WO2005025737A2

WO2005025737A2 - Molekül-arrays und verfahren zu deren herstellung

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Publication number: WO2005025737A2
Application number: PCT/AT2004/000316
Authority: WO
Inventors: Stefan Howorka; Patrick Pammer
Original assignee: Upper Austrian Research Gmbh
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2004-09-16
Publication date: 2005-03-24
Also published as: EP1663473A2; AT501110A1; US20070087382A1; WO2005025737A3

Abstract

Beschrieben werden Anordnungen zur Bindung von Molekülen, umfassend bindungsfähigen Funktionalitäten, welche als molekulareinzelne Funktionalitäten oder in Gruppen gleicher Funktionalitäten auf einem festen Träger vorliegen, wobei die Dichte der einzelnen Funktionalitäten bzw. Gruppen von Funktionalitäten auf dem festen Träger von 10<4> bis 10<10> einzelnen bzw. gruppierten Funktionalitäten pro cm<2> beträgt, sich bei zumindest 95 %, insbesondere bei zumindest 99 %, der einzelnen bzw. gruppierten Funktionalitäten innerhalb eines gewählten Abstandes d von einer (beliebigen) einzelnen bindungsfähigen Funktionalität oder Gruppe von Funktionalitäten keine weiteren bindungsfähigen Funktionalitäten befinden.

Description

Molekül-A rays und Verfahren zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft Anordnungen zur Bindung von Molekülen, insbesondere zur Anwendung als Biochips bzw. zur Analyse mittels der "Single Dye Tracing"-Scan oder "Time delayed Integration"-Methode .

Die jungen Forschungsgebiete wie Genomik und Proteo ik stellen die Biotechnologie vor große Herausforderungen, wobei die Einzelmolekül-Mikroskopie eine wichtige Stellung einnehmen kann. Gängige Methoden der Genomik und Proteomik basieren auf Untersuchungen mittels DNS- oder Protein-Arrays, bei deren Auswertung die Ensemble-Eigenschaften vieler Biomoleküle ermittelt werden (Arbeitman et al., 2002; MacBeath et al., 2000; Pollack et al., 1999; Zhu et al . , 2001). Die Einzel-Molekül Mikroskopie bietet hingegen einen qualitativen Vorteil von grundsätzlicher Bedeutung, da einzelne Biomoleküle untersucht werden können, ohne dass deren relevante Eigenschaften durch Mittelung der Ensemble- Beobachtung verzerrt oder ausgedünnt werden würden (Clausen- Schaumann et al., 2000; Mehta et al., 1999; Nie et al., 1997; Schmidt et al., 1996; Segers-Nolten et al . , 2002; Xie et al., 1999) . Beispiele für die Eigenschaften von einzelnen Molekülen sind etwa der jeweilige Satz von Mutationen eines DNS-Moleküls, oder die individuelle post-translationale Modifikation jedes einzelnen exprimierten Proteins, sowie sein Assoziationszustand mit anderen Proteinen.

Gefordert ist eine Technologie, die viele verschiedene Biomoleküle bzw. deren Strukturvarianten einzeln und schnell zu untersuchen gestattet, zum Beispiel Eigenschaften von DNS-Molekülen oder Art und Zahl von Boten-RNS Molekülen, die in einer Zelle bestimmten Zustands oder nach bestimmter Behandlung exprimiert vorliegen (Expressionsprofil) ; weiters die detaillierten Profile der jeweils exprimierten Proteine, d.h. Profile differenziert nach Typ, Zahl, post-translationaler Modifizierung (Phosphory- lierung, Glykosilierung, etc.), Verteilung der einzelnen Proteine in der Zelle, spezifische Protein-Protein Assoziationen, und der Effekt auf die Aktivität des Proteins.

Um eine statistisch relevante Aussage zu treffen, sollte die Zahl der gleichzeitig untersuchbaren Einzelmoleküle zumindest einige Zehnerpotenzen erreichen, etwa 10^ bis 10^, bei einer vertretbaren Datenaufnahmezeit.

Für diese Anwendung bietet sich der Einsatz von Einzelmolekül- Fluoreszenz-Mikroskopie an, im speziellen die "SDT-scan" oder "TDI" -Methode an (Hesse et al . , 2002; Schindler, 2000). Diese Methode ist seit einigen Jahre eine Routinetechnik, sowohl zur Detektion einzelner fixer oder diffundierender Moleküle an Oberflächen (Schmidt et al., 1996) als auch von einzelnen Biomolekülen in Zellen (Schutz et al., 2000; Sonnleitner et al . , 1999). Die Methode erlaubt die ultraschnelle Mikroskopie von Molekülen an Oberflächen mit gleichzeitiger Einzelmolekül-Empfindlichkeit. Das Verfahren gestattet die Analyse aller einzelnen fluoreszenzmarkierten Moleküle auf 1 crn^ in etwa 5 min mit sehr gutem Signal-Rausch-Verhältnis, und erfüllt somit eine der gestellten Forderung: Die Bereitstellung einer genügend empfindlichen und zugleich genügend schnellen Detektionsmethode .

Einzelmolekül-Nachweismethoden, speziell Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie, liefern einen wesentlichen Beitrag zur Analyse von Protein und DNA-Analyten im Grundlagen-wissenschaftlichen Bereich und dienen auch der Weiterentwicklung von biotechnologischen Methoden, die in der Zukunft für diagnostische oder therapeutische Untersuchung in der Medizin eingesetzt werden sollen.

Ein Beispiel für den Einsatz der Einzelmolekül-Methode für diagnostische Zwecke ist DNA-Hybridisierung (Korn et al . , 2003). DNA-Hybridisierung mit Hilfe von Microarrays ist eine weit verbreitete Technologie, um Nukleinsäuren im genomischen Maßstab zu untersuchen sowie für die Zwecke der Forschung, Diagnose und Therapie nutzen zu können. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie bietet aufgrund der hohen Sensitivität die Möglichkeit, die Am- plifikation der Proben-DNA zu vermeiden und damit bei Expressions-Analysen Amplifikations-Artefakte und verfälschte Aussagen über die Expressions-Niveaus zu verhindern.

Eine weitere Anwendung der Einzelmolekül-Mikroskopie ist die (Re) -Sequenzierung von z.B. menschlicher DNA (Braslavsky et al . , 2003; Levene et al., 2003), um medizinisch wichtige Varianten, etwa SNPs, der Erbinformation zu erhalten. Bei den derzeit angewandten Sequenzier-Methoden muss die Analyt-DNA amplifiziert werden, bevor die Sequenzierungs-Reaktion stattfindet. Durch den Einsatz von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie würde der Schritt der DNA-Amplifikation entfallen, und dies hätte die Verringerung des Reagenzien-Verbrauches und die erwünschte Kostenreduktion und die Beschleunigung des Sequenzierungs-Prozesses zur Folge.

Für beide Einzelmolekül-Anwendungen, DNA-Hybridisierung und im besonderen Maß DNA-Sequenzierung, sollten die einzelnen zu untersuchenden Moleküle idealerweise optisch isoliert auflösbar sein. Ist etwa der Abstand zweier DNA-Stränge geringer als die optische Auflösung, überlagern sich die Fluoreszenz-Signale von der Sequenzier-Reaktion beider Stränge, und die Sequenz der Stränge kann nicht mehr eindeutig eruiert werden.

Demnach sollten die zu untersuchenden DNA-Moleküle im Idealfall einzeln positioniert auf einem festen Substrat vorliegen. Diese Vorgabe wird in vielen publizierten Studien über Einzelmolekül- Untersuchungen nicht erfüllt. In diesen Studien werden die Moleküle ungerichtet und statistisch zufällig an einer Oberfläche gebunden, und dies hat zur Folge, dass sich auch Molekülgruppen oder Cluster an der Oberfläche ausbilden, die optisch nicht aufgelöst werden können. Um diese Oberladung mit Molekülen zu vermeiden, werden verdünnte Molekül-Lösungen eingesetzt, mit dem Nachteil, dass die Dichte an Molekülen auf der Oberfläche sehr gering wird; zu gering, um etwa die relevanten Abschnitte des menschlichen Genom auf diagnostisch indikativen Variationen hin zu untersuchen.

Mit Hilfe eines DNA-Arrays bei dem einzelne DNA-Stränge an definierten Positionen vorliegen, könnten sowohl einzelne DNA- Stränge optisch aufgelöst werden als auch eine hohe Dichte an DNA-Analyten erreicht werden. In diesem Array würden einzelne Moleküle an definierten Stellen vorliegen, sodass um ein Molekül im Radius größer oder gleich der optischen Auflösung kein weiteres Molekül vorliegt. Dieser Einzelmolekül-Array hätte den weiteren Vorteil, dass durch die Kenntnis der genauen Position des Analyten auf dem festen Substrat die Unterscheidung von Signal und Rauschen vereinfacht wird. Die Unterscheidung des Signals vom Hintergrund-Rauschen ist vor allem wichtig, wenn der DNA-Analyt im Verlauf der DNA-Sequenzierung mit fluoreszenzmarkierte Reagenzien prozessiert wird, die den Fluoreszenz-Hintergrund durch unspezifisches Binden an die Oberfläche des festen Substrates verursacht wird.

Die bisherigen Methoden und Ansätze, um Moleküle isoliert auf einem festen Substrat anzuordnen, sind mit unterschiedlichen Nachteilen behaftet, die einen technologischen Einsatz im Rahmen der Untersuchung einzelner Biomoleküle unvorteilhaft erscheinen lässt .

In der WO 00/06770 A werden Biomolekül-Arrays geoffenbart, die zwar bestimmte Abstände zwischen den Biomolekül-Spots einhalten, jedoch nur eine für viele Anwendungen unzureichend niedrige Dichte an Spots zulässt. Weiters ist auch eine spezifische Addressierbarkeit der dortigen Moleküle oder das Vorsehen mehrerer, voneinander verschiedenen Funktionalitäten nicht möglich. Im Übrigen bereiten die dort geoffenbarten Arrays Probleme im Hinblick auf unspezifische Bindungen und die Wiederverwendbarkeit dieser Arrays ist nicht gegeben.

Die beispielsweise in den WO89/09406 und W098/39688 vorgeschlagenen Arrays auf Basis von S-Layern mit Proteinen als Abstandshaltern weisen zwar eine sehr große Dichte auf, jedoch sind diese Arrays aus mehreren Gründen ungeeignet für die optische Analyse: Die Abstände zwischen den Funktionalitäten, die im Bereich von 10 n liegen sind zu klein, um eine optische Auflösung zu erlauben; die Schichten sind labil und nicht reproduzierbar aufbaubar. Weiters können keine verschiedenen Funktionalitäten, insbesondere addressierbare Funktionalitäten, vorgesehen werden.

Die WO 02/061126 stellt einen Array von Biomolekülen vor, in dem einzelne Moleküle an kugelförmige Gebilden gebunden sind, die als Abstandshalter zwischen den Molekülen fungieren. Dadurch kann der gemittelte Molekül-Abstand über die optische Auflösung eingestellt werden. Allerdings ist die Besetzung der kugelför- migen Abstandshalter mit den zu untersuchenden Biomolekülen un- gerichtet und zufällig, und dies führt entweder zu unerwünschten Doppel- oder Mehrfachbesetzungen pro Bead, oder bei einer Untermarkierung zu einer zu geringen Array-Dichte. Zudem ist die optische Auflösung zweier Moleküle auf benachbarten kugelförmigen Gebilde nur dann gegeben, wenn die Moleküle am Mittelpunkt der Gebilde gebunden sind. Da die genaue Position des Moleküls auf dem kugelförmigen Gebilde nicht definiert ist, können benachbarte Moleküle zu nahe sein und optisch nicht aufgelöst werden .

Bruckbauer (Bruckbauer et al . , 2003) beschreibt eine Anordnung von einzelnen Molekülen, die durch Absetzten einer Pipette auf das Substrat aufgebracht werden, wobei der Absetzungsprozess gekoppelt ist mit einem optischen Detektorsystem. Der Herstel- lungsprozess dieser Methode ist seriell und sehr langsam und daher für eine Anwendung im größeren Maßstab nicht geeignet. Zudem setzt die Methode voraus, dass das Biomolekül fluoreszenzmarkiert sein muss, und dies schränkt die Auswahl der zu arrayenden Moleküle ein.

Ein Array von einzelnen Biomolekülen bzw. von Gruppierungen von Biomolekülen wird auch durch Stempeln, d.h. durch die Übertragung der Moleküle von der Oberfläche eines nanostrukturierten elastischen Stempels auf die Oberfläche eines festes Substrates erreicht (Renaultt et al., 2003). Ebenso wie bei den anderen angeführten Erfindungen ist auch bei diesem Ansatz nicht gewährleistet, dass nur einzelne Moleküle an den definierten Positionen gebunden sind.

Ein Array von einzelnen Molekülen, die in kleinen optisch adressierbaren Reaktionsräumen, sogenannten Zero-Mode-Wavegui- des, lokalisiert sind, wurde vorgestellt (Levene et al . , 2003). Wie bei den anderen Methoden ist die Belegung der Reaktionsräumen mit Molekülen statistisch.

