WO2005071075A1 - 上皮細胞増殖因子受容体（egfr）由来ペプチド - Google Patents

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cancer
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Kyogo Itoh
Shigeki Shichijo
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Definitions

  • EGFR Epidermal growth factor receptor
  • the present invention relates to an EGFR-derived peptide that can be used for EGFR-based cancer immunotherapy. Specifically, the present invention relates to a polypeptide containing an EGFR-derived peptide capable of inducing both cellular and humoral immune responses, a cancer vaccine containing the peptide, and the like.
  • EGFR Epidermal growth factor receptor
  • EGFR is part of a family of receptors that consists of EGFR and four very similar proteins, including HER2, HER3 and HER4. This family of proteins also has extracellular ligand binding, transmembrane, and intracellular tyrosine kinase domain forces (Non-Patent Document 20). Binding of ligands such as epidermal growth factor (EGF) activates tyrosine kinases in the intracellular domain, triggering receptor autophosphorylation and activating signaling cascades involved in cell growth and survival (Non-Patent Document 20).
  • EGF epidermal growth factor
  • EGFR activation involves processes necessary for tumor growth and progression, including cell proliferation, inhibition of apoptosis, angiogenesis and metastasis (Non-Patent Document 19).
  • EGFR is one of the most suitable target molecules for cancer treatment because it is correlated with tumor exacerbation, which is relatively high in about one-third of all epithelial cancers (Non-patent literature). 21, 22).
  • Non-Patent Documents 4 and 5 a novel EGFR tyrosine kinase inhibitor, is known to be effective for treating patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • CTLs cytotoxic T cells
  • HLA major histocompatibility complex
  • Non-patent Documents 6-9 It has been reported in the past 10 years that an epitope peptide of HER2 / neu, which is one of the EGFR receptor families, can induce HLA class I-restricted CTL.
  • the present inventors reported that some CTL-recognizing peptides derived from non-mutant growth-related proteins were capable of inducing both cellular and humoral immune responses in vivo (non- Patent Document 10-12).
  • anti-peptide antibody levels in post-vaccine serum have been found to be in good agreement with the overall survival of advanced lung cancer patients receiving peptide vaccination (Non-Patent Document 12).
  • Non-Patent Document 12 There is a body of evidence suggesting that peptides capable of inducing both cellular and humoral immune responses by calorie are more immunogenic (Non-patent Documents 13-15), and stronger therapeutic activity can be expected.
  • Cytotoxic T cell (CTL) recognition epitope is a therapeutically useful compound different from existing compounds as a peptide vaccine for cancer patients with tumors that overexpress it in EGFR targeted therapy. Can be. However, there is currently no information on the EGFR CTL recognition epitope.
  • Non-patent document 1 Yamamoto, T., Ikawa, S., Akiyama, T., Semba, K., Nomura, N.,
  • Non-Patent Document 2 Coussens, L., Yang-Feng, TL, Liao, Y.-C., Chen, E., Gray, A., McGrath, J., Seeburg, PH, Libermann, TA, Schlessinger, J ., Francke, U., Levinson, A., and Ullrich, A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location neu oncogene.Science, 230: 1132-1139, 1985.
  • Patent Document 3 Salomon, DS, Brandt, R., Ciardiello, F., and Normanno, N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies.Crit. Rev.Oncol.HematoL, 19: 183-232, 1995.
  • Non-Patent Document 4 Miller, V. A "Johnson, DH, Krug, LM, Pizzo, B., Tyson, L” Perez, W., Krozely, P., Sandler, A., Carbone, D., Heelan, RT, Kris, MG., Smith, R., and Ochs, J. Pilot trial of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor gefitinib plus carboplatin and paclitaxel in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer.J. Clin. Oncol, 21: 2094-2100, 2003.
  • Non-language reference 5 Fukuoka, M., Yano, S., uiaccone, G., Tamura, ⁇ , Nakagawa, ⁇ , Douillard, J. ⁇ , Nishiwaki, ⁇ , Vansteenkiste, J., Kudoh, S., Rischin, D., Eek, R., Horai, ⁇ ⁇ , Noda, ⁇ ⁇ , Takata, I., Smit, mit ⁇ , Averbuch, S., Macleod, A., Feyereislova, A., Dong, RP, and Baselga, J. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer.J. Clin. Oncol, 21: 2237-2246, 2003.
  • Non-special reference literature b Peoples, G. ⁇ , Goedegebuure, PS, Smith, R., Linehan, DC, Yoshino, I., and Eberlein, T. j. Breast and ovarian cancer-specific cytotoxic T lymphocytes recognize the same HER2 / neu—derived peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 432-436, 1995.
  • Non-Patent Document 7 Fisk, ⁇ ⁇ , Blevins, ⁇ ⁇ L., Wharton, J.T ”and loannides, C.G.
  • Non-special reference literature 8 Kawashima, 1, Tsai, V., Southwood, S., Takesako, ⁇ , Sette, A., and Celis, E. Identification of HLA— A3— restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes from carcinoembryonic antigen and HER-2 / neu by primary in vitro immuneization with peptide-pulsed dendritic cells.Cancer, Res., 59: 431-435, 1999.
  • Non-Patent Document 9 Okugawa, T., Ikuta, ⁇ ., Takahashi, ⁇ ., Obata, ⁇ ., Tanida, ⁇ .,
  • HLA human HER2— derived peptide homologous to the mouse Kd— restricted tumor rejection antigen can induce HLA— A24— restricted cytotoxic T lymphocytes in ovarian cancer patients and healthy individuals.
  • HLA restricted cytotoxic T lymphocytes in ovarian cancer patients and healthy individuals.
  • Special Reference No. 10 Noguchi, M., Kobayashi, ⁇ , Suetsugu, ⁇ , Tomiyasu, ⁇ , Suekane, S., Yamada, A. Jtoh, K. and Noda, S. Induction Of Cellular And Humoral Immune Responses To Tumor Cells And Peptides In HLA-A24 Positive
  • Hormone RefractoryProstate Cancer Patients By Peptide Vaccination. Prostate, in press, 2003.
  • Non-patent literature ll Sato, Y., Shomura, H., Maeda, Y., Mine, T., Une, Y., Akasaka, Y., Kondo, M., Takahasni, S., Shinohara, ⁇ ⁇ , Katagin, ⁇ ⁇ , Sato, S., Okada, S., Matsui, ⁇ ⁇ , Yamada, A., Yamana, ⁇ ⁇ , Itoh, ⁇ ⁇ , and Todo, S. Immunological evaluation of peptide vaccination for patients with gastric cancer based on pre-existing cellular response to peptide.Cancer 3 ⁇ 4ci., in press, 2003.
  • Non-Patent Document 12 Mine, ⁇ ⁇ , Gouhara, R., Hida, ⁇ ⁇ , Imai, ⁇ ⁇ , Azuma, ⁇ ⁇ , Rikimaru, ⁇ ⁇ , Katagin, ⁇ ⁇ , Nishikori, M., Sukehiro, A., Nakagawa, M., Yamada, A., Aizawa, ⁇ , Shirouzu, ⁇ , Itoh, ⁇ , and Yamana, H. Immunological evaluation of CTL
  • Non-special reference literature 13 Parkar, M. ⁇ ⁇ , Kuru, L., uiouzeli, M., and Olsen, I. Expression of growth-factor receptors in normal and regenerating human periodontal cells. Arch. Oral. Biol., 46 : 275-284, 2001.
  • Non-Patent Document 14 Disis, ML, Pupa, SM, Gralow, J.R "Dittadi, R” Menard, S "and Cheever, MA High-titer HER-2 / neu protein-specific antibody can be detected in patients with early -stage breast cancer. J. Clin. Oncol., 11: 3363-3
  • Non-Patent Reference 15 Jager, ⁇ ⁇ , Gnjatic, S., Nagata, ⁇ ⁇ , Stockert, ⁇ ⁇ , Jager, D., Karbach J , Neumann, A., Rieckenberg, J., Chen, Y.
