WO2005029153A2 - Festkörper-immersionslinsen-spektroskopie und -mikroskopie - Google Patents

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WO2005029153A2
WO2005029153A2 PCT/EP2004/010302 EP2004010302W WO2005029153A2 WO 2005029153 A2 WO2005029153 A2 WO 2005029153A2 EP 2004010302 W EP2004010302 W EP 2004010302W WO 2005029153 A2 WO2005029153 A2 WO 2005029153A2
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solid immersion
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Dietrich Martin
Ramachandra Rao
Alexandre Serov
Theo Lasser
Michael Gösch
Rudolf Rigler
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Carl Zeiss Jena Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/33—Immersion oils, or microscope systems or objectives for use with immersion fluids
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/02—Objectives

Definitions

  • the invention relates to a solid-state immersion lens for a microscope and a microscopy method with a solid-state immersion lens.
  • the object of the invention is to provide a solid-state immersion lens for an optical method for producing a good light field boundary, which is particularly suitable for fluorescence spectroscopy and for high-resolution microscopy, but is not limited to these spectroscopy or microscopy methods.
  • a corresponding microscopy method is also to be provided.
  • the object is achieved by a solid-state immersion lens for a microscope with a lens system with a predetermined numerical aperture, the refractive index of the material of the solid-state immersion lens being chosen such that the numerical aperture of the objective system is increased when the solid-state immersion lens is attached to the lens system is connected upstream.
  • the solid-state immersion lens which consists of a material with a high refractive index
  • a conventional objective system microscope objective
  • an increase in the optical resolution or a well-limited focal volume can be achieved.
  • the sample volume can be shifted from the SIL surface using a suitable optical setup.
  • the refractive index of the solid-state immersion lens is preferably greater than or equal to 1.3.
  • the solid-state immersion lens can have a lens shape with at least one aplanatic surface.
  • the solid-state immersion lens can comprise at least one diffractive optical surface.
  • the solid-state immersion lens can be connected upstream of the objective system in such a way that it is spaced from the objective system, in particular by at least 1 mm.
  • the solid-state immersion lens can also be connected upstream of the objective system in such a way that it is completely thermally, electrically and / or mechanically decoupled from the objective system.
  • the solid immersion lens can be hemispherical or a flattened ball. Furthermore, the solid immersion lens can have a flat surface. In particular, the flat surface can be aligned with one side of a lens carrier.
  • the object is also achieved by a microscopy method in which the numerical aperture of the objective system is increased by means of a solid-state immersion lens connected upstream of an objective system of a microscope.
  • the microscopy method can be used as a fluorescence method that is used for single-molecule detection.
  • a pinhole e.g. an optical fiber
  • the solid immersion lens can be arranged upstream of the objective system, preferably by at least 1 mm.
  • an adjustable aberration of the objective system can be changed to shift the focal volume from an interface between a slide and a liquid to be examined into the liquid.
  • the solid-state immersion lens according to the invention or the method according to the invention can be used in high-resolution microscopy (reflection, transmitted light, polarization microscopy) in confocal microscopy, in spectroscopic Investigations, investigations and measurements that relate in particular to the single-molecule detection and / or for fluorescence methods that are used for example for single-molecule detection, such as fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence lifetime, Raman spectroscopy.
  • Solid immersion lenses can be arranged as an array.
  • the solid-state immersion lens can also be accommodated in a biochip arrangement.
  • a particular advantage of the invention is that an increase in the numerical aperture and an increased light limitation in the focal volume is possible.
  • the numerical aperture of the objective system can be less than or equal to 1 in the invention.
  • the lens system can have an adjustable aberration (e.g. spherical aberration) or the lens system can be combined with optical elements which enable an adjustable aberration (e.g. spherical aberration).
  • the lens system can include a correction ring for this setting.
  • the adjustable aberration can be used to shift the focal volume and a high optical quality with a Strehl ratio of greater than or equal to 0.8 is possible.
  • the solid-state immersion lens preferably also enables an increased light limitation in the focal volume.
  • the invention also relates to the combination of the solid-state immersion lens according to the invention with the microscope, so that an improved microscope is provided.
  • the microscope lens system can have an adjustable aberration.
  • the invention describes a new imaging and spectroscopy method with which a high resolution and an improved limitation of the light field is possible for various methods in the field of optical spectroscopy, in particular those that are used for single molecule detection (SMD).
  • SMD single molecule detection
  • a good limitation of the light fields, as provided by this optical concept, is essential for all these applications.
  • the SIL lens is combined with a conventional microscope objective, which increases the numerical aperture due to the high refractive index of the lens material used.
  • the SIL ensures improved focusing, which typically increases the initial numerical aperture of the main lens by a factor of 2.
  • a further increase is possible through an adapted SIL lens design and a lens material with a higher refractive index.
  • FIG. 1a shows a first embodiment of a SIL microscope set-up which is used in an FCS measurement
  • FIG. 1b shows an enlarged sectional view of the SIL lens arrangement, an example of the lens-SIL separation being shown, with which heat decoupling (e.g. an air gap) between the two optical elements is possible;
  • heat decoupling e.g. an air gap
  • 4a, 4b, 4c typical correlation curves for the fluorescence signal TMR in a concentration of 1 nM, 10 nM and 1000 nM; 5 shows a hemispherical SIL;
  • 8a, 8b typical correlation curves of TMR in concentrations of 1 nM and 10 nM, respectively, which were obtained with the 1.15 NA objective;
  • 11a, 11b, 11c typical correlation curves of the fluorescence signal for TMR at concentrations of 1 nM, 10 nM and 1000 nM, obtained with the 0.6 NA objective + SIL;
  • FIG. 12 shows a schematic illustration of the sample volume which was formed by the objective + SIL geometry, the sample volume being arranged approximately 6 to 7 ⁇ m from the SIL surface;
  • a solid-state immersion lens is used for fluorescence correlation spectroscopy measurements.
  • Important parameters for single molecule experiments, such as B. the collection efficiency and the excitation field limitation are examined for different distances between the SIL and the objective.
  • Fluorescence Correlation Spectroscopy is an experimental procedure used in studies of chemical and photophysical dynamics at the single-molecule level [Mansfield, S.M. and G.S. Cinema, Solid immersion Microscope. Appl. Phys.Lett, 1990. 57 (24): p. 2615].
  • an autocorrelation is obtained by measuring the random intensity fluctuations l (t) of a fluorescence response that is generated by light-excited molecules in a confocal volume [Yoshita, M., et al., Fourier imaging study of efficient near-field optical coupling in solid immersion fluorescence microscopy. J. Appl. Phys, 2002. 92 (2): p. 862].
  • An analysis of the correlation function provides information about the dynamic processes (transverse and rotational diffusion) and the kinetic processes (e.g. triplet states) of the fluorescent molecules.
  • the autocorrelation function can be expressed as follows:
  • the brackets indicate the time average; G motion ( ⁇ ) corresponds to the movement of the molecules, while X ine t ic s ? ) describes the kinetic processes of the molecule (s).
  • the analytical expression for a large number of differently weighted, freely and independently moving molecules can be represented as follows (O. Krichevsky, and G. Bonnet, "Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications", Rep Prog. Phys., Vol. 65, pp. 251-297, 2002):
  • Q j stands for the specific quantum yield, j for the average number of different molecules that are present in the detection volume element, T p for the diffusion times of molecules over the sample area, ⁇ for the aspect ratio of the detection volume element, T j for the proportion of the dye molecules in the triplet state, and ⁇ Tj for the relaxation time.
  • T p the average number of different molecules that are present in the detection volume element
  • T p the diffusion times of molecules over the sample area
  • ⁇ for the aspect ratio of the detection volume element
  • T j for the proportion of the dye molecules in the triplet state
  • ⁇ Tj for the relaxation time.
  • NA numerical aperture
  • the SIL is an aplanatic lens that increases the NA of the optical system by a factor n (hemispherical SIL (H-SIL)) [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog Phys., 2002. 65: p. 251-297]; where n stands for the refractive index of the SIL material.
  • H-SIL the reported collection efficiency was approximately 60% to 70% [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22 (3): p. 169-175].
  • FIGS. 1a and 1b The embodiment shown in FIGS. 1a and 1b is based on the confocal principle.
  • the laser beam from a diode-pumped solid-state laser (532 nm, Kimmon DPSS laser, model 5526) was expanded by a beam expander (Li and L 2 ) to over-illuminate the rear pupil of the microscope objective.
  • the excitation light was coupled into a microscope objective via a dichroic mirror (Chroma, 565LP), the fluorophore dye molecules being excited within the focal volume.
  • the fluorescence emission was collected through the same lens and passed through a band filter (Chroma HQ585 / 40), which filtered out the signal against the background light.
  • the fluorescence emission was focused through the tube lens (L 3 ) into the optical input fiber (0 50 ⁇ m, serving as pinhole) of a fiber optic 50/50 beam splitter (OZ Optics Ltd.).
  • the output fibers of the beam splitter were coupled to the single-photon counting modules SPCM-AQR-13 (Perkin Elmer Optoelectronics).
  • the photo-induced pulses from the detectors were recorded in a two-channel correlator (correlator.com, Flex990EM-12C), which calculated the cross-correlation function. This corresponds to the autocorrelation function of the fluorescence signal, the cross-correlation measurement suppressing electronic post-pulsing.
