WO2005080564A1

WO2005080564A1 - 抗ヒトｐｃａ－１抗体

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Publication number: WO2005080564A1
Application number: PCT/JP2004/012461
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Yamamoto; Noboru Konishi; Kazutake Tsujikawa
Original assignee: Hiroshi Yamamoto; Noboru Konishi; Kazutake Tsujikawa
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2004-08-24
Publication date: 2005-09-01

Abstract

本発明はヒトＰＣＡ−１ポリペプチドのある特定のアミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体を提供する。本発明の抗体は、前立腺癌において発現が亢進しているヒトＰＣＡ−１のポリペプチドを高感度且つ高い特異性で認識できるので、ヒトＰＣＡ−１の検出、定量、前立腺癌の診断に用いることができる。当該前立腺癌の診断方法は、前立腺癌の診断、経過観察、予後の予測等に有効である。また、本発明の抗体は、従来の触診検査や血中ＰＳＡ濃度による診断によっては困難であった前立腺癌と前立腺肥大症との判別に有用である。

Description

明細書

抗ヒト P C A— 1抗体

技術分野

本発明は、ヒト P C A— 1ポリペプチドを免疫特異的に認識する抗体に関する。更に詳しくは、本発明は、配列番号 4のアミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体に関する。

背景技術

前立腺癌は、欧米において男性癌罹患率、死亡率の上位を占める悪性腫瘍である。日本でも近年、食生活の欧米ィ匕と高齢ィヒに伴い前立腺癌の罹患率、死亡率が急速に上昇している。

現在前立腺癌の診断は、癌グレード（tumor grade) やステージ等の組織病理学的判定や PSA値などの生ィヒ学的パラメータ一に依存している。中でも、集団検診や人間ドックにおいて、血中前立腺特異抗原 (Prostatic Specific Antigen： PSA) 濃度の測定が急速に普及し、比較的早期に前立腺癌が発見できるようになった。しかし、血中 PSA濃度の上昇は前立腺癌の発症後において認められるものであり、また血中 P S A濃度による診断は前立腺肥大症（benign prostatic hyperplasia: BP H)や前立腺炎 (prostatitis) との区別が困難である場合があり、前立腺癌の検出、診断、経過観察のための、より特異的で高感度な新たなマーカーの開発が望まれている。

本願発明者らは、前立腺癌の治療標的分子を検索する目的で、前立腺癌患者から摘出された前立織を、病理繊戠学的に腫瘍部分と非腫瘍部分とに分離し、非腫瘍部分と腫瘍部分との間で発現量に差のある遺伝子を解析した。その結果、非腫瘍部分と比較して腫瘍部分に特異的に高発現している遺伝子として、 P C A— 1 (ヒト AlkBホモローグ 3 (human AlkB homolog 3： hABH3)とも呼ばれる）と呼ばれる遺伝子のクローユングに成功した（第 1 2 3回日本薬学会年会要旨集 4、 ρ 1 5、 2 0 0 3年）。近年、 P C A— U D NA， R N Aアルキルィ匕損傷修復酵素であることが確認され、その機能が注目されている（ネイチヤー（Nature) 、第 4 2 1卷、 p 8 5 9 - 8 6 3、 2 0 0 3年）しかし、 P C A— 1の発現量の絶対量は、前立腺癌細胞であっても、他の発現遺伝子と比較して著しく低く、また、ヒト AlkBホモローグ 1 ( BH1) 及ぴ 2 (MB H2) と高いホモロジ一を有することから、感度が高く且つ特異性の高いヒト PCA - 1に対する抗体の獲得が求められていた。

上記事情に鑑み、本発明は、ヒト PCA—1ポリペプチドを高感度且つ高い特異性で認識する抗体を提供することを目的とする。

発明の開示

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ヒト PCA— 1ポリべプチドのある特定部分のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いれば、ヒト PCA 一 1ポリぺプチドを高感度且つ高い特異性で認識する抗体を得ることが出来ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の（1) 〜（11) に関する。

