WO2005082432A1 - Procede de traitement de tissus osseux et biomateriaux implantables - Google Patents

Procede de traitement de tissus osseux et biomateriaux implantables Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a new process for the treatment of bone tissue and the implantable biomaterials capable of being obtained by this process, which have improved properties compared to the biomaterials of the prior art. .
  • the method of the invention makes it possible to treat bone tissue with a view to its implantation in humans. Such tissue must present a risk of rejection as reduced as possible, it must have a good osteoconductive capacity, that is to say that it must allow the formation and migration of new bone tissue by the recipient. It must present as low a risk of infection as possible and have mechanical properties at least equivalent to those of natural bone. In addition, it is desired to be able to obtain such properties on bone fragments or whole bones of a large volume and not only on small fragments.
  • the primary objective of bone tissue treatment processes to produce an implantable biomaterial is the elimination of organic matter such as fats, bone marrow proteins, cellular debris in order to leave the organo-mineral structure of bone tissue, composed of carbonated apatite and type I collagen, perfectly preserved. They also aim to eliminate infectious bacterial or viral contamination. These objectives have been pursued in the prior art by different treatment methods which all have the drawback of having decreasing efficiency when the volume of the sample to be treated increases. The effectiveness of a given treatment is in fact generally less good at the heart of the mass of a sample than at the periphery.
  • biomaterials derived from bulky bone fragments such as for example femoral heads, or from whole bones, treated by a process of devitalization of the bone tissue and having performances in terms of defatting, of mechanical resistance and absence of viral contamination which are homogeneous throughout the material.
  • the treatment of human bone tissue with a view to its implantation must: - ensure an eradication of the infectious agents possibly carried by the donor, - eliminate the medullary and cellular elements contained in the pores of the bone tissue in order to promote osteoconduction, - decrease antigenicity to facilitate the integration of bone tissue, - preserve the mechanical properties of bone tissue, - do not leave toxic residues.
  • This method comprises a first step of mechanical cleaning of the bone and then cutting to an appropriate shape.
  • the bone tissue is then cleaned by treatment with a fluid in the supercritical state.
  • This document illustrates the preparation of implantable biomaterials of bovine origin which, because of their size must be cut into pieces of the desired shape for their implantation.
  • the implantation of biomaterials of animal origin in humans is today ruled out because of the risks of transmission of diseases like BSE.
  • the process described in this document applied to bone fragments the size of which is not specified allows only a delipidation corresponding to an average lipid level of 1.1% after extraction with CO 2 supercritical and 0.7% after extraction with supercritical CO 2 followed by treatment with hydrogen peroxide.
  • Patent FR-2 654 625 describes a deproteinization process using organic solvents combined with an urea-based anti-viral extraction and treatment agent.
  • An objective of the invention has been the development of a method for treating bone tissue making it possible to obtain a lower lipid level than those obtained by the methods of the prior art, which is homogeneous throughout the bone tissue, even for uncut whole bones and which makes it possible to obtain a rate of viral inactivation higher than those obtained by the methods of the prior art, while retaining equivalent mechanical strength, in particular a compressive strength to that of natural bone.
  • a first objective of the invention is therefore a method of treating animal or human bone tissue, with a view to obtaining an implantable biomaterial, this method being characterized in that it comprises the following steps: a) mechanical cleaning of the bone tissue of all the organic matter that surrounds it, this step involving the removal of cartilage and osteophytes; b) treatment of the cleaned bone tissue obtained in step a) with a stream of carbon dioxide, or CO 2 , in the supercritical state; c) bringing the tissue obtained in step b) into contact with an aqueous solution of hydrogen peroxide, or H 2 O 2 , and simultaneously, treatment with ultrasonic waves; d) bringing the tissue obtained in step c) into contact with an aqueous sodium hydroxide solution, or NaOH, and simultaneously, treatment with ultrasonic waves; e) rinsing with water and neutralization; f) bringing the fabric obtained in step e) into contact with a first ethanol solution and then with a second ethanol solution whose titer is greater than the first
  • this first step further comprises an additional operation which consists in perforating the bone tissue from one end to the other along its longitudinal axis. In this case, it is a fine perforation, with a diameter not exceeding 5 mm, preferably 3 mm, and defining a longitudinal channel in the bone tissue.
  • step b) is implemented under the following conditions: the supercritical CO 2 is placed at a pressure between 100 and 500 bars, preferably between 250 and 270 bars and at a temperature between 40 and 55 ° C, preferably between 48 and 52 ° C.
  • the supercritical CO 2 is placed at a pressure between 100 and 500 bars, preferably between 250 and 270 bars and at a temperature between 40 and 55 ° C, preferably between 48 and 52 ° C.
  • step c) is implemented in the following manner: an aqueous solution of hydrogen peroxide whose w / w titer is greater than or equal to 1%, preferably greater than or equal to 10%, again more preferably at 30%, is brought to a temperature between 30 and 50 ° C, preferably equal to 40 ° C.
  • the bone tissue is immersed in the hydrogen peroxide solution and subjected to an ultrasound treatment at a frequency ranging from 35 to 45 kHz, preferably from 38 to 42 kHz, for a duration greater than or equal to 60 minutes, advantageously greater than or equal to 90 minutes, even more preferably greater than or equal to 120 minutes.
  • step d) is implemented under the following conditions: the bone tissue is immersed in an aqueous sodium hydroxide solution with a concentration ranging from 0.1 to 5 M, preferably from 0.5 to 2 M, advantageously from 0.8 to 1.2 M, at ambient temperature and subjected to treatment by ultrasound at a frequency ranging from 35 to 45 kHz, advantageously from 38 to 42 kHz, for a duration greater than or equal to 15 minutes, preferably greater than or equal to 30 minutes, even more preferably greater than or equal to 45 minutes, advantageously greater than or equal to 60 minutes.
  • step e) rinsing with water is carried out in a conventional manner by immersion in a water bath, possibly repeatedly in several baths, preferably by applying ultrasound to the submerged bone tissue.
  • Neutralization is carried out conventionally by immersion in an aqueous neutralizing solution, such as for example an aqueous solution of NaH 2 PO 4 , preferably by applying ultrasound.
  • step f) the soaking is carried out at room temperature with a first ethanol solution whose titer is greater than or equal to 90% by volume / volume for a period of 3 hours then with a second ethanol solution whose volume / volume titer is greater than or equal to 95% for a period of 2 hours.