  • Non-Patent Document 16 Ohkouchi, S., Yamada, A “Imai, N” Mine, T “Harada, K” Shichijo, S., Maeda, ⁇ ⁇ , Saijo, ⁇ ⁇ , Nukiwa, ⁇ ⁇ , and Itoh, K .
  • Non-mutated tumor-rejection antigen peptides elicit type—I allergy in the majority of healthy individuals.Tissue Antigens, 59: 259-272, 2002.
  • Non-Patent Document 17 Kawamoto, ⁇ ⁇ , Yamada, A., Ohkouchi, S., Maeda, T., Tanaka, S., Hashimoto, ⁇ ⁇ , Saijo, ⁇ ⁇ , ⁇ aijo, S., Nukiwa, ⁇ ⁇ , Shichijo, S., Aizawa, ⁇ ⁇ , and Itoh, K. IgG reactive to CTL—directed epitopes of self-antigens is enter lacking or unbalanced in atopic dermatitis patients. Tissue Antigen, 61: 352—361, 2003.
  • Non-Patent References 19 Dancey, J. & Sausville, EA.Issues and progress with protein kinase inhibitors for the treatment of cancer.Nature Rev. Drug Discov. 2, 325-334 (2003).
  • Non-Patent Document 20 Yarden, Y. & Sliwkowski, M.X.Untangling the ErbB signaling network.Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 127-137 (2001).
  • Non-special reference 21 Baselga, J. Why the epidermal growth factor receptor? The rationale for cancer therapy. The Oncologist 7 (S4), 2-8 (2002).
  • Non-Patent Document 23 Herbst RS, Maddox AM, Rothenberg ML, Small EJ, Rubin EH, Baselga J, Rojo F, Hong WK, Swaisland H, Averbuch SD, Ochs J, LoRusso PM (2002) Selective oral epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor ZD 1839 is generally well-tolerated and has activity in non-small-cell lung cancer and other solid tumor: results of a phase I trial.J Clin Oncol 20: 3815-3825.
  • Non-Patent Document 24 Dittrich Ch, Greim G, Borner M, Weigang-Kohler K, Huisman H, Amelsberg A, Ehret A, Wanders J, Hanauske A, Fumoleau P (2002) Phase I and pharmacokinetic study of BIBX 1382 BS, an epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor, given in a continuous daily oral administration.Eur J Cancer 38: 1072-1080.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Non-Patent Document 25 Mendelsohn J, Baselga J (2003) Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the Diology and treatment of cancer.J Clin Oncol 21:
  • An object of the present invention is to provide a peptide that is a candidate for a cancer vaccine from the viewpoint of developing EGFR-based cancer therapy.
  • EGFR-derived peptides that induce a humoral immune response
  • EGFR-derived peptides having specific antibodies in the serum of NSCLC patients and healthy donors (HD) were examined.
  • the present invention was completed because these peptides were able to induce cytotoxic T cells that specifically damage tumor cells by EGFR.
  • the present invention provides:
  • nucleic acid molecule encoding the peptide according to (1) or (2) or a polypeptide comprising the peptide
  • an EGFR-reactive cytotoxic T cell that recognizes the peptide of (1) or (2) or the complex of the polypeptide of (3) and HLA;
  • FIG. 1 Representative histogram of EGFR expression in tumor cells by flow cytometry assay.
  • the dotted line indicates only the secondary antibody (FITC binding control antibody), and the black line indicates the anti-EGFR monoclonal antibody and the secondary antibody.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of detecting anti-peptide IgG in a serum sample.
  • FIG. 3A is a graph showing the results of examining the peptide specificity of anti-peptide IgG in a serum sample.
  • FIG. 3B is a graph showing the results of examining the cross-reactivity of anti-peptide IgG to full-length EGFR protein.
  • FIG. 4 is a graph showing CTL induction by an EGFR-derived peptide. * P less 0.05 (Student t test).
  • FIG. 5 is a graph showing the cytotoxicity of peptide-stimulated PBMC on cancer cell lines. * P ⁇ 0.05 (two-tailed Student's t test).
  • FIG. 6 is a graph showing HLA restriction and peptide specificity of cytotoxicity due to inhibition and competition.
  • FIG. 7 is a graph showing detection results of anti-peptide IgG in a serum sample.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of examining the peptide specificity of anti-peptide IgG.
  • FIG. 9 is a graph showing CTL induction by an EGFR-derived peptide.
  • PBMC of HLA-A2 + cancer patients were stimulated with a peptide and pulsed with the corresponding peptide.
  • T2 cells HLA-A2, TB hybridoma ) was measured for IFN- ⁇ production. * P ⁇ 0.05 (Student's t-test).
  • FIG. 10 is a graph showing the cytotoxicity of peptide-stimulated PBMC on cancer cell lines.
  • SKOV3-A2 HLA-A2 +, EGFR
  • SKOV3 HLA-A2-, EGFR +
  • FIG. 11 is a graph showing HLA restriction of cytotoxicity and peptide specificity due to inhibition and competition. Peptide-pulsed T2 cells were used for competition.
  • the EGFR-derived peptide of the present invention is a highly immunogenic peptide that induces both cellular and humoral immune responses.
  • the present inventors have reported that IgG that reacts with the CTL epitope peptide is often detected in pre-vaccinated cancer patients and serum of HD (Non-Patent Documents 10-12, 16). , 17).
  • some CTL-recognizing peptides can induce both cellular and humoral immunity in vivo in phase I clinical trials, and levels of anti-peptide IgG in sera after vaccination have progressed with peptide vaccination. This is in good agreement with the overall survival rate of cancer patients (Non-Patent Documents 11 and 12).
  • Non-Patent Documents 23, 24, 25 the peptide according to the present invention can be used as a cancer vaccine useful in treating EGFR-targeted cancer.
  • the peptide of the present invention is an HLA-A24 or HLA-A2-restricted peptide.
  • Specific examples of peptides that induce both cellular and humoral immune responses include EGFR (SEQ ID NO: 1), EGFR (SEQ ID NO: 2), EGFR (SEQ ID NO: 3), and EGFR
  • EGFR-derived peptides that induce specific cytotoxic T cells and have a specific antibody-producing ability can be easily determined and selected by a method according to the Examples of the present specification. You can choose. In terms of being able to induce an immune response, EGFR and EGFR are also
  • 43-51 943-952 is a potential peptide.
  • the present invention also includes a mutant peptide of the peptide having the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, which has the same CTL inducing ability and antibody producing ability. . Mutations can be introduced by deleting, substituting, adding, or inserting one or several amino acids to the EGFR-derived peptide of the present invention, and the means are well known in the art. Mutant peptides can be selected using the strength of recognition by CTL as an index. The number of amino acid residues of the mutant peptide is at least about 8 or more, preferably about 9 or more, and more preferably as long as it is a number that is presented on the antigen-presenting cell surface and has properties as a CTL recognition epitope. Is nine or ten.
  • the present invention further includes a polypeptide comprising the EGFR-derived peptide of the present invention or a mutant peptide thereof, which has specific CTL inducing ability and antibody-producing ability.
  • Polypeptides typically have a length of 8-50 amino acid residues, preferably 8-30, more preferably 9-10 or 8-10.
  • the EGFR-derived peptide included is EGFR (SEQ ID NO: 1),
  • EGFR (SEQ ID NO: 2), EGFR (SEQ ID NO: 3), EGFR (SEQ ID NO: 4) or
  • EGFR SEQ ID NO: 5
  • the peptides and polypeptides of the present invention can also be modified by modifying constituent amino acids or carboxyl groups to such an extent that the function is not significantly impaired.
  • the peptides and polypeptides of the present invention can be produced by a generally known method in peptidomiridism.
  • the nucleic acid molecule of the present invention includes single-stranded (including complementary) and double-stranded polynucleotides encoding the amino acid sequence of the EGFR-derived peptide of the present invention or a mutant peptide thereof and a polypeptide containing the peptide. .
