WO2005061704A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

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WO2005061704A1
WO2005061704A1 PCT/JP2004/019724 JP2004019724W WO2005061704A1 WO 2005061704 A1 WO2005061704 A1 WO 2005061704A1 JP 2004019724 W JP2004019724 W JP 2004019724W WO 2005061704 A1 WO2005061704 A1 WO 2005061704A1
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seq
protein
amino acid
acid sequence
present
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PCT/JP2004/019724
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English (en)
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Eiji Sunahara
Takafumi Ishii
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Definitions

  • the present invention relates to a substance (eg, an antibody) that inhibits the binding between the SEMA4B protein or the like and the P1eXinB1 protein or the like, the SEMA4B protein or the like, and the P1eXinB1 protein.
  • the present invention relates to a substance that inhibits the activity (eg, an antibody), a prophylactic / therapeutic agent or apoptosis-promoting agent containing the substance, and a screening for a cancer-preventive / therapeutic agent or an apoptosis-promoting agent.
  • Recent advances in microarray and oligonucleotide array technologies have enabled comprehensive analysis of gene expression. It has also been predicted that the disease state of cancer can be evaluated using gene microarray profiling data. In fact, it has been reported that leukemia can be classified by gene expression profile in leukemia. By clarifying the gene expression profiles of individual cancer tissues and accumulating the classifications, it is possible to predict the responsiveness to specific cancer treatments and to discover new drug discovery target proteins for specific cancers. It is considered possible. Specifically, when the expression of a certain protein is increased in a certain cancer, (i) the expression level is reduced for patients newly diagnosed as positive for antigen, (ii) And (lii) eliciting a host immune response to the protein to induce antitumor activity.
  • Semaphorin family is a large protein family composed of both secreted and membrane-bound molecules, with at least 19 species in vertebrates and three species in invertebrates. A gene has been reported (Cell 97, 551-552, 1999).
  • Semaphorin famili is known to be involved in a wide range of neurogenesis processes, such as nerve axon guidance and synapse formation.
  • Semaphorin 3B and Semaphorin 3F derived from human belonging to Semaphorin family are reported as tumor suppressor genes (Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 13954-13959, 2001, Cancer Res. 62, 542). -546, 2002, Cancer Res. 62, 2637-2643, 2002).
  • Human Semaphorin 3C has been reported to be upregulated in human lung cancer tissues (J. Surg. Oncol. 72, 18-23, 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 14713-14718, 1997). It has been reported that human Semaphorin 3E is expressed in metastatic cells (Cancer Res. 58, 1238-1244, 1998).
  • SEMA4B Human Semaphorin 4B
  • SEMA4D Human Semaphorin 4D
  • SEMA4D Human Semaphorin 4D
  • SEMA4D Human Semaphorin 4D
  • hundreds of nucleotide sequences including SEMA4B and the like based on gene chip analysis can be used for lung cancer diagnosis or search for compounds for treating lung cancer (W002 / 86443). It has been reported that N0V7, which has 93% homology with SEMA4B at the amino acid level, is upregulated in cancer (TO 02/06329).
  • WO 03/003906 discloses a method for diagnosing bladder cancer using a polynucleotide or polypeptide having a homology of 60% or more with SEMA4B or the like, an antibody, or a compound such as Starry Jung that regulates a bladder cancer-related protein.
  • the ligand of human PlexinBl (hereinafter sometimes abbreviated as PlexinBl; GenBank: AB007867) is SEMA4D (Cell, Vol. 99, pp. 71-80, 1999), and PlexinBl is human hepatocyte proliferation. Forms a complex with the factor (HGF) receptor. When stimulated with SEMA4D, both PlexinBl and HGF receptor are phosphorylated, and cell proliferation is promoted (Nature Cell Biol. Vol. 4, 720 Pp. 724, 2002).
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and found that SEMA4B binds to PlexinBl, and that inhibition of the binding of both promotes apoptosis of cancer cells, SEMA4B was found to inhibit the binding of SEMA4B to PlexinBl. As a result of further studies based on this finding, the present invention has been completed.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 or a portion thereof Inhibits the binding of the peptide or a salt thereof to a protein or a partial peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 Substance,
  • the substance according to the above (1) which is an antibody having an activity of neutralizing cell proliferation stimulation
  • the antibody is a monoclonal antibody, the substance according to the above (2) or (3), (5) a preventive or therapeutic agent for cancer comprising the substance according to the above (1),
  • a cancer cell apoptosis promoter comprising the substance according to the above (1)
  • a cancer cell growth inhibitor comprising the substance according to (1)
  • a cancer cell growth inhibitor comprising a substance that inhibits the activity of a partial peptide or a salt thereof;
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer comprising a substance that inhibits the activity of a partial peptide or a salt thereof,
  • An agent for promoting apoptosis of cancer cells comprising a substance that inhibits the activity of a partial peptide or a salt thereof;
  • the substance inhibits a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a phosphoric acid salt thereof
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer comprising the substance of the above-mentioned [9], (1 2a) Prevention and treatment of cancer comprising the substance described in (9a) above; (13) Agent for promoting apoptosis of cancer cells comprising the substance described in (9) above; 3a] an agent for promoting apoptosis of cancer cells comprising the substance according to the above [9a]; [14] an agent for suppressing proliferation of cancer cells comprising the substance according to the above [9];
  • [15] (a) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 or a portion thereof A peptide or a salt thereof, and (b) a protein or a partial peptide or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, A method for screening a substance that inhibits the binding between the protein (a) or its partial peptide or its salt and the protein (b) or its partial peptide or its salt of (b), [16] (a) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 or ( B ) a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, or a partial peptide or a salt thereof; A kit for screening
  • SEQ ID NO: 26 characterized by using a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 26, a partial peptide thereof or a salt thereof, SEQ ID NO: 26.
  • SEQ ID NO: 26 wherein a gene containing a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof is used.
  • SEQ ID NO: 26 comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or a protein thereof Inhibits the binding of a partial peptide or a salt thereof to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof Cancer prevention / treatment method, cancer cell apoptosis promotion method and / or cancer cell growth suppression method,
  • a cancer characterized by inhibiting the phosphorylation of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof Prevention and treatment of cancer, cancer cell apoptosis promotion method and / or cancer cell growth suppression method,
  • a method for preventing or treating cancer which is characterized by inhibiting the activity of the partial peptide or a salt thereof, a method for promoting apoptosis of cancer cells, and / or a method for suppressing proliferation of cancer cells,
  • [22a] The above-mentioned [22], which is an antibody that also recognizes a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • the method described, [22b] a protein or a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10; The method according to the above (21a) using an antibody against the partial peptide or a salt thereof,
  • the above-mentioned antibody [22] which is an antibody that also recognizes a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, a partial peptide thereof, or a salt thereof. b) the method described,
  • [23] a method for preventing and treating cancer, a method for promoting apoptosis of cancer cells, and / or a method comprising administering to a mammal an effective amount of the substance described in [1] or [9].
  • a method for inhibiting the growth of cancer cells
  • a method for preventing and treating cancer a method for promoting apoptosis of cancer cells, which comprises administering an effective amount of a substance that inhibits the activity of a protein or partial peptide or salt thereof contained therein. Growth suppression method,
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 for producing an agent for preventing or treating cancer, an agent for promoting apoptosis of cancer cells (or) an agent for suppressing the growth of cancer cells
  • the present invention provides a use of a substance having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a substance that inhibits the activity of a partial peptide or a salt thereof.
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 (hereinafter referred to as the protein of the present invention or
  • the protein used in the present invention may be referred to as a human warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chick, egret, pig, sheep, pig, monkey, etc.) cells (eg, hepatocytes, hepatocytes, etc.).
  • Splenocytes nerves Cells, glial cells, spleen i3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells ( Examples: macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts Osteoclasts, mammary gland cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitor cells, stem cells or cancer cells of these cells) or any fibrous tissue where these cells are present, for example, brain, various parts of the brain (eg, , Olfactory bulb, amygdaloid nucleus, basal cerebral nucleus, hippocampus, thalamus, hypothalamus
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is at least 95%, preferably at least about 98%, preferably at least 98% with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples include amino acid sequences having about 99% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1 And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, amino acids substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 4
  • a protein having a sequence and having substantially the same activity as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferred.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes
  • the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 described above.
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. No.
  • Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include, for example, a protein substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 10
  • a protein containing an amino acid sequence and having substantially the same activity as a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferred.
  • substantially equivalent activities include, for example, the receptor binding activity used in the present invention (described later) and the phosphorylation inducing / promoting activity of the receptor used in the present invention.
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, the receptor binding activity used in the present invention and the phosphorylation inducing / promoting activity of the receptor used in the present invention are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times). (More preferably 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the binding activity can be measured according to a method known per se, for example, an EIA method, an immunoprecipitation method or a method analogous thereto.
  • each of the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention is expressed in animal cells as a tagged recombinant protein.
  • the tag FLAG, His, V5, myc, HA and the like are used, and the tag added to the protein used in the present invention ( A tag different from tag A) and a tag (tag B) added to the receptor used in the present invention are used.
  • the phosphorylation-inducing / promoting activity is measured according to a method known per se, for example, the method described in Methods in Enzymology, Vol. 200, pp. 98-107, 1991 or a method analogous thereto.
  • the receptor used in the present invention with a tag eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.
  • a tag eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.
  • the cells After reaction with the protein to be prepared, the cells are disrupted, a cell-free extract is prepared, immunoprecipitated with an anti-tag antibody, and the amount of phosphorylated receptor used in the present invention is determined by It can be measured by a known method (eg, Western plotting method) using a tyrosine antibody or the like.
  • Examples of the protein used in the present invention include: (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 50, preferably 1 to 30) Amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids have been deleted, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably 1 to 5 amino acids, and (ii) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 Two or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) amino acids to which amino acids are added)
  • SEQ ID NO: 1 one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10) Degree, more preferably number (1-5) amino acids, and (iv) SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above,
  • the position of the deletion or substitution is not particularly limited.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 and the like.
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is a human warm-blooded animal (for example, , Guinea pigs, rats, mice, chicks, rabbits, pigs, sheep, sheep cells, monkeys, etc.
  • hepatocytes eg, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, glial cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrous cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells) , 'Mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells Hepatocytes or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, or any tissue in which these cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, Basal sphere, hippocampus, thalamus
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26. Is an amino acid sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, preferably about 90% or more, and preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • substantially equivalent activities include, for example, the protein binding activity and the phosphorylating activity used in the present invention (eg, the activity of being phosphorylated by stimulation of the protein of the present invention).
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the above-mentioned activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, and more preferably 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity of phosphorylation is measured according to a method known per se, for example, the method described in Methods in Enzymology 200, pp. 98-107, 1991, or a method analogous thereto.
  • a receptor eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.
  • a tag eg, FLAG, His, V5, myc, HA
  • the amount of phosphorylated receptor used in the present invention can be quantified by a known method (eg, Western blot method) using an anti-phosphotyrosine antibody or the like.
  • the receptor used in the present invention includes, for example, (i) represented by SEQ ID NO: 26 One or more (eg, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) (Ii) one or more amino acid sequences (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26; Preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably about 1 to 5 amino acids, and (iii) one or two amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 26.
  • More than one amino acid (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5)) Amino acid sequence, (iv) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 (for example, about 1 to 50, preferably 1 to 50) An amino acid sequence in which up to about 30, more preferably about 1 to 10, and even more preferably a number (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or (V) an amino acid obtained by combining them So-called muteins, such as proteins containing sequences, are also included.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • receptor used in the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26, and the like.
  • the receptor used in the present invention may form a complex with a hepatocyte growth factor (HGF) receptor.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling.
  • Tanpagu protein and receptor used in the present invention C-terminal, carboxyl group (-C00H), Karupokishi rate (- C00-), Ami de (-C0NH 2) or ester (- C00R) but it may also be either .
  • R in the ester is, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl and the like.
  • Alkyl group for example, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenylene. Le, alpha-naphthyl and the like.
  • 6 _ 12 Ariru group, e.g., benzyl, phenylene Lou C ⁇ alkyl group or alpha, such as phenethyl - such as naphthylmethyl alpha - Nafuchiru C, etc.
  • _ 9 alkyl group C 7 _ 14 aralkyl group, piperoyloxymethyl group and the like are used.
  • the protein used in the present invention has a lipoxyl group (or lipoxylate) other than the C-terminus
  • the protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention. included.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • an amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) has a protecting group (for example, an acyl group such as a Cw alkanol such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group such as a Cw alkanol such as a formyl group or an acetyl group.
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamic acid-substituted, substituent on the side chain of amino acid in the molecule eg, -0H, -SH, amino group , those imidazole group, I Ndoru group, etc. Guanijino group
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, etc.
  • c Ashiru group such as c M Al force Noiru group such Asechi Le group
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sperm chain is bound.
  • the partial peptide of the protein or the receptor used in the present invention is the partial peptide of the protein or the receptor used in the present invention described above, and is preferably the same as that of the present invention. Any one may be used as long as it has the same properties as the protein or receptor used.
  • Peptides having 100 or more amino acid sequences are used.
  • the partial peptide has one or two or more amino acids in its amino acid sequence (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably about 1 to 5). Of amino acids, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably about 1 to 5) An amino acid is added, or 1 or 2 or more amino acids are added to the amino acid sequence (preferably, about 1 to 20; more preferably, about 1 to 10; Preferably, a number (1 to 5) of amino acids are inserted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence. (Preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids may be substituted with other amino acids.
  • the partial peptide used in the present invention C-terminal carboxyl group (- C00H), carboxylate (- C00-), amide (_C0NH 2) or ester - may be either (C00R).
  • the partial peptide used in the present invention includes those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, N-terminal amino acid residues ( E.g., methionine residue) whose amino group is protected by a protecting group, glutamine residue generated by cleavage of N-terminal in vivo, pyroglutamic acid residue, substitution of side chain of amino acid in molecule Also included are those in which the group is protected by an appropriate protecting group, and those in which a sugar chain is bonded, such as a complex peptide such as a so-called glycopeptide.
  • a carboxyl group or carboxylate
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesul
  • the protein or receptor used in the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cell or tissue by a protein purification method known per se, or a protein encoding a protein. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Also, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the cells When produced from human or mammalian tissues or cells, Alternatively, the cells can be homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract can be purified and isolated by combining chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can usually be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4 'dimethylphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4, dimethylmethoxyphenol) F moc aminoethynole) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various condensation methods known per se.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amide. Get the body.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-protected as a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester.
  • the amino acid can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvirolidone, and halogenated carbons such as methylene chloride and chloroform.
  • Hydrogens alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarpo-enole, isopollinoleoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxy-canoleponyl, C11Z, Br-Z, a Damantyloxycarbonyl, trifluoroacetinole, phthaloynole, honole 5: nore, 2-nitropheninoles norefeinole, dipheninole phosphinochioil, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propynole, ptinole, t-butyl, cyclopentynole, cyclohexynole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl) Alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzinolestenol, 4-methoxybenzinolestenol, 4-monobenzinolester, benzhydryl esterification), hues It can be protected by nasyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, or the like.
  • a linear, branched or cyclic alkyl esterified eg,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for the esterification include, for example, lower (C ⁇ 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrovinylinole group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-1,2,3,6_trimethinolebenzenesnorefoninole, DNP, benzizoleoxymethinole, Bum, Boc, Trt, Fmoc or the like is used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol); Nore, cyanometinole alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid, ester with HOB t).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol
  • Nore cyanometinole alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid, ester with HOB t.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric acid amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, hydrogen anhydride, methanesulfonic acid, and the like.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, hydrogen anhydride, methanesulfonic acid, and the like.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or with sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C to 40 ° C.
  • a desired peptide (protein) chain is added to the amino group side.
  • the desired protein can be obtained in the same manner as the amide of protein or peptide. It is possible to obtain an ester of quality or a peptide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or an amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to give the desired peptide. Can be manufactured. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) and (v).
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA include genomic DNA, genomic DNA library, the above-mentioned cell or tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell or tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA. Any of teriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like may be used.
  • amplification can be carried out directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell'tissue.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein used in the present invention include:
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 5 Encodes a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by D NA,
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions include, for example, 95% or more, and preferably about 98 or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a DNA containing a base sequence having a homology of about 99% or more is used.
  • Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 under high stringent conditions include, for example, a DNA having 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 DNA containing a base sequence is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringency conditions include, for example, a base having 99.9% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA containing a sequence is used.
  • DNAs that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions include, for example, 99.9% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • DNA containing a homologous nucleotide sequence or the like is used.
  • Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. . More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19-4 OmM, preferably about 19-20 mM, and a temperature of about 50-70 ° C, preferably about 60-70 ° C.
  • the conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a sequence DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like;
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes the nucleotide represented by SEQ ID NO: 5
  • the DNA containing the sequence or the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is (iii) a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9; and (iv) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: D N A or SEQ ID NO containing the base sequence represented by 1: D N A, etc. is used which contains the base sequence represented
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell DNA-derived cDNA, the above-described cell DNA-derived library, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11.
  • a DNA containing a part of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention is used.
  • DNAs capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 have the same significance as described above.
  • the polynucleotide encoding the receptor used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the receptor used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell and tissue-derived cDNA, the above-described cell and tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-described cell tissue.
  • Examples of the DNA encoding the receptor used in the present invention include, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35, or a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35 and high stringency. And DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under unique conditions and having substantially the same properties as a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 under high stringent conditions include, for example, about 50% or more, preferably DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about 80% or more, preferably about 90% or more, and preferably about 95% or more. Is used.
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. . More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19-4 OmM, preferably about 19-20 mM, and a temperature of about 50-70 ° C, preferably about 60 ° C. The conditions at ⁇ 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 or the like is used.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Bio Inc.), Mutan TM -K (Takara Bio Inc.), and the like.
  • the method can be performed according to a method known per se, such as the method, the gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker if desired.
  • the DNA may have ATG on its 5, terminal side as a translation initiation codon, and may have TAA, TGA or TAG on its 3, terminal side as a translation stop codon. These translation start codons and translation stop codons are It can also be added using a adapter.
  • Examples of the expression vector for the protein of the present invention include (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) connecting the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by
  • Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmid (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmid (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmid (Eg, pSH19, pSH15), pacteriophages such as ⁇ phage, animals such as retro-inoles, vacsuawinores, and baculovirus, etc., pAl-11, ⁇ 1, Rc / CMV, pRc / RSV, p cDNAI / Neo or the like is used.
  • Escherichia coli-derived plasmid eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmid eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmid Eg
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR open motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter an SRa promoter and the like.
  • the host is Escherichia, tr ⁇ promoter, la. Promoter, recA promoter, ⁇ ⁇ promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host is Bacillus sp., SPOL promoter, SP02 promoter, penP promoter, etc.
  • the host is yeast Preferred are PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may further include an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like, if desired.
  • SV40 ori an SV40 replication origin
  • the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin Resistant Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r , G4 18 resistance).
  • dhfr gene when used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in the dhfr gene, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA ′ signal sequence, an OmpA signal sequence, etc.
  • the host should include a signal sequence, a signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc.
  • yeast MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • insulin signal sequence ⁇ -interferon 'signal sequence, antibody molecule' signal sequence, etc. Available for each.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JMl03 [Nucleic Acids Research, 93 ⁇ 4309 (1981)], JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 Cjournal of Molecular Biology, 41, 459 (1969), C60 0 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus subtilis examples include, for example, Bacillus subtilis (MI) 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] are used.
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 203, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • insect cells for example, if the virus is Ac NPV, the larvae of the night rob moth Spodoptera frugiperda cell (Sf cell), MG1 cell from Trichoplusia ni midgut, High Five TM cell from Trichoplusia ni egg, Mamestra brassicae-derived cell or Estigmena acrea-derived cell .
  • Sf cell a silkworm-derived cell line (Bonibyxmori N cell; BmN cell) or the like is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCCCRL1711), Sf21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dhfr gene-deficient hamster cell CHO cell (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell).
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • dhfr- dhfr gene-deficient hamster cell CHO cell
  • Mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, cone chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like. Also, yeast extract, vitamins and growth promoting factors may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 8 9
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid can be used as a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid can be used as a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia.
  • a drug such as 3-indolylataryl acid can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is yeast, the culture medium may be, for example, a Parkholder (Burkholder) minimal medium [Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77, 4505 (1980)] or 0.5. % Casamino acid [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)].
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8. Cultivation is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation can be used as necessary.
  • Culturing transformants whose host is insect cells or insects.
  • a supplement such as 10% serum serum immobilized in Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) are appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8 volumes, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199 volumes, 519 (1967), 1 9 9 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], etc. H is preferably about 6 to 8. Culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary. Add aeration and agitation.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by, for example, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in hydrophobicity, a method utilizing a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the salt can be converted to a salt by a method analogous thereto, and conversely, when a salt is obtained, it can be converted to a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, anoregininole endopeptidase, protein kinase, dalicosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • a salt thereof the protein used in the present invention
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a partial peptide thereof or a salt thereof this Examples of the substance that inhibits the binding to the receptor used in the present invention include substances that inhibit the binding between the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention (eg, antibodies, peptides, proteins, non-peptides).
  • Antibody specifically reacting with the protein used in the present invention antibody specifically reacting with the receptor used in the present invention, bispecific reacting specifically with the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention
  • Antibody that inhibits the activity of the receptor used in the present invention eg, the protein binding activity used in the present invention, the activity of phosphorylation
  • the activity of the protein used in the present invention eg, the present invention
  • Antibodies that inhibit the receptor binding activity used, the phosphorylation-inducing / promoting activity of the receptor used in the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as the antibodies of the present invention), and the like.
  • the “substance which inhibits the activity of the protein used in the present invention” includes the activity of the protein used in the present invention (eg, the receptor binding activity used in the present invention, Substances that inhibit the receptor phosphorylation induction / promoting activity used in the invention (eg, antibodies, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extractions) Liquid) can be used, and examples thereof include the antibody of the present invention.
  • the substance that inhibits the activity of the receptor used in the present invention eg, the protein binding activity, phosphorylation activity and the like used in the present invention
  • any antibody, peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, etc. may be used.
  • the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody (neutralizing activity antibody) having an activity of neutralizing the stimulation of cancer cell growth caused by the binding of the protein used in the present invention to the receptor used in the present invention.
  • it is an antibody that inhibits the activity (preferably, the activity of being phosphorylated) of the receptor used in the present invention. More preferably, it is a monoclonal antibody.
  • antigen used for preparing the antibody of the present invention examples include amino acids represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 26. Any peptide such as a protein containing an acid sequence or a partial peptide or a salt thereof (synthetic) peptide having one or two or more antigenic determinants can be used. It may be referred to as the antigen of the present invention).
  • the above protein or its partial peptide or its salt can be produced according to the following Reference Examples and known methods. Further, (a) it is known from mammalian tissues or cells such as human, monkey, rat, mouse and the like. Using the method described in (B) chemically synthesized by a known peptide synthesis method using peptide synthesizer, etc., (c) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 1 Alternatively, it can be produced by culturing a transformant containing a DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof.
  • the tissue or cells are homogenized, and the crude fraction (eg, membrane fraction, soluble fraction) is left as it is. It can also be used as an antigen.
  • extraction is performed with an acid, surfactant, alcohol, or the like, and the extract is subjected to close chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Purification and isolation can also be performed by combining them.
  • the synthetic peptide has the same structure as the antigen of the present invention purified from a natural material using, for example, the method (a) described above.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 or any amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 consisting of 3 or more, preferably 6 or more amino acids Peptides containing one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at the position (1) are used.
  • the DNA can be prepared by a known closing method (for example, a method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)). ].
  • the cloning method includes: (1) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 26, or a protein thereof; SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 1 by hybridization using a DNA probe or DNA primer designed based on the amino acid sequence of the salt from the cDNA library A method for obtaining a transformant containing DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by 26 or a salt thereof, or (2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: No .: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or a DNA primer designed based on the amino acid sequence of a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 or a salt thereof, Contains DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7
  • Mammalian cells themselves that express the protein or receptor used in the present invention can also be used directly as the antigen of the present invention.
  • a mammalian cell a natural cell as described in the above (a), a cell transformed by the method as described in the above (c), and the like can be used.
  • the host used for the transformation may be any cell collected from human, sanore, rat, mouse, hamster, etc. SP2 / 0, P3U1, B16 or P388 are preferably used.
  • Natural or transformed mammalian cells expressing the protein or receptor used in the present invention may be suspended in a medium (eg, RPMI1640) or a buffer (eg, Hanks' Balanced Salt Solution) used for tissue culture.
  • a medium eg, RPMI1640
  • a buffer eg, Hanks' Balanced Salt Solution
  • the immunized animal can be injected in a turbid state.
  • any method can be used as long as it can promote antibody production, and intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, or subcutaneous injection is preferably used.
  • the peptide as the antigen of the present invention may be prepared by (1) a known peptide synthesis method, or (2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 2. It can also be produced by cleaving a protein containing the amino acid sequence represented by 6 with an appropriate peptidase.
  • the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described below.
  • the peptide can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when the peptide is obtained by a salt, it is converted to a free form by a known method can do.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,4, -dimethoxyphenoxyhydroxymethyl) phenoxy resin, 4_ (2,, 4, -dimethoxyphenyl) F moc aminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an appropriately protected 1,2, -amino group and a side chain functional group is condensed on the resin according to the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide may be taken out using a chlorotrityl resin, an oxime resin, a 4-hydroxybenzoic acid-based resin, or the like, and the protecting group may be removed by a conventional method to obtain a desired peptide.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carpoimides include DCC, N, N, 1-diisopropyl carpoimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carpoimide, and the like.
  • Activation by these methods involves the direct addition of a protected amino acid to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOOBt, etc.) or a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt.
  • the amino acid protected as a t-ester can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as dimethylene chloride and chloroform
  • Anoreconores, snorreoxides such as dimethinoresnorolefoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, methyl acetate, acetic acid Esters such as ethyl or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1.5 to about 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, tertiary pentynoleoxycanoleponinole, isobonoleenoleoxycanoleponinole, and 4-methoxybenzyloxycarbonyl / , C11-Z, Br_Z, adamantinoleoxycarboxyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, honolemil, 2-ditrophenylsnolephenyl, diphenylphosphinochioyl, Fmoc, etc. It is.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include lower (Cw) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, Examples thereof include groups derived from carbonic acid such as a ziroxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for ethereal dani include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinylinole group, and a t-butyl / le group.
  • phenolic hydroxyl-protecting group for tyrosine examples include Bz1, C1-Bz1,2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy2,3,6-trimethylbenzenesulfur, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethiol) Norenoconore, paranitrophenolone, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid, ester with HOB t)].
  • Activated amino groups of the raw material include, for example, the corresponding phosphoric acid amide.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or with sodium in liquid ammonia Reduction is also included.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of from 20 ° C to 40 ° C. 4.
  • an amide form of the peptide first, after amidating the ⁇ - functional propyloxyl group of the carboxyl terminal amino acid, the peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and then the peptide is added.
  • the peptide was prepared by removing only the protecting group of the ⁇ ⁇ ⁇ -terminal monoamino group of the chain and the peptide (or amino acid) by removing only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group. Condensation in such a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the terminal end of the lipoxy group is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the ester of the desired peptide is obtained in the same manner as the amide of the peptide Can be.
  • the antigen of the present invention can also be used to directly immunize an insoluble one.
  • a complex obtained by binding or adsorbing the antigen of the present invention to a suitable carrier may be immunized.
  • the mixing ratio of the carrier (carrier) and the antigen (hapten) of the present invention is determined by what ratio and what ratio as long as the antibody can be efficiently produced with respect to the antigen of the present invention bound or adsorbed to the carrier.
  • a natural or synthetic polymer carrier commonly used in the production of antibodies to hapten antigens is bound or adsorbed at a weight ratio of 0.1 to 100 with respect to 1 hapten. Things can be used.
  • Natural polymer carriers include, for example, serum albumin of mammals such as sea lions, egrets, humans, etc., and thyroglobulin of mammals such as sea lions, egrets, etc. Hemoglobin, keyhole limpet, and mococyanin are used.
  • Examples of the synthetic polymer carrier include polymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polybutyls, and polypropylenes, and various types of latetus such as copolymers. Also, various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • diazonium compounds such as bisdiazobenzidine that crosslink tyrosine, histidine, and tryptophan; dialdehyde compounds such as dartal aldehyde that crosslink amino groups; diisocyanate compounds such as toluene-1,2,4-diisocyanate; and crosslinks between thiol groups
  • dimaleimide compound such as N, N, 1-phenylenedimaleimide, a maleimide active ester conjugate which crosslinks an amino group and a thiol group, a carpoimide compound which crosslinks an amino group and a carboxyl group, etc. are conveniently used.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one amino group eg, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the thiol group can be introduced by post-reduction, and the maleimide group can be introduced into the other amino group with a maleimide active ester reagent, and then reacted with each other.