WO 02/18266 beschreibt, wie mittels Scanning Tunneling Microsco- py (STM) einzelne anorganische Atome und Moleküle auf einer Oberfläche positionsgenau angeordnet werden können. Die Arrays sollen als Speichermedien mit hoher Informationsdichte einge- setzt werden und sind aus diesem Grund nicht von biotechnologischem Interesse.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die eben geschilderten Nachteile des Standes der Technik ganz oder teilweise zu vermeiden und Arrays von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen, die eine große Dichte aufweisen, deren einzelne Bindungsbereiche genügend Abstand von benachbarten Bindungsbereichen aufweisen, die in optischen Analysesystemen genutzt werden können, adressierbare Bindungsplätze aufweisen können oder die verschiedene Funktionalitäten nutzen können. Insbesondere sollten diese Arrays für die Einzelmolekülanalyse, insbesondere unter Verwendung der SDT-Methode, nutzbar sein und den dafür erforderlichen Kriterien genügen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann auch darin gesehen werden, Anordnungen („Arrays") zur Verfügung zu stellen, die Einzelmoleküle an definierten, isolierten Positionen tragen und die mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie ausgelesen ^• werden können. Insbesondere sollen derartige Einzelmolekül-Arrays die oben erwähnten Voraussetzungen an DNA-Arrays aufweisen und eine Hochdurchsatz-Analyse von Proben ermöglichen.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Anordnung zur Bindung von Molekülen, umfassend bindungsfähige Funktionalitäten, welche als molekular-einzelne Funktionalitäten oder in Gruppen gleicher Funktionalitäten auf einem festen Träger vorliegen, wobei die Dichte der einzelnen Funktionalitäten bzw. Gruppen von Funktionalitäten auf dem festen Träger von 10^ bis 10^0 einzelnen bzw. gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro c ^ beträgt, sich bei zumindest 95 %, insbesondere bei zumindest 99 %, der einzelnen bzw. gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten innerhalb eines gewählten radialen Abstandes d von einer (beliebigen) einzelnen bindungsfähigen Funktionalität oder Gruppe von bindungsfähigen Funktionalitäten keine weiteren bindungsfähigen Funktionalitäten befinden.

Erfindungsgemäß werden unter Funktionalitäten stets bindungsfähige Funktionalitäten verstanden, wobei es erfindungsgemäß prinzipiell gleichgültig ist, ob die bindungsfähigen Gruppen auf der Oberfläche eine kovalente Bindung mit einer bindungsfähigen Gruppe auf dem zu bindenden Partnermolekül (aus einer Probe bzw. mit einem Linker) eingehen können oder z.B. nur eine Bindung realisiert werden kann, die auf elektrostatischen, ionischen und/oder hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Es ist auch gleichgültig, ob diese Bindungseigenschaften bereits „aktiviert" sind oder z.B. erst in einem herkömmlichen Aktivierungsschritt spezifisch aktiviert werden müssen. Daher kann unter einer Funktionalität gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine chemische Gruppe verstanden werden, die entweder chemisch reaktiv ist oder durch eine Aktivierung reaktiv gemacht wird. Als reaktiv wird dabei jede Art von chemischer oder physikalischer Interaktion verstanden.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen stellen eine entscheiden verbesserte Alternative zu den konventionellen Microarrays dar, insbesondere können erfindungsgemäß Dichten von 1 x 10° Molekülen oder Gruppen gleicher Moleküle oder mehr erzielt werden. Der minimale Abstand zwischen Molekülen oder Molekül- Gruppen, die mit fluoreszenzoptischer Detektion noch gerade einzeln auflösbar sein sollen, ist etwa gleich der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts, ~0,5 μm (Beugungslimit abbildender optischer Mikroskopie) . Diese prinzipielle Grenze bestimmt erfindungsgemäß in der Praxis den Minimalabstand zwischen den Molekülen oder Molekül- Gruppen zu ~ 1 μm , d.h. in einer Fläche mit dem Durchmesser von ~ 1 μm um jedes Molekül oder jede Molekül-Gruppe sollten sich keine weiteren Moleküle befinden. Dennoch sollte die Anzahl der Moleküle oder Gruppen möglichst hoch sein, d.h. in den meisten Fällen zumindest im Prozent-Bereich der bevorzugten maximalen Flächendichte von 1 x 10^/cm^ liegen, um die schnelle Datenaufnahme der SDT-scan Methode zur Geltung kommen zu lassen.

Die vorliegende Erfindung vermeidet die geschilderten Nachteile des Standes der Technik und beschreibt eine Anordnung von einzelnen Molekülen auf einem festen Substrat, wobei die Position der einzelnen Moleküle vorab bekannt ist und der Abstand, d, zwischen den einzelnen Molekülen größer ist als die optische Auflösung. Die Position der einzelnen Molekülen ist frei wähl- und bestimmbar, ebenso der Abstand zwischen den Molekülen.

Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich somit Dichten er- zielen, die zumindest um den Faktor 100 größer sind, als z.B. in der WO 00/06770 A; weiters kann die erfindungsgemäße Anordnung als geordneter Array zur Verfügung gestellt werden (im Unterschied zu den "random arrays" gemäß den WO 00/06770 A und W098/39688 A) . Schließlich können auch verschiedene Spezifitäten der Bindungsstellen vorgesehen werden und somit Multi- Komponenten-Arrays bereitgestellt werden, die auch noch wiederverwendbar sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt in der Anordnung der Abstand d von 0,1 bis 100 μm, insbesondere 0,5 bis 10 μm.

Diese Abstände erlauben eine besonders effiziente Nutzung in Zusammenhang mit optischen Methoden, insbesondere mit SDT, insbesondere im Scan-Modus gemäß der WO00/25113 A.

Die erfindungsgemäße Anordnung weist vorzugsweise zusätzlich Einheiten auf, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, wobei die Einheiten vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, insbesondere RNA und DNA, sowie Oligopeptiden und Polypep- tiden, insbesondere Antikörpern, oder organischen Molekülen, insbesondere Mitgliedern einer kombinatorischen Bibliothek.

Bevorzugter Weise beträgt in der erfindungsgemäßen Anordnung die Dichte der einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten auf dem festen Träger von 10^ bis 10°, insbesondere von 10" bis 10°, einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro c ^ .

Vorzugsweise ist die feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Anordnung zusätzlich Einheiten auf, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, und an welche Moleküle, vorzugsweise nicht kovalent, gebunden sind. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, welche durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

- Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten,

- Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypept.ide, tragen, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen über die Einheiten und Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden werden,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche entweder (i) die bindungsfähigen Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren, so dass diese bindungsfähigen Funktionalitäten ihre Bindungsfähigkeit verlieren, oder (ii) die Einheiten, die nicht an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche gebunden sind, blockieren,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und

- Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.

Vorzugsweise werden als Mittel zur (i) Inaktivierung der bindungsfähigen Funktionalitäten und zur (ii) Blockierung der Einheiten chemische Substanzen eingesetzt, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten oder Einheiten kovalent binden und diese dadurch inaktivieren oder blocken. Beispiele sind chemische Substanzen mit freien Thiolgruppen, die an bindungsfähige Funktionalitäten, wie Maleimide, binden können.

Alternativ dazu kann dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, auch durch die folgenden Schritte realisiert werden: Bereitstellen einer festen Oberfläche mit Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit aktivierbaren Funktionalitäten tragen, die an die Funktionalitäten der festen Oberfläche binden können, sofern sie durch äußere Stimuli aktiviert werden, oder

- Bereitstellen einer festen Oberfläche mit aktivierbaren Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit Funktionalitäten tragen,

- Einwirken eines äußeren Stimulus auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die aktivierten Funktionalitäten der Hilfsstrukturen bzw. der festen Oberfläche an die anderen Funktionalitäten der festen Oberfläche bzw. der Hilfsstrukturen binden und damit die Hilfsstrukturen über die Einheiten an die feste Oberfläche binden,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und

Beide Varianten nutzen ein und denselben Lösungsgedanken, indem mittels Hilfsstrukturen eine Oberfläche spezifisch und örtlich definiert aktiviert bzw. deaktiviert wird und so die erfindungsgemäß erforderlichen Parameter der Anordnungen realisiert werden.

Vorzugsweise werden zur Aktivierung der aktivierbaren Funktionalitäten äußere Stimuli, wie elektromagnetische Wellen in Form von UV-Licht sowie Veränderungen der Temperatur, eingesetzt.

Vorzugsweise werden als Hilfsstrukturen im wesentlichen kugelförmige Gebilde eingesetzt, welche aus organischen oder anorganischen Polymeren, Metallen oder Metallverbindungen bestehen. Als Beispiel einer metallhaltigen Hilfsstruktur (bead) können (als ein Beispiel unter vielen) die Produkte der Firma Dynal (z.B.: das Produkt Talon) oder BioMag®-Kügelchen (Mikro- partikel mit paramagnetischem Eisenoxid-Kern) angeführt werden. Die Dynabeads® TALON™ sind einheitliche, superparamagnetische Polystyrolkügelchen mit 1 μm Durchmesser, gekoppelt mit hoch spezifischer BD TALON™ Chemie (Tetradentat-Metallchelator bei welchem 4 der 6 Koordinationsstellen von Kobalt besetzt sind; die Imidazolringe von Histidin-Resten (in einer poly-Histidin- peptidkette können die zwei verbleibenden Koordinationsstellen einnehmen, wodurch eine Proteinbindung resultiert) .

Um mehrere verschiedene Spezifitäten vorzusehen und eine Adressierbarkeit des Arrays zu gewährleisten, weisen die Hilfsstrukturen vorzugsweise eine Markierung auf, wobei vorzugsweise mehr als eine Art von markierten Hilfsstrukturen verwendet wird.

Besonders günstig ist dabei, wenn Hilfsstrukturen mit einer Fluoreszenz-Markierung eingesetzt werden, und vorzugsweise Hilfsstrukturen mit unterschiedlicher Fluoreszenz-Markierung verwendet werden.

Vorzugsweise trägt eine beliebige Hilfsstruktur nur eine spezifische Art von Einheiten, wie organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide, wobei eine Population von Hilfsstrukturen mitje unterschiedlich belegten Einheiten verwendet wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist im erfindungsgemäßen Verfahren sowohl die spezifische Fluoreszenz-Markierung der unterschiedlichen Hilfsstrukturen als auch die spezifische Belegung der Hilfsstrukturen mit Einheiten vor Aufbringen der Hilfsstrukturen auf die feste Oberfläche bekannt.

Vorzugsweise ist aufgrund der Kenntnis der Positionen der fluo- reszenz-markierten Hilfsstrukturen auf der festen Oberfläche die chemische Identität der von der Hilfsstrukturen hinterlassenen Einheiten nach der Ablösung der Hilfsstrukturen bekannt.

Das Kontaktieren der festen Oberfläche mit den Hilfsstrukturen erfolgt vorzugsweise unter Zuhilfenahme von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Magnetkraft, elektrischer Anziehung, -Anreicherung an Zweiphasen-Grenzschichten oder Kombinationen davon.

Vorzugsweise wird als feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche eingesetzt.

Als besonders bevorzugte bindungsfähige Funktionalitäten haben sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung NH2-, SH-, OH-, COOH-, Cl-, Br-, I-, Isothiocyanat-, Isocyanat-, NHS-Ester-, Sulfonyl- Chlorid-, Aldheyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Malei id-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl-Diimidazol-, Carbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Di-azirin- Gruppen oder Kombinationen davon bewährt.

Vorzugsweise können zwischen den bindungsfähigen Funktionalitäten und den zu bindenden Einheiten oder zwischen der festen Oberfläche und den bindungsfähigen Funktionalitäten ein Spacer- Molekül vorgesehen wird.

Bei einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen folgende Schritte eingesetzt:

- Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten, vorzugsweise Maleimid-Funktionalitäten,

- Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere Nukleinsäuren oder Polypeptide, über molekulare Erkennung gebunden haben und welche terminale Thi- ol-Funktionalitäten tragen, die an die feste Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit thiolhältigem Reagenzien, vorzugsweise beta-Mercaptoethanol, welche die Funktionalitäten, insbesondere die Maleimid-Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit einem physikalischen oder chemischen Stimulus, insbesondere mit erhöhter Temperatur, welche die molekulare Erkennung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten rückgängig macht, und

- Ablösen der^" Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen folgende Schritte eingesetzt:

- Bereitstellen einer festen Oberfläche mit Funktionalitäten, insbesondere Aminen,

- Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Moleküle einer kombinatorischen Bibliothek, mit aktivierbaren Funktionalitäten, insbesondere photoaktivierbare Phenylazide, tragen, die an die Funktionalitäten, insbesondere Amin-Funktionalitäten, der festen Oberfläche binden können, sofern sie insbesondere durch einen UV-Licht-Beleuchtungsschritt aktiviert werden, wobei die Einheiten über chemisch spaltbare Funktionalitäten, insbesondere Disulfid-Brücken, an die Hilfsstrukturen gebunden sind,

- lokalisiertes Einwirken eines äußeren Stimulus, insbesondere UV-Licht, auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die Einheiten insbesondere mit den photoaktivierten Phenylaziden an die Funktionalitäten, insbesondere die Amin-Funktionalitäten, binden und damit die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, wobei der äußere Stimulus, insbesondere in Form eines evanes- zierenden Feldes von UV-Licht, eingesetzt wird und lokalisiert auf Funktionalitäten an der festen Oberfläche wirkt sowie an jenen Teilen der Hilfsstrukturen, die im Bereich des evan- szierenden Feldes sind,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, insbesondere Dithiothreitol, welche die Disulfid-Brücken zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spalten, und

Die Erfindung betrifft natürlich auch Anordnungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.

Die erfindungsgemäßen Anordnungen werden gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung im Rahmen einer Fluoreszenz-Mikroskopie-Untersuchung (vor allem für Einzelmolekül-Untersuchungen) , insbesondere der "Single Dye Tracing" (SDT) Methode, genutzt. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Bindung von Biomolekülen, insbesondere zur Bindung von An- tigenen, Liganden, Proteinen, DNS, mRNS, Toxinen, Viren, Bakterien, Zellen oder Kombinationen davon, verwendet werden und dann alle mit diesen Anordnungen mögliche Verfahren (z.B. Detetions- und Analyseverfahren) durchgeführt werden.

Weiters werden die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Untersuchung von cDNS von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte cDNSs an die Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden binden, und die Bindung für jede gebundene cDNS-Art ausgelesen werden kann, verwendet.

Die erfindungsgemäßen Anordnungen werden bevorzugt auch zur Untersuchung der Proteine von Zellen verwendet, wobei fluoreszenzmarkierte Proteine an die Anordnung von verschiedenen Antikörpern binden und die Bindung für jede gebundene Protein-Art ausgelesen werden kann.