  • the data obtained was stored in computer memory and then analyzed with software using a non-linear Marquardt-Levenberg algorithm, which can be used to extract the number of molecules, the diffusion times of the molecules, the fraction of the molecules in the triplet state and the relaxation time.
  • the sample volume was arranged in the immediate vicinity of the flat surface of the SIL (TD Muster, S.Jo. Joshua, K. Hirota, "Roles of propagating and evanesvent waves in solid immersion lens systems ", Appl. Optic, vol. 38, pp. 5046-5057, 1999).
  • the correction was set to the" ⁇ 0.125 "position, the sample volume was raised to about 7 ⁇ m above the flat SIL Surface shifted (simulated with ZEMAX (Focus Software, Inc.)).
  • nucleotide triphosphates TMR, tetramethylrhodamine-6-dCTP, New England Labs-425
  • concentrations of 1 nM, 10 nM and 1 ⁇ M were distributed in a droplet on a cover slip or directly on the flat surface of the SIL.
  • the optical power on the sample was 2 mW for the 1, 15 NA lens and 0.7 mW for the combination of 0.6 NA lens and SIL.
  • Typical correlation curves obtained with the 1, 15 NA objective are shown in Fig. 2a (TMR concentration of 1 nM) and 2b (TMR concentration of 10 nM), where crosses represent the measurement data and the solid line an adaptation of the analytical Function according to equation (2). Because of the symmetrical detection and cross-correlation signal analysis, there is no post-pulsing in the correlation curves.
  • the correlation curve shown in Fig. 3 is obtained from the sample volume formed with a SIL on its flat surface (the correction is set to the "0" division). 3 shows the typical correlation curve of the fluorescence signal from TMR in a concentration of 10 nM, obtained with the 0.6 NA lens plus SIL. The correction ring is set to the "-0.125" position. The "crosses" stand for measurement data; the solid line is an adaptation to the measured correlation curve.
  • j 2
  • N 2 0.9.
  • the measured CPM value was 100 kHz, which takes into account the lower excitation power (0.7 mW) used for the SIL experiment compared to the 84 kHz value with the 1.15 NA lens ( 1.2 mW) is remarkable.
  • FIGS. 4a, 4b and 4c Typical correlation curves for the "-0.125 mm" position are shown in FIGS. 4a, 4b and 4c, typical correlation curves for the fluorescence signal from TMR in concentrations of 1 nM (FIG. 4a), 10 nM (FIG. 4b) and 1000 nM (Fig. 4c) obtained with the 0.6 NA lens plus SIL are shown.
  • the correction is set to the "-0.125 mm" position.
  • the one-component model 1). This indicates free 3D diffusion.
  • the CPM value was up to 82 kHz for the measurement with 10 nM.
  • a comparison of the SIL results with the reference results shows an improvement in the field limitation by a factor of 5 to 7.
  • the SIL enables the following: i) a multiple increase in the resolution of the system compared to the FCS systems currently used; ii) providing high collection efficiency of the optical system; iii) a depth scan of the sample of up to at least 7 ⁇ m; iv) Measurements on the samples with up to 10 times higher fluorophore concentrations (compared to water immersion objectives).
  • the second embodiment relates to spectroscopic devices and methods using a solid-state immersion lens for fluorescence correlation spectroscopy measurements.
  • the performance of a solid immersion lens confocal microscope is compared to the performance of a conventional confocal microscope used for FCS.
  • the centerpiece of the new SIL-FCS microscope is a system that has a conventional objective (no immersion liquid) that is "equipped" with a solid-state immersion lens. Important parameters for single molecule experiments, such as collection efficiency and excitation field limitation, are examined for different modes of the SIL lens system.
  • SILs solid-state immersion lenses
  • a SIL is an analog solid-state component to an immersion liquid, which is well suited for imaging with sub-wavelength resolution.
  • the SIL approach has a potential that goes beyond wide-angle imaging microscopy, particularly a potential for single molecule detection experiments, e.g. fluorescence correlation spectroscopy, as will be shown below.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • the limitation of the optical excitation field is of great importance in FCS experiments, especially when measuring samples with a high concentration of dye-labeled molecules, e.g. in biological cells.
  • a strong limitation (less than a femtoliter) is not only reflected in a higher signal-to-noise ratio, but also in a higher resolution, both of which play a key role in a single-molecule experiment.
  • NA numerical aperture
  • the SIL an aplanatic lens
  • H-SIL hemispherical SIL
  • NA the numerical aperture of the main objective lens.
  • H-SILs have only low chromatic aberrations due to the material dispersion, i.e. the H-SILs can be considered achromatic.
  • an excitation laser is focused into a sample.
  • Each molecule that diffuses through the excitation focus causes fluorescent photons to rise.
  • the length of each photon shower (or photon burst) corresponds to the time that the molecule remains in the detection volume element.
  • a confocal structure is used to reject contributions out of focus and scattered light, which increases the signal-to-noise ratio (R. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P.Kask, “Fluorescence correlation spectroscopy with high count rates and low background: analysis of translational diffusion ", Eur. Biophys. J. Vol. 22, pp. 169-175, 1993).
  • the fluorescence photons are then detected using a single photon detector which works in Geiger mode. Each individual fluorescence photon detected generates one Pulse that is transmitted to a correlator in which the autocorrelation function of the fluorescence intensity fluctuations is calculated.
  • the autocorrelation curve contains information about the dynamics of intensity fluctuations in the time interval of typically 30 ns (dead time of the detector) up to the duration of the measurement.
  • diffusion time average transit time of a molecule in the detection volume element
  • average number of molecules in the detection volume element average number of molecules in the detection volume element
  • molecular proportions if there are several types of different diffusing molecules in the sample
  • proportion of particles that show the triplet state long-lived, non-fluorescent dark states.
  • the correlation function can be expressed as follows: W " - ⁇ * iweftcs W '(3)
  • l (t) stands for the intensity of the fluorescence that is present in the detection volume element and (for the time average.
  • ⁇ is the mean number of molecules in the
  • T stands for the proportion of dye molecules in the triplet state
  • ⁇ ⁇ is the relaxation time; ie the time during which the molecules are in the triplet state.
  • the experimental setup of this embodiment corresponds to that shown in FIGS. 1a and 1b.
  • the setup works with the confocal microscope principle.
  • the excitation light was reflected on a dichroic mirror (Chroma, 565LP) in a microscope lens system that excited the fluorophore dye molecules within the focal volume. * The fluorescence emission was collected through the same lens and passed through a band filter (Chroma HQ 585/40), which filtered out the signal against the background light.
  • the output fibers of the beam splitter were connected to the detection modules SPCM-AQR-13 (single photon counter module from Perkin Elmer Optoelectronics).
  • the photo-induced pulses from the detectors were registered by a hardware correlator with two inputs (correlator.com, Flex990EM-12C), which calculated the cross-correlation function. This corresponds to the autocorrelation function of fluorescence, the cross-correlation approach suppressing electronic post-pulsing in the correlation signal.
  • the data obtained was stored in computer memory and then analyzed with software based on a non-linear least squares minimization algorithm (Marquardt-Levenberg) indicating the number of molecules and the diffusion times of the molecules.
  • Nucleotide triphosphates (TMR, tetramethylrhodamine-6-dCTP New England Labs-425) were used in concentrations of 1 nM, 10 nM and 1 ⁇ m for diffusion measurements.
  • the dye-labeled molecules were distributed in a droplet on a cover slip or directly on the flat surface of the SIL.
  • the optical power on the sample was 1.2 mW for the 1.15 NA lens and 0.7 mW for the 0.6 NA lens plus SIL.
  • the 0.6 NA lens has a cover slip correction ring that is integrated into the lens.
  • the correction range extends from -0.125 mm to 2 mm, see Fig. 7 (0.6 NA microscope objective from Zeiss with a cover glass correction ring that is set to the position "0 mm" (left) or "-0.125 mm” ( right) is set.).
  • the correction When measuring with a SIL, the correction must be set to the "0" division. In this case, the sample volume (diffraction limited) is in the immediate vicinity of the flat surface of the SIL. However, we also used the "-0.125" position of the correction ring on the lens, which gave reliable FCS measurements when using the SIL. In this case, the sample volume was estimated to be about 7 ⁇ m from the SIL surface. The results of this investigation are given below.
  • FIGS. 8a, 8b Typical correlation curves obtained with the 1.15 NA objective are shown in FIGS. 8a, 8b (the "crosses" stand for the measurement data; the solid line is an adaptation of the analytical function, equation (6)) for two different ones Concentrations, namely 1 nM (Fig. 8a) and 10 nM (Fig. 8b). Due to the concept of the adjusted detectors and the cross-correlation signal analysis, there is no post-pulsing in the correlation curves.
  • the count rate per molecule (CPM) parameter was up to 100 kHz in some measurements.
  • the background noise (2.3 kHz) is not taken into account.
  • this lens Due to its small numerical aperture, this lens is not used alone for FCS measurements. Taken alone, it only gives a CMP of around 18 kHz. However, when combined with a SIL, this combination shows good FCS performance, as described below.
  • the correlation curve shown in FIG. 9 is obtained from the sample volume which is formed with a SIL on its flat surface at a concentration of 10 nM (the “crosses” stand for the measurement data; the solid line is an adaptation to the measured correlation curve) ,
  • the noise contribution for the SIL system was 8 kHz. This relatively high noise is caused by the photons reflected back from the flat SIL surface.