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be DNA or RNA. Peptides having an amino acid sequence encoded by these nucleic acid molecules can be recognized by CTL, activate the CTL, and function as a tumor antigen.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be a polynucleotide having at least 24 or more basic strengths corresponding to the region encoding the peptide of the present invention and a complementary strand thereof.
  • a polynucleotide can be selected, for example, by confirming the expressed peptide using a known protein expression system.
  • the antibody of the present invention also specifies a peptide or polypeptide that has at least five consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of one peptide or polypeptide, which is also selected for the neutrality of the EGFR-derived peptide or polypeptide of the present invention. It is something to recognize.
  • the antibodies can be made using these epitope peptides, which are composed of at least 5, preferably at least 8-10 amino acids.
  • the invention also includes a peptide comprising at least five amino acid residues and a nucleic acid molecule encoding the same.
  • the amino acid sequence of the epitope may not be completely identical to the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 5, but it is necessary that at least a peptide consisting of the amino acid sequence is recognized by CTL. .
  • the antibody of the present invention can be used to immunize mice, rats, rabbits, goats, and the like, in the presence or absence of an adjuvant, alone or in the form of an epitope peptide derived from EGFR or a carrier bound thereto. , Can induce production.
  • the obtained polyclonal antibody can be recovered from serum by a known method.
  • monoclonal antibodies can be produced by fusing antibody-producing cells recovered from animals that have induced an immune response as described above with permanently proliferating cells. This method is well known in the art.
  • polyclonal and monoclonal antibodies can be used as purification antibodies, reagents, labeling markers, and the like.
  • the anti-EGFR peptide IgG which has not been shown in the present specification, has not shown direct inhibition of tumor cell growth in vitro when tested so far, and has antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against tumor cells. Also could not be induced. As such, the anti-EGFR peptide IgG may not act directly on tumor cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the EGFR-derived peptide or polypeptide of the present invention, a nucleic acid molecule encoding the same, a vector prepared based on the nucleotide sequence information of the nucleic acid molecule, or the antibody of the present invention, alone or in combination. It can be prepared by using in combination. Specifically, the EGFR-derived peptide of the present invention or a mutant thereof and a polypeptide containing the peptide can be used as a cancer vaccine.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a cancer vaccine in EGFR-based immunotherapy. It can be used to treat tumors, spleen cancer, etc.
  • EGFR-targeted cancer treatment refers to, for example, an antagonist of a ligand (in this case, EGF) or a signal transmitter (eg, since EGFR is a receptor for cell growth factor EGF) It is conceptually broad, including treatment with inhibitors of the body (including signal transduction).
  • EGF ligand
  • signal transmitter eg, since EGFR is a receptor for cell growth factor EGF
  • EGFR-based immunotherapy refers to a narrow concept when EGFR is an antibody or is a target molecule of T cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention even one kind of peptide is effective as a cancer vaccine, but it is preferable to use a combination of plural kinds of peptides. This is because the CTLs of cancer patients are a population of cells that recognize multiple different types of tumor antigens, so it is expected that using multiple types of tumor antigens in combination as a cancer vaccine will be more effective It is Kara.
  • a plurality of the peptides according to the present invention may be used in combination.
  • the peptide or polypeptide for the cancer vaccine of the present invention may be used alone or in combination with or bound to a pharmaceutically acceptable carrier in the presence or absence of a suitable adjuvant.
  • a pharmaceutically acceptable carrier in the presence or absence of a suitable adjuvant.
  • the carrier is not limited as long as it does not cause harmful effects on the human body.
  • cellulose, polymerized amino acids, albumin and the like can be used.
  • As the dosage form a dosage form known for peptide preparations can be selected.
  • the dose is 0.01-100 mg / day / adult human, preferably 0.1-10 mg / day / adult human, as the active substance which changes depending on the recognition by CTL. It is administered once every few days or months.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain a nucleic acid sequence encoding the peptide of the present invention incorporated in an appropriate vector, and is introduced in vivo or ex vivo.
  • the vector include a retrovirus, an adenovirus, a vaccinia virus and the like, and a retrovirus system is preferable.
  • the dose is 0.1 ⁇ g-100 mg / day / adult human, preferably 1 ⁇ g-50 mg / day / adult human, as the power DNA content that varies depending on the recognition by CTL. It is administered once every few days or months.
  • EGFR-reactive CTL are induced, for example, from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of NSCLC patients using the peptide of the present invention.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC of an NSCLC patient are incubated with antigen-presenting cells (APC) pulsed with the peptide of the present invention to induce CTL, and evaluated using IFN- ⁇ production as an index. Furthermore, the induced CTL activity can be confirmed by using 51 Cr-releasing assay using tumor cytotoxicity as an index.
  • APC antigen-presenting cells
  • This method can be used for adoptive immunotherapy, in which antigen-specific CTLs induced in vitro are returned to the patient and tumor cells are damaged.
  • Non-Patent Document 11 serum samples are serially diluted with 0.05% Tween 20-Block Ace (Snow Brand Milk Products, Hokkaido, Japan) and peptide (20 g / well) immobilized on Nunc Covalink plates (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) The diluted serum was cultivated at 100 1 / ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Peptidic antibodies were detected by heron anti-herb HgG (y chain specific) (DAKO, Glostrp, Denmark).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the sera obtained from HD10 (HIV negative) sera were used to measure the reactivity to HIV peptide by the assay. Since the average SD of the absorbance (A) was 0.020 ⁇ 0.02, the average + SD value (0.04) was defined as the cutoff value.
  • FIG. 2 shows representative results of three NSCLC patients (Pt. 2, 3, and 10) and three HDs (HD. 2, 4, and 10).
  • the A value for the HIV control, a negative control, is subtracted from the data.
  • Table 1 summarizes the results for 11 peptides for which some sera gave a positive response.
  • IgG reacting with EGFR, EGFR and EGFR peptide are 8, 7,
  • EGFR EGFR and significant levels of IgG responsive to EGFR were shown.
  • EGFR EGFR
  • EGFR EGFR
  • EGFR EGFR
  • EGFR EGFR
  • EGFR EGFR
  • EGFR EGFR
  • the peptide specificity of the tide IgG was confirmed by an absorption test.
  • FIG. 3A Representative results for sera of Pt. 3, 8, 10, and 13 are shown in FIG. 3A.
  • the activity of these sera in response to each of the three peptides was absorbed by the corresponding peptide, but not by the HIV peptide used as a negative control (FIG. 3A).
  • IFN-y production was examined using NBCLC cancer patients and HD PMBC as an index.
  • IFN- ⁇ was measured by ELISA. Data power was also subtracted from background IFN- ⁇ production for HIV peptide (about 50 pg / ml). As a control for their CTL inducing ability, two peptides (EGFR and EGFR) for which no IgG response was detected were similarly tested.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • EGFR, EGFR and EGFR peptide can induce cytotoxic T cells
  • the cytotoxicity of peptide-stimulated PBMC was evaluated by 51 Cr release assay for 6 hours to confirm CTL induction.
  • Non-patent Document 13 an immunofluorescence-labeled anti-EGFR monoclonal antibody (mAb) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). A431 tumor cells and phytohematologica (PHA) immature T cells were used as positive and negative controls, respectively.
  • Figure 1 shows representative results of the histogram.
  • tumor cell lines were used as target cells in the 51 Cr-releasing Atsey: 11-18 (HLA-A24 / 2, human lung adenocarcinoma, EGFR "), QG56 (HLA-A26, Lung squamous cell carcinoma (SCC), EGFR +), Sq-1 (HLA-A24 / ll, lung SCC, EGFR *), LC65A (HLA-A24 / ll, non-small cell lung cancer, EGFR "), SKOV3 (HLA- A3 / 28, ovarian cancer, EGFR "), and SKOV3-A24 (HLA-A-24-transformed SKOV3).
  • PHA blast-transformed T cells from PMBC were used as a negative control for target cells for 51 Cr-releasing Atsusei. (Non-Patent Document 12).
