WO2005063984A1

WO2005063984A1 - 遺伝子発現を抑制する二本鎖ｒｎａ

Info

Publication number: WO2005063984A1
Application number: PCT/JP2004/019556
Authority: WO
Inventors: Masabumi Shibuya; Naoyuki Yabana
Original assignee: Masabumi Shibuya; Naoyuki Yabana
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-27
Publication date: 2005-07-14
Also published as: JPWO2005063984A1

Abstract

【課題】　【解決手段】　遺伝子発現を抑制する二本鎖ＲＮＡに関し、特に前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効な低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡが提供される。また、前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを含有する薬剤組成物も提供される。

Description

遺伝子発現を抑制する二本鎖 RNA 技術分野

[0001] 本発明は遺伝子発現を抑制する二本鎖 RNAに関し、特に前記 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な低分子干渉 RNA又は低分子ヘアピン RNAに関するものである。また本発明は、前記低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAを含有する薬剤組成物に関するものである。

背景技術

[0002] 最近、基礎研究の観点からも臨床応用の観点力も非常に注目されている研究課題として血管新生がある。

[0003] この血管新生（angiogenesis)は、既存の血管から分岐を生じて血管内皮細胞が増殖し、平滑筋細胞に囲まれた強固な血管ネットワークを形成する組織形態反応である。血管新生は個体の発生、発育に必須の生命現象である力成熟した個体にお V、ては性周期に関連する卵巣などを除きほとんど見られな!、。

[0004] これに対して、最近の研究から、癌などの様々な病気で病的血管新生が生じることが報告された。 Folkmanらによって示されたように、直径数 cm以上の固形癌の増殖には、腫瘍血管力もの栄養と酸素の供給が極めて大きな役割を果たす。それだけでなぐ固形癌はこの腫瘍血管を転移の経路として用い、転移先で再び血管新生を誘発する。さらにこの病的血管新生は、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎など多くの疾患の進展 ·悪性ィ匕に深く関与していることが明らかにされている。従って、病的血管新生をコントロールすることは臨床上非常に重要と考えられてきたが、その分子メ力-ズムは長ヽ間不明確であった。

[0005] しかし、最近その基本的な機構として内皮細胞の増殖 ·分ィ匕に関わっていると考えられる、血管内皮増殖因子 VEGF (vascular endothelial growth factor)とそのレセプター VEGFR (VEGF receptor: fitキナーゼ）が明らかにされた。

[0006] VEGFは、 1983年に米国の Sengerらによって新しい血管透過性因子（VPF :vas cular permeability factor)として見出された。さらに同時期に、米国ジネンティクの Ferramらは内皮細胞に特異的に作用する増殖因子を見出し、 VEGF (vascula r endothelial growth factor)と命名した。後の研究により、 VPF及び VEGFは異なる生物活性を指標にして得られたにも関わらず、同じ遺伝子の産物であることが明らかになった。この VEGFは線維芽細胞や上皮細胞には全く増殖活性を示さず、一方臍帯静脈内皮細胞、大動脈由来内皮細胞など、あらゆる内皮細胞に増殖活性を示すものであった。このように内皮細胞に対して厳密な特異性を持つ増殖因子の発見は初めてであり、その構造や受容体に関して非常に興味が持たれた。

[0007] その後の研究により、 VEGFZVEGFレセプターファミリーのシグナルメカニズムが明らかにされてきた。例えば、腫瘍細胞では、低酸素に応答して VEGF mRNAの発現が誘導され、産生された VEGFは内皮細胞にほぼ限局して発現する受容体型チロシンキナーゼ VEGFレセプター（VEGFR)— 1、—2に結合してレセプターの自己リン酸化を誘導する。活性ィ匕されたレセプターのシグナルにより内皮細胞は細胞外基底膜を分解し、増殖'遊走する。こうした VEGF及び VEGFレセプターのシグナルによるパラクライン系は、血管新生のシグナルの中心に位置付けられている。 VEGFレセプターは 3種類の遺伝子力なる力中でも特に VEGFR— 2が血管新生 '血管内皮細胞の増殖 '遊走に中心的な役割を果たしていることが、これまでに明らかにされている。

[0008] 以上のように VEGFは病的血管新生で中心的な役割を果たすことから、 VEGF及びその受容体 (VEGFR)は血管新生阻害の重要な標的と考えられてきた。これまでに抗 VEGF抗体（Hurwitz, H. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350, 2335— 2 342)、 VEGFR— 2に対する中和抗体（Witte, L. et al( 1998) Cancer Metasta sis Rev 17, 155— 61 ;Zhu, Z. et al. (2003) Lukemia 17, 604— 611)、 V EGFRのチロシンキナーゼに対する特異的阻害剤（Fong, T. A. et al. (1999) C ancer Res 59, 99— 106)、遊離型 VEGFR— 1による VEGFのトラップ（Holash, J. et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 11393一 8)など【こつ!/ヽて臨床治験が行われている。しかし、作製 '精製にコストがかかる、大量投与が必要である、特異性が低く副作用を生じる可能性があるなど、実用化には至っていないのが現状である。発明の開示