  • the typical correlation curves are shown in FIGS. 11a, 11b, 11c (the “crosses” stand for the measurement data; the solid line stands for the adjustment according to equation 6) for concentrations of 1 nM, 10 nM and 1000 nM.
  • FIG. 12 shows the detection geometry or the sample volume which was formed by this objective + SIL geometry - the sample volume is arranged approximately 6 to 7 ⁇ m from the SIL surface. How the higher field limitation is caused by a residual axial chromatic aberration and by chromatic variation of the spherical aberration, see Fig.
  • the focus for the wavelength of 532 nm (excitation light) and the focus for 560 nm (excited light) do not overlap completely , but have only one common part, which ultimately forms the sample volume, which is 5 to 7 times smaller than that possible with the 1, 15NA lens. Due to the aberrations, the sample volume is in the overlap of the point wash functions (PSF) for different wavelengths, namely for the exciting and for the excited.
  • PSF point wash functions
  • the resolution of the system is increased many times over compared to currently used FCS systems, • provides a higher collection efficiency of the optical system, • allows the sample to be captured in depth of at least up to 7 ⁇ m and • enables measurements on the samples with (compared to water immersion objectives) up to 10 times higher fluorophore concentrations.

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Abstract

Es wird eine Festkörper-lmmersionslinse (SIL) für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur bereitgestellt, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper-Immersionslinse so gewählt ist, dass bei dem Objektivsystem vorgeschafteter Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist.

Description

Festkörper-Immersionslinsen-Spektroskopie und -Mikroskopie
Die Erfindung betrifft eine Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop sowie ein Mikroskopierverfahren mit einer Festkörper-Immersionslinse.
Die DE 101 1 420 A1 und die WO 02/073172 A2 beschreiben eine Prozedur und ein Verfahren zur Detektion einer chemischen Subtanz. Insbesondere die Ansprüche beschreiben eine Trennung der Probenflüssigkeit und der Fokussierungsoptik, d. h. eine Wärmeisolierung zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem Probenbehälter. Dieser Probenbehälter kann ein optisches Element zur Verbesserung der Fokussierung aufweisen. Dieses Verfahren beschreibt jedoch nicht, daß dieses optische Element eine SIL-Linse mit den spezifischen Auslegungsdaten eines solchen Elementes ist, noch beschreibt es dessen Materialanforderungen oder dessen optische Leistung.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Festkörper-Immersionslinse für ein optisches Verfahren zum Erzeugen einer guten Leuchtfeld-Begrenzung, die für die Fluoreszenzspektroskopie sowie für die hochauflösende Mikroskopie besonders geeignet, aber nicht auf diese Spektroskopie- oder Mikroskopierverfahren beschränkt ist, bereitzustellen. Ferner soll noch ein entsprechendes Mikroskopierverfahren bereitgestellt werden.
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper-Immersionslinse so gewählt ist, daß die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem vorgeschaltet ist. Durch Anpassen an der Festkörper-Immersionslinse, die aus einem Material mit einer hohen Brechzahl besteht, an ein herkömmliches Objektivsystem (Mikroskopobjektiv) kann eine Erhöhung der optischen Auflösung oder ein gut begrenztes Fokalvolumen erreicht werden. Das Probenvolumen kann von der SIL-Oberfläche über einen geeigneten optischen Aufbau verschoben werden. Bevorzugt beträgt die Brechzahl der Festkörper-Immersionslinse größer oder gleich 1 ,3. Insbesondere kann die Festkörper-Immersionslinse eine Linsenform mit mindestens einer aplanatischen Oberfläche aufweisen.
Ferner kann die Festkörper-Immersionslinse mindestens eine diffraktiv optische Oberfläche umfassen.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem so vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem beabstandet ist, insbesondere um mindestens 1 mm. Die Festkörper-Immersionslinse kann auch so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden, daß sie vom Objektivsystem vollständig thermisch, elektrisch und/oder mechanisch entkoppelt ist.
Die Festkörper-Immersionslinse kann hemisphärisch oder als abgeflachte Kugel ausgebildet sein. Des weiteren kann die Festkörper-Immersionslinse eine ebene Oberfläche aufweisen. Insbesondere kann die ebene Oberfläche mit einer Seite eines Objektivträgers fluchten.
Die Aufgabe wird auch noch gelöst durch ein Mikroskopierverfahren, bei dem mittels einer einem Objektivsystem eines Mikroskops vorgeschalteten Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht wird.
Insbesondere kann das Mikroskopierverfahren als ein Fluoreszenzverfahren, das zur Einzelmoleküldetektion dient, verwenden werden. In diesem Fall ist es bevorzugt, das Mikroskopieverfahren als konfokales Verfahren zu betreiben, bei dem die Fiuoreszenzemission über eine Lochblende (z.B. eine optische Faser) detektiert wird, um die Konfokalität zu gewährleisten.
Ferner kann bei dem Verfahren die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem beabstandet vorgeschaltet werden, bevorzugt um mindestens 1 mm.
Bei dem Verfahren kann zur Verschiebung des Fokalvolumens von einer Grenzfläche zwischen einem Objektträger und einer zur untersuchenden Flüssigkeit in die Flüssigkeit hinein eine einstellbare Aberration des Objektivsystems geändert werden.
Insbesondere kann die erfindungsgemäße Festkörper-Immersionslinse bzw. das erfindungsgemäße Verfahren bei der hochauflösenden Mikroskopie (Reflexions, -Durchlicht-, Polarisationsmikroskopie) in der konfokalen Mikroskopie, bei spektroskopischen Untersuchungen, bei Untersuchungen und Messungen, die sich insbesondere auf die Einzelmoleküledetektionen beziehen, und/oder für Fluoreszenzverfahren, die beispielsweise zur Einzelmoleküldetektion dienen, wie z.B. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzlebensdauer, Raman-Spektroskopie, eingesetzt werden.
Mehrere Festkörper-lmmersionslinsen können als Array angeordnet werden. Die Festkörper- Immersionslinse kann auch in einer Biochip-Anordnung aufgenommen werden.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Erhöhung der numerischen Apertur und eine erhöhte Lichtbegrenzung im Fokalvolumen möglich ist. Insbesondere kann die numerische Apertur des Objektivsystems bei der Erfindung kleiner oder gleich 1 sein.
Das Objektivsystem kann eine einstellbare Aberration (z.B. sphärische Aberration) aufweisen oder das Objektivsystem kann mit optischen Elementen kombiniert werden, die eine einstellbare Aberration (z.B. sphärische Aberration) ermöglichen. Insbesondere kann das Objektivsystem für diese Einstellung einen Korrekturring umfassen.
Bei der Erfindung kann mittels der einstellbaren Aberration eine Verschiebung des Fokalvolumens bewirkt werden und eine hohe optische Qualität mit einem Strehl-Verhältnis von größer oder gleich 0,8 ist möglich.
Die Festkörper-Immersionslinse ermöglicht neben der Erhöhung der numerischen Apertur bevorzugt auch noch eine erhöhte Lichtbegrenzung im Fokalvolumen.
Die Erfindung betrifft auch die Kombination der erfindungsgemäßen Festkörper- Immersionslinse mit dem Mikroskop, so daß ein verbessertes Mikroskop bereitgestellt wird.
Das Objektivsystem des Mikroskops kann eine einstellbare Aberration aufweisen.
Die Erfindung beschreibt ein neues Bildgebungs- sowie Spektroskopieverfahren, mit dem eine hohe Auflösung sowie eine verbesserte Begrenzung des Leuchtfeldes für verschiedene Verfahren auf dem Gebiet der optischen Spektroskopie, insbesondere derjenigen, die für die Einzelmoleküldetektion (SMD) verwendet werden, möglich ist. Für alle diese Anwendungen ist eine gute Begrenzung der Leuchtfelder, wie sie durch dieses optische Konzept bereitgestellt wird, unerläßlich. Bei diesem Konzept wird die SIL-Linse mit einem herkömmlichen Mikroskopobjektiv kombiniert, was die numerische Apertur aufgrund der hohen Brechzahl des verwendeten Linsenmaterials erhöht. Bei zahlreichen Anwendungen auf dem Gebiet der Lebenswissenschaften, der Biologie und der Medizin ist eine örtliche Erwärmung und/oder eine elektrische Sondierung der Probe usw. notwendig. Daher ist eine thermische, mechanische und/oder elektrische Entkopplung von großem Interesse und Nutzen. Diese Handhabungsbedingung wird aufgrund der Trennung der SIL-Linse (=Festkörper-lmmersionslinse) und des Mikroskopobjektivs und/oder des Mikroskopkörpers ohne weiteres verwirklicht.
Die Erfindung beschreibt ferner ein spezifisches optisches Linsenelement, das in den Probenbehälter aufgenommen werden kann und das die Wärmeisolierung durch einen Abstand zwischen diesem SIL-Element und dem Mikroskopobjektiv von >= 1 mm sicherstellt. Die SIL gewährleistet eine verbesserte Fokussierung, welche die anfängliche numerische Apertur des Hauptobjektivs typischerweise um einen Faktor von 2 vergrößert. Eine weitere Erhöhung ist durch eine angepaßte SIL-Linsenauslegung und ein Linsenmaterial mit einer höheren Brechzahl möglich.