  • the implantable biomaterial obtained can advantageously be dried, for example in a ventilated oven, pack it in a sealed package so that it retains its dehydrated state and possibly subject it to treatment with radiation. , as for example by gamma rays.
  • the succession of process steps makes it possible to obtain an implantable biomaterial consisting of a collagenous bone structure having a significantly reduced lipid level compared to the methods of the prior art, in particular it makes it possible to obtain a very low lipid level. and homogeneous from bone tissue of large volume, such as for example from human femoral heads.
  • the rate of viral inactivation obtained is greater than or equal to that obtained by the methods of the prior art, even when working on whole bones.
  • the method of the invention does not cause a reduction in the mechanical resistance properties of the treated bone tissue.
  • very low lipid levels have been observed from implantable biomaterials obtained from whole human femoral heads, in particular a lipid level less than or equal to 0.4% by mass relative to the total mass of biomaterial, advantageously less than or equal to 0.2%, preferably less than or equal to 0.1%, and even more preferably less than or equal to 0.08%, and this in a homogeneous manner throughout the biomaterial and in the absence of remnants of organic solvents, especially chlorinated solvents.
  • Another object of the invention is therefore an implantable biomaterial consisting of a collagenous bone grid characterized in that it has a lipid level, by mass relative to the total mass of the biomaterial, less than or equal to 0.4% , preferably less than or equal to 0.2%, even more preferably less than or equal to 0.1% and advantageously less than or equal to 0.08%, this biomaterial being free of traces of chlorinated organic solvents.
  • the collagenous bone fabric is of human origin.
  • the biomaterial of the invention has a compressive strength, expressed by the maximum stress, comparable to that of natural bone, that is to say greater than or equal to 5 MPa.
  • the biomaterial of the invention has a compressive strength greater than or equal to 75%, preferably greater than or equal to 100% of the compressive strength of the original bone tissue.
  • the viral inactivation rates can be quantified by the reduction in viral load expressed in log 10 of the ratio between the initial viral load and the final viral load. The rate of viral inactivation obtained by the process of the invention is preferably greater than or equal to 8 logarithmic units.
  • the method of the invention makes it possible in particular to fight against parvoviruses, reputed to be difficult to eliminate, however its action is not limited to this type of virus since it is also effective in fighting against viruses of the Togaviridae family, in particular of the genus Alphavirus, such as the hepatitis C virus, and preventing their transmission during tissue transplants; to fight against viruses of the Picormaviridae family, in particular of the genus Enterovirus, more particularly the Polio Sabin virus, and to prevent their transmission during tissue transplants; to fight against viruses of the Herpesviridae family and prevent their transmission during tissue transplants; to fight against viruses of the Retroviridae family, in particular of the genus Lentivirus, more particularly viruses of the Human Immunodeficiency NIH, and to prevent their transmission during tissue transplants.
  • viruses of the Togaviridae family in particular of the genus Alphavirus, such as the hepatitis C virus, and preventing their transmission during tissue transplants
  • the method of the invention can be applied to any type of bone, whether it is cancellous (or trabecular) bone or solid bone.
  • it applies to the trabecular bone for which particularly interesting performances have been observed both in terms of defatting as well as viral inactivation and resistance to compression.
  • Figures Figure 1: photograph of a human femoral head treated with supercritical Oj; Figure 2: frontal sections of a femoral head; Figure 3: location of the 9 parallelepiped samples in a femoral half-head; Figure 4: cut in the transverse plane; Figure 5: cutting of the parallelepipeds; Figure 6: photograph by electron microscopy of a delipidated femoral head; Figure 7: photograph by electron microscopy of a delipidated femoral head.
  • 1- Preparation of an implantable biomaterial 1.1- Mechanical preparation (step 1 The human femoral heads, coming from donors operated for a hip arthroplasty, are cut with a stainless steel band saw to remove the cartilage and osteophytes.
  • a 3 mm diameter tunnel is drilled right through.
  • This preparation step is introduced at the start of the process in order to eliminate the barrier which constitutes the cartilage and which prevents good penetration of the solvents. It is therefore a porous material which is exposed to the action of supercritical CO 2 .
  • the penetration of the fluid through the entire surface and through the center of the femoral head promotes the efficiency and speed of elimination from the bone marrow.
  • 1.2- Supercritical treatment f step 2) The tissues are weighed and placed in the extraction reactor and then subjected to the supercritical treatment according to the parameters defined in Table I below:
  • step 5 The products are, at the end of the chemical treatment phase, completely soaked in 99% ethanol. Drying with hot air (40 ⁇ 1 ° C) is then carried out in a ventilated oven. This has a blower and an extraction allowing homogeneous mixing and evacuation of ethanol vapors. The drying time is a function of the quantity of ethanol to be evaporated, itself linked to the mass of the samples. The objective is to obtain residual moisture less than 5%. Drying with hot air allows to deeply dehydrate the bone tissue without altering the structural and mechanical characteristics of the bone.
  • the femoral heads from the previous step of the process are washed in two baths of 100 ml of culture medium supplemented with 0.5% (by volume by volume) of fetal calf serum for 20 minutes, with gentle stirring at room temperature.
  • the washed femoral heads are wiped on sterile gauze and then dried in an oven at a temperature of about 37 ° C overnight.
  • For inoculation of virus using the tunnel 3 mm perforated during the mechanical preparation, but whose depth is limited so as to o "hold a well of 3 mm diameter and 2 cm deep.
  • the viral suspension is introduced into this well dropwise until the viral suspension reaches the external surface of the femoral head.
  • Viral suspension is further added to the external surface of the femoral head so as to obtain a homogeneous contamination. Similar viruses are introduced into each of the perforated femoral heads The protocol described above has been implemented with an MVM virus for "minute virus of mice” or minute mouse virus of the parvoviridae family, genus parvovirus. Virus recovery protocol Each femoral head is placed in a petri dish and broken into as small fragments as possible. Assessment of penetration of the viral suspension e is carried out on the fragments by visual observation. The fragments are collected and placed in 56 ml of culture medium. The mixture is incubated with shaking for 30 minutes at a temperature of approximately 4 ° C. The supernatant is recovered.
  • the fragments are placed in a tube fitted with a filter and centrifuged at 1300 rpm for 5 minutes.
  • the medium infiltrated into the bone tissue is recovered.
  • the two liquid fractions are combined for analysis of the viral load.
  • 3.4- Measurement of the viral load and the reduction factor The viral titer is expressed in “plaque-forming unit” (PFU / ml) and makes it possible to calculate the viral load expressed in PFU as a function of the volume of the sample and of the factor concentration of the ultracentrifugation.