  • FIG. Values represent mean SD of specific lysis (%).
  • Peptide-stimulated PBMCs are used in all 11-18 NSCLC cells (HLA-A24 +, EGFR "), LC65A non-small cell lung cancer cells (HLA-A24 +, EGFR +), and SKOV3-A24 (HLA-A24 +, EGFR”) tumor cells
  • HLA-A24—, EGFR + a significant level of cytotoxicity QG56 NSCLC cells tested (HLA-A24—, EGFR +), Sq-1 NSCLC cells
  • HLA-A24 +, EGFR * HLA-A24 +, EGFR *
  • SKOV3 HLA-A24 ", EGFR + tumor cells.
  • These PMBCs also failed to kill PHA immature T cells (HLA-A24 +, EGFR-).
  • HIV peptide-stimulated PBMC used as a negative control showed no such HLA-A24-restricted cell injury (Fig. 5, bottom of left column). It has HLA-A24-restricted cytotoxicity in response to tumor cells.
  • Inhibition experiments included anti-HLA class I (W6 / 32, IgG2a), anti-HLA class II (H-DR-1, IgG2a), anti-CD8 (Nu-Ts / c, IgG2a), anti-CD4 (Nu-Th / i, IgGl) and anti-CD14 (JML-H14, IgG2a) (negative control) monoclonal antibody (20 ⁇ g / ml).
  • a competitive assay to study the peptide specificity of cytotoxicity unlabeled C1R-A2402 cells pulsed with the corresponding peptide or HIV peptide (negative control) were used for non-radioactive and radioactive target cells. At a ratio of 10: 1, the mixture was produced into 51 Cr-releasing Atsushi. Values are expressed as mean SD of specific lysis (%), and two-tailed Student's t test was used for statistical analysis.
  • the level of cytotoxicity of these peptide-stimulated PBMCs was not inhibited by any of the other monoclonal antibodies tested in this assay, which were significantly inhibited by anti-class I antibodies (W6 / 32) or anti-CD8 monoclonal antibodies.
  • the cytotoxicity was also inhibited by the addition of the corresponding peptide pulse C1R-A2402 cells.
  • the cytotoxicity was not inhibited by the addition of HIV peptide pulse cells (Fig. 6).
  • EGFR and EGFR were identified as EGFR-derived peptides that induce a humoral immune response and an HLA-A2-restricted cellular immune response in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • Anti-Bubble threat 2. ) 13 4 2 1 10 " 2 n
  • Non-Patent Documents 6-9) 124-132 54-62 479-488 1138-1147 Induces both immune and cellular immune responses, resulting in higher immunogenicity compared to the known HER2 / neu-derived CTL epitope peptide. It is suggested that they have (Non-Patent Documents 6-9).
  • NSCLC patients who respond to the tyrosine kinase inhibitor ZD1839 are only a fraction of the forces There are currently no laboratory markers suitable for predicting their clinical response. Since findings suggesting that there is a correlation between the level of the immune response to the EGFR peptide of the present invention and the clinical response to ZD1839 have been obtained, it would be more useful if the response to ZD1839 could be predicted by the EGFR-derived peptide of the present invention. (Non-Patent Documents 4, 5).
  • HLA-A24aryl which is suggested to be restricted by the EGFR peptide of the present invention, accounts for 60% of Japanese (95% of these cases have the A2402 genotype), 20% of Caucasians, and Africans. 12% of non-patent literature 18). HLA-A2 aril is found in 40% of Japanese, 50% of Caucasians, and 16% of Africans.
  • the EGFR peptides of the present invention may provide new insights into the development of EGFR-based immunotherapy that will help a large number of NSCLC patients worldwide.

Abstract

　EGFR基盤癌免疫療法に利用可能なEGFR由来ペプチドを提供すること。 　本発明は、細胞性および液性免疫応答の両方を誘導できるEGFR由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよび該ペプチドを含むポリペプチド、それらをコードする核酸分子、ならびにそれらを含有する医薬組成物に関する。

Description

明 細 書
上皮細胞増殖因子受容体 (EGFR)由来ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 EGFR基盤癌免疫療法に利用可能な EGFR由来ペプチドに関する。詳 細には、細胞性および液性免疫応答の両方を誘導できる EGFR由来ペプチドを含む ポリペプチドおよび該ペプチドを含む癌ワクチン等に関する。
背景技術
[0002] 上皮細胞増殖因子受容体 (EGFR)は、上皮細胞生物学および多くのヒト悪性腫瘍 において重要な役割を果たす (非特許文献 1-3)。 EGFRは、 EGFRの他、 HER2、 HER3および HER4が含まれる 4種のきわめてよく似たタンパク質で構成される受容体 ファミリーの一部である。このファミリーのタンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン、 膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメイン力もなる（非特許文献 20)。上 皮細胞増殖因子 (EGF)などのリガンドが結合することにより細胞内ドメインのチロシン キナーゼが活性化され、受容体の自己リン酸ィ匕を引き起こし、細胞増殖および生存 に関与する情報伝達カスケードが作動する（非特許文献 20)。 EGFRの活性ィ匕は、細 胞増殖、アポトーシスの阻害、血管新生および転移を含む腫瘍増殖と進行に必要な 過程にかかわつている（非特許文献 19)。 EGFRはすべての上皮性癌の約三分の一 で比較的発現が高ぐ腫瘍の増悪化と相関していることから、癌治療に最も適した標 的分子の一つである（非特許文献 21、 22)。
[0003] EGFR標的治療としては、細胞外リガンド結合部位に対するモノクローナル抗体や、 細胞内チロシンキナーゼドメインに対する阻害剤が集中的に研究されている。それら の中で、新規な EGFRチロシンキナーゼ阻害剤 ZD1839が、進行した非小細胞肺癌（ NSCLC)の患者の治療に有効であることが知られて 、る（非特許文献 4、 5)。
[0004] 一方、生体には出現した腫瘍細胞を排除する免疫機構が存在し、細胞傷害性 T細 胞 (CTL)がその中心的役割を果たすと考えられている。 CTLは、主要組織適合遺伝 子複合体 (ヒトにおいては HLA)により腫瘍細胞上に提示された抗原を特異的に認識 し、その細胞を傷害する。このような腫瘍細胞に対する免疫機構を利用して、腫瘍抗 原のェピトープペプチドで生体を免疫し腫瘍細胞の傷害を促進することを目的とした ワクチン治療が試みられて 、る。