Es ist offensichtlich, daß die Elemente in einer linearen oder in jeder beliebigen 2- dimensionalen Konfiguration montiert werden können.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der Zeichnungen noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1a eine erste Ausführungsform eines SIL-Mikroskop-Aufbaus, der bei einer FCS-Messung verwendet wird;
Fig. 1b eine vergrößerte Ausschnittsdarstellung der SIL-Objektiv-Anordnung, wobei ein Beispiel für die Objektiv-SIL-Trennung gezeigt ist, mit der eine Wärmeentkopplung (z.B. ein Luftspalt) zwischen beiden optischen Elementen möglich ist;
Fig. 2a und 2b typische Korrelationskurven von TMR-Konzentrationen von 1 nM bzw. 10 nM, die mit einem 1,15 NA-Objektiv erhalten wurden;
Fig. 3 eine typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM, erhalten mit einem 0,6 NA-Objektiv + SIL, wobei der Korrekturring auf die "-0,125"-Stellung eingestellt ist;
Fig. 4a, 4b, 4c typische Korrelationskurven für das Fluoreszenzsignal TMR in einer Konzentration von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM; Fig. 5 eine hemisphärische SIL;
Fig. 6 eine abgeflachte Kugel-SIL;
Fig. 7 ein 0,6 NA-Mikroskopobjektiv von Zeiss mit einem Deckglas-Korrekturring, der auf die Stellung "0 mm" (links) bzw. "-0,125 mm" (rechts) eingestellt ist;
Fig. 8a, 8b typische Korrelationskurven von TMR in Konzentration von 1 nM bzw. 10 nM, die mit dem 1,15 NA-Objektiv erhalten wurden;
Fig. 9 eine typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM, erhalten mit dem 0,6 NA-Objektiv;
Fig. 10 eine schematische Darstellung des Probenvolumens, das durch das Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde;
Fig. 11a, 11 b, 11c typische Korrelationskurven des Fluoreszenzsignals für TMR bei Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1000 nM, erhalten mit dem 0,6 NA- Objektiv + SIL;
Fig. 12 eine schematische Darstellung des Probenvolumens, das durch die Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde, wobei das Probenvolumen etwa 6 bis 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt angeordnet ist;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der chromatischen Aberration in dem 0,6 NA + SIL-Mikroskopobjektiv-System, und
Fig. 14 einen Vergleich zwischen herkömmlichen Objektiven und Objektiv-SIL- Kombinationen.
In dieser Ausführungsform wird eine Festkörper-Immersionslinse für Fluoreszenzkorrelations- spektroskopie-Messungen verwendet. Wir vergleichen die Leistung der Festkörper- Immersionslinse in einem konfokalen Mikroskop-Aufbau mit der Leistung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskops, das für die FCS verwendet wird. Die Neuheit dieses neuen SIL-FCS- Aufbaus besteht in einem System, das ein herkömmliches Objektiv (NA=0,6) in Kombination mit einer Festkörper-Immersionslinse enthält, die für eine Einzelmoleküldetektion verwendet wird. Wichtige Parameter für Einzelmolekül-Versuche, wie z. B. die Sammeleflϊzienz und die Anregungsfeldbegrenzung, werden für verschiedene Abstände zwischen SIL und Objektiv untersucht.
Jüngste Fortschritte in der Bildgebung mit einer Auflösung im Subwellenlängenbereich, sowie in der Fluoreszenzbildgebung [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p. 169-175] und in der Nahfeldoptik-Daten- Sicherung [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prag. Phys., 2002. 65: p. 251-297] haben die Brauchbarkeit von Festkörper-Immersionslinsen (SILs) für verschiedene Anwendungen bewiesen. Hier beschreiben wir den SIL-Ansatz für spektroskopische Studien und insbesondere für die auf Einzelmoleküldetektionsversuchen beruhende Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie.
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist ein Versuchsverfahren, das bei Studien der chemischen und photophysikalischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene verwendet wird [Mansfield, S.M. and G.S. Kino, Solid immersion Microscope. Appl. Phys.Lett, 1990. 57(24): p. 2615]. Hier wird eine Autokorrelation durch Messen der zufälligen Intensitätsschwankungen l(t) einer Fluoreszenzantwort erhalten, die durch lichtangeregte Moleküle in einem konfokalen Volumen erzeugt wird [Yoshita, M., et al., Fourier imaging study of efficient near-field optical coupling in solid immersion fluorescence microscopy. J. Appl. Phys, 2002. 92(2): p. 862]. Eine Analyse der Korrelationsfunktion ergibt Informationen über die dynamischen Prozesse (Quer- und Rotationsdiffusion) und die kinetischen Prozesse (z. B. Triplettzustände) der fluoreszierenden Moleküle.
Für den allgemeinen Fall kann die Autokorrelationsfunktion folgendermaßen ausgedrückt werden:
^ total W ~ (/(* , + ) ,• 2 J(Q) ~ Emotion ( Wτ, χ -* kinetiαs M T) V1 )
Die Klammern bezeichnen das zeitliche Mittel; Gmotion (τ ) entspricht der Bewegung der Moleküle, während X inetics ? ) die kinetischen Prozesse des Moleküls (der Moleküle) beschreibt. Der analytische Ausdruck für eine Vielzahl unterschiedlich gewichteter, sich frei und unabhängig voneinander bewegender Moleküle (mit dem Index j bezeichnet) läßt sich folgendermaßen darstellen (O. Krichevsky, and G. Bonnet, „Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications", Rep. Prog. Phys., Vol. 65, pp. 251-297, 2002):
Figure imgf000009_0001
Hier steht Qj für die spezifische Quantenausbeute, j für die durchschnittliche Anzahl unterschiedlicher Moleküle, die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden sind, Tp-für die Diffusionszeiten von Molekülen über den Probenbereich, ω für das Aspektverhältnis des Detektionsvolumenelementes, Tj für den Anteil der Farbstoffmoleküle im Triplettzu stand, und τTj für die Relaxationszeit. In unserem Fall werden nur Ein- und Zwei-Komponentenlösungen berücksichtigt.
Für das höchste Signal-Rausch-Verhältnis ist die Begrenzung des Anregungsfeldes von großer Bedeutung bei FCS-Versuchen, insbesondere dann, wenn Proben mit einer hohen Konzentration an farbstoffmarkierten Molekülen gemessen werden. Die Feldbegrenzung und die Sammeleffizienz stehen beide im Zusammenhang mit der numerischen Apertur (NA) des Mikroskopobjektivsystems.
Die SIL ist eine aplanatische Linse, welche die NA des optischen Systems um einen Faktor n erhöht (hemisphärische SIL (H-SIL)) [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251-297]; worin n für die Brechzahl des SIL-Materials steht. Bei der H-SIL betrug die berichtete Sammeleffizienz etwa 60% bis 70% [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p. 169-175]. Eine räumliche Auflösung von bis zu lediglich 139 nm wurde bei einer Wellenlänge von 560 nm erreicht [Wu, Q., et al., Realization of NA 2.0 using a gallium phosphide Solid Immersion Lens. Appl. Phys. Lett, 1999. 75(26): p. 4064-4066]. All dies macht die SIL zu einer nützlichen Komponente für die optische Spektroskopie mit hohem Durchsatz.
Die in Fig. 1a und 1b gezeigte Ausführungsform beruht auf dem konfokalen Prinzip. Der Laserstrahl von einem diodengepumpten Festkörperlaser (532 nm, Kimmon DPSS-Laser, Modell 5526) wurde durch einen Strahlaufweiter (Li und L2) aufgeweitet, um die hintere Pupille des Mikroskopobjektivs überauszuleuchten. Das Anregungslicht wurde über einen dichroitischen Spiegel (Chroma, 565LP) in ein Mikroskopobjektiv eingekoppelt, wobei die Fluorophor-Farbstoffmoleküle innerhalb des Fokalvolumens angeregt wurden. Die Fluoreszenzemission wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen Bandfilter (Chroma HQ585/40) geführt, der das Signal gegenüber dem Hintergrundlicht ausfilterte. Schließlich wurde die Fluoreszenzemission durch die Tubuslinse (L3) in die optische Eingangsfaser (0 50 μm, als Lochblende dienend) eines faseroptischen 50/50-Strahlteilers (OZ Optics Ltd.) fokussiert. Die Ausgangsfasern des Strahlteilers wurden mit den Einphotonen- Zählmodulen SPCM-AQR-13 (Perkin Eimer Optoelectronics) gekoppelt. Die photoinduzierten Impulse der Detektoren wurden in einem Zweikanal-Korrelator registriert (correlator.com, Flex990EM-12C), der die Kreuzkorreiationsfunktion berechnete. Diese entspricht der Autokorrelationsfunktion des Fluoreszenzsignals, wobei die Kreuzkorrelationsmessung ein elektronisches Nachpulsen unterdrückt. Die erhaltenen Daten wurden im Computerspeicher gespeichert und dann mit einer Software anhand eines nicht linearen Marquardt-Levenberg- Algorithmus analysiert, mit dem die Anzahl von Molekülen, die Diffusionszeiten der Moleküle, der Bruchteil der Moleküle im Triplettzustand und die Relaxationszeit extrahiert werden können.
