩基配列、好ましくは塩基番号 987— 1047の塩基配列、より好ましくは塩基番号 1一 1047の塩基配列を含む、塩基長 5000塩基対以内、好ましくは 2000塩基対以内、より好ましくは 1047塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。

[0042] また前記（2)又は（2' )の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表 2に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、中でも特に好谪な例としては枯苣菌の SOOIIAA— SOOIIAB— sigFオペロン ( 。οΠΑオペロン)のプロモーター配列が挙げられる。枯苣菌の SOOIIAオペロンのプロモーター配列は、配列番号 3に示す塩基配列における塩基番号 1081— 1110の塩基配列、好ましくは塩基番号 1081— 1118の塩基配列、より好ましくは塩基番号 1一 1143の塩基配列を含む、塩基長 5000塩基対以内、好ましくは 2000塩基対以内、より好ましくは 1143塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。

[0043] また、本発明で用いられる胞子形成期特異的に認識、発現されるプロモーター配列としては、表 1一表 6記載の枯草菌の各遺伝子或いは各オペロンのプロモーター配列に相当する配列も含まれる。例えば、枯草菌の sH遺伝子のプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号 2に示す塩基配列における塩基番号 987— 102 7の塩基配列、好ましくは塩基番号 1081— 1118の塩基配列、より好ましくは塩基番号 1一 1143の塩基配列に対して、 1個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長 5000塩基対以内、好ましくは 2000塩基対以内、より好ましくは 1047塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有する DNA断片が挙げられる。

[0044] また、 ^2ΐΙΔオペロンのプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号 3で示される塩基配列における塩基番号 1081— 1110の塩基配列、好ましくは塩基番号 1081— 1118の塩基配列、更に好ましくは塩基番号 1一 1143の塩基配列に対して、 1個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長 5000塩基対以内、好ましくは 2000塩基対以内、より好ましくは 1118塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該オペロンのプロモーターと同一のプロモーター機能を有する DNA断片が挙げられる。

[0045] 更に、本発明で用いられる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列には、表 2又は表 3記載の枯草菌の遺伝子又は、枯草菌のオペロンを構成する遺伝子のォーソログ（ortholog)遺伝子のプロモーター配列、好適には、バチルス属細菌由来の当該ォーソログ遺伝子のプロモーター配列も含まれる。ォーソログ遺伝子は、インターネットで公開される Microbial Geno me Database (MBLTD、 http : z / mogd. genome, ad. jpZ)の CreateZ view Orthologous gene tableプログラムを利用することによって見出すことができる。枯草菌^ kH遺伝子のォーソログ遺伝子の例としては、バチルス'ノ、ロドランスの^ k H(BH0115)遺伝子や、バチルス.セレウスの BC0114遺伝子などが挙げられる。また、枯草菌の^ 2ΠΔオペロンを構成する各遺伝子のォーソログとしては、バチルス' ハロドランスの^ g£ (BH1538)遺伝子、^ IIAS(BH1537)遺伝子、又 sr»oIIAA ( BH1536)、ノチルス，セレウスの BC4072遺伝子、 BC4073遺伝子、又 BC4074 遺伝子などが挙げられる。

[0046] 斯カる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列は、上記のプロモーター配列を単独で用いる他、複数種を組み合わせて用いることができる。

[0047] 胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列が枯草菌の^ k 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に結合してなる DNAは、例えば、元来枯草菌ゲノム上に存在する^ kA遺伝子の上流に存在する SigA認識プロモーター配列の上流又は下流に、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモ一ター配列を含む DNA断片を挿入することによってゲノム上に構築することができる。尚、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DN A断片を挿入する部位は、^ igA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流であればよいが、^ kA構造遺伝子の上流側に隣接する 2000塩基対以内の領域が好ましぐ 1000塩基対以内の領域がより好ましぐ 500塩基対以内の領域が更に好ましぐ 1一 198塩基対の領域が特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DNA断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まない場合には、該 DNA断片を^ kA構造遺伝子より 15塩基対以上、上流に挿入することが望ましい。