  • the viral reduction factor of an inactivation step is defined as the log of the ratio of the initial viral load and the final viral load after application of the step.

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Abstract

Procédé de traitement de tissus osseux et biomatériaux implantables susceptibles d'être obtenus par ce procédé. Ce procédé comporte des étapes de découpe mécanique, traitement par un courant de dioxyde de carbone à l'état supercritique, mise en contact avec une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène puis avec une solution aqueuse de soude et sous agitation par ultrasons, mises en contact successives avec deux solutions de concentrations croissantes d'éthanol.

Description

PROCEDE DE TRAITEMENT DE TISSUS OSSEUX ET BIOMATERIAUX IMPLANTABLES L'invention a pour objet un nouveau procédé de traitement de tissus osseux et les biomatériaux implantables susceptibles d'être obtenus par ce procédé, qui présentent des propriétés améliorées par rapport aux biomatériaux de l'art antérieur. Le procédé de l'invention permet de traiter un tissu osseux en vue de son implantation chez l'homme. Un tel tissu doit présenter un risque de rejet aussi réduit que possible, il doit présenter une bonne capacité ostéoconductrice, c'est-à-dire qu'il doit autoriser la formation et la migration de tissu osseux néoformé par le receveur. Il doit présenter un risque aussi réduit que possible d'infection et présenter des propriétés mécaniques au moins équivalentes à celles de l'os naturel. En outre, on souhaite pouvoir obtenir de telles propriétés sur des fragments osseux ou des os entiers d'un volume important et non pas seulement sur des fragments de petite taille. Les procédés de traitement de tissus osseux en vue de produire un biomatériau implantable ont pour objectif premier l'élimination des matières organiques telles que graisses, protéines médullaires, débris cellulaire afin de laisser la structure organo-minéraîe du tissu osseux, composé d'apatite carbonatée et de collagène de type I, parfaitement préservée. Ils visent également à éliminer la contamination infectieuse bactérienne ou virale. Ces objectifs ont été poursuivis dans l'art antérieur par différentes méthodes de traitement qui ont toutes l'inconvénient de présenter une efficacité décroissante lorsque le volume de l'échantillon à traiter augmente. L'efficacité d'un traitement donné est en effet généralement moins bonne au cœur de la masse d'un échantillon qu'en périphérie. Or, il est important de pouvoir disposer de biomatériaux issus de fragments d'os volumineux, tels que par exemple des têtes fémorales, ou d'os entiers, traités par un procédé de dévitalisation du tissu osseux et présentant des performances en termes de délipidation, de résistance mécanique et d'absence de contamination virale qui soient homogènes dans l'ensemble du matériau. De façon générale, le traitement du tissu osseux humain en vue de son implantation doit : - assurer une éradication des agents infectieux éventuellement portés par le donneur, - éliminer les éléments médullaires et cellulaires contenus dans les pores du tissu osseux en vue de favoriser l 'ostéoconduction, - diminuer l'antigénicité pour faciliter l'intégration du tissu osseux, - préserver les propriétés mécaniques du tissu osseux, - ne pas laisser de résidus toxiques. Diverses méthodes de traitement ont été développées dans le but de dévitaliser le tissu osseux. Elles associent généralement un solvant des graisses à un traitement oxydant. Dans les procédés classiques, le solvant (chloroforme ou acétone) est indispensable pour dégraisser le tissu osseux qui contient de nombreux adipocytes dans ses cavités médullaires. La présence d'une grande quantité de lipides entraîne une mauvaise mouillabilité du tissu empêchant ou gênant l'action des oxydants aqueux. Leur diffusion dans le tissu osseux étant limitée, le volume des fragments osseux pouvant être traités avec efficacité est faible. Par ailleurs, l'utilisation de ces solvants dégraissants peut laisser des résidus toxiques indésirables. Un premier procédé de traitement de tissus osseux par un fluide à l'état supercritique a été décrit dans le document EP-0 603 920. Ce procédé comporte une première étape de nettoyage mécanique de l'os puis de découpage selon une forme appropriée. Le tissu osseux est ensuite nettoyé par traitement à l'aide d'un fluide à l'état supercritique. Ce document illustre la préparation de biomatériaux implantables d'origine bovine qui, en raison de leur taille doivent être découpés en morceaux de la forme souhaitée en vue de leur implantation. L'implantation de biomatériaux d'origine animale chez des humains est aujourd'hui écartée en raison des risques de transmission de maladies comme l'ESB. En outre, le procédé décrit dans ce document appliqué à des fragments d'os dont la taille n'est pas précisée ne permet d'obtenir qu'une délipidation correspondant à un taux moyen de lipides de 1 ,1 % après extraction au CO2 supercritique et 0,7 % après extraction au CO2 supercritique suivie d'un traitement au peroxyde d'hydrogène. Or la délipidation des tissus osseux est un facteur critique pour l'ostéoconduction : plus un tissu osseux est débarrassé de ses lipides et meilleure est la migration du tissu osseux néoformé dans le biomatériau implanté. On peut par exemple se reporter à K. Thoren et al, Clinical Orthopaedics and related research, 311, 1995, 232-246. En outre un taux de délipidation élevé est l'indice d'une bonne pénétration des produits de traitement dans la trame osseuse et permet de prévoir une bonne efficacité des traitements anti-infectieux, notamment des traitements anti-viraux. Le Brevet FR-2 654 625 décrit un procédé de déprotéinisation utilisant des solvants organiques associés à un agent d'extraction et de traitement anti-viral à base d'urée. Ce procédé, outre le fait qu'il met en œuvre des solvants toxiques, difficiles à éliminer totalement du biomatériau, conduit à des taux de délipidation très hétérogènes allant de 0,1 à 5 %, sans que l'on connaisse les dimensions des échantillons traités. En outre, l'utilisation de l'urée entraîne un affaiblissement significatif de 30 % des propriétés mécaniques du tissu osseux comme l'ont démontré LNastel et al., dans Biomaterials, 2004, 25(11) : 2105-10. L'un des objectifs de l'invention était d'améliorer la délipidation des tissus osseux par rapport aux procédés de l'art antérieur, en permettant d'obtenir un taux de lipides faible et homogène dans des tissus osseux entiers sans avoir recours à des solvants organiques dangereux susceptibles de rester dans le biomatériau sous forme de traces. Un autre procédé de traitement des tissus osseux par un