Für die Messungen wurden zwei verschiedene Mikroskopobjektive verwendet. Für herkömmliche FCS-Messungen, die als Bezugsmessuπgen betrachtet werden, verwendeten wir ein 40x, NA=1 ,15, Wasserimmersionsobjektiv (Olympus, Uapo/340, Deckglas korrigiert). Für den SIL-FCS-Aufbau wurde ein Zeiss-Objektiv (LD Achroplan 40x/0.60 Kor) mit einem Arbeitsabstand von 1,8 mm verwendet. Dieses Objektiv weist eine ausreichend große numerische Apertur (NA=0,6) und einen ausreichenden Arbeitsabstand auf, um die SIL anzuordnen. Dieses 0,6NA-Objektiv hat eine variable Deckglas-Korrektur mit einem Bereich von „-0,125 mm" bis „2 mm". Sobald die SIL angebracht und die Korrektur auf die "0"-Stellung eingestellt war, wurde das Probenvolumen in unmittelbarer Nähe der ebenen Oberfläche der SIL angeordnet (T.D. Muster, S.Jo. Joshua, K. Hirota, „Roles of propagating and evanesvent waves in solid immersion lens Systems", Appl. Optic, Vol. 38, pp. 5046-5057, 1999). Als die Korrektur auf die "~0,125"-Stellung eingestellt war, wurde das Probenvolumen auf etwa 7 μm über der ebenen SIL-Oberfläche verschoben (simuliert mit ZEMAX (Focus Software, Inc.)).
Die H-SIL mit einem Radius von 0,7 mm war aus LaSF35-Glas (n=2,02) gefertigt. Für die Proben verwendeten wir Nukleotid-Triphosphate (TMR, Tetramethylrhodamin-6-dCTP, New England Labs-425) in Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1 μM. Die farbstoffmarkierten Moleküle wurden in einem Tröpfchen auf einem Deckglas oder direkt auf der ebenen Oberfläche der SIL verteilt. Die optische Leistung auf der Probe betrug ,2 mW für das 1 ,15 NA- Objektiv und 0,7mW für die Kombination aus 0,6 NA-Objektiv und SIL.
Typische mit dem 1 ,15 NA-Objektiv erhaltene Korrelationskurven sind in Fig. 2a (TMR- Konzentration von 1 nM) und 2b (TMR-Konzentration von 10 nM) gezeigt, wobei Kreuze für die Meßdaten stehen und die durchgezogene Linie eine Anpassung der analytischen Funktion gemäß Gleichung (2) ist. Aufgrund der symmetrischen Detektion und Kreuzkorrelations- Signalanalyse ist in den Korrelationskurven kein Nachpulsen vorhanden. Die erhaltenen Korrelationskurven wurden mit der Gleichung (2) an den Ein-Komponenten-Fall (j=O angepaßt. Die translatorische Diffusionszeit der Moleküle betrug D = 110 μs, wobei die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen N = 0,86 für 1 nM und N = 16 für 10 nM Lösungen betrug. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand betrug T = 0,3. Der Zählrate pro Molekül (Count rate Per Molecule = CPM)-Parameter betrug 84 kHz.
Die in Fig. 3 gezeigte Korrelationskurve wird aus dem Probenvolumen erhalten, das mit einer SIL auf deren ebener Oberfläche gebildet wurde (die Korrektur ist auf die "0"-Steilung eingestellt). In Fig. 3 ist die typische Korrelationskurve des Fluoreszenzsignals von TMR in einer Konzentration von 10 nM gezeigt, erhalten mit dem 0,6 NA-Objektiv plus SIL. Der Korrekturring ist auf die "-0,125"-Stellung eingestellt. Die "Kreuze" stehen für Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung an die gemessene Korrelationskurve. Zur bestmöglichen Anpassung wurden die erhaltenen Korrelationskurven mit der Gleichung (2) für einen Zwei-Komponenten-Fall (j=2) angepaßt. Für diesen Versuch gehen wir davon aus, daß zwei Arten von Molekülen vorliegen, nämlich i) frei diffundierende Moleküle plus ii) Moleküle, die nahe der SIL-Oberfläche mit einer Geschwindigkeit diffundieren, die etwa siebenmal langsamer ist. Durch die Anpassungsanalyse erhielten wir r£>1 = 25 μs, rD2 = 200 μs und N^O.86,
N2=0,9. Der gemessene CPM-Wert betrug 100 kHz, was unter Berücksichtigung der geringeren Anregungsleistung (0,7 mW), die für das SIL-Experiment verwendet wurde, im Vergleich zu dem 84 kHz-Wert, der mit dem 1,15 NA-Objektiv (1,2 mW) erhalten wurde, bemerkenswert ist. Der Anteil der Moleküle, die im Triplettzustand vorliegen, ist T=0,44. Dies ist ein 1 ,5-mal höherer Faktor als bei den 1 ,15 NA-Objektiv-Versuchen.
Für die "-0,125 mm"-Stellung typische Korrelations kurven sind in Fig. 4a, 4b und 4c gezeigt, wobei typische Korrelationskurven für das Fluoreszenzsignal von TMR in Konzentrationen von 1 nM (Fig. 4a), 10 nM (Fig. 4b) und 1000 nM (Fig. 4c), die mit dem 0,6 NA-Objektiv plus SIL erhalten wurden, gezeigt sind. Die Korrektur ist auf die "-0,125 mm"-Stellung eingestellt. Die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie stellt die Anpassung mit der Gleichung (2) dar. Für diese Fälle wurde die beste Anpassung mit dem Ein-Komponenten- Modell (j=1) erhalten. Dies weist auf eine freie 3D-Diffusion hin. Für alle Messungen betrug die
Diffusionszeit τD = 3S + l μs. Die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem
Probenvolumen betrug N=0,19, N=2,2, und N=215 für Konzentrationen von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM. Der CPM-Wert betrug bis zu 82 kHz für die Messung mit 10 nM. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand lag bei T=0,3.
Ein Vergleich der SIL-Ergebnisse mit den Bezugsergebnissen zeigt eine Verbesserung der Feldbegrenzung um einen Faktor von 5 bis 7. Beim Vergleich der Diffusionszeiten stellen wir fest, daß die Diffusionszeit, die mit der SIL erhalten wird, 3 mal kleiner ist als die für das 1 ,15 NA-Objektiv. Dies impliziert, daß der transversale Querschnitt des Probenvolumens im Vergleich zum 1 ,15 NA-Objektiv dreimal kleiner (200 nm bei λ=560 nm) ist.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß wir die Brauchbarkeit einer hemisphärischen Festkörper-Immersionslinse für FCS-Messungen untersucht haben. Wir haben gezeigt, daß die SIL für Messungen von Molekülen nahe oder an der Oberfläche, ii) Tiefenmessungen im Inneren der Probe, d.h. 6-7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt, verwendet werden kann. Dies zeigt uns eine Flexibilität des SIL-Ansatzes für FCS. Abschließend gehen wir davon aus, daß die SIL folgendes ermöglicht: i) eine mehrfache Erhöhung der Auflösung des Systems gegenüber den derzeit verwendeten FCS-Systemen; ii) Bereitstellung einer hohen Sammeleffizienz des optischen Systems; iii) eine Tiefenabtastung der Probe von bis zu mindestens 7 μm; iv) Messungen an den Proben mit bis zu 10-mal höheren Fluorophor- Konzentrationen (im Vergleich zu Wasser-Immersionsobjektiven).
Die zweite Ausführungsform betrifft spektroskopische Vorrichtungen und Verfahren unter Verwendung einer Festkörper-Immersionslinse für Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie- Messungen. Es wird die Leistung einer konfokalen Mikroskops mit Festkörper-Immersionslinse mit der Leistung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskops, das für die FCS verwendet wird, verglichen. Das Kernstück des neuen SIL-FCS-Mikroskops ist ein System, das ein herkömmliches Objektiv (keine Immersionsflüssigkeit) aufweist, welches mit einer Festkörper- Immersionslinse "bestückt" ist. Wichtige Parameter für Einzelmolekülversuche, wie zum Beispiel die Sammeleffizienz und die Anregungsfeldbegrenzung, werden für verschiedene Modi des SIL- Objektivsystems untersucht.
Jüngste Fortschritte in der Bildgebung mit sehr hoher räumlicher Auflösung, sowie in der Fluoreszenzbildgebung auf einer großen Vielfalt von Systemen belegten die Brauchbarkeit der Festkörper-Immersionslinsen (SILs). In diesem Fall ist eine SIL eine analoge Festkörperkomponente zu einer Immersionsflüssigkeit, die für eine Bildgebung mit Subwellenlängen-Auflösung gut geeignet ist. Es wird jedoch davon ausgegangen, daß der SIL- Ansatz ein Potential hat, das über die Weitwinkelbildgebungsmikroskopie hinausgeht, insbesondere ein Potential für Einzelmoleküldetektionsversuche, z.B. die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, wie dies nachfolgend gezeigt werden wird.
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist ein Versuchsverfahren, das bei Untersuchungen der chemischen und photophysikaiischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene verwendet wird [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251-297]. Hier wird eine Autokorrelation durch Messen der zufälligen Intensitätsschwankungen einer Fluoreszenzantwort erhalten, die durch lichtangeregte Moleküle in einem konfokalen Volumen erzeugt wird. Eine Analyse der Korrelationsfunktion ergibt Informationen über den dynamischen Prozeß (Quer- und Rotationsdiffusion) und den kinetischen Prozeß (z.B. Triplettzustände) der fluoreszierenden Moleküle. Im Lauf des letzten Jahrzehnts hat sich FCS als leistungsfähiges Verfahren zum Analysieren der Prozesse auf Molekularebene herausgestellt: Molekülinteraktionen, Konformationsänderungen, chemische Reaktionen, Proteinbindung an Zellmembranen, photophysikalische Dynamik usw.