課題を解決するための手段

[0009] 従って、本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、血管新生を有効に阻害するための新規組成物であって、作製'精製にコストがかからず、特異性が高い組成物を提供することを目的とするものである。

[0010] 本発明者らは、上記目的を達成するため、 RNA干渉 (RNAi)技術に着目した。すなわち、 RNA干渉 (RNAi)技術の（1)遺伝子発現の阻害特異性が極めて高い、 (2 )合成法や発現系が確立されており、投与量も少なくコストも安い、という特徴に着目し、 VEGFRに対する低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA力効果的な血管新生阻害作用を示すのではないかという知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、 VGEFレセプターの発現を抑制するのに有効な RNA配列の同定に成功し、この配列を有する低分子干渉 RNA(siRNA)および低分子ヘアピン RNA (sh RNA)を得たものである。

[0011] すなわち、本発明の第 1の主要な観点によれば、 VEGFレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的な RNA配列であって、前記 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な RNA配列を有することを特徴とする低分子干渉 RNA (siRNA)、又は低分子ヘアピン RNA (shRNA)が提供される。特に前記 VEGFレセプターは、これに限定されるものではな、が、 VEGFレセプター 2 (VEGFR-2)である。

[0012] このような構成によれば、例えば対象物へ導入することにより、対象物の VEGFRの発現を効果的に且つ特異的に抑制する低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAを得ることができる。

[0013] さらに、前記低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAの RNA配列は配列番号 1 の配列を有するものである。

[0014] 本発明の 1実施形態において、前記低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAは、前記 VEGFレセプター 2の 3 '— UTR配列に同一又は相補的な RN A配列を有するものである。ここで前記 3'— UTR配列は、これに限定するものではないが、配列番号 2 の DNAの 4375— 5830塩基であることが好まし!/、。

[0015] 前記 RNA配列は二本鎖 RNAであり、これに限定されるものではないが、この二本鎖領域は 15塩基以上であることが好ましい。さらに前記 RNA配列は 3'末端に突出した一本鎖領域を有するものである。

[0016] また、本発明の第 2の主要な観点によれば、対象物における VEGFレセプターの発現を有効に抑制する量の前記低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAと、その薬学的に許容される担体とからなる薬剤組成物が提供される。このようにして得られた薬剤組成物によれば、病的血管新生に関連した疾患を治療することが可能になる。

[0017] この発明の更なる特徴及び顕著な効果は、次に記載する発明の実施の形態の項の記載から当業者にとって明らかになるものである。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本明細書に参照されている参考資料及び科学文献は当業者の知識を確立するために参照され、それぞれ開示された内容はこの参照により組み込まれる。

[0019] RNA干渉 (RNAi)枝術

近年、新しい遺伝子機能解析として RNA干渉 (RNAi)技術が、バイオ業界においてのみならず、医学業界においても注目されている。すなわちこの RNA干渉技術を、病気を引き起こす遺伝子の発現 (並びにタンパク質合成）を阻止する新しいツールとして用いる試みがなされている。 RNA干渉とは、細胞内に二本鎖 RNA(dsRNA) を導入すると、これと同じ配列を有する mRNAが特異的に分解される現象であり、 19 98年【こ線虫で最初【こ報告された（Fire, A. et al. (1998) Nature 391, 806一 8 11)。その後 RNA干渉は昆虫、植物などで保存された、核酸レベルの生体防御機構であることが示唆されて、る。

[0020] 線虫などにおいて dsRNAは Dicerと呼ばれるタンパク質により 3'末端側に 2塩基のオーバーハングを持つ 21塩基の二本鎖低分子干渉 RNA (siRNA: small interf ering RNA)にプロセッシングされ、この低分子干渉 RNAは、 RNAi実行タンパク質（RNAi— induced silencing complex: RISC)と呼ばれる複合体に取り込まれる。二本鎖低分子干渉 RNAは RISCに取り込まれた後、一本鎖に解離すると考えられている。 RISCは、この一本鎖に相補的な配列を有する mRNAに結合し、これを分解すると考えられている。

[0021] 哺乳類細胞への RNA干渉の応用は難しいと考えられてきた力 2001年に Tuschl らのグループにより、二本鎖低分子干渉 RNAを細胞に導入することで、 RNA干渉が可能であることが明らかにされた（Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature 411, 494一 498)。

[0022] さらに、 RNAiを行うことを目的として、 RNAポリメラーゼ IIIによって転写されるプロモーター系を利用して転写されるヘアピン構造を有する、低分子ヘアピン RNA(sh RNA)が開発されている。この shRNAはループ部分が細胞内で分解されて、 siRN Aと同様の構造をとると考えられる。

[0023] この RNA干渉は RNAサイレンシングとも呼ばれており、標的 mRNAの特異的な分解を促進することにより標的タンパク質の発現を特異的に抑制することができるため、医療分野での応用に非常に期待されている。ただし実際の治療は現在まで報告されていない。

[0024] しカゝしながら、本発明者らは、上述の RNA干渉 (RNAi)技術の（1)遺伝子発現の阻害特異性が極めて高い、（2)合成法や発現系が確立されており、投与量も少なくコストも安い、という特徴に着目し、 VEGFRに対する低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAが、効果的な血管新生阻害作用を示すのではないかという知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、以下に述べるいくつかの性質を併せ持つ RNAの作製に成功したものである。