fluide à l'état supercritique a été décrit dans le document EP-0 748 632. Le procédé décrit dans ce document comporte quatre étapes successives : - traitement par CO2 supercritique, - traitement par du peroxyde d'hydrogène, - traitement par de la soude, et - traitement par de l'éthanol. Si ce procédé permet d'obtenir de bonnes performances globales en termes d'inactivation virale, on a constaté que celles-ci avaient été démontrées sur des quarts de têtes fémorales. Un objectif de l'invention a été la mise au point d'un procédé de traitement d'un tissu osseux permettant d'obtenir un taux de lipides inférieur à ceux obtenus par les procédés de l'art antérieur, qui soit homogène dans tout le tissu osseux, même pour des os entiers non découpés et qui permette d'obtenir un taux d'inactivation virale supérieur à ceux obtenus par les procédés de l'art antérieur, tout en conservant une résistance mécanique, notamment une résistance à la compression, équivalente à celle de l'os naturel. Un premier objectif de l'invention est donc un procédé de traitement de tissus osseux animaux ou humains, en vue d'obtenir un biomatériau implantable, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) nettoyage mécanique du tissu osseux de toutes les matières organiques qui l'entourent, cette étape comportant le retrait du cartilage et des ostéophytes ; b) traitement du tissu osseux nettoyé obtenu à l'étape a) par un courant de dioxyde de carbone, ou CO2, à l'état supercritique ; c) mise en contact du tissu obtenu à l'étape b) avec une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène, ou H2O2, et de façon simultanée, traitement par des ondes ultrasonores ; d) mise en contact du tissu obtenu à l'étape c) avec une solution aqueuse de soude, ou NaOH, et de façon simultanée, traitement par des ondes ultrasonores ; e) rinçage à l'eau et neutralisation ; f) mise en contact du tissu obtenu à l'étape e) avec une première solution d'éthanol puis avec une seconde solution d'éthanol dont le titre est supérieur à la première. Selon ce procédé, on procède dans l'étape a) à un nettoyage mécanique de l'os qui est classique. Toutefois, contrairement à ce qui est pratiqué de façon habituelle, bien qu'il s'agisse également de tissus à trame collagénique, seuls le cartilage et les ostéophytes sont ôtés du* tissu osseux dès cette étape. Selon une variante préférée de l'invention, cette première étape comporte en outre une opération supplémentaire qui consiste à perforer le tissu osseux d'une extrémité à l'autre suivant son axe longitudinal. Il s'agit dans ce cas d'une perforation fine, d'un diamètre n'excédant pas 5 mm, de préférence 3 mm, et définissant un canal longitudinal dans le tissu osseux. De façon avantageuse l'étape b) est mise en œuvre dans les conditions suivantes : le CO2 supercritique est placé à une pression comprise entre 100 et 500 bars, de préférence entre 250 et 270 bars et à une température comprise entre 40 et 55°C, de préférence entre 48 et 52°C. Dans le cas où l'on souhaite modifier la forme et/ou les dimensions du tissu osseux de départ en vue de son implantation chez un receveur, on peut après l'étape b) procéder à un découpage mécanique du tissu osseux. De préférence, l'étape c) est mise en œuvre de la façon suivante : une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène dont le titre en poids/poids est supérieur ou égal à 1 %, de préférence supérieur ou égal à 10 %, encore plus préférentiellement à 30 %, est portée à une température comprise entre 30 et 50°C, de préférence égale à 40 °C. Le tissu osseux est immergé dans la solution de peroxyde d'hydrogène et soumis à un traitement par des ultrasons à une fréquence allant de 35 à 45 kHz, de préférence de 38 à 42 kHz, pendant une durée supérieure ou égale à 60 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 90 minutes, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 120 minutes. A l'issue de cette étape, on peut éventuellement procéder à un rinçage à l'eau, éventuellement de façon répétée dans plusieurs bains, éventuellement en appliquant un traitement aux ultrasons simultanément à l'immersion. Avantageusement l'étape d) est mise en œuvre dans les conditions suivantes : le tissu osseux est immergé dans une solution aqueuse de soude d'une concentration allant de 0,1 à 5 M, de préférence de 0,5 à 2 M, avantageusement de 0,8 à 1 ,2 M, à température ambiante et soumis à un traitement par des ultrasons à une fréquence allant de 35 à 45 kHz, avantageusement de 38 à 42 kHz, pendant une durée supérieure ou égale à 15 minutes, de préférence supérieure ou égale à 30 minutes, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 45 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 60 minutes. A l'étape e), le rinçage par de l'eau se fait de façon classique par immersion dans un bain d'eau, éventuellement de façon répétée dans plusieurs bains, de préférence en appliquant des ultrasons au tissu osseux immergé. La neutralisation se fait de façon classique par immersion dans une solution aqueuse neutralisante, comme par exemple une solution aqueuse de NaH2PO4, de préférence en appliquant des ultrasons. A l'étape f), le trempage est réalisé à température ambiante avec une première solution d'éthanol dont le titre est supérieur ou égal à 90 % en volume/volume pendant une durée de 3 heures puis avec une seconde solution d'éthanol dont le titre en volume/volume est supérieur ou égal à 95 % pendant une durée de 2 heures. Après l'étape f), on peut de façon avantageuse sécher, par exemple dans une étuve ventilée, le biomatériau implantable obtenu, le conditionner dans un emballage étanche pour qu'il conserve son état déshydraté et éventuellement le soumettre à un traitement par des rayonnements, comme par exemple par des rayons gamma. La succession des étapes du procédé permet d'obtenir un biomatériau implantable constitué d'une trame osseuse collagénique ayant un taux de lipides significativement réduit par rapport aux procédés de l'art antérieur, en particulier il permet d'obtenir un taux de lipides très faible et homogène à partir de tissus osseux de volume important, comme par exemple à partir de têtes fémorales humaines. En outre, le taux d'inactivation virale obtenu est supérieur ou égal à celui obtenu par les procédés de l'art antérieur, même lorsque l'on a travaillé sur des os entiers. Enfin le procédé de l'invention ne provoque pas de diminution des propriétés de résistance mécanique du tissu osseux traité. En particulier, on a observé des taux de lipides très faibles à partir des biomatériaux implantables obtenus à partir de têtes fémorales humaines entières, notamment un taux de lipides inférieur ou égal à 0,4 % en masse par rapport à