[0005] EGFRの受容体ファミリーの一つである HER2/neuのェピトープペプチドが HLAクラ ス I拘束性 CTLを誘導できることが過去 10年間で報告された (非特許文献 6-9)。本発 明者らは臨床研究において、非変異増殖関連タンパク質に由来するいくつかの CTL 認識ペプチドが、 in vivoで細胞性および液性免疫応答の両方を誘導する能力がある ことを報告した (非特許文献 10-12)。さらに、ワクチン後の血清における抗ペプチド 抗体のレベルは、ペプチドワクチン接種をうけた進行した肺癌患者の全体的生存率 とよく一致することが見いだされている (非特許文献 12)。カロえて、細胞性および液性 免疫応答の両方を誘導できるペプチドは免疫原性がより高いことを示唆する一連の 証拠があり（非特許文献 13-15)、より強い治療活性が期待できる。
[0006] 細胞傷害性 T細胞 (CTL)認識ェピトープは、 EGFR標的治療にぉ 、てそれを過剰 発現する腫瘍を有する癌患者に対するペプチドワクチンとして、既存の化合物とは異 なる治療上有用な化合物になりうる。し力しながら現在のところ、 EGFRの CTL認識ェ ピトープに関する情報はない。
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、 EGFR基盤癌治療開発の観点から、癌ワクチンの候補となるペプチドを 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 液性免疫応答を誘導する EGFR由来ペプチドを同定するため、 NSCLC患者および 健常ドナー（HD)血清中に特異的抗体が存在する EGFR由来ペプチドについて検討 した。これらのペプチドが EGFR特異的に腫瘍細胞を傷害する細胞傷害性 T細胞を誘 導できたことにより、本発明を完成した。
[0010] 即ち、本発明は、
(1)特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生能を有する EGFR 由来ペプチドまたはその変異ペプチド、好ましくは HLA-A24あるいは HLA-A2拘束 性であるペプチド、
(2) EGFR由来ペプチド力 EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR および
800-809 124-132 54-62 479-488
EGFR の中力 選ばれる 1つのペプチドのアミノ酸配列中、連続する少なくとも 8
1138-1147
個のアミノ酸残基力もなる、（1)記載のペプチド、
(3)特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生能を有する、 (1) または（2)記載のペプチドを含むアミノ酸残基数 8から 50個のポリペプチド、
(4) (1)または（2)記載のペプチドまたはそれを含むポリペプチドをコードする核酸分 子、
(5) (4)記載の核酸分子を含有するベクター、
[0011] (6) (1)または（2)記載のペプチド、 (3)記載のポリペプチドまたは (4)記載の核酸分 子を含む、特異的な細胞傷害性 τ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生するための 医薬組成物、
(7)癌ワクチンである、（6)記載の医薬組成物、
(8) (1)または（2)記載のペプチドまたは（3)記載のポリペプチドと HLAの複合体を 認識する EGFR反応性細胞傷害性 T細胞、
(9) (1)または（2)記載のペプチドまたは（3)記載のポリペプチドを用い、 EGFR反応 性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法、および
(10) (1)または（2)記載のペプチドまたは（3)記載のポリペプチドを特異的に認識 する抗体、
に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]フローサイトメトリーアツセィによる腫瘍細胞における EGFR発現の代表的ヒストグ ラム。点線は二次抗体 (FITC結合制御抗体)のみ、黒線は抗 EGFRモノクローナル抗 体 +二次抗体を意味する。
[図 2]血清試料中の抗ペプチド IgGの検出結果を示すグラフ。
[図 3A]血清試料中の抗ペプチド IgGのペプチド特異性の検討結果を示すグラフ。
[図 3B]全長 EGFRタンパク質に対する抗ペプチド IgGの交差反応の検討結果を示す グラフ。
[図 4]EGFR由来ペプチドによる CTL誘導を示すグラフ。 * Pく 0.05 (スチューデント t検 定)。
[図 5]癌細胞株に対するペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を示すグラフ。 * Pく 0.05 ( 両側スチューデント t検定)。
[図 6]阻害および競合アツセィによる、細胞傷害性の HLA拘束性およびペプチド特異 性を示すグラフ。
[図 7]血清試料中の抗ペプチド IgGの検出結果を示すグラフ。
[図 8]抗ペプチド IgGのペプチド特異性の検討結果を示すグラフ。
[図 9]EGFR由来ペプチドによる CTL誘導を示すグラフ。 HLA-A2+癌患者の PBMCを ペプチドで刺激し、対応ペプチドでパルスした T2細胞（HLA-A2、 T-Bハイプリドーマ )に対する IFN- γ産生を測定した。 * Pく 0.05 (スチューデント t検定)。
[図 10]癌細胞株に対するペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を示すグラフ。癌細胞株 として、 SKOV3- A2(HLA- A2+、 EGFR")および SKOV3 (HLA- A2—、 EGFR+)を使用した 。 * P< 0.05 (両側スチューデント t検定)。
[図 11]阻害および競合アツセィによる、細胞傷害性の HLA拘束性およびペプチド特 異性を示すグラフ。競合アツセィには、ペプチドパルス T2細胞を使用した。
発明を実施するための最良の形態
ペプチドおよびポリペプチド
本発明の EGFR由来ペプチドは、細胞性および液性免応答の両者を誘導する免疫 原性の高いペプチドである。本発明者らは、 CTLェピトープペプチドに対して反応す る IgGが、しばしばワクチン接種前の癌患者および HDの血清で検出されることを報告 している（非特許文献 10- 12、 16、 17)。さらに、いくつかの CTL認識ペプチドが第 I 相臨床試験で in vivoにおける細胞性および液性免疫の両方を誘導でき、ワクチン接 種後の血清における抗ペプチド IgGのレベルはペプチドワクチン接種を受けた進行 癌患者の全体的生存率とよく一致している（非特許文献 11、 12)。また、 EGFRを標 的とした癌治療の臨床試験は数多く行われているが、それらにおいて見られるざ瘡 様発疹や下痢のような有害事象は (非特許文献 23、 24、 25)、発明者らが現在行つ て 、る EGFR由来ペプチドワクチン治療の第 I相臨床試験にお 、ては観察されて!、な い。以上より、本発明に係るペプチドは EGFR標的癌治療において有用な癌ワクチン として利用可能である。
好ましくは、本発明のペプチドは HLA-A24あるいは HLA-A2拘束性のペプチドであ る。細胞性および液性免応答の両者を誘導するペプチドとして具体的には、 EGFR (配列番号： 1)、 EGFR (配列番号： 2)、 EGFR (配列番号： 3)、 EGFR
800-809 124-132 54-62
(配列番号： 4)または EGFR (配列番号： 5)を挙げることができる。 EGFRの
479-488 1138-1147
全アミノ酸配列は、受託番号 CAA25240として GeneBankに登録されている（配列番号 : 6)。
特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生能を有する他の EGFR由来ペプチドは、本明細書の実施例に準じた方法により容易に決定および選 択できる。免疫応答を誘導できるという観点から、 EGFR および EGFR もまた
43-51 943-952 可能性あるペプチドである。
[0014] また、本発明は、上記配列番号： 1ないし 5のいずれか記載のアミノ酸配列を有する ペプチドの変異ペプチドであって、同等の CTL誘導能と抗体産生能を有する変異べ プチドも包含する。変異は、本発明の EGFR由来ペプチドに対して一個または数個の アミノ酸の欠失、置換、付加、挿入などを行うことにより導入することができ、その手段 は当業界にて周知である。変異ペプチドは CTLによる認識の強さを指標として選択 できる。変異ペプチドのアミノ酸残基数は、抗原提示細胞表面上に提示され、かつ CTL認識ェピトープとしての性質を有する数であればよぐ少なくとも約 8個以上、好 ましくは約 9個以上、さらに好ましくは 9個ないし 10個である。
[0015] 本発明はさらに、特異的 CTL誘導能および抗体産生能を有する、本発明の EGFR 由来ペプチドまたはその変異ペプチドを含むポリペプチドを包含する。ポリペプチド は、通常アミノ酸残基数 8-50個の長さであり、好ましくは 8-30個、より好ましくは 9-10 または 8-10個である。含まれる EGFR由来ペプチドは EGFR (配列番号： 1)、
800-809
EGFR (配列番号： 2)、 EGFR (配列番号： 3)、 EGFR (配列番号： 4)また
124-132 54-62 479-488
は EGFR (配列番号： 5)が特に好ま U、。
1138-1147
[0016] また、機能を著しく障害しない程度に構成アミノ酸またはカルボキシル基などを修飾 して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを改変することもできる。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチドィ匕学における一般的な公知方 法により製造できる。
[0017] 核酸分子
