WO2005028500A1 - 生体成分の組成が変化した溶液の調整方法 - Google Patents

生体成分の組成が変化した溶液の調整方法 Download PDF

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Shigehisa Wada
Jun Utsumi
Yoshiji Fujita
Hiroyuki Sugaya
Satoko Yamada
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Toray Industries, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for preparing a solution in which the composition of a biological component is changed by separating biological molecules such as proteins from a biological component-containing solution, particularly human plasma, urine, or the like.
  • the present invention relates to a method and apparatus for preparing a solution in which the composition of a biological component is changed by removing components that interfere with the detection of trace components, in particular, high molecular weight proteins, for the purpose of clinical proteome analysis.
  • proteome analysis research has begun to attract attention as a post-genome study. Since the gene product protein is considered to be more directly linked to the pathology of the disease than the gene, the results of proteome analysis that comprehensively examines the protein are expected to be widely applicable to diagnosis and treatment. There is a high possibility that many pathogenic proteins and disease-related factors that could not be discovered by genome analysis can be discovered.
  • MALDI-TOF-Mb matrix assisted laser desorption ionization time—of—flignt mass spectrometry
  • high-throughput ultra-low-volume dispensing of polypeptides becomes possible, and even to the very small amount of powerful proteins that can be detected conventionally. Has become identifiable and has become a powerful tool for searching for disease-related factors.
  • Biomarkers behave in relation to disease states, so they can be diagnostic markers and are also likely to be drug discovery targets. In other words, since the results of proteome analysis are more likely to be diagnostic markers and drug targets than specific genes, they will be a trump card in the diagnosis and treatment of the post-genome era, and the identified biomarkers will be used in patients' drug response. V, a major promotion of tailor-made medicine It can play a role.
  • Human proteins are estimated to have more than 100,000 species. It is said that only 10,000 proteins are contained in serum, and the total serum concentration is about 60-8 Omg / mL. is there. Proteins with high contents in human serum include albumin (molecular weight 66 kDa), immunoglobulin (150-190 kDa), transferrin (80 kDa), haptoglobin (> 85 kDa), lipoprotein (several lOOkDa), etc. It is present in large quantities in excess of / mL.
  • bioactive proteins such as peptide hormones, interleukins, and cytokins, which are considered to be biomarkers of pathological conditions and etiological factors, are present only in extremely small amounts of less than Ing / mL.
  • the content ratio is in the nano to pico level compared to the high content component of the polymer.
  • 70% or less of all types of proteins have a molecular weight of 60,000 (60 kDa) or less, and most of the aforementioned trace biomarker proteins are mostly included in this region (for example, Non-patent document 1). Since these proteins pass through the kidneys and are partially excreted in urine, it is possible to measure urine as well as blood as a sample.
  • Proteome analysis by general serologic tests requires detection of pathogen-related trace components.
  • MALD TOF—MS and ES tom MS electrospray ionization mass spectrometry
  • a product that has already been put into practical use or a disclosed technique includes a carrier on which an affinity ligand such as a blue dye is immobilized. ), A centrifugal tube-type device that separates high molecular weight components by centrifugal filtration (commercialized), a method of fractionation by the electrophoresis principle, a traditional precipitation method such as Cohn's ethanol precipitation, etc. There is a method of fractionation by chromatography (for example, Non-Patent Document 2).
  • proteome analysis will be widely performed in medical research and clinical settings, and faster and more accurate examinations and diagnoses will be possible. It is expected to be a powerful tool for investigating the cause of early intractable diseases and developing early diagnostic methods.
  • the required conditions for the technique include the ability to flow plasma components at high speed, no protein denaturing action, and fine processing for high functionality. And it is not very expensive. We have not found any devices or devices that can solve these issues.
  • Non-patent Document 1 By Anderson 'NL (Anderson NL), Anderson' NG (Anderson NG), "The Human 'Plasma Proteome: History ⁇ ⁇ ⁇ Character ⁇ ⁇ ⁇ And” Diagnos Aitsk “Bros. plasma & proteome: history, character, and diagnostic prospects), Molecular & Cellular Proteomics, (USA), The American American Society for Biochemistry, and Molecular Molecular Biology 'Incorporated (The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2002, Volume 1, p845-867.
  • Non-patent Document 2 The Society of Biochemistry, Japan, “Lecture on Experimental Chemistry (Vol.1) Protein (1) Isolation, Purification, Properties”, Tokyo Chemical Dojin, 1990
  • Non-patent Document 3 Cell Engineering Separate Volume, "Bio-Experiment Illustrated 5", Shujunsha, 2001
  • Non-patent Document 4 N. Ahmed et al, Proteomics, Online Edition, June 23, 2003
  • Non-patent Document 5 D. Shi Rothemund et al. (2003), Proteomics, Vol. 3, pp. 279-287)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 2002-542163
  • Patent Document 2 Japan, Patent No. 3297707
  • the problem to be solved by the present invention is to advantageously separate and remove extra high molecular weight proteins from a solution containing a biological component, which are obstructive when performing clinical proteome analysis.
  • An object of the present invention is to provide a method and an apparatus for preparing a biological component-containing solution in which the composition of a biological component is changed, which is suitable for proteome analysis.
  • the first invention group includes the following inventions.
  • Concentration composition of albumin relative to total protein characterized in that a biological component-containing solution is supplied to a separation membrane having a transmission ratio of at least ⁇ 2-microglobulin and albumin of 50 or more and permeated by the separation membrane.
  • composition ratio of j82-microglobulin in the total protein of the solution in which the composition of the biological component has changed should be at least 10 times the composition ratio of j82-microglobulin in the total protein of the solution containing the biological component.
  • the biochemical component is characterized in that the biological component is blood, plasma, serum or other blood-derived material, urine, ascites, saliva, tears, cerebrospinal fluid, pleural effusion, or a solution obtained by extracting protein from cellular power. How to prepare these solutions,
  • a method for analyzing a protein contained in a biological component comprising preparing a solution in which the composition of the biological component has been changed by any one of the above methods, and then analyzing the protein contained in the solution.
  • the method for analyzing a protein according to claim 9, wherein the means for analyzing the protein is at least one selected from mass spectrometry, electrophoresis analysis and liquid chromatography.
  • a device having a module with a built-in separation membrane having a permeation ratio of ⁇ 2-microglobulin and albumin of 50 or more, wherein the module is provided on the stock solution side of the separation membrane by the stock solution inlet for the biological component-containing solution and the separation membrane.
  • a second invention group includes the following inventions.
  • a module having a built-in separation membrane, a stock solution inlet and a stock solution outlet connected to the stock solution side flow path of the separation membrane, and a permeate outlet of the separation membrane;
  • a solution circulation circuit that connects the undiluted solution inlet and the undiluted solution outlet, and has a pump and a target liquid inlet for separation on the way;
  • a diluent inlet provided at a position upstream of the target liquid inlet for separation or at a position in the middle of the solution circulation circuit;
  • a liquid flow circuit for preparing a solution in which the composition of the biological component has been changed comprising:
  • At least two liquid flow circuits are included, and a liquid outlet to be separated of one liquid flow circuit and a liquid inlet to be separated of another liquid flow circuit are directly or indirectly connected by a liquid flow path.
  • a biological component-containing solution was flowed into the stock solution side of the separation membrane, and the solution on the stock solution side was circulated through a solution circulation circuit provided outside the module, and passed through the separation membrane.
  • This is a step of taking out the liquid as a solution having a changed composition of the biological component, and after starting the flow of the biological component-containing solution, diluting the biological component-containing solution with the module.
  • a method for preparing a solution having a changed composition of a biological component characterized by additionally flowing the solution into the stock solution side of a separation membrane incorporated in the
  • the biological component is a solution obtained by extracting blood-derived substances such as blood, serum, urine, ascites, saliva, tears, cerebrospinal fluid, pleural effusion, or cellular protein. How to prepare the solution,
  • the method is characterized by using two modules, using the solution obtained by any of the above-mentioned preparation methods in the first module, and performing the above-mentioned preparation method in the second module.
  • the third invention group includes the following inventions.
  • a method for preparing a solution having a changed composition of a biological component from a biological component-containing solution by performing at least two steps of treatment on the biological component-containing solution wherein the step includes:
  • step (1) add cellulose, cellulose acetate, polycarbonate, Materials containing at least one material selected from the group consisting of polyethylene, polymethacrylate, polyacrylate, polyamide, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyurethane, polystyrene, polyethylene and polypropylene.
  • a method for preparing the solution characterized by using
  • cellulose, cellulose acetate, polycarbonate, polysulfone, polymethacrylate, polyacrylate, polyamide, polyvinyl fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyethylene and polypropylene are also used.
  • the strength of cellulose, cellulose acetate, polycarbonate, polysulfone, polymethacrylate, polyacrylate, polyamide, polyvinyl fluoride, polyacrylonitrile, polyethylene and polypropylene is also selected.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a separation system used in Examples 1 and 3 of the present invention. (1 membrane separation unit)
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of a separation system used in Embodiment 2 of the present invention. (2 membrane separation units)
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a separation system used in Example 4 of the present invention. (3 membrane separation units)
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a system used in Examples 5 and 6 of the present invention. (Example of three units with membrane separation function and adsorption function and one concentration unit)
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing an example of a device belonging to a group of the third invention.
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph of a solution in which the composition of a biological component has changed.
  • FIG. 7 is a two-dimensional electrophoretic photograph of the solution in which the composition of the biological component obtained in Example 2 has changed.
  • FIG. 8 is a two-dimensional electrophoresis photograph of a human serum solution.
  • the solution in which the composition of the biological component is changed is a solution derived from a living body such as blood, that is, a solution containing the biological component, which is subjected to a specific treatment as a stock solution and subjected to a specific treatment. It is a solution in which is changed.
  • blood refers to animal blood such as human beings, and also includes solutions such as serum and plasma that are a part of components of blood.
  • solution derived from a living body includes, for example, a solution containing a protein in a biological substance such as a solution obtained by extracting protein from at least blood, urine, saliva, tears, cerebrospinal fluid, ascites, pleural effusion, or cells. Is done.
  • the “separation membrane module” referred to in the present invention is one in which a separation membrane is housed in a housing.
  • the housing is provided with an inlet for the solution to be separated and an outlet for the solution, and a permeate outlet for the solution separated through the separation membrane and flowing out.
  • the material of the housing is not particularly limited, but examples thereof include plastic materials such as polycarbonate, polypropylene, polystyrene, polysulfone, and polyethersulfone.
  • the solution in which the composition of the biological component-containing solution obtained in the present invention has changed is preferably used for protein analysis, particularly for proteome analysis.
  • the analysis method is not particularly limited, and examples thereof include LC, 2D-PAGE, nuclear magnetic resonance (NMR), MALDI-TOF-MS, and ESI-MS. These are analysis methods in which the analysis sensitivity is reduced due to the high content of proteins present in a large amount in some solutions such as albumin, and by using the solution obtained in the present invention. , High sensitivity analysis becomes possible. It is also useful for proteome analysis using MS and electrophoresis.
  • the MS to which the solution preparation apparatus of the present invention can be directly or indirectly connected is not particularly limited, but is preferably an electrospray ionization type, an atmospheric pressure ionization type, a quadrupole (QQQ) type, or a magnetic sector type. , Time-of-flight, MS / MS, MSn, FT-MS, ion trapping and combinations thereof. Also includes tandem MS such as MSZ MS or MSn (eg, MS3). In the case of tandem MS, all types of MS are applicable Forces especially for ion trapping, quadrupole-one-time-of-flight (Q-TOF), FT-MS, and sector-one instruments with quadrupole and ion-trapping Using a combination is more efficient.
  • the biological component-containing solution is converted to j8-microglobulin.
  • the sieve is supplied to a separation membrane having a permeability ratio of 50 or more, which is a value obtained by dividing the coefficient by the albumin sieve! / Coefficient, and the liquid permeated through the separation membrane is collected.
  • a module having a built-in separation membrane having a permeation ratio of j82-microglobulin and albumin of 50 or more is provided, and the module is provided on the stock solution side of the separation membrane with a stock solution inlet for a biological component-containing solution, An apparatus having at least an outlet for the permeated liquid permeated by the separation membrane is used.
  • a stock solution outlet for a biological component-containing solution may be provided on the stock solution side of the separation membrane.
  • the permeation ratio of the separation membrane is preferably 70 or more, and more preferably 140 or more. There is no particular upper limit, but in a membrane separation unit having this value that is too high, the desired Since there is a concern that the amount of recovering a protein having a molecular weight of less than 150,000 will be reduced, it is preferably 10000 or less. It is preferable to use a hollow fiber membrane for this separation membrane. Hollow fiber membranes have been widely used as materials for dialysis modules called artificial kidneys for the purpose of transmitting proteins. The separation membrane used in the artificial kidney is designed to prevent proteins such as albumin from permeating as much as possible, and to transmit low molecular components such as creatine and urea.
  • Blood is purified by flowing out low-molecular proteins unnecessary for living organisms from the outer cavity of the hollow fiber.
  • a method of permeating the hollow fiber from the lumen side to the outside through the hollow fiber membrane is preferable.
  • the present invention can be carried out efficiently because it is easy to increase the surface area and the pressure loss during operation is small.
  • the material of the separation membrane used in the group of the first invention is not particularly limited, but may be a cellulose-based polymer such as cellulose or cellulose-triacetate, a polysulfone-based polymer such as polycarbonate, polysulfone or polyethersulfone, or a polymethylmethalate.
  • Polymethacrylates such as acrylates, polyacrylates, polyamides, poly (vinylidene fluoride), polyacrylonitrile, polyesters, polyethylene and polypropylene.
  • polysulfone which is often used in dialysis machines in recent years, is a preferable material because of its good fractionation characteristics.
  • the flow path in the membrane of the separation membrane is an asymmetric structure, and furthermore, an asymmetric structure with a multilayer structure consisting of a dense layer and a support layer with high porosity and maintaining membrane strength. It is preferable that This asymmetric structure is judged by observing the cross-sectional structure of the film under an observation condition of 1000 times using an electron microscope. Judgment is made based on whether there are both a layer in which vacancies cannot be sufficiently confirmed and a layer in which vacancies can be confirmed in the thickness direction of the film. If both layers are confirmed, the structure is identified as asymmetric.
  • the pores near the surface in contact with the undiluted solution be the densest. This is also a force capable of reducing clogging of the film surface due to the solute.
  • the separation membrane used in the group of the first invention does not adsorb proteins as much as possible.
  • a membrane having a hydrophilic surface is preferable.
  • hydrophilic membranes have the effect of suppressing protein adsorption, which gives important information for proteome analysis, and recovering them without waste.
  • the hydrophilic film is not particularly limited as long as it is hydrophilized, but may be a film obtained by copolymerizing a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer, or a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer.
  • hydrophilic polymer bonded to and adhered to the surface of a hydrophobic polymer film, or a hydrophobic polymer surface that is also made of a hydrophobic polymer. And those subjected to radiation treatment.
  • the chemical structure for providing the hydrophilic component is not particularly limited, but hydrophilic polymers such as polyalkylene oxides such as polyethylene glycol, polybutylpyrrolidone, polybutyl alcohol, polyhydroxyethyl methacrylate, and polyatarylamide are preferred.
  • a step of removing the solvent such as hydraulic water or the like obtained by permeation through the separation membrane may be further performed to concentrate the protein.
  • a separation membrane such as a flat filter or a hollow fiber membrane having a molecular sieve effect is used to perform concentration by a separation sieve.
  • a separation membrane such as a flat filter or a hollow fiber membrane having a molecular sieve effect is used to perform concentration by a separation sieve.
  • the material of the membrane that can be used in the concentration step is not particularly limited, but may be cellulose, a cellulose-based polymer such as cellulose triacetate or the like, a polycarbonate, a polysulfone-based polymer such as polysulfone-polyethersulfone, or a polymethyl sulfonate.
  • Materials containing polymers selected from the group consisting of polymethacrylic acid esters such as methacrylate, polyacrylic acid esters, polyamides, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyethylene and polypropylene are also used. .
  • polysulfone which is widely used in recent years for dialysis machines and the like, is a preferable material because it can obtain a membrane having fractionation characteristics and high water permeability.
  • an asymmetric structure having a sponge structure close to a uniform structure and a multilayer structure of a dense layer and a support layer having a high porosity and maintaining the film strength are also provided. Any of the membranes can be used.
  • the molecular fractionation performance of the membrane used in the concentration step the molecular fractionation ability is such that the peptide does not pass through physiological saline, for example, the cut-off value is 0.5 kDa or less, preferably 0.1 kDa or less. It is preferable to use a high-performance membrane or ultrafiltration membrane!
  • composition of j82-microglobulin in the total protein of the biological component-containing solution is preferably at least 10 times, more preferably at least 100 times, particularly preferably at least 1,000 times. This is because in a mass spectrometer or the like, the amount of protein that can be injected into the device is limited, so that the measurement sensitivity can be increased.
  • composition ratio of albumin in the protein is 0. Desirably less than 3, more preferably less than 0.1, or even less than 0.01! /.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an example of an apparatus for preparing the solution of the first invention.
  • the flow of the liquid is indicated by arrows.
  • a sample which is a biological component such as serum, or a biological component-containing solution containing the same is supplied from a pump for injection 100 through a three-way valve 101 to a first separation membrane module having a built-in separation membrane having a specific permeability in the first step.
  • the solution is injected into 105 and is sent through a solution circulation circuit 102 composed of a tube by a circulation pump 103 to circulate.
  • the permeate that has passed through the separation membrane in the first step is obtained from the first-stage membrane unit treatment liquid recovery port 104, which is the outlet of the permeate.
  • This embodiment is a basic unit (unit) of one process. As a result, a desired proteome analysis liquid is obtained. If further removal of high molecular weight proteins is desired, multiple modules can be connected.
  • FIG. 2 shows an example in which two modules are connected to perform two-stage processing
  • FIG. 3 shows an example in which three modules are connected to perform three-stage processing.
  • the permeated liquid is injected into the unit of the next step by a tube directly connected to the processing liquid recovery port of the membrane separation unit which is the permeated liquid outlet.
  • the target solution is supplied to the recovery port (104 in the apparatus shown in FIG. 1, 204 in the apparatus shown in FIG. 2, and 304 in the apparatus shown in FIG. 3) in the most downstream unit of the process. can get.
  • FIG. 4 shows an apparatus in which a module having a function of concentrating is further connected to the apparatus shown in FIG. 3, and a target solution is recovered from a processing solution recovery port 407 of the concentrating unit.