( 1 ) 配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体。

(2) ポリクローナル抗体である、上記 (1) に記載の抗体。

(3) モノクローナル抗体である、上記（1) に記載の抗体。

(4) 上記（1) 〜（3) のいずれかに記載の抗体を用いる、ヒト PCA— 1の検出、定量方法。

(5) 前立腺癌の診断方法であって、以下の工程：

a) ヒト由来の試料中のヒト PCA— 1を、上記 (1)〜（3) のいずれかに記載の抗体を用いて検出、定量する工程；

b) 当該試料中のヒト PCA— 1の有無又は量により、当該ヒトが前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；

を含む、方法。

(6) 前立腺癌と前立腺肥大症とを判別する方法であって、以下の工程： a)前立腺癌又は前立腺肥大症を発症している危険があるヒト由来の試料中のヒト PCA— 1を、上記 (1) 〜（3) のいずれかに記載の抗体を用いて検出、定量する工程； b) 当該試料中にヒト PCA— 1が検出された場合は、当該ヒトは、前立腺癌を発症している危険があると判断し、当臂纖料中にヒト PCA— 1が検出されない場合は、当該ヒトは、正常または前立腺肥大症を発症している危険があると判断するェ程；

を含む、方法。

(7)上記 (1)〜（3)のいずれかに記載の抗体を含む、ヒト PCA— 1の検出、定量用キット。

(8)上記 (1)〜（3)のいずれかに記載の抗体を含む、前立腺癌診断用キット。

(9) 上記 (1) 〜（3) のいずれかに記載の抗体を含む、前立腺癌と前立腺肥大症との判別用キット。

(10) 配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列からなるポリぺプチド。

(11) 上記（10) に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体の製造方法。本発明の抗体は、前立腺癌において発現が亢進しているヒト P C A— 1のポリべプチドを高感度且つ高い特異性で認識できるので、前立腺癌の診断薬等として有用である。特に前立腺癌と前立腺肥大症との判別に有用である。

図面の簡単な説明

図 1は前立腺癌細胞株における P CA- 1の発現のウェスタンプロット解析を示す図である。 PC-3及ぴ DU145細胞株における約 4 OkD aの蛋白質過剰発現。

図 2は前立腺における P C A— 1の免疫組織ィヒ学的検出の結果を示す図である。 (A) 前立腺の腺癌における不均質（heterogeneous) な発現。隣接する正常な腺においては認められない（X 100) 。（B) 陰性染色（X 100) 。

図 3は前立腺における P C A— 1の免疫組織化学的染色を示す図である。（A) 前立腺癌において PC A—1の発現が認められるが、隣接する正常な前立腺においては認められない。（B) 前立腺癌において、 PC A— 1の核への局在が認められる症例を示す。

発明の詳細な説明ヒトにおいて、 P C A— 1はヒト AlkBホモローグ 3 (human AlkB homolog 3： h ABH3)あるいは DEPC - 1とも呼ばれる分子である。

正常ヒト P C A— 1遺伝子の c D N Aの塩基配列は配列番号 1であり、このうち第 4 0 7番目-第 1 2 6 7番目の残基（配列番号 3 ) がタンパク質コード領域に該当し、配列番号 2のアミノ酸配列からなるヒト P CA— 1ポリペプチドをコードする。

ヒト P C A— 1遺伝子は第 1 1番染色体の 1 1 p 1 1のローカスにコードされており、 P C A— 1遺伝子おょぴその周辺の染色体 D NA塩基配列はジーンパンクァクセッション番号 NT— 009237 (NC B Iホームページ）等に開示されている。本発明の抗体は、ヒト P C A—1ポリペプチドの一部（アミノ酸第 6 4番目から 7 6番目）である、配列番号 4 (RRAPEPRVIDREG) のアミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識することを特徴とする。

