WO2005073372A1 - 新規味覚改変ポリペプチドnas、そのdna及びその用途 - Google Patents

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WO2005073372A1
WO2005073372A1 PCT/JP2005/001068 JP2005001068W WO2005073372A1 WO 2005073372 A1 WO2005073372 A1 WO 2005073372A1 JP 2005001068 W JP2005001068 W JP 2005001068W WO 2005073372 A1 WO2005073372 A1 WO 2005073372A1
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amino acid
polypeptide
acid sequence
seq
sequence
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PCT/JP2005/001068
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Keiko Abe
Tomiko Asakura
Hiroyuki Sorimachi
Tazuko Uenoyama
Kenichiro Nakajima
Katsuhiko Kitamoto
Junichi Maruyama
Mikiya Kishi
Original Assignee
Mitsukan Group Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
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    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • Novel taste-modified polypeptide NAS, its DNA and its use
  • the present invention relates to a novel taste-modifying polypeptide NAS, its DNA and its use, and more particularly, to a polypeptide NAS, its gene, a dimeric protein neoculin having a taste-modifying activity containing the protein, and The present invention relates to a taste-modifying composition containing neoculin.
  • Curculigo latifolia is a plant classified in the lily family native to West Malaysia and southern Thailand and the like, and the curculin homologue (isoform) (hereinafter referred to as curculin) contained in the plant. Is considered to be useful as a taste modifying substance that gives a sweet taste when eating or drinking water or sour substances after eating it.
  • curculin A examples include knoreculin A, curtalin B, and the like.
  • curculin A has already been determined (for example, see Patent Document 1). Further, the entire amino acid sequence and the nucleotide sequence of curculin B are also disclosed, and it has been confirmed that several amino acids differ in amino acid composition from curculin A (for example, see Patent Document 2).
  • neoculin has a taste-modifying function sufficient to be added to foods, which is the finding first confirmed by the present invention.
  • NAS and NBS are considered to be produced as inclusion bodies in Escherichia coli cells, and correct NAS and NBS can exert taste-modifying activity simply by being expressed in Escherichia coli. Little heterodimer was produced.
  • Patent Document 1 JP-A-3-190899
  • Patent Document 2 JP-A-6-189771
  • Non-Patent Document 1 "Bioscience 'Biotechnology' and 'Biochemistry (
  • Non-Patent Document 2 "FEBS Letters", Vol. 573, p. 135-138, 2004
  • An object of the present invention is to find a substance having a better taste-modifying function as described above, determine the structure of the taste-modifying substance, elucidate it also at the genetic level, and determine the primary structure of the substance. And a gene encoding the same, and a novel taste-modifying composition comprising the taste-modifying substance.
  • This neocrine has an activity to remarkably reduce the acidity, bitterness or harshness of foods and drinks, and has an activity to enhance palatability of foods and drinks, that is, a taste-modifying activity, and is far superior to the taste-modifying effect of curculin. , It was found to be practical.
  • neotalin contained a novel subunit NAS (neoculin acidic subunit) and a known subunit of curculin.
  • NAS neoculin acidic subunit
  • curculin A and B neoculin basic subunit
  • the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS was analyzed, and as a result of elucidating neoculin at the gene level, the base protein of the precursor protein (PNAS) containing the power of the mature protein of NAS, the signal peptide and the extended peptide was analyzed. The sequence was also found.Neoculin was actually added to food and drink, and it was confirmed that it had a taste-modifying activity.In addition, as a result of examining the expression system of neoculin in different species, the genes encoding NAS or PNAS, and NBS were found. Was established in a host, and an expression system that enables the secretion and production of neoculin as a heterodimer having a taste-modifying function outside the cells was established.
  • the present invention is based on such findings.
  • the present invention described in claim 1 is a polypeptide NAS shown in the following (A) or (B).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence comprises one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, carohydrates, or inversions, and the following (a) ) Or a polypeptide capable of forming a dimeric neoculin having a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS shown in (b).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing comprises substitution, deletion, insertion, insertion, or inversion of one or several amino acids, and constitutes curculin.
  • the N-linked sugar chain having a ratio of mannose / N-acetyldarcosamine Z fucose / xylose of 3/2 / lZl is added.
  • the polypeptide is NAS.
  • the present invention according to claim 3 is a DNA of a gene encoding the polypeptide NAS shown in the following (A) or (B).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the present invention described in claim 4 is the DNA of the gene described in claim 3, which is the DNA shown in the following (A) or (B).
  • (A) DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 70 to 408 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the present invention described in claim 5 is the polypeptide PNAS shown in the following (A) or (B).
  • A a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
  • B In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, the amino acid sequence comprises one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, carohydrates, or inversions, and is matured by processing.
  • an N-linked sugar chain having a ratio of mannose / N-acetyldarcosamine Z fucose / xylose of 3/2 / lZl is added.
  • the present invention according to claim 7 is a DNA of a gene encoding the polypeptide PNAS shown in the following (A) or (B).
  • the present invention described in claim 8 is the DNA of the gene described in claim 7, which is the DNA shown in the following (A) or (B).
  • a DNA comprising a base sequence consisting of base numbers 4-1 477 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing.
  • the present invention according to claim 9 comprises the polypeptide NAS according to claim 1 or 2 and the polypeptide NBS shown in the above (a) or (b), and has a taste-modifying activity. It is the characteristic dimeric protein neoculin.
  • the present invention according to claim 10 comprises the dimeric protein neoculin according to claim 9.
  • a taste-modifying composition characterized by containing as an active ingredient.
  • the present invention described in claim 11 is a recombinant vector comprising the DNA described in claim 3 or 4, or the nucleotide sequence constituting the DNA described in claim 7 or 8.
  • the present invention according to claim 12 is a recombinant vector comprising a nucleotide sequence constituting the DNA of a gene encoding the polypeptide NBS shown in the following (a) or (b).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing comprises substitution, deletion, insertion, insertion, or inversion of one or several amino acids, and constitutes curculin.
  • the present invention according to claim 13 is the recombinant vector according to claim 11, wherein the vector is a vector that functions in eukaryotes.
  • the present invention according to claim 14 is the recombinant vector according to claim 12, wherein the vector is a vector that functions in eukaryotes.
  • the present invention according to claim 15 is the recombinant vector according to claim 11, wherein the vector is a vector that functions in filamentous fungi.
  • the present invention according to claim 16 is the recombinant vector according to claim 12, wherein the vector is a vector that functions in a filamentous fungus.
  • the present invention according to claim 17 is the recombinant vector according to claim 11, wherein the vector is a vector that functions in Aspergillus.
  • the present invention according to claim 18 is the recombinant vector according to claim 12, wherein the vector is a vector that functions in Aspergillus.
  • the present invention according to claim 19 provides the recombinant vector according to claims 11 and 12, the recombinant vector according to claims 13 and 14, the recombinant vector according to claims 15 and 16, or the claim.
  • a transformant comprising the recombinant vector according to 17 or 18.
  • the present invention according to claim 20 is the method for producing neoculin according to claim 9, wherein the transformant according to claim 19 is cultured.
  • the present invention has an excellent taste-modifying activity and, unlike curculin, has a heterodimer structure.
  • a novel dimeric protein neoculin has been provided, and it has become possible to provide a novel taste-modifying composition that can be used in foods and the like using the protein.
  • an amino acid sequence of a subunit constituting the protein is provided.
  • the protein can be provided by an appropriate synthesis method.
  • an appropriate host can be selected, and particularly, the protein can be efficiently provided using a koji mold as a host by using genetic engineering technology. It has become possible.
  • FIG. 1 is a diagram when purified neocrine powder is subjected to SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions and stained with CBB.
  • FIG. 2 is a view when purified powder of NAS and NBS is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB.
  • FIG. 3 is a view of an HPLC elution pattern of chymotrypsin-digested peptide of S-carboxyamidomethylated NAS.
  • FIG. 4 is a diagram of an HPLC elution pattern of S-carboxyamidomethylated NAS endoproteinase Asp_N digested peptide.
  • FIG. 5 is a diagram of quantitative analysis of amino acids released by trypsin digestion of S-carboxyamidomethylated NAS.
  • FIG. 6 is a diagram of a quantitative analysis of amino acids released by carboxypeptidase A digestion of S-carboxyamidomethylated NAS (lnmol).
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence of NAS.
  • FIG. 8 shows a sugar chain structure estimated from a sugar composition analysis of a sugar chain added to NAS.
  • FIG. 9 is a diagram when curculin is subjected to SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions and stained with CBB.
  • FIG. 11 A diagram showing an outline of a method for producing an NBS expression vector.
  • FIG. 9 is a diagram showing a result of a blotting analysis.
  • FIG. 14 (a) Elution pattern of purified by gel filtration column chromatography. Each fraction was subjected to SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions, and then (b) CBB staining and
  • (c) is a diagram showing the result of Western blotting analysis.
  • N in the fourth row indicates an amino acid sequence portion determined from the N-terminus
  • C114 indicates chymotrypsin digestion ability
  • D1-4 indicates an endoproteinase Asp_N digestion.
  • the amino acid sequence portion of the obtained peptide is shown
  • T14 shows the amino acid sequence portion of the peptide obtained from trypsin digestion.
  • ⁇ Indicates the sequence obtained from the C-terminal force.
  • the neoculin of the present invention is a dimeric protein comprising the polypeptide NAS and the polypeptide NBS shown in the following (a) or (b) and having a taste-modifying activity.
  • polypeptide NAS (neoculin acidic subunit) is the first protein reported by the present inventors.
  • polypeptide NBS neoculin basic subunit
  • the NBS is specifically known.
  • Means curcurin subunits such as curcurin A and B.
  • neoculin of the present invention can be obtained, for example, by appropriately combining known methods of separation and purification with curculigo 'latifolia, a plant belonging to the lily family.
  • the powder obtained by homogenizing the freeze-dried Curculigo 'latifolia fruit is extracted with a large amount of pure water, and the supernatant is discarded by centrifugation. Remove unnecessary matter.
  • the remaining precipitate is extracted with an acidic aqueous solution having a pH of 2.0 or less, neoculin is obtained in the extract.
  • the extract is neutralized, concentrated, desalted, and dried by a usual treatment method (preferably, non-heat treatment) to obtain a sufficiently practical protein neoculin.
  • polypeptide NAS described in the following (2) is artificially prepared and added to the polypeptide NBS obtained by extracting and purifying from neoculin or known curculin, or artificially synthesizing. Can also be obtained by combining Further, it can be obtained by the manufacturing method described in the following (6).
  • the neoculin of the present invention has a taste-modifying activity.
  • the taste-modifying activity refers to an activity that remarkably reduces sourness, bitterness or harshness, and enhances palatability of food and drink.
  • the activity of suppressing the bitterness of a food having bitterness the activity of suppressing the astringency of a food having an astringent taste, the activity of imparting sweetness to the food, the activity of imparting a sweetness to a food exhibiting an acidity, and the sourness are exhibited. It means the activity to suppress the acidity of food and drink.
  • polypeptide NAS of the present invention is a polypeptide shown in the following (A) or (B).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence comprises one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, carohydrates, or inversions, and the following (a) Or a polypeptide capable of forming a dimeric neoculin having a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS shown in (b).
  • the amino acid sequence comprises substitution, deletion, insertion, insertion, or inversion of one or several amino acids, and constitutes curculin.
  • the polypeptide of the present invention comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (A) according to the present invention is one of the components constituting a dimeric neoculin having a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS. It is the first thing they found.
  • polypeptide NBS (neoculin basic subunit) is (a) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, or (b) an amino acid of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acids, preferably 115 amino acids, and which can be a subunit constituting curculin means.
  • polypeptide NBS specifically, a polypeptide (curculin B) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and a polypeptide having the tryptophan at position 73 in the amino acid sequence substituted with asparagine
  • curculin B ' the amino acid sequence of the peptide
  • the lysine at position 28 the tryptophan at position 73
  • the tryptophan at position 78 the asparagine at position 81 were substituted with asparagine, asparagine, cysteine and alanine, respectively.
  • the polypeptide (curculin A) The polypeptide (curculin A).
  • the polypeptide NAS of the present invention may be (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, but may be substantially the same as the (A) polypeptide.
  • the polypeptide that is, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in (B) Sequence Listing, one or several, preferably 115, amino acid substitutions, deletions, insertions, caroylations, or inversions And a dimer neoculin which has a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS.
  • the polypeptide NAS is preferably added with a sugar chain in that the binding strength to the polypeptide NBS is increased and, as a result, neocrine can be formed with high stability.
  • an N-linked sugar chain is added.
  • the N-linked sugar chain is a general term for a sugar chain structure extending from N-acetyl glucosamine bonded to an asparagine residue in the primary structure of a protein.
  • N-linked sugar chains in particular, mannose (Z) -N-acetyl glucosamine (Z-ZylZl), a specific force of fucose / xylose Z2ZlZl
  • Z-ZylZl mannose (Z) -N-acetyl glucosamine
  • fucose / xylose Z2ZlZl a specific force of fucose / xylose Z2ZlZl
  • FIG. 8 may have a caro, lack, substitution, or modification.
  • the binding site of the N-linked sugar chain in the polypeptide NAS is considered to be the 81st asparagine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in consideration of the binding characteristics of the N-linked sugar chain. You.
  • the polypeptide NAS of the present invention is a subunit that forms neoculin, it can be obtained by combining the method of purifying curculigo containing neoculin 'known separation from the fruit of Latifolia' by a known purification method.
  • neoculin obtained by the method described in Example 1 (1) is purified by appropriately combining known ion exchange chromatography methods as described in Example 1 (2) and (3), and When applied to a cation exchange column by a commonly used method as described in Example 2, polypeptide NBS having an isoelectric point of 8.6 was adsorbed to the column, and polypeptide NAS was a non-adsorbed fraction. Is obtained.
  • the polypeptide NAS having an isoelectric point of 4.7 is adsorbed on the column, which is eluted, desalted, and dried. Just fine.
  • the polypeptide shown in the above (A) or (B) can be synthesized by an appropriate synthesis method such as solid phase synthesis, partial solid phase synthesis, solution synthesis, and fluorenylmethyloxycarbonyl method. (Fmoc method), t-butyloxycarbonyl method (tBoc method), and other chemical synthesis methods.
  • the polypeptide shown in (B) has a substitution, deletion, insertion, addition or reverse of one or several, preferably 115 amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can also be obtained by modifying the amino acid sequence to include a position, for example, by site-directed mutagenesis.
  • polypeptide PNAS of the present invention is a polypeptide shown in the following (A) or (B).
  • the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is a polypeptide containing the signal peptide and the extension peptide of the polypeptide NAS described in (2) above.
  • the present inventors have found for the first time a precursor of the peptide NAS. That is, (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is converted into (A) a precursor of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in plant cells in plant cells. It is a polypeptide that is produced and becomes a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (A) by processing.
  • the polypeptide PNAS which is a NAS precursor, may be (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, but it is substantially the same as the (A) polypeptide. Substitution, deletion, insertion, addition, or reverse of one or several, preferably 115 amino acids in the same polypeptide, ie, (B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing
  • the polypeptide may be a polypeptide capable of forming a dimeric neoculin having a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS after the amino acid sequence containing the position has become a mature polypeptide NAS by processing.
  • polypeptide NBS is as described in the above (2).
  • the polypeptide PNAS is processed to produce a signal peptide portion (a portion consisting of the amino acid sequence of amino acid Nos. 1-222 in the amino acid sequence of SEQ ID No. 3 in the sequence listing) and an extended peptide (sequence in the sequence listing).
  • a signal peptide portion a portion consisting of the amino acid sequence of amino acid Nos. 1-222 in the amino acid sequence of SEQ ID No. 3 in the sequence listing
  • an extended peptide sequence in the sequence listing.
  • a sugar chain is added because it is possible to form neoculin having high affinity, and it is particularly preferable that an N-linked sugar chain is added.
  • the ratio of mannose ZN-acetinoleg / recosamine (N-acetyl glucosamine) Z-coose (fucose) xylose (xylose) is 3/2/1/1
  • a part of the structure shown in Fig. 8 may have a carohydrate, absent, substituted, or There may be modifications.
  • the binding site of the N-linked sugar chain in the polypeptide PNAS is assumed to be asparagine at position 103 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, considering the binding characteristics of the N-linked sugar chain. Is done.
  • polypeptide PNAS is a precursor of the subunit NAS that forms neoculin
  • the polypeptide PNAS is obtained by genetic engineering techniques based on the DNA of the gene encoding PNAS shown in (4) below. Obtainable.
  • the polypeptide shown in the above (A) or (B) can be synthesized by an appropriate synthesis method such as solid phase synthesis, partial solid phase synthesis, solution synthesis, and fluorenylmethyloxycarbonyl method ( It can be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method) and the t_butyloxycarbonyl method (tBoc method).
  • polypeptide shown in (B) has a substitution, deletion, insertion, addition, or substitution of one or several amino acids, preferably 115 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can also be obtained by modifying the amino acid sequence to include an inversion, for example, by site-directed mutagenesis.
  • the DNA of the present invention is the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS described in the above (2) and the DNA of the gene encoding the polypeptide PNAS described in the above (3).