Für das höchste Signai-Rausch-Verhältnis ist die Begrenzung des optischen Anregungsfeldes von großer Bedeutung bei FCS-Versuchen, insbesondere bei der Messung an Proben mit einer hohen Konzentration von farbstoffmarkierten Molekülen, z.B. in biologischen Zellen. Eine starke Begrenzung (weniger als ein Femtoliter) schlägt sich nicht nur in einem höheren Signal-Rausch- Verhältnis nieder, sondern auch in einer höheren Auflösung, die beide bei einem Einzelmolekülexperiment eine Schlüsselrolle spielen.
Neben der Begrenzung ist eine hohe Sammeleffizienz des optischen Systems für ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis von Bedeutung, was folglich zu einer kürzeren Meßzeit führt. Die Feldbegrenzung und die Sammeleffizienz sind beide direkt proportional zur numerischen Apertur (NA) des Mikroskopobjektivsystems.
Festkörper-Immersionslinsen-Mikroskopie
Die SIL, eine aplanatische Linse, wurde ursprünglich als Technik zum Verbessern der räumlichen Auflösung der herkömmlichen Abbildungsmikroskopie entwickelt. Die SIL ist eine abgeflachte Glaskugel, welche die numerische Apertur des optischen Systems um einen Faktor n (hemisphärische SIL (H-SIL), Fig. 5: As^= n -siaa = n - NAMO ) oder sogar n2 (abgeflachte
Kugel SIL (T-SIL), Fig. 6:
Figure imgf000013_0001
n2 -NAM0) erhöht [Krichevsky, O. and G. Bonnet,
Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251-297], wobei n die Brechzahl des Linsenmaterials ist. Dabei wird auf der ebenen Oberfläche der SIL ein fokussierter Punkt erhalten. Bei beiden Linsenauslegungen (aplanatische H-SIL-Linse, auch als H-SIL bezeichnet (aufgrund ihrer hemisphärisch-planaren Form) und aplanatische T-SIL-Linse: 1. Oberfläche aplanatisch, 2. Oberfläche planar) kann eine Erhöhung der numerischen Apertur erreicht werden; die chromatische Abweichung ist jedoch sehr groß.
Die Auflösung der H-SIL ist M =λ 1(2 ■ n ■ NA) und die der T-SIL ist Ad =λ 1(2 • n2 ■ NA) , worin NA für die numerische Apertur der Hauptobjektivlinse steht. Für die H-SIL betrug die berichtete Sammeleffizienz mit dem NA = 0,8-Objektiv und der n = 1 ,845 SIL etwa 60% - 70%, was den Beugungsgrenzwert von 50% für die 2 π -Raumwinkel- Sammlung bei herkömmlichen Verfahren deutlich überschreitet [Rigler, R., et al., Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters, 1993. 22(3): p. 169-175]. Mit der T-SIL (n = 1,845) und dem Objektiv mit NA = 0,55 betrug die Sammeleffizienz den Fluoreszenz von farbstoffdotierten Mikrokugel-Tropfenproben mit einem Durchmesser von 0,11 μm das 21 -fache dessen, was bei der herkömmlichen Mikroskopie gemessen wurde (dasselbe Objektiv ohne die SIL wird verwendet), d.h. schätzungsweise 76% [Quabis, S., et al., The focus of light - theoretical calculation and experi ental tomographic reconstruction. Applied Physics B-Lasers and Optics, 2001. 72(21): p. 109-113 und Yoshita, M., et al., "Improved high collection efficiency in fluorescence microscopy with a Weierstrass-sphere solid immersion lens", Japanese Journal of Applied Physics Part 2-Letters, Vol. 41 , pp. L858- L860, 2002].
Darüber hinaus kann die Festkörper-Immersionsmikroskopie (SIM) sogar noch leistungsfähiger werden, wenn sie mit einem konfokalen Mikroskopieverfahren kombiniert wird. In jüngster Vergangenheit wurde über eine erfolgreiche Verwendung von SIL für die Konfokalmikroskopie berichtet [Stamnes, J., Waves in Focal Regions. 1986, Bristol: Adam Hilger und K. Karrai, X. Lorenz, L. Novotny, "Enhanced reflectivity contrast in confocal solid immersion lens microscopy", Appl. Phys. Letters, Vol. 77, pp. 3459-3461, 2000].
All dies macht die SIL zu einer nützlichen Komponente für die optische Spektroskopie mit hohem Durchsatz.
Für unsere Versuche beschränkten wir unsere Arbeit aus den folgenden Gründen auf die H-SIL:
1. H-SILs haben aufgrund der Materialdispersion nur geringe chromatische Aberrationen, d.h. die H-SILs können als achromatisch betrachtet werden.
2. Sie ist im Vergleich zur T-SIL toleranter gegenüber der Dicke der Linse [0].
Wir bauten eine hemisphärische SIL in einen Konfokalmikroskopaufbau ein, der ursprünglich für FCS-Versuche aufgebaut war. Später untersuchten wir die Leistung unseres SlL-FCS-Aufbaus und verglichen sie mit der Leistung eines herkömmlichen FCS-Systems. Dies zeigt die Leistung des SIL-FCS-Systems für zuverlässige Messungen der photophysikalischen Dynamik auf der Einzelmolekülebene mit einer Auflösung im Subwellenlängenbereich. Die Grundlagen für die FCS wurden vor etwa 25 Jahren geschaffen [Guo, F., T.E. Schlesinger, and D.D. Stancil, Optical field study of near-field optical recording with a solid immersion lens. Applied Optics, 2000. 39(2): p. 324-332 und D. Madge, E.L. Elson, W.W. Webb, "Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System-Measurement by Fluorescence Correlation Spectroscopy", Phys. Rev. Leu., Vol. 29, pp. 705-711, 1972; Hess, S.T. and W.W. Webb, Focal volume optics and experimental artifacts in confocal fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal, 2002. 83(4): p. 2300-2317 und M. Ehrenberg, R. Rigler, "Rotational brownian motion and fluorescence intensity fluctuations", Chem. Phys., Vol. 4, pp. 390-401, 1974], detaillierte Berichte über die FCS sind andernorts zu finden [Krichevsky, O. and G. Bonnet, Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys., 2002. 65: p. 251-297; Terris, B.D., et al., Near-field optical data storage using a Solid Immersion Lens. Appl. Phys. Lett, 1994. 65(4): p. 388].
Im allgemeinen wird ein Anregungslaser in eine Probe fokussiert. Jedes Molekül, das durch den Anregungsbrennpunkt diffundiert, bewirkt ein Ansteigen von Fluoreszenz-Photonenschauem. Die Länge jedes Photonenschauers (bzw. Photonen-Bursts) entspricht der Zeit, die das Molekül im Detektionsvolumenelement verweilt. Um Beiträge außerhalb des Fokus und Streulicht zu verwerfen, wird ein konfokaler Aufbau verwendet, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird (R. Rigler, U. Mets, J. Widengren, P.Kask, „Fluorescence correlation spectroscopy with high count rates and low background: analysis of translational diffusion", Eur. Biophys. J. Vol. 22, pp. 169-175, 1993). Danach werden die Fluoreszenzphotonen mit einem Einzelphotondetektor detektiert, der im Geiger-Modus arbeitet. Jedes detektierte Einzelfluoreszenzphoton erzeugt einen Impuls, der an einen Korrelator übertragen wird, in dem die Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenzintensitätsschwankungen berechnet wird.
Die Autokorrelationskurve enthält Informationen über die Dynamik von Intensitätsschwankungen in dem Zeitintervall von typischerweise 30 ns (Totzeit des Detektors) bis zur Dauer der Messung. Durch Anpassen der Autokorrelationsfunktion an einen analytischen Ausdruck können wichtige Grundparameter extrahiert werden: Diffusionszeit (durchschnittliche Durchgangszeit eines Moleküls im Detektionsvolumenelement), durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Detektionsvolumenelement, Molekülanteile (wenn mehrere Arten unterschiedlicher diffundierender Moleküle in der Probe vorhanden sind), und der Anteil von Teilchen, die den Triplettzustand belegen (langlebige, nicht fluoreszierende Dunkelzustände).
Für den allgemeinen Fall kann die Korrelationsfunktion folgendermaßen ausgedrückt werden: W " -<* iweftcs W ' (3)
Figure imgf000016_0001
worin Gmotioπ ( T ) die Bewegung der Moleküle widerspiegelt, z.B. Quer- und Rotationsdiffusion, und Xkinetics (O kinetische Prozesse des Moleküls (der Moleküle) beschreibt. Für den einfachsten möglichen Fall einer Diffusion einer einzelnen chemischen Spezies in einer verdünnten Lösung lautet der analytische Ausdruck für die Autokorrelationsfunktion folgendermaßen:
Gmotion 0) = Gdiffusion (0
Figure imgf000016_0002
worin l(t) für die Intensität der Fluoreszenz, die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden ist, und ( für das Zeitmittel steht. Ν ist die mittlere Anzahl von Molekülen, die in dem
Detektionsvolumenelement V = π l2ωcyωz vorliegen, wobei ω = ωz lωxy für das
Aspektverhältnis des Detektionsvolumenelement.es und τD = ω^ / 4D für die Diffusionszeit im gesamten Probenbereich steht, wobei D der Diffusionskoeffizient ist. Somit ist die durchschnittliche Konzentration der Moleküle in dem Volumenelement C=Ν/V. Der kinetische Teil der Gleichung (1) für den einfachsten Fall lautet: τ
Xn^W X^W-l-T + Te (5)
Hier steht T für den Anteil von Farbstoffmolekülen im Triplettzustand, und ττ ist die Relaxationszeit; d. h. die Zeit, während der sich die Moleküle im Triplettzustand befinden.