  • the antigen of the present invention can be administered to a warm-blooded animal alone or together with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible by an administration method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection. Is done. Complete Freund's adjuvant ⁇ incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Warm-blooded animals include, for example, rabbits, rabbits, dogs, monoremots, mice, rats, sheep, goats, and chickens. Mice are preferably used for monoclonal antibody production.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen of the present invention for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • the antibody-producing hybridoma of the present invention can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells.
  • the antibody titer of the antibody of the present invention in serum can be measured, for example, by labeling the protein or receptor used in the present invention with a radioactive substance or an enzyme and reacting with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. This is done by measuring.
  • the fusion operation is performed by a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, vol. 256, p. 495 (1975 W 200
  • Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like, and P3U1 and the like are preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells used is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubating the mixture and incubating usually at 20 to 40 ° C, preferably at 30 to 37 ° C, usually for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used for screening the antibody-producing hybridoma of the present invention.
  • it is represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 26.
  • a hybridoma culture supernatant was added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein containing an amino acid sequence or a salt thereof or a partial peptide thereof was directly or adsorbed together with a carrier, and then labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 26 And a method for detecting the antibody of the present invention.
  • Screening and breeding of the antibodies of the present invention can usually be performed in animal cell culture media supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, and GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ))
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the separation and purification of the antibody of the present invention is the same as the separation and purification of ordinary polyclonal antibodies. Separation and purification of epiglobulin [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, adsorption / desorption with ion exchanger (eg, 'DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, A specific purification method in which only the antibody is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain an antibody.
  • the antibody of the present invention can be produced by culturing the hybridoma cells in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • the bispecific monoclonal antibody that specifically reacts with the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention can be produced according to a known method.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and the antibody-containing substance of the present invention is collected from the immunized animal.
  • the antibody can be produced by separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier protein and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by crosslinking the carrier protein. If efficient, cross-linking can be performed at any ratio, for example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ thyroglobulin, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 0 01-2 to hapten 1 0, preferably about 1-5 crosslinks A method is used.
  • various condensing agents can be used for crosslinking the hapten and the carrier protein, and glutaraldehyde-carboimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible, itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured, for example, in the same manner as the antibody titer of the hybridoma culture supernatant described in (2) above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the separation and purification of the monoclonal antibody described above.
  • Polynucleotide encoding the protein or receptor used in the present invention or a partial peptide thereof eg, DNA (hereinafter, in the description of antisense polynucleotide, when these DNAs are abbreviated as DNAs of the present invention
  • the antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of)) or a part thereof includes a base sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it contains a captive or substantially complementary base sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
  • Sense DNA is preferred.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a nucleotide sequence having a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is exemplified.
  • (a) in the case of an antisense polynucleotide directed to translation inhibition, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention It is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more, complementary to the complementary sequence of the base sequence of the coding portion (eg, the base sequence near the start codon).
  • the antisense polynucleotide having a homology of at least% is (mouth) an antisense polynucleotide which directs RNA degradation by RNase H, it is possible to reduce the amount of antisense polynucleotide by the phase capture of the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns. 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, most preferably an antisense polynucleotide having a homology of about 95% or more.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, Column ID: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 35 DNA base containing base sequence
  • An antisense polynucleotide having a complementary or substantially complementary base sequence or a portion thereof in the sequence preferably, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 35 or a part thereof which is complementary to the nucleotide sequence of the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35
  • an antisense polynucleotide having The antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA are, for example, chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. May be substituted.
  • the sugar (deoxylipose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′_0_methylation, and the base (pyrimidine, purine) may also be chemically modified.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, gfi column ID: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO :
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 gfi column ID: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO :
  • Such an antisense polynucleotide can hybridize with RNA of the protein gene of the present invention, and has the ability to inhibit the synthesis or function of the RNA or through the interaction with the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention, and polynucleotides capable of specifically hybridizing with the protein-associated RNA of the present invention are in vivo or in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • corresponding means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • the "correspondence" between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a protein usually refers to the amino acids of the (directed) protein derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the end parindromic region or the three end hairpin loop can be selected as a preferred target region, but any region within a protein gene can be selected as a target.
  • any region within a protein gene can be selected as a target.
  • the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is included in the polynucleotide of the target region. On the other hand, it can be said that it is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy D-report, polynucleotides containing D-liposome, N-glycosides of purine or pyrimidine bases and other types of polynucleotides. , Other polymers having non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds ( ⁇ , such polymers are present in DNA or RNA) Found Base pairing (including nucleotides having a configuration that allows base attachment)).
  • They may be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, DNA: RNA hybrids, and may further comprise unmodified polynucleotides (or unmodified oligos).
  • Nucleotides with known modifications, such as those with a label, capped, methylated, and one or more natural nucleotides substituted with analogs, as known in the art Modified with an intramolecular nucleotide, for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, phosphoro Those with thioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (eg, nucleases, nuclease 'inhibitors, toxins, antibodies, Those having side-chain groups such as gnal peptides, poly-L-lysine, etc., sugars (eg, monosaccharides), those having an intercurrent compound (eg, athalidine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxid
  • nucleoside may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purine pyrimidines, acylated purine pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. May be converted to
  • the antisense polynucleotide of the present invention is an RNA, a DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be designed, for example, as follows. That is, antisense polynucleotides that make antisense polynucleotides more stable in cells.
  • the antisense polynucleotides of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes, microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, and lipids, which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( Hydrophobic substances such as, for example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3, or 5 'end of the nucleic acid and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside bonds.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3,5 or 5,5 ends of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNAses.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene dalicol.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide is determined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein or receptor used in the present invention. You can find out.
  • the following are (a) a substance that inhibits the binding between the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention, (b) a substance that inhibits the activity of the protein used in the present invention, (a receptor used in the present invention) (D) the antibody of the present invention, ( e ) the use of the antisense polynucleotide of the present invention, etc.
  • the protein used in the present invention has increased expression in cancer tissue and binds to the receptor used in the present invention.
  • the protein used in the present effort and the receptor used in the present invention are simultaneously expressed in cancer cells (eg, human lung cancer cells, etc.), the invasion ability induced by the receptor used in the present invention is enhanced.
  • Cell proliferation is promoted in a self-contained manner (autocrine proliferation is promoted), contributing to cancer progression and malignancy.
  • the receptor used in the present invention is activated (eg, phosphorylated) by the binding of the protein used in the present invention, and the mechanism leading to activation includes, for example, hepatocyte growth factor (HGF) Tyrosine kinases such as receptors are involved.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the phenomenon of promoting the growth of cancer cells as described above includes, for example, (i) binding of the protein used in the present invention to the receptor used in the present invention, (ii) activity of the protein used in the present invention (this Phosphorylation-inducing / promoting activity of the receptor used in the invention, receptor-binding activity used in the present invention, etc.), (iii) induction of activation of the receptor used in the present invention (eg, phosphorylation activity) It disappears by inhibiting the induction and promotion.
  • the antibody of the present invention and the antisense polynucleotide of the present invention have an apoptosis induction / promotion action, a growth suppression action, and the like of cancer cells.
  • the antibody of the present invention and the antisense polynucleotide of the present invention By binding the antibody of the present invention and the antisense polynucleotide of the present invention to the protein used in the present invention and inhibiting the expression of the protein, the growth of cancer cells is suppressed, and apoptosis is induced and promoted. .
  • a substance that inhibits the binding between the protein used in the present invention and the receptor used in the present invention (b) a substance that inhibits the activity of the protein used in the present invention, (a substance that inhibits the activity of the receptor used in the present invention)
  • Drugs containing the activity-inhibiting substance, (d) the antibody of the present invention (including a salt thereof) or the antisense polynucleotide of the present invention can be used with low toxicity and safety, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer) , Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc.)
  • a pharmaceutical such as a therapeutic agent, a cancer cell apoptosis promoter, and a cancer cell growth inhibitor.
  • the above-mentioned agent containing the antibody or the above-mentioned substance of the present invention has low toxicity and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat).
  • the antibody of the present invention or the above substance may be administered as it is, or may be administered as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or the above substance and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, etc. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or the above substance in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and a suitable dissolution aid, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (Eg, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCu-50 (polyoxyethylene (50 mol) adauct of hydrogenated castor oil)), etc.].
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol Eg, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCu-50 (polyoxyethylene (50 mol) adauct of hydrogenated castor oil)
  • sesame oil, soybean oil, etc. are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. may be used in combination as a dissolution aid, etc.
  • the prepared injection solution is filled into an appropriate ampoule.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody or substance.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to match the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody or substance, per dosage unit form usually 5 to 500 m g, especially 5 to the injection: LOOmg, it is preferable that the antibody or agent 10 ⁇ 250mg is contained in the other dosage form .
  • the dosage of the above agent varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, and the like.
  • the antibody or substance of the present invention is administered once.
  • the amount is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to about 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, It is convenient to administer by intravenous injection, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibody of the present invention and the above substance may be used in combination with other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antagonists (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer It may be used in combination with a sex antibiotic (eg, mitomycin, adriamycin, etc.), a plant-derived anticancer agent (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide and the like.
  • the antibody of the present invention or the substance and the drug may be administered to a patient at the same time or at different times.
  • the antibody of the present invention By using the antibody of the present invention, measurement of the protein or receptor used in the present invention or detection by tissue staining or the like can be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be determined based on the amount of the antigen in the test solution (for example, the amount of the protein or receptor used in the present invention).
  • Any measurement method may be used. For example, a sandwich method, a competitive method, an immunometric method, a nephelometry, etc. are used, but the sandwich method and the competitive method described later are particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • the sandwich method is not particularly limited, and may be determined based on the amount of the antigen in the test solution (for example, the amount of the protein or receptor used in the present invention).
  • the test solution is reacted with the insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and the labeled antibody of the present invention is further reacted (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein or receptor used in the present invention in the test solution can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, but a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like.
  • the antibody used in the primary reaction or the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein or receptor used in the present invention, for example,
  • the antibody used is preferably an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the ratio of the labeled protein or receptor used in the present invention bound to the antibody, the test solution and the labeled protein or receptor used in the present invention in a competitive reaction with the antibody of the present invention is quantified.
  • This reaction method is performed using, for example, a solid phase method.
  • an anti-mouse IgG antibody manufactured by ICN / CAPPEL
  • the plate on which the immobilized antibody is present is labeled with (i) the antibody of the present invention, and (ii) labeled with HRP.
  • HRP activity adsorbed on the solid phase is measured, and the protein used in the present invention is measured.
  • the protein or receptor is quantified.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • Nephrometry measures the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or solution. Even when the amount of the antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, a laser Nefmeter method utilizing laser scattering is preferably used.
  • radioisotope an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a lanthanide element and the like are used as a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance.
  • radioisotopes include [ 125 ⁇ ], [ 131 ⁇ ], [3 ⁇ 4], and C 14 c
  • the enzyme those having a stable and high specific activity are preferable, for example, i3-galactosidase,] 3-gunorecosidase, anorecaliphosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • the luminescent substance include cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, and the like.
  • cyanine fluorescent dyes eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)
  • fluorescamine fluorescein isothiocyanate
  • luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like can be mentioned.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody and the labeling agent.
  • the insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the antibody of the present invention can quantify the protein or receptor used in the present invention with high sensitivity, the physiological function of the protein or receptor used in the present invention is further elucidated, and It is useful for diagnosis of diseases involving the protein or receptor used.
  • Cancer e.g., colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, Brain tumor, hematoma, etc.
  • Cancer e.g., colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, Brain tumor, hematoma, etc.
  • the protein used in the present invention has increased expression in cancer tissues and binds to the receptor used in the present invention.
  • Protein used in the present invention and used in the present invention Since the receptor used is simultaneously expressed in cancer cells (eg, human lung cancer cells, etc.), the proliferation of cells with enhanced invasion induced by the receptor used in the present invention is self-contained. Occurs (promotes autocrine growth) and contributes to cancer progression-malignancy.
  • the receptor used in the present invention is activated (eg, phosphorylated) by the binding of the protein used in the present invention.
  • the mechanism leading to activation includes, for example, hepatocyte growth factor (HGF ) Tyrosine kinases such as receptors are involved.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the above-mentioned phenomenon of promoting the growth of cancer cells includes, for example, (i) binding of the protein used in the present invention to the receptor used in the present invention, (ii) activity of the protein used in the present invention (used in the present invention) (Iii) induction of receptor phosphorylation (promoting activity, receptor binding activity used in the present invention, etc.), (iii) induction of receptor activation used in the present invention (eg, induction and promotion of phosphorylated activity, etc.) Inhibition results in the disappearance of cancer cells, inhibiting the growth of cancer cells and inducing apoptosis.
  • the compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein or receptor used in the present invention includes, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, Spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.)
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, Spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • Prevention and treatment agent, cancer cell apoptosis promoter, cancer cell growth suppression It can be used as an agent and the like.
  • the protein or receptor used in the present invention is useful as a reagent for screening a substance that inhibits the activity of the protein or receptor of the present invention, respectively.
  • the present invention provides a method for screening a substance that inhibits the activity of the protein or receptor used in the present invention, which comprises using the protein or receptor used in the present invention.
  • the protein of the present invention and the receptor used in the present invention may be used as a method for screening a substance that inhibits the activity of the protein used in the present invention (eg, the receptor binding activity used in the present invention). It is expressed in animal cells as a tagged recombinant protein. As the tag, FLAG, His, V5, myc, HA and the like are used, and the tag added to the protein of the present invention (Tag A) is different from the tag added to the receptor used in the present invention (Tag B) Use something Yes.
  • the tag FLAG, His, V5, myc, HA and the like are used, and the tag added to the protein of the present invention (Tag A) is different from the tag added to the receptor used in the present invention (Tag B) Use something Yes.
  • An antibody against tag B is used to immunize (i) a mixture of the above-mentioned tag A-added protein and the above-mentioned tag B-added receptor, or (ii) a test compound, a mixture of the above-mentioned tag A-added protein and the above-mentioned tag B-added receptor.
  • the amount of the protein used in the present invention bound to the receptor used in the present invention was measured by performing Western blotting operation on the resulting precipitate by using an antibody against tag A. Compare cases (i) and (ii).
  • a substance that inhibits the activity of the protein used in the present invention for example, a tag (eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.) at the C-terminus and expressing the receptor used in the present invention in animal cells as a recombinant protein, (i) the protein used in the present invention, or (ii) the test conjugate.
  • a tag eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.
  • the amount is measured by a known method (eg, stamplot method) using an anti-phosphorylated tyrosine antibody or the like, and the results are compared between (i) and (ii) above.
  • the activity of inducing and promoting phosphorylation may be performed according to a method known per se, for example, the method described in Methods in Enzymology, vol. 200, pp. 98-107, 1991, or a method analogous thereto.
  • the activity of the protein used in the present invention in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared with the case of the above (i).
  • the test compound to be inhibited can be selected as a substance that inhibits the activity of the protein used in the present invention.
  • Specific examples of the method for screening a substance that inhibits the activity of a receptor (eg, phosphorylation activity) used in the present invention include, for example, a tag (eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.) Is expressed in animal cells as a recombinant protein, and (i ') the protein used in the present invention, or (ii') the protein used in the present invention.
  • a tag eg, FLAG, His, V5, myc, HA, etc.
  • the activity of the receptor used in the present invention in the case of the above ( ⁇ ′) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 20% or more of that in the above (i ′).
  • a test compound that inhibits 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the receptor used in the present invention.
  • Examples of the cells having the ability to produce the protein or receptor used in the present invention include, for example, a host (plasmid) transformed with a vector containing a DNA encoding the protein or receptor used in the present invention. (Transformant) is used.
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, antibodies, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.
  • substances that inhibit the expression of the protein or receptor gene used in the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer) , Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, blood tumor, etc. It can be used as a preventive / therapeutic agent, a cancer cell apoptosis promoter, a cancer cell growth inhibitor, etc.
  • the polynucleotide eg, DNA
  • the polynucleotide eg, DNA
  • the polynucleotide encoding the protein or receptor used in the present invention is used for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein or receptor gene used in the present invention.
  • Useful as a reagent Useful as a reagent.
  • the screening methods include (iii) culturing cells capable of producing the protein or receptor used in the present invention, and (iv) producing the protein or receptor used in the present invention in the presence of a test compound. Have the ability There is a screening method characterized by performing a comparison with the case where cells are cultured.
  • the expression level of the gene in (iii) and (iv) (specifically, the amount of the protein or receptor used in the present invention or the amount of the protein or receptor used in the present invention) Measure the amount of mRNA and compare.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same as those described above.
  • the amount of protein can be measured by a known method, for example, using the antibody of the present invention to measure the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. it can.
  • the amount of mRNA is measured by a known method, for example, as a probe, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 35; Northern hybridization using a nucleic acid containing a part thereof, or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 35 as a primer Alternatively, it can be measured according to a PCR method using a nucleic acid containing a part thereof or a method analogous thereto.
  • a test compound that inhibits the expression of the gene in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (iii) can be selected as compounds that inhibit the expression of the protein or receptor gene used in the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or receptor used in the present invention, or a cell capable of producing the protein or receptor used in the present invention.
  • Substances obtained using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, Selected from animal tissue extract, plasma, etc.
  • the salt those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the substance obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the composition for oral administration or parenteral administration is as described above.
  • the same compositions as those described in [1] can be mentioned, and they can be produced and used in the same manner. [4] Gene diagnostics
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the protein or receptor used in the present invention can be used, for example, by using it as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, sheep).
  • DNA or abnormal DNA encoding the protein or receptor used in the present invention or a partial peptide thereof in pigs, pigs, pests, pomas, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc. Abnormality) can be detected, and thus is useful as a gene diagnostic agent for, for example, damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis can be performed, for example, by the well-known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Acaaemy of Sciences of the United States of America, ⁇ 8 ⁇ , 2766-2770 (1989)).
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus
  • stomach cancer liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention has low toxicity, it can suppress the function or action of the protein or receptor used in the present invention and the DNA encoding the same in vivo and induce apoptosis of cancer cells.
  • Eg ⁇ eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, victory cancer Cancer, brain tumor, blood tumor Prophylactic and therapeutic agents, cancer cell apoptosis promoters, cancer cell proliferation inhibitors, etc.
  • the above antisense polynucleotide When used as the above agent or the like, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • the above-mentioned antisense polynucleotide is used alone or in a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc. Can be administered orally or parenterally to mammals (eg, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as a scavenger to promote uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or in combination with a carrier such as ribosome (injection), and is intravenously, subcutaneously, etc. May be administered.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, it is generally used in adults. (Body weight 60 kg), about 0.1 to 100 rag of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression.
  • RNA containing a part of the RNA encoding the protein or the receptor used in the present invention, and containing a part of the RNA encoding the protein or the receptor used in the present invention Liposomes and the like can also suppress the expression of the protein or receptor gene used in the present invention, and can suppress the function of the protein or receptor used in the present invention or the DNA encoding the same in vivo.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer
  • a preventive / therapeutic agent for spleen cancer, brain tumor, blood tumor, etc. an apoptosis promoter for cancer cells, a cancer cell growth inhibitor, etc.
  • the double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • a ribozyme can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, vol. 7, p. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of the RNA encoding the protein of the present invention. Examples of a part of the RNA encoding the protein of the present invention include a part (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme.
  • RNA or lipozyme When the above-described double-stranded RNA or lipozyme is used as the above agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • compositions containing protein or receptor used in the present invention are overexpressed in cancer, and the receptor used in the present invention is also expressed in cancer cells.
  • the protein or receptor used in the present invention to activate the patient's immune system can also be used as a cancer vaccine.
  • adoptive immunotherapy which comprises culturing strong antigen-presenting cells (eg, dendritic cells) in the presence of the protein or receptor used in the present invention, phagocytosing the protein, and then returning it to the patient's body.
  • strong antigen-presenting cells eg, dendritic cells
  • the dendritic cells returned to the body can kill cancer cells by inducing and activating cancer antigen-specific cytotoxic T cells.
  • the protein or receptor of the present invention may be, for example, a cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, ovary)
  • a cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, ovary
  • a vaccine preparation for the prevention or treatment of cancer testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, spleen cancer, brain tumor, hematological tumor, etc., safely, in mammals (eg, human, monkey, mouse, rat, rabbit, pig) )
  • the vaccine preparation usually contains the protein or receptor used in the present invention and a physiologically acceptable carrier.
  • the carrier for example, water, saline
  • Liquid carriers such as (including physiological saline), buffers (eg, phosphate buffer), alcohols (eg, ethanol).
  • the vaccine preparation can be prepared according to a usual vaccine preparation manufacturing method.
  • the protein or receptor used in the present invention is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier.
  • the protein used in the present invention and a physiologically acceptable carrier may be separately prepared, and these may be mixed and used at the time of use.
  • Pectin preparations include, in addition to the protein or receptor used in the present invention and a physiologically acceptable carrier, adjuvants (eg, aluminum hydroxide gel, serum albumin, etc.), preservatives (eg, thimerosal, etc.), pain relief Agents (eg, glucose, benzyl alcohol, etc.). Further, in order to promote the production of antibodies against the protein or receptor used in the present invention, for example, cytotoxicity (eg, interleukins such as interleukin-12, interferons such as interferon-1 ⁇ , etc.) is further added. You may mix. When used as a vaccine formulation, the protein or receptor used in the present invention may be used as an active form, or may be modified to increase antigenicity. Denaturation is usually performed by heat treatment or treatment with a protein denaturant (eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea).
  • a protein denaturant eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea
  • the resulting vaccine preparation has low toxicity, and may be usually administered as an injection, for example, subcutaneously, intradermally, or intramuscularly, or may be locally administered to or near a cancer cell mass.
  • the dose of the protein or receptor used in the present invention varies depending on, for example, the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • the dose is usually about 0.1 to 300 mg, preferably about 100 to 300 mg per dose.
  • the vaccine may be administered only once, but to increase antibody production,
  • the pectin preparation can also be administered 2-4 times, with an interval of between week and about 6 months.
  • the present invention relates to a DNA encoding an exogenous protein or receptor used in the present invention (hereinafter abbreviated as an exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the present invention provides a non-human mammal having
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof includes an unfertilized egg, a fertilized egg, a germ containing a spermatozoa and its progenitor cells.
  • an unfertilized egg preferably at the stage of embryo development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized egg cells and generally before the 8-cell stage), calcium phosphate method, electric pulse method It can be produced by transferring the target DNA by a ribofusion method, an aggregation method, a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like.
  • the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germinal cells with a cell fusion method known per se.
  • non-human mammal for example, porcupine, pig, hidge, goat, magpie, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogeny and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice The strain may be BSCSFi strain, BDF strain, B6D2F strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.) or rat (eg For example, Wister, SD, etc.) are preferable.
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base Such DNAs are used, and abnormal DNAs are also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention.
  • a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal which is the same or different from the target animal.
  • a mammal which is the same or different from the target animal.
  • the human DNA of the present invention when transferred, it may be derived from various mammals having the DNA of the present invention having a high homology to the human DNA (eg, egrets, dogs, cats, monoremots, hamsters, rats, mice, etc.).
  • the DNA is constructed by microinjecting the DNA construct of the present invention (eg, a vector) downstream of various promoters capable of expressing DNA into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be created.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni monoleukemia virus, a vaccinia virus or a paculovirus.
  • animal viruses such as Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulates the expression of DNA include (i) viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, . Virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), and (ii) promoters derived from various mammals (eg, humans, puppies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice), for example, Albumin, insulin II, peroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor j3, keratin Kl, K10 and 414, Lagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase 3 I subunit, dystrophin, tartrate-resistant alfa phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor thymic synkin
  • a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body a human peptide chain elongation factor 1a (EF-1a) promoter, a human and a chicken 3-actin promoter, and the like are preferable.
  • EF-1a human peptide chain elongation factor 1a
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferring mammal (generally called terminator).
  • terminator DNAs derived from viruses and various mammals
  • the SV40 terminator of Simian virus or the like is preferably used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are used to further express the target exogenous DNA at 5, 5, upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or Translation area It is also possible to connect 3 'downstream according to the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention may be a human or various mammals (for example, egrets, dogs, cats, monkeys /bone, hamsters, rats, mice, etc.) derived from monocytes, kidneys, thyroid cells, fibers
  • Complementary DNA prepared by known methods as whole or part of genomic DNA from blast cell-derived DNA and various commercially available genomic DNA libraries or from liver, kidney, thyroid cell, and fibroblast-derived RNA It can be obtained as a raw material.
  • an exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after the DNA transfer indicates that all of the progeny of the transgenic animal and the exogenous DNA of the present invention will be present in all of the embryonic and somatic cells. It means to keep NA.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as a DNA-bearing animal in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of DNA indicates that all of the offspring of the animal produce the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • Means to have The offspring of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention include homozygous animals that have the introduced DNA in excess of the exogenous DNA of the present invention in both their germ cells and somatic cells on both homologous chromosomes. Get this sex By crossing the animals, all offspring can be bred and passaged so as to have the DNA in excess.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the endogenous normal DNA is ultimately promoted by promoting the function of endogenous normal DNA. It may develop hyperfunction and can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
  • a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention for example, a cancer ( Examples: colorectal cancer, ⁇ cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, It can also be used for screening tests for prophylactic and therapeutic agents for brain tumors and blood tumors.
  • a cancer Examples: colorectal cancer, ⁇ cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, It can also be used for screening tests for prophylactic and therapeutic agents for brain tumors and blood tumors.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention was confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and was subcultured as an animal having the exogenous DNA in a normal breeding environment. You can do it. Further, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of the DNA means that all the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the embryonic and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and ultimately develops by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • the protein may become functionally inactive refractory, and can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. ) Is a model for elucidating.
  • a preventive / therapeutic agent for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer , Brain tumors, blood tumors, etc.) It can also be used for screening tests of therapeutic agents.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer , Brain tumors, blood tumors, etc.
  • the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the DNA transgenic animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for diseases associated with the protein of the present invention, including the inactive refractory type of the protein of the present invention, using the DNA transgenic animal of the present invention, the above-mentioned test was conducted. It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using the method and the quantitative method. In addition, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which DNA (DNA of the present invention) encoding the protein or receptor used in the present invention is inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention. .
  • Non-human mammal according to item (6) (8) the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent;
  • test compound is administered to the animal described in (7) and the expression of a reporter gene is detected.
  • a screening method is provided.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated may be obtained by artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, or By substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter, referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • ES cells Non-human mammalian embryonic stem cells
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA sequence by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (i3_galactosidase gene), cat (chloramphene).
  • DNA strand having a D NA sequence was constructed so as to destroy the child (hereinafter simply referred to as targeting vector) into the chromosomes of the animal by homologous recombination technique, the obtained ES cells DNA rooster B sequence on Southern hybridization hybridization or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing by a PCR method using the sequence as a primer and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • a reporter gene such as the nicole acetyltransferase gene, or a DNA sequence that terminates gene transcription in the introns between exons (eg, po1yA addition) Signal, etc.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. May be newly established.
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, an alternative pure immunological and genetically
  • BDF mice C57BL6 whose C57BLZ6 mice and C57BL / 6 have improved the number of eggs collected by crossing with DBA / 2 (C57BL
  • C57BL It is also possible to use a mouse established using a combination of C / 6B and DB AZ2, etc.
  • the BDFi mouse has the advantage of large number of eggs collected and its eggs are strong, and also has the advantage of using C57B LZ6 mouse.
  • the ES cells obtained by using these cells can be used to backcross the C57BLZ6 mouse to the C57BLZ6 mouse by back-crossing with the C57B LZ6 mouse when creating a disease model mouse. It can be used advantageously because it is possible.
  • blastocysts are generally used on the 3.5th day after fertilization. An embryo can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing germline chimeras. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture Primary selection of ES cells in the early stage can be performed by gender discrimination. Yes, by enabling the selection of male cells at an early stage, the labor at the beginning of culture can be greatly reduced.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth potential, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast, LIF ⁇ 10000 U / ml
  • carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% Culture at about 37 ° C with carbon dioxide gas and 90% air at the time of subculture.
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA (Preferably, about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA)
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and discard the cultured cells if morphologically abnormal cells are found. ⁇
  • ES cells can be cultured in monolayers up to high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • DNA of the present invention obtained by separating ES cells of the present invention.
  • Expression-deficient cells are useful in in vitro cell biology studies of the proteins of the invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • the non-human mammal the same one as described above is used.
  • the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the present invention as one of the targeting vectors is inactivated by the introduction.
  • the DNA of the present invention can be knocked out. .
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out are combined with a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a targeting vector.
  • the determination can be made by PCR analysis using a primer and a DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the used mouse.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human cells.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or a blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both the cells having the normal DNA locus of the present invention and the cells having the artificially changed DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. Can be obtained by, for example, selecting an individual composed of cells having the DNA locus of the present invention to which the DNA is added by, for example, judging coat color.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals with a heterozygous expression of the protein of the present invention, which are crossed with individuals with a heterozygous expression of the protein of the present invention.