本発明の核酸分子は、本発明の EGFR由来ペプチドまたはその変異ペプチドおよ び該ペプチドを含むポリペプチドの、アミノ酸配列をコードする一本鎖 (相補鎖を含む )および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子は DNAであっても RNAで あってもよい。これら核酸分子がコードするアミノ酸配列を有するペプチドは、 CTLに より認識され、該 CTLを活性ィ匕することができ、腫瘍抗原として機能し得る。
また、本発明の核酸分子は、本発明のペプチドをコードする領域に対応する少なく とも 24個以上の塩基力もなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖であってよ 、。このよ うなポリヌクレオチドは、例えば公知のタンパク質発現系を利用して発現ペプチドを確 認すること〖こより選択できる。 本発明の抗体は、本発明の EGFR由来ペプチドまたはポリペプチドの中力も選ばれ る 1つのペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列中、少なくとも連続する 5個のアミノ 酸残基力もなるペプチドまたはポリペプチドを特異的に認識するものである。該抗体 はそれらのェピトープペプチドを使用して作製でき、そのェピトープペプチドは少なく とも 5個、好ましくは少なくとも 8-10個のアミノ酸で構成される。本発明は、この少なくと も 5個のアミノ酸残基力 なるペプチドおよびそれをコードする核酸分子も包含する。 ェピトープのアミノ酸配列は、配列番号： 1ないし 5のいずれか記載のアミノ酸配列と 完全に同一でなくてもよいが、少なくとも本アミノ酸配列からなるペプチドが CTLによ つて認識されることが必要である。
本発明の抗体は、 EGFRおよびその由来物のェピトープペプチドを単独で、または 担体と結合した形で、アジュバントの存在または非存在下に例えばマウス、ラット、ゥ サギ、ャギ等に免疫し、産生を誘導することができる。得られたポリクローナル抗体は 、公知の方法により血清から回収することができる。
一方、モノクローナル抗体は、上記のように免疫応答を誘導した動物から回収した 抗体産生細胞を、永久増殖性細胞と融合することで生産できる。本方法は当業界に おいて周知である。
これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標 識マーカー等として利用することができる。また本明細書にはデータを示していない 力 抗 EGFRペプチド IgGは、これまでに試験した限りでは、 in vitroにおける直接的腫 瘍細胞増殖阻害を示さず、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞仲介細胞傷害も誘導 できなかった。それゆれ、抗 EGFRペプチド IgGは、腫瘍細胞に対して直接は作用し ない可能性がある。し力しながら、前立腺摘出術に先立ってペプチドワクチン接種プ ログラムを開始した前立腺癌患者の手術 (前立腺全摘出術)時に、腫瘍周辺で炎症 反応が観察されること、およびワクチン接種後手術前の血清中で抗ペプチド IgGレべ ルが増加していることから (Noguchi et al.、未発表データ)、これらの抗ペプチド IgGは 、腫瘍部位周辺における炎症反応を誘導することにより免疫担当細胞の腫瘍部位へ の浸潤を促進するのカゝもしれない。従って、本発明抗体は、抗腫瘍活性を補助する 機能を有する可能性があると想像される。さらには、 CTLェピトープペプチドに反応 する IgGは、アトピー性疾患患者の血清中には存在しないか、または不均一である（ 非特許文献 17)。癌患者における抗腫瘍免疫応答の発生機序は現在のところ明らか でないが、これらの結果は、 CTLペプチドに対する IgGが種々の疾患に対する宿主防 御に関与して 、る可能性を示唆して 、る。
0019] .m
本発明の医薬組成物は、本発明の EGFR由来ペプチドまたはポリペプチド、これら をコードする核酸分子、該核酸分子の塩基配列情報に基づき作製したベクター、ま たは本発明の抗体を、単独または複数組み合わせて利用することにより調製できる。 具体的には、本発明の EGFR由来ペプチドまたはその変異体および該ペプチドを 含むポリペプチドは、癌ワクチンとして使用することができる。
本発明医薬組成物は EGFR基盤免疫療法において癌ワクチンとして有用であり、具 体的には、上皮性癌、例えば非小細胞肺癌、卵巣がん、前立腺癌、乳癌、胃癌、 GIST腫瘍 (gastrointestinal stromal tumors),脾臓がんなどを処置するために使用で きる。本明細書において、「EGFR標的癌治療」とは、抗体だけでなぐ例えばリガンド (この場合は EGF)のアンタゴニストやシグナル伝達物質（EGFRが細胞増殖因子 EGF の受容体であるため、受容体あるいは受容体を介したシグナル伝達も含む）の阻害 剤などによる治療も含まれ、概念的に広い。それに対して、「EGFR基盤免疫療法」と は、 EGFRが抗体ある 、は T細胞の標的分子である場合の狭 、概念を意味する。 本発明の医薬組成物では、一種類のペプチドでも癌ワクチンとして有効であるが、 複数種類のペプチドを組み合わせて使用するのが好ましい。これは、癌患者の CTL が複数の異なる種類の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、複数種類の 腫瘍抗原を組み合わせて癌ワクチンとして使用する方がより効果的であると期待され るカゝらである。本発明に係るペプチドを複数種類組み合わせて使用してもよい。
[0020] 本発明の癌ワクチンのためのペプチドまたはポリペプチドは、適当なアジュバントの 存在または非存在下で、単独で、または製薬的に許容される担体と混合または結合 して使用することができる。担体は、人体に有害な作用を起こさない限り限定されるも のではなぐ例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。剤形は、 ペプチド製剤について周知の剤形が選択可能である。投与量は、 CTLによる認識性 により変化する力 活性本体として 0.01-100mg/日/成人ヒト、好ましくは 0.1-10mg/日 /成人ヒトである。これを数日ないし数ケ月に一回投与する。
[0021] 本発明の医薬組成物はまた、本発明に係るペプチドをコードする核酸配列を適当 なベクターに組み込んだものを含有することができ、それを、 in vivoまたは ex vivoで 導入する。ベクターとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウィル ス等が挙げられるが、レトロウイルス系が好ましい。投与量は、 CTLによる認識性によ り変化する力 DNA含量として 0.1 μ g- lOOmg/日/成人ヒト、好ましくは 1 μ g- 50mg/日 /成人ヒトである。これを数日ないし数ケ月に一回投与する。
[0022] CTLの誘導方法
EGFR反応性 CTLは、例えば NSCLC患者の末梢血単核球（PBMC)から本発明に 係るペプチドを用いて誘導する。
つまり、本発明のペプチドでパルスした抗原提示細胞 (APC)とともに NSCLC患者の PBMCをインキュベートして CTLを誘導し、 IFN- γ産生を指標として評価する。さらに 、誘導された CTLの活性は、 51Cr放出アツセィにより腫瘍細胞傷害性を指標として確 認できる。
本方法は、 in vitroで誘導した抗原特異的 CTLを患者体内に戻し腫瘍細胞を傷害 する、養子免疫療法に利用できる。
[0023] 以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によ つて 、かなる意味にぉ 、ても制限されるものではな!/、。
実施例
[0024] 実施例 1
, ' する RGFRfe ペプチド、
A. 液性免疫応答誘導能による同定
非小細胞肺癌 (NSCLC)患者 13人および健常ドナー（HD) 11人の血清中に、 EGFR 由来ペプチドに反応する免疫グロブリン G (IgG)が検出できるかについて調べた。 以下の 18種類の EGFR由来ペプチド（HLA-A24結合モチーフ含有）を、 BioSynthesis (Lewisville, TX)から購入した。それぞれ EGFRの、 43-51、 54-62、 68-76 、 73-82、 111-119、 124-132、 269-277、 625-633、 722-730、 800-809、 812-821、 899-907、 899-908、 943-952、 960-969、 1015-1023、 1015-1024、および 1068- 1077 の位置に相当する。陰性対照として、 HLA-A24結合モチーフ (RYLRDQQLLGI)を有 する HIVペプチドもまた用意した。
[0025] 久留米大学病院において、インフォームドコンセントを文書で得た NSCLC患者およ び HDから血清および PBMCを採取し、使用するまでそれぞれ- 80°Cおよび- 196°Cで 凍結保存した。被験者はすべて HIVには感染していな力つた。以前に報告したように 、 PBMC上の HLAクラス I抗原の発現を常套的方法により血清学的に測定した (非特 許文献 10)。
以前に報告したように、酵素免疫測定法 (ELISA)により血清中のペプチド特異的 IgGレベルを測定した（非特許文献 11)。端的に言えば、 0.05%Tween20-Block Ace ( 雪印乳業、北海道、日本)で血清試料を段階的に希釈し、ペプチド (20 g/ゥエル） 固相化 Nunc Covalinkプレート (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)に希釈済血清を 100 1/ゥエルでカ卩えた。ゥサギ抗ヒ HgG ( y鎖特異的） (DAKO, Glostrp, Denmark)により ペプチド抗体を検出した。 ELISA感受性限界を測定するため、 HD10人 (HIV陰性)か ら得た血清の HIVペプチドに対する反応性を該アツセィにより測定した。吸光度 (A)の 平均士 SDは 0.020 ±0.02であったので、平均 +SD値（0.04)をカットオフ値と定めた。
[0026] 図 2に、 NSCLC患者 3人（Pt.2、 3、および 10)および HD3人（HD.2、 4、および 10)の 代表的結果を示す。陰性対照である HIVペプチドに対する A値をデータ力 差し引い てある。
表 1に何人かの血清が陽性応答を示した 11種類のペプチドについての結果のまと めを示す。
[0027] [表 1] MM
, ΰ 1
o o o
Figure imgf000015_0001
A2/24
A2/11
A224 0.