[0048] また、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列を ^kA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流側に連結した DNAは PCRなどの方法によつて構築することも可能である。尚、連結部位から^ 構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在する ^kA遺伝子の上流配列に由来する配列は、 0— 2000塩基対であることが好ましぐ 0— 1000塩基対であることがより好ましぐ 0— 500塩基対であることが更に好ましぐ 0— 198塩基対であることが特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DNA断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まな、場合には、連結部位から^ gA構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在する^ kA遺伝子の上流配列に由来する配列は 15塩基対以上であることが望ましい。本発明変異バチルス属細菌を構築するためには、このようにして構築した DNAを新たに親バチルス属細菌へ導入すれば良、。

[0049] 例えば胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DNA断片と^ 遺伝子等を含む DNA断片を連結した DNA断片を PCR等の方法により調製し、親バチルス属細菌内で複製可能なプラスミドベクターにクローユングして取り込ませる方法を用いることができる。特に、本発明変異バチルス属細菌を構築するための親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合、複製可能なプラスミドベクターとしては pUB110 (Plasmid, 15, 93, (1986) )、 pC194 (j. Bacteriol. , 150, 815 , (1982) )、 ρΤΧ14— 3 (Plasmid, 30, 119, (1993) )をはじめとして既に報告のある多数のプラスミドベクターを利用することが可能である。

[0050] 或いは、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DNA断片が遺伝子等を含む DNA断片の上流に連結した DNA断片を、相同組換え等の方法によってゲノム上に導入することができる。相同組換えを利用してゲノム上に DNA断片を導入する方法につ!、ては既に!/、くつかの報告があり（Mol. G en. Genet. , 223, 268 (1990)等）、それらの方法に従うことによって、本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。

[0051] 以下、より具体的に SOE (splicing by overlap extension)— PCR法（Gene, 7 7, 51, (1989) )により調製された胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む DNA断片と^ 遺伝子を含む DNA断片が連結した DN A断片を調製し、相同組換えを利用することによりゲノム上に当該 DNA断片を導入する方法について説明するが、本発明における当該 DNA断片の導入方法は下記に限定されるものではない。

[0052] 本発明において、まず 1回目の PCRにより胞子形成期において特異的に認識、転写される胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含む D NA断片と、ハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の 3断片を調製するが、この際、例えば、当該プロモーター配列を含む DNA断片の下流末端にハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の上流側 10— 30塩基対配列、逆に薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端にはハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の下流側 10— 30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図 2)。

[0053] 次いで、 1回目に調製した 3種類の PCR断片を铸型とし、当該プロモーター配列を含む断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマーを用いて 2回目の PCRを行うことによって、当該プロモーター配列を含む断片の下流末端及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端に付加した遺伝子断片配列において、 ^kA遺伝子断片とのァニールが生じ、 PCR増幅の結果、 sigA遣伝子の上流に胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列が連結され、且つ薬剤耐性マーカー遺伝子がその下流に連結された DNA断片を得ることができる（図 2)。

[0054] 胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列として枯草菌の^ i遺伝子、或いは^ ΠΑオペロンのプロモーターを、薬剤耐性マーカー遺伝子として、ク口ラムフエ-コール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表 8に示したプライマーセットを用い、 Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）などの一般の PCR用酵素キット等を用ヽて、成書 (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edit ed by B. A. White, Humana Press, pp251 (1993)、 Gene, 77, 61, ( 1989)等）に示される通常の条件により SOE— PCRを行うことによって、所望の DNA 断片を得ることができる。