[0025] すなわち、本発明によれば、 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な RNA配列を有することを特徴とする低分子干渉 RNA又は低分子ヘアピン RNAが提供される。

[0026] VEGFレセプター低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA

最近、多くの研究により、癌などの様々な疾患の進展'悪性化が、病的血管新生に依存していることが明らかになった。つまりこの病的血管新生を効果的に抑制することができれば、病的血管新生に関連した疾患の新、治療方法を確立できるのではないかと期待されていた。

[0027] 生体内の血管新生シグナルにおいて、 VEGF (血管内皮増殖因子： vascular en dothelial growth factor)が中心的な役割を果たすことが明らかになり、そのレセプター (受容体)は血管新生阻害の重要な標的と考えられてきた。これまでに、抗体や特異的阻害剤など、 VEGFZVEGFレセプターを標的とした血管新生阻害剤が開発 ·臨床治験が行われてきたが、コストが高い、特異性が低く副作用が生じる、などの問題があり、実用化にはまだ至っていない。一方、本発明者らは、最近報告された RNA干渉 (RNAi)技術に着目し、 VEGFレセプターに対する低分子干渉 RNAZ 低分子ヘアピン RNAは効果的な血管新生阻害作用を示すのではな、かと、う知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、以下に述べるいくつかの性質を併せ持つ RNAの作製に成功した。

[0028] これまでの研究により、 VEGFとその受容体である VEGFレセプターの生物学的活性は、ほとんどが内皮細胞に限局していることが明らかにされている。

また内皮細胞上の VEGF高親和性受容体として、 VEGFレセプター 1 (Fit— 1)と VE GFレセプター 2 (KDRZFlk— 1)の 2分子が同定されている。従って、 VEGFの基本的な作用はこれら 2つの受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸ィ匕を介して引き起こされていると考えられた。

[0029] この VEGFレセプターファミリーの中では、 VEGFレセプター 2が血管新生'血管内皮細胞の増殖'遊走において中心的な役割を果たしている。すなわち VEGFレセプター 1のリン酸化は、 VEGFレセプター 2に比べるとかなり弱ぐ血管内皮細胞の増殖 •遊走へのシグナルの寄与は低いと考えられた。また、 VEGFレセプター 3は主にリンパ管内皮細胞に発現し、生体における血管内皮細胞の増殖には関与しないとされている。

[0030] そこで本発明者らは、 RNA干渉技術を用いて VEGFレセプター 2の発現を抑制すること〖こよって、血管新生を効果的に阻害できるかを検証するために、 VEGFレセプター 2の核酸配列の一部と同一又は相補的な RNA配列を有する低分子干渉 RNA または低分子ヘアピン RNAを作成し、ヒト臍帯静脈血管内皮（HUVE： human urn bilical vein endothelial)細胞に導入した結果、前記 VEGFレセプター 2の発現が有効に抑制されることを明らかにした。

[0031] また、本発明の 1実施例に従うと、前記低分子干渉 RNA又は低分子ヘアピン RNA は、 VEGFレセプター 2の発現の抑制に有効な RNA配列に同一又は相補的な配列を有しており、前記 RN A配列は前記 VEGFレセプター 2の 3 '— UTR (非翻訳領域）配列である。本発明において前記 3'— UTR配列を標的配列とすることは、対照実験の点からも有益である。すなわち、低分子干渉 RNAを用いて VEGFレセプター 2の発現を抑制し、生理的な効果を観察した場合、機能対照 (functional control)として、 VEGFレセプター 2をさらに導入したときに、この効果が打ち消されるかどうかを検討することが望ましい。本発明において 3'— UTRを標的配列とすることにより、この 3，一 UTRを含まな、翻訳領域だけの cDNAを発現させることで、機能対照実験を容易に行うことが可能になる。

[0032] ただし、本発明において、前記 RNA配列は 3'— UTR配列に限定されるものではなぐ対象物中で VEGFレセプター 2の発現を有効に抑制できる配列であればよい。

[0033] また本発明に従って作成された前記低分子干渉 RNA又は低分子ヘアピン RNA は、点変異や欠損を導入した cDNAを導入することで、 VEGFレセプター 2のどのァミノ酸が機能に重要であるかを解析することが可能である。さらに、本発明の前記低分子干渉 RNA又は低分子ヘアピン RNAの配列は、他の多数の低分子干渉 RNAと一緒にデータベース化することで、有用な dsRNAを探索する指標となり得る。

[0034] 本発明にお、て提供される VEGFレセプター 2の発現の抑制に有効な低分子干渉 RNAを作成する方法としては、本発明の 1実施例に従うと、化学合成で作製した一本鎖 RNAをァニールさせる方法がある。これによつて作成された前記低分子干渉 R NAの構造は、 3'末端に一本鎖の突出を有しており、好ましくは 2塩基のオーバーハングである。さらに二本鎖部分は 15塩基以上、好ましくは 18塩基以上、最も好ましくは 19塩基である。