la masse totale de biomatériau, avantageusement inférieur ou égal à 0,2 %, préférentiellement inférieur ou égal à 0,1 %, et encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,08 %, et cela de façon homogène dans l'ensemble du biomatériau et en l'absence de restes de solvants organiques, notamment de solvants chlorés. Un autre objet de l'invention est donc un biomatériau implantable constitué d'une trame osseuse collagénique caractérisé en ce qu'il présente un taux de lipide, en masse par rapport à la masse totale du biomatériau, inférieur ou égal à 0,4 %, préférentiellement inférieur ou égal à 0,2 %, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,1 % et avantageusement inférieur ou égal à 0,08 %, ce biomatériau étant dépourvu de trace de solvants organiques chlorés. Avantageusement, la trame osseuse collagénique est d'origine humaine. En outre, le biomatériau de l'invention présente une résistance à la compression, exprimée par la contrainte maximale, comparable à celle de l'os naturel, c'est-à-dire supérieure ou égale à 5 MPa. Ces résultats sont particulièrement remarquables dans la mesure où ils ont pu être obtenus sur des os entiers ou des morceaux d'os comportant des portions massives, comme par exemple des fragments de têtes fémorales, d'un volume supérieur à 1 cm , et même supeneur à 5 cm , encore mieux supérieur a 10 cm et avantageusement supérieur à 30cm3. Par rapport à l'os dont il est issu, le biomatériau de l'invention a une résistance à la compression supérieure ou égale à 75 %, préférentiellement supérieure ou égale à 100 % de la résistance à la compression du tissu osseux d'origine. Enfin les taux d'inactivation virale peuvent être quantifiés par la réduction de charge virale exprimée en log 10 du rapport entre la charge virale initiale et de la charge virale finale. Le taux d'inactivation virale obtenu grâce au procédé de l'invention est de préférence supérieur ou égal à 8 unités logarithmiques. Le procédé de l'invention permet en particulier de lutter contre les parvovirus, réputés difficiles à éliminer, toutefois son action ne se limite pas à ce type de virus puisqu'il est également efficace pour lutter contre les virus de la famille des Togaviridae, notamment du genre Alphavirus, tels que le virus de l'Hépatite C, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus ; pour lutter contre les virus de la famille des Picormaviridae, notamment du genre Enterovirus, plus particulièrement le virus Polio Sabin, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus ; pour lutter contre les virus de la famille des Herpesviridae et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus ; pour lutter contre les virus de la famille des Retroviridae, notamment du genre Lentivirus, plus particulièrement les virus de l'Immunodéficience humain NIH, et prévenir leur transmission lors des greffes de tissus. Le procédé de l'invention peut s'appliquer à tout type d'os, qu'il s'agisse d'os spongieux (ou trabéculaire) ou d'os massif. De façon préférentielle il s'applique à l'os trabéculaire pour lequel des performances particulièrement intéressantes ont été observées aussi bien en termes de délipidation que d'inactivation virale et de résistance à la compression. EXEMPLES Figures : Figure 1 : photographie d'une tête fémorale humaine traitée au Oj supercritique ; Figure 2 : coupes frontales d'une tête fémorale ; Figure 3 : emplacement des 9 échantillons parallélépipédiques dans une demi-tête fémorale ; Figure 4 : découpe dans le plan transversal ; Figure 5 : découpe des parallélépipèdes ; Figure 6 : photographie par microscopie électronique d'une tête fémorale délipidée ; Figure 7 : photographie par microscopie électronique d'une tête fémorale délipidée. 1- Préparation d'un biomatériau implantable 1.1- Préparation mécanique (étape 1 Les têtes fémorales humaines, provenant de donneurs opérés pour une arthroplastie de la hanche, sont découpées à la scie à ruban inox pour éliminer le cartilage et les ostéophytes. Un tunnel de 3 mm de diamètre est percé de part en part. Cette étape de préparation est introduite en début de procédé afin d'éliminer la barrière que constitue le cartilage et qui s'oppose à la bonne pénétration des solvants. C'est donc un matériau poreux qui est exposé à l'action du CO2 supercritique. La pénétration du fluide par toute la surface et par le centre de la tête fémorale favorise l'efficacité et la rapidité d'élimination de la moelle osseuse. 1.2- Traitement supercritique f étape 2) Les tissus sont pesés et placés dans le réacteur d'extraction puis soumis au traitement supercritique selon les paramètres définis dans le tableau I ci-dessous :
Figure imgf000008_0001
TABLEAU I Des sondes de température et de pression étalonnées sont utilisées pour la régulation automatique des paramètres. Une balance mesure la masse de graisse extraite pendant la durée du cycle. Un enregistreur fait l'acquisition en continu des données, permettant de contrôler en temps réel et à posteriori le bon déroulement du cycle. Un graphique figurant l'évolution du rendement d'extraction en fonction du taux de solvant permet de déterminer la fin de l'extraction. Celle-ci est atteinte lorsque que le rendement avoisine 50 % et qu'il devient stable. 1.3- Finition mécanique (étape 3) Après dégraissage, les échantillons secs sont pesés, puis, selon les besoins, fraisés et découpés avec une pièce à main et la scie à ruban. Certains tissus sont réduits en demi-têtes, en bloc ou transformés en copeaux. Les produits sont ensuite placés dans des paniers grillagés numérotés puis soumis aux étapes de traitement chimique. 1.4- Traitement chimique f étape 4) Les étapes d'inactivation par voie chimique (peroxyde d'hydrogène, soude et éthanol) sont réalisées sur des greffons dans leur fonne définitive. Les concentrations des solvants, les durées de trempage et les températures sont définies dans le tableau II ci-dessous. Ces opérations ont lieu dans un laveur à ultrasons, dont la fréquence de 40 kHz est adaptée au nettoyage de pièces fragiles avec de nombreuses infractuosités. Les ultrasons favorisent ainsi la pénétration des solvants dans les trabécules de l'os spongieux et le décrochage des résidus cellulaires. La sonication assure 3 fonctions importantes : - agitation performante augmentant l'efficacité du nettoyage dans les pores du tissu osseux - homogénéité de la température de traitement - reproductibilité des conditions entre les lots de fabrication. Au cours du traitement sont mesurés la température et le pH de certains bains avec des instruments étalonnés. La mesure de température concerne le peroxyde d'hydrogène. La mesure du pH concerne le bain de neutralisation par le phosphate monosodique.