  • a module containing a separation membrane is used, and the solution containing the biological component is caused to flow into the undiluted solution side of the separation membrane. Circulating the liquid on the side through a solution circulation circuit provided outside the module to remove the solution that has passed through the separation membrane. After the biological component-containing solution flows in, a diluent for the biological component-containing solution is supplied to the module. It is characterized by additional flow into the stock solution side of the built-in separation membrane.
  • a stock solution inlet and a stock solution outlet having a built-in separation membrane and connected to a stock solution side channel of the separation membrane, and a separation solution are provided.
  • a module having an outlet for the permeate of the membrane, a solution circulation circuit connecting the undiluted solution inlet and the undiluted solution outlet, and having a pump and a separation target liquid inlet on the way, and a position upstream of the separation target liquid inlet Or a diluent inlet provided at a position in the middle of the solution circulation circuit.
  • the separation membrane is a porous separation membrane, and may be any of a flat membrane type separation membrane such as a flat filter, a cartridge type filter, and a hollow separation membrane such as a hollow fiber membrane. Can also be used.
  • hollow fiber membranes can be used efficiently because the membrane surface area per treatment liquid volume is large and pressure loss can be reduced.
  • the inner diameter of the hollow fiber membrane is preferably smaller, more preferably 1000 m or less, more preferably 500 / zm or less.
  • the flat filter has an advantage that it can be easily formed at a low cost.
  • the membrane material examples include cellulose, cellulose acetate, polycarbonate, polysulfone, polymethacrylates such as polymethyl methacrylate, polyacrylate, polyamide, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyethylene and polyethylene.
  • polypropylene and derivatives thereof One or more materials selected from the group consisting of polypropylene and derivatives thereof can also be exemplified.
  • polysulfone which is often used in dialysers in recent years, is preferred because of its good fractionation characteristics!
  • the separation membrane used in the group of the second invention it is preferable to use a separation membrane having a permeation ratio of 50 or more between a protein having a molecular weight of less than 150,000 and a protein having a molecular weight of 60,000 or more.
  • Other preferable characteristics and shapes are the same as those of the separation membrane of the first invention group. The same as described.
  • the biological component-containing solution is caused to flow into the undiluted solution side of the separation membrane, and then the diluent for the biological component-containing solution is caused to flow. This is because, when the diluent is added, excessive concentration on the surface of the membrane is prevented, and the permeation ratio of the separation membrane is prevented. Further, it is preferable to use a physiological saline or a "buffer solution" as the diluting solution.
  • Buffer solution includes MES, BIS-TRIS, ADA, ACES, PIPES, MOPSO, BIS-TRIS PROPANE, BES, MOPS, TES, HE PES, DIPSO, MOBS, TAPSO, TRIZMA, HEPPSO, POPSO, TEA, EPP S, TRICINE, GLY—GLY, BICINE, PBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS and the like.
  • the above buffer solutions are abbreviated, but the details can be understood by referring to the catalogs of reagent manufacturers such as Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd. and MSDS (Safety Data Sheet). .
  • the flow rate Q1 of the biological component-containing solution flowing into the module is the flow rate of the liquid flowing into the module and flowing through the circuit, and is preferably larger than the flow rate Q2 at which the separated liquid is sent. This is because it is also effective in preventing concentration on the surface of the separation membrane, preventing accumulation of deposits on the membrane surface, and preventing clogging of the membrane pores. Further, it is desirable that the ratio Q2ZQ1 of the flow rate Q1 of the liquid flowing into the separation membrane module and the flow rate Q2 of the separated liquid to be sent be 0.5 or less. When the flow rate Q1 of the liquid flowing into the separation membrane module and the flow rate Q2 at which the separated liquid is sent Q2ZQ1 is 0, filtration is not performed and mass transfer only by diffusion is performed. Since the speed becomes slow, it is desirable that the speed is 0.005 or more.
  • the flow rate Q2 permeating through the separation membrane and the flow rate Q3 of the diluent flowing into the module have a relationship of 0.5 ⁇ Q2 / Q3 ⁇ 1.5. 9-1. 1, that is, preferably about 1.
  • two modules are prepared, and in the first module, while a diluent is additionally introduced as described above, a solution in which the composition of the biological component is changed is obtained.
  • a solution in which the composition of the biological component is changed is obtained.
  • a high-molecular-weight tank more suitable for proteome analysis The solution from which the protein has been removed can be prepared.
  • additional modules such as third and fourth modules can be prepared and similar steps can be performed.
  • a solution containing a large amount of the target protein component can be obtained. It can be efficiently prepared.
  • an apparatus for preparing a solution having a changed composition from a biological component-containing solution in the group of the third invention (1) means for adsorbing a part or the whole of a protein having a molecular weight of albumin or more, 2) a means for fractionating a part or all of a protein having a molecular weight of albumin or more by a molecular sieve, and (3) a means for concentrating the protein. It is characterized in that they are connected by a channel. It is preferable that the apparatus has a solution outflow path that can be connected to a liquid chromatograph, an electrophoresis apparatus, or a mass spectrometer.
  • albumin which is a molecular weight standard, refers to albumin derived from humans, pests, other mammals and birds, and is determined by the target organism.
  • the albumin is used as a reference.
  • a protein having a molecular weight of albumin or higher mainly refers to a protein having a higher molecular weight than albumin (molecular weight of 60 to 70,000). Whether it has a higher molecular weight than albumin is determined by SDS-PAGE ( sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).
  • the term “adsorption” means that the protein is soluble in an aqueous solution and is captured by the substance due to the interaction with the substance present in the process.
  • the material used for the adsorption in this step is not particularly limited, but may be a cellulose-based polymer such as cellulose or cellulose triacetate, a polysulfone-based polymer such as polycarbonate, polysnoreon, or polyetherenosulfone, or a polymethacrylic acid such as polymethyl methacrylate. Ester, polyacrylate, polyamide, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyurethane, polystyrene, polyethylene, and polypropylene are used.
  • the shape of the material may be spherical beads or fibers, flat fibers such as long fibers or short fibers, and knitted, woven or non-woven fabrics, or hollow.
  • a shape having a large surface irregularity is preferable for the effect of increasing the adsorption surface area.
  • a permeation type separation membrane such as a flat membrane or a hollow fiber membrane is preferable because low molecular weight proteins can be separated at the same time.
  • the properties of the base material itself are necessary and desired to be removed from the target solution.
  • the base material include a material whose surface is made hydrophilic so that low molecular weight proteins are not adsorbed, albumin and the like.
  • a material having a hydrophobic property is appropriately selected and used.
  • the substrate having a hydrophilic surface may be a substrate obtained by copolymerizing a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer, or a substrate obtained by mixing a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer.
  • a surface obtained by bonding and attaching a hydrophilic polymer to a surface of a hydrophobic polymer, or a surface obtained by chemically treating, plasma-treating, or radiation-treating a surface of a hydrophobic polymer may be used.
  • hydrophilic As the active component, it is preferable to use a hydrophilic polymer such as polyalkylene oxide such as polyethylene glycol, polybutylpyrrolidone, polybutyl alcohol, and polyhydroxyethyl methacrylate.
  • a hydrophilic polymer such as polyalkylene oxide such as polyethylene glycol, polybutylpyrrolidone, polybutyl alcohol, and polyhydroxyethyl methacrylate.
  • hydrophobic substrate one using a hydrophobic substance or one having a hydrophobic ligand introduced on the surface is used.
  • the hydrophobic component include methacrylic acid esters, acrylic acid esters, ethylene such as olefins such as propylene, acrylonitrile, methacrylonitrile, and other compounds having a carbon-carbon double bond, and polymers such as polysulfone and cellulose. Can be exemplified.
  • a material on which at least one of the compounds having benzyl group, phenyl group, chloromethyl group, octyl group, lauryl group, etc. for example, ethanol, isopropyl alcohol, amidomethylated polystyrene
  • a porous membrane having a form such as a flat membrane or a hollow fiber membrane and having a molecular sieving effect.
  • a hollow fiber membrane is effective because the surface area of the separation membrane becomes extremely large.
  • the material of the membrane preferably used in this step is not particularly limited, but includes cellulose, a cellulose-based polymer such as cellulose triacetate, a polysulfone-based polymer such as polycarbonate, polysnoreon and polyethersulfone, and polymethyl methacrylate. Polymers of any one of the following materials are used: polymethacrylate, polyacrylate, polyamide nylon, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyethylene and polypropylene.
  • polysulfone which is often used in dialysers in recent years, has a large ratio of a low-molecular-weight substance to a high-molecular-weight substance and a large coefficient among substances having different molecular weights to be sieved. It is a preferred material because of its good fractionation characteristics.
  • the film structure any of those having a sponge structure close to a uniform structure and those having an asymmetric structure in which a dense layer and a thick supporting layer provided to maintain film strength with a high porosity and a multilayer structure have a multilayer structure force can be used. Can also be used.
  • Asymmetric structure The preferred method of the recognition method and the asymmetric structure is the same as that described in the first invention group.
  • the membrane used in the fractionation step includes a hydrophilic membrane and a hydrophobic membrane in terms of the properties of the membrane surface.
  • the hydrophilic film is obtained by copolymerizing a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer, by blending a hydrophilic polymer and a hydrophobic polymer, or by forming a hydrophobic film.
  • a hydrophilic polymer bonded to and adhered to the surface of a film made of a high molecular weight polymer, or a film obtained by chemically, plasma or radiation treating the surface of a hydrophobic high molecular weight film.
  • the hydrophilic component is not particularly limited, but is preferably a hydrophilic polymer such as polyalkylene oxide such as polyethylene glycol, polybutylpyrrolidone, polybutyl alcohol, and polyhydroxyethyl methacrylate.
  • the hydrophobic membrane is not particularly limited as long as it can be used as a membrane material.
  • the membrane include a membrane in which a hydrophobic component is mixed and a membrane in which a hydrophobic ligand is introduced.
  • the hydrophobic component include olefins such as methacrylic acid esters, acrylic acid esters, ethylene, and propylene, and addition-polymerizable compounds having a carbon-carbon double bond such as acrylonitrile, methacrylic acid-tolyl, and poly-bolylidene. Examples thereof include polymers having physical properties and polymers such as polysulfone and cellulose. .
  • a molecular fractionation ability that does not allow albumin to pass through physiological saline for example, a cutoff value of 50 kDa or less, more preferably 30 kDa or less is preferably used.
  • various chemicals can be added to the aqueous solution to be charged to improve the adsorption or fractionation performance.
  • a suitable amount of ammonium sulfate, polyethylene glycol, poetyleneimine, chaotropic salt, or the like that promotes aggregation of albumin is added to aggregate the protein of the high molecular component to promote macromolecularization.
  • a surfactant such as the amphoteric surfactant / anionic surfactant, the interaction between proteins can be suppressed, and the fractionation by molecular sieve can be performed efficiently.
  • the step of concentrating means a step of concentrating the protein in the solution.
  • concentration step not only the neutral water in the aqueous solution is removed, but also a low molecular component having a molecular weight of lkDa or less may be removed.
  • a porous membrane is used for the membrane of the flat filter or the hollow fiber module, and the membrane is concentrated by a separation sieve.
  • the membrane used in this step is different from the separation membrane used in the above-mentioned fractionation step (2).
  • the liquid permeated through the membrane is used as a desired solution, but in the concentration step (3), the liquid remaining without permeating the membrane is used. Is different in that the desired liquid is obtained.
  • the material of the separation membrane that can be used in the concentration step is not particularly limited. Lylic acid ester, polyacrylic acid ester, polyamide, polyvinylidene fluoride, polyacrylonitrile, polyester, polyurethane, polystyrene, polyethylene, polypropylene A polymer of one or the other material is used.
  • polysulfone which is often used in dialysis machines in recent years, has good fractionation characteristics (i.e., sieves! /, Among substances of different molecular weights to be separated, sieves of low molecular weight substances relative to high molecular weight substances!). /, The coefficient ratio is large).
  • a structure with a sponge structure close to a uniform structure, or a multilayer structure with a dense layer and a thick support layer provided to maintain film strength with a high porosity and asymmetric structure Any of them can be used.
  • the method of identifying the asymmetric structure and the preferred embodiment are the same as those described in the first invention group.
  • the molecular fractionation ability of a membrane that does not allow passage of the peptide in physiological saline that is, a cutoff value of 0.5 kDa or less, and further 0.015 kDa or less.
  • each step are connected by a solution flow path and can be operated continuously, so that an effect that simple and automatic continuous operation can be obtained is obtained.
  • each step can be operated independently.
  • the liquid may be sent by a syringe.
  • concentration is performed by a centrifugal tube type device without using a separation membrane, centrifugation may be performed.
  • one step is a certain force (1) a step of adsorbing a protein having a molecular weight of albumin or more, and (2) a protein having a molecular weight of albumin or more is fractionated by molecular sieve. If the step has two or more functions selected from the step of partially or entirely removing the protein and the step (3) of concentrating the protein, it is also possible to carry out the step two or more times. Included in the range.
  • the apparatus of the third group of the invention as one means, there are (1) means for adsorbing proteins having a molecular weight of at least albumin, and (2) fractionation of proteins having a molecular weight of at least albumin by molecular sieve. Means for partially or wholly removing and (3) Means for concentrating proteins. If the means has two or more functions, the scope of the present invention in which two or more of these means can be connected to the apparatus is also effective. include.
  • steps (1) and (3) can be further repeated by repeating the same steps to further increase the total protein.
  • the ratio of albumin to mass is reduced, and an excellent effect of increasing the ratio of low molecular weight proteins to be analyzed can be obtained.
  • the decision to repeat the same step or to use two different steps can be designed according to the degree of composition of the protein contained in the biological component initially supplied.
  • the power depending on the protein composition in the plasma in the case of healthy adult plasma, the power depending on the protein composition in the plasma.
  • a high molecular weight protein having a molecular weight of 50 kDa or more can be obtained.
  • the removal rate of 90% or more, the average recovery rate of proteins with a molecular weight of less than 50 kDa is 70% or more, and the average enrichment rate of proteins with a molecular weight of less than 50 kDa is 10 times or more.
  • one processing time can be made within 116 hours.
  • the present invention relates to a biological component-containing aqueous solution and a biological component-containing solution, particularly from human plasma, urine, saliva, tears, cerebrospinal fluid, ascites, pleural effusion and the like.
  • a biological component-containing aqueous solution and a biological component-containing solution particularly from human plasma, urine, saliva, tears, cerebrospinal fluid, ascites, pleural effusion and the like.
  • the size of the membrane and the hollow fiber module and the flow rate of the liquid shown in the above are appropriately determined depending on the quality and quantity of the biomaterial such as plasma or urine as a raw material.
  • the reaction is performed at a pressure of 1 to 400 mL, preferably 5 to 100 mL, and a flow rate of 11 to 20 mLZmin, preferably 2 to 10 mLZmin.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing an example of an apparatus belonging to the group of the third invention, and is an example of three steps in the order of adsorption, fractionation, and concentration.
  • the liquid flow is indicated by arrows.
  • a sample of a material such as serum, or a biological component-containing aqueous solution containing the same is passed through a pump 8 for injection and a valve 1 to be a first step module having any of the functions of adsorption, fractionation, and concentration.
  • the solution is injected into the module 5 and is pumped through the solution circulation circuit 2 which also has a tube force by the pump 3 and circulates.
  • the solution obtained in the first step is obtained in an amount of 4 treatment solutions.
  • This embodiment is a unit of one process.
  • FIG. 5 shows an example of three stages, in which the module 6 in the second step and the module 7 in the third step are connected.
  • the obtained solution is injected into the module of the next step by a tube connected to the processing liquid recovery port.
  • the outlet of the step that is, the recovery port of the treatment liquid
  • the outlet of the step in the case of the adsorption step is in the middle of the solution circulation circuit.
  • the outlet provided therein is provided.
  • the outlet in the concentration step is an outlet provided in the middle of the solution circulation circuit.
  • each circulation pump has a force provided downstream of each step.
  • the circulation pump may be provided upstream of each step.
  • the processing of each step can be performed at the same time, and the processing conventionally performed separately for a long time is performed in a short time. This comes out.
  • a separation membrane module incorporating a separation membrane is prepared, and a solution circulation circuit is formed by connecting a stock solution (human serum) side inlet and a stock solution (human serum) outlet with a tube.
  • a sampling port, a switching valve that can discard the solution without circulating it, and an inflow path that allows the solution to flow into the solution circulation circuit are also provided in the direction of the stock solution side inlet with the stock solution outlet force.
  • a pump for circulating the undiluted solution, and a sampling port are provided in order.
  • a tube is connected from the filtration side outlet of the module, and a pump for performing filtration and an outlet (sampling port) for the filtered liquid are provided in order.
  • the separation membrane module is filled with an aqueous solution of PBS (Dulbecco PBS (-) manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (hereinafter, this aqueous solution is simply referred to as “PBS”) through the inlet channel.
  • PBS Denbecco PBS
  • the human serum is filtered from the stock solution inlet at 20 ° C at a flow rate of 1 mlZmin and a flow rate of 0.2 mlZmin. Start over.
  • the undiluted solution at the module outlet is discarded without returning by switching the valve for discarding the solution in the middle of the solution circulation circuit.
  • albumin concentration in this example was performed by outsourcing to SRL, Inc., and was measured using item code 07214 (latex agglutination immunoassay). In this measurement, those whose albumin concentration was below the measurement limit of 0.4 mg / L or less were measured using the BETHYL Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Cat No E80-129). ⁇ 2-microglobulin concentration was measured by subcontracting to SRL Co., Ltd. and using item code 02103 (latex agglutination immunoassay).
  • the original biological component-containing solution and the “solution with a changed biological component composition” obtained by the method of the present invention were analyzed by two-dimensional electrophoresis.
  • the method is as follows.
  • electrophoresis buffer for SDS-PAGE (hereinafter referred to as electrophoresis buffer) was composed of 3.0 g of Tris, 14.4 g of glycine, and 1000 ml of distilled water added to 1.0 g of SDS.
  • step 13 Transfer the gel piece from step 9 to the second dimension SDS-PAGEmini well, taking care not to introduce air bubbles.
  • the small pail is lubricated with a rainbow marker (Amersham), a commercially available molecular weight marker.
  • the discharged membrane-forming solution passes through a distance of 350 mm from the spinneret to the liquid surface of the coagulation bath, and is led to a coagulation bath of 100% water, and the hollow fiber membrane was gotten.
  • the structure of the obtained hollow fiber membrane was confirmed with an electron microscope (S800, manufactured by Hitachi, Ltd.), it had an asymmetric structure.