  • the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS is the polypeptide NAS described in the above (2), more specifically, the polypeptide NAS shown in the following (A) or (B). Is the DNA of the gene encoding
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS is (A) a DNA containing a base sequence consisting of base numbers 70 and 408 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the base sequence 1J substantially the same as this, that is, the base sequence consisting of base numbers 70 to 408 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of (B) Sequence Listing or Is a DNA capable of hybridizing with a DNA having a nucleotide sequence which can be a probe prepared from at least a part of the nucleotide sequence under stringent conditions and forming a dimeric neocrine having a taste-modifying activity together with the polypeptide NBS. It can also be obtained as DNA encoding a peptide.
  • the polypeptide NBS is as described in the above (2).
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNAs with high homology, for example, DNAs with 90% or more homology hybridize, and DNAs with lower homology, Are not hybridized, or normal hybridization washing conditions, such as washing at 65 ° C with 0.1 X SSC at a salt concentration equivalent to 0.1% SDS. I can do it.
  • the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS can be obtained, for example, by extracting mRNA from the fruit of Curculigo 'Latifolia' several weeks after pollination, and performing reverse transcription polymerase 'chain' reaction (RT-PCR). CDNA is synthesized and packaged into a phage vector. This is infected with a phage to obtain a cDNA library. Subsequently, a probe prepared based on the amino acid sequence of the polypeptide NAS revealed by the present invention is plaque-hybridized to identify, recover, and obtain the target DNA. it can.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase 'chain' reaction
  • oligonucleotides synthesized based on the base sequence consisting of base numbers 70 to 408 can also be obtained by PCR using primers as primers.
  • the DNA shown in the above (A) or (B) can also be synthesized by the DNA synthesizer described above.
  • DNA shown in (B) may be appropriately substituted, for example, by a site-specific mutagenesis method into the base sequence consisting of base numbers 70 to 408 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, It can be obtained by introducing a deletion, insertion, or addition mutation. It can also be obtained by a known mutation process.
  • the DNA of the gene encoding the polypeptide PNAS specifically includes (A) the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 4-1 477 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the force S that can be obtained as DNA, a base sequence substantially the same as this, that is, (B) the base sequence consisting of base numbers 4 to 477 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the base sequence
  • a nucleotide sequence that can be a probe created from at least a part of the nucleotide sequence, and after processing into a mature polypeptide NAS, it has a taste-modifying activity together with polypeptide NBS.
  • It can also be obtained as DNA encoding a polypeptide capable of forming a dimeric neoculin.
  • the polypeptide NBS is as described in the above (2).
  • stringent engineering conditions are the same as in the case of the DNA of the gene encoding the polypeptide NAS.
  • Such DNA of the gene encoding the polypeptide PNAS can be obtained, for example, from the fruit of Curculigo'latifolia several weeks after pollination in the same manner as in the case of the mature polypeptide NAS.
  • PCR using an oligonucleotide synthesized based on nucleotide numbers 441 to 477 as primers, or various commercially available DNA synthesizers The ability to synthesize the DNA shown in (A) or (B).
  • the DNA shown in (B) is appropriately replaced with, for example, the base sequence consisting of base numbers 4-1 477 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing by using site-directed mutagenesis or the like. , Deletion, insertion, or addition mutation. It can also be obtained by known mutagenesis. It is needless to say that the two DNAs of the present invention may contain a base sequence adjusting element and a structural portion of the gene.
  • the taste-modifying composition of the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a dimeric protein neoculin having a taste-modifying activity. About neocrine,
  • the taste-modifying composition of the present invention may be ingested as it is, but may be mixed with an appropriate amount of a food or drink or a drug such as vegetable juice, fruit juice such as grapefruit, seasoning liquid for various dishes such as sushi, and the like. May be used.
  • the blending amount of neoculin is preferably 5 to 5,000 ⁇ g, particularly preferably 50 to 500 zg / ml, in the case where the composition is added to a beverage with highly purified neoculin powder.
  • the taste-modifying composition of the present invention may be processed into powder, solution, sheet, spray, granule, emulsion, or the like, depending on the properties of the food, drink, or drug to be blended. Can use power.
  • genes encoding NAS and NBS which are two types of subunits constituting neoculin, and a gene encoding PNAS have been identified.
  • a host-vector system for expressing these genes with high efficiency and enabling industrial production of neoculin a system containing the DNA of the gene encoding NAS or the DNA of the gene encoding PNAS is used.
  • a recombinant vector comprising the DNA of the gene encoding NBS as well as a recombinant vector.
  • the present invention also provides a transformant containing a combination of the above two types of recombinant vectors.
  • the present invention also provides a method for producing a dimeric protein neoculin having a taste-modifying activity, which comprises culturing the above transformant.
  • the two types of recombinant vectors of the present invention described above that is, the DNA of the gene encoding NAS (that is, A recombinant vector containing the DNA of claim 3 or 4) or the DNA of the gene encoding PNAS (i.e., the DNA of claim 7 or 8); and It is necessary to simultaneously introduce a recombinant vector containing the DNA of the gene encoding NBS shown in (a) or (b) into the host.
  • neoculin is a heterodimer consisting of different subunits, NAS and NBS, so that both NAS and NBS subunit proteins need to be produced.
  • Such a recombinant vector of the present invention needs to have an expression control function including a promoter function for expressing a gene encoding NAS or a gene encoding NBS.
  • the recombinant vector must have a function to secrete and produce, outside the host cell, NAS and NBS produced by expressing the NAS gene and NBS gene introduced into the vector in the host cell. Is desirable.
  • a protein secreted by the host for example, in the case of Aspergillus (A. sp., Etc.), a gene encoding the secreted protein ⁇ -amylase derived from Aspergillus oryzae is used.
  • Aspergillus Aspergillus
  • a gene encoding the secreted protein ⁇ -amylase derived from Aspergillus oryzae is used.
  • the fusion protein when expressed as a fusion protein as described above, it is desirable that the fusion protein also has a processing function for converting the fusion protein into a NAS or NBS-only protein.
  • a processing function for converting the fusion protein into a NAS or NBS-only protein For example, using a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence (Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys, Arg-Arg) recognized by a KEX2-like protease present in the Golgi apparatus of Aspergillus oryzae, By incorporating the nucleotide sequence between ⁇ -amylase and NAS and NBS, expressing it, and subsequently reacting with ⁇ 2-like protease, human amylase was isolated from the fusion protein produced by the recombinant vector. , NAS and NBS dimeric proteins can be obtained.
  • the steric structure near the recognition sequence of ⁇ 2 may cause inaccuracy, and neoculin may form a heterodimer and be near the cleavage site. Since the three-dimensional structure is expected to be complicated, it is preferable to improve the cutting efficiency and the cutting accuracy. For example, NAS and NBS ⁇ terminal Asp Just before Gly, Ala, Ser, etc., the molecular weight is small and the side chains are small.
  • Such a series of operations can be performed more easily by using a vector construction kit (Multisite Gateway Three-Fragment Vector Construction Kit; manufactured by Invitrogen). That is, using the kit, (a) preparation of a 5 ′ entry clone, (b) preparation of a target gene entry clone, (c) 3, preparation of an entry clone, (d) three types of entry one clone And a destination.
  • the construction is performed in the order of the production of the recombinant vector by the recombination reaction with the vector, and a desired recombinant vector can be obtained.
  • it is also possible to produce a recombinant vector by cutting out a necessary gene fragment and introducing it into an appropriate site on a vector according to a conventional method.
  • recombinant vector of the present invention examples include pgFa3GNaSJ (Fig. 10) as a recombinant vector into which a gene encoding NAS has been introduced, and pgFa3GNbTa (Fig. 11) as a recombinant vector into which an NBS gene has been introduced. Can be mentioned.
  • a gene encoding PNAS when introduced, for example, a gene encoding NAS in pgFa3GNaSJ or a plasmid in which the gene encoding NBS in pgFa3GNbTa has been replaced with a gene encoding PNAS can be mentioned.
  • the transformant of the present invention will be described.
  • the transformant of the present invention is obtained by incorporating the above two types of recombinant vectors into an appropriate host.
  • eukaryotes are desirable.
  • a prokaryotic organism such as Escherichia coli
  • the protein is produced as an inclusion body in the microbial cell, as described above in the section of the background art, and this is called the correct heterodimer capable of exerting taste-modifying activity. Therefore, it is necessary to dissolve the polypeptides NAS and NBS constituting the inclusion body using a dissolving agent such as guanidine chloride and the like, and then to undergo a restructuring (reconstitution) step. Absent.
  • eukaryotes such as Aspergillus
  • a reagent such as a lysing agent
  • it can exhibit taste-modifying activity without requiring an extra step such as reconstitution. It can be secreted and produced as neocrine.
  • filamentous hosts for introducing the recombinant vector of the present invention are filamentous.
  • filamentous hosts for introducing the recombinant vector of the present invention are filamentous.
  • koji molds include Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae), and a typical example thereof is Aspergillus oryzae NS4 strain.
  • the present inventors introduced a recombinant vector of a gene encoding NAS and NBS into Aspergillus oryzae NS4 strain, and introduced Aspergillus oryzae NS.
  • the NAB2 strain was obtained.
  • the Aspergillus oryzae NS-NAB2 strain has been deposited with the Patent Organism Depositary, the 6th independent administrative corporation, Tsukuba Central, Ibaraki, Japan, under the deposit number FERM ABP-10 209.
  • a dimeric protein neoculin having a taste-modifying activity which is characterized by culturing the above transformant, can be produced.
  • the transformant is preferably cultured under conditions such that the expression ratio of the gene encoding NAS and the gene encoding NBS is a specific ratio. If the expression level is biased in either one, homodimers are formed, the production ratio of the heterodimer consisting of NAS and NBS decreases, and the production efficiency of neoculin decreases.
  • high expression is achieved with high probability from among the transformants obtained when the ratio of the gene encoding NAS and the gene encoding NBS used in the transformation operation is set to 1: 5.
  • the strain was selected.
  • heterodimer having the taste-modifying activity of the recombinant vector or the transformant of the present invention can be efficiently produced.
  • Curculigo 'latifolia fruit was purified according to the following procedure, and an attempt was made to obtain a novel protein having a taste-modifying activity.
  • Table 1 summarizes the protein content, activity yield, and degree of purification of the substances obtained in each of the above purification steps.
  • neoculin acidic subunit (NAS) and neoculin basic subunit (NBS).
  • Native_PAGE was performed on 1 lmg of the purified neoculin powder obtained in the above (1)-(3) using a 10% acrylamide gel containing 6 M urea. The obtained band was cut out, and a sample extracted from the gel with water was freeze-dried. The freeze-dried sample was suspended in 150 / l of water, and two panelists, each containing 50 ⁇ ⁇ in their mouth, showed that the sample had a sweet taste. It was confirmed that the acidity of .02-cuic acid was converted to sweetness, and that it had a taste-modifying activity.
  • one-thousandth of the collected sample was subjected to SDS-PAGE and subjected to silver staining, and a single band was observed at the position of 20 kDa, confirming that the taste-modifying active substance was neoculin. .
  • Example 1 The neoculin obtained in Example 1 was further purified according to the following procedure, and each subunit constituting neoculin was analyzed.
  • the NBS fraction and the NAS fraction obtained in (1) and (3) were dialyzed, respectively, and lyophilized to obtain a purified powder.
  • SDS-PAGE was performed using 10 xg of these purified powders, as shown in Fig. 2 (this, the NAS fraction, and the NBS fraction (only 13 kDa and llkDa (7) One band was observed, confirming that each subunit was purified.
  • Example 2 70 ⁇ g of the purified NAS powder obtained in (1)-(3) was subjected to two-dimensional electrophoresis, and the gel after the electrophoresis was superimposed on a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, and the electric current was applied vertically. was transferred. After the transferred PVDF membrane was stained with SYPRO Ruby protein blot stain (manufactured by Molecular Probes), a band was cut out by a usual method, and the N-terminal amino acid sequence was determined using an amino acid sequencer (HP G1005A Protein Sequencing System).
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • phenylisothiocyanate PITC
  • PTC amino acid phenylthioforce rubamyl derivative
  • PTH amino acid thiothiohydantoin
  • Example 2 10 mg of the purified NAS powder obtained in (1)-(3) was dissolved in 100 ml of 500 mM Tris-hydrochloric acid buffer ( ⁇ 80) containing 6 M urea and 20 mM DTT. This solution was allowed to stand at 50 ° C for 1 hour. 100 mg of lodoacetamide was added, mixed, and shaken in the dark at room temperature for 45 minutes. The reaction solution was dialyzed and freeze-dried to obtain S-carboxyamidomethylated NAS.
  • the chymotrypsin digestion of the S-carboxyamidomethylated NAS obtained in (i) above was performed in a 0.1 M Tris-monohydrochloride buffer (pH 8.0) at 37 ° C. for 16 hours.
  • the protein concentration was 0.2 mgZml and the enzyme: substrate ratio was 1:20.
  • the reaction was stopped at 100 ° C for 3 minutes.
  • the S-carboxamidomethylated NAS endoproteinase Asp-N obtained in (i) above was placed in a 50 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 0.01% SDS at 37 ° C for 16 hours. I went. The protein concentration was 1.0 mg / ml and the enzyme: substrate ratio was 1: 100. The reaction was stopped at 100 ° C for 3 minutes.
  • the chymotrypsin peptide, the endoproteinase Asp_N-digested peptide and the trypsin-digested peptide obtained by the operation of ⁇ ⁇ (ii) one Uv) were converted into TSKgel ⁇ DS_80TsQA force ram (Tosoh I., diameter 4.6 mm XI 5 cm ) Was separated by HPLC. Each peptide was eluted by a linear gradient elution method of acetonitrile containing 0.05% trifluoroacetic acid.
  • Figure 3 shows the HPLC elution pattern of the chymotrypsin-digested peptide detected by absorption at 220 nm.
  • Figure 4 shows the HP LC elution pattern of the endoproteinase Asp_N-digested peptide detected in the same manner.
  • Figure 4 shows the HPLC elution pattern of the trypsin-digested peptide.
  • Figure 5 shows each of them.
  • the peptide which was detected by absorption at 220 nm and collected, was dried, and the internal amino acid sequence was analyzed using an amino acid sequencer (Procise 49 lcL or Protein sequencing System or Procise 492HT Protein Sequencing System).
  • the S-carboxamidomethylated NAS lnmol carboxypeptidase A plasmid obtained in (2) (i) above was placed in a 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ ⁇ 7.5) containing 0.15% SDS at 25 ° C. C went.
  • the protein concentration was 5 mg / ml
  • the enzyme: substrate ratio was 1:40
  • sampling was performed immediately after the start of the reaction and after 6 hours of the reaction.
  • an equal amount of 10% trichloroacetic acid was added to the reaction solution, allowed to stand at 0 ° C for 30 minutes, and then centrifuged to collect the supernatant.
  • Carboxypeptidase A has an extremely low activity of releasing Pro or Arg
  • the fourth amino acid from the C-terminal was estimated to be Pro or Arg
  • the C-terminal sequence of NAS was confirmed to be NLSP / R from the C-terminal side.
  • N in the fourth row indicates the amino acid sequence portion determined from the N-terminus
  • C114 indicates the amino acid sequence portion of the peptide obtained by digestion with chymotrypsin
  • D14 indicates the amino acid sequence portion obtained from digestion of endoproteinase Asp_N.
  • the amino acid sequence part of the obtained peptide is shown
  • T14 shows the amino acid sequence part of the peptide obtained from trypsin digestion.
  • the symbol “-” indicates a system 1J from which the C-terminal force was obtained.
  • the amino acid sequence U of NBS consisted of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and was almost completely identical to the amino acid sequence of curtalin B, which is a polypeptide already disclosed in JP-A-6-189771. Gly was added to the S- and C-terminals, which was one residue longer than the number of amino acid residues 114 in curtalin B.
  • a peptide having a sugar chain-added consensus sequence that is, the chymotrypsin-digested peptide CI of the purified NAS obtained in Example 3 (2) (ii) was recovered, and an ABEE sugar composition analysis kit plus S (manufactured by Honen Corporation) was used.
  • an ABEE sugar composition analysis kit plus S manufactured by Honen Corporation
  • sialic acid was liberated, converted to a reducing sugar, and subsequently, all glycosidic bonds contained in the glycoprotein sugar chain were cleaved by acid hydrolysis to be released into a monosaccharide.
  • the resulting monosaccharide was labeled, separated by HPLC using a TSKgel ODS_80TsQA column (manufactured by Tosoichi Co., diameter 4.6 mm ⁇ 7.5 cm), detected at 305 nm absorption, and prayed.
  • FIG. 8 shows the results and the sugar chain structure added to NAS estimated with reference to the sugar chain structure generally found in plants.
  • Curculigo's Latifolia fruit (supplied by Yamashina Plant Museum, Nippon Shinyaku Co., Ltd.) was used as the material. Approximately 20.6 g of fruit 4 to 8 weeks after pollination were frozen with liquid nitrogen and ground to prevent thawing. Using 20.6 g of the powder thus obtained as a sample, Poly (A) + mRNA was extracted using mRNA Purification Kit (manufactured by Amersham Bioscience). About 4.5 ⁇ g of the extracted mRNA was used to prepare a cDNA library using a cDNA Synthesis Kit (manufactured by Amersham Bioscience). The cDNA was inserted into a ⁇ ⁇ vector (Stratagene) via EcoRI adapter ligation.