本発明の抗体が認識するアミノ酸配列の長さは、ェピトープとして免疫原性を有する長さであれば特に限定されないが、好ましくは 6アミノ酸以上、より好ましくは 8ァミノ酸以上、更に好ましくは 1 0ァミノ酸以上であり、最も好ましくは配列番号 4のアミノ酸配列の全長である。

「免疫特異的な認識」とは、その抗体が他の配列に対するその親和性よりも特定の配列に対して実質的に高い親和性を示すことを意味する。

本発明における「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb) 等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジエニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、 Fab発現ライプラリーによって作製された抗体断片、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及ぴこれらの結合性断片である。

結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えば F(ab' ) ₂、 Fab、 Fab、 Fv (variable fragment of antibody) 、 sFv、 dsFv (disu丄 phide s tabilised Fv) 、 dAb (single domain antibody) 等が挙げられる（Exp. Opin. T her. Patents, Vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996) 。抗体のクラスは、特に限定されず、 IgG、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、 IgG又は IgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくは IgGである。

ポリク口一ナル抗体あるいはモノクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、免疫原を、必要に応じてフロイントアジュパント（Freund， s Adjuvant) とともに、哺乳動物、例えばポリクロ一ナル抗体の場合，マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ゥサギ、ネコ、ィヌ、プタ、ャギ、ゥマあるいはゥシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ャギ、ゥマ又はゥサギに，モノクローナノレ抗体の場合，マウス、ラット、ハムスターに免疫する。

免疫原は、必要に応じて、担体に架橋させて用いられる。担体としては、例えば BSA、 KLH等が挙げられる。また、免疫される動物由来のタンパク質（例えば血清タンパク質等）を担体として用いてもよい。

本発明の抗体の製造に用いられる免疫原としては、配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列を有するポリペプチドが用いられる。好ましくは、当該ポリべプチドは配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列からなるポリぺプチドである。部分配列の長さは、ェピトープとして免疫原性を有する長さであれば特に限定されないが、好ましくは 6アミノ酸以上、より好ましくは 8アミノ酸以上、更に好ましくは 1 0ァミノ酸以上であるが、より好ましくは、配列番号 4のァミノ酸配列からなるポリペプチドが用いられる。

また、上記ポリぺプチドを担体に架橋する等の目的で、 1個又は複数個のァミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは 1〜1 0個、より好ましくは 1〜5個、更に好ましくは 1〜2個、最も好ましくは 1個である。

付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドの N末端、 C末端いずれでもよいが、好ましくは N末端である。付加されるアミノ酸の種類は、自体公知の 2 0種のアミノ酸のいずれでもよレ、が、好ましくは付加されるアミノ酸にシスティンが少なくとも 1つ含まれる。より好ましくは、付加されるアミノ酸はシスティンからなる。

ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ャギ、ゥマ又はゥサギ、好ましくはャギ、ゥマ又はゥサギ、より好ましくはゥサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に 1乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約 1乃至 1 4日毎に 1乃至 5回免疫を行って、最終免疫より約 1乃至 5日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。

血清をポリクローナノレ抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、飽和硫酸アンモニゥム、ュ一グロプリン沈澱法、力プロイン酸法、力プリル酸法、ィォン交換クロマトグラフィー（DEAE又は DE52等）、抗ィムノグロプリンカラムあるいはプロテイン A/Gカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたァフィ二ティカラムクロマトグラフィーにより単離及び Z又は精製される。

モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイプリドーマ（S4合細胞）を調製し、該ハイプリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによつて製造される。

モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原を、マウス、ラットあるいはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジヱニック動物を含む）の皮下内、筋肉內、静脈内、フッドパッド內あるいは腹腔内に 1乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約 1乃至 1 4日毎に 1乃至 4回免疫を行って、最終免疫より約 1乃至 5 0 後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。

モノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラー及ぴミルシュタインらの方法（Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975)及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエ口一マ細胞との細胞融合させることにより調製される。

細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ P 3/X63-AG8. 653 (653； ATCC No. CRL1580) 、 P3/NSI/卜 Ag4- 1 (NS- 1) 、 P3/X63-Ag8. Ul (P3U1) 、 SP2/0- Agl4 (S_P2/0、 Sp2) 、 PAI、 F0あるいは廳 147、ラット由来ミエ口一マ 210RCY3— Ag. 2. 3.、ヒト由来ミエ口一マ U - 266AR1、 GM1500-6TG- A1— 2、 U C729- 6、 CEM- AGR、 D1R11あるいは CEM-T15を使用することができる。

モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーユングは、ハィプリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたゥエルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、例えば RIAや ELISA等の酵素免疫測定法によつて測定することにより行なうことができる。

ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビト口、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はゥサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのィンビポで行い、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。

インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及ぴ培養方法等の種々条件に合わせて、ハイプリドーマを増殖、維持及存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。

モノクローナル抗体は、上述のポリク口ーナノレ抗体と同様に、単離及ぴ Z又は精製されることが好ましい。

また、キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）， Vol. 1. 6, No. 10, 198 8J 、特公平 3- 73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平 4 - 506458号公報、特開昭 62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol. 7, p. 13—21， 1994」、特表平 4—504 365号公報、国際出願公開 W094/25585号公報、「日経サイエンス、 6月号、第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」、「Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994」、特表平 6 -500233号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。

F(ab' )₂¾:ぴ Fab'は、ィムノグロプリンを、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。

本発明の抗体は、ヒト P CA—1ポリペプチドをきわめて高感度且つ高い特異性で認識することができるので、ヒト P C A— 1の検出、定量、濃縮等に用いることができる。

本発明の抗体をヒト P C A— 1の検出、定量に用いる方法においては、測定対象の試料と本発明の抗体とを接触させて、当該抗体の当該試料に対する特異的結合を検出、定量する。例えば、ウェスタンプロット法、免疫組織染色、 ELISA法、 RIA 法、表面プラズモン共鳴法、プロテインチップ等の自体公知の方法を用いることができる。

ヒト P CA— 1の検出、定量に用いることができる試料としては、特に限定されず、例えば、ヒトから分離された組織（例えば、前立腺、胸腺、精巣等）、細胞（組織から分離された細胞（培養された細胞も含む）、正常細胞、癌細胞、細胞株等）、液体成分（血液、血清、血漿、精液、唾液、尿、汗等）、これらの抽出物等が挙げ ' られる。また、ヒトから分離された組織又は細胞を適当な培養液中で培養することにより調製することのできる培養物（例えば、培養上清等）も試料として用いることが出来る。該培養物の調製における培養液の種類、培養時間等の条件は、当該分野において用いられる通常のものが用いられる。当該試料は、精製、固定、加熱、溶解、濃縮等の処理をされているものをも含む。

ヒト P CA— 1は、核への移行性が高く、細胞外へ分泌されるとは考えられてこなかったが、本発明の抗体は、ヒト P C A— 1ポリペプチドをきわめて高感度且つ高い特異性で認識することができるので、本発明の検出、定量方法を用いることにより、細胞外へ分泌された極めて微量のヒト P C A—1ポリペプチドを検出、定量し得る。従って、本発明のヒト P C A— 1の検出、定量方法は、ヒトから分離された液体成分（血液、血清、血漿、精液、唾液、尿、汗等）や、ヒトから分離された組織又は細胞を適当な培養液中で培養することにより調製することのできる培養物（例えば、培養上清等）に含まれるヒト P C A— 1ポリペプチドの検出、定量に適している。