Die Realisierung einer freien Fläche mit ~ 1 μm Durchmesser um jeden "Bindungsplatz" (einzelnes "Fängermolekül" oder eine Gruppe gleicher "Fängermoleküle") bei Flächendichten der "Bindungsplätze" im Bereich von vorzugsweise 10^ bis lO^/cm^ stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Eine weitere Besonderheit bevorzugter erfindungsgemäßer Anordnungen ist die Realisierung der Adressierbarkeit der Bindungsplätze. Für die avisierten Anwendungen sollten die Position und Anzahl der Bindungsplätze möglichst genau und a priori bekannt sein, sowie die Art der Moleküle auf jedem Bindungsplatz. Eine solche Adressierbarkeit der Bindungsplätze bezüglich sowohl Position als auch Funktion (spezifische molekulare Erkennung eines Analyt-Moleküls) stellt den Schlüssel für zugleich einfache und breite Anwendung dar. Für die erfindungsgemäße Anordnung mit z.B. Antikörpern und Oligonukleotiden ist bekannt, gegen welches Protein welcher Antikörper an welchem Ort gerichtet ist und welches Oligonukleotid mit welcher DNS oder Boten-RNS Sequenz an welcher Stelle der Matrix hybridisiert. Ohne Adressierbarkeit lässt sich kein Zusammenhang herstellen zwischen den Beobach- tungen an einer Bindungsstelle und der Art des gebundenen Moleküls. Es wäre keine Molekül-spezifische Aussage möglich, und damit würde der zentrale Vorteil der Anwendung von Einzelmolekül- Mikroskopie auf die beschriebenen Aufgabenstellungen entfallen.

Über Adressierbarkeit können Proben vieler verschiedener Biomoleküle durch Markierung mit nur einem Fluoreszenzmarker aufgeschlüsselt werden, denn der Fluoreszenz-Nachweis an einem bestimmten Ort bedeutet Bindung an ein bekanntes Fängermolekül. Ohne funktioneile Adressierbarkeit müssten die Analyt-Moleküle entweder einzeln markiert und sequentiell vermessen werden, oder viele verschiedene Farbstoffe zur farb-spezifischen Markierung gleichzeitig eingesetzt werden, was entweder undurchführbar ist oder sehr schnell an praktische Grenzen stößt.

Durch die Adressierbarkeit werden nicht nur Zugänge zu Informationen erleichtert, sondern auch die Rechenzeit für Datenaufnahme und Auswertungen wird in einen vertretbaren Bereich verschoben. Tatsächlich würde ohne Vorkenntnis alleine der Positionen der Bindungsstellen die Rechenzeit mit schnellen Rechnern und schnellen Algorithmen lange Zeit in Anspruch nehmen, da die notwendige Suche der Molekülpositionen (Maxima der Einzelmolekül-Fluoreszenz Intensität) von -10^ Molekülen rechenintensiv ist .

Die der Erfindung zugrunde liegenden Anforderungen zur Realisierung einer Molekül-Matrix (forthin abgekürzt durch "MARS, Matrix of Addressable Recognition Sites ") lassen sich ^• wie folgt zusammenfassen:

Die Bindungsstellen zur molekularen Erkennung (Fängermoleküle, einzeln oder in Gruppen gleicher) sollen auf dem "MARS" vorzugsweise in folgender Weise in Kombinationen vorliegen:

1. Isoliert detektierbar (keine Moleküle im Radius von mind. ~0,5 um Bindungsstelle) 2. Position jeder Bindungsstelle soll a priori bekannt sein 3. Funktion jeder Bindungsstelle soll a priori bekannt sein 4. Die Dichte an unterschiedlichen adressierbaren Bindungsstellen soll hoch sein (10⁶ bis 10⁸/cm² ) . Die Erfindung bezieht sich demgemäß insbesondere auf die Fabrikation von Matrizen von organischen Molekülen oder Biomolekülen (z.B. Antikörper, Rezeptoren, Peptide, Oligonukleotide oder Nukleinsäuren) , die über geeignete Hilfsstrukturen an eine Substratoberfläche übertragen und gebunden werden, dergestalt, dass die übertragenen Biomoleküle einzeln oder in Gruppen gleicher Moleküle isoliert vorliegen, d.h. isoliert beobachtbar mit optischer Einzel-Molekül Mikroskopie. Sowohl die Position als auch die Art jedes einzelnen Biomoleküls oder jeder isolierten Gruppe gleicher Moleküle ist vorab bekannt, wobei die mittlere Flächendichte der gebundenen Moleküle sehr hohe Werte erreichen soll. Die Anwendung dieser adressierbaren Molekül-Matrizen dient der Quantifizierung der spezifischen Bindung (molekulare Erkennung) von Bindungspartnern (z.B. Antigene, Liganden, Proteine, DNS, Boten-RNS, Toxine, Viren, Bakterien, Zellen, etc.), unter Einsatz der Fluoreszenz-Markierung der Bindungspartner und einer neuen, patentierten Mikroskopie Methode ("Single Dye Tra- cing, SDT"), die das Lesen dieser Molekül-Matrizen mit zugleich hoher Empfindlichkeit (Abbildung bis zu einzelnen Fluoreszenz- Moleküle) und sehr hoher Geschwindigkeit gestattet.

Im Folgenden werden nunmehr bevorzugte Realisierungen der erfindungsgemäßen Anordnungen anhand der in den Zeichnungsfiguren schematisch skizzierten Ausführungen beschrieben.

Zur Erfüllung der erfindungsgemäß gestellten Aufgaben können bevorzugter Weise Hilfsstrukturen verwendet werden (FIG. 1A) , insbesondere Kugeln (3, 11) aus organischen oder anorganischen Stoffen mit Durchmessern (18), die vom Verwendungszweck abhängen und im Bereich von ~ 0.5 μm bis -100 μm liegen. Jede Kugel (3,11) trägt "Fängermoleküle" (4,6) und zwar nur je einer Art. Durch Zugabe der Kugeln an ein Substrat (1) kommen die "Fängermoleküle" (5,7,12,13) in Kontakt zur Substratoberfläche und es wird eine kontrollierte Übertragung (8,14) von "Fängermolekülen" (5,7,12,13) von den Kugeln (3,11) auf die Substratoberfläche ermöglicht, dergestalt dass Bindungsstellen (einzelne oder Gruppen gleicher "Fängermoleküle") entstehen, die räumlich von einander getrennt sind (9,10,15,16). FIG. IB skizziert die einzelnen Schritte des Vorganges zur Übertragung exemplarisch an einem übertragenen "Fängermolekül". Die "Fängermoleküle" (z.B. Antikörper, Oligonukleotide, etc.; Symbol Y in FIG. IB) sind an die Kugeln gebunden, vorzugsweise über molekulare Erkennung durch komplementäre Biomoleküle (z.B. Epitope für Antikörper, komplementäre Oligonukleotide, etc.; Symbol X in FIG. IB) , welche unmittelbar oder über flexible Abstandsmoleküle an die Kugeloberfläche gebunden sind. Die Kugeln werden bevorzugt in flüssiger Phase dem Substrat zugegeben und lagern sich an dessen Oberfläche an. Bei geeigneten Bedingungen kann eine hexagonal dichte Packung erreicht werden. Ihre unspezifische Wechselwirkung mit dem Substrat ist schwach im Vergleich zu der spezifischen Bindung der "Fängermoleküle". Die "Fängermoleküle" (4, 6) binden (FIG. IB: 5, 7, 12, 13) kovalent oder über spezifische nichtkovalente molekulare Wechselwirkung an die Oberfläche des Substrats (1) . Die Bindungsstärke eines "Fängermoleküls" reicht aus, um die Kugel an der Bindungsstelle festzuhalten. Nach der Fixierung von "Fängermolekülen" an das Substrat werden die Kugeln von der Oberfläche entfernt (36) und die "Fängermoleküle" bleiben an der Kontaktstelle zur Kugel am Substrat zurück (9, 10, 15, 16). Bei der Ablösung der Kugeln werden die molekularen Erkennungskomplexe zwischen den übertragenen "Fängermolekülen" und den an die Kugeln gebundenen komplementären Molekülen dissoziiert. Die Bindungen der molekularen Erkennung können durch Wahl spezifischer Bedingungen der flüssigen Phase leicht und ohne Schaden der "Fängermoleküle" gelöst werden ohne dass die Fixierung der "Fängermoleküle" vom Substrat rückgängig gemacht wird. Andere Methoden zur Ablösung sind die Anwendung von Zugkräften (bei Verwendung von magnetischen Kugeln (Edelstein et al . , 2000)) oder hydrodynamischen Scherkräften.

Die von den Kugeln hinterlassenen "Abdrücke" sind entweder einzelne "Fängermoleküle" (FIG. 1A: 9,10), bei Verwendung von Kugeln entsprechend geringer Besetzungsdichte (3) , oder Gruppen von M Fängermolekülen (FIG. 1A: 15,16), bei Verwendung von Kugeln mit entsprechend hoher Dichte gebundener "Fängermoleküle" (11) . In beiden Fällen ist der Mindestabstand der Bindungsstellen (2) durch den Durchmesser der Kugeln (18) gegeben, reduziert um den Durchmesser des Bindungsbereiches (17) . Die er- reichbare Dichte von Bindungsstellen entspricht der Dichte der Übertragungs-Kugeln, die eine hexagonal dichte Packung erreichen kann. Allerdings wird durch die Zugabe von Kugeln und deren zufällige Bindung über "Fängermoleküle" nicht die maximale Dichte erreicht, jedoch ist etwa 25% der maximalen Dichte leicht erreichbar, eine für alle Anwendungen genügend hohe Dichte. Zum Beispiel, mit d = 1 μm Kugeln werden bei dieser Dichte pro cm² (vorgesehene normale Fläche der Molekül-Matrix) etwa 30 Millionen Bindungsstellen übertragen.

Die Anzahl der pro "Abdruck" übertragenen "Fängermoleküle" hängt von mehreren Faktoren ab und kann dadurch gesteuert werden. Zwei wichtige Faktoren sind die Flächendichte der "Fängermoleküle" auf der Kugel sowie die Bindungskapazität des Substrates gegenüber den "Fängermolekülen" . Zudem wird die Anzahl der übertragenen "Fängermoleküle" auch von der Größe der Kontaktfläche (FIG 1A: 17) zwischen Kugel (11) und Substrat (1) beeinflusst. Eine größere Kontaktfläche ergibt sich bei Einsatz von Substraten, die mit einer komprimierbaren Polymerschicht belegt sind. Bei Verwendung einer Beschichtung mittels linearer flexibler Polymerketten lässt sich der Radius des Kontaktbereichs (17), r, berechnen aus dem Kugeldurchmesser (18), d, und der effektiven Polymerlänge, h, mit der Beziehung r^~h*d. Für das flexible Abstandsmolekül PEG (Polyethylen Glykol) , Mw = 2000 mit maximal gestreckter Länge von 15 nm ergibt sich aus gemessenen Werten für dessen Flexibilität (Jeppesen et al . , 2001) ein dynamischer Längenbereich von h = 5 - 10 nm. Dies ergibt für eine Kugel mit einem Durchmesser (18) von d = lμm einen Bindungsbereich (17) mit dem Radius r = 70 - 100 nm. Kugeln mit hoher Besetzungsdichte (11), M "Fängermoleküle" pro r², erlauben dann die Übertragung von etwa M "Fängermolekülen". M ist in einem weiten Bereich einstellbar mit etablierten Verfahren zur Besetzung von Kugeln mit Biomolekülen über molekulare Erkennung, mit Dichten bis zu 1/50 nm² . Zum Beispiel, mit einer Kugel mit d = 1 μm lässt sich so eine Gruppe von M "Fängermolekülen" übertragen, einstellbar zwischen M = 1 und M ~ 200, mit einer statistischen Abweichung von ^-'^.

Zur Übertragung (FIG. 1A: 8) von einzelnen "Fängermolekülen" (9, 10) werden Kugeln mit geringer Besetzung von "Fängermolekülen" (3) eingesetzt. Die Zuverlässigkeit von Einzel-Molekül Übertragung lässt sich gut abschätzen für experimentell kontrollierbare Bedingungen. Die mittlere Zahl der "Fängermoleküle" an der Kugel sei <N>. Bei geringen Werten von <N> kann zufällige Verteilung angenommen werden, sowohl der Zahl N der "Fängermoleküle" auf einzelnen Kugeln (Poissonverteilung mit Mittelwert <N>) als auch der Verteilung der N "Fängermoleküle" auf der Oberfläche jeder Kugel, wobei die Wahrscheinlichkeit des Auffindens von M der N "Fängermoleküle" in der Kontaktfläche durch die Binomi- alverteilung beschrieben ist. Das liefert ohne weitere Annahmen eine Formel zur Abschätzung der Fehler-Wahrscheinlichkeit, dass im Kontaktbereich mehr als ein "Fängermolekül" gebunden ist: P (>1)=( <N>* (r/d)²)². Für <N> = 3, einem Kugeldurchmesser (18) d = lμm, und einem Durchmesser (17) der effektiven Kontaktfläche für Bindung von 2r = 200 nm (konservativer Wert, siehe oben) ist P(> 1)≤ 0.0009, d.h. höchstens jede lOOOte Kugel überträgt zwei "Fängermoleküle". Die Tatsache, dass sich statistisch an jeder ~20ten Kugel kein "Fängermolekül" befindet, hat keinen wesentlichen Einfluss auf das Ergebnis (geringfügige Reduktion der mittleren Dichte der Bindungsstellen) . Für noch geringere Besetzung der Kugeln, zum Beispiel für <N> = 1, steigt die Zuverlässigkeit der Übertragung einzelner "Fängermoleküle" an (höchstens jede lOOOOte Bindungsstelle trägt zwei "Fängermoleküle"), aber auch der Anteil der Kugeln ohne "Fängermoleküle" steigt auf -37%.