Figure imgf000009_0001
TABLEAU II 1.5- Séchage (étape 5) Les produits sont, à l'issue de la phase de traitement chimique, complètement imbibés d'éthanol à 99 %. Un séchage à l'air chaud (40 ± 1°C) est alors réalisé dans une étuve ventilée. Celle-ci dispose d'une soufflerie et d'une extraction permettant un brassage homogène et l'évacuation des vapeurs d'éthanol. La durée du séchage est fonction de la quantité d'éthanol à évaporer, elle- même liée à la masse des échantillons. L'objectif est d'obtenir une humidité résiduelle inférieure à 5 %. Le séchage à l'air chaud permet de déshydrater en profondeur le tissu osseux sans altérer les caractéristiques structurales et mécaniques de l'os. 2- Evaluation de la délipidation 2.1- Détermination du taux de lipides résiduels Les têtes fémorales humaines, issues d'art?hroplastie de la hanche donc de personnes âgées, sont très chargées en moelle adipeuse, au détriment de la moelle sanguine. Cette charge en graisse doit être enlevée en vue d'éliminer le risque de transmission d'agents pathogènes, et également de favoriser l'ostéoconduction du biomatériau. Partant d'une charge en graisse d'environ 50 %, l'objectif est de ramener ce taux à moins de 1 %. Cela oblige généralement à utiliser un solvant des graisses, du type chloroforme ou acétone. Cependant, ces produits sont toxiques et difficiles à manipuler. Nous avons évalué les perfonnances du procédé pour dégraisser le tissu osseux spongieux des têtes fémorales. Pour cela, 9 échantillons préparés sur 3 lots de production, ont été adressés à l'Institut des Corps Gras ITERG (Talence, France) pour un dosage de lipides résiduels. Afin de maximiser la signification des résultats, nous avons traité les têtes fémorales entières puis nous avons prélevé la partie centrale, en vue de réaliser les mesures sur la zone la plus difficile à nettoyer. L'unité de biochimie-nutrition de 1TTERG a extrait et pesé les lipides totaux contenus dans les 9 échantillons. Les résultats de ces mesures sont exposés dans le tableau III ci-dessous :
Figure imgf000010_0001
Moyenne 0,08 % TABLEAU III
Les résultats démontrent que le taux de lipides à la fin du traitement est diminué en moyenne à moins de 0,1 %, soit 10 fois moins que ce qui était attendu. 2.2- Analyse par microscopie électronique de l'efficacité du nettoyage La sécurité virale et la diminution de l'antigénicité sont les objectifs principaux du procédé de l'invention de transformation du tissu osseux humain. Pour démontrer l'efficacité du nettoyage, nous avons observé par microscopie électronique à balayage 3 têtes fémorales entières traitées et radiostérilisées. Cette étude a été menée par le laboratoire Biomatech (Chasse-sur-Rhône, France). Les photographies correspondantes sont représentées sur les figures 6 et 7. Il ressort des résultats que le centre des trois spécimens a montré une architecture osseuse dénuée de tissu médullaire. La communication entre les lacunes osseuses était clairement visible jusqu'en profondeur des prélèvements analysés. A fort grossissement (figure 7), aucun tissu cellularisé (cellules osseuses, vaisseaux et structures nerveuses, moelle osseuse) n'a été observé. Des faisceaux de fibres de collagène orientées étaient fréquemment observés en surface. En comparaison aux prélèvements du centre des échantillons, la périphérie des 3 spécimens (surface et face latérale) a présenté les mêmes caractéristiques de cavités osseuses vides de tout élément cellularisé. Le nettoyage apparaît donc très efficace dans tout le volume de la tête fémorale, 3- Protocole expérimental pour l'évaluation de la capacité d'inactivation virale : 3.1- Principe général On teste la capacité de chaque étape du traitement à éliminer et/ou inactiver les virus : 1) en contaminant les échantillons avec une quantité significative de virus, puis 2) en effectuant l'étape de traitement considérée sur les échantillons, puis 3) en déterminant la quantité de virus éliminée et/ou inactivée durant cette étape. Les échantillons testés sont des têtes de fémur d'origine humaine choisies pour leur taille importante ; environ 50 mm de hauteur et 45 mm de diamètre après préparation mécanique. Les expérimentations sont conduites par l'Institut Pasteur (PARIS, FRANCE) selon le protocole n° 5375-A1, et conformément aux réglementations communautaires françaises, et de l'O.C.D.E., des Bonnes Pratiques de Laboratoire et en référence aux lignes directrices sur les études de validation de l'inactivation virale promulguées par l'EMEA et par LTCH (International Conférence on Harmonisation). Pour chaque expérimentation (c'est-à-dire pour chaque étape testée et chaque virus), on réalise des contrôles positifs (stock de virus de même concentration que celle utilisée pour la contamination de l'échantillon, immédiatement congelé à -75 °C ; stock de virus de même concentration, ultracentrifugé, aliquoté et congelé à -75 °C ; stock de virus de même concentration, laissé à température ambiante pendant le temps de l'expérience, puis ultracentrifugé, aliquoté et congelé à -75 °C ; échantillon contaminé dans les mêmes conditions et dont l'activité virale est immédiatement testée ; échantillon contaminé dans les mêmes conditions, non soumis à l'étape de traitement mais laissé sous hotte à température ambiante pendant la durée de l'étape de traitement, puis dont l'activité virale est testée) et des contrôles négatifs (milieu de culture utilisé pour les titrages ; échantillon mis en présence de milieu de culture, puis soumis à l'étape de traitement, puis dont l'activité virale est testée). 3.2- Protocole d'inoculation des virus Pour chaque étape à tester, les têtes fémorales issues de l'étape précédente du procédé sont lavées dans deux bains de 100 ml de milieu de culture supplémenté avec 0,5 % (en volume par volume) de sérum fœtal de veau pendant 20 minutes, sous agitation douce à température ambiante. Les têtes fémorales lavées sont essuyées sur de la gaze stérile puis séchées à l'étuve à une température d'environ 37 °C pendant une nuit. Pour l'inoculation des virus , on utilise le tunnel de 3 mm perforé lors de la préparation mécanique, mais dont la profondeur est limitée de façon à o" tenir un puits de 3 mm de diamètre et de 2 cm de profondeur. La suspension virale est introduite dans ce puits goutte à goutte jusqu'à ce que la suspension virale atteigne la surface externe de la tête fémorale. De la suspension virale est encore ajoutée sur la surface externe de la tête fémorale de façon à obtenir une contamination homogène. Des volumes similaires de virus sont introduits dans chacune des têtes fémorales perforées. Le protocole décrit ci-dessus a été mis en œuvre avec un virus MVM pour « minute virus of mice » ou virus minute de souris de la famille des parvoviridae, genre parvovirus. 3.3- Protocole de récupération des virus Chaque tête fémorale est placée dans une boîte de pétri et cassée en fragments aussi petits que possible. L'évaluation de la pénétration de la suspension virale est effectuée sur les fragments par observation visuelle. Les fragments sont rassemblés et placés dans 56 ml de milieu de culture. Le mélange est incubé sous agitation pendant 30 minutes à une température d'environ 4 °C. Le surnageant est récupéré. Les fragments sont placés dans un tube muni d'un filtre et centrifugés à 1300 tours/minute pendant 5 minutes. Le milieu infiltré dans le tissu osseux est récupéré. Les deux fractions liquides sont rassemblées pour analyse de la charge virale. 