[0035] さらに、本発明におヽて前記低分子干渉 RNAを対象物へ導入する方法は、例えば細胞へ導入する場合、 Oligofectamineや Lipofectamine、 TransIT— TKOなどの市販されている形質移入試薬を用いて行われる。また、動物への導入法としては、卵へのインジェクション、ァテロコラーゲンを利用した生体投与、カチォニックリポソ一ムを用いた投与などを用いて行われる。し力しこのような方法だけでなぐ他の公知技術を用いて行われ得る。

[0036] また、本発明の VEGFレセプター 2の発現の抑制に有効な低分子ヘアピン RN Aを作成する方法としては、 RNAポリメラーゼ IIIにより転写されるプロモーターを利用して転写する方法がある。本発明の 1実施例に従うと、例えばプロモーターとしては HI プロモーター、 U6プロモーター、 CMVプロモーターが用いられる。さらにベクターの種類としては、プラスミド、レトロウイルス、レンチウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルスが用いられる。またこれらの作製に際して、制限酵素によるライゲーシヨン (連結)反応の他に、 Cre— ΙοχΡを使用した組換え反応なども使用可能である。これらのベクターのうち、プラスミドは Lipofectamine、 Effecteneなど、市販されている开質移入試薬を用いて、細胞に導入することが可能である。その他のウィルスベクターは、本発明分野では標準的な感染操作によって細胞へ導入することができる。また、これらのベクターは、局所投与、静脈注射などにより生体への投与が可能である。

[0037] さらに、本発明で得られた、対象物における VEGFレセプターの発現を有効に抑制する量の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAと、薬学的に許容される担体とを有することを特徴とする薬剤組成物が提供される。前記薬剤組成物は、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎など、病的血管新生に関連した疾患を治療するために用いてもよい。

[0038] 1実施例において、本発明の 1実施形態で得られた低分子干渉 RNA(siKDR)発現ベクターを検討した。本発明者らは、このウィルスベクターが、線維芽細胞との共培養システムにおいてヒト臍帯静脈内皮 (HUVE)細胞の、血管新生の指標の 1つである 2次元管腔形成を阻害することを明らかにした。この結果は、本発明の 1実施形態で得られた低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAが、抗血管新生療法にお!ヽて RNA干渉技術を導入するための有用であるということを強く示唆している。

[0039] 薬剤組成物という観点に関し、本発明の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA は以下の：（1)標的が厳密に遺伝子配列に依存するため、特異性が高く作用すること、（2)細胞内に取り込まれた低分子干渉 RNAは遺伝子発現抑制の効果を一週間程度持続するため、投与回数当たりの効果が高いと期待される、（3)他の既存の VE GFレセプター 2阻害剤とは異なる作用機序のため、併用による相乗的な効果が高いと考えられる、（4)ベクターを用いた低分子ヘアピン RNAとして使用した場合、コストが安く済む、という点で、有益な効果を有すると考えられる。

[0040] また、本発明の 1実施形態で得られた VEGFレセプター 2の発現を有効に抑制する低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RN Aを用いて、（l)VEGFレセプター 2は造血性幹細胞にぉ、て発現して、るので、これら幹細胞から血球系細胞への分化を抑制する、（2) VEGFレセプター 2は神経系で機能する可能性が示唆されており、こうした機能を制御することも可能であると推測される。

[0041] 次に、以下の実施例において本発明に係る、 VEGFレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的な RNA配列であって、前記 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な RNA配列を有することを特徴とする低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA の作成とその効果の一例を説明する。

実施例 1

[0042] dsRNA、形皙移人

本発明の好ましい実施形態で用いられる dsRNAは、 Nippon Bioserviceから購入した。この dsRNAの標識化（ラベリング）には LabellT siRNA Tracker Cy3キット（Mums)を用いた。 dsRNAの形質移入は、使用説明書に従って TransIT— TK O Transfection reagent (Mirus 用ヽて行つ 7こ。

[0043] RNA単離及び RT— PCR

ヒト臍帯静脈内皮（HUVE)細胞（Clonetics)は日常的に Humedia EG2 (Kura bo)中で維持された。 HUVECは 1. 6xl0⁵cells/3. 5cm plateで播種され、 siR NA形質移入は翌日実行された。 48時間後、総 RN Aをグァ-ジンチオシァネートフェノールクロ口ホルムを用いた標準プロトコール手段によって単離された。使用説明書に従って 1 μ gRNAから Μ— MLV逆転写酵素（Invitrogen)を用いて cDNAを合成した。次に以下に記載されて、るプライマーを用いて PCRを行った：

VEGFR-2の翻訳領域

5， -TTGGAGCATCTCATCTGTTACAGC- 3'

5 ' - CTTCTG AGGCAAGAACCATACCAC - 3 '

VEGFR - 2の 3 '非翻訳領域

5， -GGAGCCAGTCTTCTAGGCATA- 3'

5， -CCGCATTCAGTCTCAGACAT- 3'

VEGFR-1

5， AGCTGGCAAGCGGTCTTACC-3' 5， GAGTCAGCCACAACCAAGGT- 3'

VEGFR— 3

5 ' - AGC AGCTGTG AC ACCGTGGC - 3 '

5， GTCTCTCACGCGCTGGCAGA- 3'