[0055] 力べして得られた DNA断片を、例えば枯草菌ゲノム上に導入する場合、枯草菌細胞内にて複製出来ないプラスミドベクター、例えば pMW219 (-ツボンジーン）にクロ一ユングし、コンビテント法等によって細胞内に取り込ませると、プラスミド上のハウスキーピングシグマ因子の遺伝子領域と、ゲノム上の^ kA遺伝子領域の間で相同組換えが生じ、薬剤耐性マーカーによる選択によって、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が結合した^ gA遺伝子を含む DNA断片がプラスミドべクターと共にゲノム上に導入された細胞を分離することができる（図 2)。即ち、表 3に示したプライマーセットを用いて調製した DNA断片を pMW219にクローユングしたプラスミドを枯草菌細胞内に取り込ませた場合、クロラムフエ-コールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、 sigH遣伝子、或いは^ ΙΙΔオペロンのプロモータ一領域と^ gA遺伝子が連結した DNA断片がゲノム上に導入されてヽることを、ゲノムを铸型とした PCR法などによって確認すればよい。

[0056] 以上は主に親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合にっ、て示したが、他のバチルス属細菌についても同様にして本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。

[0057] 力べして得られたバチルス属細菌を用いることにより、異種タンパク質又はポリぺプチドの生産において、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の転写、並びにタンパク生産に関わる種々の遺伝子の転写を行う SigAが胞子形成期に発現増強される為、生産性の向上が達成される。

すなわち、 SigAによって認識されるプロモーターの下流に目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を結合させた後、これを本発明により得られた変異バチルス属細菌に導入することによって、栄養増殖期のみならず、胞子形成期に於いても目的のタンパク質又はポリペプチドの生産が継続するため、親バチルス属細菌に比べ、著量の目的タンパク質又はポリペプチドを生産する。

[0058] 目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸ィ匕還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素 (T ransferase)、加水分解酵素（Hydrolase)、脱離酵素（Lyase)、異性化酵素（Isom erase)、合成酵素（LigaseZSynthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、 α—アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J. , 280, 309 (1991) )中でファミリー 5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号 4又は 6で示されるァミノ酸配列からなるバチルスエスピー（Bacillus sp. ) KSM—S237株（FERM BP— 7875)又はバチルスエスピー（Bacillus sp. ) KSM— 64株（FERM BP— 2886) 由来のアルカリセルラーゼゃ、当該アミノ酸配列と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列力なるセルラーゼが挙げられる。

[0059] また、 α アミラーゼの具体例としては、微生物由来の α アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液ィ匕型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号 19で示されるアミノ酸配列からなるバチルスエスピー（Bacillus sp. ) KSM K38株（FERM BP— 6946)由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と 70 %、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列力もなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性は Lipman— Pearson法（Science, 227, 1435, (198 5) )によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼゃ金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号 21で示されるアミノ酸配列からなるバチルスクラウジ cillus eki )KSM— K16株（FERM BP— 3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプ口テアーゼが挙げられる。

[0060] 一方、前述の様に目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に枯草菌 S igAなどのハウスキーピングシグマ因子によって認識されるプロモーター配列が結合されている必要があり、更に、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、リボソーム結合部位および開始コドンを含む翻訳開始領域、又、分泌用シグナルペプチド領域が適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開 2000-210081号公報ゃ特開平 4— 190793号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわち KSM— S237 株（FERM BP— 7875)、 KSM— 64株（FERM BP— 2886)由来のセルラーゼ遺伝子のハウスキーピングシグマ因子で転写されるプロモーターを含む転写開始制御領域、翻訳開始領域、分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号 5で示される塩基配列の塩基番号 1一 659の塩基配列、配列番号 7で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号 1一 696の塩基配列、また当該塩基配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95 %以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有する塩基配列力なる DNA断片、あるいは上記、ずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列力なる DNA断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。

[0061] 上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含む DNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明の変異バチルス属細菌に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。また、当該 DNA断片に本発明の変異バチルス属細菌ゲノムとの適当な相同領域を結合した DNA断片を用い、本発明の変異バチルス属細菌ゲノムに直接組み込むことによつても目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。

[0062] 本発明の変異バチルス属細菌を宿主とした目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取'精製することにより行えばよい。

[0063] 以上より、胞子形成期における^ kA遺伝子の転写効率が向上したバチルス属細菌を構築することができ、当該変異バチルス属細菌を組換え生産の宿主細胞として用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。