  • An individual having a deficiency in homoexpression of the protein can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method. Compared to non-human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination. In the individual knocked out with the DNA of the present invention in this manner, the animal individuals obtained by the crossing should be confirmed to be knocked out of the DNA, and then reared in a normal breeding environment. Can be.
  • germline acquisition and retention may be performed in accordance with a standard method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where one normal individual and plural homozygous animals are obtained. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods. '
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the disease, for example, cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test conjugate and compared with an untreated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are observed.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested using as an index.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • cancer eg, colon, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, spleen
  • a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and the test compound is administered to a non-administered group.
  • the differences in the degree of onset of cancer and the degree of healing of cancer are observed over time in the above tissues.
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on a disease caused by a deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic prophylactic or therapeutic agent. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can also be used.
  • the compound obtained by the Starry-Jung method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkalis). A salt with a metal, etc.), and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, Salts with propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid
  • Salts with propionic acid fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when administered, it is generally used in adult (with a body weight of 60 kg) breast cancer patients.
  • the single dose of the compound when administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patients.
  • the amount can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the present invention relates to a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. Or a method for screening for a salt thereof.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention is inactive by introducing a reporter gene.
  • a reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same ones as described above can be used, and a galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is preferable.
  • the tissue originally expressing the protein of the present invention may _Galactosidase is expressed in place of the protein. Therefore, the protein of the present invention can be easily prepared by staining with a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside (X-gal). Of the animal in vivo can be observed.
  • a reagent serving as a substrate for j3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-galactopyranoside (X-gal).
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After the reaction at about 30 ° C. for about 30 minutes to 1 hour, the / 3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with an I mM EDTA / PBS solution, and the color may be observed. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity against DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may be a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, etc.) or a base (eg, an alkali metal, etc.) And the like, and particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, etc.
  • a base eg, an alkali metal, etc.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, Maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, Salts with benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used. ,
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, it can be used for cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) Useful.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • a drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing a protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • the compound is administered daily at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a dose calculated based on a body weight of 60 kg can be administered. It is extremely useful for screening a compound that promotes or inhibits or a salt thereof, and is useful for various diseases caused by insufficient DNA expression of the present invention. Investigating or preventing the cause ⁇ It can greatly contribute to the development of therapeutic agents.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it is possible to synthesize the protein specifically and examine its effects on living organisms. Furthermore, by linking an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, a low-molecular-weight molecule having a function of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein itself of the present invention in the body. Can be used as a search system for compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids may have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • G 1 y glycine A 1 a: Alanine
  • Th r Threonine
  • Trt Trityl
  • HOB t 1—Hydroxybenztriazole
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • SEMA 4 B having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4—encodes Ml This shows the base sequence of DNA.
  • SEMA4B indicates the nucleotide sequence of DNA containing the full length gene encoding M3. [SEQ ID NO: 13]
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • T0P10 / SEMA4B- Ml / pCR4- T0P0 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at 1-1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Prefecture since March 4, 2003. It has been deposited with the Center under the accession number FERM BP-8316.
  • TOPIO / SEMMB-M2 / pCR4-T0P0 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at 1-1-1 Tsukuba East Higashi, Ibaraki Prefecture since March 4, 2003 (postal code 305-8566). Deposited with the Center under the accession number FERM BP-8317.
  • T0P10 / SEMA4B-M3 / pCR4 T0P0 was deposited on March 4, 2003 at Tsukuba-Higashi 1-chome, Ibaraki Pref. Deposited at the Center under the accession number FERM BP-8318.
  • Semaphorin 4B Semaphorin 4B
  • Semaphorin 4B-M3 Semaphorin 4B-M3
  • a human non-small cell lung cancer cell line NCI-H1703 purchased from American Type Culture Collection (ATCC) was added to RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES) (Invitrogen) with 10% fetal bovine serum (ATCC). And seeded on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 10,000 cells / well (medium volume 0.1 ml). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas flow, the antisense oligonucleotide was transfected.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the 3 'untranslated region sequence of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10 is hybridized.
  • SEQ ID NO: 13 After designing an antisense oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 13), a phosphorothioated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC, and used for an introduction experiment (hereinafter abbreviated as antisense oligonucleotide).
  • control oligonucleotide As a control, the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the nucleotide sequence represented by Rooster 3 column number: 13 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used (hereinafter abbreviated as control oligonucleotide).
  • Oligofectamine (Invitrogen) diluted antisense oligonucleotide or control oligonucleotide diluted 5-fold with Opti-MEM (Invitrogen) and left at room temperature for 5 minutes And a ratio of 8: 3 (volume ratio), and applied to the plate at a rate of 40 ⁇ L per well.
  • the final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 250 nM.
  • the apoptosis-inducing activity of the above two kinds of oligonucleotides was measured using Cell Death Detection ELISA PUK kit (Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
  • the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) showed about 1.6 times the apoptosis-inducing activity compared to the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and showed a statistically significant difference (P ⁇ 0.01). ) (Table 3).
  • Apoptosis inducing activity (A 4 5 -. A 492 ) Mean value Standard deviation
  • Antisense oligonucleotide 0.538 0.035
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI ⁇ 11703 used in Reference Example 2 was suspended in the same medium as in Reference Example 2, and a 24-well flat bottom tissue culture was performed at a cell density of 60,000 cells per medium (medium volume: 0.6 ml). Plates (BD Falcon) were seeded. 37. In a 5% carbon dioxide gas stream. After culturing in C, the antisense oligonucleotide was transfected according to the method of Reference Example 2.
  • the addition amount of the oligonucleotide was 240 ⁇ l per square well, and two kinds of antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) and two kinds of control oligonucleotides (SEQ ID NO: The oligonucleotides of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) were used.
  • SEQ ID NO: 15 After designing an antisense oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) that hybridizes to the 3, untranslated region sequence of the protein having the indicated amino acid sequence, a phosphorothioated oligonucleotide is synthesized and purified by HPLC. Used for introduction experiments.
  • the reverse sequence (SEQ ID NO: 16) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used.
  • RNA was extracted using a R easy (registered trademark) Mini Total RA Kit (QIAGEN). Using about 300 ng of total RNA as type I, reverse transcription was carried out using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol. To total RNA?
  • the cDNA corresponding to ⁇ 9 ng was designated as type III, and two types of primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) were used with SSY4 Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) to obtain SEMA4B, SEMA4B-Ml, SEMA4B- The expression copy number of the M2 and SEMA4B-M3 genes was measured.
  • the expression amount of the 3-actin gene contained in the same amount of type III cDNA was determined using TaqMan ⁇ -actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
  • control oral oligonucleotide (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) administration groups were 4.1% and 3.4%, respectively, which were statistically significant compared to the non-transfection group. No significant decrease in the expression level was observed.
  • a PCR reaction was performed using two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20).
  • the reaction solution 50 ⁇ 1, l J ul of the cDNA, 2. 5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE Corp.), each 1. primer Omicron mu Micromax (SEQ ID NO: 1 9 and SEQ ID NO: 2 0),
  • the composition contained 200 dNTPs and 25 ⁇ l 2x GC Buffer I (Takara Bio).
  • the PCR reaction was repeated at 95 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes, followed by an extension reaction at 72 ° C for 5 minutes. .
  • 5 U of Ex Taq DNA Polymerase (Takara Bio) was added and incubated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN). This was subcloned into the plasmid vector pCR4-TOP0 (Invitrogen) according to the prescription of the T0P0TA PCR Cloning Kit (Invitrogen).
  • SEMA4B gene (GenBank Accession No. M-0444533 gene; ⁇ _198925 gene; The base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12 show the nucleotide sequences added to the 5 ′ end and 3 ′ end of the
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is completely identical to the SEMA4B protein encoded by the SEMA4B gene (GenBank Accession No. XM_044533 gene; Rei 198925 gene; ⁇ —020210 gene) Matched.
  • SEMA4B-Ml is a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, and an amino acid sequence encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • the protein containing (SEQ ID NO: 7) is named SEMA4B-M2
  • the protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 is named SEMA4B-M3, respectively. did.
  • the 90th g of the DNA sequence (SEQ ID NO: 2) of the DNA encoding SEMA4B (SEQ ID NO: 2) corresponds to a
  • the 111th g corresponds to a
  • 623 The gth is replaced by t, respectively, and the 623th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
  • the 150th g of the base sequence of the DNA encoding SEMA4B is a
  • the 489th g is a
  • 528 The 1st c is replaced by t
  • the 1266th t is replaced by c
  • the 1588th c is replaced by a
  • the 2343th a is replaced by g
  • the 489th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
  • Lys at position 364 in the amino acid sequence of SEMA4B is substituted with Asn.
  • SEMA4B / pCR4-T0P0 is a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by 2.
  • SEQ ID NO: SEMA4B-Ml / pCR4-T0P0 is a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • SEMA4B-M2 / pCR4-T0P0 is a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by 8
  • SEMA4B-M3 / pCR4-T0P0 is a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11. I named each.
  • the transformant having the plasmid SEMA4B / pCR4-T0P0 introduced therein was transformed with Escherichia coli T0P10 / SEMA4B / pCR4-T0P0, and the transformant having the plasmid SEMA4B-Ml / pCR4-T0P0 transformed with Escherichia coli T0P10 / SEMA4B-Ml.
  • the PCR reaction was performed using the cDNA obtained from 3 to 4 ng of the total RNA as the ⁇ type under the same conditions as in Reference Example 3, and the SEMA4B, SEMA4B-Ml, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes were The expression copy number was calculated.
  • the copy number of the 3 / 3-actin gene contained in 1 ng of the total RNA was calculated and used as an internal standard.
  • Table 4 shows the relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the entire gene with the ⁇ -actin gene expression level.
  • Plasmid SEMA4B / pCR4-T0P0 obtained in Reference Example 4 was used as type III, and the SEMA4B gene was ⁇ It was wide.
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was 2 ng of SEMA4B / pCR4-TOPO as type II, 2.5 U of Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 19). : 1) was added to each of 1 ⁇ , dNTPs was added to 200 ⁇ , and 10 x Pfu Buffer was added to 5 ⁇ to obtain a 50 ⁇ 1 solution.
  • PCR reaction a cycle of 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes was repeated 25 times.
  • the PCR reaction product was purified using PCR Purification Kit (QIAGEN), and then treated with restriction enzymes XbaI and EcoRI. Plasmid p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) was also treated with XbaI and EcoRI. Each DNA fragment was purified using a PCR Purification Kit, and a ligation reaction was performed using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio). After introducing the ligation reaction solution into E. coli T0P10, the transformed E.
  • SEMA4B protein SEQ ID NO: 1
  • SEMA4B-Ml protein SEQ ID NO: 4
  • SEMA4B-M2 protein SEQ ID NO: 7
  • SEMA4B-M3 protein SEQ ID NO: 10
  • Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-lie-Asn-Ser-Ser-Cys (SEQ ID NO: 22)] is the amino acid from position 402 to position 412 of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the sequence.
  • Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys is a SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) from position 797 to position 809. This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminus of the amino acid sequence up to the first.
  • KLH keyhole limpet to mosinin
  • the immunized animal used one male male egret KBL: JW (11-week-old, Oriental yeast), the first sensitization was a complete Freund's adjuvant (Dco) suspension, and the second and subsequent times were incomplete Freund's adjuvant ( Difco) suspension was used.
  • the sensitization was performed by subcutaneous injection on the back. One sensitization was performed using 0.5 mg of each antigen, and was repeated three times every 14 days after the first sensitization.
  • the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was detected using the purified peptide antibody prepared in Reference Example 8.
  • NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 10 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and placed in a 10 cm diameter dish. Seeded. The cells were cultured at 37 ° C under a 5% carbon dioxide gas stream.
  • Plasmid pCMV-14 was produced in - SEMA4B 6 mu ⁇ and Plus reagent (Invitrogen) and 0PTI- MEM I (Invitrogen Corp.) were mixed and allowed to stand at room temperature for 15 minutes, LipofectAMINE trans Hue transfection reagent ( Invitrogen) and 0PTI-MEMI were added, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes. This mixture was dropped into the culture solution to continue the culture.
  • the cells were washed with ice-cold PBS, and ice-cold RIPA buffer [50 IBM Tris.HCl buffer, pH 7.5, 150 raM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1% % SDS, 1% deoxycornoleic acid, Complete TM tablet (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail-2 (Sigma)], and left to stand at 4 ° C for 30 minutes.
  • the RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15, OOO rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract.
  • blocking solution such as a 3 mu concentration ⁇ / ⁇ 1, one at 4 ° C
  • the reaction was performed overnight. Subsequently, it was left at room temperature for 1 hour in an HRP-labeled anti-Egret IgG antibody (Amersham-Bioscience) diluted 50,000-fold or 100,000-fold with a blocking solution.
  • a cell-free extract was prepared in the same manner as in Reference Example 9.
  • a cell-free extract 400 ⁇ l was added to a suspension (50 At 1) in which Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) was suspended in an equal volume of RIPA buffer, and the peptide antibody AS-2531 described in Reference Example 8 , AS-2532, AS-2591 or AS-2592 was added to 5 g of the mixture, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight.
  • SDS-PAGE sample buffer (62.5 ⁇ Tris' hydrochloric acid buffer, ⁇ 6.8, 20% glycerol, 2% SDS , 0.02% promophenol and 2.5% 2-mercaptoethanol), heat at 95 ° C for 5 minutes, and apply 5 ⁇ l or 10 / z 1 on a 10% acrylamide gel.
  • SDS-PAGE sample buffer (62.5 ⁇ Tris' hydrochloric acid buffer, ⁇ 6.8, 20% glycerol, 2% SDS , 0.02% promophenol and 2.5% 2-mercaptoethanol), heat at 95 ° C for 5 minutes, and apply 5 ⁇ l or 10 / z 1 on a 10% acrylamide gel.
  • Detection was based on the method described in Reference Example 9.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham) was prepared by diluting mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) to 0.2 ⁇ g / ml or 0.2 g / ml with a blocking solution as the primary antibody. -Bioscience) diluted 50,000-fold or 50,000-fold with a blocking solution as a secondary antibody Using.
  • Peptide antibodies AS-2531, AS- 2532, AS- when having conducted the immunoprecipitated with either 2591 and AS 7 2592 also a specific band resulting from SEMA4B protein near the molecular weight 100kD was observed.
  • Lung cancer cell lines NCI-H2228, NCI-H1651, NCI-H358, NCI-H23 and NCI-HI 703; ovarian cancer cell lines SKOV-3 and TOV-21G; prostate cancer cell line DU145; and knee cancer cell line PANC- 1 was cultured in two Petri dishes having a diameter of 10 cm. One plate of each dish was dispersed with trypsin / EDTA (Invitrogen), and the number of cells was counted. Based on the number of cells counted, add 1 ml of ice-cold RIPA buffer (described in Reference Example 9) to 5 x 10 6 cells to the remaining one petri dish, and incubate at 4 ° C. Left for 30 minutes.
  • trypsin / EDTA Invitrogen
  • the RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15, OOO rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract.
  • a resin prepared by crosslinking the peptide antibody AS-2531 described in Reference Example 8 with ProteinG-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) was prepared. Suspended in buffer. 400 ⁇ l of the above-mentioned cell-free extract was added to the suspension 301, followed by stirring at 4 ° C.
  • the ProteinG-Sepharose 4FF coprecipitated fraction was washed with RIPA buffer, suspended in the sample buffer 301 for SDS-PAGE described in Reference Example 10, heated at 95 ° C for 5 minutes, and 20 ⁇ l was added to 10% The samples were subjected to SDS-PAGE on an acrylamide gel. Detection was performed according to the method described in Reference Example 9 using the peptide antibody AS-2532.
  • NEMA-H2228, NCI-H358, NCI-H23, SKOV-3, DU145 and PANC-1 are derived from SEMA4B protein with a molecular weight of around 100 kD in each cell line. Specific bands were observed. This revealed that the SEMA4B protein was highly expressed in the above six types of cancer cell lines.
  • NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 2 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES. After seeding on a 6-well plate, the cells were cultured at 37 ° C. under a 5% carbon dioxide gas stream.
  • the cells recovered from the other well were diluted to 0.7 cells per well, and then seeded on a 96-well plate.
  • the culture was continued at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas flow while changing the G418 selection medium every 3 or 4 days until the cell density reached about 50%.
  • inoculate 2 ⁇ l of the 48 ⁇ l plate continue culturing until the cell density becomes 50% or more, and use the cell lysate prepared from 1 ⁇ l of cells as described above for Western blotting.
  • a clone that highly expressed the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was selected, and a cell line SEMA4B / H358 that stably expressed SEMA4B was obtained.
  • SEQ ID NO: 1 A clone that highly expressed the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was selected, and a cell line SEMA4B / H358 that stably expressed SEMA4B was obtained.
  • Reference Example 1 3 A clone that highly expressed the
  • the human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228 and NCI-H358 and SEMA4B / H358 described in Reference Example 12 were each seeded on a 10 cm diameter Petri dish and cultured until they became subconfluent. After each cell was washed with PBS, PBS containing 0.5% BSA and 5 mM EDTA was added, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes to disperse the cells. Next, buffer A (HBSS (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen) containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide) was used to a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • buffer A HBSS (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen) containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide
  • AS-2532 or non-immune rabbit (Jackson) was added to a final concentration of 10 g / ml and left on ice for 3 hours.
  • the cells were suspended in buffer A containing 10 ⁇ g / ml of Alexa488-labeled anti-Peacock IgG antibody (Molecular Probes), and left on ice for 2 hours.
  • analysis was performed using FACScan (BD Biosciences). As a result, all cells were stained specifically for the rabbit antibody AS-2532, and the SEMA4B, SEMA4B-Ml, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 proteins were localized on the cell surface. Became clear.
  • NCI H3 5 8 10% fetal bovine serum (JRH Co.), was suspended NCI H3 5 8 with ImM containing sodium pyruvate and 25 niM HEPES RPMI- 1640 medium (Invitrogen), 1 Ueru per 8 X 10 3 cells density ( so that a medium liquid amount 80 mu 1), the NCI-H3 5 8 were seeded in 9 6-well flat bottom tissue culture plates (BD Falcon) in a 5% carbon dioxide gas flow to 37 ° C De ⁇ culture.
  • ImM containing sodium pyruvate 25 niM HEPES RPMI- 1640 medium (Invitrogen), 1 Ueru per 8 X 10 3 cells density ( so that a medium liquid amount 80 mu 1)
  • the NCI-H3 5 8 were seeded in 9 6-well flat bottom tissue culture plates (BD Falcon) in a 5% carbon dioxide gas flow to 37 ° C De ⁇ culture.
  • Apoptosis inducing activity (A 4 5 -. A 492 ) Mean value Standard deviation
  • Antisense oligonucleotide 0.467 0.029
  • NCI-H1703 Reference Example 2
  • NCI H 35 8 human non-small cell lung cancer cell lines Example 15
  • apoptosis was examined whether induced by antisense oligonucleotides introduced.
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES was used for NCI-H2228.
  • ACL-4 medium (ATCC) containing 10% FBS was used for NCI-H1651.
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 25 mM HEPES was used.
  • Each cell was suspended in the culture medium of their respective, 7.5 ⁇ 10 3 cells per Uweru (NCI- H2228), 7.5X10 3 pieces (NCI-H1651) and 5X10 3 cells (NCI - H23) cell density (medium solution (Amount of 125 ⁇ ) was seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) and cultured overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • medium solution Amount of 125 ⁇
  • the antisense oligonucleotide described in Reference Example 2 (SEQ ID NO: 13) and the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) / zg was diluted with OPTI-MEM I (Invitrogen), mixed with Plus reagent (Invitrogen) 0.751, and left at room temperature for 15 minutes.
  • OPTI-MEM I Invitrogen
  • Plus reagent Invitrogen
  • 4 / x1 of LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) diluted with 0PTI-MEM I. was added and left at room temperature for 15 minutes.
  • the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotide was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
  • the antisense oligonucleotide was 1.58 times (NCI-H2228), 1.21 times (NCI-H1651) and 1.25 times (NCI-H23) compared to the control oligonucleotide used as a negative control. ),
  • the risk factors were calculated as P ⁇ 0.05 (NCI-H2228), P ⁇ 0.05 (NCI-H1651) and P ⁇ 0.01 (NCI-H23), indicating a statistically significant difference. (Table 7, Table 8, and Table 9)
  • Apoptosis-inducing activity (A 405 — A 492 ) Mean standard deviation
  • Apoptosis induction activity (A 405 _A 492 ) Mean standard deviation
  • Cis induction activity (A 405 — A 492 ) Mean standard deviation
  • Antisense oligonucleotides 1.351 0.058
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI-H2228 was obtained in Reference Example 8.
  • the cells were treated with AS-2531 and AS-2532, and the apoptosis-inducing activity of these rabbit antibodies was measured. .
  • the cells were suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing HEPES, and seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) coated with type I collagen to a cell density of 4 ⁇ 10 3 cells / cell.
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • the egret peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 obtained in Reference Example 8 and the non-immune egret IgG (Jackson) were diluted with PBS, and the final concentration of each antibody was 15 ⁇ g / ml, 45 g / ml and 150 ⁇ g / ml. ⁇ g / ml was added to each culture. After culturing was further continued for 5 days, the apoptosis-inducing activity of the above-mentioned sagi peptide antibody was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
  • SEMA4B protein SEMA4B-Ml protein
  • SEMA4B-M2 protein SEMA4B-M3 protein
  • PlexinBl cDNA was obtained by PCR.
  • the composition of the reaction solution was prepared by using the above cDNA 11 as type II, 1.25 U of Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE), and two kinds of primers (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28). ) was added to each of 2 ⁇ ⁇ , dNTPs at 200 / ⁇ ⁇ , and 2x GC Buffer I (Takara Bio) for ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ to give a volume of 20 ⁇ l.
  • each PCR reaction product was separated on a 0.8% agarose gel prepared by adding crystal violet to 1.6 / zg / ml, and the MinElute Gel Extraction Kit ( (QIAGEN).
  • pCR-XL-PLXNB1-NT was co-digested with two types of restriction enzymes (EcoRI and SnaBI) to obtain a DNA fragment of about 2 kbp (DNA fragment-1).
  • pCR-XL-PLXNB1-CT was co-digested with three kinds of restriction enzymes (SnaBI, Dral and Xbal) to obtain a DNA fragment of about 4. lkbp (DNA fragment-2).
  • pcDNA3.1 (+) plasmid Invitrogen
  • DNA fragment-1, DNA fragment-2 and DNA fragment-3 were separately purified using MinElute Gel Extraction Kit, and then mixed at a volume ratio of 2: 2: 1 to obtain 5 ⁇ 1. Further, 5 ⁇ l of solution I of DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio) was added and reacted at 16 ° C. for 30 minutes. Then, 2 ⁇ l was extracted and E. coli T0P10 was transformed. Analyze the sequence of individual clones and use the full-length PlexinBl cDNA A plasmid (pcDNA3.1 (+)-PLX Bl-NT2) containing a cDNA fragment corresponding to positions -95 to 5840 of the above was obtained. ,
  • a PCR reaction was performed using the above plasmid (pcDNA3.1 (+)-PLXNB1-NT2) as type III.
  • the reaction composition in this reaction was as follows: 10 ng of the above plasmid, 1.25 U of Pfu Turbo DNA Polymerase, 1 ⁇ of each of the two primers (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), and 200 ⁇ L of dTPs. ⁇ Add 2x GC Buffer I ( ⁇ ) to make a volume of 20 ⁇ 1.
  • the PCR reaction is repeated at 95 ° C for 1 minute, followed by a cycle of 95 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 5 minutes 30 times, followed by a reaction at 72 ° C for 7 minutes.
  • PCR reaction products were separated on 0.8% Agaro Sugeru was ⁇ Ka ⁇ so that crystal violet and 1 ⁇ 6 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, MinElute Gel Extraction Kit and the DNA of length of 4 ⁇ 5kbp Purified using This was subcloned into the plasmid vector pCR-XL-T0P0, introduced into E. coli T0P10, and then selected in LB agar medium containing kanamycin.
  • the total length of PlexinBl was determined according to the prescription of the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE). T at the 3483rd position of the cDNA was converted to C, and a plasmid pCR-XL-PLXNB1-ECD-Ml into which a silent mutation was introduced was prepared. On the other hand, the constant (Fc) region of human immunoglobulin was added to the C-terminus. To express the extracellular region of PlexinBl as a protein, the human Fc region was amplified by PCR.
  • the composition of the reaction solution was as follows: Human spleen-derived cDNA (MTC Panel, BD CLONTECH), 11, Pfu Turbo DNA Polymerase, 1.25 U, and two types of primers (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34), 0.5 ⁇ each. ⁇ , 200 / ⁇ of dNTPs, and 10 ⁇ l of 2x GC Buffer I were added to make a liquid volume of 20 ⁇ l.
  • the cycle of 95 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute is repeated 30 times, and the reaction at 72 ° C for 7 minutes is further performed. Added.
  • PCR reaction product The product was purified using the MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) and subcloned into a plasmid vector pCR4-TOP0 (Invitrogen).
  • the transformed Escherichia coli T0P10 was selected on an LB agar medium containing kanamycin, and the sequence of each clone was analyzed. As a result, a plasmid pCR4-TOP0-Fc containing a cDNA fragment encoding the human Fc region was obtained.
  • pCR4-TOP0-Fc was co-digested with two types of restriction enzymes (BamHI and Hindi II) to obtain a DNA fragment of about 0.7 kbp (DNA fragment-4).
  • the aforementioned pCR-XL-PLXNB1-ECD-Ml was digested with BamHI to obtain a DNA fragment of about 4.5 kbp (DNA fragment-5).
  • pcDNA3.1 (-) plasmid (Invitrogen) was co-digested with two types of restriction enzymes (BamHI and Hindlll) to obtain a DNA fragment of about 5.4 kbp (DNA fragment-6).
  • DNA fragment-4, DNA fragment-5 and DNA fragment-6 were separately purified using MinElute Gel Extraction Kit, and then mixed at a volume ratio of 2: 2: 1 to 5 ⁇ l. 5 ⁇ l of Solution I of DNA Ligation Kit ver. 2 was added, and allowed to react at ⁇ 16 ° C., 2 ⁇ l was extracted, and Escherichia coli T0P10 was transformed. Analysis of individual clones selected on LB agar medium containing ampicillin revealed that plasmid pcDNA3.1 (-)-PLXNB1-ECD, which can express PlexinBl chimeric protein with the human Fc region linked to the C-terminal side / Fc.
  • the human fetal kidney-derived cell line HEK293 (1.5 ⁇ 10 6 cells) described in Reference Example 5 was suspended in 10 ml of DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH), and type I collagen was After seeding on a 10 cm diameter dish (BD Falcon) coated with E. coli, the cells were cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • DMEM medium Invitrogen
  • JRH fetal bovine serum
  • type I collagen After seeding on a 10 cm diameter dish (BD Falcon) coated with E. coli, the cells were cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • Example 1 The plasmid pcDNA3.1 (-)-PLXB1-ECD / Fc6ig obtained in _ (2) was diluted with 0PTI-MEMI (Invitrogen) to 200, and the FuGENE6 transfection reagent was used.
  • the plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG (described in Reference Example 7) was transfected into the human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 to prepare a cell-free extract.
  • Example 11 A mixture of PLXNBl / Fc 200 / zl prepared in (3) or 200 ⁇ l of the negative control and 250 ⁇ l of the above cell-free extract was prepared, and the protein G described in Reference Example 10 was prepared. 50 ⁇ l of -Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) suspension was added, and the mixture was stirred at 4 ° C for a while.
  • the Protein G-Sepharose 4FF coprecipitated fraction was washed with RIPA buffer (described in Reference Example 9) and suspended in 50 sample buffers for SDS-PAGE (described in Reference Example 9). After heating at 95 ° C for 5 minutes, 20 ⁇ l was subjected to SDS-PAGE on a 7.5% acrylamide gel.
  • the AS-2591 antibody (described in Reference Example 8) was diluted to 3 g / ml with the blocking solution described in Reference Example 9, or a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) was added to the blocking solution described above. The solution diluted to 2 ⁇ g / ml was used as the primary antibody.
  • the human embryonic kidney-derived cell line HEK293 (2 ⁇ 10 6 cells) described in Reference Example 5 was suspended in 10 ml of DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH), and the diameter coated with type I collagen was used. After seeding on lOcni's Petri dish (Iwaki Glass Co., Ltd.), the cells were cultured overnight at 37 ° C under 5% carbon dioxide gas flow.
  • PlexinBl / Fc fusion protein stably expressing HEK293 cell line PLX B1-Fc / HEK293
  • Example 2 PLXNB1-Fc / HEK293 obtained in (1) was suspended in 10 ml of DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH), and a type I collagen-coated 10 cm diameter Petri dish was suspended. After seeding on a dish (Iwaki Glass Co., Ltd.), the cells were cultured overnight at 37 ° C under a 5% carbon dioxide gas stream. The next day, the cells were washed with PBS, replaced with 10 ml of Ml "medium (Invitrogen) containing non-essential amino acids (Invitrogen) and ITS-X supplements (Invitrogen), and the culture was continued for another two days.