  • 10,000 hollow fiber membranes obtained were inserted into a cylindrical plastic case having a dialysate inlet and a dialysate outlet in the same manner as a general dialyzer, and both ends were sealed with resin to obtain an effective membrane area. 1.
  • a 6 m2 hollow fiber membrane module was made. After the hollow fiber membrane module was washed with water, the module was filled with water and irradiated with ⁇ -rays in a state of being filled. The gamma ray absorbed dose of the module was 27 kGy.
  • the hollow fiber membranes of the module were cut out, 100 were bundled, and both ends were fixed to the glass tube module case with an epoxy potting agent so that the hollow portion of the hollow fiber membrane was not closed. Created.
  • the mini-module has an outer diameter of about 7 mm and an overall length of about 17 cm, and has two hollow fiber outer ports similar to a general hollow fiber membrane dialyzer.
  • the hollow fiber membrane of the mini-module and the inside of the module were washed with distilled water.
  • mini-module (1) a hollow fiber membrane mini-module (hereinafter abbreviated as mini-module (1)). Two mini-modules were prepared, and one of them was used to measure the permeation ratio of the separation membrane, which was 70.5. The remaining one was used for the following experiment.
  • Human serum (SIGMA H1388, Lot 28H8550) was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to remove precipitates, and then subjected to a 0.45 ⁇ m filter treatment.
  • One of the ports on the outside of the mini-module (1) was capped, and the other was connected with a silicone tube and connected to a peristaltic peristaltic pump.
  • the stock solution inlet and the stock solution outlet were connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and serum could be circulated using a peristaltic pump.
  • an inlet for introducing additional PBS was provided in the middle of the solution circulation circuit.
  • the total protein in the solution was measured using Micro BCA Protein Assay (manufactured by PIERCE), and the calibration curve was measured using BSA.
  • the total protein concentration in the filtrate was 275 mgZl, and the albumin concentration relative to the total protein concentration was 0.22. Further, the concentration of ⁇ 2-microglobulin relative to the total protein was 0.000024 in human serum and 0.000024 in the filtrate, indicating a 10.8-fold increase in calories.
  • the discharged membrane-forming solution passed through a distance of 350 mm from the spinneret to the liquid surface of the coagulating bath, and was guided to a coagulating bath of 100% water, and a hollow fiber membrane was obtained.
  • a hollow fiber membrane was obtained.
  • an electron microscope S800, manufactured by Hitachi, Ltd.
  • 10,000 hollow fiber membranes obtained were inserted into a cylindrical plastic case having a dialysate inlet and a dialysate outlet in the same manner as a general dialyzer, and both ends were sealed with resin to obtain an effective membrane area. 1.
  • a 6 m2 hollow fiber membrane module was made.
  • aqueous solution containing 0.1% by weight of polyethyleneimine (a weight-average molecular weight of 100,000, manufactured by BASF) as a cationic hydrophilic polymer is filled into the hollow fiber membrane module inside and outside the hollow fiber membrane module. did. Thereafter, the module was irradiated with gamma rays. The ⁇ -ray absorption dose of the module was 27 kGy.
  • the hollow fiber membranes of the module were cut out, bundled into 100 pieces, and both ends were fixed to a glass tube module case with an epoxy potting agent so as not to close the hollow portion of the hollow fiber membrane, thereby producing a mini-module.
  • the mini-module has an outer diameter of about 7 mm and an overall length of about 17 cm, and has two ports outside the hollow fiber like a general hollow fiber membrane type dialyzer.
  • the hollow fiber membrane and the inside of the module were washed with distilled water. So Thereafter, an aqueous solution of PBS (Dulbecco PBS (-) manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was filled to obtain a fixed module; a hollow fiber membrane mini-module (hereinafter abbreviated as mini-module (2)). Two mini-modules were prepared, and one of them was used to measure the permeation ratio of the separation membrane. The remaining mini-modules were used for the following experiments.
  • mini-module (1) the same hollow fiber membrane mini-module (mini-module (1)) as in Example 1 was prepared, one of the outer ports of the hollow fiber was capped, and the other was connected to a silicone tube.
  • the inlet and outlet of the stock solution were connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and a peristaltic pump was provided on the way to allow the stock solution to circulate.
  • a three-way valve was provided in the middle of the solution circulation circuit, and an injection pump was provided on one side via a tube.
  • the mini-module (2) also capped one of the outer ports and connected a silicone tube to the other.
  • This mini-module also has a solution circulation circuit for the liquid inside the hollow fiber membrane by connecting the inlet and outlet of the undiluted solution, and a bellister pump is provided on the way to allow the solution to circulate.
  • a three-way valve was provided in the middle of the solution circulation circuit.
  • the silicone tube connected to the port on the outside of the mini-module (1) was joined to a three-way valve provided in the middle of the solution circulation circuit of the mini-module (2). Then, PBS was filled into these tubes and the two modules, and a system was constructed in which two mini modules were connected in series as shown in Fig. 2.
  • the mini-module (1) is used to fractionate proteins with a molecular weight higher than albumin
  • the mini-module (2) is used to adsorb proteins with a molecular weight higher than albumin and the molecular weight higher than albumin. This corresponds to a step having both functions of fractionating a protein.
  • Serum is injected through a tube through an injection pump, and the mini-module (1) and the mini-module (2) are circulated at a flow rate of 5 mlZmin and a filtration flow of 0.2 mlLZmin at 20 ° C in each of the miniature module (1) and minimodule (2). Filtration was performed for 4 hours. At this time, PBS in an amount equal to the volume of the filtered solution was added through an injection pump to keep the circulating liquid amount constant.
  • the filtrate obtained from module (2) that is, the solution in which the composition of the biological component has changed, has an albumin concentration of 0.62 mgZL, a1 microglobulin concentration of 0.036 mg / L, and j82 microglobulin The concentration was 0.05 mg ZL.
  • the total protein concentration in the human serum used was 53000 mg / l, albumin concentration was 33000 mg / l, a1 microglobulin concentration was 16.5 mgZl, and j82 microglobulin concentration was 1.17 mgZl, indicating significant increase in albumin concentration. Significant decrease was observed.
  • the total protein concentration in the filtrate was 8.1 mgZl, and the ratio of albumin concentration to total protein concentration was 0.08.
  • the concentration of j82 microglobulin relative to the total protein was 0.000723 in the filtrate compared to 0.000223 in human serum, and the calorie increased 277 times.
  • FIG. 7 shows the result of analyzing this sample by two-dimensional electrophoresis.
  • FIG. 7 is a two-dimensional electrophoresis photograph of the concentrated solution obtained using 3000 ⁇ l of the solution in which the composition of the biological component was changed, obtained in Example 2. As can be seen from Fig. 7, there are many independent spots at locations with a molecular weight of less than 60,000. The sample separated by this device was able to obtain many spots in the low molecular weight region.
  • FIG. 8 is a two-dimensional electrophoresis photograph using 0.5 ⁇ l of human serum before treatment in Example 2.
  • the spots are broad, the substance cannot be identified, and spots in the low molecular weight region are hardly observed.
  • a resin adhesive portion at both ends of a dialyzer BS1.8L (Lot. 20440312) manufactured by Toray Industries, Inc. was cut to obtain a hollow fiber membrane.
  • the dimensions of the obtained hollow fiber membrane were 200 m in inner diameter and 40 m in film thickness.
  • the inner diameter of the mini-module is about 5 mm and the length is about 17 cm.
  • two ports (blood port) inside the hollow fiber membrane and two ports outside (dialysis fluid) are used. Po Have two).
  • the hollow fiber membrane of the mini-module and the inside of the module were washed with distilled water.
  • mini-module (3) a hollow fiber membrane mini-module (hereinafter abbreviated as mini-module (3)). Two mini-modules were prepared, and the permeation ratio of the separation membrane was measured using one of them, and it was 149. The remaining one was used for the following experiment.
  • Human serum (SIGMA H1388, Lot 122K0424) was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to remove precipitates, and then filtered at 0.45 ⁇ m.
  • the lower port 106 of the module was capped, and the upper port was the processing liquid recovery port 104 of the membrane separation unit.
  • the liquid inside the hollow fiber membrane was connected to a stock solution inlet and outlet with a silicone tube to form a solution circulation circuit 102, and a circulation pump 103 as a peristal pump was provided on the way to enable serum to circulate.
  • a three-way valve 101 was provided in the middle of the solution circulation circuit 102, and an injection pump was installed on one side of the three-way valve 101.
  • the total protein concentration in human serum was 48000 mg / l, albumin concentration was 29800 mg / L, a1 microglobulin concentration was 13.2 mgZL, and j82 microglobulin concentration was 1.27 mgZL.
  • Human serum used as stock solution total protein mass used 192,000 / zg, anolebumin amount 119000 g, a1-microglobulin 52.8 / zg, j82 microglobulin amount 5.08 / zg
  • the total amount of protein in the filtrate was 56000 ⁇ g
  • the amount of albumin was 1640 g
  • j82-microglobulin was 3.40 / zg
  • the amount of j82-microglobulin Albumin was significantly removed while maintaining the globulin level.
  • composition ratio of albumin to the total protein concentration was 0.15.
  • composition ratio of ⁇ 2 -microglobulin to the total protein was 0.00000265 in human serum, but 0 in the filtrate. 00613, which was 23 times more calorie.
  • mini-module Using the hollow fiber membrane (permeation ratio: 149) obtained in Example 3, one mini-module was prepared.
  • the shape of the mini-module and the number of hollow fiber membranes are the same as in Example 3.
  • This mini-module is hereinafter referred to as mini-module (4).
  • 40 hollow fiber membranes (permeation ratio: 149) obtained in Example 3 were fixed in a glass tube module case having an inner diameter of about 5 mm and a length of about 12 cm. 5) was created in the same manner as in Example 1. These mini-modules were used in the following experiments.
  • one mini module (4) was prepared, one of the outer ports was capped, and the other was connected with a silicone tube.
  • the stock solution inlet and outlet were connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and a peristaltic pump was provided in the circuit to allow the solution to circulate.
  • a three-way valve was provided in the middle of the solution circulation circuit, and an injection pump was attached in one direction of the three-way valve. This was used as the first-stage membrane separation unit.
  • one of the mini-modules (5) was capped on one of the outer ports and connected to a silicone tube on the other.
  • a liquid circulation circuit is established by connecting the undiluted solution inlet and outlet of the module with a silicone tube so that a peristaltic pump can be installed in the circuit to circulate the solution. did. Further, a three-way valve was provided in the solution circulation circuit. This was used as the second-stage membrane separation unit. In addition, one of the outer ports of the other mini-module (5) was capped, and one of the remaining ports was connected to a silicone tube.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the separation system used in this example.
  • the liquid flow is indicated by arrows.
  • Serum and diluent (PBS) enter the solution circulation circuit 102 from the infusion pump 100 via the three-way valve 101, and are further sent by the circulation circulation pump 103.
  • the first separation membrane module 105 mini module ( 4) is injected into) and circulates through the solution circulation circuit 102.
  • the solution obtained in the first membrane separation unit is taken out from the processing liquid recovery port 104 of the membrane separation unit.
  • this solution flows into the second-stage separation membrane unit, is injected into the second-stage separation membrane module 205 (the first mini-module (5)), and is further supplied to the second-stage solution circulation circuit 202. Circulated by the second stage circulation pump 203.
  • the solution that has passed through the second-stage separation membrane module 205 of the second membrane separation unit is taken out of the processing liquid recovery port 204. Further, this solution flows into the third separation membrane unit, is injected into the third separation membrane module 304 (second mini-module (5)), and circulates. The solution that has passed through the third separation membrane module is obtained from the treatment liquid recovery port 304.
  • the albumin concentration was 0.38 mgZl and the ⁇ 2-microglobulin concentration was 0.583 mgZL.
  • the total protein concentration was 49,000 mg / l, albumin concentration was 31200 mg / l, and ⁇ 2-microglobulin concentration was 1.19 mgZL.
  • the total protein concentration of human serum used as a stock solution is 19600 0 mu g, albumin weight 124800 ⁇ ⁇ , ⁇ 2- microglobulin amount whereas was 4. 76 mu g, total protein of the filtrate 100 g, albumin content 1.5 g, j82-microglobulin content is 2.3 g.
  • the composition ratio of albumin to the total protein concentration was 0.02.
  • the concentration of j82-microglobulin relative to the total protein was 0.000724 in human serum, 0.0307 in the base solution, and increased by 1263 times.
  • the sample was concentrated using a Sartorius vivaspin500 (3000 MWCO type) until the sample volume reached 1Z10, and the sample buffer (0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 0.5 ml, glycerol 0.4 m, 0.8 ml of 10% SDS, 0.1 ml of 0.1% bromophenol blue, 0.1 ml of distilled water were added to make 10 ml), and 25 1 of the solution heated in boiling water for 3 minutes was added. Analysis was performed by electrophoresis. The results are shown in S3 lane in FIG.
  • the module strength of the hollow fiber membrane prepared in Example 1 was cut out before irradiation with ⁇ -rays, and 100 hollow fiber membranes were prepared. It was dried for 24 hours under an atmosphere of 50 ° C and a relative humidity of 13%.
  • This hollow fiber membrane was fixed at both ends to a glass tube module case with an epoxy potting agent in the same manner as in Example 4 to produce a mini-module.
  • the hollow fiber membrane of the mini-module and the inside of the module were washed with distilled water. Thereafter, an aqueous solution of PBS (Dulbecco PBS (-) manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was filled to obtain a hollow fiber membrane mini-module for concentration (hereinafter, referred to as mini-module (6)).
  • PBS Dulbecco PBS (-) manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • one of the ports on the outside of the mini module (6) is capped, and the other is filtrate.
  • the stock solution inlet and outlet are connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and the stock solution can be circulated using a peristaltic pump.
  • a three-way valve was provided in the middle of the solution circulation circuit. This was used as a concentration membrane unit.
  • a separation system having a three-stage membrane separation unit used in Example 4 was newly created.
  • the processing liquid recovery port of the third stage mini-module and the three-way knob of the concentration membrane unit were joined with a silicone tube.
  • a processing liquid recovery port of the concentration unit which also has a three-way valve, so that only the solution circulation circuit is opened during the concentration operation.
  • the entire system was filled with PBS, and a combined system was created in which a membrane separation unit for separating proteins above albumin by molecular sieve and a unit for concentrating proteins were directly connected.
  • FIG. 4 is a schematic diagram (an example of a membrane separation unit and a concentration unit) of the separation system used in the fifth embodiment.
  • the liquid flow is indicated by arrows.
  • Serum and diluent (PBS) are injected into the solution circulation circuit 102 via the injection pump 100 and the three-way valve 101, and further sent by the circulation pump 103, and the first separation membrane module 105 (mini module ( 4) Injected in (1) and circulates through the solution circulation circuit 102.
  • the solution treated in the first membrane separation unit is obtained from the treatment liquid recovery port 104 of the membrane separation membrane unit.
  • this solution is injected into the second separation module 205 (the first mini-module (5)), and circulates in the second-stage circulation circuit 202.
  • the solution treated in the second membrane separation unit is obtained from the treatment liquid recovery port 204 of the second stage membrane separation unit. Further, this solution is injected into the third separation membrane module 305 (second mini-module (5)), and circulates through the third-stage solution circulation circuit 302. The liquid processed by the third membrane separation unit is obtained from the processing liquid recovery port 304. Further, this processing solution is injected into the concentration membrane module 405 (mini-module (6)) and circulates through the concentration unit circulation circuit 402. At this time, the liquid that has passed through the condensing membrane module is taken out from the filtrate outlet 404 of the condensing unit and discarded. After the operation of permeation and concentration is completed, the solution remaining in the circulation circuit 402 of the concentration membrane module is taken out by opening the treatment liquid recovery port 407 of the concentration unit.
  • the specific conditions are as follows. 1 ml of serum at 0.2 ml Zmin for first stage membrane separation After adding to the units, the first, second, and third membrane separation units flow through each solution circulation circuit at a flow rate of 5.OmLZmin. Filtration was performed at a flow rate of 0.2 mL Zmin at 20 ° C for 4 hours. At this time, the filtered volume of PBS was added at 0.2 mlZmin from the injection pump 100 to keep the amount of liquid circulating in each separation tube and the concentration unit constant.
  • the solution taken out from the valve 407 had an albumin concentration of 0.490 mg Zl, a j82 2-microglobulin concentration of 0.502 mg ZL, and a total protein concentration of human serum used as a stock solution of 49,000 mg. / l, albumin concentration was 31200 mg / L, and 2-microglobulin concentration was 1.19 mg ZL.
  • Tsutano der 76 mu g, filtrate is 3.
  • the amount of albumin 1 The amount of 81 g and ⁇ 2-microglobulin was 1.86 g, and albumin was significantly removed while maintaining the amount of j82-microglobulin. From these results, the composition ratio of albumin to the total protein concentration was 0.0297. The concentration of j82-microglobulin relative to the total protein was 0.003043 in human serum, 0.0304 in the control solution, and increased by 1253 times.
  • the albumin concentration was 5755mgZl, the j82-microglobulin concentration was 0.534mgZl, the albumin concentration in the human serum used as the stock solution was 128.5mgZl, and the j822-microglobulin concentration was 0.446mgZl.
  • the human serum used as the stock solution had an albumin content of 27049 g and a ⁇ 2-microglobulin amount of 2.51 ⁇ g, whereas the filtrate had an albumin amount of 578 Ug and a ⁇ 2-microglobulin amount of 2. 01 ⁇ g.
  • ⁇ 2-microglobulin, anolevumin and transmission ratio (here, the transmittance is the value obtained by dividing the concentration of the filtrate by the concentration of the stock solution, and the transmission ratio is the value obtained by dividing the transmittance of ⁇ 2-microglobulin by the transmittance of albumin. ) was as low as 40.
  • the composition ratio of albumin was as high as 0.32.
  • Example 6 A composite system similar to that of Example 5 was created except that the hollow fiber membrane used in the mini-module (2) of Example 2 was used instead of the hollow fiber membrane built in the mini-module (6) of Example 5. .
  • the amount of j82-microglobulin was 2.0 ⁇ g, and albumin could be significantly removed while maintaining the amount of ⁇ 2-microglobulin. From these results, the composition ratio of albumin to the total protein concentration was 0.02. Also, the concentration of j82-microglobulin relative to the total protein was 0.00343 in human serum, 0.0343 in the filtrate, and increased by 1414 times.
  • the method or the adjusting device of the present invention it is possible to obtain a solution containing a biological component with improved analysis accuracy, and this solution is suitable as a sample for drug research and proteome analysis in clinical settings.