例えば、ウェスタンプロット法においては、例えば、試料を適切な溶解緩衝液 (1 ysis buffer) 等中で溶解し、タンパク質成分を抽出する。抽出された試料を、電気泳動（例えば SDS-PAGE、等電点電気泳動、二次元電気泳動等）に供し、分離する。ゲル中の蛋白質を膜（例えばニトロセルロース膜、 PVDF膜等）に転写する。非特異的結合を抑制するために BSA等で膜を処理し、引き続き、膜上に転写されたタンパク質を本発明の抗体と接触させる。膜を適切な洗浄緩衝液により洗浄し、本発明の抗体の特異的結合を自体公知の方法（例えば標識二次抗体を用いた方法等）により検出し、その結果として、試料中のヒト P C A— 1を検出、定量する。

また、免疫組織染色においては、例えば、凍結した又はパラフィン包埋した試料等を用いて、切片を作成し、当該切片をスライドガラス等の上に固定する。必要に応じて、当該切片を、脱パラフィン処理や、加熱処理等の処理をしてもよい。引き続き当該切片を本発明の抗体と染色させる。切片を適切な洗浄緩衝液により洗浄し、本突明の抗体の特異的結合を自体公知の方法（例えば標識二次抗体を用いた方法等）により検出、その結果として、試料中のヒト P C A—1を検出、定量する。

ELISA法としては、本発明の抗体を 2種類、あるいは本発明の抗体とヒト P C A — 1ポリペプチドを免疫特異的に認識する他の抗体とを組合せて用いる、サンドィツチ ELISA法等を挙げることが出来る。

本発明の検出、定量方法は、ヒト P C A— 1が疾患の発症、進行に関与している疾患、ヒト P C A—1をマ一カーとして用いることが可能な疾患の診断に用いることができる。当該疾患としては、例えば癌（前立腺痛、乳癌、滕癌等）が挙げられる。特に、前立腺癌においては、 P C A—1の発現が亢進しているので、本発明の検出、定量方法は前立腺癌の診断に有用である。また、前立腺肥大症においては、 P S Aの発現様式とは異なり、 P C A— 1の発現は亢進していないことから、本発明の検出、定量方法は特に前立腺癌と前立腺肥大症との判別に有用である。即ち、本突明は、前立腺癌の診断方法であって、以下の工程： a ) ヒト由来の試料中のヒト P C A— 1を、本発明の抗体を用いて検出、定量する工程；

b ) 当該試料中のヒト P C A— 1の有無又は量により、当該ヒトが前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；

を含む、方、法に関する。

本発明において、「前立腺癌」とは、前立腺において発生した癌を広く包含する概念であり、前立腺に発生した腺癌のみならず、扁平上皮癌、移行上皮癌、神経内分泌癌、未分化癌等をも包含する。好ましくは、前立腺癌は前立腺に発生した腺癌である。

本発明の前立腺癌の診断方法において用いられる試料としては、上述の試料を全て用いることが出来るが、好ましくは前立腺、前立腺から分離された細胞、前立腺癌細胞、前立腺細胞株、血清及ぴこれらの抽出物である。また、前立腺、前立腺から分離された細胞、前立腺癌細胞、前立腺細胞株を適当な培養液中で培養することにより調製することのできる培養物も試料として好ましい。

検出、定量の結果、ヒト由来の試料中にヒト P C A— 1が検出された場合は、当該ヒトは、前立腺癌を発症している危険がある（又は高い）又は発症する危険がある（又は高レ、）と判断する。逆に、ヒト試料中にヒト P C A— 1が検出されない場合は、当該ヒトは前立腺癌を発症している危険がない（又は低い）又は発症する危険がない（又は低い）と判断する。

また、ヒト由来の試料中にヒト P C A— 1が検出された場合において、試料中のヒト P C A— 1量が多い場合は、当該量が少ない場合と比較して、前立腺癌を発症している危険又は発症する危険がより高いと判断することができる。

