WO2005027969A1

WO2005027969A1 - 視神経障害を伴う眼疾患の治療剤

Info

Publication number: WO2005027969A1
Application number: PCT/JP2004/014446
Authority: WO
Inventors: Shinji Yoneda; Rie Yamamoto; Hideaki Hara
Original assignee: Santen Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2005-03-31
Also published as: EP1666068A4; US20060287246A1; EP1666068A1

Abstract

本発明は、セクレターゼ阻害活性を有する化合物の新たな医薬用途を探索することを目的とする。セクレターゼ阻害活性を有する化合物は、顕著な網膜神経細胞死抑制作用を有するので、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用である。

Description

明細書視神経障害を伴う眼疾患の治療剤

技術分野

本発明は、セクレターゼ阻害剤を有効成分とする網膜神経細胞の保護剤であり、特に網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤に関する。背景技術

網膜は、外部からの光を受容する機能を有しており、視機能に関して重要な役割を果たしている。構造的には網膜色素上皮層を始め、内網状層、神経節細胞層、神経線維層等の 1 0層から成る、厚さ 0 . 1〜0 . 5 mmの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在するが、光の照射開始時と終了時によく応答することから、この神経細胞は光強度の検出器として働くと考えられている。神経節細胞層には、網膜のもっとも内側に位置する神経節細胞（以下「R G C」とする。）が存在しており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層には、網膜中心動静脈の分枝である網膜血管が走行しており、網膜神経細胞に酸素および栄養を供給する役割を担っている。

ところで、網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化等の要因により閉塞または狭窄すると網膜循環に障害が生じ、網膜神経細胞への酸素ならびに栄養の供給が閉ざされる。網膜循環障害は、網膜疾患の中でも特に重要な位置を占めており、網膜循環障害により酸素や栄養の供給が不足すれば、最終的には網膜神経細胞は死に至り、視神経障害が引き起こされる。視神経障害を伴う症状の代表的な例として、網膜静脈や網膜動脈が閉塞あるいは狭窄した網膜血管閉塞症、網膜剥離まで引き起こす可能性のある糖尿病網膜症、視機能の障害が出現する虚血性視神経症がある。さらに、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などにおいても、この網膜神経細胞死が発症に深く関与すると考えられている。緑内障は、適切に治療されなければ失明に至る重篤な視機能障害をもたらす眼疾患のひとつである。緑内障においては網膜神経細胞のうち特に R G Cが選択的に障害を受け、視神経障害が引き起こされる結果、視野障害へと進行していくことから、 R G C障害を予防あるいは最小限に抑える治療を考えることが究極的な緑内障治療につながるという、いわゆる「ニューロプロテクション」という考え方が確立されつつある（眼科， , 251-273, 1998) 。

緑内障性視神経障害の詳細なメカニズムは未だ明らかではないが、眼圧上昇により視神経が直接圧迫され、視神経萎縮が生ずるという機械的障害説と視神経乳頭の循環障害が視神経萎縮の主因であるという循環障害説が提唱されており、これら機械的障害と循環障害に基づく両メカニズムが複雑に関与していると考えられている。そして、機械的障害および循環障害は、いずれも視神経軸索輸送障害を引き起こし、この軸索輸送障害に伴って神経栄養因子の供給が途絶することが R G C障害の一因になっていると考えられている（眼科， , 1413-1416, 2002 ) 。また、グルタミン酸は網膜内の神経伝達物質の一つであるが、何らかの原因によりこのグルタミン酸シグナルカスケ一ドが過度に活性化することも R G C障害の一因であると考えられている（Surv. Ophthalmol. 8, S38-S46, 2003

) o

以上のことから、 R GCなどの網膜神絰細胞に対して保護効果を有する薬物が存在すれば、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレ一ベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療に有用であることが期待される。