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Abstract

　本発明は、質量分析、電気泳動、液体クロマトグラフィー等を使用する臨床プロテオーム解析に好適な生体成分含有溶液の調整方法およびそのための装置である。本発明では、(1)分子量がアルブミン以上のタンパク質を吸着する工程、(2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を分画する工程および(3) タンパク質を濃縮する工程のうち２工程を組み合わせて溶液を調整する方法、また分子量１．５万未満のタンパク質と分子量６万以上のタンパク質との透過比率が５０以上である膜分離ユニットを用いて分離することによって溶液を調整する方法、また分離膜モジュールに対して、生体成分原液を流入した後に希釈液を流入させて、液を循環させつつ、液の一部を分離膜を通じて透過させることにより調整する方法である。

Description

明 細 書
生体成分の組成が変化した溶液の調整方法
技術分野
[0001] 本発明は生体成分含有溶液、特にヒトの血漿、尿等からタンパク質などの生体分子 を分離して、生体成分の組成が変化した溶液の調製方法および調製装置に関する。 特に、臨床プロテオーム解析を目的とし、微量成分の検出に対して妨害する成分、 特に高分子量のタンパク質を除去し、生体成分の組成を変化させた溶液を調製する 方法および装置に関する。
背景技術
[0002] 近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究 (プロテオミタス）が注目され 始めた。遺伝子産物であるタンパク質は遺伝子よりも疾患の病態に直接リンクしてい ると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果 は診断と治療に広く応用できると期待されている。し力も、ゲノム解析では発見できな かった病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高い。
[0003] プロテオーム解析の急速に進展しだしたのは、技術的には質量分析装置 (mass spectrometer: MS)による高速構造分析が可能となってきたことが大きぐ
MALDI-TOF-Mb (.matrix assisted laser desorption ionization time— of— flignt mass spectrometry)等の実用化によって、ポリペプチドのハイスルースループット超微量分 祈が可能となり、従来検出し得な力つた微量タンパク質までが同定可能となり、疾患 関連因子の探索に強力なツールとなってきている。
[0004] プロテオーム解析の臨床応用の第一目的は、疾患によって誘導あるいは消失する バイオマーカータンパク質の発見である。バイオマーカーは、病態に関連して挙動す るため、診断のマーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわ ち、プロテオーム解析の成果は、特定遺伝子よりも診断マーカーや創薬ターゲットと なる可能性が高いため、ポストゲノム時代の診断と治療の切り札技術となり、同定され たバイオマーカーは患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測という直接的に患者 が享受しえる利益につながることから、 V、わゆるテーラーメード医療の推進に大きな 役割を果たすといえる。
[0005] 臨床研究にプロテオーム解析を導入する場合には、大量の検体を迅速、確実に解 析することが求められており、し力も臨床検体は微量で貴重なために高分解能 ·高感 度 ·高機能測定を迅速に行う必要がある。この大きな推進力となったのは質量分析 (mass spectrometry)であり、質量分析装置のもつ超高感度でハイスループットの特性 の貢献するところが大きい。しかしながら、その手法や機器が急速に改良されてきて はいるものの、プロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に実施できる状況には 、まだない。
[0006] その原因のひとつに臨床検体の前処理が挙げられる。質量分析にかける前の処理 として臨床検体のタンパク質を分画し精製することが必要で、この処理にはまだ数日 かかるのが実態であり、さらに前処理の操作が煩雑で経験も必要とされることが、臨 床への応用の大きな障害となって!/、る。少量の血液や体液から全身の疾患の診断や 病態管理ができれば、その有用性は極めて大きいが、血漿中に含まれるタンパク質 の多様性のために、多くの課題を生じている。
[0007] ヒト 'タンパク質は 10万種以上とも推定されている力 血清中に含まれるタンパク質 だけでも約 1万種類にものぼるといわれ、総量としての血清中濃度は約 60— 8 Omg/mLである。ヒト血清中の高含量のタンパク質は、アルブミン (分子量 66kDa)、免 疫グロブリン (150— 190kDa)、トランスフェリン (80kDa)、ハプトグロビン (〉85kDa)、リポタ ンパク質 (数 lOOkDa)等であり、いずれも lmg/mLを超える程度に大量に存在する。一 方、病態のバイオマーカーや病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、イン ターロイキン、サイト力イン等の生理活性タンパク質の多くは、 Ing/mL未満という極微 量にしか存在せず。その含有量比は高分子の高含量成分に比べて、実に nanoから picoレベルである。タンパク質の大きさという点では、タンパク質全種類の 70%以下は 分子量 6万（60kDa)以下であり、上記の極微量なバイオマーカータンパク質はいず れもこの領域に含まれる場合がほとんどである (例えば非特許文献 1)。これらのタンパ ク質は腎臓を通過して尿中に一部排泄されるため、血液のみならず尿を検体として 測定することも可能である。
[0008] 一般的な血清学的検査でプロテオーム解析するには、病因関連の微量成分検出 の妨害となる分子量 6万以上の高分子成分を除外し、分子量 1. 5万未満のタンパク 質をできるだけ回収することがまず必須となる。
[0009] この高分子量タンパク質の分離'除去手段として、現状では高速液体クロマトグラフ ィー (liquid chromatography: LC)や二次元電気泳動
(2 dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis: 2D— PALrE) »用 ヽりれて ヽ 力 、 LCや 2D- PAGEの作業だけでも 1一 2日を要している。この所要時間は、
MALDト TOF— MSや ESト MS (electrospray ionization mass spectrometry)等の数分と いう分析時間に比べて非常に長ぐ分析手段である MSのもつハイスループットという 大きな利点が臨床プロテオーム解析では十分発揮できずにいる。このため、医療現 場で診断や治療のためにできるだけ短時間に分析結果がほしいという目的には、現 時点では実用性に乏しいといわざるを得ず、日常の臨床検査に MSが利用しにくいひ とつの大きな原因になって 、る。
[0010] そこで、試料力も一部または全部の高分子量タンパク質を除去する手段の高速ィ匕 が達成されると、臨床プロテオーム解析による臨床検査の診断の迅速性は飛躍的に 向上すると期待できる。具体的には、 LCや 2D- PAGEの代替となるような、微量の検 体で高速に目的タンパク質群残すかたちで生体成分の組成が変化した生体成分含 有溶液を得る方法や装置があればょ ヽ。
[0011] アルブミンを主な対象物質として除去する手段として、すでに実用化されている製 品あるいは開示されている技術としては、ブルー色素などのァフィユティーリガンドを 固定化した担体 (製品化されている。）、高分子量成分を遠心分離ろ過によって分画 する遠心管形式の装置 (製品化されている。）、電気泳動原理によって分画する方法 、 Cohnのエタノール沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画す る方法 (例えば非特許文献 2)などがある。
[0012] し力しこれらは、いずれも分離性能が十分ではな力つたり、微量試料には不適当で あったり、あるいは質量分析等に障害となる薬剤が混入したりするなどの問題点があ る。特に、アルブミンをターゲットとして吸着だけで除外する方法は、アルブミンは除 去できても免疫グロブリンなどの他の 6万以上の高分子成分を除去する事は困難で める。 [0013] また、人工腎臓、人工肺、血漿分離装置などに使用されている分離膜はその用途 に応じて様々な大きさのものが開発され、生体成分との適合性を向上させるような改 善もされているが (特許文献 2)、アルブミンなどの高分子量タンパク質を高効率にて 取り除くと 、う臨床プロテオームが抱えて 、る課題の解決を示唆するものはな 、。
[0014] これらを解決する方法や装置が開発できれば、医学研究ならびに臨床現場でプロ テオーム解析が広く行われるようになり、より迅速で高精度な検査や診断が可能とな つて、有用な治療法がない難治性の疾患の原因究明や早期の診断法の開発には強 力なツールとなると期待できる。
[0015] 上述のとおり、臨床プロテオーム解析をする際に、妨害となる過剰な高分子量のタ ンパク質を除去することが必要である。 2D-PAGEや液体クロマトグラフィーなどの高 分離能ではあるが、煩雑で時間がかかる手法よりも、簡便で短時間に高い分離能を 有するデバイスが求められて ヽる。
[0016] 最近でも、 Affi-Gel Blueゲルを用いた方法や（非特許文献 3) "Gradiflow"システムを 用いた方法 (非特許文献 4)などが有効な改良されたアルブミン除去法として発表さ れてはいる力 より多くの情報を得るための分析用溶液には至っていない。
[0017] 血漿中力 のアルブミンの除去を指標として、求められる手法の条件としては、血漿 成分を高速で流せること、タンパク質変性作用がないこと、高機能化のための微細加 ェがされていること、著しく高価でないこと等である。これらの課題を解決する装置や デバイスは、まだ見当っていない。
非特許文献 1：アンダーソン 'NL(Anderson NL),アンダーソン 'NG( Anderson NG)著 , 「ザ ·ヒューマン'プラズマ ·プロテオーム：ヒストリ^ ~ ·キャラクタ^ ~ ·アンド'ダイァグノス アイツク'ブロスへクッ (The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)」，モレキュラー ·アンド ·セノレラー ·プロテオミクス (Molecular & Cellular Proteomics), (米国），ザ'アメリカン 'ソサエティ一'フォ一'バイオケミストリー 'アンド'モレキュラー 'バイオロジー 'インコーポレーテッド (The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2002年，第 1卷， p845- 867.
非特許文献 2 :日本生化学会編， 「新生化学実験講座 (第 1卷)タンパク質 (1)分離，精 製，性質」，東京化学同人， 1990年 非特許文献 3 :細胞工学別冊， 「バイオ実験イラストレイテッド 5」，秀潤社， 2001年 非特許文献 4 : N. Ahmed et al, Proteomics, On- line版， 2003年 06月 23日
非特許文献 5 : D.し Rothemundら. (2003), Proteomics,第 3卷， 279- 287頁） 特許文献 1 :日本国、特表 2002 - 542163号公報
特許文献 2 :日本国、特許 3297707号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 上記のような事情から、本発明が解決しょうとする課題は、臨床プロテオーム解析を する際に妨害となる余分な高分子量のタンパク質を生体成分含有溶液から有利に分 離'除去し、プロテオーム分析に好適な、生体成分の組成が変化した生体成分含有 溶液を調製する方法および装置を提供することである。
課題を解決するための手段
[0019] 本発明のうち、第 1の発明のグループとしては、以下の発明からなる。
1.生体成分含有溶液を、少なくとも β 2—ミクログロブリンとアルブミンの透過比率が 5 0以上である分離膜に供給し、分離膜により透過させることを特徴とする、総タンパク 質に対するアルブミンの濃度組成比が 0. 3未満である生体成分の組成が変化した 溶液の調製方法、
2.前記分離膜の透過比率が 70以上であることを特徴とする前記の溶液の調製方法
3.前記濃度組成比が 0. 1未満であることを特徴とする前記いずれかの溶液の調製 方法、
4.生体成分含有溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロブリンの組成比率に対する 、生体成分の組成が変化した溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロブリンの組成 比率が、 10倍以上であることを特徴とする前記いずれかの溶液の調製方法、
5.前記倍率が 100倍以上であることを特徴とする前記の溶液の調製方法、
6.分離膜の膜内の流路が非対称構造である前記!/、ずれかの溶液の調製方法、
7.生体成分が血液、血漿、血清などの血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄 液、胸水もしくは細胞力もタンパク質を抽出した溶液であることを特徴とする前記 ヽず れかの溶液の調製方法、
8.前記 、ずれかの調整方法によって得られたプロテオーム解析用溶液、
9.前記いずれかの方法によって生体成分の組成が変化した溶液を調製した後、前 記溶液に含まれるタンパク質を分析することを特徴とする、生体成分に含まれるタン パク質の分析方法、
10.タンパク質の分析手段が質量分析、電気泳動分析および液体クロマトグラフィー 力も選ばれる少なくとも 1種である請求項 9記載のタンパク質の分析方法、
11. β 2—ミクログロブリンとアルブミンの透過比率が 50以上である分離膜を内蔵する モジュールを有する装置であって、モジュールが分離膜の原液側に生体成分含有 溶液の原液入口、および分離膜により透過した透過液の出口を少なくとも有すること を特徴とする、生体成分の組成が変化したプロテオーム解析用の溶液を調製する装 置。
また本発明のうち、第 2の発明のグループとしては、以下の発明からなる。
1.分離膜を内蔵し、前記分離膜の原液側流路に連結された原液入口および原液出 口、ならびに分離膜の透過液の出口を有するモジュール、
前記原液入口と前記原液出口とを連結し、途中にポンプおよび分離用対象液入口 を有する溶液循環回路、ならびに
前記分離用対象液入口の上流の位置に、または前記溶液循環回路の途中の位置 に、設けられた希釈液流入口、
を具備することを特徴とする生体成分の組成が変化した溶液を調製するための液流 回路、
2.前記液流回路を少なくとも 2個含み、 1の液流回路の分離対象液出口と他の 1の 液流回路の分離対象液入口が液流路で直接または間接に連結されて 、ることを特 徴とする生体成分の組成が変化した溶液を調製するための装置、
3.分離膜を内蔵するモジュールを用い、分離膜の原液側に生体成分含有溶液を流 入させ、原液側の液をモジュールの外に設けられた溶液循環回路を通じて循環させ 、分離膜を透過した液を生体成分の組成が変化した溶液として取り出す工程であつ て、生体成分含有溶液の流入開始後、生体成分含有溶液への希釈液を、モジユー ルに内蔵した分離膜の原液側に追加流入させることを特徴とする、生体成分の組成 が変化した溶液の調製方法、
4.分離膜の原液側に流入する生体成分含有溶液の流量 Ql、透過した液の流量 Q 2が、 0<Q2ZQ1< 1を満たす条件で分離されることを特徴とする前記の溶液の調 製方法、
5. Q2ZQ1力 s、 0. 005≤Q2/Q1≤0. 5である前記の溶液の調製方法、
6.透過した液の流量 Q2と分離膜の原液側に流入する生体成分含有溶液および希 釈液の流量の和 Q3が 0. 5≤Q2/Q3≤1. 5を満たすものである前記いずれかに記 載の溶液の調整方法、
7. Q2ZQ3がおよそ 1である前記の溶液の調製方法、
8.希釈液に、生理食塩水または緩衝溶液を用いることを特徴とする請求項前記いず れかの載の溶液の調整方法、
9.生体成分が血液、血清などの血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸 水もしくは細胞カゝらタンパク質を抽出した溶液であることを特徴とする前記いずれか の溶液の調製方法、
10. 2個のモジュールを用い、第 1のモジュールで前記いずれかの調製方法で得ら れた溶液を用い、さらに第 2のモジュールで前記 、ずれかの調製方法を行うことを特 徴とする生体成分の組成が変化した溶液の調製方法。
さらに、本発明のうち、第 3の発明のグループとしては、以下の発明からなる。
1.生体成分含有溶液を少なくとも 2工程の処理を行うことによって、生体成分含有溶 液から生体成分の組成が変化した溶液を調製する方法であって、前記工程が
(1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を吸着する工程、
(2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を分子篩いにより分画し、一部または全部を 除去する工程および
(3)タンパク質を濃縮する工程
カゝら選ばれる少なくとも 2工程を連結して用いることを特徴する生体成分カゝら組成が 変化した溶液を調製する方法、
2.前記 (1)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスル ホン、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ -リデ ン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンおよび ポリプロピレン、力もなる群より 1種類以上選択される素材を含む材料を用いることを 特徴とする前記の溶液の調製方法、
3.前記 (2)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスル ホン、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ -リデ ン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群よ り 1種類以上選択される素材を含む分離膜を用いることを特徴とする前記いずれかに 記載の溶液の調製方法、
4.前記 (3)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスル ホン、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ -リデ ン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群より 1種類以上 選択される素材を含む分離膜を用いることを特徴とする前記いずれかに記載の溶液 の調製方法、
5.ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、ポリフエノール、ブルー色素、 2価金属ィ オンおよびアルキル基含有化合物からなる群より 1種類以上選択される物質が表面 に固定された素材を (1)の工程または (2)の工程に用 、る前記！/、ずれかに記載溶液の 調製方法、
6.界面活性剤、乳化剤、有機溶媒、アルコール、エチレンダルコール、ポリプロピレ ングリコール、ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、硫酸プロタミン、硫酸アンモ- ゥム、ポリフエノール、ブルー色素、カオトロピック塩およびアルキル基含有化合物か らなる群より 1種類以上選択される物質を (1)の工程または (2)の工程における水溶液 に添加することを特徴とする前記いずれかに記載の溶液の調製方法、
7.生体成分含有溶液がヒト由来成分の検体を含むことを特徴とする前記いずれかに 記載の溶液の調製方法、
8. (1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を吸着する手段、（2) 分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を分子篩いにより分画する 手段および (3)タンパク質を濃縮する手段力 選ばれる少なくとも 2種の手段を有し、 前記選ばれた手段同士が流路によって連結されていることを特徴とする生体成分含 有溶液から組成が変化した溶液を調製する装置、