GAPDH

5， -TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA- 3'

5， - GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTCAG - 3 '

PCR条件としては、 94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 90秒を 25サイクルである。 VEGFR— 1の場合は 94°Cで 15秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 60秒を 40サイクル行つた。

[0044] VEGF刺激及び細胞抽出

1. 6xl0⁵cells/3. 5cm plateの HUVECは上述と同条件で形質移入された。 4 8時間後、細胞は増殖因子非含有の培地 (EGM2、 0. 4%ゥシ胎児血清)で 14時間培養された。 VEGFR— 2を刺激するために hr— VEGF— A165 (Genzyme Techne )を最終濃度 50ngZmlで 5分間細胞へ添加され、 PBSで 2回洗浄した後、可溶化された。総細胞可溶化液は HNTGバッファー（50mM Hepes pH7. 4、 150mM NaCl、 1% TritonX— 100、 10% グリセロール、 1. 5mM MgCl、 ImM EGT

2

A、 ImM バナジン酸、 ImM PMSF、 1% Trasylol)を用いて準備され、 7. 5% SDS— PAGEで分離し、 Immobilon(Millipore)へ移し、ウェスタンブロットに供した。 VEGFR2に対する抗体は以前記載された（Takahashi et al. EMBO J 20 pp 2768— 2778)抗体を使用した。抗 PLC γ (Santa Cruz)、抗リン酸 MAPK、及び抗 MAPK(Cell Signaling)は購入した。タンパク質はウェスタンブロティング（ Western blotting Luminol Reagent) (Santa Cruz)手段を用いた化学発光によって検出された。

[0045] MTSアツセィ

5xl0³の HUVECは 95ゥエルプレートに播種され、 siRNAで形質移入された。 4時間後、培地を lOngZml hr— VEGF— A165若しくは同濃度の BSAを含む 0. 1%ゥシ胎児血清含有 EGM2に交換した。 48時間後、生細胞を Aqueous One Soluti on Proliferation Assay (Promega)によって定量化された。 492nmで吸光度を測定した。

[0046] S

siKDRによる VEGFR2 mRNA発現の阻害

VEGF— A及び VEGFR— 2 (KDR/Flk-1)システムは血管新生のシグナル伝達に重要であると知られている（図 1)。 RNA干渉によって内皮細胞中の VEGFR2遺伝子発現を抑制するために、本発明者らはヒト VEGFR— 2 mRNAの 3' UTR領域を特異的標的とした siKDR dsRNAを設計した（図 2、図 4)。前記 siKDRをヒト臍帯静脈内皮（HUVE)細胞に導入し、 48時間後、 VEGFR2遺伝子をサイレンシングする能力を有した siKDRとして働くかどうかを解析するために RT-PCRによって遺伝子発現を解析した。いくつかの商業的に利用可能な形質移入試薬を用いて、本発明者らは dsRNAを運搬する能力を試験し、続く実験にお!ヽて HUVE細胞の形質移入効率が 90%を超えるように TransIT— TKOを用いた。コード化配列中のプライマーによつて検出された VEGFR2 mRNAの 800bpRT— PCR産物の量は、 mock処理細胞と比較して 90%以上減少された（図 3)。

[0047] 3， UTR領域中のプライマーを用いた RT— PCR解析も同様な結果を示し、これによつて siKDRによる下方制御を確認した。このサイレンシング効果は RNAiの独特な配列特異性によって仲介されていることを確認するために、本発明者らは、 siKDRに対して整合性はある力その中心領域内に 2つの変異を有する別の dsRNA(siKDRm ut)を設計した（図 4)。この siKDRmutは VEGFR2 mRNAレベルに対して影響を及ぼさないと予想された。 VEGFレセプターファミリーの 2つの他のメンバーである VE GFR1及び VEGFR3と、ハウスキーピング遺伝子である GAPDHの発現は、 siKDR で処理しても変化はなぐさらに RNAiの配列特異性を確認した。これらの結果によつて、 siKDRは VEGFR2 mRNAを特異的標的にしており、内皮細胞中のその発現を効果的に減少することができると証明された。

[0048] siKDRによる VEGFR2タンパク質及び下流シグナル伝達のノックダウン

本発明者らは次に VEGFR2タンパク質及びその下流シグナル伝達の発現を解析し、 siKDR処理細胞中の VEGFR2 mRNAの著しい減少と一致していた。 siKDR 形質移入 HUVE細胞可溶ィ匕液にぉ、て、 230kD及び 200kDバンドとして検出される VEGFR2の量は抗体で検出可能なレベル以下まで減少した。一方、他のタンパク質である PLC γ及び MAPキナーゼの発現レベルは変化しなかった（図 5)。対照として siKDRmutを HUVE細胞へ導入した場合、 VEGFR2タンパク質の減少は観察されなかった。 VEGF— A で刺激した結果、 siKDR処理細胞中で MAPキナーゼの

165

弱ヽ活性化が見られたが、 mock若しくは siKDRmut処理 HUVE細胞でも関連する活性ィ匕が観察された。この結果は、内皮細胞への siKDRの導入は VEGFR2仲介シグナル伝達を阻害するための効果的な手段になり得ることを意味している。