Schließlich kann der analytische Ausdruck für eine Vielzahl unterschiedlich gewichteter, sich frei und unabhängig voneinander bewegender Moleküle geschrieben werden als (O. Krichevsky, and G. Bonnet, „Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications", Rep. Prog. Phys., Vol. 65, pp. 251-297, 2002):
G (6)
Figure imgf000016_0003
Hier wird jeder Beitrag der verschiedenen Moleküle (mit dem Index j bezeichnet), die in dem Detektionsvolumenelement vorhanden sind, mit den spezifischen Quantenausbeuten Qj gewichtet. In unserem Fall wird nur eine Zwei-Komponenten-Lösung in Betracht gezogen.
Der Versuchsaufbau dieser Ausführungsform entspricht dem, der in Fig. 1a und 1b dargestellt ist. Der Aufbau arbeitet mit dem Konfokalmikroskop-Prinzip.
Der Laserstrahl eines diodengepumpten Festkörper-Lasers (532 nm, Kimmon DPSS Laser, Modell 5526) wurde durch einen Strahlaufweiter aufgeweitet (Li (f=25 mm), L2 (f=400 mm)), um die hintere Pupille des Mikroskopobjektivs überauszuieuchten. Ferner wurde das Anregungslicht an einem dichroitischen Spiegel (Chroma, 565LP) in ein Mikroskopobjektivsystem reflektiert, das die Fluorophorfarbstoff-Moleküle innerhalb des Fokalvolumens anregte.* Die Fluoreszenzemission wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen Bandfilter (Chroma HQ 585/40) geleitet, der das Signal gegenüber dem Hintergrundlicht herausfilterte. Schließlich wurde die Fluoreszenzemission durch die Tubuslinse (L3 (f=180 mm)) in die optische Eingangsfaser (0 50 μm, als Lochblende dienend) eines faseroptischen 50/50-Strahlteilers (von OZ Optics Ltd) fokussiert. Die Ausgangsfasern des Strahlteilers wurden mit den Detektionsmodulen SPCM-AQR-13 (Einzelphotonen-Zählmodul von Perkin Eimer Optoelectronics) verbunden. Die photoinduzierten Impulse von den Detektoren wurden durch einen Hardware-Korrelator mit zwei Eingängen registriert (correlator.com, Flex990EM-12C), der die Kreuzkorrelationsfunktion berechnete. Diese entspricht der Autokorrelationsfunktion der Fluoreszenz, wobei der Kreuzkorrelationsansatz ein elektronisches Nachpulsen in dem Korrelationssignal unterdrückt. Die erhaltenen Daten wurden im Computerspeicher gespeichert und dann mit einer Software analysiert, die auf einem nichtlinearen Minimierungsalgorithmus der kleinsten Quadrate (Marquardt-Levenberg) basierte und die Anzahl der Moleküle und die Diffusionszeiten der Moleküle anzeigt.
Zwei unterschiedliche Mikroskopobjektive wurden für die Messungen verwendet. Für herkömmliche FCS-Messungen, die als Bezugsmessungen betrachtet werden, verwendeten wir einen 40x NA=1 ,15-Wasserimmersions-Objektiv (Olympus, Uapo/340, Deckglas korrigiert). Für den SIL-FCS-Aufbau wurde ein Zeiss-Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 1,8 mm verwendet (LD Achroplan 40x/0,60 Kor). Die Wahl dieses Objektives ist durch das Erfordernis einer hohen numerischen Apertur (NA=0,6) einerseits und eines ausreichenden Arbeitsabstandes zum Anordnen der SIL andererseits bedingt. Für die H-SIL verwendeten wir eine Kugellinse mit einem Radius von 0,7 mm aus einem Material mit einer Brechzahl von n=2,02 (Glas-Typ Schott-Glas LaSF35), die durch Polieren in eine hemisphärische Form gebracht wurde. Proben
Nukleotidtriphosphate (TMR, Tetramethylrhodamin-6-dCTP New England Labs-425) wurden in Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1 μm für Diffusionsmessungen verwendet. Die farbstoffmarkierten Moleküle wurden in einem Tröpfchen auf einem Deckglas oder direkt auf der ebenen Oberfläche der SIL verteilt. Die optische Leistung auf der Probe betrug 1 ,2 mW für das 1 ,15 NA-Objektiv und 0,7 mW für das 0,6 NA-Objektiv plus SIL.
Messungen, Ergebnisse und Diskussionen
In diesem Abschnitt beschreiben wir die spektroskopischen Messungen, die mit und ohne SIL durchgeführt wurden. Wir werden die Leistung unterschiedlicher Objektivsysteme vergleichen: i) 1,15 NA-Objektiv ii) 0,6 NA-Objektiv plus SIL.
Das 0,6 NA-Objektiv weist einen Deckglas-Korrekturring auf, der in das Objektiv integriert ist. Der Korrekturbereich erstreckt sich von -0,125 mm bis 2 mm, siehe Fig. 7 (0,6 NA- Mikroskopobjektiv von Zeiss mit einem Deckglas-Korrekturring, der auf die Stellung "0 mm" (links) bzw. "-0,125 mm" (rechts) eingestellt ist.).
Bei der Messung mit einer SIL muß die Korrektur auf die "0"-Steilung eingestellt werden. In diesem Fall befindet sich das Probenvolumen (beugungsbegrenzt) in unmittelbarer Nähe der ebenen Oberfläche der SIL. Wir verwendeten jedoch auch die "-0,125"-Stellung des Korrekturrings an dem Objektiv, was zuverlässige FCS-Messungen ergab, wenn die SIL verwendet wird. In diesem Fall war das Probenvolumen schätzungsweise etwa 7 μm von der SIL-Oberfiäche entfernt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind nachfolgend angegeben.
Messungen mit dem 1,15 NA-Objektiv
Das verwendete Objektiv mit seiner hohen NA=1,15 ergibt eine hohen Sammeleffizienz und eine gute Begrenzung des Anregungsfeldes.
Typische Korrelationskurven, die mit dem 1 ,15 NA-Objektiv erhalten wurden, sind in Fig. 8a, 8b (die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung der analytischen Funktion, Gleichung (6)) für zwei verschiedene Konzentrationen, nämlich 1 nM (Fig. 8a) und 10 nM (Fig. 8b), gezeigt. Aufgrund des Konzeptes der abgeglichenen Detektoren und der Kreuzkorrelations-Signalanalyse ist in den Korrelationskurven kein Nachpulsen vorhanden.
Die erhaltenen Korrelationskurven wurden mit der Gleichung (6) für eine Komponente (j=1) angepaßt. Die Translationsdiffusionszeit der Moleküle betrug τD = 110 μs, die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen war N=0,86 für eine 1 nM-Lösung und N=16 für eine 10 nM- Lösung. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand war T=0,3. Der Zählrate pro Molekül (CPM)-Parameter betrug bei manchen Messungen bis zu 100 kHz. Das Hintergrundrauschen (2,3 kHz) wird nicht berücksichtigt.
NA 0,6+SIL, Korrekturring in "0"-Stellung
Dieses Objektiv wird aufgrund seiner geringen numerischen Apertur nicht alleine für FCS- Messungen verwendet. Für sich genommen, ergibt es nur eine CMP von etwa 18 kHz. Wenn es jedoch mit einer SIL kombiniert wird, zeigt diese Kombination eine gute FCS-Leistung, wie dies nachfolgend beschrieben wird.
Die in Fig. 9 gezeigte Korrelationskurve wird aus dem Probenvolumen erhalten, das mit einer SIL auf deren ebener Oberfläche bei einer Konzentration von 10 nM gebildet wird (die "Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie ist eine Anpassung an die gemessene Korrelationskurve). Die Korrelationskurve erfüllte nicht gut ein Ein-Komponenten-Modell, wobei wir davon ausgehen, daß dies durch die Modifikation der freien 3D-Diffusion nahe der Oberfläche bedingt war. Da das Probenvolumen in unmittelbarer Nähe der Oberfläche liegt (in Fig. 10; Probenvolumen, das durch diese Objektiv + SIL-Geometrie gebildet wurde - das Probenvolumen befindet sich unmittelbar auf der SIL-Proben-Grenzfläche), sollte nicht nur die Beobachtung einer freien 3D-Diffusion zu erwarten sein, sondern auch eine 2D-Diffusion auf der SIL-Oberfläche. Daher wurde die erhaltene Korrelationskurve gemäß der Gleichung (6) für einen Zwei-Komponenten-Fall (j=2) angepaßt.