[0064] 以下、実施例を用いて、本発明の変異バチルス属細菌の構築方法と、当該変異バチルス属細菌を宿主として用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。

実施例

[0065] 実施例 1 胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有する^ kA遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドの構築

図 2に示す方法と同様にして、^ kH遺伝子プロモーター或いは^ ΠΑオペロンブ口モーターを構造遺伝子の上流に連結した DNA断片を、 1回交差の相同組換えを利用して枯草菌ゲノム上へ導入する為のプラスミドの構築を行った。即ち、枯草菌 168株力も抽出したゲノム DNAを铸型とし、表 8に示した sigAfと sigArのプライマ一セットを用いて ^gA遺伝子を含む 1. 2kb断片 (A)を PCRにより調製した。同様に表 8に示した sigHUfと sigHUr— sigAのプライマーセットを用いてゲノム上の^ i遺伝子の上流に隣接する^ kH遺伝子のプロモーターを含む 1. Okb断片 (B)を調製した。同様に表 8に示した sigFUfと sigFUr— sigAのプライマーセットを用いてゲノム上の^ ΠΑオペロンの上流に隣接し、 sigF遺伝子の転写を司る^ ΠΑオペロンのプ口モーターを含む 1. lkb断片（C)を調製した。またプラスミド pC194 (j. Bacteriol . 150 (2) , 815 (1982) )を铸型とし、表8に示したCmFWとCmr—sigAのプラィマ一セットを用いてクロラムフエ-コール耐性遺伝子を含む 0. 9kb断片 (D)を調製した

。次いで、得られた (A) (B) (D) 3断片を混合して铸型とし、表 8に示した sigHUfと C mFWのプライマーセットを用いた SOE— PCRを行うことによって、 3断片を（B) (A) (

D)の順になる様に結合させ、 sigH遣伝子のプロモーター力 sigA構造遣伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフエ-コール耐性遺伝子が逆向きに結合した 3. 1 kbの DNA断片 (E)を得た。同様に (A) (C) (D) 3断片を混合して铸型とし、表 8に示した sigFUfと CmFWのプライマーセットを用いた SOE— PCRを行うことによって、 3 断片を（C) (A) (D)の順になる様に結合させ、^ ΠΔオペロンプロモーターが ^kA 構造遺伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフエ-コール耐性遺伝子が逆向きに結合した 3. 2kbの DNA断片（F)を得た。 3. lkbの DNA断片（E)と 3. 2kbの

DNA断片 (F)をそれぞれ枯草菌細胞内では複製できな!/、大腸菌用プラスミドベクタ一 pMW219の≤m i制限酵素切断点に挿入し、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有する^ _Δ遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミド _pM

WPHsigA及び pMWPFsigAを構築した。

[0066] また上記のプライマーのうち、 sigAf及び sigFUr— sigAに代えて、それぞれ表 8に示す sigAmf及び sigFUr— sigAmを用いて同様の操作を行うことにより、 pMWPFsi gAにおける^ gA遺伝子の開始コドン (ATG)が開始コドンとして認識されなヽ (ATA )に置換された pMWPFsigAmを構築した。

[0067] 実施例 2 胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有する^ kA遺伝子の枯草菌 168株ゲノムへの導入

胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有する遺伝子、又は開始コドン (ATG)が (ATA)に置換された^ gA遺伝子 (sigAm)を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミド pMWPHsigA、 pMWPFsigA、及び pMWPFsigAmを用いてコンビテント法によりそれぞれ枯草菌 168株の形質転換を行い、クロラムフエ-コールを含む LB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体力ゝら抽出したゲノムを铸型として PCRを行うことによって、ゲノム上の sigA遣伝子とプラスミド上の^ kA遺伝子又は ^kAmの間での相同組換えにより、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有する ^kA又は^ sAm力 1. 2kb断片（D