Figure imgf000015_0002
o
[0028] EGFR 、 EGFR および EGFR ペプチドに反応する IgGは、それぞれ 8、 7、
800-809 124-132 54-62
および 6人の患者の血清にぉ 、て有意なレベル (血清 100倍希釈で A値 > 0.04)で検 出された。被検 HD11人中、 9、 5、および 3人からの血清もまた、それぞれ EGFR 、
800-809
EGFR および EGFR に反応する有意なレベルの IgGを示した。 EGFR 、
124-132 54-62 899-908
EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、および
1015-1023 269-277 899-907 812-821 625-633 73-82
EGFR ペプチドに反応する IgG力 1人または 2人の癌患者および数人の HDか
1015-1023
ら得た血清にぉ 、て有意なレベルで検出された。 EGFRは上皮癌細胞だけでなく一 定の正常上皮細胞においても発現しているので、癌患者および HDの両者における EGFRペプチドに対する免疫応答に驚くことはない (非特許文献 1-3)。被験者の大 部分は HLA-24陽性であった力 これらの EGFRペプチドに対する液性応答は、 HLA-A24陽性および陰性被験者の両者において観察された。それに対して、残り 7 ペプチドに反応する IgGは、被験血清の 、ずれにぉ 、ても有意なレベルでは検出さ れなかった (データ非提示)。
以上の結果は、 18種類の合成ペプチドのうち EGFR 、 EGFR および EGFR
800-809 124-132
54-62ペプチドが、本発明が目的とする免疫応答誘導により適していることを示唆する。
[0029] B. 抗ペプチド抗体のペプチド特異性の評価
EGFR 、 EGFR および EGFR ペプチドについて、血清試料中の抗ぺプ
800-809 124-132 54-62
チド IgGのペプチド特異性を吸収試験により確認した。
プレートウエル中の固定化ペプチド (20 μ g/ゥエル)で、血清試料 100 μ 1/ゥエル
(0.05% PBSで 100倍希釈)を 37°Cで 2時間吸収した。吸収とその後の ELISAによる抗ぺ プチド IgGの試験は三回繰り返した。
Pt.3、 8、 10、および 13の血清の代表的結果を図 3Aに示す。三つのペプチド各々に 反応するこれらの血清の活性は対応するペプチドで吸収されたが、陰性対照として 使用した HIVペプチドでは吸収されな力つた（図 3A)。
抗ペプチド IgGが全長 EGFRタンパク質に反応するかについて調べるため、抗ぺプ チド活性を有する患者の血清を固相化 EGFR (ヒト A431細胞より単離、純度 85%) ( Upstate, Charlottesville, USA)または固相化ヒトアルブミン（陰性対照）で吸収し、そ の後、ペプチド特異的 IgG活性を ELISAにより測定した。 Pt.3および Pt.12の血清から 得られた代表的結果を図 3Bに示す。これら三つのペプチドの 、ずれかに反応するぺ プチド IgGのレベルは本吸収試験によって全く減少しなかった（図 3B)。このことは、 抗ペプチド IgGは全長 EGFRタンパク質に対する交差反応性がな 、ことを示して 、る。 以上の結果より、本発明の EGFR EGFR および EGFR ペプチドが、ぺ
800-809 124-132 54-62
プチド特異的な液性免疫応答を誘導できることが示された。
[0030] 実施例 2
EGFR由来ペプチドによる CTL誘導
A. IFN- γ産生
EGFR , EGFR および EGFR ペプチドの CTL誘導能を、 HLA- A24+
800-809 124-132 54-62
NSCLC癌患者および HDの PMBCを用いて IFN- y産生を指標として試験した。
ペプチド特異的 CTLを誘導するため、以前の報告のように、 96ウェルマイク口培養 プレート (Nunc, Roskilde, Denmark)の四つのゥエルで、 IL- 2含有培養培地 200 1中、 PBMC (15xl04 cells/ml)を各ペプチド 10 μ Μとインキュベートした。ペプチド導入のた め C1R-A2402 (HLA-2402形質転換細胞株)細胞株を使用した (非特許文献 12) 14 日目に各ゥエルカゝら細胞を別個に回収し、洗浄した。これら細胞をそれぞれ 4等分し 、そのうち 2つを対応するペプチドで、残りの 2つを陰性対照ペプチド (HIV)でデュプ リケートでパルスした C1R-A2402と 18時間インキュベートした後、上清を回収して ELISAにより IFN- γを測定した。 HIVペプチドに対するバックグラウンド IFN- γ産生（ く 50pg/ml)をデータ力も差し引いた。それらの CTL誘導能の対照として、 IgG応答が 検出できなかった二つのペプチド（EGFR および EGFR )についても同様に試
43-51 943-952
験した。
[0031] 4人の患者（Pt.l 11 13、および HD11)の代表的結果を図 4に示す (4ゥ ルそれ ぞれから得られた結果を示して!/、る）。
すべての被験者のまとめは表 2に示す。ペプチド特異的 CTLの誘導に成功したゥェ ルは、ゥエル上清中の IFN- γ産生が 100pg/ml (p-値 <少なくとも 0. 05)を超える場 合に陽性として判断した。試験した 4ゥエル中の、陽性ゥエルの IFN- γ量の平均値を
3¾ zj ^し/こ。
[0032] [表 2] s¾v
τs oォ
Figure imgf000018_0001
EGFR 、 EGFR およひEGFR ペプチドは、被験癌患者 8人中それぞれ 5、
800-809 54-62 124-132
5、および 4人において、被験 4ゥェルのうち少なくとも一つの PMBC.を刺激し、統計学 的に有意な量の IFN- 0/ (p値く 0.05、および IFN- y >100pg/ml)を、対応ペプチドで パルスした C1R-A2402細胞に対して産生させた。これらのペプチドは、被験 HD5人 中 3、 4、および 4人においてもまた、有意なレベルの IFN- yを産生するよう刺激を与 えた。 IgG応答が検出されなかった EGFR および EGFR もまた被験癌患者 8人
差替え用紙（規則 2 中それぞれ 2人にお!、て PBMCを刺激し、対応するペプチドでパルスした C1R-A2402 に対して有意なレベルの IFN- γを産生させた（表 2)。 EGFR および EGFR は
43-51 943-952
、被験 HD5人中それぞれ 1および 0人にお!、て PBMCを刺激した。
以上より、 EGFR , EGFR および EGFR ペプチドが細胞傷害性 T細胞を
800-809 124-132 54-62
誘導できることが示された。
[0034] Β. 腫瘍細胞傷害
ペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性を 6時間51 Cr放出アツセィにより評価し、 CTL誘 導を確認した。
免疫蛍光標識抗 EGFRモノクローナル抗体（mAb)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いたフローサイトメトリーアツセィ (非特許文献 13)により腫瘍細胞株 における EGFRの発現を検討した。陽性および陰性対照として、それぞれ A431腫瘍 細胞およびフイトへマダルチュン (PHA)幼若化 T細胞を使用した。ヒストグラムの代表 的結果を図 1に示す。これらの結果に基づき、 51Cr放出アツセィにおける標的細胞と して以下の腫瘍細胞株を使用した： 11-18 (HLA-A24/2,ヒト肺腺癌、 EGFR")、 QG56 (HLA - A26、肺扁平上皮細胞癌く SCC〉、 EGFR+)、 Sq- 1 (HLA - A24/ll、肺 SCC、 EGFR*)、 LC65A (HLA - A24/ll、非小細胞肺癌、 EGFR")、 SKOV3 (HLA - A3/28、 卵巣癌、 EGFR"),および SKOV3- A24 (HLA- A- 24形質転換 SKOV3)。 51Cr放出アツ セィの標的細胞の陰性対照として PMBCからの PHA幼若化 T細胞を使用した (非特許 文献 12)。