9.液体クロマトグラフ、電気泳動装置または質量分析装置に連結できる液流出路を 有する請求項 29の溶液を調製する装置。
発明の効果
[0022] これらの発明に開示された方法または装置により、血液、血清、血漿をはじめとする 生体成分から、従来検出が困難であった微量のタンパク質を数多く検出できる溶液 を、短期間で調製することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明の実施例 1, 3で用いた分離システムの概略図である。（膜分離ユニット が 1個）
[図 2]本発明の実施例 2で用いた分離システムの概念図である。（膜分離ユニットが 2 個）
[図 3]本発明の実施例 4で用いた分離システムの概略図である。（膜分離ユニットが 3 個）
[図 4]本発明の実施例 5, 6で用いたシステムの概略図である。（膜分離機能と吸着機 能とを有するユニットが 3個、濃縮ユニットが 1個の例）
[図 5]第 3の発明のグループに属する装置の一例を示す概念図である。
[図 6]生体成分の組成が変化した溶液の電気泳動写真である。
[図 7]実施例 2で得られた生体成分の組成が変化した溶液の 2次元電気泳動写真で める。
[図 8]ヒト血清溶液の 2次元電気泳動写真である。
符号の説明
[0024] 1 バルブ
2 溶液循環回路
3 循環用ポンプ
4 処理液回収口
5 第 1工程モジユーノレ 6 第 2工程モジユーノレ
7 第 3工程モジユーノレ
8 注入用ポンプ
100 注入用ポンプ
101 三方バルブ
102 溶液循環回路
103 循環用ポンプ
104 膜分離ユニット処理液回収口
105 分離膜モジュール
106 モジユーノレの下部ポート
202 2段目溶液循環回路
203 2段目循環用ポンプ
204 2段目の膜分離ユニットの処理液回収口 205 第 2分離膜モジュール
206 2段目のモジュールの下部ポート
302 3段目溶液循環回路
303 3段目循環ポンプ
304 3段目の膜分離ユニットの処理液回収口 305 第 3分離膜モジュール
306 3段目のモジュールの下部ポート
402 濃縮ユニット溶液循環回路
403 濃縮ユニット循環ポンプ
404 濃縮ユニットの濾液出口
405 濃縮膜モジュール
406 濃縮用モジュールの下部ポート
407 濃縮ユニットの処理液回収口
発明を実施するための最良の形態
まず本発明に共通した部分にっ 、て説明する。 [0026] 本発明で ヽぅ本発明で言う [生体成分の組成が変化した溶液]とは、血液などの生 体由来の溶液すなわち生体成分含有溶液を原液として特定の処理を行いタンパク 質の組成を変えた溶液のことである。ここで、「血液」とはヒトなどの動物血液のことで あり、血清、血漿など血液中の一部の成分力 なる溶液も含まれる。「生体由来の溶 液」とは少なくとも血液の他、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、腹水、胸水もしくは細胞か らのタンパク質を抽出した溶液など生体関連の物質でタンパク質を含む溶液が例示 される。
また本発明でいう 「分離膜モジュール」とは、分離膜をハウジング内に収納してな るものである。このハウジングには、分離される溶液が流入する入口および流出する 出口と、分離膜を透過して分離された溶液が流出する透過液流出口が備えられてい る。上記ハウジングの素材は特に限定しないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポ リスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等のプラスチック製のものを挙げるこ とがでさる。
[0027] 本発明で得られる生体成分含有溶液の組成が変化した溶液は、タンパク質分析、 特にプロテオーム解析に好ましく用いられるものである。分析法としては特に限定し ないが LCや 2D- PAGE、核磁気共鳴 (NMR)、 MALDI- TOF- MSや ESI- MS等を例示す ることができる。これらは、アルブミン等の一部の溶液中に多量に存在するタンパク質 が高い含有率で含まれていることによって、分析感度が低くなる分析方法であり、本 発明で得られた溶液を用いることによって、高感度分析が可能となる。また MS、電気 泳動を用いたプロテオーム解析に有用である。本発明の溶液調製装置が直接あるい は間接的に連結できる MSは特に限定されないが、好ましくは、電子スプレーイオンィ匕 型、大気圧イオン化型、四重極 (QQQ)型、磁気セクタ一型、飛行時間型、 MS/MS, MSn、 FT- MS型、イオン捕捉型およびこれらの組合せ型のものである。また、 MSZ MSまたは MSn (例えば MS3)のようなタンデム MSを含む。タンデム MSの場合は、全て のタイプの MSが適用可能である力 特にイオン捕捉、四重極一飛行時間（Q-TOF)、 FT-MS、および四重極およびイオン捕捉とのセクタ一機器の組合せを使用することが 効率がよい。これにより、 MSZMSおよび Zまたは MSn測定において生じるピークの 選択的な検出が可能となる。 [0028] 本発明の方法または精製装置で得られた溶液を用いて、上記分析装置を使用す ることにより、さらに発展されれば各種微量タンパク質成分の構造情報を集めることが できる。それらはペプチド 'マスフィンガープリント (peptide-mass fingerprint: PMF)の みならず、各ペプチドの一次構造情報 (アミノ酸配列)も含まれる。
[0029] 次に第 1の発明のグループについて説明する。
[0030] 第 1の発明のグループで生体成分の組成が変化し、特定されるアルブミンの濃度 組成比が 0. 3未満である溶液を得るためには、生体成分含有溶液を j8 2-ミクログロ ブリンのふる 、係数をアルブミンのふる!/、係数で除した値である透過比率が 50以上 である分離膜に供給し、分離膜を透過した液を採取する方法が採用される。またその 方法のためには、 j8 2—ミクログロブリンとアルブミンの透過比率が 50以上である分離 膜を内蔵するモジュールを有し、モジュールが分離膜の原液側に生体成分含有溶 液の原液入口、および分離膜により透過された透過液の出口を少なくとも有する装 置が使用される。前記装置のモジュールにおいては、分離膜の原液側に生体成分 含有溶液の原液出口を有することもできる。
[0031] 前記分離膜の透過比率は 70以上であることが好ましぐ更には 140以上であること が好ましい、上限値は特に設けないが、この値があまりにも高い膜分離ユニットでは、 所望の分子量 1. 5万未満のタンパク質を回収する量が少なくなつてしまうことが懸念 されるため、好ましくは 10000以下である方がよい。この分離膜には中空糸膜を用い ることが好ましい。中空糸膜はタンパク質を透過する目的では、従来より人工腎臓と 言われる透析モジュールの素材として多く利用されている。人工腎臓に使用される分 離膜は、アルブミン等のタンパク質をなるベく透過させないようにし、クレアチュンや 尿素などの低分子成分を透過させるよう設計されており、中空糸内腔側に血液を流 し、中空糸外腔から、生体にとって不要な低分子のタンパク質を流出させることにより 血液を浄ィ匕している。 第 1の発明のグループの分離膜において、中空糸膜を通じて 中空糸内腔側から外側に透過していく手法が好ましい。特に、中空糸内腔側にはァ ルブミン等の高分子量成分をなるベく透過せず、一方、主に分子量 1. 5万以下のタ ンパク質成分を透過させることにより、溶液を得る方法が好ましい。平膜の分離膜を 用いても同様の結果を得ることは可能である力 中空糸膜の利用は処理液量あたり の表面積が大きくする事が容易であること、また操作上の圧力損失が少ないため、効 率よく本発明を実施することができる。
[0032] 第 1の発明のグループで用いる分離膜の素材は特に限定しないが、セルロース、セ ノレローストリアセテート等のセノレロース系ポリマー、ポリカーボネート、ポリスルホンや ポリエーテルスルホンなどのポリスルホン系ポリマー、ポリメチルメタタリレート等のポリ メタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、ポリア タリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群より 1種類以 上選択される高分子を含む素材が使用される。この中でも近年透析器などに良く用 V、られて 、るポリスルホンは分画特性が良好であるために好まし 、素材である。膜構 造に関しては、分離膜の膜内の流路が非対称構造であることが好ましぐさらには緻 密層と、空隙率が高く膜強度を維持する支持層との多層構造力 なる非対称構造で あること好ましい。この非対称構造は電子顕微鏡を用いて膜の断面構造を 1000倍 の観察条件にて観察した場合にて判断する。膜の厚み方向に対して空孔が十分確 認できない層と空孔が確認できる層の両者が存在するか否かによって判断する。両 者の層が確認される場合、非対称構造と認定する。
[0033] また、この非対称構造にお!、ては原液が接触する面の近傍がの空孔が最も緻密で あることが好ましい。なぜなら溶質による膜表面の目詰まりを低減できる力もである。
[0034] 第 1の発明のグループに使用される分離膜にはできるだけタンパク質が吸着しない ことが好ましぐその観点力 表面が親水性の膜が好ましい。特に親水性の膜はプロ テオーム解析に重要な知見を与えるタンパク質の吸着を抑え、無駄なく回収する効 果がある。親水性膜としては、親水化されていれば特に限定されないが、親水性の 単量体と疎水性の単量体を共重合させたものや、親水性の高分子と疎水性の高分 子をブレンド製膜したもの、あるいは疎水性の高分子力 なる膜の表面に親水性ポリ マーを結合、付着させたもの、疎水性の高分子力もなる膜の表面をィ匕学処理、プラズ マ処理、放射線処理したものなどがあげられる。親水性成分を付与する化学構造とし ては特に限定しないが、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリ ビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリヒドロキシェチルメタタリレート、ポリアタリ ルアミドなどの親水性高分子が好ま 、 さらに、必要に応じて上記の分離膜を用いての透過により得られる液力 水分など の溶媒を取り除くというタンパク質を濃縮する工程をさらに行うことができる。
[0035] 濃縮する工程では、平面フィルター、中空糸膜などの分離膜であって、分子篩 ヽ効 果を有する多孔性膜を用い、分離ふるいによる濃縮を行う。サンプルが少量の場合 には、既に市販されているような遠心分離器用のチューブに平面フィルターを貼り付 けた濃縮デバイスを用い、一方大量のサンプルの場合には、中空糸を用いることが 有効である。
[0036] 濃縮工程で用いることのできる膜の素材は特に限定しないが、セルロース、セル口 一ストリアセテート等のセノレロースアセテート系ポリマー、ポリカーボネート、ポリスノレホ ンゃポリエーテルスルホンなどのポリスルホン系ポリマー、ポリメチルメタタリレート等 のポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、 ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群より 1 種類以上選ばれる高分子を含む素材が使用される。この中でも近年透析器などに良 く用いられて 、るポリスルホンは分画特性と高 、透水性を有する膜を得ることができる ために好まし 、素材である。
[0037] 濃縮工程に使用される膜の構造に関しては、均一構造に近いスポンジ構造を有す るものや、緻密層と空隙率が高く膜強度を維持する支持層の多層構造力もなる非対 称膜のいずれも用いることができる。濃縮工程に使用される膜の分子分画性能に関 しては、生理的食塩水中でペプチドを通過させない程度の分子分画能、例えばカツ トオフ値が 0.5kDa以下、好ましくは 0. lkDa以下の性能を有する膜か限外ろ過膜を用 、ることが好まし!/、。
[0038] 第 1の発明のグループの調製の目的とする生体成分の組成が変化した溶液では、 分子量 1. 5万未満のタンパク質の存在割合が高いことが必要であり、本発明では前 記存在割合の指標として、分子量 1. 16万である β 2—ミクログロブリンを用いている。 また、アルブミンや免疫グロブリントランスフェリンなどの高分子量のタンパク質が少な いことも必要であり、ここでは分子量が 6万に近いアルブミンを指標にした。アルブミン を指標とする理由は、血液の場合はアルブミンの量が最も多いことと、膜を使用した 方法の場合にアルブミンが十分に取り除かれていれば、通常は免疫グロブリンなどの より大きな分子も同時に取り除くことができるからである。
[0039] また、得られた生体成分の組成が変化した溶液を用いて、良好なプロテオーム解 析を行うためには、生体成分含有溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロブリンの組 成に対する生体成分の組成が変化した溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロプリ ンの組成組成が 10倍以上であることが好ましく更には 100倍以上、特に好ましくは 1 000倍以上であることが好ましい。これは、質量分析装置などにおいては装置に注入 できるタンパク質量が限られているため、測定感度を上げることができるからである。
[0040] このようにして総タンパク質中の分子量 6万以上のタンパク質の組成比率が低 ヽ液 を得ることができるが、高感度の分析を行うためにはタンパク質中のアルブミンの組成 比が 0. 3未満であることが望ましぐさらには 0. 1未満、またさらには 0. 01未満であ ることがよ!/、。
[0041] 以下、第 1の発明のグループの一態様例につき、図を用いながら説明する。
[0042] 図 1は、第 1の発明の溶液を調製する装置の例を示した概念図である。液の流れを 矢印で示してある。血清など生体成分である検体またはそれを含む生体成分含有溶 液は、注入用ポンプ 100から、三方バルブ 101を通じて、第 1工程の特定の透過比 率を有する分離膜を内蔵する第 1分離膜モジュール 105に注入され、チューブから なる溶液循環回路 102の中を循環用ポンプ 103によって送液せられ、循環する。第 1 工程で分離膜を透過した透過液は、透過液の出口である 1段目の膜ユニット処理液 回収口 104から得られる。この態様が 1工程の基本単位 (ユニット）である。これにより 所望のプロテオーム解析用の液が得られる。さらに高分子量のタンパク質を除去した い場合には、複数のモジュールを連結することができる。図 2は 2本のモジュールを 連結して 2段処理を行う例を示しており、図 3は 3本のモジュールを連結して 3段処理 を行う例を示している。透過した液は、透過液出口である膜分離ユニットの処理液回 収口に直結されたチューブによって次工程のユニットに注入される。目的とする溶液 は工程の最下流のユニットに存在する回収口（図 1の装置においては 104,図 2の装 置にぉ 、ては 204、図 3の装置にお!ヽては 304)力 得られる。
[0043] 図 4は図 3の装置にさらに濃縮の機能を有するモジュールを連結した装置であり、 目的とする溶液は濃縮ユニットの処理液回収口 407から回収される。 [0044] 次に第 2の発明のグループについて説明する。
[0045] 第 2の発明のグループのうち、生体成分の組成が変化した溶液の調整方法として は、分離膜を内蔵するモジュールを用い、分離膜の原液側に生体成分含有溶液を 流入させ、原液側の液をモジュールの外に設けられた溶液循環回路を通じて循環さ せ、分離膜を透過した溶液を取り出す工程であって、生体成分含有溶液の流入後、 生体成分含有溶液に対する希釈液をモジュールに内蔵した分離膜の原液側に追加 流入させることを特徴とするものである。また第 2の発明のグループのうち、生体成分 の組成が変化した溶液の調整手段としては、分離膜を内蔵し、前記分離膜の原液側 流路に連結された原液入口および原液出口、ならびに分離膜の透過液の出口を有 するモジュール、前記原液入口と前記原液出口とを連結し、途中にポンプおよび分 離用対象液入口を有する溶液循環回路、ならびに前記分離用対象液入口の上流の 位置に、または前記溶液循環回路の途中の位置に、設けられた希釈液流入口を具 備することを特徴とする。
[0046] 第 2の発明においても分離膜とは多孔性の分離膜のことであり、平面フィルター、力 ートリッジ式フィルタ一等の平膜型分離膜、中空糸膜等の中空状分離膜のいずれも 用いることができる。特に、中空糸膜は処理液量あたりの膜表面積が大きぐ圧損も 少なくできるため、効率よく用いることができる。処理液量あたりの膜表面積を大きく するためには、中空糸膜の内径は小さい方が好ましぐ 1000 m以下が好ましぐ 5 00 /z m以下がより好ましい。また、平面フィルタ一は製膜が容易で安価に作成するこ とができると言う利点がある。膜素材としては、セルロース、セルロースアセテート、ポ リカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルメタタリレート等のポリメタクリル酸エステル、 ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、ポリアクリロニトリル、ポリエス テル、ポリエチレンおよびポリプロピレンおよびこれらの誘導体力もなる群より 1種類以 上選択される素材を例示することができる。この中でも近年透析器などに良く用いら れて 、るポリスルホンは分画特性が良好であるために好まし!/、素材である。
[0047] 第 2の発明のグループで使用される分離膜では、分子量 1. 5万未満のタンパク質 と分子量 6万以上のタンパク質との透過比率が 50以上である分離膜を用いることが 好ましい。その他の好ましい特性、形状は第 1の発明のグループの分離膜について 述べたものと同様である。
[0048] 第 2の発明のグループのうち溶液の調整に関する発明においては、分離膜の原液 側に、生体成分含有溶液を流入させ、その後に生体成分含有溶液に対する希釈液 を流入させる。希釈液を追加すると、膜の表面での過剰な濃縮が防止され、分離膜 の透過比率の悪ィ匕が防止されるからである。また、希釈液には生理食塩水または「緩 衝溶液」を用いることが好ましい。「緩衝溶液」としては、 MES、 BIS— TRIS、 ADA、 ACES, PIPES, MOPSO、 BIS— TRIS PROPANE, BES、 MOPS, TES、 HE PES, DIPSO、 MOBS, TAPSO、 TRIZMA、 HEPPSO、 POPSO、 TEA, EPP S、 TRICINE、 GLY— GLY、 BICINE、 PBS、 TAPS, AMPD、 TABS, AMPSO 、 CHES、 CAPSO、 AMP、 CAPS, CABS等を挙げることができる。上記緩衝溶液 は略称で示してあるが、詳細な内容は和光純薬工業 (株）、シグマアルドリッチジャパ ン (株)などの試薬メーカーのカタログや MSDS (安全性データシート）を参照すれば 理解できる。
[0049] モジュールに流入する生体成分含有溶液の流量 Q1とはモジュールに流入し回路 を流れる液の流量のことであり、分離された液が送液される流量 Q2よりも大きいこと が望ましい。なぜなら分離膜表面での濃縮防止、膜表面への堆積物の積層防止、膜 孔の目詰まり防止の観点力もである。さらに分離膜モジュールに流入する液の流量 Q 1、分離された液が送液される流量 Q2の比率 Q2ZQ1は、 0. 5以下であることが望 ましい。また、分離膜モジュールに流入する液の流量 Ql、分離された液が送液され る流量 Q2の比率 Q2ZQ1が 0の場合は、濾過が行われず、拡散のみでの物質移動 になるため、分離の速度が遅くなるため、 0. 005以上であることが望ましい。
[0050] 分離膜で透過していく流量 Q2と、モジュールに流入される希釈液の流量 Q3とは 0 . 5≤Q2/Q3≤1. 5の関係にあることが望ましぐさらに Q2ZQ3が 0. 9-1. 1、す なわちおよそ 1であることが好ましい。
[0051] さらに、 2個のモジュールを準備し、第 1のモジュールにおいて、上述のように希釈 液を追加流入させつつ、生体成分の組成が変化した溶液を得た後、当該溶液を第 2 のモジュールに流入させ、さらに希釈液を追加流入させつつ、さらに生体成分の組 成が変化した溶液を調整すれば、プロテオーム解析にさらに好適な高分子量のタン ノ ク質が除去された溶液を調整することができる。さらに、第 3、第 4など追加のモジュ ールを準備し、同様の工程を行うこともできる。