  • Genomic DNA was extracted from the freeze-dried Curculigo 'Latifolia fruit 20 mg using a DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Based on the amino acid sequence of NBS disclosed in JP-A-6-189771, an NCIS primer shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and an NC1A primer shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing were synthesized and extracted. PCR reaction (94 ° C, 3 minutes, 42 ° C, 3 minutes, 72 ° C, 3 minutes 1 cycle, 94 ° C, 30 ha, 42 ° C, 30 ha) After performing 50 cycles at 72 ° C for 1 minute, a 469 bp DNA fragment encoding a part of the NAS was obtained. This DNA fragment was used as a probe.
  • the single plaque phage obtained in (3) was co-infected with helper phage and XLl_Blue MRF 'and ex vivo in vivo; pBluescriptll SK (1) containing the insert cDNA was cut out from the I I vector.
  • the nucleotide sequence of the cDNA was determined by the dideoxy method.
  • the determined nucleotide sequence was as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleotide sequence consisting of base number 70 408 is the amino acid sequence of NAS obtained in Example 4 (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing). Consistent with the described amino acid system IJ).
  • an open reading frame (ORF) containing the amino acid sequence of NAS was found in the portion consisting of nucleotide numbers 4-1 477 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. This confirms that NAS is produced in the form of a precursor peptide (PNAS) containing a signal peptide and an extension peptide.
  • PNAS precursor peptide
  • the amino acid sequence IJ of the PNAS encoded by the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 4 to 477 is as described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Vegetable juice to which neoculin was added was prepared according to the following procedure, and its taste modifying activity was evaluated.
  • Totoro Toda 135 g of freshly cut spinach, 65 g of peppers, 65 g of celery, and 25 g of lemon juice, add 300 ml of water, suspend the mixture for 5 minutes with a mixer, filter this with a nylon mesh with a pore size of 0.1 mm. 400 ml of vegetable juice was obtained.
  • a panel sample was prepared by adding 4 mg of the purified neoculin powder of Example 1 to 100 ml of this vegetable juice, and adding 10 mg of the purified neoculin powder as a high-concentration vegetable juice. Sensory evaluation was performed. The evaluation point was the bitterness and savory taste of additive-free vegetable juice
  • the neoculin of the present invention has an effect of significantly reducing bitterness and astringency and enhancing the taste of foods by imparting sweetness.
  • Grapefruit juice added with neocrine was prepared according to the following procedure, and its taste modifying activity was evaluated.
  • a sample containing 1 OOml of grapefruit juice and 1% Omg of the purified neoculin powder of Example 1 was added as a high-concentration sample, 5mg was added as a low-concentration sample, and no-added grapefruit juice was used as a control sample.
  • Sensory evaluation was performed by four persons. The evaluation score was 0 for the bitterness, sourness, and sweetness of the target sample. For each taste, 2 points when markedly enhanced, 1 point when enhanced, and 1 point when markedly reduced. Points, and the point when it was reduced was set to 11 points. Table 3 shows the average of the evaluation results.
  • neoculin of the product of the present invention has the effect of remarkably reducing bitterness, suppressing acidity, and imparting sweetness to enhance food taste.
  • a seasoning solution for sushi material to which neocrine was added was prepared according to the following procedure, and its taste-modifying activity was evaluated.
  • the seasoning for sushi is referred to as a seasoning of sushi material, either as it is, or by being pre-applied or immersed in sushi material for sushi that has been heat-treated once. It is a seasoning.
  • the composition of the seasoning for sushi was as shown in Table 4.
  • the seasoning for sushi material was used after being appropriately diluted with water according to the type and amount of the sushi material when used, and thus was used by diluting it twice in this example.
  • Example 1 To 100 ml of the diluted sushi seasoning solution, 11.3 mg of the purified neocrine powder of Example 1 was added to obtain a neocrine-added seasoning solution.
  • Shrimp was immersed in the neocrine-added seasoning liquid for 20 minutes to obtain shrimp sushi ingredients (samples with neocrine).
  • shrimp were similarly immersed in a seasoning liquid for a diluted sushi material without addition of neocrine powder to obtain a sushi material of the prawn (control sample).
  • curculin B was expressed by the method disclosed in Example 1-12 of JP-A-6-189771.
  • SDS-PAGE confirmed that curculin B formed a homodimer. That is, when 10 zg of kunoreculin powder was subjected to SDS-PAGE at a gel concentration of 15% and then CBB stained, a single band was observed at approximately 20 kDa under non-reducing conditions, as shown in Figure 9. In addition, it was confirmed that one band was observed at about llkDa under reduction. The following sensory test was performed using the homodimer and curculin.
  • the purified neoculin obtained in Example 1 was adjusted to a concentration of 30, 50, 75, lOO ig / ml and the curculin obtained in (1) was adjusted to lOO ⁇ g / ml with water.
  • Example 11 Expression of neoculin in Aspergillus oryzae was confirmed using a vector containing the DNA of the gene encoding NAS and a vector containing the DNA of the gene encoding NBS.
  • neoculin was produced by expressing a gene encoding NAS and a gene encoding NBS using human amylase, which is a protein secreted in a large amount in Aspergillus oryzae, as a carrier.
  • Recombinant vectors (pgFa3GNaSJ and pgFa3GNbTa) were prepared using a Hector construction kit (Multisite Gateway Three-Fragment Vector construction Kit; manufactured by Invitrogen).
  • the method using this kit is as follows: (a) Preparation of 5 'entry clone, (b) Preparation of target gene entry clone, ( c ) Preparation of 3 ' entry clone, (d) Three types of entry clone and destination '' Construct the expression vector by recombination reaction with the vector.
  • a 5 ′ entry clone (pg5 ′ PFa) was prepared according to the method of Mabashi et al. (See, for example, 2004 Japanese Society of Agricultural Chemistry, p. 24, 2004).
  • RIB No. 40 the genome of Aspergillus oryzae RIB40 strain (conserved as RIB No. 40 at the National Institute of Liquor Research and available as RIB No. 40) is designated as type III, and the sequence of the salt shown in SEQ. Primer 1 (5'_GGGGACAACTTTG The underline indicates the attB site sequence) and the sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • the amplified fragment obtained by PCR was introduced into the donor vector pDONR P4-PlR (manufactured by Invitrogen) using the recombination reaction between the attB site and the attP site (BP recombination reaction). (Hereinafter, referred to as pg5'PFa). Thereafter, pg5'PFa was introduced into Escherichia coli DH5 strain, and the obtained colonies were grown. Thereafter, the plasmid was extracted.
  • the entry clone (pgE3GNa) of the gene encoding NAS was prepared as follows. That is, in the cDNA clone of the gene encoding NAS, the mature region of NAS (the portion encoding 23 Asp 135 Asn, the portion consisting of nucleotide numbers 70-408 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) is used. Primer 3 (5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAA) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 designed by adding a KE X2 cleavage sequence (Lys-Arg) and 3 residues of Gly before the N-terminus
  • a primer 4 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing designed by adding a nucleotide sequence containing a stop codon after the C-terminus.
  • the amplified fragment obtained by PCR was introduced into a donor vector pD ⁇ NR221 (manufactured by Invitrogen) using a BP recombination reaction to obtain an entry clone of a gene encoding NAS (hereinafter, referred to as pgE3GNa). Thereafter, pgE3GNa was introduced into Escherichia coli DH5 strain, and the obtained colonies were proliferated and plasmids were extracted.
  • the entry clone of the gene encoding NAS was basically performed in the same manner as in the case of the gene encoding NAS described above. That is, in the cDNA clone of the gene encoding NBS, the mature region of NBS (the portion encoding 23 Asp- 137 Gly, the portion consisting of nucleotide number 67411 in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing). And a primer 5 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing designed by adding a KEX2 cleavage sequence and 3 residues of Gly before the N-terminus (5′—GGGGACAAGT
  • CCTGCTCTCCG-3 ' with the underlined sequence consisting of the attB primer system IJ) and the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing designed by adding a system 1J with a termination codon after the C-terminal.
  • the amplified fragment obtained by PCR was introduced into a donor vector pD ⁇ NR221 (manufactured by Invitrogen) using a BP recombination reaction to obtain an entry clone of a gene encoding NBS (hereinafter referred to as pgE3GNb). Thereafter, pgE3GNb was introduced into Escherichia coli DH5 strain, and the obtained colonies were proliferated and plasmids were extracted.
  • entry clones (pg3'sCJ and pg3'Ta) were prepared according to the method of Mabashi et al. (For example, see the 2004 Annual Meeting of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, p. 24, 2004).
  • pgDSN a plasmid incorporating the sequence of amyB terminator 1 and the ATP sulfurylase (sC) gene of Asperugillus nidulans (base sequence described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing)
  • sC ATP sulfurylase
  • the underline indicates the sequence of the attB primer) to amplify the sequences of the amyB terminator 1 and the sC gene of Asperugillus nidulans.
  • the amplified fragment obtained by PCR was introduced into a donor vector pD ⁇ NRP2R_P3 (manufactured by Invitrogen) using a BP recombination reaction to obtain a 3 ′ entry clone (hereinafter referred to as pg3 ′ sCJ). Then, pg3 'sCJ was introduced into E. coli DH5 strain, and the resulting colonies were expanded. After propagation, the plasmid was extracted.
  • primer 1 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing as base type 1J described in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing (5′-GGGGACAGCTTTCTTGTA CAAAGTGGGATCTGTAGTAGCTCGTGAAG-3, where underlined is the attB primer Sequence)
  • primer 10 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • PCR was performed using GCGTGC-3 '(underlined indicates the attB primer sequence).
  • the amplified fragment obtained by PCR was introduced into a donor vector pD ⁇ NRP2R_P3 (manufactured by Invitorogen) by a BP recombination reaction to obtain a 3 ′ entry clone (hereinafter, referred to as pg3′Ta). After that, colonies obtained by introducing the strain into Escherichia coli DH5 strain were grown, and then plasmids were extracted.
  • a recombinant vector into which the DNA of the gene encoding NAS was introduced that is, a NAS expression vector (hereinafter, referred to as pgFa3GNaSJ) was prepared as follows.
  • FIG. 10 shows an outline of the production process and structure of such pgFa3GNaSJ.
  • a recombinant vector into which the DNA of the gene encoding NBS was introduced that is, an NBS expression vector (hereinafter, referred to as pgFa3GNbTa) was prepared as follows.
  • the three types of entry clones pg5 'PFa obtained in (a) described above, pgE3GNb obtained in (b), and pg3' Ta obtained in (c), were transformed into the destination 'vector pDE After mixing with STR4-R3 (manufactured by Invitrogen), LR Clonase Plus Enzyme Mix was added, and LR recombination reaction was performed. The resulting recombinant vector was introduced into Escherichia coli DH5a strain for transformation, and the resulting colony was propagated. Thereafter, pgFa3GNbTa was extracted as a target recombinant vector.
  • FIG. 11 shows an outline of the production process and structure of such pgFa3GNbTa.
  • the first feature is that the gene encoding beguhi-amylase, which expresses a fusion protein of NAS and NBS with human amylase, encodes the gene encoding NAS and NBS; That was introduced with the gene.
  • gnorecoamylase a secreted protein of the host. It has been reported that the production volume increased as a result (Biosci. Biotechnol. Biochem.), Vol. 58, No. 5, p. 895 —899, 1994). However, use of another secreted protein as a carrier has not been studied. Here, the present inventors have tried to stabilize a heterologous protein in the secretory pathway and increase the production amount using ⁇ -amylase, which is the enzyme secreted by Aspergillus' oryzae in the largest amount.
  • the second feature is that a recognition sequence (Lys-Arg) of ⁇ 2 has been introduced into the linking portion between ⁇ -amylase and NAS or NBS.
  • KEX2-like protease is present in the Golgi apparatus of Aspergillus.
  • KEX2 protease is a serine protease that recognizes basic amino acid pairs (Lys_Lys, Lys_Arg, Arg_Lys, and Arg-Arg: KEX2 recognition sequence) and cleaves its C-terminal.
  • these proteins having the KEX2-recognized sequence are transferred to the Golgi apparatus, they are cleaved by the KEX2-like protease in the Golgi apparatus. Therefore, by introducing the KEX2 recognition sequence, the fusion protein, monoamylase, and NAS or NBS are cleaved (processing), and NAS or NBS alone can be obtained.
  • the third feature is that the cutting efficiency is improved.
  • the above-mentioned cleavage by KEX2 may be incorrectly performed depending on the three-dimensional structure near the KEX2 recognition sequence.
  • Neocrine forms a heterodimer, and the steric structure near the cleavage site was expected to be complex.Therefore, three residues of Gly were inserted just before the N-terminal Asp of NAS and NBS, resulting in cleavage. Improvements in efficiency and cutting accuracy were made.
  • the cells were collected with sterilized Miracloth (manufactured by Calbiochem) and washed with sterilized water.
  • the cells were transferred to an L-shaped tube containing eate buffer, pH 5.5) and gently shaken at 30 ° C for 3 hours to form protoplasts.
  • the obtained protoplasts were passed through Miracloth to remove bacterial cell residues, and an equal amount of Sol-2 (1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HC1, pH 7.5) was added.
  • Sol-2 1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HC1, pH 7.5
  • the plants were planted three times in 0, 2% glucose, 1.5% Agar, pH 5.5) to stabilize the trait. 1 step
  • the cells were shake-cultured in a 00 ml flask at 30 ° C. and 200 rpm for 3 days.
  • the cells were separated from the culture using Miracloth and collected.
  • the recovered culture was subjected to SDS-PAGE (15% acrylamide) under reduction, then transferred to a PVDF membrane (Millipore), and subjected to stamp lotting analysis.
  • the membrane was immersed in TBST containing 5% skim milk and gently shaken at room temperature for 60 minutes. 2.
  • 0.5 ⁇ l of anti-neocrine antibody was added as a primary antibody to 5 ml of TBST containing 5% skim milk, put in a plastic bag, and left at room temperature for 60 minutes.
  • 2.5 ⁇ l of alkaline phosphatase-conjugated anti-Egret IgG antibody (manufactured by Sigma) was added to TBST containing 5% skim milk as a secondary antibody. And left at room temperature for 60 minutes.
  • 10 ml The reaction solution (0 • IM Tris-HCl (pH 9.5), 5mM MgCl, 0.
  • the conidia of the transformant (# 2 strain) obtained by selecting the above (3) neoculin producing strain were smeared on a PD plate with a bamboo skewer and incubated at 30 ° C for 3-7 days. 10 ml of 0.01% Tween80 solution was poured into the plate on which the conidia had grown, and the conidia were removed with a sterile dropper (Sarstedt).
  • DPY liquid media ( ⁇ 8.0) were added to a 500 ml flask in 120 ml portions to prepare five. Conidia were added to each at l ⁇ 10 7 cells / l, and cultured with shaking at 30 ° C. and 200 rpm for 72 hours. The cells were separated from the culture solution by Miracloth and about 400 ml were collected.
  • the medium collected in the large-scale culture described in (4) above was heated with ammonium sulfate so that the saturated ammonium sulfate concentration became 60%, and then incubated for 30 minutes. Centrifuge at 10,000 rpm, 4 ° C for 30 minutes to collect the precipitate. It was.
  • the precipitate obtained by fractionating ammonium sulfate was dissolved in Buffer A (3 M NaCl, 20 mM Acetate_Na, pH 5.0), and then dialyzed against Buffer A for 1 ⁇ . After recovery, the solution was filtered through a 0. filter to obtain a sample.
  • Buffer A 3 M NaCl, 20 mM Acetate_Na, pH 5.0
  • Fr. 1 fraction obtained by purification by phenyl hydrophobic column chromatography was dialyzed against water, freeze-dried, and dissolved in a small amount of water to obtain a sample.
  • Fr. 1-4 were collected individually, dialyzed against water, lyophilized, and dissolved in a small amount of water. This was subjected to electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing or non-reducing conditions, and CBB staining (Fig. 14 (b)) and Western blotting analysis (Fig. 14 (c)) were performed. It was eluted in Fr. 3 and Fr. 4 and was found to be low.
  • Fr. 3 (lane 3) and Fr. 4 (lane 4) show a smear band (NAS) at approximately 13 kDa in NAS under reducing conditions in SDS-PAGE.
  • a black arrow in FIG. 14 (b)) was observed, and a band that appeared to be NBS (white arrow in FIG. 14 (b)) was detected at about llkDa.
  • a band that appeared to be a heterodimer was detected at about 20 kDa (black arrowhead in Fig. 14 (b)).
  • Fr. 3 contained a large amount of an impure protein other than neoculin, which is the target protein (not detected by Western blotting analysis).
  • Fr. 4 had a high content of neotalin protein.
  • the purified recombinant neoculin was dissolved in water at a concentration of 0.3 mg / ml, and taste-modifying activity was evaluated.
  • a novel dimeric protein neoculin having excellent taste-modifying activity and having a heterodimer structure unlike curculin is provided, and a novel taste-modification that can be practically used in foods and the like using the protein is provided. It has become possible to provide a composition.
  • an amino acid sequence of a subunit constituting the protein is provided.
  • the protein can be provided by an appropriate synthesis method.
  • an appropriate host can be selected, and particularly, the protein can be efficiently provided using a koji mold as a host by using genetic engineering technology. It has become possible.