[0049] siKDRによる内皮細朐增殖及び Z若しくはアポトーシスの阻害

siKDRの内皮細胞への影響に関する生物学的因果関係を解決するために、本発明者らは siRNA導入後の前記 VEGF依存性増殖及び Z若しくは HUVE細胞の生存を検討した。 MTSアツセィを用いて、 VEGF— A存在下で siKDR若しくは siKDR mutの形質移入 48時間後に生細胞を定量化した。 mock若しくは siKDRmut処理細胞の数は VEGF存在下で 1. 8倍多ぐ siKDR処理細胞の数は 1. 2倍であり（図 6 )、 siKDRによって仲介された VEGFR2の RNAiは、内皮細胞の増殖及び Z若しくは生存を阻害することができることが証明された。

[0050] siKDRによる血管新牛.阳.害作用

アデノウイルスの作製

siKDRに一致する低分子ヘアピン RNA(shRNA)を発現するために、本発明者らは以下に記載のオリゴヌクレオチドを合成し、

配列番号 1；

o - gatccgtagagttcgttgtgctgtttcaagagaacagcacaacgaactctacttttttggaaa - 3

5 - agcttttccaaaaaagtagagttcgttgtgctgttctcttgaaacagcacaacgaactctac - 3 二本鎖 DNAを産生するためにアニーリングし、前記 shRNAの発現を促進する pSile ncer2.1 -U6 hygro (Ambion)へ; ι£結し 7こ。

[0051] siKDRmutに一致する前記オリゴヌクレオチドは以下のように合成し、 5 ' - gatccgtagagttGgttCtgctgtttcaagagaacagcaGaacCaactctacttttttggaaa - 3'

5 ' - agcttttccaaaaaagtagagttGgttCtgctgttctcttgaaacagcaGaac^aactctac - 3 上記と同様の方法で pSilencer2.1 - U6 hygroへ導入した。

[0052] 両 shRNA発現カセットは Hindlllと EcoRIで切断され、 5 '、 3 '末端を平滑末端（ブラントエンド）にし、 pAxcw (アデノウイルス発現ベクターキット（Takara Bio) )の Sw al部位に連結した。このコスミドベクターは Effectene (Qiagen)を用いて DNA— TP Cと共に 293細胞へ同時形質移入された。前記 shRNA発現カセットを有したこの組換えアデノウイルスは製造説明書に従ってスクリーニングされ、 U6プロモーターから s iKDRと KDRmutをそれぞれ発現するアデノ siKDRとアデノ siKDRmutを作製した

[0053] HUVE細胞へのアデノウイルスの感染はアデノウイルス発現ベクターキットの説明書に記載された方法に従って行った。簡潔には、 6ゥエル培養プレート中でサブコンフルェントの HUVE細胞を、アデノウイルスを含む 5%FBS含有ダルベッコ変法ィーグル培地（DMEM)で 1時間インキュベートし、さらに Humedia EG2で指示された時間インキュベートした。時間経過実験のため、 HUVE細胞は MOI = 40でウィルスに感染され、細胞は図中の指示された時間で総可溶ィ匕液にされた。前記 VEGFR— 2発現のサイレンスに対する効果的な MOI (感染効率)を評価するために、前記アデノウィルス溶液は 5%FBS含有 DMEMで希釈され、図中に指示された MOIで HUV E細胞に対する感染用に使用された。感染 48時間後、細胞は RNA調整された。

[0054] In vitro血管新生アツセィ

In vitro血管新生は、ヒト二倍体線維芽細胞と共培養された HUVE細胞の毛細血管様構造の形成で評価された。この実験手順は Angiogenesis Kit (Kurabo)に付属する説明書に従った。簡潔には、 HUVE細胞は shRNA発現アデノウイルスに 3— 7日感染され、固定された。続いてキットに従ったプロトコールによって HUVE細胞は抗ヒト CD31抗体 (Kurabo)を用いて染色された。毛細血管様ネットワークの形成を測定するために、 CD31染色の顕微鏡画像は Angiogenesis Image Analyzerソフトウェアによって解析された。

[0055] S

siKDRは HUVE細胞の毛細形成を阻害する

血管新生における siKDRの生物学的効果を評価するために、発明者らは siKDR 力二倍体線維芽支持細胞との共培養システムで内皮細胞の管腔形成を阻止するカゝどうか検討した。まず本発明者らは、 siKDR若しくは siKDRmutに一致する低分子ヘアピン RNA (shRNA)を発現するアデノウイルスを作成した。感染後 2日目から、アデノ siKDRは VEGFR— 2 mRNAの発現をノックダウンできた力一方アデノ si KDRmutの場合 VEGFR— 2 mRNAレベルは変化しなかった（図 7)。アデノ siKD Rのこの効果は感染後少なくとも 4日まで続き、 MOI = 0. 2の場合でも明らかであつた（図 8)。

[0056] 本発明者らは次に、 siKDR若しくは siKDRmutを、内皮細胞と線維芽細胞の共培養システムへ添加し、前記実験手順に記載されたように、毛細ネットワークの接合部分 (joints)と枝分かれ部分 (paths)の数を測定した。アデノ siKDR感染 HUVE細胞の接合部分と枝分かれ部分の数は、 siKDRmutの場合と比較して、有意に減少した (図 9、 10)。これはアデノ siKDRは内皮細胞の管腔形成を阻害するのに効果的であることを意味している。