Um die Position der Abdrücke der übertragenen "Fängermoleküle" am Substrat zu bestimmen, werden die Positionen der Kugeln vor ihrer Ablösung gemessen (FIG.2: 22). Auch hierfür ist der Einsatz der SDT-scan Methode vorteilhaft. Bei Verwendung von fluoreszierenden Kugeln kann die Position jeder Kugel aus seinem Abbild (24) auf dem Pixel-Array (23) der bei der SDT- Methode eingesetzten CCD (Charged Coupled Device) Kamera sehr genau bestimmt werden, zu etwa 40 nm (Hesse et al . , 2002). Für praktische Anwendungen genügt die ungenauere Zuordnung einzelner Pixel zu jeder Kugel (FIG. 2: 26 sowie FIG. 3: 26) wodurch die limitierende Zeit der Datenauswertung wesentlich verkürzt wird, auf etwa die Zeit der Datenaufnahme. Neben den Kugeln, die zur Herstellung von Bindungsstellen benutzt werden, enthält die Matrix noch Kugeln, die als Positionsreferenzen dienen (FIG. 2: 19 und FIG. 3: 19). Diese Kugeln tragen reaktive Funktionalitäten (FIG. 2: 20) in hoher Dichte und werden an das Substrat über mehrere kovalente oder nicht-kovalente Bindungen (FIG. 2: 21) fixiert und können nicht mehr abgelöst werden. Sie sind fluoreszierend und geben ein signifikant größeres Signal (FIG.2: 25) auf dem Pixel-Array (FIG.2: 23). Nach dem Ablösen der Übertragungs-Kugeln verbleiben die Referenz-Kugeln auf dem Substrat und deren Positionen (FIG. 2: REF 1) geben ein langlebiges Raster zum Wiederfinden (FIG. 3:27) der Positionen der Bindungsstellen (FIG.3: 26). Die SDT-scan Methode erlaubt das Wiederfinden jeder Position einer Oberfläche, die zu nur 0.1 % mit zufällig verteilten Referenzkugeln bedeckt ist, mit einer Präzision weit unter einem Pixel, auch nach zwischenzeitigem Entfernen der Matrix vom SDT-scan Mikroskop.

Zur Realisation der funktionalen Adressierbarkeit (a priori Zuordnung von Typ und Zahl von "Fängermolekülen" zu den Bindungsstellen) wird Farbkodierung der Kugeln eingesetzt (FIG. 4). Farbkodierung von Kugeln aus anorganischen oder organischen Polymeren der fraglichen Größe ist Stand der Technik und wird in einigen Varianten von Firmen angeboten (Bangs, Luminex, Micro- particles, micromod, dynal) . Hierbei befinden sich fluoreszierende Moleküle verschiedener Farben in den Kugeln, wobei die Zahlen der Moleküle jeder Farbe auf definiert abgestufte Werte eingestellt werden können. Bei n verschiedenen Farben und m verschiedenen Konzentrationen jedes Fluorophors lassen sich im Prinzip mⁿ -1 in ihrer Fluoreszenz unterscheidbare Kugeln herstellen. Durch Bindung von bestimmten "Fängermolekülen" an Kugeln mit bestimmtem Farbkode wird über Fluoreszenzmessung der gebundenen Kugeln für jede Bindungsstelle (Fig. 4: 26) ein Farbkode (33, 34) gemessen, der angibt, welches "Fängermolekül" an der Bindungsstelle vorliegt. Auf Grund der extremen Empfindlichkeit der SDT-Methode können Kugeln hinsichtlich der Abstufungen ihrer Fluoreszenz-Intensität und hinsichtlich ihrer Position genau vermessen werden. In FIG. 4 ist das für 5 Abstufungen 0, 1, 2, 3, und 4 (kommerziell erhältlich sind bis zu 10 Abstufungen für den gleichen Farbstoff) der Fluoreszenz von 4 verschiedenen Farbstoffen skizziert. Für jede Farbe wird das Fluoreszenzbild der Kugelmatrix (FIG.4) getrennt aufgenommen. Dies ergibt für jede Kugelposition (FIG. 4: 26) einen Farbkode (33), zum Bei- spiel 1314 für die Kugel an der Stelle 2,7, bestimmt aus den 4 verschiedenen Fluoreszenz-Intensitäten (29, 30, 31,32) für diese Kugel. Mit den 4 Farben und den 5 Abstufungen lassen sich 54 -1 = 624 verschiedene Kugeln unterscheiden. Die optische Auflösung der SDT-scan Methode lässt vermutlich die Unterscheidung von Bibliotheken mit Tausenden verschiedener Farbkode-Kugeln zu, wobei allerdings die Erstellung solch großer Bibliotheken einen erheblichen technischen Aufwand erfordert. Für jede Kugel der Matrix wird die Pixelposition und der Farbkode einschließlich jener der Referenzkugeln (34) mit hoher Fluoreszenzintensität

(28) gespeichert. Dieser Datensatz dient nach der Ablösung (FIG. 5: 36) der Übertragungs-Kugeln der Identifizierung der Bindungsstellen innerhalb der Matrix. Die ~1 cm² große Matrix (FIG. 5: 37) von Bindungsstellen und Referenzkugeln mit einem Durchmesser von 1 μm zusammen mit den gespeicherten Positionen Pi aller Bindungsstellen, i = 1 bis -30 Millionen, und deren Funktion (Typ des "Fängermoleküls", Fi, und Zahl der "Fängermoleküle", mi, an der Stelle i) , sei mit "MARS (Pi; Fi,mi) " bezeichnet, wobei "MARS" die Abkürzung von "Matrix of Adressable Recognition Sites" ist.

Die Verwendung von Kugeln zur Übertragung von Molekülen gestattet neben der Herstellung einer biochemischen "Matrix of Adressable Recognition Sites", MARS, auch die Produktion des chemischen Analogons, einer "Matrix of Adressible Chemical reac- tion Sites", kurz MACS. Im Gegensatz zu MARS wird bei der Herstellung von MACS die Ablösung der Kugeln nicht durch Dissoziation von komplementären biochemischen Bindungspartnern wie Oligonukleotiden bewerkstelligt, sondern durch die chemische Spaltung einer kovalenten Bindung. FIG. 6A zeigt die bei der Herstellung einer MACS ablaufenden Schritte exemplarisch anhand eines Moleküls. Die zu übertragenden Moleküle sind an die Kugeln gebunden und sind aufgebaut aus einer spaltbaren Funktionalität (40) (z.B. eine Disulfid-Brücke) , einem optionalen Molekülteil (57, 58) sowie einer terminalen Funktionalität. Die Kugeln lagern sich nach Zugabe am Substrat an und binden über die terminalen Funktionalitäten an dessen Oberfläche. Zur Ablösung der Kugeln werden die spaltbaren Funktionalitäten (40) getreent (z.B. Reduktion des Disulfids durch Dithiothreitol) ; ein Anteil der gespaltenen Funktionalität (41, 42) (z.B. Thiol) sowie der optionale Molekülteil (60,61) verbleiben am Substrat (1).

MACS Molekül-Matrizen können über den hier beschriebenen Weg für zwei unterschiedliche Aufgaben hergestellt werden: Im ersten Fall (FIG. 6B-1) bezweckt man, eine Population unterschiedlicher Moleküle (57, 58) von Kugeln (3, 11) auf das plane Substrat zu übertragen (59) . Die je unterschiedlichen Moleküle liegen entweder einzeln (60) oder in Gruppen (61) in der Matrix MACS (Pi;Fi,mi) vor, wobei Pi die Position, Fi der Molekültyp und i die Anzahl von Molekülen für die Bindungsstellen, i = 1 bis 30 Millionen, ist. Ein Beispiel für eine spezifische Anwendung ist eine kombinatorische Bibliothek von organischen Substanzen auf Kugeln (Jung, 2000; Nicolaou et al . , 2002). Eine Kugel trägt nur je einen Typ einer organischen Substanz, und die Gesamtheit der unterschiedlichen Substanzen soll auf ein planes Substrat übertragen werden, um deren biologische Aktivität testen zu können. Um die Auswertung nicht zu stören, können die gespaltenen Funktionalitäten (41, 42 in FIG. 6A und FIG 6B-1; z.B. Thiol) inaktiviert werden (Methyliodid) .

Im anderen Fall (FIG. 6B-2) wird eine chemische Matrix mit identischen, gespaltenen reaktiven Funktionalitäten (41, 42) (z.B. Thiol) auf einer Oberfläche hergestellt. Die chemischen Funktionalitäten können chemisch weiter modifiziert werden, etwa mit Antikörpern oder Oligonukleotiden. Allgemein kann diese chemische Matrix beschrieben werden durch MACS(Pi;mi) wobei an der Position Pi die Anzahl mi reaktiver Funktionalitäten vorliegt.

FIG. 7 summiert einige Wege, wie "Matrices of Adressible Chemical reaction Sites" des zuletzt genannten Typs MACS(Pi,mi) (FIG. 6B-2) hergestellt und dann in MARS "Matrices of Adressable Recognition Sites" überführt werden können. Ausgehend von dem Substrat (1) werden über den Übertragungsschritt (44, 46) die Funktionalitäten (40) von Kugeln (11, 3) mit hoher oder geringer Belegungsdichte auf die Substratoberfläche übertragen. Die resultierenden Matrizen enthalten isolierte Stellen mit Gruppen von reaktiven Funktionalitäten (41), MACS (Pi,mi) (45) oder Stellen mit einzelnen reaktiven Funktionalitäten (42) , MACS (Pi,l) (48). Chemische Matrix MACS (Pi,mi) (45) kann auch in MACS (Pi,l) (48) überführt werden (47) durch Anwendung kleinerer Kugeln (38) mit sehr wenigen reaktiven Funktionalitäten (40) . Das bietet den Vorteil, hochreine Matrizen mit einzelnen reaktiver Funktionalitäten (42) herstellen zu können. Dies wird erreicht durch die zyklische Wiederholung der Bindung der kleineren Kugeln (38) mit Funktionalitäten (40) (z.B. Ortho-py- ridylsulfid) an einige der reaktiven Funktionalitäten (41) (z.B. Thiol) , welche dadurch geschützt werden vor der nachfolgenden Inaktivierung der freien Funktionalitäten am Substrat (1) z.B. durch N-Ethyl-Maleimid. Bei diesem Weg (47) kommt es nicht zu einer wesentlichen Verminderung der Flächendichte der reaktiven Stellen (42) . Natürlich kann das gleiche Verfahren auch direkt auf die Matrix "MACS(Pi, 1)" (48) angewendet werden (nicht in Fig.7 inkludiert) , um die Matrix von Fehlstellen mit mehr als einer reaktiven Funktionalität zu reinigen.

Die resultierenden chemischen Matrizen (45,48) sind universell einsetzbar und können zur Herstellung von "MARS"-Matrizen verschiedener Art eingesetzt werden. Einige Beispiele sind dargestellt. Weg (51): die Herstellung von multi-fuhktionalen Einzel-Molekül Matrizen, "MARS (Pi; Fi, 1) " (55), ist dadurch erleichtert, dass die Beladung der Kugeln, vorteilhaft kleine Kugeln

(39) mit "Fängermolekülen" (4,6) in hoher Belegung, unkritisch ist bezüglich der Flächendichte der "Fängermoleküle" auf den Kugeln, denn für deren Bindung an die Substratoberfläche steht pro Bindungsstelle nur eine reaktive Gruppe am Substrat zur Verfügung. Weg (50) : Alternativer Weg zur Herstellung von "MARS

(Pi;Fi,l)" (55), unter Benutzung kleiner, mit wenigen "Fängermolekülen" (4,6) beladener Kugeln (38). Weg (52): Matrizen mit nur einer Art von "Fängermolekül", "MARS (Pi; 1, 1) " (56), können direkt durch Zugabe von "Fängermolekülen" in die flüssige Phase

(53) erzeugt werden. Weg (49) ist eine Möglichkeit zur Herstellung von Matrizen "MARS (Pi; Fi,mi) " (54) mit einzelnen oder Gruppen von Fängermolekülen. Weg (49) geht von der Matrix MACS (Pi,mi) (45) aus und ist eine Alternative zum direkten Weg (43) zur Herstellung von "MARS (Pi; Fi,mi) " Matrizen ohne chemische Matrizen.

Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Anordnung aus zwei Komponenten aufgebaut, einer Oberfläche mit nanoskopischen Inseln und einem Adaptor, der auf dieser Insel gebunden ist . Die erste Komponente ist einfestes Substrat mit nanostrukturierter Oberfläche (Fig.16). Die Nano- strukturierung besteht in Form von Inseln mit nanoskopischen Dimensionen (Fig.16, 2), die auf dem festen Substrat aufgebracht sind (Fig.16; 1) und sich von der umgebenden, chemisch unveränderten Oberfläche durch ihre unterschiedliche chemische Zusammensetzung unterscheiden. Das Material, aus dem die Inseln zusammengesetzt sind, muss mit der festen Oberfläche, auf der es aufgebracht wird, in einer Weise wechselwirken können, dass die Insel fest und dauerhaft mit der festen Oberfläche verbunden bleibt. Auch müssen die Inseln nach dem Aufbringen auf die Oberfläche lokalisiert bleiben und dürfen sich in ihrer Ausdehnung (abgesehen von geringfügigem atomaren Abdiffundieren und leichten thermischen Effekten) nicht verändern. Die räumliche Ausdehnung der Inseln muss daher nach der Absetzung auf der Oberfläche konstant bleiben, insbesondere auch in den Messprozessen während der anschließenden Anwendung. Das Inselmaterial wird auch abhängig vom anzuwendenden Lösungsmittel gewählt; das Material sollte im gewählten Lösungsmittel inert sein, beispielsweise gegen Oxidation.

Das Material, aus dem die nanoskopischen Inseln bestehen, wird so gewählt, dass die Inseln Adaptoren-spezifisch sind, d.h. dass die Adaptoren spezifisch an die Inseln binden, nicht jedoch an die feste Oberfläche bzw. an das Substrat zwischen den Inseln. Die Größe der Inseln ist durch den Prozess der Herstellung einstellbar und die Ausdehnung kann brauchbarer Weise 1 bis 100 nm betragen. Die Größe der Inseln wird erfindungsgemäß bevorzugt an die verwendeten Adaptoren „maßgeschneidert", so dass gewährleistet werden kann, dass ein Adaptorenmolekül eine Insel ganz abdeckt. Kleinere Inseln haben jedoch den Nachteil, dass ihre Form bzw. die Konstanz ihrer räumlichen Ausdehnung nur schwer zu gewährleisten ist, da sich bei derartigen allzu kleinen Inseln die Eigenschaften des jeweiligen Materials zum Teil dramatisch verändern können. Allzu große Inseln (d.h. allzu große Adaptoren) sind im Hinblick auf ihre exakte Lokalisierbarkeit im De- tektionsexperiment nachteilig. Daher haben sich erfindungsgemäß nanoskopische Inseln mit einer räumlichen Ausdehnung (Durchmesser auf dem festen Substrat) von 3 bis 70 nm, bevorzugt von 5 bis 50 nm, insbesondere von 10 bis 30 nm, besonders bewährt. Un- abhängig davon beträgt der Abstand zwischen einem an die Funktionalität gebundenem, durch Licht anregbarem Molekülteil, insbesondere einem Fluorophor, und der nanoskopischen Insel von 0,1 bis 100 nm, vorzugsweise 1 bis 50 nm, insbesondere 5 bis 30 nm.