)と共にゲノム内に挿入されたことを確認し、これらを 168PHsigA株、 168PFsigA株、及び 168PFsigAm株と命名した。

[0068] 実施例 3 枯草菌変異株のアルカリセルラーゼ分泌生産評価

実施例 2にて得られた 3種類の枯草菌変異株（168PHsigA株、 168PFsigA株、及び 168PFsigAm株）、及び対照として枯草菌 168株に、バチルスエスピー (Baci llus sp. )KSM—S237株（FERM BP— 7875)由来のアルカリセルラーゼ（特開 2 000— 210081号公報）をコードする DNA断片（3. lkb)がシャトルベクター pHY30 OPLK (ヤクルト）の^ mHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミド pHY— S2 37を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによつて得られた菌株を 10m Lの LB培地で一夜 37°Cで振盪培養を行い、更にこの培養液 0. 05mLを 50mLの 2 X L—マルトース培地（2%トリプトン、 1%酵母エキス、 l%NaCl、 7. 5%マルトース、 7. 5ppm硫酸マンガン 4— 5水和物、 15ppmテトラサイクリン）に接種し、 30°Cで 3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラ一ゼの量を求めた。この結果、表 9に示した様に、宿主として 168PHsigA株又は 16 8PFsigA株を用いた場合、対照の 168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。一方、宿主として 168PFsigAmを用いた場合のアルカリセルラーゼ分泌量は、対照の 168株（野生型）と同等であったことから、 168 PHsigA株又は 168PFsigA株に於ける高生産化力ゲノム上に新たに付加された gH遺伝子或、は SOOIIAオペロンのプロモーターを持つ sigA遣伝子〖こより、 SigAが生産されたことによるものと推定された。

[0069] [表 8] プライマー塩基配列 ' 配列番号

SigAf ATGGCTGATAAACAAACCCA 8

Si Ar CACCACAATGTTCATTTGCA 9 sigHUf ACAGCCTTTCTTCCTCATTCT 1 0 sigHUr-sigA CGTGGGTTTGTTTATCAGCCATTCCGATCCCCCCGGCGCACG 1 1

sigFUf GCTGATAGAACGTGACACGGG 1 2 sigFUr-si A CGTGGGTTTGTTTATCAGCCATGCTCATTCCTCCTTGATATG 1 3

CmFW CAACTAAAGCACCCATTAG 1 4

Cmr-sigA CATTTGCAAATGAACATTGTGGTGCTTCTTCAACTAACGGGGCA 1 5 sigAtnf ATAGCTGAT ACAAACCCA 1 6 sigFUr-sigAm CGTGGGTTTGTTTATCAGCTATGCTCATTCCTCCTTGATATG 1 7

[0070] [表 9]

[0071] 実施例 4 枯草菌変異株のアルカリプロテアーゼ分泌生産評価

実施例 3にてアルカリセルラーゼ生産性向上が認められた 168PHsigA株及び 16 8PFsigA株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼ生産性評価を行った。バチルスクラウジ（Bacillus eki )KSM— K16株（FERM BP— 3376)より抽出したゲノム DNAを铸型として、表 10に示される S237pKAPpp— Fと KAPter— R ( Bglll)のプライマーセットを用いて PCRを行、、配列番号 21で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol. , 43, 473, (19 95) )をコードする 1. 3kbの DNA断片（G)を増幅した。またバチルスエスピー（ illus sp. )KSM— S237株（FERM BP— 7875)より抽出したゲノム DNAを铸型として、表 10に示される S237ppp— F2 (BamHI)と S237pKAPpp— Rのプライマーセットを用いて PCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開 2000— 210081号公報）のプロモーター領域を含む 0. 6kbの DNA断片（H)を増幅した。次いで、得られた（ G) (H)の 2断片を混合して铸型とし、表 10に示される S237ppp-F2(BamHI)と APter— R(Bglll)のプライマーセットを用いた SOE—PCRを行うことによって、アル力リセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した 1.8 kbの DNA断片（I)を得た。得られた 1.8 kbの DNA断片（I)をシャトルベクター PHY300PLK (ヤクルト）の^ mHI— IslII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミド pHYKAP (S237p)を構築した。