Dieses Modell paßt gut zu den Versuchsdaten. Aus der Anpassungsanalyse erhielten wir
•rI)1 = 25 μs, rO2 = 200 μs, und N-,=0,86, N2=0,9. Der CPM-Wert betrug 100 kHz, was bemerkenswert hoch ist. Der Anteil der Moleküle, die im Triplettzustand vorliegen, ist T=0,44. Dies ist ein 1 ,5-mal höherer Faktor als bei den Versuchen mit dem 1 ,15 NA-Objektiv. Innerhalb dieses Modells gehen wir davon aus, daß zwei Typen von Molekülen vorliegen, nämlich i) frei diffundierende Moleküle plus ii) Moleküle, die an der SIL-Oberfläche mit einer etwas langsameren Geschwindigkeit diffundieren (wie gemessen). Aus einem Vergleich der Messungen, die mit dem 1 ,15 NA-Objektiv und mit dem 0,6+SlL- Objektiv bei einer Konzentration von 10 nM durchgeführt wurden, schlössen wir, daß das mit der SIL erhaltene Probenvolumen etwa 9-mal kleiner ist. Die CPMs sind für beide Schemata vergleichbar (siehe Daten in Fig. 8a, 8b und Fig. 9). Dies paßt gut zu den numerischen Aperturen NA=1 ,15 für das Immersionsobjektiv und NA=1 ,2 für das 0,6 NA+SIL-System. Die optischen Feldverteilungen sind jedoch sehr unterschiedlich und müssen näher untersucht werden [Muster, T.D., Chromatic Correction of High-Performance Solic Immersion Lens System. Jpn. J. Appl. Phys., 1999. 38(Part 1, 3B): p. 1777-1779].
Der Rausch-Beitrag für das SIL-System betrug 8 kHz. Dieses relativ hohe Rauschen ist durch die von der ebenen SIL-Oberfläche zurückreflektierten Photonen bedingt.
NA 0,6+SIL, Korrekturring in "-0J125"-Ste!lung
Durch Verkleinern des Abstandes zwischen dem Objektiv und der SIL um 20 μm erhielten wir den höchsten CPM-Wert. Das Probenvolumen wurde um etwa 6-7 μm von der SIL-Oberfläche wegverschoben.
In diesem Fall entsprachen die erhaltenen Korrelationskurven gut einem Ein-Komponenten- Modell (j=1 in Gleichung (6)), was sich durch die Probenvolumen-Verschiebung und eine zu erwartende, freie 3D-Diffusion erklärt. Die typischen Korrelationskurven sind in Fig. 11a, 11b, 11c (die „Kreuze" stehen für die Meßdaten; die durchgezogene Linie steht für die Anpassung gemäß Gleichung 6) für Konzentrationen von 1 nM, 10 nM und 1000 nM gezeigt.
Für alle Messungen wurde festgestellt, daß die Diffusionszeit τD = 38 + ljUS war. Die durchschnittliche Anzahl von Molekülen in dem Probenvolumen war N=0,19, N=2,2 und N=215 für die Konzentrationen von 1 nM, 10 nM bzw. 1000 nM. Der CPM-Wert betrug bis zu 120 kHz für die 10 nM-Messung (Einzelmolekül-Modus), und der Rauschpegel lag bei 2500 Hz. Der Anteil der Moleküle im Triplettzustand betrug etwa T=0.3.
Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Ergebnissen, die mit dem 1 ,15NA-Objektiv erhalten wurden, zeigt die Verbesserung der Feldbegrenzung um einen Faktor von 5 bis 7 mit niedrigeren CPM-Werten für die Konzentrationen von 1 nM und 1000 nM TMR. Im Fall der höchsten Konzentration erkennt der Detektor keine Zwei- und Mehrphotonen-Ereignisse, im Fall der niedrigsten Konzentration ist der optimale Ort schwer zu bestimmen, was zu niedrigeren CPM-Werten führte. Figur 12 zeigt die Detektionsgeometrie bzw. das Probenvolumen, das durch diese Objektiv+SIL-Geometrie gebildet wurde - das Probenvolumen ist etwa 6 bis 7 μm von der SIL- Oberfläche entfernt angeordnet. Wie die höhere Feldbegrenzung durch eine restliche axiale chromatische Aberration und durch chromatische Variation der sphärischen Aberration bedingt ist, siehe Fig. 13: Der Fokus für die Wellenlänge von 532 nm (Anregungslicht) und der Fokus für 560 nm (angeregtes Licht) überlappen sich nicht vollständig, sondern weisen nur einen gemeinsamen Teil auf, der schließlich das Probenvolumen bildet, das 5- bis 7-mal kleiner als das mit dem 1 ,15NA-Objektiv mögliche ist. Aufgrund der Aberrationen befindet sich das Probenvolumen in der Überlappung der Punktverwaschungsfunktionen (PSF) für unterschiedliche Wellenlängen, nämlich für die anregenden und für die angeregten.
Bei einem Vergleich der Diffusionszeiten stellten wir fest, daß die mit der SIL erhaltene Diffusionszeit 3-mal kürzer ist als die für das 1.15NA-Objektiv. Dies bedeutet, daß der XY- Durchmesser des Probenvolumens sowie die Auflösung des SIL-„bestückten" Systems gegenüber dem 1.15NA-Objektiv ebenfalls 3 mal kleiner ist (200 nm bei λ =560 nm).
Bei dieser Arbeit untersuchten wir die Brauchbarkeit einer hemisphärischen Festkörper- Immersionslinse für FCS-Messungen. Wir bauten ein Festkörper-Immersionslinsen- Konfokalmikroskop, um FCS-Messungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Fluoreszenzmolekülen durchzuführen. Wir zeigten die Leistung dieses Mikroskopsystems hinsichtlich der Sammeleffizienz und der Feldbegrenzung, die beide von großer Bedeutung für FCS-Experimente sind. Es wurde gezeigt, daß die Sammeleffizienz des SIL-Mikroskops nahezu dieselbe ist wie die eines herkömmlichen FCS-Mikroskops; wir erreichten mit der SIL- Konfiguration eine Zählrate von bis zu 100 kHz pro Molekül. Das Probenvolumen, das mit der SIL gemessen wurde, schien bis zu 9-mal kleiner zu sein (für die ,,0"-Korrektur) als im Vergleich mit dem Wasserimmersionsobjektiv, während die Querauflösung etwa 200 nm (bei λ =560 nm) betrug. Dies ebnet den Weg für FCS-Messungen mit höherer Auflösung sowie für Messungen mit höheren Fluorophorkonzentrationen - was durch die mit der SIL durchgeführten Messungen bei einer TMR-Konzentration von 1000 nM gezeigt wurde. Wir zeigten zwei unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten der SIL für FCS: i) die SIL wird für Messungen von Molekülen nahe oder auf der Oberfläche, ii) für Tiefenmessungen im Inneren der Probe, d. h. 6 bis 7 μm von der SIL-Oberfläche entfernt, verwendet. Dies zeigt uns eine Flexibilität des SIL-Ansatzes für FCS.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die SIL-Konfiguration für die Einzelmolekülspektroskopie
• die Auflösung des Systems gegenüber derzeit verwendeten FCS-Systemen um ein Vielfaches erhöht, • eine höhere Sammeleffizienz des optischen Systems bereitstellt, • ein Erfassen der Probe in der Tiefe von mindestens bis zu 7 μm zuläßt und • Messungen an den Proben mit (im Vergleich zu Wasserimmersionsobjektiven) bis zu 10-mal höheren Fluorophor-Konzentrationen ermöglicht.
Fig. 14 zeigt einen Vergleich zwischen herkömmlichen Objektiven und Objektiv-SIL- Kombinationen.

Claims

Patentansprüche
1. Festkörper-Immersionslinse für ein Mikroskop mit einem Objektivsystem mit einer vorbestimmten numerischen Apertur, wobei die Brechzahl des Materials der Festkörper- Immersionslinse so gewählt ist, daß die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht ist, wenn die Festkörper-Immersionslinse dem Objektivsystem vorgeschaltet ist.
2. Festkörper-Immersionslinse nach Anspruch 1 , bei der die Brechzahl größer oder gleich 1 ,3 beträgt.
3. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, wobei der die Festkörper-Immersionslinse eine Linsenform mit mindestens einer aplanatischen Oberfläche aufweist.
4. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, bei der die Festkörper- Immersionslinse mindestens eine diffraktive optische Oberfläche umfaßt.
5. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem beabstandet ist, bevorzugt um mindestens 1 mm.
6. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die so dem Objektivsystem vorgeschaltet werden kann, daß sie vom Objektivsystem vollständig thermisch, elektrisch und/oder mechanisch entkoppelt ist.
7. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die als hemisphärische oder als abgeflachte Kugel ausgebildet ist.
8. Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche, die eine ebene Oberfläche aufweist.
9. Festkörper-Immersionslinse nach Anspruch 8, bei der die ebene Oberfläche mit einer Seite eines Objektträgers fluchtend verläuft.
10. Verwendung der Festkörper-Immersionslinse nach einem der obigen Ansprüche bei einem Mikroskop mit einem Objektivsystem, wobei mehrere der Festkörper-Immersionslinsen in einer 2-dimensionalen Anordnung dem Objektivsystem vorgeschaltet sind.
11. Mikroskopierverfahren, bei dem mittels einer einem Objektivsystem eines Mikroskops vorgeschalteten Festkörper-Immersionslinse die numerische Apertur des Objektivsystems erhöht wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , das als Fluoreszenzverfahren, das zur Einzelmoleküldetektion dient, betrieben wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, das als konfokales Mikroskopieverfahren betrieben wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die Festkörper-Immersionslinse beabstandet dem Objektivsystem vorgeschaltet wird, bevorzugt um mindestens 1 mm.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, bei dem zur Verschiebung des Fokalvolumens von einer Grenzfläche zwischen einem Objektivträger und einer zu untersuchenden Flüssigkeit in die Flüssigkeit hinein eine einstellbare Aberration des Objektivsystems geändert wird.
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