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Abstract

　本発明は、より優れた味覚改変機能を有する物質を見出し、該味覚改変物質の構造を決定すると共に、遺伝子レベルにおいても解明し、当該物質の一次構造、並びにこれをコードする遺伝子を取得するとともに、当該味覚改変物質を含むことを特徴とする新規な味覚改変組成物を提供することを目的とする。 　すなわち、本発明は、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すポリペプチドＮＡＳ、該ポリペプチドＮＡＳとポリペプチドＮＢＳとからなり、味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質ネオクリンを提供する。 　（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 　（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド

Description

明 細 書
新規味覚改変ポリペプチド NAS、その DNA及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、新規味覚改変ポリペプチド NAS、その DNA及びその用途に関し、詳し くは、ポリペプチド NAS、その遺伝子、当該タンパク質を含有する味覚改変活性を有 する二量体タンパク質ネオクリン、並びにネオクリンを含有する味覚改変組成物に関 する。
背景技術
[0002] クルクリゴ 'ラチフォリア（Curculigo latifolia)は、西マレーシアやタイ南部などに自生 するユリ科に分類される植物であり、該植物に含有されるクルクリン同族体 (アイソフォ ーム）（以下、クルクリンと称する。）は、これを食した後、水又は酸味物質を飲食する と、甘味を感じさせる味覚修飾物質として有用であるとされている。
[0003] 従来知られているクルクリンを構成するサブユニットとしては、クノレクリン A、クルタリ ン B等がある。
クルクリン Aについては、既に全アミノ酸配列が決定されている（例えば、特許文献 1参照）。また、クルクリン Bについても、全アミノ酸配列ならびに塩基配列が開示され ており、クルクリン Aとはアミノ酸組成において数個のアミノ酸が異なることが確認され ている（例えば、特許文献 2参照）。
これらのサブユニットは、いずれもホモダイマーとしてクルクリンを構成し、味覚修飾 機能を有するとされていたが、これらの味覚修飾機能は食品に添加するには充分と は言えなかった。
[0004] し力、し、本発明において、クノレクリンとは異なり、 NAS及び NBSの 2種の異なるアミ ノ酸配列を有するサブユニットからなるヘテロダイマー構造を取る新規な二量体タン パク質を見出すことに成功し、該タンパク質をネオクリンと命名し、その結果を開示し た (例えば、非特許文献 1参照）。なお、ネオクリンは食品に添加するに充分な味覚修 飾機能を有することは、本発明で初めて確認された知見である。
[0005] 一方、ネオクリンの高効率生産を可能とするベぐ NAS及び NBSの 2種の異なるァ ミノ酸配列を有するサブユニットをコードする遺伝子を、原核生物である大腸菌にお レ、て発現させた結果が開示されている (例えば、非特許文献 2参照)。
し力し、この方法において、 NAS及び NBSは、大腸菌菌体内にインクルージョンボ ディとして生産されるためと考えられる力 単に大腸菌で発現させただけでは味覚修 飾活性を発揮できるような正しい NAS及び NBSのへテロダイマーはほとんど生産さ れなかった。
そして、味覚修飾機能を発揮させるためには、上記インクルージョンボディを回収し た後、塩ィ匕グァニジンなどの溶解剤を用いて溶解した後、再構成する操作が必要で あった。このような試薬を用いる必要があることは、作業上の煩雑さや生産コスト面で の不利があるば力 でなぐ生産されたネオクリンを食品用途に用いる際には、安全 十生の面から工業生産には不向きであった。
[0006] このような状況下、より実用性の高い、優れた味覚改変機能を有する物質の解明と 、食品用途に耐えられる安全で効率的な生産方法の開発が求められていた。
[0007] 特許文献 1 :特開平 3— 190899号公報
特許文献 2：特開平 6 - 189771号公報
非特許文献 1 :「バイオサイエンス 'バイオテクノロジー 'アンド'バイオケミストリー（
Biosci. Biotechnol. Biochem. )」、 68卷、 6号、 p. 1403—1407、 2004年 非特許文献 2 :「フエブス ·レターズ（FEBS Letters)」、 573卷、 p. 135-138, 2004 年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、上記のように、より優れた味覚改変機能を有する物質を見出し、 該味覚改変物質の構造を決定すると共に、遺伝子レベルにおいても解明し、当該物 質の一次構造、並びにこれをコードする遺伝子を取得するとともに、当該味覚改変物 質を含むことを特徴とする新規な味覚改変組成物を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記課題に基づき、鋭意検討を重ねた結果、クルクリゴ 'ラチフォリア
(Curculigo latifolia)の果実抽出物中に、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは 異なりへテロダイマー構造を取る新規な二量体タンパク質を見出すことに成功し、該 タンパク質をネオクリンと命名した。
このネオクリンは、飲食物の酸味、苦味又はえぐ味を顕著に低減すると共に、飲食 物の嗜好性を高めるような活性、すなわち味覚改変活性を有し、クルクリンの味覚修 飾作用よりも格段に優れ、実用性に優れていることを見出した。
[0010] すなわち、本発明者らはネオクリンを精製し、その構造を決定する過程で、ネオタリ ンは、従来知られていない新規サブユニット NAS (neoculin acidic subunit)と、 クルクリンのサブユニットとして既知のクルクリン Aや Bといったサブユニット NBS (neo culin basic subunit)とのへテロダイマーであることに着目した。
そこで、該新規サブユニット NASの構造解析を行った結果、 NBSを構成する既知 のクルクリン Aや B同士の相同性と比較して、相同性の低い新規なポリペプチドを得 ること力 Sできた。
そして、ポリペプチド NASをコードする遺伝子の DNAの解析を行い、ネオクリンを 遺伝子レベルにおいて解明した結果、 NASの成熟体タンパク質のほ力、シグナルぺ プチド及び延長ペプチドを含む前駆体タンパク質 (PNAS)の塩基配列をも見出した また、ネオクリンを実際に飲食物に添加して、味覚改変活性を有することを確認した 更に、異種におけるネオクリンの発現系を検討した結果、 NASまたは PNAS、及び NBSをコードする遺伝子を宿主において発現させ、菌体外に味覚修飾機能を有す るへテロダイマーとしてネオクリンを分泌生産させることを可能とする発現系を確立し た。
本発明は係る知見に基づくものである。
[0011] すなわち、請求項 1に記載の本発明は、下記の (A)、又は（B)に示すポリペプチド NASである。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
請求項 2に記載の本発明は、マンノース/ N—ァセチルダルコサミン Zフコース/キ シロースの比が 3/2/lZlで構成される N結合型糖鎖が付加された請求項 1に記 載のポリペプチド NASである。
[0012] 請求項 3に記載の本発明は、下記の（A)、又は（B)に示すポリペプチド NASをコ ードする遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、前記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
請求項 4に記載の本発明は、下記の (A)又は（B)に示す DNAである請求項 3に記 載の遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる塩 基配列を含む DNA。
(B)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる塩 基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、前記の（a)又は（b)に 示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポ リペプチドをコードする DNA。
[0013] 請求項 5に記載の本発明は、下記の（A)又は（B)に示すポリペプチド PNASであ る。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 (B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、前記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。 請求項 6に記載の本発明は、マンノース/ N—ァセチルダルコサミン Zフコース/キ シロースの比が 3/2/lZlで構成される N結合型糖鎖が付加された請求項 5に記 載のポリペプチド PNASである。
[0014] 請求項 7に記載の本発明は、下記の（A)又は（B)に示すポリペプチド PNASをコ ードする遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、前記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。 請求項 8に記載の本発明は、下記の (A)又は（B)に示す DNAである請求項 7に記 載の遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基 配列を含む DNA。
(B)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基 配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、プロセシングにより成熟 体ポリペプチド NASとなった後に、前記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSと共 に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードする DN A。
[0015] 請求項 9に記載の本発明は、請求項 1又は 2に記載のポリペプチド NASと前記の（ a)又は (b)に示すポリペプチド NBSとからなり、味覚改変活性を有することを特徴と する二量体タンパク質ネオクリンである。
請求項 10に記載の本発明は、請求項 9に記載の二量体タンパク質ネオクリンを有 効成分として含有することを特徴とする味覚改変組成物である。
[0016] 請求項 11に記載の本発明は、請求項 3又は 4記載の DNA、若しくは請求項 7又は 8に記載の DNAを構成する塩基配列を含む組換えベクターである。
請求項 12に記載の本発明は、下記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSをコー ドする遺伝子の DNAを構成する塩基配列を含む組換えベクターである。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[0017] 請求項 13に記載の本発明は、ベクターが、真核生物で機能するベクターである請 求項 11記載の組換えベクターである。
請求項 14に記載の本発明は、ベクターが、真核生物で機能するベクターである請 求項 12記載の組換えベクターである。
請求項 15記載の本発明は、ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項 11記載の組換えベクターである。
請求項 16記載の本発明は、ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項 12記載の組換えベクターである。
請求項 17記載の本発明は、ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項 11 記載の組換えベクターである。
請求項 18記載の本発明は、ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項 12 記載の組換えベクターである。
[0018] 請求項 19記載の本発明は、請求項 11及び 12記載の組換えベクター、請求項 13 及び 14記載の組換えベクター、請求項 15及び 16記載の組換えベクター、又は、請 求項 17及び 18に記載の組換えベクターを含む形質転換体である。
請求項 20記載の本発明は、請求項 19に記載の形質転換体を培養することを特徴 とする請求項 9に記載のネオクリンの製造方法である。
発明の効果
[0019] 本発明により、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは異なりへテロダイマー構 造を取る新規な二量体タンパク質ネオクリンが提供され、当該タンパク質を用いて、 食品等に実用可能な新規な味覚改変組成物を提供することが可能となった。
また、本発明により、当該タンパク質を構成するサブユニットのアミノ酸配列が提供 され、このアミノ酸配列通りに、適当な合成方法によって当該タンパク質を提供するこ とが可能となった。
さらには、本発明により、当該タンパク質をコードする遺伝子の DNAが提供された ことで、適当な宿主を選び、特に麹菌を宿主として、遺伝子工学技術を用いて効率 的に当該タンパク質を提供することが可能となった。
図面の簡単な説明
[図 1]ネオクリン精製粉末を還元下又は非還元下で SDS—P AGEに供し、 CBB染色 した時の図である。
[図 2]NAS及び NBSの精製粉末を SDS-PAGEに供し、 CBB染色した時の図であ る。
[図 3]S—カルボキシアミドメチル化 NASの chymotrypsin消化ペプチドの HPLC溶 出パターンの図である。
[図 4]S—カルボキシアミドメチル化 NASの endoproteinase Asp_N消化ペプチド の HPLC溶出パターンの図である。
[図 5]S—カルボキシアミドメチル化 NASの trypsin消化により遊離したアミノ酸の定量 分析の図である。
[図 6]S—カルボキシアミドメチル化 NAS (lnmol)の carboxypeptidase A消化によ り遊離したアミノ酸の定量分析の図である。
[図 7]NASのアミノ酸配列を示す。
[図 8]NASに付加された糖鎖の糖組成分析から推定された糖鎖構造を示す。
[図 9]クルクリンを還元下又は非還元下で SDS—P AGEに供し、 CBB染色した時の図 である。
園 10]NAS発現ベクターの作製法の概略を示した図である。
園 11]NBS発現ベクターの作製法の概略を示した図である。
[図 12]形質転換株 12株の培養液を、還元下で SDS—PAGEに供した後、ウェスタン ブロッテイング解析した結果を示した図である。
[図 13] (a)フエニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製した際の溶出パターンと、
(b)それぞれの分画を還元下又は非還元下で SDS— PAGEに供した後、ウェスタン ブロッテイング解析した結果を示した図である。
[図 14] (a)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製した際の溶出パターンと、それ ぞれの分画を還元下又は非還元下で SDS—P AGEに供した後、（b) CBB染色及び
(c)ウェスタンブロッテイング解析した結果を示した図である。
符号の説明
[0021] 図 7において、 4行目の Nは N末端から決定したアミノ酸配列部分を示し、 C1一 14 は chymotrypsin消化力 得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、 D1— 4は、 endoproteinase Asp_N消化力 得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示し、 T 1一 4は trypsin消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示す。また、 ^は C 末端力 得られた配列を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0022] (1)本発明の二量体タンパク質ネオクリン
本発明のネオクリンは、ポリペプチド NASと下記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSとからなり味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質である。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
ポリペプチド NAS (neoculin acidic subunit)については、下記の（2)で説明す るように、本発明者らが初めて報告するタンパク質である。また、ポリペプチド NBS (n eoculin basic subunit)とは、（a)又は（b)に示すポリペプチドを意味する力 これ も後述の（2)で詳細に説明するように、具体的には、既知のクルクリン Aや Bといった クルクリンのサブユニットを意味する。
両者は、糖鎖を持つ NASと糖鎖を持たない NBSが結合することにより安定なへテ 口ダイマーを形成する。 [0023] 本発明のネオクリンは、例えば、ユリ科に属する植物であるクルクリゴ 'ラチフォリア 力 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて取得できる。
例えば、実施例 1の（1)に記載するように、凍結乾燥したクルクリゴ 'ラチフォリアの 果実をホモジナイズして得た粉末を大量の純水で抽出し、遠心分離によって上清を 廃棄することにより、不要物を除去する。残った沈殿を pH2. 0以下の酸性水溶液で 抽出すると、ネオクリンが抽出液中に得られる。次いで、この抽出液を通常の処理方 法 (好ましくは非加熱処理)で中和、濃縮、脱塩、乾燥すると、十分に実用可能なタン パク質ネオクリンが得られる。
尚、下記の（2)で説明するポリペプチド NASを人工的に作成し、これに、ネオクリン 或いは既知のクルクリンから抽出 '精製して得られる、或いは人工的に合成して得ら れるポリペプチド NBSを結合させることによつても得ることができる。更に、下記の（6) で説明する製造方法によって得ることもできる。
[0024] 本発明のネオクリンは、味覚改変活性を有するものである。ここで、味覚改変活性と は、酸味、苦味又はえぐ味を顕著に低減すると共に、飲食物の嗜好性を高めるような 活性を言う。すなわち、苦味を有する飲食物の苦味を抑える活性、えぐ味を有する飲 食物のえぐ味を抑える活性、飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物に 甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物の酸味を抑える活性を意味する。
[0025] (2)本発明のポリペプチド NAS
本発明のポリペプチド NASは、下記の（A)、又は（B)に示すポリペプチドである。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。 [0026] 本発明の（A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 ポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを構成するサブュ ニットの 1つとして本発明者らが初めて見出したものである。
ポリペプチド NBS (neoculin basic subunit)とは、前記したように、（a)配列表の 配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、或いは (b)配列表の配列番 号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個、好ましくは 1一 5個のアミノ酸の 置換、欠失、揷入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチドを意味する。このようなポリペプチド NBS として、具体的には、配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド (クルクリン B)、該アミノ酸配列中 73番目のトリプトファンをァスパラギンに置換してな るポリペプチド（クルクリン B'と称する。）、該アミノ酸配列中、 28番目のリジン、 73番 目のトリプトファン、 78番目のトリプトファン及び 81番目のァスパラギンを、それぞれァ スパラギン、ァスパラギン、システィン、及びァラニンに置換してなるポリペプチド（クル クリン A)を挙げること力 Sできる。