[表 1]

配列番号 2

ORIGIN V E G Fレセプタ一 2

1 actgagtccc gggaccccgg gagagcggtc agtgtgtggt cgctgcgttt cctctgcctg 61 cgccgggcat cacttgcgcg ccgcagaaag tccgtctggc agcctggata tcctctccta 121 ccggcacccg cagacgcccc tgcagccgcc ggtcggcgcc cgggdccct agccctgtgc 181 gctcaactgt cctgcgctgc ggggtgccgc gagttccacc tccgcgcctc cttctctaga 241 caggcgctgg gagaaagaac cggctcccga gttctgggca tttcgcccgg ctcgaggtgc 301 aggatgcaga gcaaggigct gctggccgtc gccctgtggc tctgcgtgga gacccgggcc 361 gcctctgtgg gtttgcctag tgtttctctt gatctgccca ggctcagcat acaaaaagac 421 atacttacaa ttaaggctaa tacaactctt caaattactt gcaggggaca gagggacttg 481 gactggcttt ggcccaataa tcagagtggc agtgagcaaa gggtggaggt gactgagtgc 541 agcgatggcc tcttctgtaa gacactcaca attccaaaag tgatcggaaa tgacactgga 601 gcctacaagt gcttctaccg ggaaactgac ttggcctcgg tcatttatgt ctatgttcaa 661 gattacagat ctccatttat tgcttctgtt agtgaccaac atggagtcgt gtacattact 721 gagaacaaaa acaaaactgt ggtgattcca tgtctcgggt ccatttcaaa tctcaacgtg 781 tcactttgtg caagataccc agaaaagaga tttgttcctg atggtaacag aatttcctgg 841 gacagcaaga agggctttac tattcccagc tacatgatca gctatgctgg catggtcttc 901 tgtgaagcaa aaattaatga tgaaagttac cagtctatta tgtacatagt tgtcgttgta 961 gggtatagga tttatgatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 1021 gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 1081 tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacG 1141 cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 1201 agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 1261 acatttgtca gggtccatga aaaacctttt gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 1321 gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 1381 ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 1441 gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cacigtcatc 1501 cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 1561 ccaccccaga ttggtgagaa atctctaatc tctcctgtgg attcctacca gtacggcacc 1621 actcaaacgc tgacatgtac ggtctatgcc attcctcccc cgcatcacat ccactggtat

[表 2] 1681 tggcagttgg aggaagagtg cgccaacgag cccagccaag ctgtctcagt gacaaaccca 1741 tacccttgtg aagaatggag aagtgtggag gacttccagg gaggaaaiaa aattgaagtt 1801 aataaaaatc aatttgctct aattgaagga aaaaacaaaa ctgtaagtac ccUgttatc 1861 caagcggcaa atgtgtcagc tttgtacaaa tgtgaagcgg tcaacaaagt cgggagagga 1921 gagagggtga tctccttcca cgtgaccagg ggtcctgaaa ttactttgca acctgacatg 1981 cagcccactg agcaggagag cgtg励 g tggtgcactg cagacagatc tacgttigag 2041 aacctcacat ggtacaagct tggcccacag cctctgccaa tccatgtggg agagttgccc 2101 acacctgttt gcaagaactt ggatactctt tggaaattga atgccaccat gttctctaat 2161 agcacaaatg acattttgat catggagctt aagaatgcat ccttgcagga ccaaggagac 2221 tatgtctgcc ttgctcaaga caggaagacc aagaaaagac atigcgtggt caggcagctc 2281 acagtcctag agcgtgtggc acccacgatc acaggaaacc tggagaatca gacgacaagt 2341 attggggaaa gcatcgaagt ctcatgcacg gcatctggga atccccctcc acagatcatg 2401 tggtttaaag ataatgagac ccttgtagaa gactcaggca ttgtattgaa ggatgggaac 2461 cggaacctca ctatccgcag agtgaggaag gaggacgaag gcctctacac ctgccaggca 2521 tgcagtgttc廿 ggctgtgc aaaagtggag gcatttttca taatagaagg tgcccaggaa 2581 aagacgaact tggaaatcat tattctagta ggcacggcgg tgattgccat gttcttctgg 2641 ctacttcttg tcatcatcct acggaccgtt aagcgggcca atggagggga actgaagaca 2701 ggctacttgt ccatcgtcat ggatccagat gaactcccat tggatgaaca ttgtgaacga 2761 ctgccttatg atgccagcaa atgggaattc cccagagacc ggctgaagct aggtaagcct 2821 cttggccgtg gtgcctttgg ccaagtgatt gaagcagatg cctttggaat tgacaagaca 2881 gcaacttgca ggacagtagc agtcaaaatg ttgaaagaag gagcaacaca cagtgagcat 2941 cgagctctca tgtctgaact caagatcctc attcatattg gtcaccatct caatgtggtc 3001 aaccttctag gtgcctgtac caagccagga gggccactca tggtgattgt ggaattctgc 3061 aaatttggaa acctgtccac ttacctgagg agcaagagaa atgaatttgt cccctacaag 3121 accaaagggg cacgattccg tcaagggaaa gactacgttg gagcaatccc tgtggatctg 3181 aaacggcgct tggacagcat caeca gt age cagagctcag ccagctctgg atttgtggag 3241 gagaagtccc tcagtgatgt agaagaagag gaagctcctg aagatctgta taaggacttc 3301 ctgaccttgg agcatctcat ctgttacagc ttccaagtgg ctaagggcat ggagttcttg 3361 gcatcgcgaa agtgtatcca cagggacctg gcggcacgaa atatcctctt atcggagaag 3421 aacgtggtta aaatctgtga ctttggcttg gcccgggata tttataaaga tccagattat 3481 gtcagaaaag gagatgctcg cctccctttg aaatggatgg ccccagaaac aatttttgac 3541 agagfgtaca caatccagag tgacgtctgg tcttttggtg ttttgctgtg ggaaatattt