3.4- Mesure de la charge virale et du facteur de réduction Le titre viral est exprimé en « plaque-forming unit » (PFU/ml) et permet de calculer la charge virale exprimée en PFU en fonction du volume de l'échantillon et du facteur de concentration de l'ultracentrifugation. Conformément aux lignes directrices, le facteur de réduction virale d'une étape d'inactivation est défini comme le logio du rapport de la charge virale initiale et de la charge virale finale après application de l'étape. 4- Evaluation de l'effet antiviral du traitement au peroxyde d'hydrogène sous ultrasons 4.1- Conditions d'application de l'étape peroxyde d'hydrogène Les têtes fémorales issues de l'étape de traitement au CO2 supercritique et inoculées par la suspension virale de MVM ont été trempées dans un bain de solution à 35 % (m/m) de peroxyde d'hydrogène à 37 °C pendant 115 minutes et sous traitement par ultrasons à 40 kHz. 4.2- Résultats pour l'étape peroxyde d'hydrogène Après récupération des virus et mesure de la charge virale, les résultats obtenus sur deux échantillons distincts sont exposés dans le tableau IV ci-dessous :
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TABLEAU IV Moyenne de l'inactivation virale pour l'étape peroxyde d'hydrogène : > 4,84 log10 5- Evaluation de l'effet antiviral du traitement à la soude sous ultrasons 5.1- Conditions d'application de l'étape peroxyde d'hydrogène Les têtes fémorales issues de l'étape de traitement au peroxyde d'hydrogène et inoculées par la suspension virale de MVM ont été trempées dans un bain' de solution 1 M de soude à 20 °C pendant 55 minutes et sous traitement par ultrasons à 40 kHz. 5.2- Résultats pour l'étape soude Après récupération des virus et mesure de la charge virale, les résultats obtenus sur deux échantillons distincts sont exposés dans le tableau V ci-dessous :
Figure imgf000013_0002
TABLEAU V Moyenne de l'inactivation virale pour l'étape soude: 3,94 logio 6- Conclusion Les essais exposés ci-dessus ont été mis en œuvre de façon indépendante. On sait que la diminution de la charge virale par le peroxyde d'hydrogène et par la soude est cumulative. On peut donc prévoir que le facteur de réduction de la charge virale du procédé global sera d'au moins 8,78 logio- 7- Influence du procédé de l'invention sur la résistance à la compression de l'os spongieux de têtes fémorales humaines 7.1- Principe Pour être significative, l'évaluation de l'influence d'un procédé sur les propriétés mécaniques de l'os spongieux nécessite de comparer des échantillons initialement identiques. Des travaux de Brown et al, Acta Orthop. Scand., 51, 429-437, 1980 ont montré une distribution symétrique de la rigidité d'une tête fémorale humaine par rapport au plan frontal. Chaque tête fémorale est donc découpée en deux dans le plan frontal pour réaliser deux parties symétriques. L'une subit le procédé décrit au § 1. L'autre est congelée. Les mesures de résistance mécanique sont faites de façon identique pour chaque demi-tête. 7.2- Protocole Treize têtes fémorales ont été sélectionnées pour cette étude. On coupe les têtes en deux selon le plan de symétrie frontal, avec une scie à ruban inox Murin- Fouillat. Puis suivant un plan parallèle au plan frontal, on coupe dans chaque demi-tête obtenue une tranche de 15 mm d'épaisseur (Figure 2), afin de réduire l'épaisseur de la demi-tête pour pouvoir par la suite la placer entre les mors de la scie diamant lors de la phase de découpe des échantillons. Ces deux tranches ont donc une face commune ce qui assure des propriétés mécaniques suffisamment proches. Pour chacune des têtes fémorales, on obtient donc deux demi-têtes de 15 mm d'épaisseur dans la direction antéro-postérieure. L'une est congelée et sera décongelée la veille du test en compression, nous l'appellerons demi-tête « fraîche ». L'autre subit toutes les étapes du traitement de l'invention, nous l'appellerons demi-tête « traitée ». La découpe des échantillons : De façon générale, nous avons prévu de découper dans chaque demi-tête neuf échantillons parallélépipédiques comme le montre la figure 3 dans laquelle la nomenclature est la suivante : - SI : Supérieur Interne, - SM : Supérieur Médium, - SE : Supérieur Externe, - CI : Central Interne, - CM : Central Médium, - CE : Central Externe, - II : Inférieur Interne, - IM : Inférieur Médium, - IE : Inférieur Externe. Chaque demi -tête est découpée dans un premier temps à l'aide d'une scie diamant basse vitesse Isomet 2000® (Buehler) en trois tranches de 7 mm d'épaisseur sur le plan transversal : coupes (1), (2), (3) et (4) illustrées sur la figure 4. Ces trois tranches sont ensuite découpées dans le plan frontal avec la scie diamant pour donner les coupes (5) et (6) espacées de 1 O mm, représentées sur la figure 5, d'une part pour améliorer la qualité de la coupe réalisée avec la scie ruban, d'autre part pour obtenir des tranches de 10 mm de largeur. Pour terminer, la tranche est découpée à la scie diamant suivant les coupes (7), (8), (9) et (10) représentées sur la figure 5 de façon à obtenir trois parallélépipèdes de 7 x 9 x 10 mm . Essai de compression Les échantillons parallélépipédiqu&s sont soumis à un test de compression destructif sur Instron 8500 (capteur de force 1000 N, précision 1 N), dans une enceinte spécialement conçue dans laquelle circule de l'eau maintenue à une température constante de 37°C (au degré près). En ce qui concerne la compression, nous avons utilisé une vitesse de
1 mm/min soit 2,4.10"3 s"1 pour un échantillon de 7 mm de hauteur. La moelle n'ayant un effet viscoélastique que pour des vitesses de sollicitations supérieures à 10 s"1 elle ne devrait pas induire de différence entre les têtes fraîches qui ont encore leur moelle et les têtes traitées qui en sont démunies. Afin d'améliorer la reproductibilité de l'essai de compression le test en compression proprement dit est précédé d'un précyclage de 10 cycles entre 0 et 0,8 % de déformation (soit 0,056 mm pour un échantillon 4e 7 mm de hauteur) permettant d'atteindre un état stable. Cette première étape de l'essai est non destructive puisque l'on reste dans le domaine élastique de l'os, la seconde se poursuit jusqu'à la rupture de l'échantillon. Les résultats obtenus sont alors traités et l'on calcule la différence moyenne de résistance mécanique entre demi-tête traitée et demi-tête fraîche. Un test non paramétrique de Wilcoxon est enfin appliqué afin de savoir si cette différence est significative. 7.3- Résultats et discussion Comparaison des contraintes maximales de compression Pour cette étude, ont été réalisés 131 tests sur échantillons parallélépipédiques d'os frais et 125 sur échantillons parallélépipédiques d'os traité, pour 13 têtes fémorales soit 26 demi-têtes. Le tableau VI montre les contraintes maximales de compression obtenues en moyenne pour l'ensemble des échantillons.