[0027] 従って、本発明のポリペプチド NASは、（A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸 配列からなるポリペプチドであってもよいが、該 (A)ポリペプチドと実質的に同一のポ リペプチド、すなわち（B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若し くは数個、好ましくは 1一 5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含む アミノ酸配列からなり、かつ、ポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体 ネオクリンを形成しうるポリペプチドであっても良い。
[0028] ポリペプチド NASは、ポリペプチド NBSとの結合力が増し、結果的に安定性の高 レ、ネオクリンを形成することができる点で、糖鎖が付加されてなることが好ましぐ特に 、 N結合型糖鎖が付加されてなることが好ましい。ここで N結合型糖鎖とは、タンパク 質の一次構造に存するァスパラギン残基に結合した N—ァセチルダノレコサミン（ N-acetyl glucosamine)を基点として伸長する糖鎖構造の総称を意味する。
N結合型糖鎖の中でも、特に、マンノース（mannose)ZN—ァセチルダルコサミン（ N-acetyl glucosamine) Zフコース（fticose) /キシロース（xylose)の比力 Z2ZlZl で構成される Ν結合型糖鎖であることが好ましい。具体的には、図 8に示す構造から なる糖鎖配列を挙げることができる。尚、図 8に示す構造の一部に付カロ、欠如、置換 、又は修飾があってもよい。
尚、ポリペプチド NASにおける N結合型糖鎖の結合部位は、 N結合型糖鎖の結合 特性を考慮すると、配列表の配列番号 2記載のアミノ酸配列中 81番目のァスパラギ ンであるものと推測される。
[0029] 本発明のポリペプチド NASは、ネオクリンを形成するサブユニットであるから、ネオ クリンを含むクルクリゴ 'ラチフォリアの果実から公知の分離'精製法を組み合わせて 取得することができる。例えば、実施例 1の（1)に記載した方法で所得したネオクリン を、実施例 1の（2)及び（3)に記載するように公知のイオン交換クロマトグラフィー法 を適切に組み合わせて精製すると共に、実施例 2に記載するように、通常用いられる 方法で陽イオン交換カラムに供すると、等電点が 8. 6であるポリペプチド NBSはカラ ムに吸着され、ポリペプチド NASは非吸着画分に得られる。この非吸着画分を通常 用いられる方法で、陰イオン交換カラムに供すると、等電点が 4. 7であるポリペプチド NASはカラムに吸着されるので、これを溶出し、脱塩、乾燥すればよい。
また、下記の（4)に示す DNAを元にして遺伝子工学的手法を用いて得ることがで きる。
一方、上記 (A)又は（B)に示すポリペプチドを、適当な合成方法、例えば、固相合 成法、部分固相合成法、溶液合成法のほか、フルォレニルメチルォキシカルボニル 法（Fmoc法）、 t-ブチルォキシカルボニル法（tBoc法）等の化学合成法などによつ て製造すること力できる。また、（B)に示すポリペプチドは、配列表の配列番号 2に記 載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個、好ましくは 1一 5個のアミノ酸の置換、欠 失、揷入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように、例えば部位特異的変異法 によって改変することによつても取得され得る。
[0030] (3)本発明のポリペプチド PNAS
本発明のポリペプチド PNASは、下記の（A)又は（B)に示すポリペプチドである。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、前記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
[0031] ここで、 （A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前 記（2)におレ、て説明したポリペプチド NASのシグナルペプチド及び延長ペプチドを 含むポリペプチド NASの前駆体として、本発明者らが始めて見出したものである。す なわち、 （A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 (A) 配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの前駆体として植物 細胞内で産生され、プロセシングによって、（A)配列表の配列番号 2に記載のァミノ 酸配列からなるポリペプチドとなるポリペプチドである。
従って、 NAS前駆体であるポリペプチド PNASは、（A)配列表の配列番号 3に記 載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても良レ、が、該 (A)ポリペプチドと実質 的に同一のポリペプチド、すなわち（B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列に おいて、 1若しくは数個、好ましくは 1一 5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又 は逆位を含むアミノ酸配列力 なり、かつ、プロセシングにより成熟体ポリペプチド N ASとなった後に、ポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリン を形成しうるポリペプチドであっても良い。
尚、ポリペプチド NBSについては、前記（2)において説明した通りである。
[0032] ポリペプチド PNASはプロセシングにより、シグナルペプチド部分（配列表の配列番 号 3記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 1一 22記載のアミノ酸配列からなる部分 )、及び延長ペプチド（配列表の配列番号 3記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号 1 36— 158記載のアミノ酸配列からなる部分）が切断された後に得られるポリペプチド NASと、ポリペプチド NBSとの結合力を増加させ、結果的に安定性の高いネオクリン を形成させることができる点で、糖鎖が付加されてなることが好ましぐ特に、 N結合 型糖鎖が付加されてなることが好ましい。 N結合型糖鎖の中でも、特に、マンノース（ mannose) ZN—ァセチノレグ /レコサミン (N— acetyl glucosamineリ Zノコース (fucose) キシロース（xylose)の比が 3/2/1/1で構成される N結合型糖鎖であることが好ま しい。具体的には、図 8に示す構造からなる糖鎖配列を挙げることができる。尚、図 8 に示す構造の一部に付カロ、欠如、置換、又は修飾があってもよい。 尚、ポリペプチド PNASにおける N結合型糖鎖の結合部位は、 N結合型糖鎖の結 合特性を考慮すると、配列表の配列番号 3記載のアミノ酸配列中 103番目のァスパ ラギンであるものと推測される。
[0033] このようなポリペプチド PNASは、ネオクリンを形成するサブユニット NASの前駆体 であるから、下記の（4)に示す PNASをコードする遺伝子の DNAを元にして遺伝子 工学的手法を用いて得ることができる。一方、上記 (A)又は (B)に示すポリペプチド を、適当な合成方法、例えば、固相合成法、部分固相合成法、溶液合成法のほか、 フルォレニルメチルォキシカルボニル法（Fmoc法）、 t_ブチルォキシカルボニル法（ tBoc法）等の化学合成法などによって製造することができる。また、（B)に示すポリべ プチドは、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個、好ま しくは 1一 5個のアミノ酸の置換、欠失、揷入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列とな るように、例えば部位特異的変異法によって改変することによつても取得され得る。
[0034] (4)本発明の DNA
本発明の DNAは、上記（2)で説明したポリペプチド NASをコードする遺伝子の D NA、及び、上記（3)で説明したポリペプチド PNASをコードする遺伝子の DNAであ る。
[0035] すなわち、第一に、ポリペプチド NASをコードする遺伝子の DNAは、前記（2)にお いて説明したポリペプチド NAS、詳しくは以下の (A)又は（B)に示すポリペプチド N ASをコードする遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、前記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
[0036] このポリペプチド NASをコードする遺伝子の DNAは、具体的には、（A)配列表の 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70 408からなる塩基配列を含む D NAとして得ることができるが、これと実質的に同一の塩基配歹 1J、すなわち、（B)配列 表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる塩基配列又 は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列の DNAと 、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、ポリペプチド NBSと共に味覚改 変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードする DNAとして得 ることもできる。尚、ポリペプチド NBSについては、前記（2)において説明した通りで ある。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非 特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること は困難であるが、一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 90%以上の相同 性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブ リダィズしない条件、あるいは、通常のハイブリダィゼーシヨンの洗浄条件、例えば 0. 1 X SSCで 0. 1 %SDSに相当する塩濃度にて 65°Cで洗浄が行われる条件などが挙 げられる。
[0037] このような、ポリペプチド NASをコードする遺伝子の DNAは、例えば、受粉から数 週間後のクルクリゴ 'ラチフォリアの果実から、 mRNAを抽出し、逆転写ポリメラーゼ' チェーン 'リアクション（RT— PCR)によって cDNAを合成し、ファージベクターにパッ ケージングする。これをファージに感染させ cDNAライブラリーを得る。続いて、本発 明によって明らかとなったポリペプチド NASのアミノ酸配列に基づいて作製したプロ ーブをプラークハイブリダィゼーシヨンさせて、 目的とする DNAを特定し、回収して取 得すること力できる。
一方、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる 塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた PCRによって 得ることもできるほカ 市販されている種々の DNA合成装置によっても、上記 (A)又 は（B)に示す DNAを合成することができる。
また、 （B)に示す DNAは、例えば配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 70— 408からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜 置換、欠失、揷入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突 然変異処理によっても取得することが可能である。
[0038] また、第二に、ポリペプチド PNASをコードする遺伝子の DNAは、前記（3)におレヽ て説明したポリペプチド PNAS、詳しくは以下の (A)又は（B)に示すポリペプチド PN ASをコードする遺伝子の DNAである。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、前記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
[0039] このようなポリペプチド PNASをコードする遺伝子の DNAは、具体的には、 （A)配 列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基配列を 含む DNAとして得ることができる力 S、これと実質的に同一の塩基配列、すなわち、（B )配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基配 列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列の D NAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、プロセシングにより成熟体 ポリペプチド NASとなった後に、ポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二 量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードする DNAとして得ることもできる。尚 、ポリペプチド NBSについては、前記（2)において説明した通りである。
「ストリンジ工ントな条件」については、ポリペプチド NASをコードする遺伝子の DN Aの場合と同様である。
[0040] このような、ポリペプチド PNASをコードする遺伝子の DNAは、例えば、受粉から数 週間後のクルクリゴ 'ラチフォリアの果実から、成熟体ポリペプチド NASの場合と同様 にして取得することができる。また、該配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番 号 4一 477に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた PCRや、巿 販されている種々の DNA合成装置によっても、上記 (A)又は（B)に示す DNAを合 成すること力 Sできる。
また、 （B)に示す DNAは、例えば配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 4一 477からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜置 換、欠失、揷入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突然 変異処理によっても取得することが可能である。 [0041] なお、本発明の 2つの DNAが、塩基配列の調整要素及び当該遺伝子の構造部分 を含んでも良いことは、言うまでもない。
[0042] (5)本発明の味覚改変組成物
本発明の味覚改変組成物は、有効成分として、味覚改変活性を有する二量体タン パク質ネオクリンを含有することを特徴とするものである。ネオクリンについては、前記
(1)において説明した通りである。
本発明の味覚改変組成物は、そのまま摂取してもよいが、野菜ジュース、グレープ フルーツ等の果汁、すしネタ等各種料理用調味液をはじめとする飲食物又は薬剤等 に適当量を配合して使用してもよい。この場合のネオクリンの配合量は、当該組成物 が高度に精製されたネオクリン粉末を飲料に添加する場合を例に取ると、 5— 5, 000 μ g 特に 50— 500 z g/mlが好ましい。
また、本発明の味覚改変組成物は、配合対象である飲食物又は薬剤等の性状に 応じて、粉末状、溶液状、シート状、スプレー状、顆粒状、又は乳化物状等に加工し て使用すること力できる。
[0043] (6)本発明の二量体タンパク質ネオクリンの製造方法
本発明においては、ネオクリンを構成する 2種のサブユニットである NAS及び NBS をコードする各遺伝子、さらには PNASをコードする遺伝子が同定されている。
そこで本発明においては、これらの遺伝子を高効率に発現させ、ネオクリンの工業 生産を可能とするための宿主一ベクター系として、 NASをコードする遺伝子の DNA 又は PNASをコードする遺伝子の DNAを含む組換えベクターを提供すると共に、 N BSをコードする遺伝子の DNAを含む組換えベクターを提供する。更に、本発明は、 上記二種類の組換えベクターを組み合わせて含む形質転換体をも提供する。更にま た、本発明は、上記形質転換体を培養することを特徴とする味覚改変活性を有する 二量体タンパク質ネオクリンの製造方法をも提供する。
[0044] 本発明において、宿主一ベクター系を利用してネオクリンを製造するためには、上 記した本発明の 2種類の組換えベクター、すなわち、 NASをコードする遺伝子の DN A (すなわち、請求項 3又は 4記載の DNA)あるいは PNASをコードする遺伝子の D NA (すなわち、請求項 7又は 8記載の DNA)を含む組換えベクター、及び請求項 11 の（a)又は（b)に示す NBSをコードする遺伝子の DNAを含む組換えベクターを、宿 主に同時に導入する必要がある。
これは、ネオクリンが NAS及び NBSという異なるサブユニットからなるヘテロダイマ 一であるので、 NASと NBSの両方のサブユニットタンパク質が生産されることが必要 だからである。
このような本発明の組換えベクターは、 NASをコードする遺伝子、或いは NBSをコ ードする遺伝子を発現させるためのプロモーター機能を含む発現調節機能を備えて いる必要がある。
また、組換えベクターは、該ベクターに導入した NAS遺伝子や NBS遺伝子が宿主 菌内において発現して生産される NASや NBSを、宿主菌体外に分泌生産させるた めの機能を備えていることが望ましい。具体的には、例えば、 NASや NBSをコード する遺伝子のほかに、宿主が分泌するタンパク質、例えば、麹菌（ァスペルギルス 'ォ リゼなど）の場合、麹菌由来の分泌タンパク質 α—アミラーゼをコードする遺伝子を適 当なベクターに組み込み、 NAS及び NBS、並びに α—アミラーゼの融合タンパク質 として発現させることにより、宿主菌の菌体外に分泌生産させることができる。尚、アミ ラーゼの代わりに、ダルコアミラーゼ（GlaA)を用いることもできる。
さらに、上述のようにして融合タンパク質として発現させる場合には、融合タンパク 質を NASや NBS単独のタンパク質にするためのプロセシング機能も備えているのが 望ましレ、。具体的には、例えば、麹菌のゴルジ体に存在する KEX2様プロテアーゼ が認識するアミノ酸配列（Lys— Arg, Lys— Lys, Arg-Lys, Arg— Arg)をコードする 塩基配列を利用して、該塩基配列を α—アミラーゼと NAS及び NBSとの間に組み込 んでこれを発現させ、後で ΚΕΧ2様プロテアーゼを作用させることにより、組換えべク ターが産生した融合タンパク質からひ—アミラーゼを単離し、 NAS及び NBSの二量 体タンパク質を得ることができる。
更に、上記のようにして ΚΕΧ2により切断する場合には、 ΚΕΧ2の認識配列付近の 立体構造によって不正確になされることがあること、及び、ネオクリンはへテロ 2量体を 形成し、切断部位付近の立体構造が複雑であると予想されることから、切断効率と切 断の正確性の改良を行うことが好ましレ、。例えば、 NAS及び NBSの Ν末端の Aspの 直前に Gly、 Ala, Serなどのように分子量が小さぐ側鎖も小さいために立体障害を 生じ難レ、アミノ酸を 3残基程度挿入することができる。
このような一連の操作は、ベクター構築キット（Multisite Gateway Three-Fragment Vector Construction Kit ; Invitrogen社製）を利用することにより、より簡便に行うこと力 S できる。すなわち、該キットを利用して、（a) 5 'エントリークローンの作製、（b)目的遺 伝子エントリークローンの作製、（c) 3，エントリークローンの作製、（d) 3種類のエントリ 一クローンとデスティネーション.ベクターとの組換え反応による組換えベクターの作 製、の順でコンストラタシヨンを行って、所望の組換えベクターを得ることができる。一 方、常法に基づき、必要な遺伝子断片を切り出し、ベクター上の適切なサイトに導入 することによつても、組換えベクターを作製することが可能である。