  • DMEM medium Invitrogen
  • JRH fetal bovine serum
  • the culture solution is filtered through a 0.45 ⁇ filter (BD Falcon), and the molecular weight cutoff is approximately ⁇ ) using an ultra-concentrator ⁇ , ( ⁇ .
  • This concentrated solution was named PLX Bl / Fc (lot No. 2) and used for the following studies:
  • Each cell was seeded in a Petri dish (BD Falcon) with a diameter of 10 cm and cultured until it became subconfluent. Was washed with PBS, PBS containing 0.25% BSA and 2.5 mM EDTA was added, and the cells were allowed to stand at room temperature for 15 minutes to disperse the cells, containing 50 ⁇ l of the aforementioned PLXNBl / Fc (lot No. 2). 3 ⁇ 10 6 cells were suspended in 2 ⁇ 0 ⁇ l buffer ⁇ (described in Reference Example 14) prepared as described above, and left to stand for 3 hours on ice.
  • the recombinant SEMA4B protein is located in the extracellular domain of SEMA4B and its C-terminal.
  • a vector was constructed to express a protein tagged with FLAG-tag or 6 x His-tag, and a protein expression system was constructed using BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System (Invitrogen).
  • BAC-TO-BAC Baculovirus Expression System Invitrogen.
  • PCR reaction was repeated at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes for 30 cycles.
  • the PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, collected using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), cloned into pCR2.1-TOP0 (Invitrogen), and cloned into pCR2.1 / SEMA4B-FLAG and pCR2.1 / SEMA4B. -Got His. After confirming the nucleotide sequence, pCR2.
  • 1 / SEMA4B-FLAG and P CR2. 1 / SEMA4B- His a were simultaneously digested out with EcoR I (Takara Bio Inc.) and Hind III (Takara Bio Inc.), respectively, ⁇ moth Rosugeru electric
  • the gel was electrophoresed, and the DNA digestion fragment was recovered using the QIAquick Gel Extraction Kit.
  • pFASTBACl Invitrogen
  • a ligation reaction was performed using Ligation High (Toyobo), and a beta-pFB / SEMA-FLAG with FLAG-tag added to the C-terminal or a vector pFB / SEMA-His with 6 XHis-tag added to the C-terminal was prepared.
  • Ligation High Toyobo
  • a beta-pFB / SEMA-FLAG with FLAG-tag added to the C-terminal
  • a vector pFB / SEMA-His with 6 XHis-tag added to the C-terminal was prepared.
  • Example 3_ (1) Using the recombinant SEMA4B-FLAG protein prepared in Example 3_ (1) as an immunogen, a rabbit heron polyclonal antibody was prepared. Emulsion prepared by mixing equal amounts of PBS solution of SEMA4B-FLAG protein and complete adjuvant in Freund was added to rabbits (Japanese white, female, 3 kg). Immunized with protein / one bird. For the second and subsequent immunizations, protein emulsions replaced with Freund's incomplete adjuvant were prepared in the same manner, and booster immunizations were repeated seven times every two weeks.
  • Pre-immunization 4th and 6th immunization One week after the immunization, blood was collected from the ear vein and an increase in serum antibody titer was confirmed by ELISA using an immunoplate coated with SEMA4B-FLAG protein. One week after the final immunization, blood under anesthesia was collected from three puppies under anesthesia, and 65.1 ml from No. 1 puppies, 79.5 ml from No. 2 puppies, and 68.0 from No. 4 puppies. ml of antiserum was obtained.
  • the recombinant SEMA4B-His protein described in Example 3 (1) was purified using HiTrap NHS-Activated HP (Amersham-Bioscience). Was adsorbed on an antigen column immobilized in the company. After washing the column with PBS, the column was eluted with 0.1 M Glycine-HC1 / 0.15 M NaCl '(pH 3) . The eluate was neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 8). Dialysis at 4 ° C overnight. Anti-SEMA4B polyclonal antibody was purified and obtained.
  • PlexinBl binding activity obtained in the presence of non-immune egret IgG was defined as 100%, and the binding inhibitory activity of the above-mentioned egret anti-SEMA4B polyclonal antibody was calculated.
  • the median of the obtained fluorescence intensities was used for the calculation of PlexinBl binding activity.
  • the NCI-H358 cell line described in Reference Example 5 or the SEMA4B / H358 cell line described in Reference Example 12 was transformed into an RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 1% fetal calf serum (JRH), ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES. ) And seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 5 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l. At the same time as the seeding, the rabbit herb anti-SEMA4B polyclonal antibody No. 1, No. 2, No.
  • Example 4 or the non-immune rabbit herb IgG (Jackson) obtained in Example 3 (2) was used at a final concentration of 1 g / ml, 10 The mixture was added at z g / ml or 100 ⁇ g / ml and cultured at 37 ° C. for 6 days in a 5% carbon dioxide gas stream. After the completion of the culture, 20 ⁇ l of Cell Counting Kit-8 (Dojindo) was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 90 minutes in a 5% carbon dioxide gas stream. Then, the difference in absorbance at 450 nm and 620 nm was measured. Using the absence of the antibody as a negative control, the cell proliferation inhibitory activity of the above-mentioned Egret polyclonal antibody was calculated.
  • Non-immune rabbits did not show statistically significant growth inhibitory activity on either cell line (Table 10, Table 11), indicating that the growth inhibitory activity was specifically induced by SEMA4B It became clear.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 according to the present invention (the present invention)
  • an antibody having an activity of neutralizing the stimulation of cancer cell proliferation brought about by the binding of the protein to the receptor is, for example, a cancer (eg, colon Pain, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, brain tumor, Agent for the prophylaxis or treatment of liquid tumors, etc.), apoptosis promoters
  • a cancer eg, colon Pain, breast cancer, lung cancer,
  • the quality preferably, a neutralizing active antibody etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus
  • It can be safely used as a preventive / therapeutic agent for cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor, blood tumor, etc., a cancer cell apoptosis promoter, a cancer cell growth inhibitor, etc. .

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Abstract

本発明は、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質、そのような物質を含有する癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などを提供する。

Description

明細書 癌の予防 ·治療剤 技術分野 .
本発明は、 S EMA 4 Bタンパク質等と P 1 e X i n B 1タンパク質等との結 合を阻害する物質 （例、 抗体） 、 S EMA 4 Bタンパク質等および P 1 e X i n B 1タンパク質の活性を阻害する物質 （例、 抗体） 、 該物質を含有する癌の予防 •治療剤またはアポトーシス促進剤、 癌の予防 ·治療剤またはアポトーシス促進 剤のスクリーニングなどに関する。 背景技術
近年のマイクロアレイ ·オリゴヌクレオチドアレイ技術の進歩により、 遺伝子 発現の網羅的な解析が可能となってきた。 癌においても遺伝子のマイクロアレイ プロフアイリングデータでその病態が評価しうることも予見され、 実際、 白血病 においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告 されている。 また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、 その分 類を積み重ねることによって、 特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定 の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考 えられる。 具体的には、 ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められ る場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して （i)その発現量を低下さ せる、 （ii)機能を抑制する、 （lii)該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在 化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。 これと同時に、 抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、 患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。 以上のように発現プロ ファイル解析は、 癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうる ものと期待されている。
Semaphorinファミリ一は、 分泌型分子と膜結合型分子の両方から構成される大 きなタンパク質フアミリーで、脊椎動物で少なくとも 19種、非脊椎動物で 3種の遣 伝子が報告されている （Cell 97巻， 551-552頁， 1999年） 。
Semaphorinフアミリ一は神経軸索誘導やシナプス形成などに代表される広範囲 な神経発生過程に関わることが知られている。 近年になり、 Semaphorinファミリ 一の免疫系への関与 （Trends in Immunol. 22巻， 670- 676頁， 2001年） や、 臓器 発生 ·血管新生における関与が明らかになりつつある。 Semaphorinフアミリーに 属するヒト由来の Semaphorin 3B、 Semaphorin 3Fは、 癌抑制遺伝子として報告さ れている （Proc. Natl Acad. Sci. USA 98卷， 13954 - 13959頁， 2001年、 Cancer Res. 62卷， 542- 546頁， 2002年、 Cancer Res. 62卷， 2637- 2643頁， 2002年） 。 ヒ ト Semaphorin 3Cは、 ヒ ト肺がん組織で発現が亢進しているという報告がある （J. Surg. Oncol. 72巻， 18 - 23頁， 1999年、 Proc. Natl Acad. Sci. USA 94卷， 14713 - 14718 頁， 1997年） 。 ヒ ト Semaphorin 3Eは転移性細胞で発現していると報告されている (Cancer Res. 58卷， 1238- 1244頁， 1998年） 。
ヒ ト Semaphorin 4B (以下、 SEMA4Bと略すこともある；配列番号： 1 ) は、 ヒ ト Semaphorin4D (以下、 SEMA4Dと略すこともある） とアミノ酸レベルで相同性が 41 %であり、 低酸素条件下で発現が上昇する遺伝子のひとつとして報告されている (W0 02/46465号公報） 。 また、 ジーンチップ解析に基づき SEMA4Bなどを含む数百 種の塩基配列が、 肺癌の診断または肺癌を治療する化合物の探索などに使用でき るとの報告もある （W0 02/86443号公報） 。 SEMA4Bとアミノ酸レベルで 93%の相同 性を有する N0V7は、 癌で発現亢進していることが報告されている （TO 02/06329 号公報） 。 SEMA4Bなどと相同性 60%以上を有するポリヌクレオチドやポリべプチ ドを用いる膀胱癌の診断法、 抗体、 膀胱癌関連タンパク質を調節する化合物のス タリーユングなどが、 W0 03/003906号公報に報告されている。また、 ヒ ト PlexinBl (以下、 PlexinBlと略することもある； GenBank： AB007867) のリガンドは SEMA4D であること （Cell、 99卷、 71〜80頁、 1999年） 、 および PlexinBlはヒト肝細胞増 殖因子（HGF)受容体と複合体を形成しており、 SEMA4Dで刺激すると PlexinBlおよ ぴ HGF受容体の両方がリン酸化され、 細胞の増殖が促進されること （Nature Cell Biol. 4卷、 720頁- 724頁、 2002年） が知られている。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、 癌細胞の増殖阻害を誘導する安全 な薬剤が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 SEMA4Bと PlexinBlとが結合すること、 両者の結合を阻害することにより癌細胞のアポトー シスが促進されること、 SEMA4Bに対する抗体が SEMA4Bと PlexinBlとの結合を阻害 することを見出した。 この知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害する物質、
〔2〕 物質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である上記 〔 1〕 記載の物質、
[ 2 a ) さらに、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩も認識する抗体である上記 〔2〕 記載の物質、
〔3〕 物質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞 増殖刺激を中和する活性を有する抗体である上記 〔1〕 記載の物質、
〔4〕 抗体が、 モノクローナル抗体である上記 〔2〕 または 〔3〕 記載の物質、 〔5〕 上記 〔1〕 記載の物質を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
〔6〕 上記 〔1〕 記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、 〔7〕 上記 〔1〕 記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔8〕.配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してな る癌細胞の增殖抑制剤、
〔8 a〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有して なる癌の予防 ·治療剤、
〔8 b〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有して なる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔9〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性 を阻害する物質、
〔9 a〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の遣 伝子の発現を阻害する物質、
〔1 0〕 物質が、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸酉己列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩のリン酸ィヒを阻害する活性を有する抗体である上記 〔9〕 記載の物質、
〔1 1〕 抗体が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細 胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である上記 〔1 0〕 記載の物質、
〔1 2〕 上記 〔9〕 記載の物質を含有してなる癌の予防，治療剤、 〔1 2 a〕 上記 〔9 a〕 記載の物質を含有してなる癌の予防.治療剤、 〔1 3〕 上記 〔9〕 記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、 [ 1 3 a ] 上記 〔9 a〕 記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤 〔1 4〕 上記 〔9〕 記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
[ 1 4 a ] 上記 〔9 a〕 記載の物質を含有してなる癌細胞の增殖抑制剤、
[ 1 4 b ) 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩をコ 一ドするポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有するァンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防 ·治療剤
〔1 4 c〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドまたはその塩をコ 一ドするポリヌクレオチドに相捕的または実質的に相補的な塩基配列またはその —部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌細胞のアポトー シス促進剤、
〔1 4 d〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩をコ 一ドするポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌細胞の増殖抑制 剤、
〔1 5〕 (a) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b)配列番号： 2 6 で表きれるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上記 (a) のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 上記 （b) の タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のス クリーニング方法、 〔1 6〕 (a) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0 で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（b) 配列番号： 2 6 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とする 、 上記 (a) のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 上記 （b) のタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害する物質の スクリーニング用キット、
〔1 6 a〕 上記 〔1 5〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔1 6〕 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる物質、
〔1 6 b〕 上記 〔1 6 a ] 記載の物質を含有してなる癌の予防 ·治療剤、 癌細胞 のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤、
〔1 7〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドま たはその塩の活性を阻害する物質のスクリ一二ング方法、
[ 1 7 a ] 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の 遺伝子を用いることを特徴とする、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分 ぺプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する物質のスクリ一ユング方法、
〔1 8〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含 有することを特徴とする、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチド またはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング用キット、
〔1 8 a〕 上記 〔1 7〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔1 8〕 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる物質、 〔1 8 b〕 上記 〔1 8 a〕 記載の物質を含有してなる癌の予防 ·治療剤、 癌細胞 のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤、
〔1 9〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質も しくはその部分ぺプチドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の 予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促進方法および （または） 癌細胞の增殖 抑制方法、
〔2 0〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記 〔1 9 〕 記載の方法、
〔2 1〕 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩のリ ン酸化を阻害することを特徴とする癌の予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス 促進方法および （または） 癌細胞の増殖抑制方法、
[ 2 1 a ] 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴と する癌の予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促進方法および （または） 癌細 胞の増殖抑制方法、
〔2 2〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表 されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタン パク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記 〔2 1 〕 記載の方法、
[ 2 2 a ] さらに、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩も認識する抗体である上記 〔2 2〕 記載の方法、 〔2 2 b〕 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記 〔 2 1 a〕 記載の方法、
[ 2 2 c ] さらに、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたは その塩も認識する抗体である上記 〔2 2 b〕 記載の方法、
〔2 3〕 哺乳動物に対して、 上記 〔1〕 または 〔9〕 記載の物質の有効量を投与 することを特徴とする癌の予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促進方法およ び （または） 癌細胞の増殖抑制方法、
〔2 3 a〕 哺乳動物に対して、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7また は配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防 ·治療方法、 癌細胞の アポトーシス促進方法おょぴ （または） 癌細胞の増殖抑制方法、
〔2 4〕 癌の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤および （または） 癌細 胞の増殖抑制剤を製造するための、 上記 〔1〕 または 〔9〕 記載の物質の使用、
〔2 4 a〕 癌の予防'治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤おょぴ （または） 癌 細胞の増殖抑制剤を製造するための、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活 性を阻害する物質の使用などを提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質 (以下、 本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称すること もある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ 、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例、 肝細胞、 脾細胞、 神経 細胞、 グリア細胞、 脾臓 i3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス 細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維 細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナ チュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは 間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくは それらの細胞が存在するあらゆる糸且織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁 桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血 、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク 質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては 、 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8 %以上 、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては
、 配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有するァミ ノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 7で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては
、 配列番号： 7で表されるァミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。 配列番号： 7で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する ァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミ 酸配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
ァミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center I or Biotechnology information Basic Local Alignment Search Tool) を用レヽ、 以下の条件 （期待値 = 10；ギヤップを許す；マトリクス =BL0SUM62；ブイノレタリ ング =0FF) にて計算することができる。
上記の実質的に同質の活性としては、 例えば （後述の） 本発明で用いられるレ セプター結合活性、 本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導 ·促進活性な どが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に 、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 本発明で用いられる レセプター結合活性、 本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導 ·促進活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好まし くは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質 の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
上記結合活性の測定は、 自体公知の方法、例えば EIA法、免疫沈降法またはこれ らに準じる方法に従って測定することができる。 具体的には、 本発明で用いられ るタンパク質および本発明で用いられるレセプターのそれぞれを、 タグを付加し た組換え型タンパク質として動物細胞で発現させる。該タグとしては、 FLAG、 His 、 V5、 myc、 HAなどが用いられ、本発明で用いられるタンパク質に付加するタグ （ タグ A) と、 本発明で用いられるレセプターに付加するタグ （タグ B ) とは異な るものを用いる。 タグ Bに対する抗体で、 上記タグ A付加タンパク質および上記 タグ B付加レセプターの混合液を免疫沈降し、 得られた沈殿物を、 タグ Aに対す る抗体を用いてウェスタンプロッティング操作を行うことにより、 本発明で用い られるレセプターに結合した本発明で用いられるタンパク質の量を測定すること ができる。
上記リン酸化誘導 ·促進活性の測定は、 自体公知の方法、 例えば Methods in Enzymology 200卷、 98頁一 107頁、 1991年に記載の方法またはそれに準じた方法に 従って測定する。 具体的には、 例えばタグ （例、 FLAG、 His, V5、 myc、 HAなど） を c末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として 動物細胞に発現させ、 本発明で用いられるタンパク質と反応させた後、 細胞を破 砕し、 無細胞抽出液を調製し、 抗タグ抗体で免疫沈降し、 リン酸化された本発明 で用いられるレセプターの生成量は、 抗リン酸ィ匕チロシン抗体などを用いて公知 の方法 （例、 ウェスタンプロット法など） により測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1 ) (i) 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましく は 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個 程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii)配列番号： 1で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好 ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入 されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0.個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸 で置換されたアミノ酸配列、または（V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含 有するタンパク質などのいわゆるムティン、 （2 ) (i) 配列番号： 4、 配列番号 ： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ま しくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 4、配列番 号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列に 1または 2個のアミノ酸 が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号 ： 1 0で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個のアミノ酸が他のアミノ酸で置 換されたアミノ酸配列、または（V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有す るタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が揷入、 欠失または置換されている場合、 その揷入
、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されなレ、。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるァミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあ げられる。
配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明で用いられるレセプターと称するこ ともある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮト リ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例、 肝細胞、 脾細胞、 神 経細胞、 グリア細胞、 勝臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハン ス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊 維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、'肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球 、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしく は間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしく はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 脾臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢 血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパ ク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ る。
配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しレ、。
上記の実質的に同質の活性としては、 例えば本発明で用いられるタンパク質結 合活性、 リン酸化される活性 （例、 本発明のタンパク質の刺激によりリン酸化さ れる活性など） などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に (例、 生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 上 記の活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 よ り好ましくは 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タ ンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リン酸化される活性の測定は、 自体公知の方法、 例えば Methods in Enzymology 200卷、 98頁一 107頁、 1991年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って測定 する。 具体的には、 例えば、 タグ （例、 FLAG、 His、 V5、 myc、 HAなど） を C末端に 付加した本発明で用いられるレセプターを、 糸且換え型タンパク質として動物細胞 に発現させ、 本突明で用いられるタンパク質と反応させた後、 細胞を破砕し、 無 細胞抽出液を調製し、 抗タグ抗体で免疫沈降する。 リン酸化された本発明で用い られるレセプターの生成量は、 抗リン酸ィヒチロシン抗体などを用いて公知の方法 (例、 ウェスタンプロット法など） により定量することができる。
本発明で用いられるレセプターとしては、例えば、 （i)配列番号： 2 6で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1 〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 2 6で表されるアミ ノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程 度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミ ノ酸が付加したァミノ酸配列、 （iii)配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入 されたァミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたアミノ酸配列、または （V)それらを組み合わせたアミノ酸配列を 含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が揷入、 欠失または置換されている場合、 その揷入 、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本発明で用いられるレセプターの具体例としては、 例えば、 配列番号： 2 6で 表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
また、本発明で用いられるレセプターは、肝細胞増殖因子（HGF)受容体と複合 体を形成していてもよい。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 本発明で用いられる タンパグ質およびレセプターは、 C末端がカルボキシル基（-C00H) 、 カルポキシ レート（- C00-) 、 アミ ド （-C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであってもよ い。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピル、 n—ブチルなどの。 アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエ二.ル、 α—ナフチル などの。6_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー C ァ ルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C，_9アルキル基など の c 7_14ァラルキル基、 ピパロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポ キシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォェン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C wアルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば- 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾール基、 ィ ンドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ル基などの c Mアル力ノィル基などの c ァシル基など） で保護されているもの
、 あるいは精鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含 まれる。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの部分ペプチド （本発明で用 いられる部分ペプチド） としては、 前記した本発明で用いられるタンパク質また はレセプターの部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用いられ るタンパク質またはレセプターと同様の性質を有するものであればいずれのもの でもよい。
例えば、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの構成アミノ酸配列 のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個 以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配 列を有するペプチドなどが用いられる。
また、 上記部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1 〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに 好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個 程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸が他の アミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （- C00H) 、 カルボキシレート （- C00— ) 、 アミド （_C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れ であってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレート） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプターまたは部分ペプチドの塩と しては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ 金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸 、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプター、 またはその部分ペプチド またはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタン パク質の精製方法によって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 ま た、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩、 またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる 。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂 、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジル アルコール樹脂、 4ーメチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒド 口キシメチルメチルフエ二ルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂 、 4— ( 2， ， 4 ' ージメ トキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂 、 4一 ( 2 ' ， 4， ージメ トキシフエ二ノレ一 F m o cアミノエチノレ） フエノキシ 樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 《—ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク 質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶 液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部 分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用でき.る各種活 性化試薬を用いることができ、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N， N，ージイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N '- ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらに よる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t， H O O B t ) とともに 保護ァミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または H O B tエス テルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行な つた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ ロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約 _ 2 0〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミ ノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒ ドリン反応を用いたテス トの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰 り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイ'ミダゾールを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにす ることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチルォキシ カルポェノレ、 イソポルニノレオキシカルボニル、 4ーメ トキシベンジルォキシカノレ ポニル、 C 1一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチノレ、 フタロイノレ、 ホノレ 5：ノレ、 2—ニトロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジフエ二ノレ ホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ、 プチノレ、 tーブチル、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4— ニトロべンジノレエステノレ、 4—メ トキシベンジノレエステノレ、 4一クロ口べンジノレ エステル、 ベンズヒ ドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 （C^ 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカ ルポ-ル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられ る。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロ ビラ二ノレ基、 t一プチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12— B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメ トキシ 一 2， 3, 6 _トリメチノレベンゼンスノレホニノレ、 DNP、 ベンジゾレオキシメチノレ 、 Bum, B o c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 ， 4, 5 _トリクロ口フエノーノレ、 2, 4一ジニトロフエノ一ノレ、 シァノメチノレ アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N ーヒ ドロキシフタルイミ ド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0°C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾ一ノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチノレス關 ルフイ ド、 1， 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのような カチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基と して用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去さ れ、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 ， 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処 理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミ ド化して保護した後 、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプ チド鎖の Ν末端の α—アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ぺプ チドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分べ プチドとを製造し、 これらのタンパク質またはぺプチドを上記したような混合溶 媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得 られた保護タンパク質またはべプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 この粗 タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望のタンパク質またはべプチドのァミド体を得ることがで きる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用 いられる部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の （i) (v) に記載された方法が挙げられる。
( i ) M. Bodanszky およぴ M. A. Ondetti , ペプチド ' シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年, (ii) Sc roederおよぴ Luebke、ザ ·ペプチド (The Peptide)， Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によつて遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 .組織由来の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total R NAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P CR法と略称する） によって増幅することもできる。
本発明で用いられるダンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、
(i)配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で 表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配 列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質 的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、
(ii) 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 5 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(iii)配列番号： 8で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 8 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(iv) 配列番号： 1 1で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NAであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイプリ ダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8以上、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 5で表される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイブリ ダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる D NAどしては、 例えば、 配列番号： 1 1で表される塩基配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。 ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる 。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 （i)配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する D NAまたは配列番号： 3で表される塩基配列を含有する D NAなどが、 （ii) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N A としては、 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する D NAまたは配列番号： 6で表される塩基配列を含有する D NAなどが、 （iii)配列番号： 7で表される アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 8 で表される塩基配列を含有する D NAまたは配列番号： 9で表される塩基配列を 含有する D NAなどが、 （iv) 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質をコードする D NAとしては、 配列番号： 1 1で表される塩基配列 を含有する D N Aまたは配列番号： 1 2で表される塩基配列を含有する D N Aな どが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA ) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を 含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノ ム D NAライブラリー、 前記した細胞'組織由来の c D NA、 前記した細胞'組 織由来の c D NAライブラリー、 合成 D N Aのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配 列を含有する D NAの一部分を有する D NA、 または配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイス トリンジェ ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実 質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする D N Aの一部分を含有する D N Aなどが用いられる。 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される 塩基配列とハイブリダイズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およぴハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるレセプターをコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 しだ本発明で用いられるレセプターをコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは D NAである。 D NAとしては、 ゲ ノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の c D NA、 前記した細胞 ·組織由来の c D NAライプラリー、 合成 D NAのいずれでもよい 。
ライブラリーに使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 · »織より total R N Aまたは m R N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T— P C R法と略称する） によって增幅することもできる。
本発明で用いられるレセプターをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番 号： 3 5で表わされる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 3 5で表わ される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする塩基配列 を含有し、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質 的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NAなどが挙げられる。
配列番号： 3 5で表される塩基配列とハイストリンジヱントな条件下でハイプ リダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 3 5で表される塩基配列と 約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 好ましくは 約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ 一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる 。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジヱントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 O m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする D NAとしては、 配列番号： 3 5で表される塩基配列を含有する D NAなどが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、 部分ペプチド （以下、 これ らをコードする D NAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単 に本発明のタンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAのクロ 一ユングの手段としては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を 有する合成 D NAプライマーを用いて P C R法によって増幅する力、 または適当 なべクターに組み込んだ D N Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコ ードする D NA断片もしくは合成 D NAを用いて標識したものとのハイブリダィ ゼーシヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼーションの方法は、 例 ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et a丄. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライ ブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。
D N Aの塩基配列の変換は、 P C R、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (Takara Bio (株） ） 、 Mutan™- K (Takara Bio (株） ） 等を用いて、 0DA-LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに 準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードする D NAは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することが できる。 該 D NAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 ま た 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての T AA、 T GAまたは T AGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 D NAァ ダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322， p BR32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 110， p TP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH19， p SH15) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロゥイノレス， ワクシュアウイノレス ， バキュロウィルスなどの動物ゥイノレスなどの他.、 pAl— 11、 ρΧΤ1、 Rc/CMV、 pRc/RSV、 p cDNAI/Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、 CMV (サイ トメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロモ 一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r ρプロモーター、 l a。プロモーター、 r e cAプロモ ター、 Ρ^プロモー ター、 l p pプロモーター、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 p e nPプロモータ 一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター 、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞で ある場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 N e o rと略称する場合がある、 G4 1 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ' シグナル配列 、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 a—了 ラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合 は、 MF a ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞であ る場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン 'シグナル配 列、 抗体分子'シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、例えば、ェシェリヒア 'コリ （Escherichia coli) K 1 2 · DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷， 160 (1968)〕 ， J Ml 0 3 [Nucleic Acids Research, 9¾ 309 (1981) ] , J A 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120卷， 517(1978)〕 ， HB 1 0 1 Cjournal of Molecular Biology, 41卷 ，459(1969)〕 ， C 6 0 0 [Genetics, 39卷， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス .サプチルス （Bacillus subtilis )M I 1 1 4 [Gene, 24卷， 255(1983)〕， 2 0 7 - 2 1 [Journal of Biochemistry, 95 卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2, AH 2 2 R—, NA8 7 - 1 1 A, DKD— 5 D, 2 0 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC Y C 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell； Sf細胞） 、 Trichoplusia niの中腸由 来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが Bm PVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bonibyxmori N細胞； BmN細胞） などが用い られる。 該 Sf細胞としては、 例えば、 Sf9細胞 （ATCCCRL1711) 、 Sf21細胞 （以上 、 Vaughn, J.L.ら、 イン.ヴイボ (In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用い られる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 315卷， 592 (1 985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， V e r o , チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チヤィ- ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r -) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエローマ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Pro Natl. Acad. Sci. USA ， 69卷， 2110 (1972)や Gene, 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
バチルス属菌を开質転換するには、例えば、 Molecular & General Genetics, 168 卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182-187 (1991) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75卷， 1929 (1978)などに記載の方法に従って行な うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6， 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263-267(1995) (秀潤社努行） 、 Virology, 52卷， 456(1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。 宿主がェシヱリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモ-ゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 パレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリゥム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成長促進因子など を添カ卩してもよレ、。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい 9