Figure imgf000016_0001
TABLEAU VI Contraintes maximales de compression (MPa) obtenues pour les treize têtes fémorales On obtient au final une contrainte de 10,2 MPa pour l'os traité contre 9,7 MPa pour l'os frais, soit une augmentation de la contrainte après traitement de 5 %. Le nombre d'échantillons étant inférieur à 30, un test non paramétrique de Wilcoxon a été appliqué, au termes duquel cette différence apparaît comme non significative (p value = 0.55, supérieure au seuil de significativité de 0.05).

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement de tissus osseux animaux ou humains, en vue d'obtenir un biomatériau implantable, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) nettoyage mécanique du tissu osseux de toutes les matières organiques qui l'entourent, cette étape comportant le retrait du cartilage et de l'ostéophyte ; b) traitement du tissu osseux nettoyé obtenu à l'étape a) par un courant de dioxyde de carbone à l'état supercritique ; c) mise en contact du tissu obtenu à l'étape b) avec une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène, et, de façon simultanée, traitement par des ondes ultrasonores ; d) mise en contact du tissu obtenu à l'étape c) avec une solution aqueuse de soude, et de façon simultanée, traitement par des ondes ultrasonores ; e) rinçage à l'eau et neutralisation ; f) mise en contact du tissu obtenu à l'étape e) avec une première solution d'éthanol dont le titre est supérieur ou égal à 90 % en volume/volume puis avec une seconde solution d'éthanol dont le titre en volume/volume est supérieur ou égal à 95 %.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) comporte en outre une opération supplémentaire qui consiste à perforer le tissu osseux d'une extrémité à l'autre suivant son axe longitudinal.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la perforation est d'un diamètre n'excédant pas 5 mm, de préférence 3 mm.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape b) est mise en œuvre dans les conditions suivantes : le CO supercritique est placé à une pression comprise entre 100 et 500 bars, de préférence entre 250 et 270 bars et à une température comprise entre 40 et 55°C, de préférence entre 48 et 52 °C.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que après l'étape b) on procède à un découpage mécanique du tissu osseux.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape c) est mise en œuvre de la façon suivante : une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène dont le titre en poids/poids est supérieur ou égal à 1 %, de préférence supérieur ou égal à 10 %, encore plus préférentiellement à 30 %, est portée à une température comprise entre 30 et 50°C, le tissu osseux est immergé dans la solution de peroxyde d'hydrogène et soumis à un traitement par des ultrasons à une fréquence allant de 35 à 45 kHz, de préférence de 38 à 42 kHz, pendant une durée supérieure ou égale à 60 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 90 minutes, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 120 minutes.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que à l'issue de l'étape c) on procède à un rinçage à l'eau.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape d) est mise en œuvre dans les conditions suivantes : le tissu osseux est immergé dans une solution aqueuse de soude d'une concentration allant de 0,1 à 5 M, de préférence de 0,5 à 2 M, avantageusement de 0,8 à 1,2 M, à température ambiante et soumis à un traitement par des ultrasons à une fréquence allant de 35 à 45 kHz, avantageusement de 38 à 42 kHz, pendant une durée supérieure ou égale à 15 minutes, de préférence supérieure ou égale à 30 minutes, encore plus préférentiellement supérieure ou égale à 45 minutes, avantageusement supérieure ou égale à 60 minutes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que à l'étape e), le rinçage par de l'eau se fait par immersion dans un bain d'eau, en appliquant des ultrasons au tissu osseux immergé et la neutralisation se fait par immersion dans une solution aqueuse de NaH2PO4.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que après l'étape f) on sèche le biomatériau implantable et on le soumet à un traitement par des rayonnements.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'on a utilisé comme produit de départ un os trabéculaire
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on a utilisé comme produit de départ une tête fémorale humaine.
13. Biomatériau implantable constitué d'une trame osseuse collagénique susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il présente un taux de lipide, en masse par rapport à la masse totale du biomatériau, inférieur ou égal à 0,4 %, préférentiellement inférieur ou égal à 0,2 %, encore plus préférentiellement inférieur ou égal à 0,1 %, ce biomatériau étant dépourvu de trace de solvants organiques chlorés.
14. Biomatériau implantable constitué d'une trame osseuse collagénique susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il présente un taux de lipide, en masse par rapport à la masse totale du biomatériau, inférieur ou égal à 0,08 %.
15. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que la trame osseuse collagénique est d'origine humaine.
16. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le biomatériau de l'invention présente une résistance à la compression supérieure ou égale à 5 MPa.
17. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que par rapport à l'os dont il est issu, le biomatériau de l'invention a une résistance à la compression supérieure ou égale à 75 % de la résistance à la compression du tissu osseux d'origine.
18. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce qu'il est d'un volume supérieur à 1 cm3, préférentiellement supérieur à 5 cm , encore plus préférentiellement supérieur à 10 cm , avantageusement supeneur a 30 cm3.
19. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce qu'il présente un taux d'inactivation virale par rapport au tissu osseux d'origine supérieur ou égal à 8 unités logarithmiques.
20. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que tissu osseux à trame collagénique est d'origine humaine.
21. Biomatériau selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisé en ce que tissu osseux à trame collagénique est une tête fémorale humaine.
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