[0046] 本発明の組換えベクターの具体例としては、 NASをコードする遺伝子を導入した 組換えベクターとして pgFa3GNaSJ (図 10)、 NBS遺伝子を導入した組換えべクタ 一として pgFa3GNbTa (図 11)などを挙げることができる。
一方、 PNASをコードする遺伝子を導入する場合、例えば、 pgFa3GNaSJ中の N ASをコードする遺伝子、または、 pgFa3GNbTa中の NBSをコードする遺伝子を、 P NASをコードする遺伝子に代えたプラスミドが挙げられる。
[0047] また、本発明の形質転換体について説明する。本発明の形質転換体は、上記二種 類の組換えベクターが適当な宿主に組み込まれてなるものである。
本発明の組換えベクターの宿主としては、真核生物が望ましい。大腸菌等の原核 生物を宿主とした場合は、背景技術の欄で既に述べたように、菌体内にタンパク質が インクルージョンボディとして生産されるために、これを味覚修飾活性を発揮できる正 しいへテロダイマーとするために、該インクルージョンボディを構成するポリペプチド N AS及び NBSを、塩化グァニジン等の溶解剤などを用いてー且溶解した後、再構築（ 再構成)過程を経る必要があることから、好ましくない。これに対して、麹菌などの真 核生物を宿主とすると、溶解剤などの試薬を用いる必要がない上に、再構築などの 余分な過程を必要とせずに、味覚修飾活性を発揮することができるネオクリンとして 分泌生産させることが可能である。
[0048] 本発明の組換えベクターを導入するための宿主としては、真核生物の中でも糸状 菌が好ましぐその中でさらに好ましいのは麹菌である。また、麹菌の具体的なものと しては、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)が挙げられ、さらにその代表的な ものとしてァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae) NS4株が挙げられる。
このような形質転換体の例として、本発明者らは、ァスペルギルス 'ォリゼ（ Aspergillus oryzae) NS4株に NAS及び NBSをコードする遺伝子の組換えベクター を導入して、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae) NS—NAB2株を得た。この ァスペルギルス'ォリゼ（Aspergillus oryzae) NS—NAB2株は、 日本国茨城県つくば 巿中央第 6の独立行政法人特許生物寄託センターに、寄託番号 FERM ABP-10 209として寄託されている。
[0049] 本発明においては、上記形質転換体を培養することを特徴とする味覚改変活性を 有する二量体タンパク質ネオクリンを製造することができる。
形質転換体の培養は、 NASをコードする遺伝子と NBSをコードする遺伝子の発現 割合が特定比率となるような条件で行うことが望ましい。発現量がどちらか一方に偏り があると、ホモダイマーが形成されて NASと NBSからなるヘテロダイマーの生産割合 が低くなり、ネオクリンの生産効率が低下する。
本発明においては、形質転換操作に用いる NASをコードする遺伝子と NBSをコー ドする遺伝子の割合を 1： 5の比率とした際に得られた形質転換体の中から、高い確 率で高発現株を選抜できた。尚、高い生産効率を達成するためには、 pH8. 0前後 の培地条件で培養を行うことが好ましレ、。
このようにして、本発明の組換えベクターや形質転換体味覚修飾活性を有するへ テロダイマーが効率的に生産可能である。
以下に、実施例を示す。
実施例 1
[0050] クルクリゴ 'ラチフォリアの果実を、以下の手順に従い精製し、味覚改変活性を有す る新規タンパク質の取得を試みた。
[0051] (1)粗抽出液の調製
凍結乾燥したクルクリゴ ·ラチフォリアの果実 (表 1の果実凍結乾燥粉末)約 1kgに 4
0リツターの純水を加え、 15分間ホモジナイズした後、 6, OOOrpmで 20分間遠心分 離を行い、上清 (上清に味覚修飾活性は無い）を除去した。前述の操作を 2回繰り返 し、沈殿残渣を得た。
次に、この沈殿残渣に 0. 05N硫酸を 20リツター加え、 10分間ホモジナイズした後 、 6, OOOrpmで 20分間遠心分離を行レ、、上清を回収した。この操作を 2回繰り返し た。沈殿に味覚修飾活性はない。
次に、この抽出液に 1N水酸化ナトリウムを 2リツター加え、中和して、活性物質を含 む粗抽出液 (表 1の 0. 05N硫酸抽出液）を得た。
[0052] (2) Amberlite IRC—50カラムによる精製
(1)で得た粗抽出液約 40リツターを 50mMリン酸緩衝液（pH5. 5)で平衡化した A mberlite IRC—50カラム（オルガノ社製、直径 8cm X 30cm)に流し、吸着させた。 続いて、 50mMリン酸緩衝液 (PH5. 5) 1リツターで洗浄後、 1M塩化ナトリウムを含 む 50mMリン酸緩衝液 (pH5. 5) 1. 5リツターで溶出したところ、味覚修飾活性を示 す画分が得られた。この活性画分に 60%飽和となるよう硫酸アンモニゥムを添加し、 活性物質を析出させ、 6， OOOrpmで 30分間遠心分離を行った。得られた沈殿は 0. 2N酢酸 100mlに溶解し、活性物質溶液（表 1の Amberlite IRC-50 Chromatography )として回収した。
[0053] (3) Sephadex G—25カラムによる精製
(2)で得た活性物質溶液 100mlを 0. 2N酢酸で平衡化した Sephadex G_25力 ラム（Amersham Biosciences社製、直径 8cm X 30cm)に供し、脱塩した。この活性物 質溶液を凍結乾燥することにより高度に精製されたネオクリン粉末 (表 1の S印 hadex G-25 Chromatography)が得られた。
上記の各精製ステップにおレ、て得られる物質のタンパク質含量、活性収率及び精 製度を表 1にまとめた。
[0054] [表 1] タンパク含量 〔g ) 活性収率 （％) 精製度 （倍） 果実凍結乾燥粉末 1 0 0 0 1 0 0 1
0 . 0 5 N硫酸抽出液 1 8 8 0 4 5
Amb er l i t e I RC - 50 3 5 5 1 8 5
Chroma to graphy
Sepha dex G - 25 1 3 6 4 3 2
Chroma to graphy
[0055] (4)精製結果の確認
前記の（1)一（3)で得たネオクリン精製粉末 2. 5 μ gを、還元下又は非還元下でゲ ル濃度 15%で SDS— PAGE後、 CBB染色を行ったところ、図 1に示す通り、非還元 下で 20kDaの位置に単一バンドが見られ、還元下では 13kDa及び l lkDaの位置 に 2本のバンドが見られた。このことから、得られたネオクリンが高度に精製されている ことが確認でき、さらに、ネオクリンが 13kDa及び l lkDaのサブユニット各 1個力もな る 2量体であることが確認できたので、それぞれを neoculin acidic subunit (NAS )、 neoculin basic subunit (NBS)とし 7こ。
[0056] (5)味覚修飾活性の確認
さらに、前記の（1)一（3)で得たネオクリン精製粉末 1 · lmgを、 6M尿素を含む 10 %アクリルアミドゲルを用いて、 Native_PAGEを行った。得られたバンドを切り出し 、ゲルから水で抽出した試料を凍結乾燥した。凍結乾燥後のサンプノレを 150 / lの水 に懸濁し、パネラー 2名がそれぞれ 50 μ ΐを口に含んだところ、当該サンプルが甘味 を呈すること、さらに、サンプルを吐き出した後に口に含んだ 0. 02Μクェン酸の酸味 が甘味に変換されてレ、ることを確認し、味覚改変活性を有することを確認した。
さらに、回収したサンプルのうち 1000分の 1量を SDS—PAGEに供して銀染色を行 つたところ、 20kDaの位置に単一バンドが見られ、味覚修飾活性本体がネオクリンで あることが確認された。
実施例 2
[0057] 実施例 1において得られたネオクリンを、以下の手順に従い更に精製し、ネオクリン を構成する各サブユニットの解析を行った。
[0058] (l) HiTrap SP Sepharose Fast Flowカラムによる精製
実施例 1で得たネオクリン粉末 lOOmgを 20mlのバッファー A (8M尿素、 30mM DTTを含む 50mMトリス一塩酸緩衝液（ρΗ7· 5) )に溶解し、全量をバッファー Αで 平後丁ィ匕しプこ Hi frap ¾P Sepnarose Fast Flowカフム mersham Biosciences社 製、直径 1 · 6cm X 2. 5cm)に供した。続いて、バッファー A50mlで洗浄を行った。 続いて、 1M塩化ナトリウムを含むバッファー A50mlで溶出を行レ、、精製された NBS 画分を得た。また、洗浄画分 70mlはイオン交換水中で透析により 100mlとなった。
[0059] (2) HiTrap SP Sepharose Fast Flowカラムによる 2回目の精製
上記（1)で得られた洗浄画分 100mlに 8M尿素、 30mM DTT、 50mM酢酸緩衝 液（pH4. 5)を加え 150mlとし（全て終濃度）、これをバッファー B (8M尿素、 30mM DTTを含む 50mM酢酸緩衝液（pH4. 5) )で平衡化した HiTrap SP Sepharos e Fast FlowXフム (Amersham Biosciences社 、 ¾径 1. 6cm X 2. 5cm)に供し た。続いて、バッファー B50mlで洗浄後、 1M塩化ナトリウムを含むバッファー B50ml で溶出を行った。また、洗浄画分 200mlはイオン交換水中で透析により 250mlとな つに。
[0060] (3) HiTrap DEAE Sepharose Fast Flowカラムによる精製
上記（2)で得られた洗浄画分 250mlに 8M尿素、 30mM DTT、 50mMトリス一塩 酸緩衝液（ρΗ9· 0)を加え 350mlとし（全て終濃度）、これをバッファー C (8M尿素、 30mM DTTを含む 50mMトリス一塩酸緩衝液（ρΗ9· 0) )で平衡化した HiTrap DEAE Sepharose Fast Flowカフム (Amersham Biosciencesf土 、 径 1.り cm Χ 2· 5cm)に供した。続いて、バッファー C50mlで洗浄後， 1M塩化ナトリウムを含 むバッファー C50mlで溶出を行ったところ、精製された NAS画分を得た。
[0061] (4)精製結果の確認
(1)及び（3)で得られた NBS画分及び NAS画分をそれぞれ透析後、凍結乾燥し、 精製粉末を得た。これらの精製粉末を 10 x g用いて SDS— PAGEを行ったところ、図 2ίこ示すよう (こ、 NAS画分、 NBS画分のそれぞれ (こつレヽて、 13kDa、 l lkDa(7)¾ 分に単一バンドが見られ、各サブユニットが精製されていることが確認された。
実施例 3
[0062] 実施例 2において得られたネオクリンを構成する NAS画分のアミノ酸配列を、以下 の手順に従い解析した。 [0063] (1) N末端アミノ酸配列解析
実施例 2 (1)—（3)で得られた精製 NAS粉末 70 β gを二次元電気泳動に供し、電 気泳動後のゲルをポリビニリデンジフルオライド（PVDF)膜と重ねて上下に電流を流 すことにより転写した。転写した PVDF膜を、 SYPRO Ruby protein blot stain (Molecular Probes社製）で染色後、通常の方法でバンドを切り出し、アミノ酸シーケ ンサー（HP G1005A Protein Sequencing System)により N末端アミノ酸配列を決定し た。すなわち、 N末端部分の遊離アミノ基にフヱニルイソチオシァネート（PITC)を反 応させ、フヱニルチオ力ルバミル誘導体（PTCアミノ酸）とし、次いでトリフルォロ酢酸 によってァニリノチアゾリノン一アミノ酸として遊離させ、さらに酸性下で安定なフエ二 ルチオヒダントイン (PTHアミノ酸）に変換して分析するものである。これにより N末端 より 40残基のアミノ酸配列が決定された。
[0064] (2)内部アミノ酸配列解析
(i) S—カルボキシアミドメチル化
実施例 2 (1)—（3)で得られた精製 NAS粉末 10mgを 6M尿素、 20mM DTTを 含む 500mMトリス一塩酸緩衝液（ρΗ8· 0) 100mlに溶解した。この溶液を 50°C、 1 時間静置した。ョードアセトアミド lOOmgを添加して混合し、暗所、かつ室温で 45分 間振盪した。反応液を透析後、凍結乾燥させ、 S—カルボキシアミドメチル化した NA Sを得た。
[0065] (ii) chymotrypsinによる断片化
上記（i)で得られた S—カルボキシアミドメチル化 NASの chymotrypsin消化を、 0· 1Mトリス一塩酸緩衝液（pH8. 0)中で 37°C、 16時間行った。タンパク質濃度は 0. 2 mgZmlで、酵素：基質比は 1 : 20とした。反応停止には 100°Cで 3分間処理した。
[0066] (iii) endoproteinase Asp_Nによる断片化
上記（i)で得られた S—カルボキシアミドメチル化 NASの endoproteinase Asp-N 消ィ匕を、 0. 01 %SDSを含む 50mMリン酸緩衝液（pH8. 0)中で 37°C、 16時間行つ た。タンパク質濃度は 1. 0mg/mlで、酵素：基質比は 1 : 100とした。反応停止には 100°Cで 3分間処理した。
[0067] (iv) trypsinによる断片化 上記（i)で得られた S—カルボキシアミドメチル化 NASの trypsin消化を、 2M尿素を 含む 0. 1M炭酸アンモニゥム緩衝液（pH8. 5)中で 37°C、 24時間行った。タンパク 質濃度は 0. 2mg/mlで、酵素：基質比は 1： 20とした。反応停止には 100°Cで 3分 間処理した。
[0068] (V)ペプチドの分離及び配列解析
± Βΰ (ii)一 Uv)の操作でネ导られた chymotrypsin消ィ匕ぺフチド、 endoproteinase Asp_N消化ペプチド及び trypsin消化ペプチドを、 TSKgel 〇DS_80TsQA力 ラム（東ソ一社製、直径 4. 6mm X I 5cm)を用いた HPLCによって分離した。各ぺプ チドは 0. 05%トリフルォロ酢酸を含むァセトニトリルの直線濃度勾配溶出法で溶出し た。
220nmの吸収によって検知された chymotrypsin消化ペプチドの HPLC溶出パタ 一ンを図 3に、同様にして検知された endoproteinase Asp_N消化ペプチドの HP LC溶出パターンを図 4に、 trypsin消化ペプチドの HPLC溶出パターンを図 5に、そ れぞれ示す。
220nmの吸収によって検知され、分取されたペプチドは乾燥後、アミノ酸シーケン サー (Procise 49lcLし Protein sequencing System又は Procise 492HT Protein Sequencing System)により内部アミノ酸配列を解析した。
[0069] (3) C末端アミノ酸配列解析
上記（2) (i)で得られた S—カルボキシアミドメチル化 NAS lnmolの carboxypept idase A消ィ匕を、 0· 15%SDSを含む 50mMトリス-塩酸緩衝液（ρΗ7· 5)中で 25 °Cで行った。タンパク質濃度は 5mg/mlで、酵素：基質比は 1 : 40とし、反応開始直 後と 6時間反応後にサンプリングした。反応停止には反応液に等量の 10%トリクロ口 酢酸を添加し、 0°C、 30分静置後、遠心分離して上清を回収した。
上清にある遊離したアミノ酸を PTC化し、 TSKgel ODS_80TsQAカラム（東ソ一 社製、直径 4. 6mm X I 5cm)を用いた HPLCによって定量分析した。結果を図 6に 示す。
図 6の結果に示すように、 Asn、 Leu,及び Ser以外のアミノ酸は遊離されなかった 。 Carboxypeptidase Aは、 Proまたは Argを遊離する活性が著しく低いことから、 C末端から 4番目のアミノ酸は Proまたは Argと推定され、 NASの C末端配列は C末 端側から NLSP/Rであることが確認された。
[0070] (4)一次構造の決定
以上の方法により決定されたアミノ酸配列は、配列表の配列番号 2及び図 7に示す 通りである。尚、図 7において、 4行目の Nは N末端から決定したアミノ酸配列部分を 示し、 C1一 14は chymotrypsin消化力 得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示 し、 D1 4は、 endoproteinase Asp_N消化から得られたペプチドのアミノ酸配列 部分を示し、 T1一 4は trypsin消化から得られたペプチドのアミノ酸配列部分を示す 。また、—は C末端力も得られた配歹 1Jを示す。
実施例 4
[0071] 実施例 2において得られたネオクリンを構成する NBS画分のアミノ酸配列を、実施 例 3と同様の手順に従い解析した。
その結果、 NBSのアミノ酸配歹 Uは、配列表の配列番号 6に示すアミノ酸配列からな り、特開平 6-189771公報において既に開示されているポリペプチドであるクルタリ ン Bのアミノ酸配列とほぼ完全に一致した力 S、 C末端に Glyが付加されており、クルタリ ン Bのアミノ酸残基数 114よりも 1残基長力 た。
実施例 5
[0072] 実施例 2において得られたネオクリンを構成する NAS画分の糖鎖修飾について、 以下の手順に従い解析した。
すなわち、糖鎖付加コンセンサス配列を有するペプチド、すなわち、実施例 3 (2) (i i)で得た精製 NASの chymotrypsin消化ペプチド CIを回収し、 ABEE糖組成分析 キットプラス S (ホーネンコーポレーション社製）を用いて、糖鎖の糖組成を分析した。 具体的には、シアル酸の遊離処理をしてから、還元糖に変換し、引き続き、酸加水 分解により、糖タンパク質糖鎖中に含まれるグリコシド結合を全て切断し、単糖に遊 離した。生じた単糖は標識化をした後、 TSKgel ODS_80TsQAカラム（東ソ一社 製、直径 4. 6mm X 7. 5cm)を用いた HPLCで分離し、 305nmの吸収で検出し、分 祈した。
分析の結果、 NASに付加された糖鎖の糖組成は、マンノース/ N -ァセチルダル コサミン/フコース /キシロースがほぼ 3/2/1/1の比であった。この結果、及び 植物に一般的に見られる糖鎖構造を参考に推定された NASに付加された糖鎖構造 を図 8に示す。
実施例 6
[0073] ネオクリンを構成する NASをコードする遺伝子を、以下の手順に従いクローニング した。
[0074] (l) cDNAライブラリーの作成
材料には、クルクリゴ 'ラチフォリアの果実（日本新薬 (株） 山科植物資料館から提 供された）を用いた。受粉 4一 8週後の果実約 20. 6gを液体窒素によって凍結し、解 凍しないように粉砕した。このようにして得た粉末 20. 6gを試料として、 mRNA Puri fication Kit (Amersham Bioscience社製）を用いて Poly (A) +mRNAを抽出した。 抽出した mRNA約 4. 5 μ g力ら cDNA Synthesis Kit (Amersham Bioscience社 製）を用いて cDNAライブラリーを作成した。 cDNAは EcoRIアダプター連結で λ Ζ ΑΡΠベクター（Stratagene社製）に挿入した。これを Gigapack III Gold Packagi ng Extract (Stratagene社製）を用いてファージにパッケージングし、大腸菌 XL1— Blue MRF こ感染させたところ、約 1. 2 X 105個のプラーク力、ら成るライブラリーを 得た。
[0075] (2)プローブの作成
凍結乾燥処理したクルクリゴ 'ラチフォリアの果実 20mgを材料とし、 DNeasy Plan t Mini Kit (QIAGEN社製）を用いてゲノム DNAを抽出した。特開平 6—189771 号公報で開示されている NBSのアミノ酸配列を元に配列表の配列番号 4に記載の N CISプライマー、及び配列表の配列番号 5に記載の NC1Aプライマーを合成し、抽 出したゲノム DNAを铸型として PCR反応（94°C， 3分， 42°C, 3分、 72°C， 3分を 1サ イクノレ、 94°C， 30禾少、 42°C, 30禾少、 72°C, 1分を 50サイクノレ）を行ったところ、 NAS の一部をコードする 469bpの DNA断片が得られた。この DNA断片をプローブとして 使用した。
[0076] (3)プラークハイブリダィゼーシヨン