本発明の彭断方法においては、コントロールとして、前立腺癌を発症しているヒト由来の試料（陽性コント口ール）、健常ヒト由来の試料（陰性コント口ール）を用いることで、より精度の高い診断を行うことができる。

また、本発明の前立腺癌の診断方法は、他の前立腺癌の診断方法等と組合せて用いることにより、診断の精度を向上させることができる。他の前立腺癌の診断方法としては、触診検査、血清中等の前立腺特異抗原 (P S A) 濃度を用いる方法、前立腺針生検サンプルを用いた病理検査（病理学的 Tステージ（pathological T st age:_PT) ) 、グレーソン癌スコア（Gleason tumor score) 、超音波検查、 MR I， C T, 骨シンチ等が挙げられる。

また、本発明は、前立腺癌と前立腺肥大症とを判別する方法であって、以下のェ程：

a )前立腺癌又は前立腺肥大症を発症している危険があるヒト由来の試料中のヒト P C A— 1を、本発明の抗体を用いて検出、定量する工程；

b ) 当該試料中にヒト P CA—1が検出された場合は、当該ヒトは、前立腺癌を発症している危険があると判断し、当該試料中にヒト P C A— 1が検出されない場合は、当該ヒトは、正常または前立腺肥大症を発症している危険があると判断するェ

；

を含む、方法に関する。

「前立腺癌又は前立腺肥大症を発症している危険があるヒト」とは、男性ヒト全てを含みうるが、好ましくは、自覚症状（残尿感等）、触診検查（前立腺のしこり等）、血清中等の PSA濃度検査（高値の PSA濃度等）等により前立腺癌又は前立腺肥大症を発症していることが疑われる男性ヒトをいう。

本発明の判別方法において用いられる試料は、上述の診断方法において用いられる試料と同様である。

検出、定量の結果、ヒト試料中にヒト： P C A—1が検出された^^は、当該ヒトは、前立腺癌を発症している危険があると判断し、当該試料中にヒト P CA— 1が検出されない場合は、当該ヒトは、正常または前立腺肥大症を発症している危険があると判断する。

本発明の判別方法においては、コントロールとして、前立腺癌を発症しているヒト由来の試料（陽性コントロール）、前立腺肥大症を発症しているヒト又は健常ヒト由来の試料（陰性コントロール）を用いることで、より精度の高い判別を行うことができる。また、本発明は、本発明の抗体を含む、ヒト P CA— 1の検出、定量用キットに関する。当該キットを用い、上述の方法によりヒト P CA— 1を検出、定量することが出来る。当該キットは、更に標識二次抗体、基質等を含むことができる。また、本発明は、本発明の抗体を含む、前立腺癌診断用キットに関する。当該キットを用いて、上述の方法により前立腺癌を診断することが出来る。当該キットは、好ましくは更に、本発明の抗体は前立腺癌の診断に使用することが出来る、又は使用すべきであることを記載した記载物を含む。当該キットは、更に標識二次抗体、基質等を含むことができる。

また、本発明は、本発明の抗体を含む、前立腺癌と前立腺肥大症との判別用キットに関する。当該キットを用いて、上述の方法により前立腺癌と前立腺肥大症とを判別することが出来る。当該キットは、好ましくは更に、本発明の抗体は前立腺癌と前立腺肥大症との判別に使用することが出来る、又は使用すべきであることを記載した記載物を含む。当該キットは、更に標識二次抗体、基質等を含むことができる。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではなレ、。

(実施例 1 )