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 し Miller , Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 力 S好ましレヽ 。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 ーィ ンドリルアタリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 パークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77卷， 4505 (1980) 〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻 , 5330 (1984) ) が挙げられる。培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。培 養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌 を力 [Iえる。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する傺、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195， 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等 の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に 調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じ て通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、'例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [： Science, 122卷， 501 (1952)〕 ， DME M培地 [Virology, 8卷， 396 (1959) ] , R P M I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Medical Association, 199卷， 519 (1967〕， 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1950)〕 などが用いられる。 H は約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間 行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本努明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、·リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリ トン X - 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよレ、。培養液中にタンパク質が 分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上 清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ-ティークロマトグラフィーな どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
力べして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプ シン、 キモトリプシン、 ァノレギニノレエンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 ダリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウェスタンブロッテイングなどにより測定することができる。
「配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分べプチ.ドまたはその塩 （本発明で用いられるタンパク質） と 、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 （本発明で 用いられるレセプター） との結合を阻害する物質」 としては、 本発明で用いられ るタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合を阻害する物質 （例、 抗 体、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細 胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液など） であればいずれでもよく、 例えば 、 本発明で用いられるタンパク質に特異的に反応する抗体、 本発明で用いられる レセプターに特異的に反応する抗体、 本発明で用いられるタンパク質および本発 明で用いられるレセプターに特異的に反応する二重特異性抗体、 本発明で用いら れるレセプターの活性 （例、 本発明で用いられるタンパク質結合活性、 リン酸化 される活性など） を阻害する抗体、 本発明で用いられるタンパク質の活性 （例、 本発明で用いられるレセプター結合活性、 本発明で用いられるレセプターのリン 酸化誘導 ·促進活性など） を阻害する抗体 （以下、 これらをまとめて本発明の抗 体と称することもある） などが挙げられる。
「本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質」 としては、 本発明で 用いられるタンパク質の活性 （例、 本発明で用いられるレセプター結合活性、 本 発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導 ·促進活性など） を阻害する物質 （ 例、 抗体、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産 物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液など） であればいずれでもよく、 例えば、 本発明の抗体などが挙げられる。
「本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質」 としては、 本発明で 用いられるレセプターの活性 （例、 本発明で用いられるタンパク質結合活性、 リ ン酸化される活性など） を阻害する物質 （例、 抗体、 ペプチド、 タンパク質、 非 ぺプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液など） であればいずれでもよく、 例えば、 本発明の抗体などが挙げられ る。
本発明の抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクロ ナル抗体の何れであっても よい。
本発明の抗体として好ましくは、 本発明で用いられるタンパク質と本発明で用 いられるレセプターとの結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性 を有する抗体 （中和活性抗体） である。 または、 本発明で用いられるレセプター の活性 （好ましくは、 リン酸化される活性など） を阻害する抗体である。 さらに 好ましくは、 モノクローナル抗体である。
以下に、 本発明の抗体の抗原の調製法、 および該抗体の製造法について説明す る。
( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまた はその塩と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する （合成） ペプチドな ど何れのものも使用することができる （以下、 これらを単に本発明の抗原と称す ることもある） 。
上記タンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩は、 後述の参考例や公 知の方法に準じて製造でき、 さらに、 （a) 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウスな どの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用い て調製、 （b)ぺプチド ·シンセサイザ一等を使用する公知のぺプチド合成方法で 化学的に合成、 （c) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番 号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチ ドまたはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによって も製造される。
(a)該哺乳動物の組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合、その組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 粗分画物 （例、 膜画分、 可溶性画分） をそのま ま抗原として用いることもできる。 あるいは酸、 界面活性剤またはアルコールな どで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー 、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのク 口マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。
(b)化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上 述の（a)の方法を用いて天然材料より精製した本発明の抗原と同一の構造を有す るもの、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列において 3個以上、 好ましくは 6 個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列を 1 種あるいは 2種以上含有するペプチドなどが用いられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号 ： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質またはその塩を製造する場合、該 DNAは、公知のクロ一エング 方法 〔例 は、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕 に従って作製することができる。 該クローニング方法とは、 (1) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もし くは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質またはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインした DNAプローブまた は DNAプライマーを用い、 cDNAライブラリ一からハイブリダイゼーション法により 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配 列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコー ドする DNAを含有する形質転換体を得る方法、 または （2) 配列番号: 1、 配列番 号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表され るァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩のアミノ酸配列に基づきデ ザインした DNAプライマーを用い、 PCR法により配列番号： 1、 配列番号： 4、 配 列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質またはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体 を得る方法などが挙げられる。 、
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを発現する哺乳動物細胞自体 を、 本発明の抗原として直接用いることもできる。 哺乳動物細胞としては、 上記 (a) 項で述べたような天然の細胞、 上記 （c) 項で述べたような方法で形質転換 した細胞などを用いることができる。 形質転換に用いる宿主としては、 ヒ ト、 サ ノレ、 ラッ ト、 マウス、 ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも 良く、 HEK293、 C0S7、 CH0 - Kl、 NIH3T3、 Balb3T3、 FM3A、 L929、 SP2/0、 P3U1、 B16 、 または P388などが好ましく用いられる。 本発明で用いられるタンパク質または レセプターを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、 組織培養に用いられる培地 （例、 RPMI1640) または緩衝液 （例、 Hanks' Balanced Salt Solution) に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法 としては、 抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、 静脈 内注射、 腹腔内注射、 筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。 本発明の抗原としてのペプチドは、 （1 ) 公知のペプチドの合成法に従って、 または （2 ) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるァミノ酸配列を含有するタンパク質を適当 なぺプチダーゼで切断することによって製造することもできる。
該ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによつ ても良い。 すなわち、 該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と 残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することに より目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離と してはたとえば、 以下に記載された方法等が挙げられる。
Uノ M. Bodanszky およひ M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年） (ii) Sckroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965 年）
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラ フィ一、液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて該ぺプチドを精製 単離することができる。 上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、 公 知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合は、 公 知の方法によつて遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用い ることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキ シメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベンジルォ キシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹 脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフヱニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリ ルアミ ド樹脂、 4― ( 2，， 4， -ジメ トキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノ キシ樹脂、 4 _ ( 2，， 4，-ジメ トキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノ キシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ，，一アミノ基と側 鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに、 公知 の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチドを 切り出すと同時に各種保護基を除去し、 目的のペプチドを取得する。 あるいはク ロロトリチル樹脂、 ォキシム榭脂、 4ーヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、 部 分的に保護したペプチドを取り出し、 更に常套手段で保護基を除去し目的のぺプ チドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ぺプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができ、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては D C C、 N， N，一ジイソプロピルカルポジイミ ド、 N—ェチルー N'— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが挙げられる。 これら による活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 H O O B tなど） と ともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加する力 または、 対称酸無水物また は HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護されたァ ミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護されたァミノ 酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用 しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえば N， N—ジメチ ルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルァセトアミ ド、 N—メチルピロリ ドンなどの 酸アミ ド類、 塩ィヒメチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフ /レオ口エタノーノレなどのァノレコーノレ類、 ジメチノレスノレホキシドなどのスノレホキシ ド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフランなどのェ 一テル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はべプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適 宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜約 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化され たアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5ないし約 4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン 反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことな く縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返 しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾール を用いて未反応アミノ酸をァセチルイ匕して、 後の反応に影響を及ぼさないように することができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 B o c、 ターシャ リーペンチノレォキシカノレポ二ノレ、 イソボノレエノレォキシカノレポ二ノレ、 4ーメ トキシ ベンジルォキシカルボ二/レ、 C 1一 Z、 B r _ Z、 ァダマンチノレオキシカルポ二 ル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホノレミル、 2—二トロフエニルスノレフ ェニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙げられる。 カルボキ シル基の保護基としては、 たとえば アルキル基、 C3_8シクロアルキル基、 C 7-14ァラルキル基、 2—ァダマンチル、 4—二トロベンジル、 4ーメ トキシベンジ ル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシルおよびべンジルォキシカルボエルヒドラジ ド、 ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒドラジドなどが挙 げられる。
セリンおよぴスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテノレ化に よって保護することができる。 このエステノレ化に適する基としては例えばァセチ ル基などの低級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベン ジルォキシカルボ二ル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基な どが挙げられる。 また、 エーテルィ匕に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒドロビラ二ノレ基、 t -プチ/レ基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば B z 1、 C 1 -B z 1 , 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t-ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 To s、 4ーメ トキシー 2， 3 ， 6—トリメチルベンゼンスルホュル、 DNP、 B om, Bum, Bo c、 T r t、 Fmo cなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフェノール、 2, 4, 5—トリクロロフエノール、 2， 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチ ノレァノレコーノレ、 パラニトロフエノーノレ、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t) とのエステル] などが挙げられる。 原 料のアミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミ ドが挙 げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば P d—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 20°C 〜40°Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チォ ァニソ一ノレ、 メタクレゾ一ノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチルスルフイ ド、 1, 4一 ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が 有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2， 4— ジニトロフエニル基はチオフヱノール処理により除去され、 トリプトファンのィ ンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール 、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸 化ナトリゥム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシル末端ァミノ 酸の α—力ルポキシル基をァミド化した後、 ァミノ基側にぺプチド鎖を所望の鎖 長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の 一アミノ基の保護基のみを除いた ぺプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （またはアミ ノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護ペプチド を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ペプチドを得 ることができる。 この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要 画分を凍結乾燥することで所望のぺプチドのァミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るには力ルポキシ末端ァミノ酸の α—カルボキシル 基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのアミド 体と同様にして所望のぺプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の抗原は、 不溶ィ匕したものを直接免疫することもできる。 また、 本発明 の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよレ、。 該担体 （ キャリアー） と本発明の抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結合あるいは吸 着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どのようなものをどの ような比率で結合あるいは吸着させてもよく、 通常ハプテン抗原に対する抗体の 作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン 1に対し 0 . 1〜 1 0 0の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することが できる。 天然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒトなどの哺乳動物 の血清アルブミンや例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチログロプリン、 例え ばゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジなどの哺乳動物のヘモグロビン、 キーホールリン ペットへモシァニンなどが用いられる。 合成の高分子担体としては、 例えばポリ アミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアクリル類、 ポリビュル類、 ポリプロピレン 類などの重合物または供重合物などの各種ラテツタスなどを用いることができる また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できる。 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリプトファンを架橋するビスジァゾ 化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 アミノ基同志を架橋するダルタルアル デビトなどのジアルデヒド化合物、 トルエン一 2， 4—ジイソシァネートなどの ジイソシァネート化合物、 チオール基同志を架橋する N， N，一 o—フエ-レンジ マレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチオール基を架橋するマレイ ミド活性エステルイ匕合物、 ァミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルポジイミ ド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同志を架橋する際にも、 一 方のアミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、 3- (2-ピリ ジルジチォ）プロピオン酸 N-スクシンイミジル（SPDP) など） を反応させた後還元 することによりチオール基を導入し、 他方のァミノ基にマレイミド活性エステル 試薬によりマレイミド基を導入後、 両者を反応させることもできる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
本発明の抗原は、 温血動物に対して、 例えば腹腔内注入、 静脈内注入、 皮下注 射などの投与方法によって、 抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担 体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロ イントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は 、 通常 2 ~ 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 温血動物としては、 例えばサ^^、 ゥサギ、 ィヌ、 モノレモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮ トリなどがあげられるが、 モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いら れる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、 本発明の抗原を免疫された温血動物、 たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採琅し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 本発明の抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 血清中の本発明の抗体の抗体価の測定は、 例えば本発明で用いられるタンパク質 またはレセプターを放射性物質または酵素などで標識し、 抗血清と反応させた後 、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。 融合操作は既知 の方法、 例えばケーラーとミルスタインの方法 〔Nature、 256卷、 495頁 （1975年 W 200
) 〕 に従い実施できる。 融合促進剤としては、 ポリエチレングリコール （PEG) や センダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは PEGなどが用いられる。骨髄腫 細胞としては、例えば NS- 1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1などがあげられ、 P3U1などが好ま しく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄細胞数との好ま しい比率は、 通常 1： 1〜20： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80%程度の濃度で添カ卩され、 通常 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°C、 通常 1 〜10分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明の抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき 、 例えば配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその 塩あるいはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相 （ 例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や 酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウス の場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え 、 固相に結合した本発明の抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプ 口ティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や 酵素などで標識した配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番 号： 1 0、 または配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチ ドを加え、 固相に結合した本発明の抗体を検出する方法などがあげられる。 本発 明の抗体のスクリーニング、 育種は、 通常 HA T (ヒポキサンチン、 アミノプテ リン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および 育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1 ~ 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎仔血清を含 む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎仔血清を含む G I T培地（和光純薬 工業 （株） ） またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好まし くは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週 間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。
本発明の抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免 疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電 気泳動法、 イオン交換体 （例、' DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロティン Aまたはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗 体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕 に従って行わ れる。 . 以上のようにして、 ハイプリ ドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養 し、 その体液または培養物から抗体を採取することによって、 本宪明の抗体を製 造することができる。
(a) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7もしくは配列番号： 1 0、 ま たは配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の一部領域と 反応する本発明の抗体を産生するハイプリ ドーマ、および（b)上記タンパク質と ほ反応するが、 その一部領域とは反応しない本発明の抗体を産生するハイプリ ド 一マのスクリーニングは、 例えば、 その一部領域に相当するペプチドとハイプリ ドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターに特異的 に反応する二重特異性モノクローナル抗体は、 公知の方法に準じて製造すること ができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 自体公知またはそれに準じる方法に従って製 造することができる。 例えば、 免疫抗原自体、 またはそれとキャリアータンパク 質との複合体をつく り、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に 免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製 を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテ ンとの混合比は、 キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して 抗体が効率良くできれば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもく、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比 でハプテン 1に対し、 約 0 · 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で架橋させる 方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアータンパク質の架橋には、 種々の縮合剤を用いるこ とができ、 グルタルアルデヒドゃカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位に、 それ自体または 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュパントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口ーナル抗体価の測定は、 例えば上記 （ 2 ) で述べたハイプ リ ドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体 の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの 分離精製法に従って行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプターまたはその部分べプチドを コードするポリヌクレオチド （例、 D N A (以下、 アンチセンスポリヌクレオチ ドの説明においては、 これらの D NAを、 本発明の D NAと略記する場合がある ) ) の塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を 有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例 、 D NA) の塩基配列に相捕的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれ のアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、 アンチセンス D N Aが好まし レ、。
本発明の D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D N Aに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられ る。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻害を指向し たアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位を コードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖 と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も 好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 （ 口） R N a s e Hによる RNA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの 場合は、 イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列の相捕鎖と約 7 0 %以上 、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である 具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配 列番号： 8、 配列番号： 9、 列番号： 1 1、 配列番号： 1 2、 配列番号： 3 5 で表わされる塩基配列を含有する D NAの塩基配列に相捕的な、 もしくは実質的 に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド 、 好ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2または配列 番号： 3 5で表わされる塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相捕な塩基配列 、 またはその一部分を有するァンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。 アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 (ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾リン 酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリポース ) は、 2 ' _ 0 _メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩 基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列番 号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 gfi列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号 ： 9、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 2または配列番号： 3 5で表わされる塩基 配列を有する D N Aにハイブリダイズするものであればレ、ずれのものでもよレ、。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて 製造することができる。 本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできる該遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クロー ン化した、 あるいは決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に 基づき設計し、 合成しうる。 かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明の タンパク質遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成ま たは機能を阻害することができる力 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aと の相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 .制御することがで きる。 本発明のタンパク質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオ チド、 およぴ本発明のタンパク質関違 R N Aと特異的にハイブリダイズすること ができるポリヌクレオチドは、 生体内おょぴ生体外で本発明のタンパク質遺伝子 の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用 である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または 核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌク レオチド、 塩基配列または核酸とタンパク質との間で 「対応する」 とは、 ヌクレ ォチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される （指令にある） タンパク 質のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5， 端ヘアピンループ、 5 ， 端 6—ベースペア ' リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コド ン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3， 端非翻訳領域、 3， 端 パリンドローム領域または 3， 端ヘアピンループなどは、 好ましい対象領域とし て選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 については、 目的核酸が対象領域とハイプリダイズすることができる場合は、 そ の目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対して 「アンチセンス」 であ るということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2—デォキシー D— リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポ一スを含有しているポリヌ クレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイ プのポリヌクレオチド、 非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば 、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結 合を含有するその他のポリマー （伹し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出さ れるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを 含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 D NA： R NAハイブリッドであってもよく、 さらに非 修飾ポリヌクレオチド （または非修飾ォリゴヌクレオチド） 、 公知の修飾の付加 されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの 、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの 、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホ スホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど) を 持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例、 ホスホロチォエート、 ホ スホロジチォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （例、 ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ 'インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプチド、 ポリ一 L— リジンなど） や糖 （例、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの 、 インターカレント化合物 (例、 アタリジン、 ソラレンなど) を持つもの、 キレ ート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例 えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「 ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するの みでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い 。 このような修飾物は、 メチル化されたプリンおょぴピリミジン、 ァシル化され たプリンおょぴピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾され ていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換さ れていたり、 またはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R NA、 D NAまたは修飾された 核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては、 核酸の硫黄 誘導体、 チォホスフェート誘導体、 ポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシ ドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。 本発明のアンチセンスポリヌ クレオチドは、 例えば、 以下のように設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアン チセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、 アンチセンスポリヌクレオ チドの細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大き なものにする、 また、 もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチ ドの毒性をより小さなものにする。 このような修飾は、 例えば Pharm Tech Japan, 8卷， 247頁または 395頁， 1992年、 Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾された 糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊 な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与え られることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基 骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜と の相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例、 ホスホリ ピド、 コレステロールなど） などの疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ま しい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端または 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3， 端または 5， 端に特異 的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌク レアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の 基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグリコ ールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに 限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の 生体内や生体外の遺伝子発現系、 または本発明で用いられるタンパク質またはレ セプターの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
以下に、 （a)本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプター との結合を阻害する物質、 （b)本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する 物質、 （ 本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質、 （d) 本発明 の抗体、 （e) 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどの用途を説明する。 〔1〕 癌の予防'治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の增殖抑制剤 本発明で用いられるタンパク質は癌組織で発現が増加し、 本発明で用いられる レセプターと結合する。 本努明で用いられるタンパク質および本発明で用いられ るレセプターは、 癌細胞 （例、 ヒ ト肺癌細胞など） で同時に発現しているので、 本発明で用いられるレセプターによって誘導される浸潤能の亢進を伴った細胞増 殖促進が自己完結的に起こり （オートクライン増殖促進） 、 癌の進展 ·悪性化に 寄与している。 本発明で用いられるレセプターは、 本発明で用いられるタンパク 質が結合することによって活性ィヒ （例、 リン酸化） され、 活性化に至るメカ-ズ ムには、例えば肝細胞増殖因子（HGF)受容体などのチロシンキナーゼが関与する 。 上記のような癌細胞の増殖促進現象は、例えば（i)本発明で用いられるタンパ ク質と本発明で用いられるレセプターとの結合、 （ii) 本発明で用いられるタン パク質の活性 （本発明で用いられるレセプターのリン酸ィ匕誘導 ·促進活性、 本発 明で用いられるレセプター結合活性など）、 （iii)本宪明で用いられるレセプタ 一の活性化誘導 （例、 リン酸化される活性誘導 ·促進など） などを阻害すること により消失する。 また、 本発明の抗体、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド は、 癌細胞のアポトーシス誘導 ·促進作用、 増殖抑制作用などを有する。 本発明 の抗体、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドが本発明で用いられるタンパク 質に結合し、 該タンパク質の発現を阻害することにより、 癌細胞は増殖が抑制さ れ、 アポトーシスが誘導'促進される。
従って、 （a)本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプター との結合を阻害する物質、 （b)本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する 物質、 （ 本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質、 （d) 本発明 の抗体 （その塩も含む） または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどを含 有する医薬は、 低毒性で安全な、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 腌臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 癌細胞の アポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などの医薬として使用することができ る。
本発明の抗体または上記物質を含有する上記剤は低毒性であり、 そのまま液剤 として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的また は非経口的 （例、 血管内投与、 腹腔内投与、 皮下投与など） に投与することがで さる。
本発明の抗体または上記物質は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な 医薬組成物として投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発 明の抗体または上記物質と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤 とを含むものであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与 に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調整で きる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 本発明の抗体または上記物質を通常 注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化するこ とによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ 糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解捕助剤、 例えば、 ァ ルコール (例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポ リエチレングリコー 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C u— 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adauct of hydrogenated castor oil) 〕 等 と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶 解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよレ、。 調 製された注射液は、 適当.なアンプルに充填されることが好ましい。 直腸投与に用 いられる坐剤は、 本発明の抗体または上記物質を通常の坐薬用基剤に混合するこ とによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 ( 糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 ( ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このよ うな組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担 体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤として は、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 なお前記した各組成物は、 上記抗体または物質との配合により好ましくない相 互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体または物質の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜： LOOmg、その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体または物質 が含有されていることが好ましい。
上記の剤の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても 異なり、 例えば、 成人の乳癌の治療 ·予防のために使用する場合には、 本発明の 抗体または物質を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0.：!〜 10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、好 ましくは 1日 1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口 投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特 に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
さらに、 本発明の抗体および上記物質は、 他の薬剤、 例えばアルキル化剤 （例 、 サイクロフォスフアミド、 ィフォスフアミド等） 、 代鶴す拮抗剤 （例、 メソトレ キセート、 5—フルォロウラシル等） 、 抗癌性抗生物質 （例、 マイトマイシン、 アドリアマイシン等） 、 植物由来抗癌剤 （例、 ビンクリスチン、 ビンデシン、 タ キソール等） 、 シスブラチン、 カルポプラチン、 エトポキシドなどと併用しても よい。 本発明の抗体または上記物質および上記薬剤は、 同時または異なった時間 に、 患者に投与すればよい。
〔 2〕 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの定量
本発明の抗体を用いることにより、 本発明で用いられるタンパク質またはレセ プターの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。 これらの目 的には、抗体分子そのものを用いてもよく、 また抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab'または Fab画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液 中の抗原量 （例えば、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプター量） に対 応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段によ り検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出 する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 サンドイッチ法 、 競合法、 ィムノメトリック法、 ネフロメトリーなどが用いられるが、 感度、 特 異性の点で後述するサンドイッチ法、 競合法が、 特にサンドイッチ法が好ましい ( 1 ) サンドイッチ法
サンドイッチ法においては、 不溶化した本発明の抗体に被検液を反応 （1次反 応） させ、 さらに標識化された本発明の抗体を反応 （2次反応） させた後、 不溶 化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明で用いられるタ ンパク質またはレセプターの量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は 同時に行なつてもよいし時間をずらして行なつてもよい。 標識化剤および不溶化 の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫 測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1 種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混 合物を用いてもよい。 すなわち、 1次反応おょぴ 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明で用いられるタンパク質またはレ セプターの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C 端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
( 2 ) 競合法
本発明の抗体、 被検液および標識化された本発明で用いられるタンパク質また はレセプターとを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明で用 いられるタンパク質またはレセプターの割合を測定することにより、 被検液中の 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを定量する。
本反応法は、 例えば、 固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウス IgG抗体（ICN/CAPPEL社製） を固相化抗体として用い 、 この固相化抗体の存在するプレートに、 （i) 本発明の抗体、 （ii) HRPで標識 化された本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、および（iii)被検液 を添加し、反応後、 固相に吸着した HRP活性を測定し、本発明で用いられるタンパ ク質またはレセプターを定量する。
( 3 ) ィムノメトリック法
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化さ れた本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは 被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、 次に固相化 抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、 固相と 液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量 する。
( 4 ) ネフロメ トリー
ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶 性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物しか 得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフ口メトリ一などが好 適に用いられる。
上記 ( 1 ). 〜 （4 ) において、 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤と しては、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 ランタニド元素などが用 いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔125ι〕 、 〔131ι〕 、 〔¾〕 、 C14c
〕 などが、 酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば i3—ガ ラクトシダーゼ、 ]3—グノレコシダーゼ、 ァノレカリフォスファターゼ、 パーォキシ ダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが、 蛍光物質としては、 例えばシァニン蛍光色 素 (例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製) など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィソチオシァネートなどが、 発光物質とし ては、 例えばルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが それぞれ挙げられる。 さらに、 抗体と標識剤との結合にビォチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 例えばァガロース、 デキストラン、 セルロース などの不溶性多糖類、 例えばポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコンなど の合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、 特別の条件 、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法 に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の測定系を構築すればよい。 これら の一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる [例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入 江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定 法」 （第2版） （医学書院、 昭和57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法 J ( 第3版） （医学書院、 昭和62年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GY」 Vol. 70 ( Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同書 Vol. 73 ( Immunochemical Techniques (Part B) ) 、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) ) 、 |P]書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) 、 |P]書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) )、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカァ ックプ レス社発行） など参照] 。 したが όて、 本発明のサンドイッチ免疫測定法などよ る測定系を構築する場合、 その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、 本発明の抗体は、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプ ターを感度良く定量することができるので、 本発明で用いられるタンパク質また はレセプターの生理機能のさらなる解明、 および本発明で用いられるタンパク質 またはレセプターの関与する疾患の診断に有用である。 具体的には、 本発明の抗 体を用いて、 組織中や体液中 （血液、 血漿、 血清、 尿など） に含まれる本発明で 用いられるタンパク質またはレセプターの量を測定することにより、 例えば、 癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌 、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫 瘍など） などを診断することができる。
〔3〕 疾病に対する医薬候補物のスクリーニング
本発明で用いられるタンパク質は癌組織で発現が増加し、 また、 本発明で用い られるレセプターと結合する。 本発明で用いられるタンパク質および本発明で用 いられるレセプターは、 癌細胞 （例、 ヒト肺癌細胞など） で同時に発現している ので、 本発明で用いられるレセプターによつて誘導される浸潤能の亢進を伴つた 細胞増殖促進が自己完結的に起こり' （オートクライン増殖促進） 、 癌の進展-悪 性化に寄与している。 本発明で用いられるレセプターは、 本発明で用いられるタ ンパク質が結合することによって活性ィヒ （例、 リン酸化） され、 活性化に至るメ 力二ズムには、例えば肝細胞増殖因子（HGF)受容体などのチロシンキナーゼが関 与する。 上記のような癌細胞の増殖促進現象は、例えば（i) 本発明で用いられる タンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合、 （ii) 本発明で用いられ るタンパク質の活性 （本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導 .促進活性 、本発明で用いられるレセプター結合活性など） 、 （iii)本発明で用いられるレ セプターの活性化誘導 （例、 リン酸化される活性誘導 ·促進など） などを阻害す ることにより消失し、 癌細胞の増殖阻害が起こりアポトーシスが誘導される。 従って、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの活性を阻害する化 合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、'食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状 腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス 促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターは、 本発明のタ ンパク質またはレセプターの活性を阻害する物質のスクリーニングのための試薬 として、 それぞれ有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを用い ることを特徴とする、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの活性を 阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明で用いられるタンパク質の活性 （例、 本発明で用いられるレセプター結 合活性など） を阻害する物質のスクリーニング方法としては、 例えば、 本発明の タンパク質およぴ本発明で用いられるレセプターのそれぞれを、 タグを付加した 組換え型タンパク質として動物細胞で発現させる。 該タグとしては、 FLAG、 His 、 V5、 myc、 HAなどが用いられ、 本発明のタンパク質に付加するタグ （タグ A) と 、 本発明で用いられるレセプターに付加するタグ （タグ B ) とは異なるものを用 いる。 タグ Bに対する抗体で、 （i)上記タグ A付加タンパク質および上記タグ B 付加レセプターの混合液、 または （ii) 試験化合物、 上記タグ A付加タンパク質 およぴ上記タグ B付加レセプターの混合液をそれぞれ免疫沈降し、 得られた沈殿 物を、 タグ Aに対する抗体を用いてウェスタンブロッテイング操作を行うことに より、 本発明で用いられるレセプターに結合した本発明で用いられるタンパク質 の量をそれぞれ測定し、 上記 （i) の場合と （ii) の場合とで比較する。
本発明で用いられるタンパク質の活性 （例、 本発明で用いられるレセプターの リン酸化誘導 ·促進活性など） を阻害する物質のスクリ一ユング方法としては、 例えば、 タグ （例、 FLAG、 His, V5、 myc、 HAなど） を C末端に付加した本発明で用 いられるレセプターを組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、 （i)本発 明で用いられるタンパク質、 または （ii) 試験ィ匕合物おょぴ本発明で用いられる タンパク質と、 それぞれ反応させた後、 細胞を破砕し、 無細胞抽出液を調製し、 抗タグ抗体で免疫沈降し、 リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成 量を、 抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法 （例、 ゥヱスタンプロッ ト法など） により測定し、 上記 （i) の場合と （ii) の場合とで比較する。 リン酸 化誘導 ·促進活性は、 自体公知の方法、 例えば Methods in Enzymology 200卷、 98 頁— 107頁、 1991年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って行えばよい。 例えば、 上記 （ii) の場合における本発明で用いられるタンパク質の活性を、 上記 （i) の場合に比べて、約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明で用いられるタンパク質の活性 を阻害する物質として選択することができる。
本発明で用いられるレセプターの活性 （例、 リン酸ィ匕される活性など） を阻害 する物質のスクリーニング方法の具体例としては、 例えば、 タグ （例、 FLAG、 His 、 V5、 myc、 HAなど） を C末端に付カ卩した本発明で用いられるレセプターを、 組換 え型タンパク質として動物細胞に発現させ、 （i' ) 本発明で用いられるタンパク 質、 または （ii' ) 本発明で用いられるタンパク質および試験ィ匕合物と、それぞれ 反応させた後、 細胞を破碎し、 無細胞抽出液を調製し、 抗タグ抗体で免疫沈降し 、 リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量を、 抗リン酸ィヒチロシ ン抗体などを用いて公知の方法 （例、 ウェスタンプロット法など） により定量し 、 上記 （i' ) の場合と （ϋ' ) の場合とで比較する。
例えば、 上記 (ϋ' ) の場合における本発明で用いられるレセプターの活性を、 上記 （i' ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好まし くは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明で用いられるレセプターの活 性を阻害する化合物として選択することができる。