他方、セクレターゼとしては、 α—、 J3—およびァ—のサブタイプが知られているが、それらのうち /3—またはァーセクレ夕一ゼに対して阻害活性を有する化合物は、）3—アミロイドペプチドの生成を抑制し、アルツハイマー病の治療に有効であることが報告されている（特表 2 0 0 1 - 5 0 3 7 8 2号公報、特表平 1 1 - 5 0 6 9 2 3号公報）。しかしながら、網膜疾患や緑内障などの眼疾患に関して、セクレターゼ阻害活性を有する化合物がいかなる薬理作用を示すかについては全く検討されていない。発明の開示

セクレターゼ阻害活性を有する化合物の新たな医薬用途を探索することは非常に興味ある課題である。

本発明者は、 βーセクレターゼ阻害剤ゃァーセクレターゼ阻害剤などのセクレターゼ阻害剤について初代培養した網膜神経細胞、 RGCおよびラットを用いて薬理試験を実施したところ、セクレターゼ阻害剤が優れた細胞死抑制効果を発揮することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、セクレターゼ阻害剤を有効成分とする RGCなどの網膜神経細胞の保護剤であり、かかるセクレ夕一ゼ阻害剤は網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用である。

本発明において、セクレ夕一ゼ阻害剤は、セクレターゼ阻害活性を有する化合物であれば特に制限されず、例えば /3—セクレターゼ阻害剤であっても、 r—セクレタ一ゼ阻害剤であってもよい。セクレターゼ阻害剤は、 US 2 0 0 3/0 1 2 5 2 5 7、特表 2 0 0 1— 5 0 3 7 8 2、 Biochem. Biophys. Res. Commun., 268, 133-135 (2000) 、 Int. J. Pept. Protein Res., 20. 16-25 (1982)、特開 2 0 0 2— 3 7 7 3 1、 US 2 0 0 2/0 0 1 3 3 1 5、 US 2 0 0 2/0 1 1 5 6 1 6、 US 2 0 0 3/0 0 5 5 0 0 5、 US 2 0 0 3/0 1 0 9 5 5 9, US 2 0 0 3/0 1 3 5 044などに記載されており、具体例としては、ダルタミル一バリルーァスパラギル一 3—ヒドロキシー 6—メチルーァ一ァミノヘプタノィルーバリルーァラニルーダルタミル一フエ二ルァラニンアミド、 N—ベンジルォキシカルポ二ルーパリルーロイシル一口イシナールなどの β—セクレターゼ阻害剤、 Ν— (3， 5—ジフルオロフェニルァセチル） —L一ァラニルー（S) —フェニルダリシン一メチルエステル、 Ν—ベンジルォキシカルポ二ルー S—（ίーブチル）システィルーィソロイシル一口イシナ一ルなどのァーセクレ夕一ゼ阻害剤などが挙げられる。本発明のセクレターゼ阻害剤による網膜神経細胞の保護作用は、後述する血清除去によつて細胞死を惹起したラット胎児培養網膜神経細胞を用いた薬理試験、グルタミン酸によって細胞死を惹起したラット培養 R G Cを用いた薬理試験、およびラットの軸索圧迫誘発網膜障害に対する薬理試験において、 /3—セクレターゼ阻害剤、ァーセクレターゼ阻害剤などのセクレターゼ阻害剤が優れた網膜神経細胞死抑制効果を発揮することに基づくものである。

本発明のセクレターゼ阻害剤は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤または配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。

本発明に係るセクレターゼ阻害剤は、非経口でも、経口でも投与することができる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが、経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、汎用される技術を用いて製剤化することができる。例えば、点眼剤であれば、添加物として、等張化剤、緩衝剤、 pH調節剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合することができる。また、 pH調節剤、増粘剤、分散剤などを添加することにより、薬物を懸濁化させて、安定な点眼剤を得ることもできる。等張化剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール等を挙げることができる。緩衝剤としては例えば、リン酸、リン酸塩、クェン酸、酢酸、 ε -アミノカプ口ン酸等を挙げることができる。

p H調節剤としては、例えば塩酸、クェン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を挙げることができる。