[0035] 上記 Αの評価にお!、て対応するペプチドに対し IFN- yを産生したゥヱル中の細胞 を回収し、さらに IL-2単独で 10日から 14日間培養して51 Cr放出アツセィのための多数 の細胞を得た。三つの E/T (エフェクター細胞/標的細胞)比で標準的 6時間51 Cr放 出アツセィを行った。この方法は以前報告している（非特許文献 12)。両側スチュー デント t検定を用いて、統計学的解析を行った。
4人の患者 (Pt.l、 2、 3、および 13)の代表的結果を図 5に示す。値は特異的溶解（ %)の平均士 SDを表す。ペプチド刺激 PBMCは、 11-18 NSCLC細胞 (HLA- A24+, EGFR"), LC65A非小細胞肺癌細胞（HLA- A24+, EGFR+)、および SKOV3- A24 (HLA-A24+, EGFR")腫瘍細胞のすべてに対して有意なレベルの細胞傷害性を示し た力 試験した QG56 NSCLC細胞 (HLA- A24— , EGFR+)、 Sq- 1 NSCLC細胞
(HLA- A24+, EGFR*),または SKOV3 (HLA-A24", EGFR+)腫瘍細胞のいずれも殺せ なかった。これら PMBCはまた、 PHA幼若化 T細胞（HLA-A24+, EGFR— )を殺せなかつ た。陰性対照として用いた HIVペプチド刺激 PBMCは、このような HLA-A24拘束性細 胞傷害を示さな力つた（図 5、左カラム一番下)。これらの結果は、これら PBMCが、 EGFR+腫瘍細胞に反応する HLA-A24拘束性細胞傷害性を有することを示している。
[0036] 細胞傷害性の拘束性およびペプチド特異性をさらに、それぞれ阻害および競合ァ ッセィにより確認した。
阻害実験には、抗 HLAクラス I (W6/32, IgG2a)、抗 HLAクラス II (H- DR-1, IgG2a)、 抗 CD8 (Nu-Ts/c, IgG2a)、抗 CD4 (Nu— Th/i, IgGl)、および抗 CD14 (JML— H14, IgG2a) (陰性対照）モノクローナル抗体 (20 μ g/ml)を使用した。細胞傷害性のぺプチ ド特異性を研究する競合アツセィにお ヽては、対応するペプチドまたは HIVペプチド (陰性対照)でパルスした非標識 C1R-A2402細胞を、非放射性標的細胞と放射性標 的細胞比 10対 1で51 Cr放出アツセィにカ卩えた。値は特異的溶解（％)の平均士 SDで 表し、統計学的解析には両側スチューデント t検定を用いた。
これらペプチド刺激 PBMCの細胞傷害性のレベルは、抗クラス I抗体 (W6/32)また は抗 CD8モノクローナル抗体により有意に阻害された力 本アツセィで試験した他の モノクローナル抗体によっては阻害されなかった。対応ペプチドパルス C1R-A2402細 胞の添カ卩によっても細胞傷害性は阻害された力 HIVペプチドパルス細胞の添加に よっては阻害されなかった（図 6)。
これらの結果は、 EGFR 、EGFR および EGFR ペプチドが主として HLAク
800-809 124-132 54-62
ラス I拘束性にペプチド反応性 CD8+T細胞を活性ィ匕することを示唆している。
[0037] 実施例 3
実施例 1および 2と同様にして、液性免疫応答および HLA-A2拘束性細胞性免疫 応答を誘導する EGFR由来ペプチドとして、 EGFR および EGFR を同定した
479-488 1138-1147
。本結果を表 3および図 7から 11に示す。
[表 3] 表 3ペプチドに対する液践疫応答
_ E3FRペプチドに財る1¾香（ODit) _ _ . 者 "ΗΪΑ サブタイプ EGFR1M8 EGF 61-70 EGFR110-118 EGFR599-B07 EGFRS53-6e2 EGFR65 -662 EGFR729-738 EGFR765-776 EGFR852-861 EGF 1138-1147
Α2/24
Figure imgf000021_0001
抗ぺブチ嚇 2。） 13 4 2 1 10 " 2 n
HDf^1 i 1 2 1 2 4 0 ― 3 0 0 0
力 "トオフ鳆（0- 06〉ょり«ぃ00(¾は-で示し 。
これらの結果より、本発明の EGFR由来ペプチドが EGFR基盤免疫療法において癌 ワクチンとして応用可能であることが示唆される。
産業上の利用可能性
[0038] 本発明の EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR および EGFR は、液
800-809 124-132 54-62 479-488 1138-1147 性および細胞性免疫応答の両方を誘導することから、既知の HER2/neu由来 CTLェ ピトープペプチドと比較してより高い免疫原性を有することが示唆される（非特許文献 6— 9)。
[0039] チロシンキナーゼ阻害剤である ZD1839に反応する NSCLC患者はほんの一部分で ある力 その臨床応答を予測するのに適した実験室的マーカーは現在のところ存在 しない。本発明の EGFRペプチドに対する免疫応答のレベルと ZD1839に対する臨床 応答に相関があることを示唆する知見が得られていることから、本発明の EGFR由来 ペプチドにより ZD1839に対する応答を予測できるならば、さらに有用であろう（非特 許文献 4, 5)。
[0040] 本発明の EGFRペプチドの拘束性が示唆される HLA-A24ァリルは、日本人の 60% ( これらの場合の 95%は A2402の遺伝子型である）、白人の 20%、およびアフリカ人の 12%に見られる（非特許文献 18)。また HLA-A2ァリルは、日本人の 40%、白人の 50 %、およびアフリカ人の 16%に見られる。従って、本発明の EGFRペプチドは、世界中 の多数の NSCLC患者の助けとなる EGFR基盤免疫療法の開発に新たな洞察を与え ることがでさる。

Claims

請求の範囲
[1] 特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生能を有する上皮細 胞増殖因子受容体 (EGFR)由来ペプチドまたはその変異ペプチド。
[2] EGFR由来ペプチドが、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR 、 EGFR および
EGFR の中力 選ばれる 1つのペプチドのアミノ酸配列中、連続する少なくとも 8
1138-1147
個のアミノ酸残基力もなる、請求項 1記載のペプチド。
[3] 特異的な細胞傷害性 τ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生能を有する、請求項 1または 2記載のペプチドを含むアミノ酸残基数 8から 50個のポリペプチド。
[4] 請求項 1または 2記載のペプチドまたは請求項 3記載のポリペプチドをコードする核 酸分子。
[5] 請求項 4記載の核酸分子を含有するベクター。
[6] 請求項 1または 2記載のペプチド、請求項 3記載のポリペプチドまたは請求項 4記載 の核酸分子を含む、特異的な細胞傷害性 Τ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体産生 するための医薬組成物。
[7] 癌ワクチンである、請求項 6記載の医薬組成物。
[8] 請求項 1または 2記載のペプチドまたは請求項 3記載のポリペプチドと HLAの複合 体を認識する EGFR反応性細胞傷害性 Τ細胞。
[9] 請求項 1または 2記載のペプチドまたは請求項 3記載のポリペプチドを用い、 EGFR 反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法。
[10] 請求項 1または 2記載のペプチドまたは請求項 3記載のポリペプチドを特異的に認 識する抗体。
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