上記の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有す る細胞としては、 例えば、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコ ードする D N Aを含有するベクターで形質転換された宿主 （形質転換体） が用い られる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H O細胞、 H E K 2 9 3細胞 などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングには、 例えば、 前述の 方法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質 転換体が好ましく用いられる。 本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法 は、 前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、.例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿 などがあげられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質の遺伝子も、 癌組織において発現が增 加するので、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発現を 阻害する物質も、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 贪道癌、 胃 癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺 癌、 脾臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促 進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするポ リヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプ ターの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーエングのための試 薬として有用である。
スクリーニング方法としては、 （iii)本発明で用いられるタンパク質またはレ セプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存 在下、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有する 細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げ られる。
上記方法において、 （iii) と （iv) の場合における、前記遺伝子の発現量 （具 体的には、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプタ一量または本発明で用 いられるタンパク質またはレセプターをコードする mR NA量） を測定して、 比 較する。
試験化合物およぴ本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明の抗体を用いて、 細胞抽 出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン解析、 E L I S A法などの 方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2、 配 列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 1 1または配列番号： 3 5で表される塩 基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼーション 、 あるいはプライマーとして配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列 番号： 1 1または配列番号： 3 5で表される塩基配列またはその一部を含有する 核酸を用いる P C R法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。 例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （iii) の場合に比べ て、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害さ せる試験化合物を、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の 発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質またはレ セプター、 または本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能 力を有する細胞などを含有する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 物質は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などから選ばれる。
該塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 物質を上述の剤として使用する場合、 常套手段に従って製剤化することができる 例えば、 経口投与または非経口投与のための組成物としては、 上記 〔1〕 で記 載した組成物と同様のものが挙げられ、 同様に製造でき、 同様に使用できる。 〔4〕 遺伝子診断薬
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするポリヌクレオチ ド （例、 D NA) は、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ 、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明で用いら れるタンパク質またはレセプターまたはその部分べプチドをコ一ドする D NAま たは mR NAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは mR N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや P C R—S S C P法 (Genomics,第 5卷, 874〜879頁 (1989年)、 Proceedings of the National Acaaemy of Sciences of the United States of America, ^8 ^, 2766 〜2770頁（1989年)）などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現過多が検出された場合や P C R—S S C P法により D NAの突然変異などが検出された場合は、 例えば癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌 、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 腌臓癌、 脳腫瘍、 血液腫 瘍など） である可能性が高いと診断することができる。
〔5〕 アンチセンスポリヌクレオチド含有医薬
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 本発明で用いられる タンパク質またはレセプター、 それをコードする D NAの生体内における機能や 作用を抑制し、 癌細胞のアポトーシスを誘導することができるので、 例えば瘅 （ 例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍 など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤など として使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の剤などとして使用する場合、 自体 公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロゥ ィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウ ィルスべクタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常套手段に従って、 ヒトま たは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチセンスポ リヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために捕助剤などの生理学 的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾルィ匕して吸入剤として 気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目的 に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担体と ともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンス ポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg) においては、 一日 にっき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0. l〜100rag投与す'る。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明で用いられるタンパク質 またはレセプターをコードする RNAの一部を含有する二重鎖 RNA、 本発明で 用いられるタンパク質またはレセプターをコードする R N Aの一部を含有するリ ポザィムなども、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発 現を抑制することができ、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または レセプター、 またはそれをコードする D NAの機能を抑制することができるので 、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脾臓癌、 脳 腫瘍、 血液腫瘍など） の予防'治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の 增殖抑制剤などとして使用することができる。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411卷， 494頁， 2001年） に準じて 、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7卷， 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部に公知のリ ポザィムを連結することによって製造することができる。 本発明のタンパク質を コードする R NAの一部としては、 公知のリボザィムによって切断され得る本発 明の R NA上の切断部位に近接した部分 （RNA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記剤として使用する場合、 アンチセ ンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
〔6〕 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを含有する医薬 本発明で用いられるタンパク質は癌で過剰に発現しており、 本発明で用いられ るレセプターも癌細胞で発現していることから、 癌患者の免疫系を活性化するた めに本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを癌ワクチンとして用いる こともできる。
例えば、 強力な抗原提示細胞 （例、 樹状細胞） を本発明で用いられるタンパク 質またはレセプター存在下培養し、 該タンパク質を貪食させた後に、 再ぴ患者の 体内に戻す、 所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。 体内に戻された樹状 細胞は癌抗原特異的な細胞障害性 T細胞を誘導、 活性化することにより癌細胞を 死滅させることが可能である。
また、 本発明のタンパク質またはレセプターは、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌 、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子 宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 瞎臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防また は治療のためのワクチン製剤として、 安全に、 哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 マウ ス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ） に投与することもできる。 該ワクチン製剤は、 通常、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターお よび生理学的に許容されうる担体を含有する。 担体としては例えば、 水、 食塩水
(生理食塩水を含む） 、 緩衝液 （例、 リン酸緩衝液） 、 アルコール （例、 ェタノ 一ノレ） などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、 通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができ る。
通常、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターは、 生理学的に許容さ れうる担体に溶解または懸濁される。 また、 本発明で用いられるタンパク質と生 理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、 用時それらを混合して用いてもよ い。
ヮクチン製剤には、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターおよび生 理学的に許容されうる担体に加え、 アジュパント （例、 水酸化アルミニウムゲル 、 血清アルブミンなど） 、 防腐剤 （例、 チメロサールなど） 、 無痛化剤 （例、 ブ ドウ糖、 ベンジルアルコールなど） などを配合させてもよ)/、。 また、 本発明で用 いられるタンパク質またはレセプターに対する抗体産生を促進させるために、 例 えばサイト力イン (例、 インターロイキン一 2などのインターロイキン類、 イン ターフェロン一 γなどのインターフェロン類など） をさらに配合させてもよい。 ワクチン製剤として用いる際、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプタ 一は活性体として用いてもよいが、 抗原性を高めるために変性させてもよい。 変 性は、 通常、 加熱処理、 タンパク質変性剤 （例、 ホルマリン、 塩酸グァニジン、 尿素） による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、 通常注射剤として、 例えば皮下、 皮内 、 筋肉内に投与してもよく、 また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与しても よい。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの投与量は、 例えば対象疾患 、 投与対象、 投与ルートなどによって異なるが、 例えば本発明で用いられるタン パク質またはレセプターを癌に罹患した成人 （体重 60kg) に皮下的に注射剤とし て投与する場合、 1回当たり通常 0. l〜300mg程度、好ましくは 100〜300mg程度であ る。 ワクチン製剤の投与回数は 1回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約 2 週間〜約 6ヶ月の間隔をあけて、 該ヮクチン製剤を 2〜4回投与することもできる。 〔7〕 DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコード する DNA (以下、 本発明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A ( 本発明の外来性変異 DNAと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提 供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子おょぴその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフヱクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法によ り融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B SCSFi系統， BDF 系 統， B 6D2F 系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラット （例 えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 D N Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の D NA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本宪明の D NAをいう。
本発明の変異 D NAとしては、 元の本発明の D NAの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた D NAなどが用いられ、 また、 異常 D NAも含まれる。
該異常 D NAとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる D NAを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る D NAなどが用いられる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあた つては、 該 D NAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N Aコンストラタトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 (例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モノレモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト D N Aを結合した D NAコンストラク ト （例、 ベクターなど) を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の D N Aを高発現する D N A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのパクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ヴィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はパキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の D NA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、 （i) ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J 。ウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモー ター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスタ 一、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリ ン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S—トラン スフヱラーゼ、 血小板由来成長因子 j3、 ケラチン K l， K 1 0および Κ 1 4、 コ ラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ 3 Iサ ブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファターゼ、 心房ナ トリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略さ れる） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リン酸化酵素 （N a， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロプ ロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ドーパミン i3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 la (EF- 1 α) 、 βァクチン、 aおよび j3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント 、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン A 、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現 することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒ トペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 a) のプロモーター、 ヒトおよぴニヮトリ 3ァクチンプロモータ 一などが好適である。
上記ベクターは、 DN A転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5，上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モ^/モット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の月干 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAラ イブラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 R N Aより公知の方法により調製された相補 D N Aを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞おょぴ体細胞のすべてに本発明の外来性 D NAを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞およぴ体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本宪明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 轧癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状 腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防'治療剤のスクリーニング試験に も利用可能である。
—方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D NAを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D N Aコン ストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞おょぴ体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。 本発明 • の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D NAを有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本宪明の異常 D NA転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negative作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明のタ ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活性型 不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防.治療剤のスクリーニン グ試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(ii) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析する 、 または D NAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本発明 のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性につい ての解析、
(iii) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使 用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv)上記（iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤 のスクリー-ング、 および
(v) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究おょぴ治療に貢献することができる。
また、 本発明の DN A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検查法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物ま たは本発明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
〔8〕 ノックァゥト動物
本発明は、 本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードする DN A (本発明の DNA) が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の 一ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ遣 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物 (8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壌することに より本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (i3_ガラクトシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壌する力、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DNA配列 （ 例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメッセンジャー RNA を合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した D NA配列を有する DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について 本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ リダイゼーシヨン角军析あるいはターゲッティングベクター上の DNA酉 B列とター ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PCR法により解析し、 本発明のノックァゥト ES細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 Evans と Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細 胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的 背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明 らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 B LZ6マウスや C 57 B L/6の採卵数の少なさを DB A/2との交雑により改善した B D F マウス (C 57 B L/6と DB AZ2との を用いて樹立したものなども良好に用 いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に 加えて、 C 57 B LZ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細 胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 B LZ6マウスとバッククロスす ることでその遣伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代えることが可能である点で 有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用する 力 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よ く多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で L I F 〜 10000 U/ml ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5 %酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で培養し 、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0. 5%ト リプシン/ 0. 1-5 mM EDTA, 好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ 1 mM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する 方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜3日毎に行なうが、 この際に 細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放 棄することが望まれる。 ·
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり [： M. J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature, 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschmanら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオ ロジー 'アンド 'ェクスペリメンタル 'モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年 ] 、 本発明の E S細胞を分ィヒさせて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、 ィ ンビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。 該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックァゥトさせることができる。
本発明の D NAがノックァゥトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析またはター ゲッティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D NA以外の近傍領域の D NA配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のへテ口発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することによりターゲッティングべクターを染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に 変異のあるものを選択することにより得られる。 このようにして本発明の D NAがノックァゥトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得おょぴ保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ ート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ 口ザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。 '
〔8 a ] 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して治療 ·予防効果を有する化 合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など があげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であ つてもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験ィ匕合物で処理し 、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を 指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脾臓癌、 脳腫 瘍、 血液腫瘍など） に対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングす る場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化 合物非投与群と癌の発症度合レ、の違いや癌の治癒度合レ、の違いを上記組織で経時 的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効 果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こさ れる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性な 予防'治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー二 ングで得られた化合物がら誘導される化合物も同様に用いることができる。 該スタリ一ユング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例 、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 このような塩と.しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸 、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが 用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重 60kg として） の乳癌患者においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましく は約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合 は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例え ば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の乳癌患者に投与する 場合、一日にっき該ィ匕合物を約 0. 01〜30mg、好ましくは約 0. l〜20mg、 より好まし くは約 0. 1〜： LOmgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も 、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔8 b〕 本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物のスクリーユング方法
本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対するプ 口モーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D N Aがレポータ一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポータ一遣伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。 レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 —ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポータ一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来の i3 一ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発明のタ ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに _ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4 _クロロー 3 _インドリル一 一ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような j3—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、約 3 0分ないし 1時間反応させた後、組織標本を I mM E D T A/ P B S溶 液で洗浄することによって、 /3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観察 すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよ い。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 アル力 リ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例え.ば、 塩酸、 リン酸、 臭 化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオ ン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。 ，
本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現の阻害、 該タンパク質の機能を阻害することができる ので、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脾臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 '治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の乳癌患者におい ては、一日にっき該化合物を約 0. 1〜： 100mg、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好まし くは約 1. 0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D NAに対する プロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該ィヒ合物を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0.：!〜 20mg、 より好ましくは約 0. 1〜： LOmgを静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる このように、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本楽明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二 ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジヱニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特 異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能とな る。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが 発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産 生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として 使用できる。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における 慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸
d CTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SD S ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ：グリシン A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：ノ リン
Le u ： ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ： スレオニン
C y s ： システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グノレタミン酸
As ： ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：ァノレギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ：フエ二ルァラニン
T y r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グノレタミン
p G 1 u ： ピログノレタミン酸
S e c ：セレノシスティン (selenocysteme)
また、 本明細 中で繁用される置換基 保護基およぴ試薬を下記の記号で表記 する。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
Ph ： フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 (R) 一カノレポキサミ ド基
Ί o s P トノレエンスノレフォニノレ CHO ： ホルミル
B z 1 ： ベンジノレ
Cl2-Bzl ： 2， 6—ジクロロべンジル
B om ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジノレ才キシカノレポ二ノレ
C 1一 Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r - Z : 2—ブロモペンジノレオキシカノレポ二ノレ
B o c ： tーブトキシカノレポニノレ
DNP ： ジニトロフエ二ノレ
T r t ： トリチル
Bum ： t一ブトキシメチノレ
Fmo c ： N— 9 _フルォレニノレメ トキシカノレポ二ノレ
HOB t ： 1—ヒ ドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3， 4ージヒ ドロ一 3—ヒ ドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2， 3—ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒ ドロキシ- 5 -ノルポノレネン- 2, 3 -ジカノレポキシィミ ド
DCC ： N, N' ージシクロへキシルカルポジイミ ド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
S EMA4 Bのアミノ酸配列を示す。
ほ 3列番号： 2〕 ' 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する SEMA4Bをコードする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
SEMA4Bをコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
S EMA 4 B— Mlのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有する SEMA 4 B— Mlをコードす る D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕 ,
SEMA4B—M1をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 7〕
SEMA4B—M2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるァミノ酸配列を有する SEMA4B— M2をコードす る D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
SEMA4B—M2をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 10〕
S EMA 4 B一 M 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する SEMA 4 B— M 3をコード する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
SEMA4B— M3をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 13〕
参考例 2、 参考例 3、 参考例 15および参考例 16で用いられたアンチセンス オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
参考例 2、 参考例 3、 参考例 1· 5およぴ参考例 16で用いられたオリゴヌクレ ォチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
参考例 3で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
参考例 3で用いられたォリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
参考例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。 〔配列番号： 18〕
参考例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： ；L 9〕
参考例 4、 参考例 6および参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す
〔配列番号： 20〕
参考例 4およぴ参考例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
参考例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
参考例 8で用いられたペプチド 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
参考例 8で用いられたぺプチド 2のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
参考例 8で用いられたペプチド 3のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕
参考例 8で用いられたぺプチド 4のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
P l e x i nB lのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 27〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 30〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
実施例 1で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。 〔配列番号： 3 2〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 4〕
実施例 1で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 5〕
P 1 e X i n B 1をコードする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 3 6〕
実施例 3で用いられたプライヤーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 7〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 8〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
後述の参考例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli
T0P10/SEMA4B- Ml/pCR4- T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センターに、 寄託番号 FERM BP - 8316として寄託されている。
後述の参考例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli
TOPIO/SEMMB- M2/pCR4-T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センターに、 寄託番号 FERM BP-8317として寄託されている。
後述の参考例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli
T0P10/SEMA4B- M3/pCR4 T0P0は、 2003年 3月 4日力 ら茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センターに、 寄託番号 FERM BP-8318として寄託されている。
以下において、 参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、 この 発明はこれらに限定されるものではない。
参考例 1 遺伝子発現解析
肺がん組織で特異的に発現亢進している遺伝子群 明らかにするため、 肺がん 組織 4例、 正常肺組織 5例から抽出された total R A (表 1 ) を材料とし、 oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95ii; Affymetrix社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 実験方法は、 Affymetrix社の 実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。
その結果、 肺がん組織 3例 (lot. 0011- 192- 01285、 lot. 0011 - 192- 01293および lot. 0011- 192- 01297) において、 Semaphorin 4B (SEMA4B) および後述の参考例 4 記載の Semaphorin 4B-M1 (SEMA4B-M1) 、 Semaphorin 4B-M2 (SEMA4B-M2) ならび に Semaphorin 4B-M3 (SEMA4B-M3) 遺伝子の発現亢進が検出された （表 2 ) 。
〔表 1〕
RNAを抽出した組織
肺がん組織 (lot. 0009-192-00122) BioClinical Partners社
肺がん組織 (lot. 0011-192-01285) BioClinical Partners社
肺がん組織 (lot. 0011-192-01293) BioClinical Partners社
肺がん組織 (lot. 0011-192-01297) BioClinical Partners社
正常肺組織 (lot. 0009-192-00150) BioClinical Partners社
正常肺組織 (lot. 0009-192-00168) BioClinical Partners社
正常肺組織 (lot. 0011-192-01283) BioClinical Partners社
正常肺組織 (lot. 0011- 192 - 01285) BioClinical Partners社
正常肺組織 (lot. 0011-192-01297) BioClinical Partners社 〔表 2〕 組織 遺伝子発現量
肺がん組織 (lot. 0009- -192- -00122) ND
肺がん組織 (lot. 0011 - -192- -01285) 10
肺がん組織 (lot. 0011 - -192- -01293) 9. 5
肺がん組織 (lot. 0011- -192- -01297) 1. 9
正常肺組織 (lot. 0009- -192- -00150) ND
正常肺組織 (lot. 0009- -192- -00168) ND
正常肺組織 (lot. 0011- -192- -01283) ND
正常肺組織 (lot. 0011- -192- -01285) ND
正常肺組織 (lot. 0011- - 192- -01297) ND
遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が検出された
全遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。
ND; not detected 参考例 2
ヒト肺癌細胞株のアポトーシス誘発
SEMA4Bおよび後述の参考例 4記載の SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2ならぴに SEMA4B- M3 遺伝子の発現を抑制することにより、 ヒト肺がん細胞株のアポトーシスが誘発さ れるか否かを調べた。
まず、 アメリカンタイプカルチャーコレクション （ATCC) より購入したヒト非 小細胞肺がん細胞株 NCI- H1703を、 RPMI- 1640培地 （25mM HEPES含有） （Invitrogen 社） に牛胎仔血清 （ATCC) を 10%加えた培地で懸濁し、 1ゥエル当たり 1万個の細 胞密度 （培地液量 0. 1ml) で 96穴平底組織培養プレート （BDファルコン社） に播種 した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオ チドをトランスフエクシヨンした。
具体的には、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列を有するタンパク質の 3'非翻訳領域配列にハイブリダ ィズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列 （配列番号： 1 3) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製して導入実験に用い た （以下、 アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する） 。 コントロールとしては 、 酉 3列番号： 13で示される塩基配列のリバース配列 （配列番号： 14) を同様 に phosphorothioate化し、 HPLC精製して用いた （以下、 コント口ールォリゴヌク レオチドと略する） 。
Opti-MEM (Invitrogen社) で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは コントロールオリゴヌクレオチドを、 Opti- MEM (Invitrogen社） で 5倍に希釈し室 温で 5分間放置したォリゴフヱクトァミン （Invitrogen社） と 8： 3の割合 （容量比 ) で混合し、 1ウエノレ当たり 40 μ Lの割合でプレートに添力 nした。 オリゴヌクレオ チドの終濃度は 250nMとなるよう調整した。 上記の条件で更に 3日間培養した後、. Cell Death Detection ELISAPUKキット （Roche Diagnostics社） を用いて添付プ 口トコールに従い、上記の 2種類のオリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を 測定した。
その結果、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3) はコントロー ルオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) に比べて約 1.6倍のアポトーシス誘導活 性を示し、 統計学的に有意な差 （P≤0.01) を示した （表 3) 。
〔表 3〕
アポトーシス誘導活性 （A4。5— A492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 21 2 0. 032
コント口ールォリゴヌクレオチド 0. 1 0 0. 01 7
(配列番号： 1 4)
アンチセンスオリゴヌクレオチド 0. 538 0. 035
(配列番号： 1 3) 参考例 3
SEMA4Bアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現量の低下
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、 SEMA4Bおよび後述の参考例 4記 載の SEMA4B-M1、 SEMA4B- M2ならぴに SEMA4B-M3遺伝子の発現量が低下するか否か調 ベた。
参考例 2で用いたヒト非小細胞肺がん細胞株 NCI^11703を参考例 2と同じ培地 に懸濁し、 1ゥヱル当たり 6万個の細胞密度（培地液量 0. 6ml) で 24穴平底組織培養 プレート （BDファルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37。Cでー晚培養し た後、 参考例 2の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフエ クシヨンした。 但し、 オリゴヌクレオチドの添加量は 1ゥエル当たり 240 μしとし、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして 2種類（配列番号： 1 3および配列番号： 1 5 ) 、 コント口ールォリゴヌクレオチドとして 2種類 （配列番号： 1 4およぴ配 列番号： 1 6 ) のオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号： 1 5および配列番号： 1 6に由来するアンチセンスオリゴヌクレオ チドおよぴコントロールオリゴヌクレオチドに関しては、 配列番号： 1、 配列番 号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を有するタ ンパク質の 3，非翻訳領域配列にハイブリダィズするアンチセンスオリゴヌクレオ チド配列 （配列番号： 1 5 ) を設計後、 phosphorothioate化ォリゴヌクレオチド を合成し、 HPLC精製して導入実験に用いた。 配列番号： 1 5で示される塩基配列 のリバース配列 （配列番号： 1 6 ) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製し て用いた。
トランスフヱクシヨン後、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24時間培養を継続した後 に R easy (登録商標） Mini Total R A Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを抽 出した。 約 300ngのトータル RNAを铸型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems社） を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応 した。 トータル RNAにして？〜 9ngに相当する cDNAを铸型とし、 2種類のプライマー (配列番号： 1 7および配列番号： 1 8 ) t SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社） を用いて SEMA4B、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B-M2および SEMA4B-M3遺伝子の 発現コピー数を測定した。同量の铸型 cDNA中に含まれる 3 -ァクチン遺伝子発現量 を TaqMan β -actin Control Reagents (Applied Biosystems社) ¾用レヽて彻 J定し 内部標準とした。
オリゴヌクレオチド溶液の代わりに蒸留水を用いた場合 （以下、 非トランスフ ェクション群と略する） では、 SEMA4B、 SEMA4B-M1、 SEMA4B- M2およぴ SEMA4B - M3 遺伝子発現量の総和は J3 -ァクチン遺伝子発現量の 6. 6%であったのに対し、 アン チセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3およ 配列番号： 1 5 ) 投与群で は 0. 98%および 1. 1 %であり、 統計学的に有意 （P 0. 05) な遺伝子の発現量低下 が認められた。
一方、 コント口ールォリゴヌクレオチド （配列番号： 1 4および配列番号： 1 6 ) 投与群では 4. 1 %および 3. 4%であり、 非トランスフエクシヨン群と比べて統 計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これより、 SEMA4B、 SEMA4B-M1, SEMA4B-M2および SEMA4B- M3遺伝子の発現抑制と アポトーシス誘導とは相関することがわかった。 参考例 4
SEMA4B, SEMA4B - Ml、 SEMA4B - M2および SEMA4B- M3をコードする cDNAのクローニング と塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株 （A549) 由来の Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社） を铸型と し、 2種のプライマー （配列番号： 1 9および配列番号： 2 0 ) を用いて PCR反応 を行った。 該反応液 50 ^ 1は、 l Ju lの上記cDNA、 2. 5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 、 各 1. Ο μ Μのプライマー （配列番号： 1 9および配 列番号： 2 0 ) 、 200 dNTPs、 および 25 μ 1 2x GC Buffer I (Takara Bio社） を含む組成とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 1分、 60°C · 1分、 72°C · 4 分を 30サイクル繰り返し、 さらに 72°C · 5分間伸長反応を行った。 PCR反応産物の 3' 端に dATPを付加するため、 5Uの Ex Taq DNA Polymerase (Takara Bio社） を添加し て 72°C · 7分間保温した。 得られた PCR反応産物は、 PCR Purification Kit (QIAGEN 社） を用いて精製した。 これを T0P0 TA PCRクローニングキット （Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクター pCR4- T0P0 (Invitrogen社）へサプクローニング した。 これを大腸菌 T0P10に導入後、アンピシリンを含む LB寒天培地中で cDNAを持 つクローンを選択した。 個々のクローンについて塩基配列を解析した結果、 配列 番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 および配列番号： 1 1で表される cDNA の塩基配列がそれぞれ得られた。
SEMA4B遺伝子 （GenBank Accession No. M— 044533遺伝子；丽_198925遺伝子； 匪— 020210遺伝子） の塩基配列の 1〜237番目および 2749〜3766番目の塩基配列を、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8および配列番号： 1 1で表される塩 基配列の 5'端および 3'端にそれぞれ付加した塩基配列をそれぞれ配列番号： 3、配 列番号： 6、 配列番号： 9および配列番号： 1 2に示す。
配列番号： 2で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 ) は SEMA4B遺伝子 （GenBank Accession No. XM_044533遺伝子；麗— 198925遺伝子； 丽— 020210遺伝子） がコードする SEMA4Bタンパク質と完全に一致した。
配列番号： 5で表される塩基配列がコードするァミノ酸配列 （配列番号： 4 ) を含有するタンパク質を SEMA4B- Ml、配列番号： 8で表される塩基配列がコ一ドす るァミノ酸配列 （配列番号： 7 ) を含有するタンパク質を SEMA4B-M2、配列番号： 1 1で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) を含有す るタンパク質を SEMA4B - M3とそれぞれ命名した。
SEMA4B-M1のアミノ酸配列 （配列番号： 4 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列番 号： 1 ) の 208番目の Serが lieに置換されている。
SEMA4B-M1をコードする DMの塩基配列 （配列番号： 5 ) では、 SEMA4Bをコード する DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 90番目の gが aに、 111番目の gが aに、 623 番目の gが tにそれぞれ置換されており、623番目の置換がァミノ酸置換を伴ってい る。
SEMA4B- M2のアミノ酸配列 （配列番号： 7 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列番 号： 1 ) の 163番目の Metが lieに置換されている。
SEMA4B- M2をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 8 ) では、 SEMA4Bをコード する DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 150番目の gが aに、 489番目の gが aに、 528 番目の cが tに、 1266番目の tが cに、 1588番目の cが aに、 2343番目の aが gにそれぞ れ置換されており、 489番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
SEMA4B- M3のアミノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列 番号： 1 ) の 364番目の Lysが Asnに置換されている。
SEMA4B- M3をコードする D皿の塩基配列 （配列番号： 1 1 ) では、 SEMA4Bをコー ドする D N Aの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 1092番目の gが tに置換されており、 アミノ酸置換を伴っている。 配列番号 ： 2で表される塩基配列を有する DNAを有するプラスミ ドを SEMA4B/pCR4-T0P0 配列番号： 5で表される塩基配列 有する DNAを有するプラス ミドを SEMA4B - Ml/pCR4- T0P0、 配列番号： 8で表される塩基配列を有する DNAを有 するプラスミドを SEMA4B-M2/pCR4 - T0P0、配列番号： 1 1で表される塩基配列を有 する DNAを有するプラスミドを SEMA4B-M3/pCR4- T0P0とそれぞれ名付けた。
さらに、 プラスミド SEMA4B/pCR4 - T0P0が導入された形質転換体を Escherichia coli T0P10/SEMA4B/pCR4 - T0P0、 プラスミド SEMA4B-Ml/pCR4-T0P0が導入された形 質転換体を Escherichia coli T0P10/SEMA4B- Ml/pCM- T0P0、 プラ ス ミ ド SEMA4B- M2/pCR4 - T0P0が 導入 さ れた形質転換体 を Escherichia coli T0P10/SEMA4B- M2/pCR4- T0P0、 プラスミド SEMA4B- M3/pCR4- T0P0が導入された形質 転換体を Escherichia coli TOP10/SEMA4B- M3/pCR4- T0P0とそれぞれ命名した。 参考例 5
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株 SK-N- MC、 SK - N - AS、 SK- N-BE、 SK- N-DZ、 SK - N- FI 、 SK- N- SH、 D341Med、 Daoy、 DBTRG- 05MG、 U- 118 MG、 U- 87 MG、 CCF- STTGlおよび SW 1088；ヒト乳癌細胞株 HCC1937、 ZR - 75- 1、 AU565、 MCF- 7および MDA-MB- 231；ヒ ト大腸癌細胞株 Caco - 2、 C0L0201、 C0L0 205、 COLO 320DM、 HCT- 8、 HT-29、 LoVo 、 LS123、 SNU- Cl、 SK - CO - 1、 SW 403、 SW 48、 SW480、 SW 620、 SW 837およぴ SW 948 ；ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293 ;ヒト小細胞肺癌細胞株 NCI- H187、NCI - H378、NCI- H526 、 NCI - H889、 NCI - H1672、 NCI - H1836、 NCI- H2227、 NCI- N417および SHP- 77；ヒト非 小細胞肺癌細胞株 A549、 NCI- H23、 NCI- H226、 NCI- H358、 NCI- H460、 NCI- H522、 NCI - H661、 NCI- H810、 NCI- H1155、 NCI- H1299、 NCI- H1395、 NCI- H1417、 NCI-H1435 、 NCI- H1581、 NCI-H1651、 NCI- H1703、 NCI- H1793、 NCI- H1963、 NCI- H2073、 NCI-H2085 、 NCI- H2106、 NCI - H2228、 NCI- H2342および NCI- H2347； ヒト卵巣癌細胞株 ES- 2、 Caov- 3、 MDAH2774, NIH: 0VCAR3、 0V - 90、 SK- 0V- 3、 丁(^-1120ぉょび1>(^-2 ； ヒ ト 瞵臓癌細胞株 PANC - 1、 MIA- PaCa- 2、 AsPC- 1、 BxPC- 3、 Capan- 1および Capan- 2； ヒ ト前立腺癌細胞株 DU145 ;ヒト網膜芽腫細胞株 WERI - Rb- 1および Y79 ;ヒト精巣癌細 胞株 Gates- 1Bの 86株は、 ATCCより購入した。 ヒ ト正常気道上皮細胞 SAECおよびヒ ト正常前立腺上皮細胞 HPrECは、 Clonetics社より購入した。 ヒト大腸癌細胞株 C0CM1、 ヒト非小細胞肺癌細胞株 VMRC - LCDおよびヒ ト 立腺癌細胞株 PC3は、 JCRB より購入した。 これら細胞株は参考例 9以降の参考例でも用いることがある。 上記細胞株 91株より RNeasy Mini Total R A Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを調製した。 このトータル RNAを錄型としてランダムプライマーを用いた逆転 写反応で cDNAを調製し、定量的 PCR反応を行うことにより、 SEMA4B遺伝子（配列番 号： 2 ) 、 SEMA4B- Ml遺伝子 （配列番号： 5 ) 、 SEMA4B- M2遺伝子 （配列番号： 8 ) および SEMA4B-M3遺伝子 （配列番号： 1 1 ) の発現量を検討した。
該 PCR反応は、 上記トータル RNA 3〜4ngより得られた cDNAを铸型として使用し、 参考例 3と同一条件で PCR反応を行い、 SEMA4B、 SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2および SEMA4B-M3遺伝子の発現コピー数を算出した。 並行して TaqMan™ Human β -actin Control Reagents (Applied Biosystems社） を用いて上記トータノレ RNA 1 ngに含 まれる /3 -ァクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、 β -了クチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現 率を表 4に示す。
上記遺伝子発現量の総量が β一了クチン遺伝子発現量の 1%を超える癌細胞株が 17株見出され、 上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
〔表 4〕
Figure imgf000092_0001
参考例 6
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例 4で得たプラスミド SEMA4B/pCR4 - T0P0を铸型とし、 PCRで SEMA4B遺伝子を 增幅した。 該反応における反応液の組成は SEMA4B/pCR4 - TOPO 2ngを铸型として使 用し、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） を 2. 5U、 2種類のプ ライマー （配列番号： 1 9および配列番号： 2 1 ) を各 1 μ Μ、 dNTPsを 200 μ Μ、 お ょぴ 10 x Pfu Bufferを 5 μ ΐ加え、 50 μ 1の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の 後、 95°C · 1分、 60°C · 1分、 72°C · 4分のサイクルを 25回繰り返し行った。次に PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて該 PCR反応産物を精製した後、 制限酵素 Xba I および Eco RIにて処理した。 プラスミド p3xFLAG-CMV- 14 (Sigma社） も Xba Iおよ び Eco RIにて処理した。 それぞれの DNA断片は PCR Purification Kitにて精製し、 DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio社） を用いてライゲーシヨン反応を行った 。ライゲーシヨン反応液を大腸菌 T0P10に導入した後、形質転換された大腸菌をァ ンピシリンを含む LB寒天培地中で選択し個々のクローンを解析した結果、 SEMA4B 遺伝子 （配列番号： 2 ) に相当する cDNA断片を含むプラスミ ド pCMV- 14- SEMA4B を得た。 参考例 7
組換え型タグ付き完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
SEMA4Bタンパク質の C末端に 3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する動物 細胞用発現べクターを構築した。 SEMA4B遺伝子を PCRで増幅する時に用いるプライ マーペアを、 別のプライマーペア （配列番号： 1 9および配列番号： 2 0 ) に変 更したこと以外は参考例 6記載の方法に従い、 形質転換した大腸菌の選別を行つ た。 その結果、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の C末端に 3xFLAGタグが融合 したタンパク質をコードする cDNA断片を含むプラスミ ド pCMV - 14 - SEMA4B - 3xFLAG を得た。 参考例 8
ペプチド抗体の作製と精製
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) 、 SEMA4B - Mlタンパク質 （配列番号： 4 ) 、 SEMA4B-M2タンパク質 （配列番号： 7 ) および SEMA4B-M3タンパク質 （配列番号： 1 0 ) のアミノ酸配列に基づき、 12〜15アミノ酸からなる以下の 4種のペプチド（ ペプチド 1〜4 ) を Fmoc固相合成法により合成した。
ペプチド 1のアミノ酸配列 〔 .