可溶化剤としては、例えばポリソルベート 8 0、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0、マクロゴール 4 0 0 0等を挙げることができる。増粘剤、分散剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリピニルピロリドン等を、また、安定化剤としては、例えばェデト酸、ェデト酸ナトリゥム等を挙げることができる。

保存剤（防腐剤）としては、例えば汎用のソルビン酸、ソルピン酸カリウム、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム、パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸プロピル、クロロブタノ一ル等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。

点眼剤の P Hは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、 4 . 0 ~ 8 . 5 の範囲が好ましく、また、浸透圧比を 1 . 0付近に設定することが望ましい。また、注射剤には、溶液、懸濁液、乳濁液および用時液中に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤が包含され、例えば薬物を液中に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。

投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、点眼剤であれば 0 . 0 0 1 - 1 0 % (w/ v ) のものを 1 日 1回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常 1 日 0 . 0 0 0 1〜 l m gを 1回または数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常 1 日当り 1 0 ^ g〜 1 gを 1回または数回に分けて投与することができる。

後述する薬理試験の項で詳細に説明するが、培養液中にセクレターゼ阻害薬を添加すれば培養網膜神経細胞死および培養 R G C死を顕著に抑制することができた。またラットの軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を検討したところ、セクレ夕ーゼ阻害薬は R G Cに対して顕著な細胞死抑制作用を示した。これらのことから、本発明のセクレ夕一ゼ阻害剤は、網膜神経細胞の保護剤、および網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用であることがわかる。図面の簡単な説明

図 1は、血清除去による、 GL— 189を用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 2は、血清除去による、 Z— VL L— CHOを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 3は、血清除去による、 DAPMを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 4は、血清除去による、ァ X I Vを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 5は、グルタミン酸添加による、 GL— 1 89を用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 6は、グルタミン酸添加による、 Z— VL L— CHOを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 7は、グルタミン酸添加による、 DAPMを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 8は、グルタミン酸添加による、 r X I Vを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。

図 9は、 0八？ぉょび2—¥ししー（：1^0のラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下に、薬理試験および製剤例を掲げて、本発明を詳しく説明するが、これらは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

[薬理試験]

セクレターゼ阻害活性を有する化合物の網膜神経細胞保護作用を検討するべく、 /3セクレターゼ阻害薬であるダル夕ミル一パリルーァスパラギル一 3—ヒドロキシー 6—メチル一ァーアミノヘプタノィル—パリルーァラニルーダル夕ミル— フエ二ルァラニンアミド（以下「GL— 1 89」とする。 CALB I OCHEM 社製）、 |3セクレターゼ阻害薬である N—ベンジルォキシカルポ二ルーバリルーロイシルーロイシナール（以下「Z— VLL— CH〇」とする。 CALB I OC HEM社製）、ァセクレターゼ阻害薬である N— (3， 5—ジフルオロフェニルァセチル） - L—ァラニルー（S) 一フエ二ルグリシン一メチルエステル (以下「DAPM」とする。 C ALB I OCHEM社製）、 rセクレターゼ阻害薬である N—ベンジルォキシカルポ二ルー S—（ί—プチル）システィル—イソロイシル —口イシナ一ル（以下「ァ X I V」とする。 C AL B I OCHEM社製）を用いて、（Α) 血清除去によって惹起したラット胎児網膜神経培養細胞死に対する作用、（Β) グルタミン酸添加によって惹起したラット新生児培養 RGCに対する作用、（C) ラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を以下の方法で検討した (Α) 血清除去によって惹起したラット胎児網膜神経培養細胞死に対する作用 ( 1 ) GL— 1 89の作用