(1)で得たライブラリーのうち、 2xl04個のプラークをナイロンメンブレンに移して D NAを固定した後、 （2)で作成したプローブを用い、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを 行った。洗浄は 0. lxSSC, 0. 1 %SDSを用い 65°Cで行った。その結果、約 100個 のプラークがプローブとハイブリダィズした。強レ、シグナルを示す 25個のプラークに ついて、 2次スクリーニングを行レ、、シングルプラークに分離した。
[0077] (4)塩基配列の決定
(3)で得たシングルプラークファージをヘルパーファージと XLl_Blue MRF'に 共感染させ in vivo excisionすることで; I ΖΑΡΠベクターからインサート cDNAを 含む pBluescriptll SK (一）を切り出した。 cDNAの塩基配列をジデォキシ法により 決定した。
その結果、決定された塩基配列は配列表の配列番号 1に示すとおりであった。配列 表の配列番号 1に示す塩基配列のうち、塩基番号 70 408からなる塩基配列がコー ドするポリペプチドのアミノ酸配列は、実施例 4で得られた NASのアミノ酸配列（配列 表の配列番号 3記載のアミノ酸配歹 IJ)と一致してレ、た。
また、配列表の配列番号 1に示す塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる部分 には、 NASのアミノ酸配列を含むオープンリーディングフレーム（ORF)が見出され た。このこと力ら、 NASはシグナルペプチド及び延長ペプチドを含む前駆体ペプチド (PNAS)の形で産生されることが確認された。塩基番号 4一 477からなる塩基配列 力 Sコードする PNASのアミノ酸配歹 IJは、配列表の配列番号 3に記載するとおりである。 実施例 7
[0078] ネオクリンを添加した野菜ジュースを、以下の手順に従い調製し、その味覚改変活 性を評価した。
糸田力、く切った新鮮なほうれん草 135g、ピーマン 65g、セロリ 65g、及びレモン汁 25g に水 300mlを加えてミキサーで 5分間懸濁し、これを孔計 0. 1mmのナイロンメッシュ でろ過して、約 400mlの野菜ジュースを得た。この野菜ジュース 100mlに実施例 1の 精製ネオクリン粉末を 50mg添加したものを高濃度添加野菜ジュース、 10mg添加し たものを低濃度添加野菜ジュースとし、無添加野菜ジュースを対照サンプルとして、 パネラー 4名により官能評価を行った。評価点は無添加野菜ジュースの苦味、えぐ味
、及び甘味をそれぞれ 0点とし、それぞれの味において、顕著に増強された時を 2点 、増強された時を 1点、顕著に低減された時を一 2点、低減された時を一 1点とした。評 価結果の平均値を表 2に示す。
[0079] [表 2]
Figure imgf000030_0001
[0080] 表 2の結果から、本発明のネオクリンは、苦味及びえぐ味を顕著に低減すると共に、 甘味を付与することにより食品の嗜好を高める効果があることが確認された。
実施例 8
[0081] ネオクリンを添カ卩したグレープフルーツ果汁を、以下の手順に従い調製し、その味 覚改変活性を評価した。
グレープフルーツ果汁 1 OOmlに実施例 1の精製ネオクリン粉末を 1 Omg添カ卩したも のを高濃度添加サンプル、 5mg添加したものを低濃度添加サンプノレとし、無添加グ レープフルーツ果汁を対照サンプノレとして、パネラー 4名により官能評価を行った。 評価点は対象サンプルの苦味、酸味、及び甘味をそれぞれ 0点とし、それぞれの味 において、顕著に増強された時を 2点、増強された時を 1点、顕著に低減された時を 一 2点、低減された時を一 1点とした。評価結果の平均値を表 3に示す。
[0082] [表 3]
Figure imgf000030_0002
[0083] 表 3の結果から、本発明品のネオクリンは、苦味を顕著に低減すると共に、酸味を 抑制し、甘味を付与することにより食品の嗜好を高める効果があることが確認された。 実施例 9
[0084] ネオクリンを添加した寿司ネタ用調味液を、以下の手順に従い調製し、その味覚改 変活性を評価した。尚、ここでいう寿司ネタ用調味料とは、生のまま、又は一旦加熱 処理した寿司用の寿司ネタに予め塗布したり、浸漬したりして寿司ネタを調味するた めの調味料である。
寿司ネタ用調味料の組成は、表 4に示す通りとした。尚、寿司ネタ用調味料は、使 用時は寿司ネタの種類、量に応じて適宜、水で希釈して用いるため、本実施例にお いては 2倍希釈して用いた。
[表 4]
Figure imgf000031_0001
[0086] 希釈済寿司ネタ用調味液 100mlに、実施例 1の精製ネオクリン粉末 11. 3mgを添 加してネオクリン添加調味液を得た。このネオクリン添加調味液に海老を 20分間浸 漬して海老の寿司ネタ (ネオクリン添加サンプル)を得た。一方、ネオクリン粉末を添 カロしないままの希釈済寿司ネタ用調味液にも同様に海老を浸漬して海老の寿司ネタ (対照サンプル）を得た。パネラー 4名が、ネオクリン添加サンプノレ及び対照サンプノレ を各一尾ずつ食することにより、各サンプノレのえぐ味の強さを評価した。その結果、ネ ォクリン添加サンプルは、対照サンプルに比べて、えぐ味が顕著に抑制されることが 確認された。
実施例 10
[0087] ネオクリンの味覚改変活性とクルクリンの味覚修飾活性とを、以下の手順で比較し た。
[0088] (1)クルクリンの調製
まず、特開平 6-189771号公報の実施例 1一 12において開示されている方法によ り、クルクリン Bを発現させた。
その後、クルクリン Bを発現している形質転換大腸菌を超音波発生装置により破壊 した懸濁液を、 50mM塩化ナトリウムを含む 25mMリン酸緩衝液（pH6. 8)を用いて 遠心分離により 4回洗浄した。これを 8M尿素、 10mM DTTを含む 500mMトリス塩 酸緩衝液 (PH9. 5)に溶解し、 37°Cで 2. 5時間還元した。この溶液に、 10倍量の 8 M尿素、 0. 11M酸化型ダルタチオンを含む 500mMトリス塩酸緩衝液（ρΗ8· 5)を 添加し、室温で 3時間静置し、タンパク質をダルタチオン化した。このダルタチオン化 タンパク質に、 10倍量の 4mMシスティンを含む 50mMトリス塩酸緩衝液（ρΗ9· 0) を添カ卩し、 4°Cで 2日間反応させた後、 0. 1M塩化ナトリウムを含む 50mMリン酸緩 衝液 (pH6. 8)に透析することでホモダイマーを形成させた。その後、凍結乾燥する ことで、クルクリン Bのホモダイマーであるクルクリン粉末を得た。
[0089] クルクリン Bがホモダイマーを形成していることは、 SDS—PAGEで確認した。すな わち、クノレクリン粉末 10 z gを、ゲル濃度 15%で SDS— PAGE後、 CBB染色を行つ たところ、図 9に示す通り、非還元下で約 20kDaの位置に単一バンドが見られ、還元 下では約 l lkDaの位置に 1本のバンドが見られることを確認した。該ホモダイマー、 クルクリンを用いて以下の官能検查を行った。
[0090] (2)味覚改変活性及び味覚修飾活性の比較
実施例 1で得た精製ネオクリンを、 30、 50、 75、 lOO i g/mlの各濃度となるように 、また、 （1)で得たクルクリンを、 lOO ^ g/mlとなるように、水に溶解した。 100 /i g/ mlクルクリン溶液 500 μ 1を口に含み、溶液を吐き出した後、 0. 1% (ν/ν)酢酸を口 に含んだ時の甘さを基準として、各濃度のネオクリン溶液 500 μ 1を口に含み、溶液を 吐き出した後、 0. 1 % (ν/ν)酢酸を口に含んだ時の甘さをパネラー 3名で評価した。 その際、クルクリン溶液時の甘さに比べて、同等の甘味の時は 0点、やや甘味が強い 時は 1点、甘味が強い時は 2点、著しく甘味が強い時は 3点、やや甘味が弱い時は一 1点、甘味が弱い時は一 2点、著しく甘味が弱い時は一 3点とした。評価結果の平均値 を表 5に示す。
[0091] [表 5]
Figure imgf000032_0001
[0092] 表 5の結果から、ネオクリンの有する味覚改変活性は、クルクリンの味覚修飾活性よ りも著しく強いことが確認された。
実施例 11 [0093] NASをコードする遺伝子の DNAを含むベクターと NBSをコードする遺伝子の DN Aを含むベクターを用いて麹菌でのネオクリンの発現を確認した。
麹菌の一種であるァスペルギルス.ォリゼ（Aspergillus oryzae)などの糸状菌を用い た異種タンパク質生産では、宿主分泌タンパク質との融合タンパク質として発現する ことにより、大量に生産することが可能である。また、ゴルジ体に局在するプロテア一 ゼである KEX2の切断配列を融合部位に揷入することで、 目的のタンパク質のみを 分泌させることができる（例えば、「アプライド'アンド'エンバイ口メンタル 'マイクロバイ ォロジ一（Appl. Environ. Microbiol. )」、 63卷、 p488— 497、 1997年参照）。
本実施例ではァスペルギルス ·ォリゼで最も大量に分泌されるタンパク質であるひ— アミラーゼをキャリア一にして、 NASをコードする遺伝子と NBSをコードする遺伝子を 発現させて、ネオクリンの生産をおこなった。
発現の手順は、以下に示す通りとした。
[0094] (1)組換えベクターの作製
ヘクター構築 ット (Multisite Gateway Three-Fragment Vector construction Kit ; Invitrogen社製）を使用して組換えベクター（pgFa3GNaSJ及び pgFa3GNbTa)を 作製した。
このキットを用いた方法は、 （a) 5 'エントリークローンの作製、 （b)目的遺伝子ェント リークローンの作製、（c) 3 'エントリークローンの作製、（d) 3種類のエントリークローン とデスティネーション 'ベクターとの組換え反応による発現ベクターの作製、の順でコ
Figure imgf000033_0001
具体的には、以下に示すような手順及び条件にて実施した。
[0095] (a) 5 'エントリークローンの作製
馬橋らの方法 (例えば、 2004年日本農芸化学会要旨集、 p. 24、 2004年参照）に 従って、 5 'エントリークローン（pg5 ' PFa)を作製した。
すなわち、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae) RIB40株（独立行政法人酒 類総合研究所に RIB No. 40として保存され、入手可能）のゲノムを錡型とし、配列 表の配列番号 7に示す塩某配列カ^なるプライマー 1 (5 ' _GGGGACAACTTTG 下線は attBサイト配列を示す）と、配列表の配列番号 8に示す塩基配列からなるブラ
AGATCTTGCTA— 3 '、但し下線は attBサイト配列を示す）とを使用した PCRを行 つて、 amyBプロモーター及びその〇RFの配列を増幅した。
[0096] PCRによって得られた増幅断片を、ドナーベクター pDONR P4-PlR (Invitrogen 社製）に attBサイトと attPサイトの組換え反応（BP組換え反応）を利用して導入し、 5 ，エントリークローン (以下、 pg5 ' PFaと称する）を得た。その後、 pg5 ' PFaを大腸菌 DH5ひ株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
[0097] (b)目的遺伝子エントリークローンの作製
目的遺伝子のうち、 NASをコードする遺伝子のエントリークローン（pgE3GNa)は、 以下のようにして作製した。すなわち、 NASをコードする遺伝子の cDNAクローンの うち、 NASの成熟領域 (23Asp 135 Asnをコードする部分、配列表の配列番号 1記載 の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる部分）を铸型とし、 N末端の前に KE X2切断配列 (Lys - Arg)及び 3残基の Glyを付加して設計された配列表の配列番号 9に示す塩基配列からなるプライマー 3 (5 ' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAA
'、但し下線は attBサイト配列を示す）と、 C末端の後に終止コドンを含む塩基配列を 付加して設計された配列表の配列番号 10に示す塩基配列からなるプライマー 4 (5'
GCACCC_3 '、但し、下線は attBサイト配列を示す）とを使用した PCRを行った。
PCRによって得られた増幅断片を、ドナーベクター pD〇NR221 (Invitrogen社製） に BP組換え反応を利用して導入し、 NASをコードする遺伝子のエントリークローン（ 以下、 pgE3GNaと称する）を得た。その後、 pgE3GNaを大腸菌 DH5ひ株に導入し 、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
NASをコードする遺伝子のエントリークローン（pgE3GNb)についても、基本的に は上記 NASをコードする遺伝子の場合と同様に行った。すなわち、 NBSをコードす る遺伝子の cDNAクローンのうち、 NBSの成熟領域（23 Asp—137 Glyをコードする部 分、配列表の配列番号 17記載の塩基配列のうち塩基番号 67 411からなる部分） を铸型とし、 N末端の前に KEX2切断配列及び 3残基の Glyを付加して設計された 配列表の配列番号 11に示す塩基配列からなるプライマー 5 (5'— GGGGACAAGT
CCTGCTCTCCG—3 '、但し下線は attBプライマー配歹 IJ)と、 C末端の後に終止コ ドンが入る配歹 1Jを付加して設計された配列表の配列番号 12に示す塩基配列からな
CACCATTAACACGGCG— 3 '、但し下線は attBプライマー配歹 IJ)とを使用した P CRを行った。
PCRによって得られた増幅断片を、ドナーベクター pD〇NR221 (Invitrogen社製） に BP組換え反応を利用して導入し、 NBSをコードする遺伝子のエントリークローン（ 以下、 pgE3GNbと称する）を得た。その後、 pgE3GNbを大腸菌 DH5ひ株に導入し 、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
(c) 3，エントリークローンの作製
馬橋らの方法 (例えば、 2004年日本農芸化学会要旨集、 p. 24、 2004年参照）に 従って、 3，エントリークローン (pg3 ' sCJ及び pg3 ' Ta)を作製した。
まず、 amyBターミネータ一及び Asperugillus nidulansの sC遺伝子を組み込んだ 3， エントリークローンは、以下のようにして得た。すなわち、 pgDSN (amyBターミネータ 一及び Asperugillus nidulansの ATPスルフリラーゼ（sC)遺伝子の配列（配列表の配 列番号 18に記載の塩基配列）を組み込んであるプラスミド）を铸型とし、配列表の配 列番号 13に示したプライマー 7 (5， -GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTG GGTGATCTGTAGTAGCTCGTGAA-3 \但し下線は attBプライマー配列を 示す）と、配列表の配列番号 14に示したプライマー 8 ( 5， -GGGGACAACTTTGT
、下線は attBプライマー配列を示す）を使用し PCRを行って、 amyBターミネータ一 及び Asperugillus nidulansの sC遺伝子の配列を増幅した。
PCRによって得られた増幅断片を、ドナーベクター pD〇NRP2R_P3 (Invitrogen 社製）に BP組換え反応を利用して導入し、 3 'エントリークローン (以下、 pg3' sCJと称 する）を得た。その後、 pg3' sCJを大腸菌 DH5ひ株に導入し、得られたコロニーを増 殖させた後、プラスミドを抽出した。
[0100] また、 amyBターミネータ一のみを持つ 3，エントリークローン（pg3 ' Ta)は、上記 pg 3' sCJと同様の手順で得た。
すなわち、配列表の配列番号 18に記載の塩基配歹 1Jを錡型として、配列表の配列 番号 15に示す塩基配列からなるプライマー 9 (5 ' -GGGGACAGCTTTCTTGTA CAAAGTGGGATCTGTAGTAGCTCGTGAAG - 3，、但し下線は attBプライ マー配列を示す）と、配列表の配列番号 10に示す塩基配列からなるプライマー 10 (
GCGTGC—3 '、但し下線は attBプライマー配列を示す）を使用し、 PCRを行った。
PCRによって得られた増幅断片を、ドナーベクター pD〇NRP2R_P3 (Invitorogen 社製）に BP組換え反応によって導入し、 3 'エントリークローン（以下、 pg3'Taと称す る）を得た。その後、大腸菌 DH5ひ株に導入して得られたコロニーを増殖させた後、 プラスミドを抽出した。
[0101] (d) 3種類のエントリークローンとデスティネーション 'ベクターとの組換え反応による 発現ベクターの作製
NASをコードする遺伝子の DNAを導入した組換えベクター、すなわち NAS発現 ベクター（以下、 pgFa3GNaSJと称する）は、以下のようにして作製した。
すなわち、上述の（a)で得られた pg5 ' PFaと、（b)で得られた pgE3GNaと、（c)で 得られた pg3 ' sCJの 3種類のエントリークローンを、デスティネーション 'ベクター pDE STR4-R3 (Invitrogen社製）と混合し、 LR Clonase Plus Enzyme Mixを加え 、 attLサイトと attRサイトの組換え反応 (LR組換え反応）を行った。その結果得られ る組換えベクターを大腸菌 DH5ひ株に導入して形質転換し、得られたコロニーを増 殖させた後、 目的の組換えベクターとして、 pgFa3GNaSJを抽出した。
このような pgFa3GNaSJの作製過程及び構造の概略を、図 10に示した。
[0102] NBSをコードする遺伝子の DNAを導入した組換えベクター、すなわち NBS発現 ベクター（以下、 pgFa3GNbTaと称する）は、以下のようにして作製した。
すなわち、上述の（a)で得られた pg5 ' PFaと、（b)で得られた pgE3GNbと、（c)で 得られた pg3 ' Taの 3種類のエントリークローンを、デスティネーション 'ベクター pDE STR4-R3 (Invitrogen社製）と混合し、 LR Clonase Plus Enzyme Mixを加え 、 LR組換え反応を行った。その結果得られる組換えベクターを大腸菌 DH5 a株に 導入して形質転換し、得られたコロニーを増殖させた後、 目的の組換えベクターとし て pgFa3GNbTaを抽出した。
このような pgFa3GNbTaの作製過程及び構造の概略を、図 11に示した。
[0103] このようにして得られた組換えベクター（pgFa3GNaSJ及び pgFa3GNbTa)は、以 下に示す 3つの特徴をもつ。
まず、第一の特徴は、キャリアータンパク質としてひ—アミラーゼを用レ、、 NAS及び NBSとひ一アミラーゼとの融合タンパク質を発現させるベぐ ひ一アミラーゼをコードす る遺伝子を、 NAS及び NBSをコードする遺伝子と共に導入したことである。
タンパク質を、本来の由来生物以外の異種を宿主として生産する場合、特に宿主と してァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)を用いた報告としては、宿主の分泌 タンパク質であるグノレコアミラーゼ（GlaA)をキャリア一として用い、その結果、生産量 が増加したとレ、う報告がある（「バイオサイエンス 'バイオテクノロジー ·アンド ·バイオケ ミストリー（Biosci. Biotechnol. Biochem. )」、 58卷、 5号、 p. 895—899、 1994年）。 しかし、他の分泌タンパク質をキャリア一として用いることは検討されていない。今回、 本発明者らは、ァスペルギルス 'ォリゼが最も大量に分泌する酵素である α—アミラー ゼを用い、分泌経路での異種タンパク質の安定化及び生産量の増加を試みた。
[0104] 第二の特徴は、 α—アミラーゼと NAS又は NBSとの連結部分に、 ΚΕΧ2の認識配 列（Lys— Arg)を導入したことである。
麹菌のゴルジ体中には、 KEX2様のプロテアーゼが存在する。 KEX2プロテア一 ゼとは、塩基性アミノ酸対（Lys_Lys、 Lys_Arg、 Arg_Lys、及び Arg— Arg : KEX 2 の認識配列）を認識し、その C末端を切断するセリンプロテアーゼである。つまり、こ れらの KEX2の認識配列を持つタンパク質が小胞体（ER)力 ゴルジ体へと移行す ると、ゴルジ体内で KEX2様プロテアーゼにより切断される。従って、 KEX2の認識 配列を導入することにより、融合タンパク質であるひ一アミラーゼと NAS又は NBSとの 間が切断され（プロセシング）、 NAS又は NBSを単独で得ることができる。