Das Material, aus dem die erfindungsgemäßen nanoskopischen Inseln bestehen, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Metallen, anorganischen oder organischen Materialien, insbesondere Metalloxiden, kurzkettigen organischen Molekülen, organischen Polymeren und Silanreagentien. Bevorzugte Metalle sind dabei erfindungsgemäß vor allem Gold und Silber, aber auch Kupfer, Zink, Blei, Palladium und Platin. Prinzipiell werden edlere Metalle gegenüber anderen wegen ihrer Inertheit hinsichtlich Oxidation, insbesondere an Luftsauerstoff oder Wasser, bevorzugt (Metalle, die gegenüber Wasser und/oder Luftsauerstoff oxidationsbeständig sind) . Bevorzugte anorganische Materialien sind Metalloxide insbesondere Kupferoxid, Tantaloxid, Titanoxid, und Halbleiterstrukturen insbesondere Quantum Dots aus CdSe, ZnSe oder InGaAs. Bevorzugte kurzkettige organische Moleküle sind 16-Mercaptohexadecansäure und 16-Hydro- xyhexadecansäurehydroxamsäure; bevorzugte organische Polymere sind Poly-L-Lysin, Poly-L-Glutamat oder Biotin-Polyethylen-Gly- kol-Poly-L-Lysin; bevorzugte Silanreagentien sind Mercaptome- thyl-dimethylethoxysilan, 3-Mercaptopropyl-triethoxysilan, 16- Bromo-hexandecan-trichlorsilan, 3-Amino-propyl-triethoxysilan und 3-Glycidoxypropyl trimethoxysilnan.

Bevorzugter Weise werden die Materialien, aus denen die Inseln aufgebaut werden, auch aufgrund ihrer Eignung in bestimmten Aufbringungsverfahren ausgewählt. Materialien, deren prinzipielle Eignung in einem oder mehreren der Aufbringungsverfahren („Spotting") im Stand der Technik bekannt sind, gelten daher jedenfalls als bevorzugt.

Gemäss dieser bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung besteht die zweite Komponente aus Adaptoren, welche Einzelmoleküle, z.B. Biomoleküle, etwa einzelne DNA-Stränge, an die Inseln binden. Ein erfindungsgemäß zu verwendender Adapter (Fig.17; 3), besitzt zwei funktionelle Teile, (i) Der erste Teil (Fig.17; 4), welcher mit den Inseln nicht aber an die Bereiche zwischen den Inseln interagiert, bewirkt, dass die Adaptoren nur an die Inseln nicht aber an die Bereiche zwischen den Inseln bindet, (ii) Der zweite Teil (Fig.17; 5) hat eine Bindungsfähigkeit, mittels welcher ein bestimmtes Einzelmolekül, insbesondere ein Biomolekül, (Fig.17; 6) an den Adapter, und damit an die Inseln an der Oberfläche des festen Substrates gebunden wird. Wesentlich ist, dass an den Adapter nur spezifische (Bio-) Moleküle gebunden werden, also der Adapter eine spezifische Bindungsstelle für ein spezifisches Molekül aufweist, welches dann nur an den Adapter, nicht jedoch an die feste Oberfläche oder das Inselmaterial bindet. Die Adaptoren können dabei bevorzugter Weise mit einer einzigen Bindungsspezifität ausgestattet sein, in anderen Fällen kann die Aufgabenstellung auch das Vorsehen mehrerer, voneinander verschiedener oder mehrerer gleicher spezifischer Bindungsstellen (z.B 2, 3 oder 4 Stellen; jedenfalls immer nur eine von vornherein festgelegte, bestimmte Anzahl) im Adaptormolekül bedingen. Ein weiteres Merkmal der Adaptoren ist, dass die beiden Teile auf unterschiedlichen Seiten des Adapters angeordnet sind, sodass der Adapter mit der einen Seite (Fig. 17; 4) auf die Insel bindet, während die Bindungsfähigkeit der anderen Adapter-Seite (Fig. 17; 5) für Einzelmoleküle, insbesondere Biomoleküle, nicht beeinträchtigt wird. Ein drittes Merkmal der Adaptoren ist, dass ihre (entlang der Normale zur festen Oberfläche) projizierte 2-dimensionale Größe mindestens die Größe der Inseln erreicht, bzw. jene auch übersteigen kann. Dies stellt sicher, dass pro Insel nur ein Adapter mit einem Biomolekül gebunden hat. Wären die Adaptoren viel kleiner als die Inseln, könnten mehrere Adaptoren und Biomoleküle an eine einzige Insel binden, und es wäre der Einzelmolekül- Array nicht mehr gewährleistet, so dass diese Ausführungsformen in der Regel nur verschlechterte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.

Vorzugsweise werden bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Anordnung die bereits im Stand der Technik etablierten und bewährten Verfahren angewendet. Demgemäß sind daher die folgenden Methoden zum Aufbringen der nanoskopische Inseln auf die Oberfläche des festen Substrates bevorzugt: Mit der Dip-Pen-Nanoli- thographie (DPN) (Lee et al . , 2002) wird eine mit Molekülen benetzte Atomic-Force-Microscopie-Spitze über dem Substrat positioniert, und durch Absetzen der Spitze werden die Moleküle auf der Oberfläche deponiert. Mit Scanning Tunneling Microscopie

(STM) wird eine etwa mit Gold beschichtete AFM-Spitze über die zu strukturierende Oberfläche gehalten, und durch Anlegen einer Spannung zwischen AFM-Spitze und Substrat wird ein Teil des Metalls von der AFM Spitze auf die Substratoberfläche übertragen (Kolb et al., 1997; Mamin et al., 1990). Mit der Electron Beam Lithographie (EBL) wird eine sensitive Lack-Schicht auf einer Oberfläche mit einem Elektronen-Strahl beschrieben (Chen and Pe- pin, 2001; Chen et.al., 1998) um ReliefStrukturen zu erhalten, die nach Goldbedampfung und Lift-off die entsprechende Inseln auf dem Substrat ergeben. Mit dem Mikro Contact Printen (μCP)

(Bernard et al., 1998; Whitesides et al., 2001) werden auf das Substrat Moleküle durch Stempeln mit einem elastischem Polymer- Replika übertragen.

Vorzugsweise ist die feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall, oder Metalloxid-Oberfläche, die vorzugsweise plan, glatt und undurchlässig (z.B. für das Lösungsmittel oder einen Probenpuffer) ist.

Gemäss der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestehen die Inseln aus Metall, Metalloxid, organischen oder anorganischen Polymeren, sowie Gruppierungen von organischen oder anorganischen Verbindungen.

Vorzugsweise sind die Adaptoren metallischer, anorganischer, organischer, oder biochemischer Natur. Für einen metallischen Adapter werden gemäss einer bevorzugten Ausführungsform Goldoder Silber-Cluster- oder Nanogold (oder -silber) -Derivate (Boisset et al., 1994), insbesondere solche mit nur einer Funktionalität eingesetzt, an welche ein einzelner DNA-Strang gebunden wird.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden als organische Adaptoren Dendrons, auch „molekular Wedges" genannt, eingesetzt. Die Spitze der Dendronkerns besteht aus einer einzige Funktionalität, an die eine Biomolekül gekoppelt ist, während die Peripherie des Dendrons, d.h. das andere Ende des Dendrons, aus einer Vielzahl an gleichen Funktionalitäten besteht, die an die Insel binden (Bell et al., 2003). Die WO97/39041 sowie Zhang (Zhang et al., 2000; Zhang et al., 2001) beschreiben die un- gerichtete Bindung von Dendrimeren auf Oberflächen, ohne dass die Positionierung der Dendrons durch ein Ordnungsprinzip geleitet werden würde.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden als biochemische Adaptoren, DNA-Dendrimere oder bevorzugt Proteine verwendet. Proteine eignen sich aus zweierlei Gründen für den Einsatz als Adaptoren. Proteine oder definierte Protein-Multimere haben eine maximale Ausdehnung von bis zu 100 nm und haben damit eine vergleichbare Größe wie die nanostrukturierten Inseln sodass eine Mehrfachbelegung der Inseln mit mehreren Adaptoren erschwert wird. Der Einsatz von Proteinen als Adaptoren ist bevorzugt, da bei Kenntnis ihrer dreidimensionaler Struktur durch Mutagenese- Methoden gezielt im Proteingerüst Veränderungen vorgenommen werden können, damit in weiterer Folge ein einzelnes Biomolekül gerichtet an den Adapter gekoppelt wird ohne die Interaktion des Adapters mit den Inseln zu stören.

Vorzugsweise erfolgt die Bindung der Adaptoren oder der einzelnen Moleküle an die Adaptoren an die Inseln durch kovalente Kopplung, elektrostatische Interaktion, Liganden-Komplexe, biomolekulare Erkennung, Chemisorption oder Kombinationen davon. Für die kovalente Kopplung werden bevorzugt folgende Funktionalitäten eingesetzt: NH₂-, SH-, OH-, COOH-, Cl-, Br-, 1-, Iso- thiocyanat-, Isocyanat-, NHS-Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldehyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl- Diimidazol-, Carbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diazirin-Gruppen oder Kombinationen davon eingesetzt. Für die biomolekulare Erkennung werden bevorzugt die Biotin-Streptavidin, Antikörper-Antigen, DNA-DNA-Interaktion, Zucker-Lectin oder Kombinationen davon eingesetzt.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Anordnung von einzelnen Molekülen, welches durch folgende Schritte gekenn- zeichnet ist :

- Aufbringen von nanoskopischen Inseln auf der Oberfläche eines festen Substrates durch eine Oberflächenstrukturierungsmetho- de, insbesondere mit STM, DPN, EBL, Ionenstrahl-Lithographie, oder Micro Contact Printen

- Aufbringen von Adapter auf die nanoskopischen Inseln, Kopplung von Einzelmolekülen an die Adaptoren, die an den nanoskopischen Inseln gebunden sind,

- Absättigen von eventuell vorhandenen unbelegten Inseln durch Varianten von Adaptoren, die keine Moleküle tragen.

Alternativ dazu kann dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von einzelnen Molekülen auch durch folgende Schritte erreicht werden:

- Aufbringen von nanoskopischen Inseln auf der Oberfläche eines festen Substrates durch eine Oberflächenstrukturierungsmetho- de, insbesondere mit STM, DPN, EBL oder Ionenstrahl-Lithographie, oder Micro Contact Printen Kopplung von Molekülen an Adaptoren in Lösung, Abscheiden der ungekoppelten Adaptoren bzw. ungekoppelten Molekülen durch Reinigungsschritte, Aufbringen der mit einzelnen Molekülen gekoppelten Adaptoren auf das mit nanoskopischen Inseln strukturierte feste Substrat.

In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Erfindung wird die Herstellung einer Anordnung von Einzelmolekülen durch folgende Schritte erreicht: Aufbringen von nanoskopischen Inseln, vorzugsweise Gold-Dots, auf der Oberfläche eines festen Substrates aus Glas durch Scanning Tunneling Mikroskopie, Aufbringen von Adaptoren, insbesondere Dendrons, auf die Inseln, insbesondere die Gold-Dots, wobei ein Dendron an der Peripherie nichtaktivierte Disulfidgruppen trägt, welche an eine Insel, insbesondere ein Gold-Dot, binden, und der Dendronkern eine einzelne Funktionalität, insbesondere eine N-Hydroxy-Suc- cinimid-Funktionalität, trägt, die mit der Amin-Funktionalität eines Einzelmoleküls, insbesondere eines modifizierten DNA- Oligonukleotides, koppeln kann, Kopplung der Einzelmoleküle an die Adaptoren, insbesondere durch Reaktion der Amin-Funktionalität der DNA-Oligonukleotide an die N-Hydroxy-Funktionalität der Dendrons, welche an die nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold-Dots, gebunden haben, Entfernen jener Adaptoren und Einzelmoleküle, die nicht an die nanoskopischen Inseln gebunden haben, insbesondere durch Waschen.

In einer anderen, besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Erfindung wird die Herstellung einer Anordnung von Einzelmolekülen durch folgende Schritte erreicht:

- Aufbringen von nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold-Dots, auf der Oberfläche des festen Substrates aus Glas durch Scanning Tunneling Mikroskopie, Kopplung der Einzelmoleküle an Adaptoren in Lösung, insbesondere durch Reaktion der Amin-Funktionalität der DNA-Oligonukleotide, an die einzelne Funktionalität des Dendronkerns, insbesondereeine N-Hydroxy-Succinimid-Funktionalität, Aufreinigen der Adapter-Einzelmolekül-Konjugate, insbesondere von Dendron-DNA-Konjugaten, und Entfernen der nicht gekoppelten Einzelmoleküle oder nicht gekoppelten Adaptoren durch Aufreinigungsmethoden, insbesondere Gelpermeations- Chromatographie,

- Aufbringen der Adapter-Einzelmolekuel-Konjugateauf die nanoskopischen Inseln, insbesondereGold-Dots, wobei ein Dendron an der Peripherie nichtaktivierte Disulfidgruppen trägt, welche an eine nanoskopische Insel binden, Entfernen jener Adapter-Einzelmolekül-Konjugate, die nicht an die nanoskopischen Inseln gebunden haben, insbesondere durch Waschen.

Die Erfindungen betrifft auch Anordnungen, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.

Die Auslesung der erfindungsgemäßen Anordnung von isolierten Molekülen erfolgt durch Methoden der Einzelmolekül-Mikroskopie und Einzelmolekülfluoreszenz-Mikroskopie, insbesondere mit der Methode gemäß der WO 00/25113 A.