免疫前の血清を 2匹のニュージーランド白色ゥサギ（日本 S L C株式会社）から第 1回目の免疫前に採取した。免疫原としては、ヒト P C A— 1ポリペプチドの部分配列である RRAPEPRVIDREG (配列番号 4 ) のァミノ酸配列の N末端にシスティン残基が 1つ付加した、 CRRAPEPRVIDREG (配列番号 5 ) のァミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた。当該ポリペプチドは K L Hに MBS法により架橋した（シグマジエノシス）。 K LHに架橋させた当該ペプチド（約 0. 5 m g ) を同体積のフロイントアジュパント中にェマルジヨン化し、ゥサギの皮下の複数箇所に注射した。初回はフロイント完全アジュバントを，それ以後はフ口イント不完全ジュパントを用いた。各ゥサギから 2週間間隔で辺縁静脈より全部で 5回採血し、各試料から抗血清を調製した。 E L I S Aにより、抗血清試料の同一ポリペプチドに対する相対的な反応性を評価し、高い力価の抗血清を SulfoLink(Pierce Biotech.ネ: fc )を用いてァフィュティ精製した。

(実施例 2)

(ウェスタンプロット解析）

ATCC (American Type Culture Collection)より入手したヒト前立腺癌細胞株 P C— 3、及ぴ DU— 145を、 10%の熱不活性化胎児ゥシ血清 (PAA Lab.製）及ぴ 1 OmgZm 1のカナマイシンを添加した適切な培養液（シグマ社製）中で、 3 7 °C、 5½C0₂の環境下で培養した。細胞は 1 m 1の氷冷した溶解緩衝液 ( 1 % N P 4 O、 150 mM N a C 1、 50 mM Tr i s pH7. 4、 5 mM EDTA、 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride及ぴ 1 mM benzamidine) 中に氷上で溶解した。不溶解物を除去するために、細胞ライセートを遠心分離し、 1 0% SDS— PAGEにより分析した。ライセートタンパク質を SDS-ポリアクリルアミドゲルから-トロセルロース膜（Schleicher & Schuell Bio Science ネ環）に転写し、内在活性を 3 %ゥシ血清アルプミン（BSA) TBS-T (20 mM Tr i s— HC 1 pH8. 0、 137mM Na C 1、 0. 1% Twe e n 20) にてブロックし、 0. 2 μ g/m 1の抗 PC A— 1ポリクローナル抗体 (実施例 1にて製造）とともに室温にて 1時間ィンキュベートし、 TBS— Tにより 3回洗净した。抗体結合を検出するために当該膜を T B S— T中に希釈した H R P (Horseradish peroxidase) 橋抗ゥサギ I gG (Santa Cruz Biotech. に曝した。 TB S— Tにて 3回洗浄後、結合した HRP架橋物（con jugate)を増強ィ匕学発光試薬、 enhanced chemiluminescent reagent) (Wako Pure Chemical ¾fc$¾) により可視ィ匕した。

結果を図 1に示す。

図 1から明らかなように、前立腺癌細胞株の細胞溶解液をウェスタンブロット解析した結果、 PC— 3及ぴ DU— 145細胞株において、約 40 kD aの PC A— 1タンパク質産物が確認された。

検出されたパンドは単一のバンドであり、ヒト PCA— 1ポリペプチド以外の蛋白質に対する非特異的な結合は認められなかった。 (実施例 3 )

実施例 1により製造された抗 P C A— 1ポリクローナル抗体を、 7 0個の前立腺癌試料における P C A— 1発現の免疫組織化学的解析に用いた。

全ての前立鹏且織は 1 0 %中 '14爰衝ホルマリンにより固定し、パラフィン中に包埋し、組織病理学的解析のために 4 πιに切片化した。脱パラフィン化の後、切片を 1 0 mMクェン酸ナトリウム緩衝液 ( H6. 0)に浸しォートクレープ中 1 2 0 °C で 5分間熱した。切片を室温にて 1時間、抗血清の 1 ： 2 0 0希釈とインキュベートした。反応は引き続き Histofine SAB-PO kit (二チレイネ土製）及び色素として d iaminobenzidineを用いて可視ィヒし、へマトキシリンにより対比染色した。 2 0 % より少ない腫瘍細胞が陽性であった場合を（一）、 2 0 %以上 5 0 %以下の腫瘍細胞が陽性であった場合を（+)、 5 0 %を超える腫瘍細胞が陽性であった場合を（+ +) として免疫染色の相対程度を記録した。