[0052] また必要に応じて上述の 1個のモジュールを用いた工程または複数のモジュール を用いた工程力 得られる液から、水分などの溶媒を取り除きタンパク質を濃縮する 工程をさらに行うことにより、生体成分の組成が変化した溶液を得ることができる。そ の濃縮の工程に使用される膜の素材、構造、性能については、第 1の発明のグルー プの説明にお 、て、濃縮工程につ!、て説明した内容と同様である。
[0053] 次に第 3の発明のグループについて説明する。
[0054] 第 3の発明によれば、吸着、篩いによる分画、および濃縮の 3つのタンパク質を処理 する工程のうち少なくとも 2工程を有することによって、 目的とするタンパク質成分を多 く含有する溶液を効率的に調製することができる。
[0055] 第 3の発明のグループのうち溶液の調整方法に関する発明では、（1)分子量がアル ブミン以上のタンパク質を吸着する工程、（2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を 分子篩いにより分画し、一部または全部を除去する工程および (3)タンパク質を濃縮 する工程カゝら選ばれる少なくとも 2工程を有することが特徴である。
[0056] また、第 3の発明のグループにおける生体成分含有溶液から組成が変化した溶液 を調製する装置としては、 （1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全 部を吸着する手段、（2)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を分 子篩いにより分画する手段および (3)タンパク質を濃縮する手段力 選ばれる少なくと も 2種の手段を有し、前記選ばれた手段同士が流路によって連結されていることを特 徴とする。前記装置においては、液体クロマトグラフ、電気泳動装置または質量分析 装置に連結できる溶液の流出路を有するものであることが、タンパク質分析の簡便さ 力 好ましい。
[0057] 第 3の発明のグループで分子量の基準となるアルブミンとはヒト、ゥシ、その他哺乳 動物および鳥類由来のアルブミンのことをいい、対象とする生体によって決定される 力 本発明では、ヒトのアルブミンを基準とするのが好ましい。分子量がアルブミン以 上のタンパク質とは、主にアルブミン (分子量 6— 7万)より高分子量のタンパク質のこ とを 、う。アルブミンより高分子量であるか否かは SDS-PAGE ( sodiumdodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis：ドアンノレ硫酸ナトリウムを 含むポリアクリルアミドゲル電気泳動）と!、う方法により判別可能である。
[0058] 以下第 3の発明のグループで特徴づけられる 3つの工程または手段について説 明する。
( 1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を吸着する工程または 手段
ここで 、う「吸着」とは水溶液中に可溶ィ匕して 、るタンパク質が工程に存在する物質 との相互作用により、その物質に捕捉されることをいう。
[0059] 本工程の吸着に用いられる素材は特に限定しないが、セルロース、セルローストリ アセテート等のセノレロース系ポリマー、ポリカーボネート、ポリスノレホンやポリエーテノレ スルホンなどのポリスルホン系ポリマー、ポリメチルメタタリレート等のポリメタクリル酸 エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、ポリアクリロニトリル 、ポリエステル、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンのいずれか ひとつの素材の高分子が使用される。
[0060] また素材の形状としては、球状ビーズや繊維等の形態のもの、長繊維、短繊維など の繊維を素材とし、編物、織物、不織布などの布帛とした平面状の形態のもの、中空 糸の形態のものなどが挙げられ、それぞれの形態において、表面の凹凸が大きい形 状であることが吸着表面積を増大させる効果のために好ましい。また、平膜や中空糸 膜等の透過型分離膜であれば、低分子のタンパクの分離も併せて行うことができるた め、好ましい。
[0061] 基材自体の特性としては、目的とする溶液には必要であって除去されたくな ヽ低分 子量タンパク質が吸着されないように、表面が親水性化されたものや、アルブミン等 の高分子量タンパク質を選択的に吸着するために疎水性ィ匕されたもの力 適宜選択 されて使用される。
[0062] 親水性表面を有する基材としては、親水性の単量体と疎水性の単量体を共重合さ せたものや、親水性の高分子と疎水性の高分子を混合したもの、あるいは疎水性の 高分子力 なる表面に親水性ポリマーを結合、付着させたもの、疎水性の高分子か らなる表面を化学処理、プラズマ処理、放射線処理したものなどがあげられる。親水 性成分として、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリビュルピロ リドン、ポリビュルアルコール、ポリヒドロキシェチルメタタリレートなどの親水性高分子 の使用が好ましい。疎水性基材では、疎水性物質を使用したものや、疎水性リガンド を表面に導入したものが用いられる。疎水性成分としてはメタクリル酸エステル、ァク リル酸エステル、エチレン、プロピレン等のォレフィン、アクリロニトリル、メタタリロニトリ ル等の炭素 炭素二重結合を有する化合物力 なる付加重合体や、ポリスルホン、 セルロースなどの重合体を例示することができる。
[0063] さらには、ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、ポリフエノール、ブルー色素、 2 価金属イオン (Zn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+等）、疎水性基 (メチル基、ベンジル基、フエ-ル 基、クロロメチル基、ォクチル基、ラウリル基等）を有する化合物（例えばエタノール、 イソプロピルアルコール、アミドメチル化ポリスチレン）などのうち、少なくともいずれか ひとつ以上を固定化した素材を用いることもできる
(2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を分子篩いにより分画し、一部または全部 を除去する工程
本工程では、平膜あるいは中空糸膜などの形態を有し、分子篩い効果を有する多 孔性膜を用いるのが好ましい。特に中空糸膜を用いると分離膜の表面積が極めて大 きくなるため、有効である。
[0064] 本工程で好ましく用いられる膜の素材は特に限定しないが、セルロース、セルロー ストリアセテート等のセノレロースアセテート系ポリマー、ポリカーボネート、ポリスノレホン やポリエーテルスルホンなどのポリスルホン系ポリマー、ポリメチルメタタリレート等の ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミドナイロン、ポリ弗化ビ-リ デン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレンのいずれかひと つの素材の高分子が使用される。この中でも近年透析器などによく用いられて ヽるポ リスルホンは、ふるい分けを行う異なる分子量の物質のうち、高分子量の物質に対す る低分子量の物質のふる 、係数の比が大き 、と 、う分画特性が良好であるために好 ましい素材である。膜構造に関しては、均一構造に近いスポンジ構造を有するものや 、緻密層と空隙率が高く膜強度を維持するために設けられた、厚みの厚い支持層と の多層構造力もなる非対称構造のものいずれも用いることができる。非対称構造の 認定方法、非対称構造の好ましい態様は第 1の発明のグループにて説明した内容と 同様である。
[0065] 分画工程に使用される膜としては、膜表面の性質で表現すると親水性膜と疎水性 膜とがある。
[0066] 親水性膜では、親水性の単量体と疎水性の単量体を共重合させたものや、親水性 の高分子と疎水性の高分子をブレンド製膜したもの、あるいは疎水性の高分子から なる膜の表面に親水性ポリマーを結合、付着させたもの、疎水性の高分子力 なる膜 の表面を化学処理、プラズマ処理、放射線処理したものなどがあげられる。親水性成 分は特に限定しないが、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレンオキサイド、ポリ ビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ポリヒドロキシェチルメタタリレートなどの親 水性高分子が好ましい。これらの親水性膜は必要とするタンパク質の吸着を抑え、無 駄なく回収する効果がある。
[0067] 一方、疎水性膜では、膜素材として用いることができるものであれば特に限定される ものではないが、疎水性成分を混入したものや、疎水性リガンドを膜表面に導入した ものが用いられる。疎水性成分としてはメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、ェ チレン、プロピレン等のォレフィン、アクリロニトリル、メタタリ口-トリル、ポリ沸化ビ-リ デン等の炭素 炭素二重結合を有する付加重合性ィヒ合物力 なる重合体や、ポリス ルホン、セルロースなどの重合体を例示することができる。。
[0068] さらには、ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、ポリフエノール、ブルー色素、 2 価金属イオン (Zn2+, Ni2+, Co2+, Cu2+等）、疎水性基 (メチル基、ベンジル基、フエ-ル 基、クロロメチル基、ォクチル基、ラウリル基等）を有する化合物（例えばエタノール、 イソプロピルアルコール、アミドメチル化ポリスチレン）などのうち、少なくともいずれか ひとつ以上を、付着または化学反応により固定ィ匕した素材を用いることもできる。
[0069] 膜の分子分画性能に関しては、生理的食塩水中でアルブミンを通過させない程度 の分子分画能、たとえばカットオフ値 50kDa以下、さらに好ましくは 30kDa以下のもの が好ましく使用される。
[0070] (1)の工程または（2)の工程では、投入する水溶液中に、各種の薬剤をカ卩えて、吸 着または分画性能を向上させることができる。具体的には、工程に用いる水溶液中に 、界面活性剤、乳化剤、有機溶媒、エチレンダルコール、ポリプロピレングリコール、 ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、硫酸プロタミン、硫酸アンモ-ゥム、ポリフエ ノール、ブルー色素、カオトロピック塩、疎水性基 (メチル基、ベンジル基、フエ-ル基 、クロロメチル基、ォクチル基、ラウリル基等）を有する化合物（例えばエタノール、イソ プロピルアルコール）などのうち、少なくとも 1種以上を用いることができる。
[0071] たとえば、アルブミンの凝集を促進させる硫酸アンモ-ゥム、ポリエチレングリコール 、ポェチレンィミン、カオトロピック塩等を適当量カ卩えることにより、高分子成分のタン パク質を凝集させ巨大分子化を促進し、吸着の促進や分離膜からの漏出を抑制し、 高分子成分の透過を効率的に抑制することができる。逆に、両性界面活性剤ゃ陰ィ オン性海面活性剤等の界面活性剤を適当量加えることにより、タンパク質間の相互 作用を抑制し、分子篩いによる分画を効率的に行うことができる。
(3)タンパク質を濃縮する工程
濃縮する工程とは溶液中のタンパク質を濃縮する工程を意味する。ここでいう濃縮 工程では水溶液中力 水が除去されるのはもちろん、分子量 lkDa以下の低分子成 分が除去されるものでもよい。本工程では、平面フィルターあるいは中空糸モジユー ルの膜に多孔性の膜を用い、分離ふるいによる濃縮を行う。分子分画能の点で、こ の工程で使用する膜は、上記（2)の分画工程に使用する分離膜とは異なる。さらに、 上記 (2)の分画工程で、分離膜を使用する場合は、膜を透過した液を所望の溶液と するが、（3)の濃縮の工程では、膜を透過せず残存した液が所望の液となることで異 なる。
[0072] 試料が少量の場合には、市販されている遠心分離器用のチューブに平面フィル ターを貼り付けた濃縮デバイスを、大量のサンプルの場合には、中空糸を用いること が有効である。
[0073] 濃縮工程で使用できる分離膜の素材は特に限定しないが、セルロース、セルロー ストリアセテート等のセノレロース系ポリマー、ポリカーボネート、ポリスノレホンやポリエ 一テルスルホンなどのポリスルホン系ポリマー、ポリメチルメタタリレート等のポリメタク リル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、ポリアクリロ 二トリノレ、ポリエステル、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンのい ずれかひとつの素材の高分子が使用される。この中でも近年透析器などに良く用い られて 、るポリスルホンは、分画特性が良好 (すなわちふる!/、分けを行う異なる分子 量の物質のうち、高分子量の物質に対する低分子量の物質のふる!/、係数の比が大 きい）であるために好ましい素材である。膜構造に関しては、均一構造に近いスポン ジ構造を有するものや、緻密層と空隙率が高く膜強度を維持するために設けられた、 厚みの厚い支持層との多層構造力もなるも非対称構造のものいずれも用いることが できる。非対称構造の認定方法、好ましい態様については、第 1の発明のグループ にて説明した内容と同様である。
[0074] 濃縮工程に使用される膜の分子分画性能に関しては、生理的食塩水中でぺプチ ドを通過させない程度の分子分画能、すなわちカットオフ値が 0.5kDa以下、さらに 0.015kDa以下である分離膜か限外ろ過の分離膜が用いられる。
[0075] この第 3の発明のグループにおいては、各工程の手段を溶液流路で連結し、連続 して稼動できることによって、簡便かつ自動的に連続運転できるという効果が得られ る。ただし各工程を独立して稼動させることもできる。送液には液流路に接続したボン プを用いることができる力 小規模の装置の場合にはシリンジによって送液してもよい 。分離膜によらず遠心チューブ型装置によって濃縮する場合には、遠心操作で行つ ても構わない。
[0076] 第 3のグループの発明の方法において、一つの工程ではある力 （1)分子量がァ ルブミン以上のタンパク質を吸着する工程、 (2)分子量がアルブミン以上のタンパク 質を分子篩いにより分画し、一部または全部を除去する工程および (3)タンパク質を 濃縮する工程から選ばれる 2以上の機能を有する工程である場合には、その工程を 2回以上行うことも方法に係る本発明の範囲に含まれる。第 3のグループの発明の装 置においても、一つの手段ではあるが、（1)分子量がアルブミン以上のタンパク質を 吸着する手段、（2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を分子篩いにより分画し、 一部または全部を除去する手段および (3)タンパク質を濃縮する手段力も選ばれる 2 以上の機能を有する手段である場合には、その手段を 2以上連結することも装置に 力かる本発明の範囲に含まれる。
[0077] 上記の（1)一 (3)の工程は、さらに同一工程の繰り返しによって、さらに総タンパク 質量に対するアルブミンの比率が低減され、解析のターゲットとする低分子量のタン ノ ク質の比率を高めるという優れた効果を得ることができる。同一工程の繰り返し、あ るいは異なる 2つの工程を用いることの判断は、最初に供給される生体成分に含まれ るタンパク質の組成の程度によって設計することができる。
[0078] 第 3の発明のグループに示される調整方法により、健康成人の血漿の場合、その中 のタンパク質組成にもよる力 この発明の 1回の操作で、分子量 50kDa以上の高分 子量タンパク質の除去率 90%以上、分子量 50kDa未満のタンパク質の平均回収率 70%以上、分子量 50kDa未満のタンパク質の平均濃縮率 10倍以上の効果が得ら れる。
[0079] また、 1回の処理時間が 1一 6時間以内とすることができる。また別検体力ものコンタ ミネーシヨンおよびバイオノヽザードの防止の点から、一連のデバイスは一回使用とす ることが好ま U、が、本発明における方法に使用される装置はデイスポーザブル仕様 とすることができ、検体からの汚染の回避や分析の再現性の確保の点からも大きな利 点である。
[0080] 第 3のグループの発明にお 、ても、この発明は生体成分含有水溶液生体成分含有 溶液、特にヒトの血漿、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、腹水、胸水等のからの生体分子 特にタンパク質成分の分離に適する。上記ので示した膜および中空糸モジュールの サイズならびに液の流速は、原料とする血漿や尿等の生体材料の質と量に依存して 適宜決められるが、いわゆる卓上サイズで実施する場合、血漿では 1一 400mL好ま しくは 5— lOOmLで実施され、流速は 1一 20mLZmin好ましくは 2— lOmLZmin で行われる。
[0081] 以下、第 3の発明グループに属する生体成分含有水溶液生体成分含有溶液から 組成を変化させる方法およびそのための装置の一態様例につき、図を用いながら説 明する。
[0082] 図 5は、第 3の発明のグループに属する装置の一例を示す概念図であり、吸着、分 画、濃縮の順になる 3工程の例である。液の流れを矢印で示してある。血清などの材 料の検体、またはそれを含む生体成分含有水溶液生体成分含有溶液は、注入用ポ ンプ 8、バルブ 1を経て吸着、分画および濃縮のいずれかの機能を有する第 1工程モ ジュール 5に注入され、チューブ力もなる溶液循環回路 2の中をポンプ 3によって送 液せられ、循環する。第 1工程で処理され得られた溶液は、処理液 4カゝら得られる。こ の態様が 1工程という単位である。図 5は 3段の例を示しており、第 2工程のモジユー ル 6と第 3工程のモジュール 7が連結されている。得られた溶液は、処理液回収口に 連結されたチューブによって次工程のモジュールに注入される。
[0083] 分子篩いによる分画の工程の場合には、工程の出口、すなわち処理液の回収口は 、透過した溶液の出口となる、吸着工程の場合の工程の出口は、溶液循環回路の途 中に設けられた出口となることが、通常であるが、吸着に透過型の膜を使用する場合 には、透過した液の出口が、工程の出口となる。濃縮工程の場合の出口は溶液循環 回路の途中に設けられた出口となる。図 5の態様では、各循環用ポンプは各工程の 下流に設けてある力 この循環用ポンプが各工程の上流に設けるのでもよい。
[0084] 選ばれた工程のうち濃縮工程力 Sもっとも下流にある場合には、各工程の処理が同 時に行なうことが可能であり、従来別々に長時間かけて行った処理を短時間に行うこ とがでさる。
実施例
[0085] <透過比率の測定方法 >
ヒト血清（SIGMA社 H1388もしくは同等品）を 3000rpml5分の条件にて遠心処 理を行い沈殿物を取り除いた後 0. 45 μ mのフィルター処理を行っておく。
[0086] 分離膜を内蔵する分離膜モジュールを準備し、原液 (ヒト血清)側入口と原液側 ( ヒト血清）出口とをチューブにより接続することにより、溶液循環回路を構成しておく。 溶液循環回路の途中には、原液側出口力も原液側入口の方向に、サンプリングポー ト、循環させることなく溶液を廃棄することができる切り替えバルブ、溶液循環回路に 溶液を流入させることができる流入路、原液を循環させるポンプ、サンプリングポート が順に設けられている。またモジュールの濾過側出口から、チューブを接続し、濾過 を行うためのポンプ、濾過された液の出口（サンプリングポート）を順に設けておく。流 入路を通じて、分離膜モジュールに対して PBS (日本製薬社製ダルベッコ PBS (—) ) 水溶液 (以下、この水溶液を単に「PBS」という。）を充填しておく。原液側入口からヒ ト血清を原液を循環流量 lmlZmin、濾過流量 0. 2mlZminの流速で 20°Cにて濾 過を開始する。濾過中、モジュール出口の原液は、溶液循環回路の途中にある溶液 を廃棄するためのバルブを切り替えることにより、戻さずに廃棄する。そのまま、ヒト血 清注入開始から 30分から 60分後の間、モジュール原液入口近くのサンプリングポー ト、モジュール原液出口近くのサンプリングポートおよびモジュールの濾過側出口近 傍のサンプリングポートそれぞれから試料を採取する。これら試料中のアルブミンお よび j8 2—ミクログロブリンの濃度を測定し、これらの測定値力 アルブミンおよび |8 2 ミクログロブリンのふる 、係数を算出する。この時原液側濃度はモジュール入口お よび出口近傍の各サンプリングポートから採取した試料の濃度の平均値を用いる。そ して得られた β 2—ミクログロブリンのふる!/、係数をアルブミンのふる!/、係数で除した 値を透過比率とする。 なお、本実施例におけるアルブミン濃度の測定は、エスァー ルエル (株）に外注し、項目コード 0721 4 (ラテックス凝集免疫法）にて測定した。 この測定にて、アルブミン濃度 0. 4mg/L 以下の測定限界以下になったものにつ いては、 BETHYL社製 Human Albumin ELISA Quantitation Kit ( Cat No E80- 129 ) にて測定した。 β 2—ミクログロブリン濃度の測定は、エスアールエル (株）に外注し、 項目コード 02103 (ラテックス凝集免疫法）にて測定した