Asn- Ser- Ala- Arg- Glu- Arg- Lys- lie- Asn- Ser- Ser- Cys (配列番号： 2 2 )〕は、 SEMA4B タンパク質（配列番号： 1 ) の 402番目から 412番目までのアミノ酸配列の C末端に 、 Cysを付加した配列である。
ペプチド 2のアミノ酸配列 [：
Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-Phe-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys (配列番号： 2
3 ) 〕 のアミノ酸配列は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 582番目から 596 番目までの配列である。
ペプチド 3のアミノ酸配列 〔
Pro-Leu-Asp-Hi s-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys (配歹幡号： 2
4 ) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 781番目から 794番目までのアミ ノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配列である。
ペプチド 4のアミノ酸配列 〔
Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys (配列番号： 2 5 ) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の 797番目から 809番目までのアミノ酸 配列の C末端に、 Cysを付加した配列である。
上記ペプチド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3およびペプチド 4のそれぞれのぺプ チドに、キーホールリンペットへモシァニン（KLH) をキャリアータンパク質とし て結合させ抗原とし、 以下のように、 ゥサギポリクローナル抗体を作製した。 免疫動物は雄性ゥサギ KBL:JW (11週齢、 オリエンタル酵母） 一羽を用い、 初回 感作は完全フロインドアジュパンド （D co社） 懸濁液、 2回目以降は不完全フロ ィンドアジュパンド（Difco社）懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い 、 1回の感作には各抗原 0. 5mgを用い、 初回感作後 14日毎に 3回繰り返した。 初回 感作後 52日目に麻酔下頸動脈採血を行い、 血清約 50mlを得た。 このようにして得 られた血清を硫酸ァンモニゥム塩析法により濃縮し、得られた粗 IgG画分全量をプ 口ティン Aアブイ二ティーカラム （Amersham - Bioscience社） により精製し、 ぺプ チド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3またはペプチド 4を免疫したゥサギから、 それ ぞれ約 103mg、 約 76mg、 約 112mgおよび約 122mgの精製 IgGを得た。 さらに、 各々の 免疫源ぺプチドを固定化した力ラムに結合する IgG画分を取得した。固定化には各 ペプチドの C末端の Cysを利用し、 ホウ酸緩衝液を用,いてセファロースカラム （ Amersham- Bioscience社）にカップリングした。カラムからの溶出には 8M尿素 Zリ ン酸緩衝化生理食塩水 (PBS) を用いた。 溶出液を PBSに対して透析して尿素を除 いた後、 限外濃縮、 フィルターろ過滅菌することにより、 ペプチド 1、 ペプチド 2、 ぺプチド 3およびべプチド 4に対するァフィ二ティー精製抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS- 2591および AS - 2592を、 約 15mg、 約 126mg、 約 17mgおよぴ約 35mgずつ 取得した。 参考例 9
ゥサギぺプチド抗体を用いたウェスタンブロッテイング
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) の検出は、 参考例 8で作製した精製べプチ ド抗体を用いて行った。 ヒト非小細胞肺癌由来 NCI- H358細胞 1. 5 X 106個を 10%牛 胎仔血清（JRH社）を含む RPMI- 1640培地（Invitrogen社） 10 mlに懸濁し、直径 10cm のぺトリディッシュに播種した。 5%炭酸ガス気流下、 37°Cでー晚培養した。参考 例 6で作製したプラスミド pCMV- 14 - SEMA4B 6 μ § と Plus試薬 （Invitrogen社） および 0PTI- MEM I ( Invitrogen社） とを混合し、 室温で 15分間放置した後、 LipofectAMINEトランスフエクション試薬（Invitrogen社） および 0PTI- MEM Iを添 加し、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液を培養液に滴下して培養を継続 した。 発現プラスミド導入 2日後に細胞を氷冷した PBSで洗浄し、 氷冷した RIPA緩 衝液〔50IBMトリス.塩酸緩衝液、 pH 7. 5、 150 raM塩化ナトリウム、 l%Triton X- 100 、 0. 1 %SDS、 1 %デォキシコーノレ酸、 Complete™タブレット （Roche Diagnostics 社） 、 Phosphatase Inhibitor Cocktail- 2 (Sigma社） 〕 1mlを添加し 4°Cで 30分間 放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15， OOOrpmで 20分間遠心分離した上澄液を無 細胞抽出液とした。この無細胞抽出液および 2倍濃度 SDS- PAGE用サンプルバッファ 一 Cl25mM トリス ·塩酸緩衝液、 pH6. 8、 40%グリセロール、 4%SDS、 0. 04%プロ モフエノールブルーおよび 5% 2 -メルカプトエタノール〕 を等容量で混合し、 95 °Cで 5分間加熱した後、 ΙΟ μ Ιを 10%アクリルアミドゲルでの SDS-PAGEに供した。 泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブ口ット Ρ膜（ATT0社） に転写した 後、 ブロッキング溶液 〔50mMトリス .塩酸緩衝液、 pH 7. 5、 500 mM塩化ナトリウ ム、 0. 1% Tween 20N 5%スキムミルク〕 中に 1時間寧温放置した。 次に、 参考例 8で作製したペプチド抗体 AS - 2531、 AS- 2532、 AS - 2591または AS- 2592を、 3 μ §/πι1 の濃度となるようブロッキング溶液で希釈し、 4°Cにて一晩反応させた。 続いて、 ブロッキング溶液で 5万倍または 10万倍に希釈した HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 （ Amersham- Bioscience社） 中で 1時間室温放置した。 検出には ECL plus ( Amersham - Bioscience社）を用い、添付プロトコールに従い SEMA4Bタンノヽ。ク質を検 出した。
AS - 2531を除き、 AS- 2532、 AS- 2591および AS- 2592のいずれを用いた場合でも、 分子量 100kD近傍の位置に SEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンドが認めら れた。 - 参考例 1 0
ゥサギぺプチド抗体を用いた免疫沈降
参考例 8で作製した精製べプチド抗体を用いて、 SEMA4Bタンパク質の免疫沈降 を非変性状態にて行った。
参考例 7で得たプラスミド pCMV - 14- SEMA4B - 3xFLAGを用いて、参考例 9と同様の 操作で無細胞抽出液を調製した。 Protein G-Sepharose 4FF (Amersham— Bioscience 社） を等容量の RIPA緩衝液で懸濁した懸濁液 50 At 1に無細胞抽出液 400 μ 1を加え、 さらに参考例 8記載のペプチド抗体 AS - 2531、 AS-2532、 AS - 2591または AS- 2592の いずれか一つを 5 g加えた混合液を調製し、 4°Cにて一晩撹拌した。 Protein G - Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗浄後、 50 μ 1の SDS- PAGE用サンプ ルバッファー 〔62. 5πιΜ トリス '塩酸緩衝液、 ρΗ6. 8、 20%グリセロール、 2%SDS 、 0. 02%プロモフヱノールプル一および 2. 5% 2 -メルカプトエタノール〕 に懸濁 し、 95°Cで 5分間加熱した後、 5 μ 1または 10 /z 1を 10%アクリルアミドゲルでの SDS - PAGEに供した。検出は参考例 9記載の方法に準拠した。但し、マウス抗 FLAG M2 抗体（Sigma社）をブロッキング溶液で 0. 2 μ g/mlまたは 0. g/mlとなるように希 釈したものを一次抗体として、 HRP標識抗マウス: IgG抗体 （Amersham- Bioscience 社） をプロッキング溶液で 2. 5万倍または 5万倍に希釈したものを二次抗体として 用いた。
ペプチド抗体 AS-2531、 AS- 2532、 AS- 2591および AS72592のいずれを用いて免疫 沈降を行つた場合にも、分子量 100kD近傍に SEMA4Bタンパク質に由来する特異的な バンドが認められた。
これより、 ペプチド抗体 AS - 2531、 AS- 2532、 AS- 2591および AS - 2592は、 未変性 の SEMA4Bタンパク質と結合することが明らかとなった。 参考例 1 1
癌細胞株における SEMA4Bタンパク質の発現検討
肺癌細胞株 NCI- H2228、 NCI- H1651、 NCI - H358、 NCI- H23ならびに NCI- HI 703；卵 巣癌細胞株 SKOV- 3ならびに TOV- 21G；前立腺癌細胞株 DU145；および膝癌細胞株 PANC- 1を、直径 10cmのぺトリディッシュ 2枚で培養した。各々の細胞についてぺト リディッシュ 1枚分をトリプシン · EDTA (Invitrogen社） で分散し、細胞数を計測 した。計測した細胞数を基にして、 5 X 106個の細胞に対して 1 mlの割合で氷冷 RIPA 緩衝液 （参考例 9に記載） を残りのペトリデイツシュ 1枚に添加し、 4°Cで 30分間 放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15, OOOrpmで 20分間遠心分離した上澄液を無 細胞抽出液とした。 一方、 Size™ X ProteinG Iramunoprecipitation Kit (Pierce 社） の添付プロ トコールに従い参考例 8記載のペプチド抗体 AS- 2531を ProteinG-Sepharose 4FF (Amersham - Bioscience社） に架橋した樹脂を用意し、 等 容量の RIPA緩衝液で懸濁した。この懸濁液 30 1に前述の無細胞抽出液 400 μ 1を加 え、 4°Cにてー晚撹拌を行った。 ProteinG- Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液 にて洗浄後、 参考例 1 0記載の SDS- PAGE用サンプルバッファー 30 1に懸濁し 95 °Cで 5分間加熱した後、 20 μ 1を 10%アクリルアミ ドゲルでの SDS- PAGEに供した。 検出はぺプチド抗体 AS-2532を用いて参考例 9記載の方法に準じて行った。
上記 9種類の細胞株の中で、 NCI- H2228、 NCI- H358、 NCI- H23、 SKOV- 3、 DU145お ょぴ PANC- 1の各細胞株において、分子量 100kD近傍に、 SEMA4Bタンパク質に由来す る特異的なバンドが認められた。 これより、 SEMA4Bタンパク質が、上記 6種類の癌 細胞株で高発現していることが明らかとなった。 参考例 1 2
組換え型完全長タンパク質安定発現細胞株の樹立 ，
ヒト非小細胞肺がん由来 NCI-H358細胞 2. 0 X 105個を 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ImMピルビン酸ナトリゥムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社 ) 2 mlに懸濁し、 6ゥエルプレートに播種した後、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで一 晚培養した。 一方、 0PTI- MEM I (Invitrogen社） で希釈した参考例 6記載のプラ スミ ド pCMV - 14- SEMA4B Ι /x gを Plus試薬 （Invitrogen社） 6 μ 1と混合し室温で 15 分間放置した後、 0PTI- MEM I で希釈した LipofectAMINEトランスフエクシヨン試 薬 （Invitrogen社） 4 μ 1を添カ卩し、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液を 培養液に滴下してさらに 1日培養を継続した後、 トリプシン · EDTA (Invitrogen 社） で細胞を分散し、上記の培養培地に G418 (プロメガ社） を 400 μ g/mlとなるよ うに加えた培地で 10倍に希釈して 24ゥエルプレートに播種した。 3日または 4日ご とに G418を含む上記培地（G418選択培地） を交換しながら 5%炭酸ガス気流下、 37 °Cで培養を継続した。 1個〜 3個の細胞が増殖しコロニーを形成したゥエルから細 胞を回収し、 48ゥヱルプレートの 2ゥエルに等しく播種した。細胞密度が 50%以上 になるまで培養を継続した後、 1ゥヱル分の細胞に参考例 1 0記載の SDS- PAGE用サ ンプルバッファー 50 μ 1を加え、細胞溶解液を調製した。 95°Cで 5分間加熱処理し た後、 5 μ ΐを 10%アクリルアミドゲルでの SDS - PAGEに供した。 参考例 9で記載し た方法に準じ、 ぺプチド抗体 AS- 2532を用いてウェスタンプロッティングを行い、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) を構成的に発現する安定発現細胞を探索した 。もう一方のゥエルから回収した細胞を、 1ゥエルあたり 0. 7個となるように希釈 後、 96ゥエルプレートに播種した。 G418選択培地を 3日あるいは 4日ごとに交換し ながら細胞密度が 50%程度になるまで、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで培養を継続し た。再ぴ、 48ゥヱルプレートの 2ゥヱルに等しく播種し、細胞密度が 50%以上にな るまで培養を継続し、 1ゥヱル分の細胞から調製した細胞溶解液を用いて、 上記 と同様にウェスタンブロッテイングを行った。 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1 ) を最も高発現するクローンを選ぴ、 SEMA4B安定発現細胞株 SEMA4B/H358を得た。 参考例 1 3
SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （ピオチン標識） .
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI - H2228ならぴに NCI - H358、およぴ参考例 1 2で作製 した組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株（SEMA4B/H358) を用いて、細胞 表層上【こ露出してレヽるタンノ ク質を Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics社） を用いてビォチン標識した。 続いて、 参考例 9の方 法に従い調製した無細胞抽出液 lmlと参考例 8で作製したぺプチド抗体 AS- 2591 5 とを用いて、 参考例 1 0の方法に従って免疫沈降し SDS - PAGEを行った。 HRP 標識したストレプトァビジン（Amersham- Bioscience社）を用いて検出したところ 、 分子量 100 k D近傍に SEMA4Bタンパク質に由来するバンドが認められ、 SEMA4B タンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B- M2タンパク質およぴ SEMA4B- M3タンパ ク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。 参考例 1 4
SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （FACS解析）
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI-H2228ならびに NCI - H358、および参考例 1 2に記載 した SEMA4B/H358を、直径 10cmのぺトリディッシュにそれぞれ播種し、サブコンフ ルェントになるまで培養した。 各細胞を PBSで 浄後、 0. 5%BSAおよび 5mM EDTA を含む PBSを加え室温で 15分間放置し、細胞を分散した。 次に、緩衝液 A〔2%牛胎 仔血清（JRH社）および 0. 1%アジ化ナトリゥムを含む HBSS (Hanks ' Balanced Salt Solutions, Invitrogen社） 〕 で 4 X 106個/ mlの濃度になるように細胞を懸濁し、 終濃度 lO g/mlとなるよう AS - 2532または非免疫ゥサギ IgG (Jackson社） を加え、 氷中に 3時間放置した。 緩衝液 Aで細胞を洗浄後、 10 μ g/mlの Alexa488標識抗ゥサ ギ IgG抗体 （Molecular Probes社） を含む緩衝液 Aで懸濁し、 氷上にて 2時間放置し た。 緩衝液 Aで再ぴ洗浄後、 FACScan (BDバイオサイエンス社) にて解析した。 そ の結果、 いずれの細胞においてもゥサギぺプチド抗体 AS-2532特異的に染色され、 SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B-M2タンパク質および SEMA4B - M3 タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。 参考例 1 5
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非 、細胞肺癌細胞株 NCI- H358の アポトーシス誘導
参考例 2に記載の NCI-H1703以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチ センスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討し た。
10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ImMピルビン酸ナトリウムおよび25 niM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） で NCI- H358を懸濁し、 1ゥエル当たり 8 X 103個の 細胞密度 （培地液量 80 μ 1) となるよう、 NCI-H358を 96穴平底組織培養プレート （ BDファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cでー晚培養した。 一方、 参 考例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3 ) およびコント 口ールォリゴヌクレオチド（配列番号： 1 4 )各 0. 06 μ gを OPTI- MEM I (Invitrogen 社） で希釈し、 Plus試薬 （Invitrogen社） 0. 5 μ 1と混合した後、 室温で 15分間放 置した。 OPTI- MEM I で希釈した LipofectAMINEトランスフエクション試薬 （ Invitrogen社） 0. 4// 1を加え、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液全量を NCI-H358の培養液に添加し 3日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社） および Caspase- Glo 3/7 assay (Promega社） の 添付プロトコールに従い、 上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測 定した。
その結果、 NCI-H358においては、 Cell Death Detection ELISAPLUSおよび Caspase_Glo 3/7 assayともに、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象とし て用いたコントロールォリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ 1. 42倍おょぴ 1. 77倍 のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（P 0. 01) を示した （表 5 および表 6 ) 。 〔表 5〕
アポトーシス誘導活性 （A4。5— A492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 21 7 0. 007
コント口ールォリゴヌクレオチド 0. 330 0. 041
(配列番号： 1 4)
アンチセンスオリゴヌクレオチド 0. 467 0. 029
(配列番号： 1 3)
〔表 6〕
アポトーシス誘導活性 （CPS)
平均値 標準偏差
ブランク 7625 235
コント口一ルォリゴヌクレオチド 8727 1 88
(配列番号： 1 4)
ァンチセンスォリゴヌクレ才チド 1 5452 570
(配列番号： 1 3) 参考例 16
ァンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒ ト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228 、 NCI- H1651および NCI- H23のアポトーシス誘導
NCI-H1703 (参考例 2) および NCI- H358 (参考例 15) 以外のヒト非小細胞肺癌 細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが 誘発されるか否かを検討した。
NCI- H2228には、 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ImM ピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） を用いた。 NCI- H1651には、 10 %FBSを含む ACL- 4培地 （ATCC) を用いた。 NCI- H23には、 10%牛胎仔血清 （JRH社 ) および 25mMHEPESを含む RPMI-1640培地 （Invitrogen社） を用いた。 各細胞をそ れぞれの培地に懸濁し、 1ゥヱル当たり 7.5X103個 （NCI- H2228) 、 7.5X103個 （ NCI-H1651) および 5X103個（NCI - H23)の細胞密度 （培地液量 125 μΐ) となるよう 96穴平底組織培養プレート （BDファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37 °Cで一晩培養した。 一方、 参考例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配 列番号： 13 )およぴコントロールォリゴヌクレオチド（配列番号： 14 )各 0· 135 /zgを OPTI - MEM I (Invitrogen社） で希釈し、 Plus試薬 （Invitrogen社） 0.75 1 と混合した後、 室温で 15分間放置した。 0PTI - MEM I .で希釈した LipofectAMINEト ランスフヱクション試薬 （Invitrogen社） 0, 4/x 1を加え、 さらに室温で 15分間放 置した。 この混合液全量を各細胞の培養液に添加し 3日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社）の添付プロトコールに従い上記 オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、 いずれの細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰 性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ 1.58倍 （ NCI-H2228) 、 1.21倍 （NCI- H1651) および 1.25倍（NCI- H23)のアポトーシス誘導活 性を示し、 危険率は P≤0.05 (NCI - H2228) 、 P≤0.05 (NCI - H1651) および P≤ 0.01 (NCI-H23)と算出され、統計学的に有意な差を示した（表 7、表 8および表 9 )
〔表 7〕
アポトーシス誘導活性 （A405— A492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 31 2 0. 009
コント口—ルォリゴヌクレ才チド 0. 526 0. 0 3
(配列番号： 1 4)
アンチセンスオリゴヌクレオチド
(配列番号 : 1 3) 〔表 8〕
アポト一シス誘導活性 （A405_A 492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 523 0. 091
コントロールオリゴヌクレオチド 1. 1 52 0. 1 01
(配列番号： 1 4)
ァンチセンスォリゴヌクレオチド 1. 390 0. 1 04
(配列番号： 1 3) 〔表 9〕
アポ! ^一シス誘導活性 （A405— A492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 678 0. 028
コント口ールォリゴヌクレオチド 1. 081 0. 050
(配列番号： 1 4)
ァンチセンスォリゴヌクレオチド 1. 351 0. 058
(配列番号： 1 3) 参考例 17
ゥサギぺプチド抗体を用いたアポトーシス誘発
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228を、参考例 8で取得したゥサギぺプチド抗体
AS- 2531および AS - 2532で処理し、 これらゥサギぺプチド抗体のアポトーシス誘導 活性を測定した。 .