Das Auslesen der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Signale wird durch das Vorhandensein von metallischen Inseln nicht negativ gestört, sondern die Häufigkeit der Detektion von Fluoreszenz-Photonen wird durch die Nähe des spezifisch gebundenen Fluorophores zur nanoskopischen metallischen Inseln überraschender Weise sogar noch verstärkt (Enderlein, 2000; Geddes and Lakowicz, 2002; Ged- des et al., 2003a; Geddes et al., 2003b; Lakowicz, 2001; Lakowicz et al., 2002) .

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Untersuchung von Biomolekülen, insbesondere von Oligonukleotiden, DNA, mRNA, cDNA, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Liganden, Toxinen eingesetzt und zu deren Nachweis und Untersuchung mittels Detektionsverfahren verwendet werden.

Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Bindung von anderen Biomolekülen, insbesondere von Oligonukleotiden, DNA, mRNA, cDNA, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Liganden, Toxinen, Viren, Bakterien, Zellen oder Kombinationen davon, eingesetzt und zu deren Nachweis und Untersuchung mittels Detektionsverfahren verwendet werden.

Wie in Fig. 17 skizziert werden nach der Oberflächenstruktu- rierung des Substrates die nanoskopischen Inseln mit Adaptoren belegt. Die Adaptoren (Fig. 17: 3) sind das Bindeglied zwischen den nanoskopischen Inseln (Fig. 17: 2) und den Ziel-Molekülen (Fig. 17: 6), die in der Anordnung auf das Substrat (Fig. 17: 1) gekoppelt werden. Entsprechend ihrer Funktion besitzen die Adaptoren sowohl eine Funktionalität (Fig. 17: 5), mit der sie die Ziel-Moleküle binden können, als auch eine Gruppe von weiteren funktionelle Einheiten (Fig. 17: 4), mit der die Adaptoren auf den nanostrukturierten Inseln (Fig. 17: 2) binden können. Die chemische Natur der Funktionalitäten der Adaptoren und jene der Interaktion zwischen Adapter und Molekül, und zwischen Adapter und nanoskopischen Insel kann kovalent oder nichtkovalent sein und ist hochspezifisch, d.h. die Adaptoren können nur an die nanoskopischen Inseln binden nicht aber an die Bereiche des Substrates zwischen den nanoskopischen Inseln; weiters können die Moleküle nur an den Adaptoren nicht aber an den nanoskopischen Inseln oder in den Bereichen zwischen den Inseln binden.

Die Adaptoren können aufgebaut sein aus organischen, an- organischen oder biochemischen Polymeren 3θwie Metallen. In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Adaptoren aus einem organischen Polymer, etwa den keilförmigen Dendronen, die aufgebaut sind aus Dihydroxybenzylalkohol-Einheiten oder aus anderen Grundgerüst-Einheiten. Die Kopplung der Dendronen an die nanoskopischen Inseln aus Gold kann z.B. auf der stabilen Thiol-Gold-Wechselwirkung beruhen wenn Dendrons mit einer Vielzahl von Thiol oder Disulfidgruppen eingesetzt werden. Das Koppeln der Adaptoren an die nanoskopischen Inseln kann erreicht werden durch die Zugabe einer Lösung von Adaptoren zu dem Substrat, gefolgt von Waschschritten, um überschüssige Adaptoren vom Substrat zu entfernen, die nicht an die nanoskopischen Inseln gebunden haben. In einem weiteren Schritt werden die einzelnen Moleküle an die Substrat-gebundenen Dendrone gekoppelt. So können die Moleküle eine einzelne Amin-Funktionalität tragen, die an die einzelne Funktionalität der Dendronen unter Einsatz von z.B. N-Hydroxysuccinimid-Chemie binden kann. Überschüssige und nicht an Adapter gekoppelte Moleküle können durch verschiedenste im Stand der Technik bekannte Methoden, insbesondere durch Waschen mit geeigneten Reinigungsflüssigkeiten, entfernt werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bestehen die Adaptoren aus einem anorganischen Polymer, etwa Glas, und haben kugelförmige Gestalt. In diesem Fall kann die Kopplung der kugelförmigen Adaptoren an die nanoskopischen Inseln dadurch erfolgen, dass Gold-Inseln mit thiolhältigen Reagentien wie N- ( 6- (Biotinamidohexyl) -3' - (2' -pyridyldithio) -propionamide (Biotin- HPDP) modifiziert werden und diese mit Streptavidin-beschichte- ten Adaptoren beleget werden. Die Streptavidin-beschichteten Adaptoren können vor oder nach der Verankerung am festen Substrat mit einer Loesung von Molekülen in Kontakt gebracht werden, damit einzelne Moleküle an den Goldinseln zu liegen kommen.

Die Grosse der Adapatoren ist frei wählbar und ist dem Durchmesser der nanoskopischen Inseln angepasst, sodass pro nanosko- pischer Insel nur ein Adaptor binden kann. Für die Herstellung einer Anordnung mit einzelnen Molekuelen können gleichzeitig verschiedene Arten von Adaptoren eingesetzt werden; vorzugsweise wird eine Anordnung nur mit einer Art von Adaptor realisiert. Die Erfindung wird anhand der nun folgenden Beispiele (und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht beschränkt ist, näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1: (A) Schematische Darstellung des Vorgangs, bei welchem einzelne oder Gruppen von Molekülen mittels sphärischer Hilfsstrukturen an ein planes Substrat übertragen werden. (B) Schematische Darstellung der einzelnen Schritte des Vorgangs zur Übertragung von Biomolekülen exemplarisch anhand eines "Fängermoleküls".

Fig. 2: Schematische Darstellung von an einem planen Substrat angelagerten Kugeln, deren Fluoreszenz-Intensität durch Scannen bestimmt wird.

Fig. 3. Schematische Darstellung des Verfahrens, um die Position von fluoreszierenden Kugeln anhand eines Array von Pixeln eindeutig festzulegen.

Fig. 4. Schematische Darstellung der Fluoreszenzaufnahmen von oberflächenlokalisierten und farbkodierten Beads, welche verschiedene Fluorophore in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.

Fig. 5. Schematische Darstellung zur Herstellung einer "Matrix of Adressable Recognition Sites", MARS.

Fig. 6. Schematische Darstellung des Vorgangs zur Herstellung einer "Matrix of Adressible Chemical Reaction Sites", MACS mittels sphärischer Hilfsstrukturen. (A) Darstellung der einzelnen Schritte des Vorgangs zur Herstellung einer MACS exemplarisch anhand eines Moleküls. (B) Schematische Darstellung der Herstellung zweier unterschiedlicher Arten von MACS.

Fig. 7. Schematische Darstellung verschiedener Wege, um "Matrices of Adressible Chemical Reaction Sites in "Matrices of Adressable Recognition Sites" überzuführen. Fig. 8: Anwendungen für MARS-Matrizen: Nutzbarmachung der hohen Empfindlichkeit .

Der grosse Umfang der Matrize "MARS (Pi; Fi, 1 )" von -10^ Bindungsstellen erlaubt viele verschiedene "Fängermoleküle" (hier exemplarisch 100 verschiedene Antikörper; es können auch Mischungen von Oligonukleotiden und Antikörpern angewendet werden) anzubieten und gleichzeitig jedes "Fängermolekül" in vielen Kopien (hier 1 Million) , woraus sich mit der Detektions- empfindlichkeit von einzelnen Fluoreszenz-Molekülen ein dynamischer Bereich für Detektion von 6 Größenordnungen ergibt, und zwar gleichzeitig für die Detektion von 100 verschiedenen Biomolekülen, messbar mit SDT-scan in -5 min.

Fig. 9: Anwendungen für MARS-Matrizen: Proteomik

Fig. 9A: Anwendungen für MARS-Matrizen: Protein-Funktion. Gleichzeitige Messung der Funktion von vielen (hier 10^ ) einzelnen Proteinen (Dreiecke) durch wiederholte Bildaufnahme, zur Erfassung der zum jeweiligen Zeitpunkt gebundenen Liganden (L) , welche eine Fluoreszenz-markierung (Stern) tragen. Die Liganden in Lösung geben bei der bevorzugten Anwendung einen zu vernachlässigenden Fluoreszenz-Hintergrund. Die Anwendung auf Enzyme ist besonders vielversprechend. Die Funktionsantworten (Serien von + , Bindung, und -, keine Bindung) ergeben direkt die Bindungskonstanten und die Assoziations- und Dissoziationskonstanten für die Liganden-Bindung jedes einzelnen der 10^ Rezeptor-Moleküle oder Enzyme, und erlaubt damit die direkte Messung der Funktionsvariabilität von Biomolekülen. Die SDT-scan Methode erlaubt 10^ Moleküle im Abstand von -1 μm in 50 ms aufzunehmen, sodass die Funktion der Proteine mit einer Zeitauflösung von -50 ms erfolgt.

Fig.9B: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung der post-trans- lationalen Modifikation von Proteinen. Durch Einsatz von fluoreszenzmarkierten Anikörpern gegen Phosphorylierungsstellen (P) und von markierten Lektinen gegen Zuckerreste an den Proteinen kann das Profil dieser Modifikationen für ein Protein oder mehrere Proteine gemessen werden, und gegebenenfalls mit der vorher gemessenen Variation der Funktion (Fig. 9A) in einen Struktur- Funktions-Zusammenhang gestellt werden.

Fig. 9C&D: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung von Protein- Assoziationen. Hierbei wird ausgenutzt, dass die SDT -Methode stöchiometrische Messungen. von ko-lokalisierten Fluoreszenz-Molekülen erlaubt. Die Intensität an den Bindungsstellen gibt Auskunft über Homo-Assoziation (Fig. 9C) oder Hetero-Assoziation (Fig. 9D) . Für den letzteren Fall ist im unteren Teil des Bildes dargestellt, dass die gleiche Information unabhängig auch durch Einsatz zweier verschiedener -Farbstoffe erzielt bzw. überprüft und abgesichert werden kann.

Fig. 10: Anwendungen für MARS-Matrizen: DNS und mRNS Analysen.

Fig. 10A: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung von mRNA-Pro- filen. Eine Matrix mit zahlreichen verschiedenen Oligonukleotiden , jedes jedoch in genügend hoher Zahl zur Gewährleistung hoher Empfindlichkeit, kann eingesetzt werden, um mRNA-Profile von zum Beispiel Extrakten von Zellen oder Organellen zu erstellen für verschiedene Zustände der Zellen.

Fig. 10B: Anwendungen für MARS-Matrizen: Korrelation benachbarter SNP's. Ein großes Interesse besteht derzeit an der Bestimmung der Reihenfolge von SNP's (Single Nucleotide Polymor- phism) in bestimmten Bereichen des Genoms. Die fraglichen DNS Einzelstränge werden zunächst an Magnetkugeln mit einem Ende fixiert, und das andere Ende an entsprechende Oligonukleotide auf der Matrizze. Durch Anwendung von Magnetkraft werden die DNA Stränge gestreckt, damit die Bindung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden an die zu untersuchenden SNP-Stellen möglichst sicher erfolgt. Die Fuoreszenz-Antwort durch SDT-Scan gibt dann Aufschluss über gleichzeitig auftretende Mutationen an den SNP- Stellen.

Fig. IOC: Anwendungen für MARS-Matrizen: Mutationen in "repeats". Das gleiche Verfahren wie in Fig.lOB kann angewendet werden auf die Identifizierung von Mutationen in Bereichen von DNS mit vielfach sich wiederholenden Sequenzen ("repeats"), durch Einsatz von zwei verschiedenen Oligonukleotiden: Eines gegen die natürliche Sequenz und eines gegen die mutierte Sequenz. Die obere Bildhälfte zeigt das Ergebnis für DNS ohne Mutation, die untere mit einer Mutation.

Fig. 11: Figur zu Beispiel 1: Visualisierung einzelner Fluo- rophore mittels der SDT-scan Methode

Fig. 12: Figur zu Beispiel 2: Hexagonal dichte Packung von Kugeln auf einer Oberfläche.

Fig. 13: Figur zu Beispiel 3: Ablösung von Markerbeads. A: Mit Pfeilen gekennzeichnete Markerbeads vor (A) und nach der Ablösung (B) von nicht gekoppelten Beads .

Fig. 14: Figur zur Beispiel 4: Abdruck von Gruppen fluoreszenzmarkierter Moleküle, die mittels Kugeln auf eine plane Oberfläche übertragen und kovlent gebunden wurden.

Fig. 15: Figur zur Beispiel 5: An einer Oberfläche angeordnete Beads mit unterschiedlicher Fluoreszenz-Markierung.

Fig. 16. Schematische Darstellung einer Anordnung von nanoskopischen Inseln (2), die auf einem festen Substrat (1) aufgebracht sind. Der mittlere Abstand zwischen den nanoskopischen Inseln, d, und der Durchmesser der nanoskopischen Inseln, h, ist durch die Oberflächenstrukturierungsmethode frei wählbar. Die Anordnung besteht aus beliebig vielen nanoskopischen Inseln.

Fig. 17. Schematische Darstellung einer Anordnung von einzelnen Molekülen in Seitenansicht. Ein Einzelmolekül (6) ist an einen Adapter (3) über eine Funktionalität (5) gebunden. Der Adapter (3) bindet mit seiner anderen Seite (4) an eine nanoskopische Insel (2) , die auf die Oberfläche eines festen Trägers (1) gebunden ist. Der mittlere Abstand zwischen zwei nanoskopischen Inseln, den Adaptoren und damit zwischen den Einzelmolekülen ist gegeben durch d. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur zwei nanoskopische Inseln mit den Adaptoren eingezeichnet; die Anordnung besteht aus einer beliebigen Anzahl von Inseln, Adaptoren und Molekülen.