結果を図 2、 3及び表 1に示す。

表 1 前立における P C A— 1の発現

図 2、 3から明らかなように、免疫組織学的解析の結果、前立腺癌において P C A— 1の特異的発現が認められた。正常前立腺 (prostatic glands) は抗 P C A— 1抗血清による染色が陰性であった。

表 1に、免疫組織学的解析による前立腺癌における P C A— 1の発現の相関をまとめる。表 1から理解されるように、 P C A— 1の発現は癌部前立藤織の 9 0 % ( 6 3 / 7 0 ) で陽性であった。また，非癌部前立膨袓織は 7 0例すベて陰性であつた。以上の結果から、 P C A—1は前立腺癌に極めて特異的に発現していることが示唆された。 (実施例 4 )

実施例 1により製造された抗 P C A— 1ポリクロ一ナル抗体を、 5 7個の前立腺肥大症試料における P C A— 1発現の免疫組織化学的解析に用いた。陽性コントロ一ノレとして前立腺癌試料を用いた。免疫組織化学的解析は実施例 3と同様の条件にて行った。

その結果、前立腺肥大症 5 7例は全て P C A—1の発現は陰性であった。一方、陽性コントロールである前立腺癌は P C A— 1の発現が陽性であり、癌周囲の正常腺管は P C A— 1の発現が陰性であった。

産業上の利用可能性

本明の抗体は、前立腺癌において発現が亢進しているヒト P CA- 1のポリべプチドを高感度且つ高い特異性で認識できるので、ヒト P C A— 1の検出、定量、前立腺癌の診断に用いることができる。本発明の前立腺癌の診断方法は、前立腺癌の診断、経過観察、予後の予測等に有効である。また、本発明の抗体は、従来の触診検査や血中 P S A濃度による診断によつては困難であった前立腺癌と前立腺肥大症との判別に有用である。本出願は、日本で出願された特願 2 0 0 4— 4 7 0 3 4を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。配列表フリーテキスト

配列番号 4 ：ヒト P C A— 1ポリベプチドの部分配列

配列番号 5 ：抗ヒト P C A— 1抗体調製のための免疫原

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体。

2. ポリクローナル抗体である、請求項 1に記載の抗体。

3. モノクローナル抗体である、請求項 1に記載の抗体。

4. 請求項 1〜 3のいずれかに記載の抗体を用いる、ヒト PCA—1の検出、定量方法。

5. 前立腺癌の診断方法であって、以下の工程：

a) ヒト由来の試料中のヒト PCA— 1を、請求項 1〜 3のいずれかに記載の抗体を用いて検出、定量する工程；

を含む、方法。

6. 前立腺癌と前立腺肥大症とを判別する方法であって、以下の工程：

a )前立腺癌又は前立腺肥大症を発症している危険があるヒト由来の試料中のヒト P C A— 1を、請求項 1〜 3のいずれかに記載の抗体を用いて検出、定量する工程； b) 当^;料中にヒト PCA— 1が検出された場合は、当該ヒトは、前立腺癌を発症している危険があると判断し、当該試料中にヒト P C A— 1が検出されない場合は、当該ヒトは、正常または前立腺肥大症を発症している危険があると判断するェ程；

を含む、方法。

7. 請求項 1〜3のいずれかに記載の抗体を含む、ヒト PCA— 1の検出、定量用キット。

8. 請求項 1〜3のいずれかに記載の抗体を含む、前立腺癌診断用キット。

9. 請求項 1〜 3のいずれかに記載の抗体を含む、前立腺癌と前立腺肥大症との判別用キット。

1 0. 配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列からなるポリぺプチド。

1 1 . 請求項 1 0に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、配列番号 4のァミノ酸配列又はその部分配列を免疫特異的に認識する抗体の製造方法。