NCI- H2228を、 10%牛胎仔血清（JRH社）、 ImMピルビン酸ナトリゥムおよび25 mM
HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） に懸濁し、 1ゥヱル当たり 4X 103個 の細胞密度になるよう I型コラーゲンをコートした 96穴平底耝織培養プレート（BD ファルコン社) に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した。参考例 8で 取得したゥサギぺプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、および非免疫ゥサギ IgG (Jackson 社）を PBSで希釈し、各抗体について終濃度が 15μ g/ml、 45 g/mlおよび 150 ^ g/ml となるよう培養液にそれぞれ添加した。 さらに 5日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社） の添付プロトコールに従い、 上記ゥサギぺプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、 45 g/mlおよび 15 g/mlの AS - 2531存在下では、同濃度の非免疫ゥサ ギ IgGに比べ、 1.26倍および 1.31倍のアポトーシス誘導活性を示した （P≤0.05お ょぴ P 0.01)。また、 150μβ/ηι1の AS- 2532存在下では、同濃度の非免疫ゥサギ IgG に比べ、 1.27倍のアポトーシス誘導活性を示した （P≤0.01) 。
このように、 SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B - Mlタンパク質、 SEMA4B-M2タンパク質 および SEMA4B- M3タンパク質は、ヒト肺癌細胞の生存維持に重要な働きをしている ことが明らかとなった。 実施例 1
PlexinBlと SEMA4Bとの結合 ，
( 1 ) PlexinBl細胞外領域 cDNAのクローニング
ヒ ト腎臓由来 cDNA (MTC Panel, BD CL0NTECH社） を錡型とし、 PlexinBlの cDNA を PCRで取得した。 該反応における反応液の組成は上記 cDNA 1 1を铸型として使 用し、 Pfu Turbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） を 1. 25 U、 2種類のプライマー (配列番号： 2 7および配列番号： 2 8 ) を各 2 μ Μ、 dNTPsを 200 /ζ Μ、および 2x GC Buffer I (Takara Bio社） を ΙΟ μ Ι加え、 20 μ 1の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 30秒、 72°C · 6分 30秒のサイクルを 40回繰り返し、 さらに 72°C · 7分間の反応を追カ卩した。 同様の条件で、別のプライマーペア （配列 番号： 2 9および配列番号： 3 0 ) を用いた PCR反応も並行して行った。 それぞれ の PCR反応産物を T0P0 XL PCRクローニングキット （Invitrogen社） の処方に従い 、 クリスタルバイオレットを 1. 6 /z g/mlとなるよう添カ卩した 0. 8%ァガロースゲル で分離し、 MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。 これを プラスミドベクタ一 pCR- XL- T0P0 (Invitrogen社） へサブクローニングし大腸菌 TOP10 (Invitrogen社） に導入した後、カナマイシンを含む LB寒天培地中で選択し た。個々のクローンの配列を解析した結果、 PlexinBl全長 cDNAの- 95番目から 3016 番目に相当する cDNA断片を含むプラスミド （pCR - XL- PLXNB1- NT) 、 および I628番 目から 5840番目に相当する cDNA断片を含むプラスミド （pCR- XL-PLX B1- CT) をそ れぞれ得た。
まず、 pCR- XL- PLXNB1 - NTを 2種類の制限酵素（EcoRIと SnaBI)で同時消化し約 2kbp の DNA断片を得た （DNA断片- 1) 。続いて、 pCR- XL- PLXNB1- CTを 3種類の制限酵素 （ SnaBI, Dralおよび Xbal) で同時消化し約 4. lkbpの DNA断片を得た (DNA断片 - 2) 。 ' 最後に pcDNA3. 1 (+)プラスミド（Invitrogen社） を 2種類の制限酵素（EcoRIと Xbal ) で同時消化し、 約 5. 4kbpの DNA断片を得た （DNA断片- 3) 。 上記 DNA断片- 1、 DNA 断片- 2および DNA断片- 3を、 MinElute Gel Extraction Kitを用いて別々に精製し た後、 容量比 2： 2 ： 1の割合で混合し 5 ^ 1とした。 さらに DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio社） の溶液 Iを 5 μ 1加え 16°Cで 30分間反応させた後、 2 μ 1を抜きとり 、大腸菌 T0P10を形質転換した。個々のクローンの配列を解析し、 PlexinBl全長 cDNA の- 95番目 から 5840番目 に相当する cDNA断片を含むプラス ミ ド （ pcDNA3. l(+)-PLX Bl-NT2) を得た。 ，
次に、 細胞外領域のみをコードする cDNA断片を取得する為に、 上記プラスミド (pcDNA3.1(+) - PLXNB1 - NT2)を铸型とする PCR反応を行った。該反応における反応 組成は、 上記プラスミドを 10ng、 Pfu Turbo DNA Polymeraseを 1.25 U、 2種類のプ ライマー （配列番号： 31および配列番号： 32) を各 1μΜ、 d TPsを 200//¾1、 お ょぴ 2x GC Buffer Iを ΙΟμΙ加え、 20μ1の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の 後、 95°C · 30秒、 65°C · 30秒、 72°C · 5分のサイクルを 30回繰り返し、 さらに 72 °C · 7分間の反応を追加した。 PCR反応産物を T0P0XLPCRクローユングキットの処 方に従い、 クリスタルバイオレットを 1·6μ§/ιη1となるよう添カ卩した 0.8%ァガロ ースゲルで分離し、 4〜5kbpの長さの DNAを MinElute Gel Extraction Kitを用いて 精製した。これをプラスミドベクター pCR- XL - T0P0へサブクローニングし、大腸菌 T0P10に導入した後、カナマイシンを含む LB寒天培地中で選択した。個々のクロー ン.を解析した結果、 PlexinBl全長 cDNAの- 44番目から 4443番目に相当する断片の両 端に、 制限酵素 BamHIの認識配列が付加した DNA断片を含むプラスミ ド pCR- XL- PLXNB1- ECDを得た。
(2) PlexinBl細胞外領域部分タンパク質発現ベクターの構築
上記 （1) で得られたプラスミド （pCR- XL- PLXNB1- ECD) の PlexinBl配列中に存 在する BamHI認識配列を潰すために、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社） の処方に従い、 PlexinBl全長 cDNAの 3483番目に位置する Tを Cに 変換し、 サイレント変異を導入したプラスミド pCR-XL- PLXNB1- ECD- Mlを作製した 一方、 C末端にヒト免疫グロプリンの定常（Fc)領域を付加した融合タンパク質 として PlexinBl細胞外領域を発現させるために、 ヒト Fc領域を PCRで増幅した。反 応液の組成は、 ヒト脾臓由来 cDNA (MTC Panel, BD CLONTECH社） を 1 1、 Pfu Turbo DNA Polymeraseを 1.25 U、 2種類のプライマー （配列番号： 33および配列番号： 34) を各 0.5^Μ、 dNTPsを 200/ Μ、 および 2x GC Buffer Iを lO^ul加え、 20 μ 1 の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 30秒、 65°C · 30秒、 72°C · 1 分のサイクルを 30回繰り返し、 さらに 72°C · 7分間の反応を追加した。 PCR反応産 物を MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製し、 プラスミドべ クタ一 pCR4 - T0P0 (Invitrogen社）へサブクローニングした。形質転換した大腸菌 T0P10をカナマイシンを含む LB寒天培地中で選択し個々のクローンの配列を解析 した結果、 ヒト Fc領域をコードする cDNA断片を含むプラスミド pCR4- T0P0 - Fcを得 た。
まず、 pCR4- T0P0- Fcを 2種類の制限酵素 （BamHIおよび Hindi II) で同時消化し、 約 0. 7kbpの DNA断片を得た （DNA断片- 4) 。 次に、 前述の pCR- XL- PLXNB1- ECD- Mlを BamHIで消化し、 約 4. 5kbpの DNA断片を得た （DNA断片- 5) 。 最後に pcDNA3. 1 (- )プ ラスミド（Invitrogen社） を 2種類の制限酵素 （BamHIおよび Hindlll) で同時消化 し、 約 5. 4kbpの DNA断片を得た （DNA断片- 6) 。 DNA断片- 4、 DNA断片 - 5および DNA 断片- 6を MinElute Gel Extraction Kitを用いて別々に精製した後、 容量比 2： 2 ： 1の割合で混合し 5 μ 1とした。 DNA Ligation Kit ver. 2の溶液 Iを 5 μ 1加え、 16 °Cでー晚反応させた後、 2 μ 1を抜きとり大腸菌 T0P10を形質転換した。アンピシリ ンを含む LB寒天培地中で選択した個々のクローンを解析した結果、ヒト Fc領域が C 末端側に繋がった PlexinBlキメラタンパク質を発現させることのできるプラスミ ド pcDNA3. 1 ( -) - PLXNB1- ECD/Fcを得た。
( 3 ) 組換え型 PlexinBl/Fc融合タンパク質の調製
参考例 5に記載したヒ ト胎児腎臓由来細胞株 HEK293 (1. 5 X 106個） を 10%牛胎 仔血清 （JRH社） を含む DMEM培地 （Invitrogen社） 10mlに懸濁し、 I型コラーゲン をコートした直径 10cmのぺトリディッシュ （BDフアルコン社） に播種後、 5%炭酸 ガス気流下、 37 °Cで一晩培養した。 実施例 1 _ ( 2 ) で得たプラスミ ド pcDNA3. 1 ( -)一 PLX B1- ECD/Fc 6 i gを 0PTI - MEM I (Invitrogen社） で 200 となる ように希釈し、 FuGENE6トランスフヱクション試薬 （Roche Diagnostics社） 18 μ 1 を加え室温で 30分間放置した。 この混合液を培養液に滴下し一晩培養を継続した 。 翌日細胞を PBSで洗浄し、 0PTI- MEM I (Invitrogen社） 10mlに培地交換し、 さら に二日間培養を継続した。 その後、 培養液を MILLEX- GV (MILLIP0RE社） でろ過し 、分画分子量が 10, 000の膜を装着した遠心式限外濃縮装置 (MILLIP0RE社）を用いて 約 20倍に濃縮した。 この濃縮液を PLXNBl/Fcと命名した。 プラスミ ド pcDNA3. 1 (-）- PLXNB1 - ECD/Fcを添加せずにトランスフエクシヨンした場合の培養 上清も並行して調製し、 陰性対照と命名した。
( 4 ) PlexinBlと SEMA4Bとの結合実験 ，
参考例 1 0に記載の方法に従って、 ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H358にプラス ミド pCMV- 14- SEMA4B- 3xFLAG (参考例 7に記載） をトランスフエクシヨンし、無細 胞抽出液を調製した。 実施例 1一 （3 ) で調製した PLXNBl/Fc 200 /z lまたは陰性 対照 200 μ 1に、 上記無細胞抽出液を 250 μ 1加えた混合液を用意し、 参考例 1 0に 記載した Protein G-Sepharose 4FF (Amersham- Bioscience社） 懸濁液 50 μ 1を添加 し、 4°Cで一晚撹拌した。 Protein G-Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液 （参 考例 9に記載） で洗浄後、 50 の SDS- PAGE用サンプルバッファー （参考例 9に記 載） に懸濁した。 95°Cで 5分間加熱した後、 20 μ 1を 7. 5%ァクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 AS- 2591抗体（参考例 8に記載） を、参考例 9記載のブロッキ ング溶液で 3 g/mlとなるように希釈したもの、 またはマウス抗 FLAG M2抗体 （ Sigma社） を上記ブロッキング溶液で 0. 2 μ g/mlとなるように希釈したものを一次 抗体として用いた。 その後、 HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 （Amersham- Bioscience社 ) を上記ブロッキング溶液で 10万倍に希釈したもの、 または HRP標識抗マウス IgG 抗体（Amersham- Bioscience社） を上記ブロッキング溶液で 5万倍に希釈したもの を二次抗体として用い、 ECL plus (Amersham— Bioscience社） の添付プロトコール に従レ、 SEMA4Bタンパク質を検出した。 その結果、 PLXNBl/Fcを用いた場合にのみ、 SEMA4Bタンパク質が検出できた。
これより、 SEMA4Bタンパク質は PlexinBlタンパク質と結合することが明らかと なった。 実施例 2
' PlexinBlと SEMA4Bとの結合 （FACS解析）
( 1 ) 組換え型 PlexinBl/Fc融合タンパク質安定発現株の樹立
参考例 5に記載したヒト胎児腎臓由来細胞株 HEK293 (2 X 106個） を 10%牛胎仔 血清 （JRH社） を含む DMEM培地 （Invitrogen社） 10mlに懸濁し、 I型コラーゲンを コートした直径 lOcniのぺトリディッシュ （岩城硝子社） に播種後、 5%炭酸ガス気 流下、 37 °Cで一晩培養した。 実施例 1 一 （ 2 ) で得たプラスミ ド pcDNA3. 1 (-) -PLXNBl-ECD/Fc 6 μ gを OPTI— MEM I (Invitrogen社） で 1200 μ 1となる ように希釈し、 FuGENE6トランスフヱクション試薬 （ oche Diagnostics社） 18 μ 1 を加え室温で 30分間放置した。培養液に滴下してさらに 1日培養を継続した後、 ト リプシン * EDTA (Invitrogen社） で細胞を分散し、 上記の培養培地に G418 (プロ メガ社） を 750 μ g/ralとなるように加えた培地（G418選択培地） で 10倍に希釈して 、 I型コラーゲンをコートした直径 10cmのペトリディッシュに播種した。 3日また は 4日ごとにトリプシン · EDTAで細胞を分散し 10倍に希釈した後、 G418選択培地 で培養を継続した。 G418選択培地で培養を開始してから 2週間後に増殖してきた 細胞を集め、 PlexinBl/Fc融合タ ンパク質安定発現 HEK293細胞株 （ PLX B1-Fc/HEK293) と命名した。
( 2 ) PlexinBl/SEMA4B結合活性の解析
実施例 2—（ 1 )で得た PLXNB1- Fc/HEK293を 10%牛胎仔血清（JRH社）を含む DMEM 培地（Invitrogen社） 10mlに懸濁し、 I型コラーゲンをコートした直径 10cmのぺト リディッシュ （岩城硝子社） に播種後、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで一晩培養した 。 翌日細胞を PBSで洗浄し、 非必須アミノ酸 （Invitrogen社） と ITS- Xサプリメン ト （Invitrogen社） を含む Ml"培地 （Invitrogen社） 10mlに培地交換し、 さらに 二日間培養を継続した。その後、培養液を孔径 0. 45 μ ιηのフィルター （BDフアルコ ン社） でろ過し、 分画分子量 ^^，(^。の限外濃縮装置^^^^^！^ネ を用ぃて約^) 倍に濃縮した。 この濃縮液を PLX Bl/Fc (lot No. 2)と命名し以下の検討に用いた。 参考例 5に記載したヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI-H358およぴ参考例 1 2で得た SEMA4B安定発現細胞株 SEMA4B/H358を、 10%牛胎仔血清 （JRH社）、 ImMピルビン酸 ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1δ40培地 （Invitrogen社） で懸濁し、 そ れぞれの細胞を直径 10cmのペトリディッシュ （BDファルコン社） に播種し、 サブ コンフルェントになるまで培養した。 各細胞を PBSで洗浄し、 0. 25%BSAおよぴ 2. 5mM EDTAを含む PBSを加え 15分間室温放置して細胞を分散した。 前述の PLXNBl/Fc (lot No. 2)を 50 μ 1含むように調製した 2δ0 μ 1の緩衝液 Α (参考例 1 4に 記載） で 3 X 106個の細胞を懸濁し、 氷中に 3時間放置した。 その後、 緩衝液 Aで細 胞を洗浄し、 10 /1111の八16 3488標識抗ヒト IgG抗体 （Molecular Probes社） を含 む緩衝液 Aで再懸濁し、 永中で 1時間放置した。 緩衝液 Aで再度洗浄後、 FACScan ( BDバイオサイエンス社） で細胞に結合した Alexa488の蛍光強度を測定した。
その結果、 V、ずれの細胞も PLXNBl/Fc (lot No. 2)と結.合したものの、 SEMA4B/H358 細胞株は NCI- H358細胞株に比べ PLX Bl/Fc (lot No. 2)結合量が多く、 SEMA4Bタンパ ク質発現量と良く相関した。 このことから、 SEMA4Bタンパク質と PlexinBlタンパ ク質が特異的に結合することが明らかとなった。 実施例 3
ゥサギ抗 SEMA4Bポリクローナル抗体の SEMA4B/PlexinBl結合阻害活性
( 1 ) 組換え型 SEMA4Bタンパク質の発現と精製
組換え型 SEMA4Bタンパク質は、 SEMA4Bの細胞外ドメィンとその C末端側に
FLAG - tagまたは 6 x His- tagを付カ卩したタンパク質を発現するようにベクターを作 製し、 BAC— TO- BAC Baculovirus Expression System (Invitrogen社） を用いてタ ンパク質発現系の構築を行った。 すなわち、 FLAG - tag付きタンパク質の場合は N 末端側に EcoR Iの制限酵素サイトを付加したプライマー （配列番号： 3 6 ) と C 末端側に FLAG- tag、 終止コドンおょぴ Hind IIIの制限酵素切断サイトを付加する ようなプライマー （配列番号： 3 7 ) を用いた。 6 X His- tag付きタンパク質の場 合は N末端側に EcoR Iの制限酵素サイトを付加したプライマー （配列番号： 3 6 ) と C末端側に 6 x His- tag、終止コドンおょぴ Hind IIIの制限酵素切断サイトを付カロ するようなプライマー （配列番号： 3 8 ) を用いた。 各々のプライマーペアを用 い参考例 6に記載されている pCMV— 14—SEMA4Bを铸型にして LA- Taq DNA
Polymerase (Takara Bio社） を添加し PCR反応を行い、 SEMA4B細胞外ドメインをコ ードする cDNA断片 （2151bp) を取得した。 PCR反応は、 94°C · 30秒、 60°C · 30秒、 72°C · 3分を 30サイクル繰り返した。 PCR産物はァガロースゲル電気泳動により分 離し、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社）で回収後、 pCR2. 1- T0P0 (Invitrogen 社） にクローニングして pCR2. 1/SEMA4B-FLAGおよぴ pCR2. 1/SEMA4B - Hisを得た。 塩基配列を確認後、 pCR2. 1/SEMA4B-FLAGおよび PCR2. 1/SEMA4B- Hisをそれぞれ EcoR I (Takara Bio社） と Hind III (Takara Bio社） とで同時消化した後、 ァガ ロースゲル電気泳動を行い QIAquick Gel Extraction Kitで DNA消化断片を回収し た。 pFASTBACl (Invitrogen社） についても同様にして DNA消化断片を回収し、 Ligation High (Toyobo社）を用いてライゲーシヨン反応を行い、 C末端に FLAG- tag を付加させたベタタ一 pFB/SEMA- FLAGまたは C末端に 6 XHis- tagを付加させたべク ター pFB/SEMA- Hisを作製した。次に、 BAC- TO- BAC Baculovirus Expression System の添付プロトコールに従い、 組換え Bacmid DNAを調製後、 組換えバキュ口ウィル スを取得した。
組換え型 SEMA4Bタンパク質の発現は、上記で得られた組換えウィルス 1/100量（ v/v)を Sf+細胞株（日本農産社）に感染させて行った。感染後、無血清培地 Sf- 900 II SFMを用いて 27°C、 100 rpmで 3日間振とう培養し、 組換え型タンパク質を含む 上清を回収した。 FLAGタグ付きタンパク質を含む培養液上清の場合は A TI- FLAG M2 Affinity Gel (Sigma社） を用い、 6 X Hisタグ付きタンパク質を含む培養液上 清の場合は Ni- NTA Superf low (QIAGEN社） を用いて分離精製し、更に Superdex 200 pg (Amersham- Bioscience社） で精製し、 組換え型 SEMA4B- FLAGおよび SEMA4B- His を取得した。
( 2 ) ゥサギ抗 SEMA4Bポリク口ーナル抗体の作製と精製
実施例 3 _ ( 1 )で調製した組換え型 SEMA4B- FLAGタンパク質を免疫原としてゥ サギポリク口ーナル抗体を作製した。 SEMA4B- FLAGタンパク質の PBS溶液とフロイ ンド完全アジュパントとを等量混合して作製したエマルシヨンを家兎 （日本白色 種、 雌、 3 kg) 3羽の背部皮下おょぴ皮内に 0. 1 mgタンパク質 /1羽で免疫した。 2 回目以降の免疫にはフロインド不完全ァジュパントに置き換えたタンパク質エマ ルシヨンを同様に調製し、 2週間毎に 7回追加免疫を繰り返した。
免疫前おょぴ 4回目と 6回目の免疫 1週後に耳静脈より採血し、 SEMA4B- FLAGタン パク質をコートしたィムノプレートを用いる ELISAにより血清抗体価の上昇を確 認した。 最終免疫の 1週間後に 3羽のゥサギより麻酔下、 類動脈採血を行い No. 1の ゥサギから 65. l ml、 No. 2のゥサギから 79. 5 ml、 No. 4のゥサギから 68. 0 mlの抗血 清を取得した。 これらの抗血清を PBSで 2倍希釈し、 遠心分離して上清を取得した 後、 実施例 3— ( 1 ) に記載した組換え型 SEMA4B - Hisタンパク質を HiTrap NHS- Activated HP (Amersham- Bioscience社） に固定化した抗原カラムに吸着させ た。 カラムを PBSで洗浄後、 0. 1 M Glycine- HC1 /0. 15 M NaCl ' (pH 3)で溶出し、 溶出液を 1 M Tris-HCl (pH 8)で中和した後、 PBSに対して 4°Cで終夜透析し、 ゥサ ギ抗 SEMA4Bポリク口ーナル抗体を精製取得した。
( 3 ) ゥサギ抗 SEMA4Bポリク口ーナル抗体の SEMA4B/piexinBl結合阻害活性 SEMA4Bに対する PlexinBlの結合活性は、参考例 1 2記載の SEMA4B/H358細胞株を 用い実施例 2— ( 2 ) に記載した方法に従ってフローサイトメトリー法で解析し た。 ゥサギ IgGの結合阻害活性の測定は、 実施例 3 _ ( 2 ) で取得したゥサギ抗 SEMA4Bポリクローナル抗体 No. 1、 No. 2、 No. 4または非免疫ゥサギ IgG (Jackson社 ) を添加して測定した。 非免疫ゥサギ IgG存在下で得られる PlexinBl結合活性を 100%と定義し、上記ゥサギ抗 SEMA4Bポリクローナル抗体の結合阻害活性を算出し た。 PlexinBl結合活性の算出には、 得られた蛍光強度の中央値を用いた。
その結果、終濃度 100 μ g/mlでゥサギポリクローナル抗体 No. 1が 63%、 No. 2が 74 %、 No. 4が 60%の結合阻害活性をそれぞれ示した。 さらに、 ゥサギポリクローナ ル抗体 No. 4の F (ab， ）2断片を用いて同様の結合阻害活性を検討したところ、 終濃 度 100 μ g/mlで 73%、 10 μ g/mlで 30%の結合阻害活性をそれぞれ示した。 実施例 4
ゥサギ抗 SEMA4Bポリクローナル抗体の増殖抑制活性
参考例 5記載の NCI- H358細胞株または参考例 1 2記載の SEMA4B/H358細胞株を、 1%牛胎仔血清 （JRH社)、 ImM ピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） で懸濁し、 1ゥヱル当たり 5 X 103個の細胞密度と なるように 96穴平底組織培養プレート (BDファルコン社) に播種した。 播種と同 時に、実施例 3— （ 2 )で取得したゥサギ抗 SEMA4Bポリクローナル抗体 No. 1、 No. 2 、 No. 4または非免疫ゥサギ IgG (Jackson社） を終濃度が 1 g/ml、 10 z g/mlまたは 100 μ g/mlとなるように添加し、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで 6日間培養した。培養 終了後に Cell Counting Kit- 8 (Do jindo社）を 20 μ ΐ添加し、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで 90分間反応させた後、 450nmおよび 620nmでの吸光度の差分を測定した。 抗 体非存在下を陰性対照として上記ゥサギポリクローナル抗体の細胞増殖抑制活性 を算出した。
その結果、 NCI- H358に対しては終濃度 100 / g/mlで、ゥサギポリクローナル抗体 No. 1が 26%、 No. 2が 19%、 No. 4が 32%の増殖抑制活性をそれぞれ示し、 終濃度 10 g/mlでは No.4が 11%の增殖抑制活性を示し、 それぞれ統計学的に有意な差 （P ≤0.01) を示した （表 10)。
SEMA4B/H358に対しては終濃度 100 μ g/mlで、 ゥサギポリク口ーナル抗体の No.1 が 4δ%、 No.2が 46%、 No.4が55%の增殖抑制活性をそれぞれ示し、終濃度 10 μ g/ml では No.1が 11%、 No.4が 21%の増殖抑制活性をそれぞれ示し、 それぞれ統計学的 に有意な差 （P≤0.01) を示した （表 11)。
非免疫ゥサギ IgGはどちらの細胞株に対しても統計学的に有意な増殖抑制活性 を示さなかった （表 10、 表 1 1) ことから、 増殖抑制活性は、 SEMA4B特異的に 誘発されていることが明らかとなった。
〔表 10〕
；辰 細胞増殖活性 (A45。- A62。）
( β g/ml) 平均値 標準偏差 細胞非添加 0.123 0.002
抗体非存在下 1.563 0.018
非免疫ゥサギ IgG 100 1.539 0.047
10 1.552 0.027
1 1.596 0.027
ゥサギポリクロ一ナル抗体（Νο·1) 100 1.164 0.048
10 1.444 0.051
1 1.522 0.067
ゥサギポリクローナル抗体（Νο.2) 100 1.267 0.029
10 1.502 0.033
1 1.519 0.135
ゥサギポリクローナル抗体 (Νο.4) 100 1.066 0.016
10 1.395 0.004
1 1.466 0.084 〔表 1 1〕
；辰 f 細胞増殖活性 (A45。- A62Q)
( g/ml) 平均値 標準偏差 細胞非添加 0. 124 0. 001
抗体非存在下 1. 561 0. 048
非免疫ゥサギ IgG 100 1. 518 0. 095
10 1. 512 0. 049
1 1. 532 0. 045
ゥサギポリクローナル抗体（No.1) 100 0. 866 0. 052
10 1. 382 0. 028
1 1. 503 0. 067
ゥサギポリクロ一ナル抗体（No.2) 100 0. 844 0. 037
10 1. 422 0. 080
1 1. 627 0. 059
ゥサギポリクローナル抗体（Ν 4) 100 0. 705 0. 019
10 1. 232 0. 056
1 1. 530 0. 034
産業上の利用可能性
本発明に係る配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質 （本発明で用いられるタンパク質） と配列番号： 2 6で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質 （ 本発明で用いられるレセプター） との結合を阻害する物質、 〔好ましくは、 上記 タンパク質と上記レセプターとの結合によりもたらされる癌細胞增殖刺激を中和 する活性を有する抗体 （以下、 中和活性抗体と称することもある） 〕 は、 例えば 、 癌 （例、 大腸痛、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾 臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膝臓癌、 脳腫瘍、 血 液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制 剤などとして安全に使用することができる。 また、 本発明で用いられるタンパク 質の活性、 および （または） 本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物 質 （好ましくは、 中和活性抗体など） は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌 、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促進剤、 癌細胞の増殖抑制剤などとして安全に使用するこ とができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしく はその部分ぺプチドまたはその塩との結合を阻害する物質。
2 . 物質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0 で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体である請求項 1 記載の物質。
3 . 物質が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0 で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク 質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞增 殖刺激を中和する活性を有する抗体である請求項 1記載の物質。
4 . 抗体が、 モノクローナル抗体である請求項 2または請求項 3記載の物質。
5 . 請求項 1記載の物質を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
6 . 請求項 1記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
7 - 請求項 1記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
8 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表され るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク
' 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してなる 癌細胞の増殖抑制剤。
9 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩の活性を 阻害する物質。
1 0 . 物質が、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩のリン酸化を阻害する活性を有する抗体である請求項 9記載の物質。
1 1 . 抗体が、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有す るタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞 増殖刺激を中和する活性を有する抗体である請求項 1 0記載の物質。
1 2 . 請求項 9記載の物質を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
1 3 . 請求項 9記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
1 4 . 請求項 9記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
1 5 . (a) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 2 6で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、 上 記 （a) のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 上記 （b) のタ ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のスク リーニング方法。
1 6 . (a) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 および（b)配列番号： 2 6で 表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタ ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、 上記 （a) のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 上記 （b) の タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のス クリーニング用キット。
1 7 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用い ることを特徴とする、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまた はその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング方法。
1 8 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有 することを特徴とする、 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドま たはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
1 9 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表さ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 配列番号： 2 6で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もし くはその部分べプチドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の予 防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促進方法および （または） 癌細胞の増殖抑 制方法。
2 0 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる請求項 1 9記 載の方法。
2 1 . 配列番号： 2 6で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩のリン 酸化を阻害することを特徴とする癌の予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促 進方法おょぴ （または） 癌細胞の増殖抑制方法。
2 2 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパ ク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる請求項 2 1記 載の方法。
2 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 1または請求項 9記載の物質の有効量を投与す ることを特徴とする癌の予防 ·治療方法、 癌細胞のアポトーシス促進方法および (または） 癌細胞の增殖抑制方法。
2 4 . 癌の予防 ·治療剤、 癌細胞のアポトーシス促準剤おょぴ （または） 癌細胞 の増殖抑制剤を製造するための、 請求項 1 'または請求項 9記載の物質の使用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038907A1 (ja) * 2011-09-14 2013-03-21 日本化薬株式会社 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
JP2018521062A (ja) * 2015-06-29 2018-08-02 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア Ｂ１ｓｐ融合タンパク質の治療薬、方法、および使用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2730441C (en) * 2008-07-30 2019-04-16 Jiten Odhavji Dihora Encapsulated benefit agents and compositions requiring reduced levels of scavenger materials

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012708A2 (en) * 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
WO2000078961A1 (en) * 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001036440A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Human Genome Sciences, Inc. 23 human secreted proteins
WO2001068848A2 (en) * 2000-03-01 2001-09-20 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001077137A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002006329A2 (en) * 2000-07-18 2002-01-24 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
WO2002046465A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for identification of genes involved in specific diseases
WO2002052005A1 (fr) * 2000-12-22 2002-07-04 Kazusa Dna Research Institute Foundation Genes et proteines codees par ceux-ci
WO2004058817A1 (ja) * 2002-12-26 2004-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited 新規タンパク質およびその用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7073800A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Regents Of The University Of California, The Novel plexins and uses thereof
JP3787473B2 (ja) * 1999-11-30 2006-06-21 独立行政法人科学技術振興機構 セマフォリン受容体
EP1365018A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) CD100 semaphorin in myelination

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000012708A2 (en) * 1998-09-01 2000-03-09 Genentech, Inc. Further pro polypeptides and sequences thereof
WO2000078961A1 (en) * 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001036440A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Human Genome Sciences, Inc. 23 human secreted proteins
WO2001068848A2 (en) * 2000-03-01 2001-09-20 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001077137A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002006329A2 (en) * 2000-07-18 2002-01-24 Curagen Corporation Human polynucleotides and polypeptides encoded thereby
WO2002046465A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method for identification of genes involved in specific diseases
WO2002052005A1 (fr) * 2000-12-22 2002-07-04 Kazusa Dna Research Institute Foundation Genes et proteines codees par ceux-ci
WO2004058817A1 (ja) * 2002-12-26 2004-07-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited 新規タンパク質およびその用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1712619A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013038907A1 (ja) * 2011-09-14 2013-03-21 日本化薬株式会社 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
JPWO2013038907A1 (ja) * 2011-09-14 2015-03-26 日本化薬株式会社 細胞の増殖抑制方法、ｎｅｋ１０バリアント遺伝子に対するｒｎａ干渉作用を有する核酸分子、及び抗癌剤
JP2018521062A (ja) * 2015-06-29 2018-08-02 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア Ｂ１ｓｐ融合タンパク質の治療薬、方法、および使用
JP2021180671A (ja) * 2015-06-29 2021-11-25 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア Ｂ１ｓｐ融合タンパク質の治療薬、方法、および使用
JP7193590B2 (ja) 2015-06-29 2022-12-20 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア Ｂ１ｓｐ融合タンパク質の治療薬、方法、および使用

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