Fig. 18. Figur zu Beispiel 6. Bindung von kugelförmigen Adaptoren auf nanoskopische Goldinseln. Für die Herstellung der Anord- nungen können vorzugsweise feste Substrate verwendeten werden, die durch eine Oberflächenstrukturierungsmethode mit einem regelmässigen Gitter bestehend aus nanoskopischen Inseln versehen worden sind (Fig. 16) . Die nanoskopischen Inseln (Fig. 16: 2) bestehen bevorzugt aus Metall wie Gold oder Silber und werden durch die direkte Ablagerung des Metalls etwa mit STM in regelmässigen Abständen auf das feste Substrat (Fig. 16: 1) vorzugsweise ein elektrisch leitendes Substrat wie Indium-Zinnoxid-Glas aufgebracht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die nanoskopischen Inseln aus Metall im Rahmen eines elektro- strahllithographischen Prozesses auf dem Substrat abgesetzt. Der Durchmesser der nanoskopischen Inseln, h, ist vom speziellen Verwendungszweck abhängig und liegt vorzugsweise im Bereich 5 bis 50 nm (Fig 16) . Die vertikale Höhe der nanoskopischen Inseln ist abhängig von der Art der Oberflächenstrukturierungsmethode und kann bei STM 1-5 nm betragen, bei EBL im Bereich von 3 - 5 nm. Die nanoskopischen Inseln sind räumlich voneinander getrennt und der mittlere Abstand zwischen zwei Inseln, d, ist durch die Oberflächenstrukturierungsmethode frei wählbar und liegt über dem Beugungslimit der optischen Mikroskopie.

Index der Bezeichnungen in den Figuren 1-7:

1. Substrat

2. Mindestabstand der übertragenen Moleküle am Substrat

3. Kugel zur Übertragung, mit wenigen Fängermolekülen belegt

4. Fängermolekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel durch molekulare Erkennung gebunden

5. An das Substrat fixiertes Fängermolekül (4) vor Ablösung der Kugel

6. Fängermolekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel durch molekulare Erkennung gebunden, Fängermolekül un terschiedlich zu 4

7. An das Substrat fixiertes Fängermolekül (6) vor Ablösung der Kugel

8. VORGANG: Übertragung einzelner Fängermoleküle

9. Übertragene einzelne Fängermoleküle (4) nach der Ablösung der Kugel

10. Übertragene einzelne Fängermoleküle (6) nach der Ablösung der Kugel

11. Kugel zur Übertragung, mit vielen Fängermolekülen belegt

12. An das Substrat fixierte Fängermoleküle (Gruppen von 4) vor Ablösung der Kugel

13. An das Substrat fixierte Fängermoleküle (Gruppen von 6) vor Ablösung der Kugel

14. VORGANG: Übertragung mehrerer Fängermoleküle (Gruppen)

15. Übertragene Gruppen von Fängermolekülen (4) nach der Ablö sung der Kugel

16. Übertragene Gruppen von Fängermolekülen (6) nach der Ablö sung der Kugel

17. Bindungsbereich an der Kontaktfläche Kugel-Substrat

18. Durchmesser einer Kugel zur Übertragung

19. Referenz-Kugel

20. Reaktive Gruppen mit hoher Dichte auf Referenz-Kugel

21. An das Substrat "kovalent gebundene" reaktive Gruppen (20) von der Referenz-Kugel

22. VORGANG: Scanning der Kugeln vor der Ablösung

23. Pixel-Array

24. Abbild der Kugeln zur Übertragung auf Pixel-Array

25. Abbild der Referenz-Kugeln auf Pixel-Array

26. Position der Bindungsstellen definiert durch Position der Kugeln abgebildet am Pixel-Array

27. VORGANG: Wiederfindung der Positionen

28. Fluoreszenzintensität der Referenz-Kugel

29. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Über tragung, innerhalb eines ausgewählten Wellenlängenbereichs.

30. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Über tragung, innerhalb eines von 29 abweichenden Wellenlängenbe reichs .

31. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Über tragung, innerhalb eines von 29 und 30 abweichenden Wellen längenbereichs .

32. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Über tragung, innerhalb eines von 29,30 und 31 abweichenden Wellenlängenbereichs .

33. Farbcode (mit willkürlichen Werten)

34. Farbcode der Referenz-Kugel

35. An Kugeln verbleibende Anteil nach Spaltung der Funktionali tat 40 36. VORGANG: Ablösung der Kugeln zur Übertragung

37. Matrix von Bindungsstellen und Referenz-Kugeln, MARS (Matrix of Addressable Recognition Sites) oder MARS (Pi,Fi,mi)

38. Kleine Kugeln zur Übertragung, mit wenigen Molekülen belegt

39. Kleine Kugeln zur Übertragung, mit vielen Fängermolekülen belegt

40. Reaktive spaltbare Funktionalitäten zur Erzeugung von MACS (Matrix of Addressable Chemical reaction Sites)

41. Übertragene Gruppen von reaktiven Funktionalitäten auf MACS

42. Übertragene einzelne reaktive Funktionalitäten auf MACS

43. VORGANG zur Erzeugung von MARS (Pi,Fi,mi) (37)

44. VORGANG zur Erzeugung von MACS (Pi,mi) (45)

45. MACS mit Gruppen gleicher Funktionalitäten, MACS (Pi, mi)

46. VORGANG zur Erzeugung von MACS (Pi,l) (48)

47. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi,mi) (45) in MACS (Pi,D (48)

48. MACS mit einzelnen Stellen gleicher Funktionalitäten, MACS (Pi,l)

49. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, mi) (45) in MARS (Pi,Fi,mi) (54)

50. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi,mi) (45) in MARS (Pi, Fi, 1) (55)

51. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi,l) (48) in MACS (Pi,Fi,l) (55)

52. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi,l) (48) in MACS (Pi,l,D (56)

53. Fängermoleküle in flüssiger Phase

54. MARS (Pi,Fi,mi) mit einzelnen und Gruppen an verschiedenen Fängermolekülen verschiedener Art, aus MACS(Pi,mi) (45) hergestellt

55. MARS (Pi,Fi,l) mit ausschließlich einzelnen Fängermolekülen verschiedener Art, aus MACS(Pi,mi) (45) und MACS(Pi,l) (48) hergestellt

56. MARS (Pi,l,l) mit ausschließlich einzelnen Fängermolekülen gleicher Art, aus MACS(Pi,l) (48) hergestellt

57. Molekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel gebunden

58. Molekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel ge bunden; Molekül unterschiedlich zu 57

59. VORGANG: Übertragung von Molekülen einzeln und/oder in Gruppen

60. Übertragenes einzelnes Molekül

61. Übertragene Gruppe von Molekülen

B e i s p i e l e :

Beispiel 1 :

Einzelne Cy3 Fluorophore wurden auf einem Glasplättchen immobilisiert und mit SDT-Scan visualisiert . Zur Immobilisierung wurde Cy3 zunächst an Polyethylenglykol-Diamin gekoppelt, und dieses Konjugat wurde über die verbleibende terminale Amingruppe des PEG an eine Epoxid-Oberflache kovalent gebunden. Zur Herstellung des Cy3-PEG-Konjugates wurden 0,2 Gramm (100 μmol) PEG- Diamin (Mw 2000, Rapp Polymerere) in 4 ml salzsaurem Dimethyl- formamid (DMF) pH = 6,5 gelöst und mit 1 mg (1,3 μmol) Cy3-N-Hy- droxysuccinimid (Cy3-NHS, Amersham Pharmacia) , gelöst in 1 ml DMF, für 3 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl einer 5%-igen Disopropylethylamin (DIEA) /DMF-Lösung gestartet; Reaktionsverlauf und Reaktionsende wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überwacht. Die Aufreinigung erfolgte über Gel-Filtration und Ionenaustauch-Chromatographie, und die Reinheit der Fraktionen wurde mit DC überprüft. Zur Herstellung von Glasplättchen mit Epoxid-Beschichtung wurden Deckgläschen (Esco, microscope cover glass, 24 x 50 mm; Erie Scientific, Portsmouth, N.H.) mit Trifluoressigsäure geätzt und mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPS) gemäß der Publikation (Piehler et al., 2000) silanisiert. Die Qualitiät der Beschichtung wurde mit Kontaktwinkelmessungen (Dataphysics OCA 20) bestätigt. Die Kopplung von Cy3-PEG-Amin an die silanisierten Glasplättchen erfolgte mit einer Konzentration von 20 nM (Messung mit UV-Vis-Spektrophotometer Shimadzu UV1601) in 50 mM Borat-Puffer pH = 8,8 für 10 Minuten. Überschüssiges, nicht gebundenes Cy3-PEG-Amin würde durch mehrmaliges Waschen in Wasser entfernt. Zur Visualisierung der immobilisierten Fluorophore wurde das Fluoreszenz-Lesegerät "Nanoreader" verwendet. Zur Anregung wurde ein Dioden-gepumpter Festkörper-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm eingesetzt, als Objektiv wurde ein Axio- vert PNF 40x/l,3 Öl verwendet. Die Belichtungsdauer betrug 100 ms und das Signal wurde mit einem Cy3-Filtersatz (Chroma, HQ610 75m) gefiltert. Zur Bildwiedergabe wurde das Programm V++ (Digital Optics) eingesetzt. Fig. 11 zeigt eine Fläche von 30 μm mal 50 μm mit einzelnen und Clustern von Fluorophoren mit einer durchschnittlichen Einzel-Signalintensität von 15 Counts. Das Signal zu Rauschverhältnis betrug im Mittel 50.

Beispiel 2 :

Zur Herstellung einer hexagonal dichten Packung von Kugeln an einer Oberfläche wurden Beads mit einer Beschichtung aus Poly- ethylen Glykol (PEG) eingesetzt. Zur Beschichtung mit PEG wurden die Beads (Latex-Beads, Polysciences, Durchmesser 2 μm, Carboxyl-Oberflache) in 20 μl IM 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäu- re (MES) -Puffer mit einer Endkonzentration von 1 Massenprozent suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von 0,1M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 mM l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid und 10 mM Methoxy-Polyethylenglykol-Ämin (Mw 5000, Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) gemischt und für 2 Stunden in einem Schüttler bei 150 rpm inkubiert. Nach der PEG-Beschichtung wurden die Beads mehrmals gewaschen und in einer 1% Suspension auf eine pegylierten Glasplättchenoberfläche aufgebracht. Zur Herstellung einer pegylierten Glasoberfläche wurden mit Glyci- doxypropyltrimethoxysilan modifizierten Glasplättchen (Herstellung siehe Beispiel 1) mit 100 mg Methoxy-Polyethylenglykol-Ämin (Mw 5000) (Shearwater Polymers) in 25 ml 50 mM Borat Puffer pH = 8,8 bei Raumtemperatur für 24 Stunden inkubiert. Fig. 12 zeigt einen 110 μm mal 60 μm großen Ausschnitt eines Durchlicht-Bildes von in hexagonal dichter Packung angeordneter pegylierter Latex- kuglen auf pegyliertem Glasplättchen, aufgenommen mit dem Nano- reader.

Beispiel 3 :

Zur Demonstration des Einsatzes von Markerbeads wurde eine Mischung von nicht fluoreszierenden Beads und kovalent koppelnden, fluoreszierenden Markerbeads auf ein Glassubstrat aufgebracht. Die Markerbeads banden kovalent und verblieben nach dem Waschen auf der Oberfläche während nicht gekoppelte Beads von der Oberfläche abgelöst werden. Zur Herstellung von koppelnden Markerbeads wurden fluoreszenzmarkierte Silikatbeads (sicastar ® -redF von Micromod, mit Carboxyl-Oberfläche, Durchmesser von 2 μm) mit PEG-Diamin (Mw 3400, Shearwater Polymers) via EDC-Aktivierung modifiziert. Für die Modifizierung wurden die Beads in 20μl IM MES-Puffer pH = 4,5 mit einer Endkonzentration von 1 Massenprozent resuspendiert. Diese Suspension wurde transferiert in 1 ml 0,1M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 mM l-Ethyl-3- (3-dimethylamino- propyl) carbodiimid (EDC; Sigma) und 10 mM Polyethylenglykol- Dia in (Mw 3400, Shearwater Polymers) und für 2 Stunden in einem Schüttler bei 750 rpm inkubiert. Die mehrfache Waschung erfolgte mit Wasser. Zur Herstellung von nichtkoppelnden Beads wurden unmarkierte Silikatbeads (sicastar ® von Micromod, mit Carboxylat- Oberflache, Durchmesser von 2 μm) in 1 ml 0,1 M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 M EDC und 10 mM Methoxy-Polyethylenglykol-Ämin (Mw 5000, Shearwater Polymers) für 2 Stunden in einem Schüttler (Thermomixer comfort, Eppendorf) bei 750 rpm inkubiert. Die mehrfache Waschung erfolgte mit Wasser. Für die Belegungsexperimente mit Beads wurden pegylierte Glasplättchen mit Amin-re- aktiver Oberfläche eingesetzt. Zur Herstellung einer pegylierten Glasoberfläche wurden mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan-modifi- zierte Glasplättchen (Herstellung siehe Beispiel 1) mit 100 mg Methoxy-Polyethylenglykol-Ämin (Mw 5000, Shearwater Polymers) in 25 ml Borat Puffer pH = 8,8 bei Raumtemperatur für 24 Stunde inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurde die terminale Amin- Funktion mit Succinanhydrid (Sigma) in einer gesättigten, mit 6N NaOH auf pH = 6,2 - 6,5 gehaltenen Lösung für 2 Stunden modifiziert. Die entstandene Carboxylat-Funktion wurden in 25 ml DMF mit 13 mM N,N,N' , N' -Tetramethyl-O- (N-succinimidyl) -uronium-te- trafluoroborat (TSTU) und 6,9 mM NHS unter Zugabe von 20μl Trie- thylamin aktiviert. Die Waschung erfolgte mit einem DMF/Isopro- panol-Gradienten, abschließend wurde im Stickstoffstrom getrocknet. Zur Belegung der beschichteten Glasplättchen mit Beads wurde eine Mischung von 0,01% Markerbeads mit PEG-Amin-Terminus und von 1% Beads mit PEG-Terminus in Borat Puffer pH = 8,8 aufgenommen, die Mischung auf das Plättchen aufgetragen und 60 Minuten inkubiert. Fig. 13 A zeigt eine Durchlicht-Aufnahme der angelagerten Beads. Während der Inkubation koppelten die Markerbeads mit dem Aminterminus an die NHS-aktivierte Glasoberfläche, sodass die Markerbeads nach einem Waschschritt an dem Glasplättchen verblieben während nichtkoppelnden Beads abgelöst wurden. Fig. 13 B zeigt eine Cy3 Fluoreszenz-Aufnahme der anhaftenden Makerbeads nach der Ablösung der nichtkoppelnden Beads. Der abgebildete Plättchenbereich ist gleich jenes in Fig. 13 A. Beispiel :