< 2次元電気泳動によるタンパク質分析 >
もとの生体成分含有溶液および本発明の方法で得られた「生体成分の組成が変化 した溶液」を 2次元電気泳動法によって分析した。方法は次の通りである。
1.生体成分分離溶液に 80%ショ糖溶液を等量加え、泳動用サンプルとする。
2.市販の等電点電気泳動用ゲルである IEF— PAGEmini pH3—10 1mm厚（TE FCO製)を泳動槽にセットする。
3.上部バッファー（0. 05M 水酸化ナトリウム） 200mlと下部バッファー（0. 01M リ ン酸） 500mlを入れる。
4.上部バッファーで各ゥエルを洗浄し、 10%ショ糖溶液を 20ulをゥエルにのせる。
5.ゥエルに入れたショ糖溶液の下に 1.で調整したサンプルをおく。
6.泳動 【こカノ一をし電源【こつなぎ、 100Vで 30分、 200Vで 30分、さら【こ 500V で 60分泳動する。
7.ゲルカセットのプラスチック版をはがしゲルを取り出し、 40%酢酸水溶液に浸け、 30分振とうする。
8.クマシ一ブリリアントブルー染色液 (CBB染色）にて 5分染色し、脱色液（10%メタ ノール、 7. 5%酢酸）にて脱色しバンドを確認し、水を換えながら 30分以上水洗する
9.ゲルを 1レーン分切り出す。
10.切り出したゲル片を SDS— PAGE用泳動バッファーに 10— 20分浸し平衡化させ る。 SDS— PAGE用泳動バッファー（以下泳動バッファーと記す)組成はトリス 3. 0g、 グリシン 14. 4g、 SDS1. Ogに蒸留水をカロえて 1000mlとしたものである。
11.市販の SDS— PAGE用ゲルである SDS— PAGEmini 4— 20% 1. 5mm厚 2-Dwell (TEFCO製）を泳動槽にセットする。
12.泳動バッファーを入れ、泳動バッファーでゥエルを洗浄する。
13. 9.のゲル片を、 2次元目の SDS— PAGEminiのゥエルに気泡が入らないように 注意しながら移す。小さいゥエルには市販の分子量マーカーであるレインボーマー カー (アマシャム）を lulのせる。
14. 1%ァガロース Z泳動バッファー（調整時にブロモフエノールブルーを目視で着 色する程度に僅か〖こ添加しておく）でゲルを封入する。
15.泳動槽にカバーをし電源につなぎ、 15mAで 120分程度（ブロモフエノールブル 一がゲルの下端まで移動するまで)泳動する。
16.ゲルカセットからゲルを取り出し、 CBB染色、銀染色を行う。銀染色は、市販の キットである銀染色 Πキットヮコー (和光純薬社製)を使用する。
(実施例 1)
ポリスルホン (ソルベー社製ユーデル (登録商標） P-3500) 18重量部およびポリビ- ルピロリドン（BASF社製 K30) 9重量部を N, N，ージメチルァセトアミド 72重量部およ び水 1重量部の混合溶媒に加え、 90°Cで 14時間加熱して溶解し、製膜原液を得た 。この製膜原液を外径 0. 3mm、内径 0. 2mmのオリフィス型二重円筒型口金の外 側の管より吐出した。芯液として N, N'—ジメチルァセトアミド 58重量部および水 42 重量部からなる溶液を内側の管より吐出した。吐出された製膜原液は、 口金から凝 固浴液面までの距離 350mmを通過した後、水 100%の凝固浴に導かれ、中空糸膜 が得られた。得たれた中空糸膜の構造を電子顕微鏡（日立社製 S800)にて確認した ところ非対称構造を有していた。得られた中空糸膜を 10000本、一般の透析器と同 様に透析液入口および透析液出口を有する円筒状のプラスチックケースに挿入し、 両端部を榭脂で封止して、有効膜面積 1. 6m2の中空糸膜モジュールを作成した。 この中空糸膜モジュールを水で洗浄した後、該モジュールに水が充填されて 、る状 態で γ線を照射した。モジュールの γ線吸収線量は 27kGyであった。
[0088] 該モジュールの中空糸膜を切り出し、 100本を束ね、中空糸膜中空部を閉塞しな V、ようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミ 二モジュールを作成した。該ミニモジュールの外直径は約 7mm、全体長さは約 17c mであり、一般的な中空糸膜型透析器と同様の中空糸の外側のポートを 2個有して いる。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。
[0089] その後、 PBS (日水製薬社製ダルベッコ PBS (—) )水溶液を充填し、中空糸膜ミニ モジュール（以降、ミニモジュール（1)と略す）を得た。本ミニモジュールを 2本作成し 、うち 1本を用いて分離膜の透過比率を測定したところ 70. 5であった。残りの 1本は 以下の実験に用いた。
[0090] ヒト血清（SIGMA社 H1388、 Lot 28H8550)を 3000rpml 5分の条件にて 遠心処理を行!、沈殿物を取り除!/、た後 0. 45 μ mのフィルター処理を行った。
[0091] ミニモジュール（1)の外側のポートのひとつをキャップし、他のひとつはシリコーンチ ユーブをつなぎ、透過用ペリスターポンプに接続した。一方中空糸膜内側の液はモ ジュールの原液入口と原液出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、 ペリスターポンプを用いて血清を循環できるようにした。また溶液循環回路の途中に は追加の PBSを投入する入口を設けた。
[0092] 4mlの血清を用いて循環流量 5mlZmin、濾過流量 0. 2mlZminの流速で 20°C 、 4時間濾過を実施した (本工程は、主にアルブミンより大きいタンパク質を分画する 工程に相当する）。この時濾過された容量分は、 PBSを血清に添加して循環する液 量は一定に保った。 4時間で得た濾液すなわち生体成分の組成が変化した溶液 52 . 5ml中のアルブミン濃度は 61mgZl、 α 1—ミクログロブリン濃度は 0. 4mg/U β 2 -ミクログロブリン濃度は 0. 066mgZlであった。用いたヒト血清中の総タンパク質濃 度は 53000mgZl、ァノレブミン濃度は 33000mgZl、 α 1—ミクログロブリン濃度は 16 . 5mgZl、 j8 2—ミクログロブリン濃度は 1. 17mgZlであり、アルブミン濃度の大幅低 下が認められた。
[0093] 溶液の総タンパク質は Micro BCA Protein Assay (PIERCE社製）を用いて、 検量線には BSA用いて測定を行った。濾液中の総タンパク質濃度は 275mgZlであ り、総タンパク濃度に対するアルブミンの濃度は 0. 22であった。また、総タンパク質 に対する β 2—ミクログロブリンの濃度はヒト血清中の 0. 0000223に対して濾液中で は 0. 00024であり、 10. 8倍に増カロしていた。
[0094] (実施例 2)
ポリスルホン（ソルベー社製ユーデル (登録商標） Ρ-3500) 18重量部およびポリビ -ルピロリドン（BASF社製 Κ30) 9重量部を N, N，ージメチルァセトアミド 72重量部 および水 1重量部の混合溶媒に加え、 90°Cで 14時間加熱して溶解し、製膜原液を 得た。この製膜原液を外径 0. 3mm、内径 0. 2mmのオリフィス型二重円筒型口金の 外側の管より吐出した。芯液として N, N'—ジメチルァセトアミド 58重量部および水 4 2重量部からなる溶液を内側の管より吐出した。吐出された製膜原液は、 口金から凝 固浴液面までの距離 350mmを通過した後、水 100%の凝固浴に導かれ、中空糸膜 が得られた。得たれた中空糸膜の構造を電子顕微鏡（日立社製 S800)にて確認した ところ非対称構造を有していた。得られた中空糸膜を 10000本、一般の透析器と同 様に透析液入口および透析液出口を有する円筒状のプラスチックケースに挿入し、 両端部を榭脂で封止して、有効膜面積 1. 6m2の中空糸膜モジュールを作成した。 カチオン性親水性高分子としてポリエチレンィミン (BASF社製、重量平均分子量 10 0万) 0. 1重量％を含む水溶液を、この中空糸膜モジュールの中空糸膜内面側およ び外面側に充填した。この後、該モジュールに γ線照射した。モジュールの γ線吸 収線量は 27kGyであった。該モジュールの中空糸膜を切り出し、 100本束ね、中空 糸膜中空部を閉塞しな 、ようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュ ールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの外直径は約 7m m、全体長さは約 17cmであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸の外側の ポートを 2個有している。中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。そ の後、 PBS (日水製薬社製ダルベッコ PBS (—) )水溶液を充填し、ポリェ； 固定ィ匕中空糸膜ミニモジュール (以降ミニモジュール (2)と略す)を得た。本ミニモジ ユールを 2本作成し、うち 1本を用い分離膜の透過比率を測定したところ 400であった 。残りのミニモジュールを以下の実験に用いた。
[0095] ヒト血清（SIGMA社、 H1388、 Lot 28H8550)を 3000rpm、 15分の条件【こて 遠心処理を行!、上澄み液および沈殿物を取り除!/、た後 0. 45 μ mのフィルター処理 を行った。
[0096] まず、実施例 1と同じ中空糸膜ミニモジュール (ミニモジュール（1) )を準備し、中空 糸の外側のポートのひとつをキャップし、もうひとつはシリコーンチューブをつないだ。 中空糸膜内側の液にっ 、ては原液の入口と出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液 循環回路とし、途中にはペリスターポンプを設けて原液を循環できるようにした。溶液 循環回路の途中には三方バルブを設け、一方にはチューブを介して注入用ポンプを 設けた。さらに、ミニモジュール（2)も外側ポートのひとつをキャップし、もうひとつはシ リコーンチューブを接続した。またこのミニモジュールも、中空糸膜内側の液について は、原液の入口と出口をつなぎ溶液循環回路とし、途中にはべリスターポンプを設け て溶液が循環できるようにした。またこの溶液循環回路の途中に三方バルブを設け た。
[0097] ミニモジュール（1)の外側のポートにつながれたシリコーンチューブとミニモジユー ル（2)の溶液循環回路の途中に設けられた三方バルブとを接合した。そして、これら チューブおよび 2つのモジュール内に PBSを充填し、図 2に示すようなミニモジユー ルが 2段直列につながったシステムを作成した。ここで、ミニモジュール（1)の使用が アルブミン以上の分子量であるタンパク質を分画する工程、ミニモジュール（2)の使 用がアルブミン以上の分子量であるタンパク質を吸着する機能と、アルブミン以上の 分子量であるタンパク質を分画する機能の両者を備える工程に相当する。
[0098] 注入用ポンプを通じて、チューブを介して血清を投入し、ミニモジュール（1)および ミニモジュール（2)それぞれの溶液循環回路の循環流量 5mlZmin、濾過流量 0. 2 mlLZminの流速で 20°C、 4時間濾過を実施した。この時濾過された溶液の容量分 の PBSを注入用ポンプを通じてカ卩えて、循環する液量は一定に保った。 [0099] 4時間経過後、モジュール (2)から得た濾液すなわち生体成分の組成が変化した 溶液中のアルブミン濃度は 0. 62mgZL、 a 1 ミクログロブリン濃度は 0. 036mg/ L、 j8 2 ミクログロブリン濃度は 0. 05mgZLであった。用いたヒト血清中の総タンパ ク質濃度は 53000mg/l、アルブミン濃度は 33000mg/l、 a 1 ミクログロブリン濃 度は 16. 5mgZl、 j8 2 ミクログロブリン濃度は 1. 17mgZlであり、アルブミン濃度 の大幅な低下を認めた。濾液中の総タンパク質濃度は 8. lmgZlであり、総タンパク 質濃度に対するアルブミン濃度の比率は 0. 08であった。また、総タンパク質に対す る j8 2 ミクログロブリンの濃度はヒト血清中の 0. 0000223に対して濾液中では 0. 0 0617であり、 277倍に増カロしていた。
[0100] このサンプルを 2次元電気泳動にて分析した結果を図 7に示す。
[0101] 図 7は実施例 2で得られた、生体成分の組成が変化した溶液、 3000ul分を用いて 得た濃縮液の 2次元電気泳動写真である。図 7から判るように、分子量 6万未満の場 所に多くの独立したスポットが見られる。本デバイスによって分離したサンプルは低分 子量領域に数多くのスポットを得ることが出来た。
(比較例 1)
分離前ヒト血清を比較サンプルとして 2次元電気泳動分析を行った。結果を図 8〖こ 示す。図 8は、実施例 2で処理する前のヒト血清 0. 5ulを試料とした 2次元電気泳動 写真である。図 8では、スポットがブロードであり、物質を特定することができないと共 に、低分子量領域でのスポットはほとんど観察されな 、。
(実施例 3)
東レ株式会社製透析器 BS1. 8L (Lot. 20440312 )の両端の榭脂接着部分を 切り、中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径 200 m膜厚 40 mで あり、中空糸膜の構造を電子顕微鏡（日立社製 S800)にて確認したところ非対称構 造を有していた。
[0102] 該中空糸膜を 100本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティ ング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。 該ミニモジュールの内直径は約 5mm、長さは約 17cmであり、一般的な中空糸膜型 透析器同様に中空糸膜の内側のポート (血液ポート）を 2個と外側のポート (透析液ポ ート）を 2個有して 、る。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留 水にて洗浄した。その後、 PBS (日水製薬社製ダルベッコ PBS (—) )水溶液を充填し 、中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール（3)と略す)を得た。本ミニモジユー ルを 2本作成し、うち 1本を用いて分離膜の透過比率を測定したところ 149であった。 残りの 1本は以下の実験に用いた。
[0103] ヒト血清（SIGMA社 H1388、 Lot 122K0424)を 3000rpml 5分の条件にて 遠心処理を行!、沈殿物を取り除!/、た後 0. 45 μ mのフィルター処理を行った。
[0104] 図 1に示すようにミニモジュール（1)の外側のポートのうち、モジュールの下部ポート 106をキャップし、上部ポートは膜分離ユニットの処理液回収口 104とした。中空糸 膜内側の液は原液入口と出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路 102とし 、途中にはペリスターポンプである循環用ポンプ 103を設けて血清を循環できるよう にした。また溶液循環回路 102の途中には三方バルブ 101を設け，三方バルブ 101 力も一方には注入用ポンプを装着した。
[0105] 4mlの血清を、注入用ポンプを介して 1. OmlZminで加えた後、循環流量 lOmlZ min、濾過流量 1. OmLZminの流速で 20°C、 50分間濾過を実施した。この時、透 過により濾過された容量に相当する容量である 1. OmlZminの流速 PBSを循環回 路に加えて、循環する液量を一定に保った。 50分間で得られた溶液は、約 50mlで アルブミン濃度は 32. 8mg/l、 a 1 ミクログロブリン濃度は 0. 06mg/U β 2—ミク ログロブリン濃度は 0. 068mgZLであり、原液として用いたヒト血清中の総タンパク 質濃度は 48000mg/l、アルブミン濃度は 29800mg/L、 a 1 ミクログロブリン濃 度は 13. 2mgZL、 j8 2 ミクログロブリン濃度は 1. 27mgZLであった。原液として 用 ヽたヒト血清 ίま、総タンノ ク質量 ίま 192000 /z g、ァノレブミン量 119000 g、 a 1— ミクログロブリン 52. 8 /z g、 j8 2 ミクログロブリン量は 5. 08 /z gであったのに対して、 濾液の総タンパク質量は 56000 μ g、アルブミン量 1640 g、 α 1—ミクログロブリン 3 . OO ^ g, j8 2—ミクログロブリン量は 3. 40 /z gであり、 j8 2—ミクログロブリン量を維持 しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。これらの結果より、総タンパク質 濃度に対するアルブミンの組成比率は 0. 15であった。また、総タンパク質に対する β 2—ミクログロブリンの組成比率はヒト血清中の 0. 0000265に対して濾液中では 0 . 00613であり、 23倍に増カロしていた。
(実施例 4、比較例 2)
実施例 3で得られた中空糸膜 (透過比率 149)を用いて、ミニモジュールを 1個作成 した。ミニモジュールの形状、中空糸膜本数は実施例 3と同様である。このミニモジュ ールを以下ミニモジュール (4)という。また、実施例 3で得られた中空糸膜 (透過比率 149) 40本を、内直径が約 5mm、長さが約 12cmのガラス管モジュールケースに固 定し、ミニモジュール (以降、ミニモジュール（5)と略す)を実施例 1と同様に 2個作成 した。これらミニモジュールを以下の実験に用いた。
[0106] ヒ卜血清（SIGMA社、 H1388、 Lot 122K0424)を 3000rpm、 15分の条件【こ て遠心処理を行!、濾液および沈殿物を取り除 、た後 0. 45 μ mのフィルター処理を 行った。
[0107] まず、 1個のミニモジュール（4)を準備し、外側のポートのうちひとつをキャップし、も うひとつはシリコーンチューブをつないだ。中空糸膜内側の液については、原液入口 と出口とをシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターボン プを設け、溶液を循環できるようにした。前記溶液循環回路の途中に三方バルブを 設け、三方バルブの一方向には注入ポンプを取り付けた。これを 1段目の膜分離ュ ニットとした。さらに、ミニモジュール（5)のうち 1個のミニモジュールについて、外側の ポートのうちひとつをキャップし、ほかのひとつはシリコーンチューブを接続した。ミニ モジュール (5)の中空糸膜内側の液にっ 、ても、モジュールの原液入口と出口をシ リコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターポンプを設けて 溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三方バルブを設け た。これを 2段目の膜分離ユニットとした。さらに、もう 1個のミニモジュール (5)の外側 のポートのうちひとつをキャップし、のこりの一つはシリコーンチューブを接続した。 2 個目のミニモジュール（5)の中空糸膜内側の液についても、モジュールの原液入口 と出口をシリコーンチューブでつなぎ、溶液循環回路となし、回路の途中にペリスタ 一ポンプを設けて溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三 方バルブを設けた。これを 3段目の膜分離ユニットとした。次に各ミニモジュールの外 側のポートに接続されたシリコーンチューブを次の段の膜分離ユニットの三方バルブ につなぎ、分離システム全体に PBSを充填し、図 3に示すような 3段の膜分離ユニット を有する分離システムを作成した。