[0105] 第三の特徴は、切断効率が改良された点である。 上記した KEX2による切断は、 KEX2の認識配列付近の立体構造によって不正確 になされることがある。ネオクリンはへテロ 2量体を形成し、切断部位付近の立体構造 が複雑であることが予想されたため、 NAS及び NBSの N末端の Aspの直前に 3残基 の Glyを揷入して、切断効率と切断の正確性の改良を行った。
[0106] (2)形質転換体の作製
形質転換はプントらの方法（「メソッズ 'イン'ェンザィモロジ一（Methods Enzymol. ) 」、 216卷、 p. 447—457、 1992年）の方法を改変して、以下のようにして行った。
[0107] (a)プロトプラストの調製
PDプレート（1リツターの水に対して 39gのポテトデキストロース（二ッスィ社製）を溶 解しオートクレープした後、滅菌済みプレートに分注）に、ァスペルギルス'オリゼ（ Aspergillus oryzae) NS4株（sC, niaD)を滅菌した竹串に塗布し、 7日間 30°Cでイン キュベーシヨンして分生子を生育させた。
これを 100mlの DPY液体培地（2%Dextrin、 l %Polypeptone、 0. 5% Yeast extract, 0. 5%KH P〇、 0. 05%MgSO · 7Η2〇、 pH5. 5)に、竹串で搔き入れ
2 4 4
30°C、 200i"pmで 20時間振とう培養した後、滅菌したミラクロス（Calbiochem社製）で 菌体を回収し、滅菌水で洗浄した。
10mlの Sol— l (l %Yatalase (宝酒造社製）、 0. 6M (NH ) SO 、 50mM Mai
4 2 4
eate buffer, pH5. 5)を入れた L字管に菌体を移し、 30°Cで 3時間やさしく振とうし プロトプラスト化した。
[0108] (b)発現ベクターの導入一適当量の発現ベクターを共形質転換と栄養要求培地によ る選択と形質の安定化
得られたプロトプラストをミラクロスに通し菌体残渣を除去し、等量の Sol— 2 (1. 2M Sorbitol, 50mM CaCl、 35mM NaCl、 lOmM Tris— HC1、 pH7. 5)を加え
2
、 2000rpm, 4°C、 break offで遠心した。
沈殿を So卜 2で 2回洗浄後、 200 μ 1の Sol_2に 1 X 107cell/mlになるように Sol— 2に懸濁した。
[0109] NAS導入プラスミドを 2 μ g、 NBS導入プラスミドを 10 μ gずつ加え、 30分氷上でィ ンキュベー卜した。 250 μ 1、 250 μ 1、 850 μ 1と段 Ρ皆的に Sol_3 (60%PEG4000、 5 OmM CaCl、 lOmM Tris_HCl、 pH7. 5)を加え、やさしく混合し 20分室温放置
2
した。 5— 10mlの Sol_2を加えて遠心後、 500 μ 1の Sol_2に懸濁した。
[0110] 懸濁液を予め分注し保温しておいた 5mlの Top Agar (l . 2M Sorbitol入り）に 加え、下層培地（MSプレート； 1. 2 M Sorbitol. 0. 2% NH Cl、 0. 1% (NH )
4 4
SO、 0. 05%KC1, 0. 05% NaCl、 0. 1% KH PO、 0. 05%MgSO - 7H〇
2 4 2 4 4 2
、 0. 002% FeSO - 7H〇、 2%glucose、 1. 5% Agar, pH5. 5)に流し込んだ。
4 2
その後、パラフィルムをまき空気穴を開け 30°Cで 3 5日インキュベートした。得られ たコロニーを Mプレート（0. 2% NH Cl、 0. 1 % (NH ) S〇、 0. 05% KC1、 0. 0
4 4 2 4
5% NaCl、 0. 1% KH PO、 0. 05% MgSO - 7H〇、 0. 002% FeSO - 7H
2 4 4 2 4
0、 2%glucose、 1. 5% Agar, pH5. 5)に 3回植えついで形質を安定させた。 1プ
2
レートにつき 30株の形質転換体が得られた。
[0111] (3)ネオクリン生産株の選抜
(a) DPY液体培地（ρΗ8· 0)による小スケールでの生産と培養液の回収
上記（2)形質転換体の作製で得られた形質転換体 12株を Μプレートに塗布し、 30 °Cで 2— 4日インキュベートした。オートクレーブした竹串で分生子を搔き取り 20mlの DPY液体培地（ρΗ8· 0) (DPY液体培地（ρΗ5· 5)の試薬の組成のうち、 0· 5%Κ H POを 0· 5%Κ ΗΡΟに替え、 1Μ Na〇H溶液で pHを 8· 0に調整）を入れた 1
2 4 2 4
00mlフラスコで 30°C、 200rpmで 3日間振とう培養した。培養液から菌体をミラクロス で分離し回収した。
[0112] (b)生産株の選抜とウェスタンブロッテイング解析
回収した培養液を還元下で SDS—P AGE (15%アクリルアミド）に供した後、 PVDF 膜（Millipore社製）に転写しゥヱスタンプロッテイング解析を行った。
転写終了後の膜を 5%スキムミルクを含む TBSTに浸し、 60分室温でゆるやかに振 とうさせた。 2. 5mlの 5%スキムミルクを含む TBSTに 0. 5 μ 1の抗ネオクリン抗体を 1 次抗体として加えプラスチックバッグに入れ室温で 60分放置した。 TBSTで膜を 10 分ずつ 3回洗浄したのち、 5%スキムミルクを含む TBSTに 2. 5 μ ΐのアルカリフォスフ ァターゼ結合抗ゥサギ IgG抗体（Sigma社製）を 2次抗体としてカ卩ぇプラスチックバッ グに入れ室温で 60分放置した。 TBSTで膜を 10分ずつ 3回洗浄したのち、 10mlの 反応液（0· IM Tris-HCl (pH9. 5)、 5mM MgCl、 0. IM NaCl)に、基質とし
2
て 66 μ 1の ΝΒΤと 33 μ 1の BCIPを加え、これを遮光条件で数分間反応させ発色させ た。その結果を図 12に示した。
[0113] その結果、クルクリゴ果実から精製したネオクリン標品の分子量と、形質転換体によ り産生された 2つのサブユニットのバンドの割合（図 12の矢印）を考慮して 12株の形 質転換体の中から # 2株を選抜した。ここに選択された # 2株は、ァスペルギルス-ォ リゼ（Aspergillus oryzae) NS—NAB2株と命名され、 日本国茨城県つくば巿中央第 6 の独立行政法人特許生物寄託センターに、寄託番号 FERM ABP— 10209として 寄託されている。
[0114] (4)大量培養
(a)分生子の回収
上記（3)ネオクリン生産株の選抜で得られた形質転換体（ # 2株）の分生子を、 PD プレートに竹串で塗りつけ 30°Cで 3— 7日間インキュベートした。分生子が成長した プレートに 10mlの 0· 01 %Tween80溶液を注ぎ滅菌スポイト（Sarstedt社製）で分生 子を搔き取った。
これを 15mlファルコンに回収し、 1分間激しく攪拌したのち、滅菌したミラクロスで菌 体残渣を取り除いた。 4°Cで 4000rpm、 5分間遠心した後、上清を捨て 10mlの 0. 0 l %Tween80溶液を加え攪拌した。同じ操作をもう 1度繰り返した後、 4°Cで 4000rp m、 5分遠心し、上清を捨て沈殿を lmlの滅菌水に溶解した。回収液のうち数 μ ΐを水 で 10倍程度に希釈しトーマ血球計算版を用いて分生子の数を計測した。
[0115] (b) DPY液体培地（ρΗ8· 0)での大量振とう培養
DPY液体培地（ρΗ8. 0)を 120mlずつ、 500mlフラスコに加えたものを 5つ用意し た。それぞれに分生子を l X 107cell/lとなるように加え、 30°C、 200rpmで 72時間 振とう培養した。培養液から菌体をミラクロスで分離し約 400mlを回収した。
[0116] (5)組換えネオクリンの精製
(a)硫安分画
上記 (4)の大量培養で回収した培地に、飽和硫安濃度が 60%になるように硫安を カロえたのち 30分インキュベートした。 10000rpm、 4°C、 30分間遠心し沈殿を回収し た。
[0117] (b)フエニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製
硫安分画して得られた沈殿を Buff erA (3M NaCl、 20mM Acetate_Na、 pH5 . 0)に溶解したのち、 Buff erAに対して 1晚透析した。回収後、溶液を 0. フィ ルターでろ過したものをサンプルとした。
カラムは HIC PH-814 (20 X 150mm) (Shodex社製）を用レヽ、 0— 20分までは BufferA、 20— 90分の間は BufferAに対して BufferB (20mM Acetate— Na、 p H5. 0)を、 0から 100%のグラジェント、さらに、 90 110分までは BufferBを移動 相として、流速 3. Oml/minの条件で、フエニル疎水カラムクロマトグラフィーによる 分画 (検出； 280nm)を行った（図 13 (a) )。得られた画分 (Fr. 1— 5)を電気泳動し た後、ウェスタンブロッテイング解析したところ（図 13 (b) )、組換えネオクリン (NASと NBSのへテロダイマー）は、 Fr. 1に溶出し、 Fr. 2— 5では主に NASのホモダイマ 一と見られるバンドが検出された。 Fr. 1を回収し、さらに精製を進めた。 （図 13)。
[0118] (c)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製
フエニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製で得られた Fr. 1画分を水に対して 透析後、凍結乾燥したのち少量の水に溶解したものをサンプノレとした。
カラム ίま TSK— GEL G3000SW(7. 5 X 300mm) (TOSOH社製）を用レヽ、 0. 5 M NaCl、 50mM Acetate_Na、 pH5. 0を移動相として、流速 1 · Oml/minの 条件で、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる分画（検出； 280nm)を行った（図 14 (a) ) 0
Fr. 1一 4を個々に回収し、それぞれを水に対して透析後、凍結乾燥したのち少量 の水に溶解した。これを還元条件又は非還元条件の下で電気泳動（SDS—PAGE) し、 CBB染色（図 14 (b) )及びウェスタンブロッテイング解析（図 14 (c) )を行った結果 、組換えネオクリンは Fr. 3及び Fr. 4に溶出し低ることが明らかとなった。
[0119] Fr. 1一 4のうち、 Fr. 3 (レーン 3)と Fr. 4 (レーン 4)には還元条件下の SDS—PAG Eにおいて、約 13kDaの位置に NASとみられるスメァなバンド（図 14 (b)の黒矢印） が見られ、また、約 l lkDaの位置に NBSとみられるバンド（図 14 (b)の白矢印）が検 出された。 また、非還元条件下の SDS—P AGEにおいては、約 20kDaの位置にヘテロダイマ 一とみられるバンドが検出された（図 14 (b)中の黒矢尻）。
尚、 Fr. 3には目的タンパク質であるネオクリン以外の不純タンパク質（ウェスタンブ ロッテイング解析では検出されなレ、）が多量に含まれていた。一方、 Fr. 4はネオタリ ンタンパク質の含量が高いことが明らかになった。
[0120] 更に、 Fr. 4の還元条件下の SDS—PAGEにおける 13kDa及び l lkDaの位置の バンド（図 14中、左下図のレーン 4の矢印）について PVDF膜に転写したのちアミノ 末端配列を解析したところ、 13kDaの位置のバンドのタンパク質は Gly— Gly— Gly— Asp— Ser_Val_Leu_Leu— Serであり、また、 1 lkDaの位置のバンドのタンパク質 は Gly_Gly_Gly_Asp_Asn_Val_Leu_Leu_Serであって、これらはそれぞれ、 K EX2による切断効率を高めるために N末端に付加した 3つの Glyに続ぐ配列表の配 列番号 2記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号 1一 6部分、配列表の配列番号 6記載の アミノ酸配列のアミノ酸番号 1一 6部分に該当していたことから、 NAS及び NBSを意 味していることが分かった。このこと力ら、いずれも正確な位置でプロセシングされた 組換えネオクリンが得られたことが明らかとなった。
[0121] (6)組換えネオクリンの味覚改変活性確認
精製した組換えネオクリンを 0. 3mg/mlの濃度で水に溶解し、味覚改変活性評 価をおこなった。
0. 02Nのクェン酸を 200 /i l味わって酸味を感じたのち、 20 /i lの組換えネオクリン 溶液を味わい舌になじませた。その後、再度クェン酸を 200 /i lを味わったところ、酸 味の抑制と甘味が感じられ味覚修飾活性が確認された。
これは同濃度の標品（0. 3mgZml)と同程度の比活性であり、組換えネオクリンを 味わった後 10分後にクェン酸を味わってもその活性は維持されていた。また水を摂 取しても甘味は感じられおよそ 60分程度にわたってその活性は確認できた。
以上の結果から、 NASをコードする遺伝子の DNAを含むベクターと NBSをコード する遺伝子の DNAを含むベクターを用いることにより、麹菌による味覚修飾活性を 持ったネオクリンの発現が可能であることが確認された。
産業上の利用可能性 本発明により、優れた味覚改変活性を有し、クルクリンとは異なりへテロダイマー構 造を取る新規な二量体タンパク質ネオクリンが提供され、当該タンパク質を用いて、 食品等に実用可能な新規な味覚改変組成物を提供することが可能となった。
また、本発明により、当該タンパク質を構成するサブユニットのアミノ酸配列が提供 され、このアミノ酸配列通りに、適当な合成方法によって当該タンパク質を提供するこ とが可能となった。
さらには、本発明により、当該タンパク質をコードする遺伝子の DNAが提供された ことで、適当な宿主を選び、特に麹菌を宿主として、遺伝子工学技術を用いて効率 的に当該タンパク質を提供することが可能となった。

Claims

請求の範囲
[1] 下記の（A)、又は（B)に示すポリペプチド NAS。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[2] マンノース/ N—ァセチルダルコサミン/フコース /キシロースの比が 3/2/1/1 で構成される N結合型糖鎖が付加された請求項 1に記載のポリペプチド NAS。
[3] 下記の（A)、又は（B)に示すポリペプチド NASをコードする遺伝子の DNA。
(A)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、下記の（a) 又は (b)に示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを 形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[4] 下記の（A)又は（B)に示す DNAである請求項 3に記載の遺伝子の DNA。
(A)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる塩 基配列を含む DNA。
(B)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 70— 408からなる塩 基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列 の DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、下記の（a)又は（b)に 示すポリペプチド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポ リペプチドをコードする DNA。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
下記の（A)又は（B)に示すポリペプチド PNAS。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、下記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
マンノース/ N—ァセチルダルコサミン/フコース /キシロースの比が 3/2/1/1 で構成される N結合型糖鎖が付加された請求項 5に記載のポリペプチド PNAS。 下記の（A)又は（B)に示すポリペプチド PNASをコードする遺伝子の DNA。
(A)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、プロセシン グにより成熟体ポリペプチド NASとなった後に、下記の（a)又は（b)に示すポリぺプ チド NBSと共に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチド。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、揷入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[8] 下記の（A)又は（B)に示す DNAである請求項 7に記載の遺伝子の DNA。
(A)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基 配列を含む DNA。
(B)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 4一 477からなる塩基 配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列の DNAと、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、プロセシングにより成熟 体ポリペプチド NASとなった後に、下記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSと共 に味覚改変活性を有する二量体ネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードする DN A。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[9] 請求項 1又は 2に記載のポリペプチド NASと下記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSと力 なり、味覚改変活性を有することを特徴とする二量体タンパク質ネオクリン
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[10] 請求項 9に記載の二量体タンパク質ネオクリンを有効成分として含有することを特 徴とする味覚改変組成物。
[11] 請求項 3又は 4記載の DNA、若しくは請求項 7又は 8に記載の DNAを構成する塩 基配列を含む組換えベクター。
[12] 下記の（a)又は（b)に示すポリペプチド NBSをコードする遺伝子の DNAを構成す る塩基配列を含む組換えベクター。
(a)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。 (b)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、欠失、挿入、付カロ、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、クルクリンを 構成するサブユニットとなりうるポリペプチド。
[13] ベクターが、真核生物で機能するベクターである請求項 11記載の組換えベクター
[14] ベクターが、真核生物で機能するベクターである請求項 12記載の組換えベクター
[15] ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項 11記載の組換えベクター。
[16] ベクターが、糸状菌で機能するベクターである請求項 12記載の組換えベクター。
[17] ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項 11記載の組換えベクター。
[18] ベクターが、麹菌で機能するベクターである請求項 12記載の組換えベクター。
[19] 請求項 11及び 12記載の組換えベクター、請求項 13及び 14記載の組換えべクタ 一、請求項 15及び 16記載の組換えベクター、又は、請求項 17及び 18に記載の組 換えベクターを含む形質転換体。
[20] 請求項 19に記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求項 9に記載のネオ クリンの製造方法。
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