B r a i n R e s . ， 967， 2 5 7— 6 6， 200 3に記載された試験方法に準じて、ラット胎児（1 8日齢）の網膜神経細胞を単離し、ポリエチレンィミンコートされたプラスチックカバ一スリップ上に播種後、 1 0%ゥシ胎児血清を含有させたイーグル基礎培地中にて 5日間培養した。培養 6日目よりシトシンァラビノシド（培地中濃度 1 0 /iM) を添加した 1 0 %ゥシ胎児血清を含有させたイーグル基礎培地中で培養をすることにより非ニューロン性の細胞の増殖を抑制した。培養 8日目に培地を 10 %ゥマ血清を含有させたイーグル基礎培地に変更し 24時間培養した後、試験に用いた。なお、培養は 3 7°C、 5 %C0₂条件下で行った。培養 9日目に溶媒（0. 1 %ジメチルスルホキシド）あるいは GL 一 1 8 9 (1 M、 1 0 /ζΜ) を含有し、かつ、血清を含まないイーグル基礎培地中にて網膜神経細胞を 24時間インキュベート（37 、 5 % CO ₂) した後、細胞の生死判定を行い、 0. 1 %ジメチルスルホキシドを添加した 1 0 %ゥマ血清を含有させたィグル基礎培地中で 24時間ィンキュベ一トした対照群 (1 00 %) に対する各群の生存率を算出した。細胞の生死判定は卜リパンプル一染色法により実施した。すなわち、 1. 5 %トリパンブル一溶液で 10分間細胞を染色した後、 1 0 %中性ホルマリン溶液にて固定し、生理食塩液で洗浄した後、染色細胞は死細胞として、また、非染色細胞は生存細胞として判定し、顕微鏡下で死細胞数および生存細胞数（総計数細胞数 200以上）を計数した。実験結果を図 1のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。

(2) Z—VLL— CHOの作用

GL— 1 8 9に代えて、 Z— VLL— CHO (1 ηΜ、 10 n M) を用いる以外は、上記（1) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 2のグラフに示す。

(3) DAPMの作用

GL— 1 89に代えて、 DAPM (1 0 nM、 1 00 n M) を用いる以外は、上記（1) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 3のグラフに示す。

(4) r X I Vの作用

GL— 1 89に代えて、 rX I V (1 ηΜ、 Ι Ο ηΜ) を用いる以外は、上記 (1) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 4のグラフに示す。

(B) グルタミン酸添加によって惹起したラット新生児培養 RGCに対する作用 ( 1 ) G L— 1 89の作用

B r a i n R e s . , 9 67， 257— 6 6, 2003に記載された試験方法に準じて、ラット新生児（7日齢）の RGCを 2—ステップパンニング法により単離した。培養培地としては、脳由来神経栄養因子（BDNF、 50 n g/m 1 ) 、繊毛様神経栄養因子（CNTF、 50 n g/m 1 ) 、 L一グルタミン（2 mM) 、ぺニシリン-ストレプトマイシン ( 1 00単位/ m \ - 1 0 0 g/m 1 ) 、フオルスコリン（5 μΜ) 、および Β— 27添加物を含有させた神経細胞培養用培地を用いた。 RGCを単離後、溶媒（0. 1 %ジメチルスルホキシド) あるいは GL— 1 89 ( 1 ^Μ) を含有する培養培地中で 24時間インキュべ一トした後、培養液中の濃度が 2 5 Μになるようにグルタミン酸を添加し、さらに 2日間インキュベートした。インキュベートは（3 7°C、 5 % C O ₂) の条件下で行った。対照群は同期間溶媒（0. 1 %ジメチルスルホキシド) 含有培養培地中でィンキュベ一トした。ダルタミン酸処置後、 C a 1 c e i n— AMを用いて生存 RGCの同定を行った。すなわち、 1 β g/m 1の C a l c e i n— A M溶液中で 1 5分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、 C a l c e i n陽性かつ細胞直径以上の長さの突起を有する細胞を生存 RGCとみなし、蛍光顕微鏡下で生存 RGC数を計数し、対照群と同数の RGCが生存していた際を 1 00 %とする生存率を算出した。実験結果を図 5のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、 '誤差線は標準誤差を示す。

(2) Z— VLL— CHOの作用

GL— 1 89に代えて、 Z— VLL— CH〇（Ι Ο Ο ηΜ) を用いる以外は、上記（1) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 6のグラフに示す。