[0108] 図 3は、この実施例で用いた分離システムの概略図である。液の流れを矢印で示し てある。血清および希釈液（PBS)が注入ポンプ 100から、三方バルブ 101を経て溶 液循環回路 102の中に入り、さらに循環循環用ポンプ 103によって送液され、第 1の 分離膜モジュール 105 (ミニモジュール (4) )に注入され、そして溶液循環回路 102を 循環する。第 1の膜分離ユニットで得られた溶液は、膜分離ユニットの処理液回収口 104から取り出される。次に、この溶液は、 2段目の分離膜ユニットに流入し、 2段目 の分離膜モジュール 205 (第 1のミニモジュール（5) )に注入され、さらに 2段目溶液 循環回路 202を、 2段目循環用ポンプ 203により循環する。第 2の膜分離ユニットの 2 段目の分離膜モジュール 205にて透過した溶液は、処理液回収口 204から取り出さ れる。さらに、この溶液は、第 3の分離膜ユニットに流入し、第 3の分離膜モジュール 3 05 (第 2のミニモジュール（5) )に注入され、循環する。の第 3の分離膜モジュールを 透過した溶液は、処理液回収口 304から得られる。
[0109] 詳細な条件は以下のとおりである。 4mlの血清を 0. 2mlZminで 1段目の膜分離 ユニットに加えた後、 1段目の膜分離ユニット、 2段目の膜分離ユニット、 3段目の膜 分離ユニット共に流量 5. OmLZminの条件で溶液循環回路を循環させ、また各分 離膜モジュール濾過流量を 0. 2mLZminとする流速で 20°C、 4時間濾過を実施し た。この時、透過により濾過された容量分の PBSを 0. 2mlZminで注入ポンプ 100 を経て第 1の膜分離ユニットに加えて、循環する液量を一定に保った。 4時間で得ら れた溶液は、約 47mlであった。この溶液をザルトリウス社製膜 vivaspin20 (3000M WCOタイプ）を用いて 4mlに濃縮したところ、アルブミン濃度は 0. 38mgZl、 β 2—ミ クログロブリン濃度は 0. 583mgZLであり、原液として用いたヒト血清中の総タンパク 質濃度は 49000mg/l、アルブミン濃度は 31200mg/L、 β 2—ミクログロブリン濃 度は 1. 19mgZLであった。原液として用いたヒト血清の総タンパク質濃度は 19600 0 μ gであり、アルブミン量 124800 μ §、 β 2—ミクログロブリン量は 4. 76 μ gであった のに対して、濾液の総タンパク質量は 100 g、アルブミン量 1. 5 g、 j8 2—ミクログ ロブリン量は 2. 3 gであり、 j8 2—ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大 幅に除去することができた。これらの結果より、総タンパク質濃度に対するアルブミン の組成比率は 0. 02であった。また、総タンパク質に対する j8 2—ミクログロブリンの濃 度はヒト血清中の 0. 0000243に対して據液中では 0. 0307であり、 1263倍に増カロ していた。
[0110] 該サンプルをザルトリウス社製 vivaspin500 (3000MWCOタイプ）を用いてサンプ ル容量が 1Z10になるまで濃縮し、サンプルバッファー（0. 5Mトリス塩酸 (pH6. 8) 0. 5ml、グリセロール 0. 4m、 10%SDS0. 8ml、 0. 1%ブロモフエノールブルー 0. lml、これらに蒸留水をカ卩えて 10mlとしたもの）を等量カ卩え、沸騰水中で 3分間加熱 した溶液のうち 25 1を電気泳動にて分析した。結果を図 6の S3レーンに示す。巿販 の分子量マーカーである Rainbow マー —、 Amersham Biosciences 、 RPN 756 ) を SIレーンに、また、比較のために実施例 4の分離システム処理前のヒト血 清 (0. 02ul相当）にサンプルバッファーを加え、沸騰水中で 3分間加熱した溶液を S 2レーンにアプライし、 S1から S3レーンのサンプルを同時に泳動した結果を併せて 図 6に示す。
[0111] S2レーン力も判るように、ヒト血清は、分子量 6万以上の場所にタンパク質が多く存 在し、分子量 1. 5万以下の場所にタンパク質は少量し力観察されな力つた。それに 対し、 S3レーン力 判るように、分離システムで処理した実施例 4の濾液の濃縮液は 、分子量 6万以上の場所にタンパク質は少なぐ分子量 1. 5万以下の場所に多くのタ ンパク質があることが確認できた。
[0112] (実施例 5)
実施例 1で作成した中空糸膜を γ線を照射する前にモジュール力 切り出し、 10 0本準備した。 50°C、相対湿度 13%の雰囲気下で 24時間乾燥させた。この中空糸 膜を実施例 4と同様にエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケー スに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュ ール内部を蒸留水にて洗浄した。その後、 PBS (日水製薬社製ダルベッコ PBS (—) ) 水溶液を充填し、濃縮用中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール (6)という） を得た。
[0113] さらに、ミニモジュール（6)の外側のポートのうちひとつをキャップし、一方は濾液 出口とした。このミニモジュール（6)の中空糸膜内側の液も、モジュールの原液入口 と出口をシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、ペリスターポンプを用いて 原液を循環できるようにした。また溶液循環回路の途中には三方バルブを設けた。ま たこれを濃縮膜ユニットとした。
[0114] 実施例 4で用いた 3段の膜分離ユニットを有する分離システムを新たに作成した。
3段目のミニモジュールの処理液回収口と濃縮膜ユニットの三方ノ レブとをシリコー ンチューブで接合した。また濃縮膜ユニットの溶液循環回路の途中には、三方バル ブカもなる濃縮ユニットの処理液回収口が設けられており、濃縮の操作中は溶液循 環回路のみが開通するようにしている。システム全体に PBSを充填し、アルブミン以 上のタンパク質を分子ふるいにより分画する膜分離ユニットとタンパク質を濃縮するュ ニットが直結された複合システムを作成した。
[0115] 図 4は、この実施例 5で用いた分離システムの概略図 (膜分離ユニットと濃縮ュ- ットの例）である。液の流れを矢印で示してある。血清および希釈液 (PBS)が注入ポ ンプ 100、三方バルブ 101を経て、溶液循環回路 102の中に注入されさらに循環用 ポンプ 103によって送液せられ、第 1の分離膜モジュール 105 (ミニモジュール (4) ) に注入され、溶液循環回路 102を循環する。第 1の膜分離ユニットで処理された溶液 は、膜分離膜ユニットの処理液回収口 104から得られる。次に、この溶液は、第 2分 離膜モジュール 205 (第 1のミニモジュール（5) )に注入され、 2段目循環回路 202循 環する。第 2の膜分離ユニットで処理された溶液は、処理液回収口 2段目の膜分離ュ ニットの処理液回収口 204から得られる。さらに、この溶液は、第 3の分離膜モジユー ル 305 (第 2のミニモジュール（5) )に注入され、 3段目溶液循環回路 302を循環する 。第 3の膜分離ユニットで処理された液は、処理液回収口 304から得られる。さらに、 この処理液は、濃縮膜モジュール 405 (ミニモジュール (6) )に注入され、濃縮ュニッ ト循環回路 402を循環する。その際、濃縮膜モジュールカゝら透過した液は濃縮ュ-ッ トの濾液出口 404から取り出され、廃棄される。透過、濃縮の操作終了後、濃縮膜モ ジュールの循環回路 402に残っている溶液は濃縮ユニットの処理液回収口 407を開 放することにより取り出される。
[0116] 具体的条件は以下のとおりである。 1mlの血清を 0. 2mlZminで 1段目の膜分離 ユニットに加えた後、 1段目の膜分離ユニット、 2段目の膜分離ユニット、 3段目の膜 分離ユニット共に流量 5. OmLZminの条件で各溶液循環回路を循環し、各モジュ ールの濾過流量 0. 2mLZminの流速で 20°C、 4時間濾過を実施した。この時、濾 過された容量分の PBSを 0. 2mlZminで注入ポンプ 100から加えて、各分離ュ-ッ トおよび濃縮ユニットを循環する液量を一定に保った。
[0117] 4時間の運転後にバルブ 407から取り出した溶液のアルブミン濃度は、 0. 490mg Zl、 j8 2—ミクログロブリン濃度は 0. 502mgZLであり、原液として用いたヒト血清中 の総タンパク質濃度は 49000mg/l、アルブミン濃度は 31200mg/L、 2—ミクロ グロブリン濃度は 1. 19mgZLであった。原液として用いたヒト血清の総タンパク質量 は 196000 μ g、アルブミン量 124800 μ g、 β 2—ミクログロブリン量は 4. 76 μ gであ つたのに対して、濾液は 3. 7mlで、アルブミン量 1. 81 g、 β 2—ミクログロブリン量 は 1. 86 gであり、 j8 2—ミクログロブリン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去 することができた。これらの結果より、総タンパク質濃度に対するアルブミンの組成比 率は 0. 0297であった。また、総タンパク質に対する j8 2—ミクログロブリンの濃度はヒ 卜血清中の 0. 0000243に対して據液中では 0. 0304であり、 1253倍に増カロしてい た。
(比較例 3)
市販の平膜を用いた分離システム (ポリエーテルスルホン膜使用 ）を用い、 3000r pm、の条件下で、 PBSで 4倍に希釈した血清 4. 7mlの濾過を行った。
[0118] アルブミン濃度は 5755mgZl、 j8 2—ミクログロブリン濃度は 0. 534mgZlであり、 原液として用いたヒト血清中のアルブミン濃度は 128. 5mgZl、 j8 2—ミクログロブリン 濃度は 0. 446mgZlであった。原液として用いたヒト血清は、アルブミン量 27049 g、 β 2—ミクログロブリン量は 2. 51 μ gであったのに対して、濾液はアルブミン量 578 U g, β 2—ミクログロブリン量は 2. 01 μ gであった。 β 2—ミクログロブリンとァノレブミン と透過比率 (ここでは濾液の濃度を原液の濃度で除した値を透過率とし、 β 2—ミクロ グロブリンの透過率をアルブミンの透過率で除した値を透過比率とした）は 40と低力 つた。アルブミンの濃度組成比も 0. 32と高かった。
(実施例 6) 実施例 5のミニモジュール (6)に内蔵する中空糸膜に置き換えて、実施例 2のミニ モジュール（2)で用いた中空糸膜を用いた以外は実施例 5と同様の複合システムを 作成した。
[0119] 実施例 5と同様に lmlの血清を処理し、 4時間に処理回収口 407から取り出した液 のアルブミン濃度は 0. 3mgZl、 j8 2-ミクログロブリン濃度は 0. 515mgZLであり、 原液として用いたヒト血清中の総タンパク質濃度は 49000mgZl、アルブミン濃度は 31200mgZL、 j8 2—ミクログロブリン濃度は 1. 19mgZLであった。原液として用い たヒト血清の総タンパク質量は 196000 μ g、アルブミン量 124800 μ g、 β 2—ミクログ ロブリン量は 4. 76 /z gであったのに対して、濾液は 3. 8mlで、アルブミン量 1. 141 g、 j8 2—ミクログロブリン量は 2. 0 μ gであり、 β 2—ミクログロブリン量を維持しなが ら、アルブミンを大幅に除去することができた。これらの結果より、総タンパク質濃度に 対するアルブミンの組成比率は 0. 02であった。また、総タンパク質に対する j8 2—ミク ログロブリンの濃度はヒト血清中の 0. 0000243に対して濾液中では 0. 0343であり 、 1414倍に増カロしていた。
産業上の利用可能性
[0120] 本発明の方法または調整装置によれば、分析精度が向上した生体成分を含有す る溶液を得ることができ、この溶液は医薬研究および臨床現場におけるプロテオーム 解析の試料として好適である。

Claims

請求の範囲
[I] 生体成分含有溶液を、少なくとも β 2—ミクログロブリンとアルブミンの透過比率が 50 以上である分離膜に供給し、分離膜により透過させることを特徴とする、総タンパク質 に対するアルブミンの濃度組成比が 0. 3未満である生体成分の組成が変化した溶 液の調製方法。
[2] 前記分離膜の透過比率が 70以上であることを特徴とする請求項 1記載の溶液の調 製方法。
[3] 前記濃度組成比が 0. 1未満であることを特徴とする請求項 1記載の溶液の調製方法
[4] 生体成分含有溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロブリンの組成比率に対する、 生体成分の組成が変化した溶液の総タンパク質中の j8 2—ミクログロブリンの組成比 率が、 10倍以上であることを特徴とする請求項 1の溶液の調製方法。
[5] 前記倍率が 100倍以上であることを特徴とする請求項 4の溶液の調製方法。
[6] 分離膜の膜内の流路が非対称構造である請求項 1の溶液の調製方法。
[7] 生体成分が血液、血漿、血清などの血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、 胸水もしくは細胞力もタンパク質を抽出した溶液であることを特徴とする請求項 1の溶 液の調製方法。
[8] 請求項 1一 7 ヽずれかの調整方法によって得られたプロテオーム解析用溶液。
[9] 請求項 1一 7いずれかの方法によって生体成分の組成が変化した溶液を調製した後
、前記溶液に含まれるタンパク質を分析することを特徴とする、生体成分に含まれる タンパク質の分析方法。
[10] タンパク質の分析手段が質量分析、電気泳動分析および液体クロマトグラフィーから 選ばれる少なくとも 1種である請求項 9記載のタンパク質の分析方法。
[II] β 2—ミクログロブリンとアルブミンの透過比率が 50以上である分離膜を内蔵するモジ ユールを有する装置であって、モジュールが分離膜の原液側に生体成分含有溶液 の原液入口、および分離膜により透過した透過液の出口を少なくとも有することを特 徴とする、生体成分の組成が変化したプロテオーム解析用の溶液を調製する装置。
[12] 分離膜を内蔵し、前記分離膜の原液側流路に連結された原液入口および原液出口 、ならびに分離膜の透過液の出口を有するモジュール、
前記原液入口と前記原液出口とを連結し、途中にポンプおよび分離用対象液入口 を有する溶液循環回路、ならびに
前記分離用対象液入口の上流の位置に、または前記溶液循環回路の途中の位置 に、設けられた希釈液流入口、
を具備することを特徴とする生体成分の組成が変化した溶液を調製するための液流 回路。
[13] 請求項 12の液流回路を少なくとも 2個含み、 1の液流回路の分離対象液出口と他の 1の液流回路の分離対象液入口が液流路で直接または間接に連結されて 、ることを 特徴とする生体成分の組成が変化した溶液を調製するための装置。
[14] 分離膜を内蔵するモジュールを用い、分離膜の原液側に生体成分含有溶液を流入 させ、原液側の液をモジュールの外に設けられた溶液循環回路を通じて循環させ、 分離膜を透過した液を生体成分の組成が変化した溶液として取り出す工程であって 、生体成分含有溶液の流入開始後、生体成分含有溶液への希釈液を、モジュール に内蔵した分離膜の原液側に追加流入させることを特徴とする、生体成分の組成が 変化した溶液の調製方法。
[15] 分離膜の原液側に流入する生体成分含有溶液の流量 Ql、透過した液の流量 Q2が 、 0<Q2ZQ1< 1を満たす条件で分離されることを特徴とする請求項 14に記載の 溶液の調製方法。
[16] Q2ZQ1が、 0. 005≤Q2/Q1≤0. 5である請求項 15に記載の溶液の調製方法。
[17] 透過した液の流量 Q2と分離膜の原液側に流入する生体成分含有溶液および希釈 液の流量の和 Q3が 0. 5≤Q2/Q3≤1. 5を満たすものである請求項 14に記載の 溶液の調整方法。
[18] Q2ZQ3がおよそ 1である請求項 17に記載の溶液の調製方法。
[19] 希釈液に、生理食塩水または緩衝溶液を用いることを特徴とする請求項 14記載の溶 液の調整方法。
[20] 生体成分が血液、血清などの血液由来物、尿、腹水、唾液、涙液、脳脊髄液、胸水 もしくは細胞カゝらタンパク質を抽出した溶液であることを特徴とする請求項 14溶液の 調製方法。
[21] 2個のモジュールを用い、第 1のモジュールで請求項 14の調製方法で得られた溶液 を用い、さらに第 2のモジュールで請求項 14の調製方法を行うことを特徴とする生体 成分の組成が変化した溶液の調製方法。
[22] 生体成分含有溶液を少なくとも 2工程の処理を行うことによって、生体成分含有溶液 カゝら生体成分の組成が変化した溶液を調製する方法であって、前記工程が
(1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を吸着する工程、
(2)分子量がアルブミン以上のタンパク質を分子篩いにより分画し、一部または全部を 除去する工程および
(3)タンパク質を濃縮する工程
カゝら選ばれる少なくとも 2工程を連結して用いることを特徴する生体成分カゝら組成が 変化した溶液を調製する方法。
[23] 前記 (1)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスルホン 、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、 ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリ プロピレン、力もなる群より 1種類以上選択される素材を含む材料を用いることを特徴 とする請求項 22に記載溶液の調製方法。
[24] 前記 (2)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスルホン
、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、 ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群より 1 種類以上選択される素材を含む分離膜を用いることを特徴とする請求項 22に記載の 溶液の調製方法。
[25] 前記 (3)の工程に、セルロース、セルロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスルホン 、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、 ポリアクリロニトリル、ポリエチレンおよびポリプロピレン力もなる群より 1種類以上選択 される素材を含む分離膜を用いることを特徴とする請求項 22に記載の溶液の調製方 法。
[26] ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、ポリフエノール、ブルー色素、 2価金属ィォ ンおよびアルキル基含有化合物からなる群より 1種類以上選択される物質が表面に 固定された素材を (1)の工程または (2)の工程に用いる請求項 22に記載溶液の調製 方法。
[27] 界面活性剤、乳化剤、有機溶媒、アルコール、エチレンダルコール、ポリプロピレング リコール、ポリエチレンィミン、アミノメチルビリジン、硫酸プロタミン、硫酸アンモ-ゥム 、ポリフエノール、ブルー色素、カオトロピック塩およびアルキル基含有化合物からな る群より 1種類以上選択される物質を (1)の工程または (2)の工程における水溶液に添 加することを特徴とする請求項 22記載の溶液の調製方法。
[28] 生体成分含有溶液がヒト由来成分の検体を含むことを特徴とする請求項 22溶液の 調製方法。
[29] (1)分子量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を吸着する手段、（2)分子 量がアルブミン以上のタンパク質の一部または全部を分子篩いにより分画する手段 および (3)タンパク質を濃縮する手段力 選ばれる少なくとも 2種の手段を有し、前記 選ばれた手段同士が流路によって連結されていることを特徴とする生体成分含有溶 液から組成が変化した溶液を調製する装置。
[30] 液体クロマトグラフ、電気泳動装置または質量分析装置に連結できる液流出路を有 する請求項 29の溶液を調製する装置。
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