構築したプラスミド pHYKAP(S237p)を 168PHsigA株、 168PFsigA株、及び対照として枯草菌 168株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによつて得られた菌株を実施例 3と同様の条件にて 3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除、た培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテア一ゼの量を求めた。この結果、表 11 に示した様に、宿主として 168PHsigA株又は 168PFsigA株を用いた場合、対照の 168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。

[0072] [表 10]

[0073] [表 11] 宿主アル力リプロテアーゼ分泌生産量（相対値）

1 6 8 (野生株） 100

1 6 8 PH s i g A 129

1 6 8 P F s i g A 130 実施例 5 枯草菌変異株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価

実施例 3及び 4にてアルカリセルラーゼ及びアルカリプロテアーゼ生産性向上が認められた 168PHsigA株及び 168PFsigA株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を更に確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアミラーゼ生産性評価を行った。

バチルスエスピー（Bacillus sp. )KSM— K38株（FERM BP— 6946)より抽出したゲノム DNAを铸型として、表 10に示される K38matu— F2 (ALAA)と SP64K3 8— R(Xbal)のプライマーセットを用いて PCRを行い、配列番号 19で示されるァミノ酸配列を有するアルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol. , 67, 1744, (20 01) )をコードする 1. 5kbの DNA断片 (J)を増幅した。またバチルスエスピー (Baci llus sp. )KSM— S237株（FERM BP— 7875)より抽出したゲノム DNAを铸型として、表 10に示される S237ppp— F2 (BamHl)と S237ppp— R2 (ALAA)のプライマーセットを用いて PCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開 2000— 210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む 0. 6kbの D NA断片 (K)を増幅した。次いで、得られた CO (Κ)の 2断片を混合して铸型とし、表 1 0に示される S237ppp— F2 (BamHI)と SP64K38— R (Xbal)のプライマーセットを用いた SOE—PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した 2. lkbの DNA断片（L)を得た。得られた 2. 2kbの DNA断片（L)をシャトルベクタ一 PHY300PLK (ヤクルト）の^ mHI— I制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミド PHYK38 (S237ps)を構築した。

構築したプラスミド pHYK38 (S237ps)を 168PHsigA株、 168PFsigA株、及び対照として枯草菌 168株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによつて得られた菌株を実施例 3と同様の条件にて 5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除！ヽた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によつて菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。この結果、表 12に示した様に、宿主として 168PHsigA株又は 168PFsigA株を用いた場合、対照の 168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、上記変異株が種々のタンパク質又はポリペプチド生産において有効であることが示された。

[表 12] 宿主アル力リアミラーゼ分泌生産量（相対値）

168 (野生株） 100

168 PH s i g A 189

168 PF s i gA 182

Claims

請求の範囲

[1] sigA遣伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなる DNAを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌。

[2] 胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が、枯草菌の^ kH遺伝子のプロモーター配列又はこれに相当する配列及び Z又は枯草菌の^ ΠΔオペ口ンのプロモーター配列又はこれに相当する配列である請求項 1記載の変異バチルス属細菌。

[3] バチルス属細菌が、枯草菌である請求項 1又は 2記載の変異バチルス属細菌。

[4] 請求項 1一 3のいずれか 1項記載の変異バチルス属細菌に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。

[5] 請求項 4記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

[6] タンパク質がセルラーゼ、アミラーゼ又はプロテアーゼである請求項 5記載の製造方法。

[7] セルラーゼが配列番号 4で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して 70%以上の相同性を有し、かつアルカリセルラーゼ活性を有するものである請求項 6記載の製造方法。

[8] アミラーゼが配列番号 19で示されるアミノ酸配列力もなるアルカリアミラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して 70%以上の相同性を有し、かつアルカリアミラーゼ活性を有するものである請求項 6記載の製造方法。

[9] プロテアーゼが配列番号 21で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して 70%以上の相同性を有し、かつアルカリプロテア一ゼ活性を有するものである請求項 6記載の製造方法。

[10] ^kA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなる DNAを、バチルス属細菌のゲノム上或、はプラスミド上に有するように構築することを特徴とする変異バチルス属細菌の構築方法。