(3) DAPMの作用

GL- 1 8 9に代えて、 DAPM (1 0 nM) を用いる以外は、上記（ 1 ) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 7のグラフに示す。

(4) r X I Vの作用

GL- 1 8 9に代えて、 rX I V (1 0 nM) を用いる以外は、上記（1) と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図 8のグラフに示す。 (C) DAPMおよび Z— VL L— CHOのラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用

J . 0 c u 1. P h a rma c o l . T h e r . , 1 8, 241 - 9, 2 00 2に記載された試験方法に準じ、 5 %フルォロゴ一ルドをラット中脳上丘へ注入することにより、 RGCを逆行性標識した。フルォロゴールド注入の 7日後、ラットをアト口ピン点眼液で散瞳させ、 3 %ハロタンで麻酔導入し、 1 %八口タンで維持した。（ハロタンは、酸素 0. 5 L/分、笑気 1. 5 L/分で気化させた）。実体顕微鏡下で視神経を露出させ、眼球から 1〜 2mmの位置にある軸索を 60 gの圧力のクリップで 30秒間挟むことにより軸索圧迫処置を行った。軸索圧迫処置の 5分後に溶媒（0. 1 %ジメチルスルホキシド) 、 DAPM ( 1 00 0 pmo 1 艮）ぁるぃはー乙しー。！"！。（l O O pmo l Z眼）を硝子体内投与した。軸索圧迫処置の 7日後に眼球を摘出し、 4%パラフオルムアルデヒド液中 4°Cで 1時間固定した。角膜、虹彩、水晶体を除去し、 4%パラフォルムアルデヒド液中 4ででさらに 30分固定した後、網膜を花弁状に 6分割し、フラットマウント標本を作製した。蛍光顕微鏡および CCDカメラを用いて、 6 分割した各区画の視神経乳頭部から約 1. 5 mmの部位および網膜の端から 0. 5mmの部位それぞれを中心とした画像を取得し（各網膜につき計 1 2枚）、画像解析ソフト Op t i ma sを用いて解析を行い、平均 RGC密度を算出した。実験結果を図 9のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。

[製剤例]

製剤例 1 (点眼剤）

処方： GL - 1 89 1 m g

濃グリセリン 250 m g ポリソルベート 80 200 m g リン酸ニ水素ナ卜リゥムニ水和物 20 m g 1 N水酸化ナトリゥム

1 N塩酸

滅菌精製水滅菌精製水に G L— 1 8 9およびそれ以外の上記成分を加え、十分に混合して点眼剤とする。製剤例 2 (錠剤）処方： D A P M 1 m g

乳糖 6 6 . 4 m g トウモロコシデンプン 2 0 m g カルポキシメチルセルロースカルシウム 6 m g ヒドロキシプロピルセルロース 6 m g ステアリン酸マグネシウム ― 0 . 6 m g 合計 1 0 0 m g

D A P M、乳糖およびトウモロコシデンプンを混合機中で混合し、その混合物にカルポキシメチルセルロースカルシウムおよびヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシゥムを加えて混合し、打錠機で打錠する。産業上の利用可能性

本発明は、セクレターゼ阻害剤を有効成分とする網膜神経細胞の保護剤であり、特に網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療に有用な治療剤を提供する。

Claims

請求の範囲

1 . セクレターゼ阻害剤を有効成分とする網膜神経細胞の保護剤。

2 . セクレターゼ阻害剤を有効成分とする視神経障害を伴う眼疾患の治療剤 <

3 . セクレターゼ阻害剤が —セクレターゼ阻害剤またはァーセクレ夕

—ゼ阻害剤である請求項 2記載の治療剤。

4 . 眼疾患が緑内障である請求項 2記載の治療剤。

5 . 眼疾患が網膜疾患である請求項 2記載の治療剤。

6 . 網膜疾患が網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症またはレーベル病である請求項 5記載の治療剤。