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81

9^S6T0/t00∑df/I3d t86C90/S00∑: OAV [表 4]

5521 ttatttagac ttttaacata tagagctatt tctactgatt tttgcccttg ttctgtcctt 5581 tttttcaaaa aagaaaatgt gttttttgtt tggtaccata gtgtgaaatg ctgggaacaa

5641 tgactataag acatgctatg gcacatatat ttatagtctg tttatgtaga aacaaaigta 5701 atatattaaa gccttatata taatgaactt tgtacta廿 c acattttgta tcagtattat

5761 gtagcataac aaaggtcata atgctttcag caattgatgt cattttatta aagaacattg 5821 aaaaacttga

図面の簡単な説明

[図 1] VEGF— VEGFレセプターシステム、特に、 VEGF— A及び VEGFR— 2 (KDR ZFlk— 1)システムの血管新生のシグナル伝達を示した図。

[図 2]本発明に係る、好ましいヒト VEGFR2 mRNAの 3， UTR領域における siKDR dsRNAの部位と、実験で用いたプライマーの部位を示した図。

[図 3]本発明に係る siKDR、対照の siKDR-mut、及び mockによる、 VEGFR— 2、 VEGFR— 1、 VEGFR— 3遺伝子の発現に対する影響を RT— PCRにより解析した図

[図 4]本発明に係る siKDRと、その中心領域内に 2つの変異を有する別の dsRNA(s iKDRmut)の iRNA酉己列を示した図。

[図 5]本発明に係る siKDR、対照の siKDR-mut、及び mockによる、 VEGFR—2タンパク質及びその下流シグナル伝達の発現を解析した図。

[図 6]siRNA(siKDR、 siKDR— mut、及び mock)導入後の VEGF依存性増殖及び Z若しくは HUVE細胞の生存を MTSアツセィを用いて検討した図。

[図 7]アデノ siKDR及びアデノ siKDRmutの VEGFR— 2 mRNAの発現への影響を、感染後 2、 3、 4日目で検討した図である。

[図 8]アデノ siKDR及びアデノ siKDRmutの VEGFR— 2発現のサイレンスに対する効果的な MOI (感染効率)を評価した図。 [図 9]アデノアデノ siKDR及びアデノ siKDRmutの、ヒト二倍体線維芽細胞と共培養された HUVE細胞の毛細血管様構造の形成に対する影響を評価した図。

[図 10]アデノ siKDR感染及びアデノ siKDRmut感染 HUVE細胞における、毛細血管様構造の接合部分 (joints) (上図）と枝分かれ部分 (paths) (下図)の数を測定した図。

Claims

請求の範囲

[1] VEGFレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的な RNA配列であって、前記 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な RNA配列を有することを特徴とする低分子干渉 RNA。

[2] VEGFレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的な RNA配列であって、前記 VEGFレセプターの発現の抑制に有効な RNA配列を有することを特徴とする低分子ヘアピン RNA。

[3] 前記 VEGFレセプターは VEGFレセプター 2であることを特徴とする、請求項 1又は請求項 2記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA。

[4] 前記 VEGFレセプター 2の 3 '— UTR配列に同一又は相補的な RN A配列を有するものであることを特徴とする請求項 3記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RN

A。

[5] 前記 RNA配列は配列番号 1の配列を有するものであることを特徴とする請求項 3 記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA。

[6] 前記 3'— UTR配列は、配列番号 2の DNAの 4375— 5830塩基であることを特徴とする請求項 4記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA。

[7] 前記 RNA配列は二本鎖 RNAであり、この二本鎖領域は 15塩基以上であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA。

[8] 前記 RNA配列は 3'末端に突出した一本鎖領域を有するものであることを特徴とする請求項 1一 3記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNA。

[9] 対象物における VEGFレセプターの発現を有効に抑制する量の請求項 1又は 2記載の低分子干渉 RNAZ低分子ヘアピン RNAと、

その薬学的に許容される担体と

を有することを特徴とする薬剤組成物。

[10] 前記薬剤組成物は、病的血管新生に関連した疾患を治療するためのものであることを特徴とする請求項 9記載の薬剤組成物。