Fluoreszenzmarkierte Moleküle wurden von Kugeln in kontrollierter Weise auf eine plane Oberfläche übertragen. Dazu wurden Beads mit Amin-PEG-Cy3 belegt und auf ein Glasplättchen mit PEG-NHS Beschichtung aufgebracht. An den Kontaktstellen zwischen Kugeln und Glas wurde Amin-PEG-Cy3 auf das Glassubstrat übertragen und kovalent gekoppelt, sodass nach Abwaschen der Kugeln fluoreszenzmarkierte Abdrücke verblieben. Für diese Übertragung wurden 20 μl Silicat Beads (Bangs Laboratories Ine, mit Carboxylatoberfläche, Durchmesser 5 μm) in PBS Puffer pH=7,3 mit einer Endkonzentration von 10 Massenprozent resuspendiert. Diese Beads-Suspension wurde zu 1 ml PBS Puffer pH = 7,3 mit 1,2 μM (1 mg) Amin-PEG-Cy3 (Synthese siehe Beispiel 1) zugegeben und für 2 Stunden unter Schütteln (Thermomixer Eppendorf comfort) bei 750 rpm inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in PBS Puffer pH=7,3 wurde im Überstand kein Fluoureszenzsignal (Fluoreszenzenzspek- trometer Hitachi f-4500) nachgewiesen. Zu den beladenden Über- tragungsbeads wurden Markerbeads (Silicat Beads, Bangs Laboratories Inc., Carboxylatoberfläche, Durchmesser 5 μm mit einer gemischten PEG-Amin/ Cy3-PEG-Amin-0berfläche, Herstellung analog zu Beispiel 3) im 1000-fachten Unterschuss gemengt. Die Mischung wurde auf das Glasplättchen mit PEG-NHS-Beschichtung aufgebracht und für 15 Minuten inkubiert (Herstellung der beschichteten Plättchen siehe Beispiel 3) . Die Übertragungsbeads wurden durch Waschen abgelöst und die fluoreszenzmarkierten Abdrücke mit dem Nanoreader visualisiert (siehe Beispiel 1) . Fig. 14 A zeigt einen etwa 100 μm mal 50 μm großen Ausschnitt mit einem Marker- bead hoher Fluoreszenzintensität und ca. 100 Abrücken geringerer Intensität. Fig. 14B zeigt einen Teilausschnitt von Fig. 14A mit Abdrücken unterschiedlicher Fluoreszenzintensitäten.

Beispiel 5 :

Zur Demonstration des Einsatzes von farbmarkierten Beads wurden drei Sorten unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Silikat-Beads (sicastar ® blueF und sicastar ® greenF, sicastar ® redF von Mi- cro od, mit Carboxylatoberfläche, Durchmesser je 2 μm) eingesetzt. Die Beads wurden mit Methoxy-PEG-Amin mittels EDC Aktivierung modifiziert (Herstellung siehe Beispiel 2) . Ebenso wurde das Glassubstrat mit Methoxy-PEG-Amin beschichtet (Herstellung siehe Beispiel 2) . Zur Belegung des Glasplättchens mit Kugeln wurde eine Mischung der drei Beadsorten mit gleichen Anteilen von 0,5 Massenprozent in Wasser mit einer gesamten Endkonzentration von 1,5 Massenprozent suspendiert und auf das Plättchen aufgetragen. Zur Fluoreszenzaufnahme der adsorbierten Beads wurde ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberdampflampe (Zeiss, fluo are HBO 100) und einem Objektiv (Zeiss,Axio- vert PNF 40x/l,3 Öl ) eingesetzt. Ein Bildausschnitt wurde mit drei Filtersätzen aufgenommen: DAPI Anregungsfilter: D365/10x, Dichroitischer Strahlteiler: 380DCLP, Emissionsfilter: D460/50m. FITC Anregungsfilter: HQ480/40x, Dichroitischer Strahlteiler: Q505LP— Emissionsfilter: HQ535/50m. Cy3 Anregungsfilter: HQ535/50x, Dichroitischer Strahlteiler: Q565LP— Emissionsfilter: HQ610/75m. Cy5 Anregungsfilter: HQ620/60x, Dichroitischer Strahlteiler: Q660LP— Emissionsfilter: HQ700/75m. Die einzelnen Bilden wurden zur Verdeutlichung abhängig von den ausgesandten Wellenlängen farblich kontrastiert und mit Hilfe der Software V++ übereinandergelegt (Fig. 15) .

Die blauen Kugeln entsprechen den Signalen der Sicastar blue, die grünen Kugeln jener von Sicastar red, die schwarzen Kugeln jenen der Sicastar green.

Beispiel 6

Zur Demonstration, dass Moleküle an nanoskopischen Inseln gebunden werden können, wurden fluoreszenz-markierte Nanopartikel über molekulare Erkennung (Streptavidin-Biotin) an Gold-Inseln auf einem festen Substrat gekoppelt. Als Nanopartikel wurden gelb-fluoreszierende Beads (Em/Ext: 505/515 nm) (Molecular Probes) mit einem Durchmesser von 40 nm und einer Neutravidin beschichteten Oberfläche eingesetzt. Als Substrat mit nanoskopische Inseln wurde auf einem Silizium-Substrat mittels Elektro Beam Lithographie Gold-Insel mit einem Durchmesser von 50 nm deponiert. Die Oberfläche der Gold-Inseln wurde in der Folge mit N- ( 6- (Biotinamidohexyl) -3 ' - (2' -pyridyldithio) -propiona ide (Bio- tin-HDPD) (Pierce) modifiziert; An die biotinylierte Goldinseln wurden Neutravidin-beschichtete Nanopartikel gebunden. Dazu wurde eine Suspension von 3.6 x 10⁹ Partikeln/ml in PBS auf das modifizierte Substrat aufgebracht, und für 30 min inkubiert. Überschüssige Beads wurden durch mehrmaliges Waschen entfernt und spezifisch gebundenen Beads wurde mit einem Fluoreszenz-Mi- kroskop ausgelesen. Die Auslesung erfolgt mit Fluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberdampflampe (Zeiss, fluo are HBO 100) und einem Objektiv (Zeiss, Axiovert PNF 100x/l,4 Öl). Folgender Filter wurde eingesetzt. FITC Anregungsfilter: HQ480/40x, Dichroitischer Strahlteiler: Q505LP- Emissionsfilter: HQ535/50m.

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Claims

Patentansprüche :

1. Anordnung zur Bindung von Molekülen, umfassend bindungsfähige Funktionalitäten, welche als molekular-einzelne Funktionalitäten oder in Gruppen gleicher Funktionalitäten auf einem festen Träger vorliegen, wobei die Dichte der einzelnen Funktionalitäten bzw. Gruppen von Funktionalitäten auf dem festen Träger von 10^ bis 10-'-0 einzelnen bzw. gruppierten Funktionalitäten pro cm² beträgt, sich bei zumindest 95 %, insbesondere bei zumindest 99 %, der einzelnen bzw. gruppierten Funktionalitäten innerhalb eines gewählten radialen Abstandes d von einer (beliebigen) einzelnen bindungsfähigen Funktionalität oder Gruppe von Funktionalitäten keine weiteren bindungsfähigen Funktionalitäten befinden.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand d von 0,1 bis 100 μm, insbesondere 0,5 bis 10 μm, beträgt .

3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Einheiten, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, aufweist, wobei die Einheiten vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, insbesondere RNA und DNA, sowie Oligopeptiden und Polypeptiden, insbesondere Antikörpern, oder organischen Molekülen, insbesondere Mitgliedern einer kombinatorischen Bibliothek.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten auf dem festen Träger von 10^ bis 10°, insbesondere von 10" bis 10°, einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro cm² beträgt.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche ist.

6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Einheiten, die über die bindungs- fähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, und an welche Moleküle, vorzugsweise nicht kovalent, gebunden sind.

7. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das feste Substrat eine Oberfläche mit nanoskopischen Inseln besitzt.

8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nanoskopischen Inseln aus einem Metall, organischem oder anorganischem Material bestehen.

9. Anordnung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die nanoskopischen Inseln eine Größe von 1 bis 100 nm, bevorzugt von 3 bis 70 nm, besonders bevorzugt von 5 bis 50 nm, insbesondere 10 bis 30 nm, haben.

10. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen den einzelnen nanoskopischen Inseln 0,1 bis 100 μm, insbesondere 0,5 bis 10 μm, beträgt und unabhängig davon der Abstand zwischen einem an die Funktionalität gebundenem, durch Licht anregbarem Molekülteil, insbesondere einem Fluorophor, und der nanoskopischen Insel von 0,1 bis 100 nm, vorzugsweise 1 bis 50 nm, insbesondere 5 bis 30 nm, beträgt.

11. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die nanoskopischen Inseln durch Elektronenstrahl-Lithographie oder Ionenstrahl-Lithographie geschrieben, oder durch Contact Printen mit weichen Stempeln, Atomkraft- Mikroskopie oder Scanning Tunneling Mikroskopie deponiert werden.

12. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass an den einzelnen nanoskopischen Inseln der festen Oberfläche einzelne Adaptoren gebunden sind.

13. Anordnung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Adaptoren dermaßen aufgebaut sind, dass ein Adapter an einer Seite des Adapters eine Bindungsstelle zueiner nanoskopischen Insel der Oberfläche und an der anderen Seite des Adapters eine Bindungsstelle zu einem einzelnen Molekül oder 2, 3 oder 4 von- einander verschiedene Bindungsstellen für verschiedene einzelne Moleküle aufweist.

14. Anordnung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Adaptoren aus anorganischen oder organischen Polymeren, insbesondere Dendrons, oder Biopolymeren, insbesondere Proteinen oder DNA-Dendrimeren, bestehen.

15. Anordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass die Adaptoren an die nanoskopischen Inseln der Oberfläche des festen Substrates über eine kovalente Kopplung, insbesondere über NH₂-, SH-, OH-, COOH-, Cl-, Br-, I-, Iso- thiocyanat-, Isocyanat-, NHS-Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldehyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl- Diimidazol-, Carbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diazirin-Gruppen oder Kombinationen davon, elektrostatische Interaktion, Liganden-Komplexe, biomolekulare Erkennung, insbesondere über Biotin-Streptavi- din, Antikörper-Antigen, DNA-DNA-Interaktion, Zucker-Lectin oder Kombinationen davon, Chemisorption oder Kombinationen davon gebunden sind.

16. Anordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass an einen Adapter ein Einzelmolekül gekoppelt ist, sodass pro Strukturelement auf der Oberfläche des festen Substrates nur ein Einzelmolekül gebunden ist.

17. Anordnung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass für die Kopplung der Einzelmoleküle an die Adapter kovalente Kopplung, insbesondere über NH₂-, SH-, OH-, COOH-, Cl-, Br-, I-, Isothiocyanat-, Isocyanat-, NHS-Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldehyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl-Diimidazol-, Carbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diazirin-Gruppen oder Kombinationen davon, Liganden-Komplexe, biomolekulare Erkennung, insbesondere über Biotin-Streptavidin, Antikörper-Antigen, DNA-DNA-Interaktion, oder Kombinationen davon, oder Kombinationen davon gebunden sind.

18. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide, tragen, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen über die Einheiten und Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden werden,

19. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit aktivierbaren bindungsfähigen Funktionalitäten tragen, die an die Funktionalitäten der festen Oberfläche binden können, sofern sie durch äußere Stimuli aktiviert werden, oder

- . Bereitstellen einer festen Oberfläche mit aktivierbaren bindungsfähigen Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit bindungsfähigen Funktionalitäten tragen,

- Einwirken eines äußeren Stimulus auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, so dass die ak- tivierten bindungsfähigen Funktionalitäten der Hilfsstrukturen bzw. der festen Oberfläche an die anderen bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bzw. der Hilfsstrukturen binden und damit die Hilfsstrukturen über die Einheiten an die feste Oberfläche binden,

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstrukturen im wesentlichen kugelförmige Gebilde eingesetzt werden, welche aus organischen oder anorganischen Polymeren, Metallen oder Metallverbindungen bestehen.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfsstrukturen eine Markierung aufweisen und vorzugsweise mehr als eine Art von markierten Hilfsstrukturen verwendet werden.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass Hilfsstrukturen mit einer Fluoreszenz-Markierung eingesetzt werden, und vorzugsweise Hilfsstrukturen mit unterschiedlicher Fluoreszenz-Markierung verwendet werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche ,18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass eine beliebige Hilfsstruktur nur eine spezifische Art von Einheiten, wie organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide trägt, und eine Population von Hilfsstrukturen mit je unterschiedlich belegten Einheiten verwendet wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die spezifische Fluoreszenz-Markierung der unterschiedlichen Hilfsstrukturen als auch die spezifische Belegung der Hilfsstrukturen mit Einheiten vor Aufbringen der Hilfsstrukturen auf die feste Oberfläche bekannt ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund der Kenntnis der Positionen der fluoreszenz-markierten Hilfsstrukturen auf der festen Oberfläche die chemische Identität der von der Hilfsstrukturen hin- terlassenen Einheiten nach der Ablösung der Hilfsstrukturen bekannt ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontaktieren der festen Oberfläche mit den Hilfsstrukturen unter Zuhilfenahme von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Magnetkraft, elektrischer Anziehung, Anreicherung an Zweiphasen-Grenzschichten oder Kombinationen davon erfolgt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche eingesetzt wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als bindungsfähige Funktionalitäten NH2-, SH-, OH-, COOH-, Cl-, Br-, I-, Isothiocyanat-, Isocyanat-, NHS- Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldheyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl- Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl-Diimidazol-, Carbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diazirin-Gruppen oder Kombinationen davon eingesetzt werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den bindungsfähigen Funktionalitäten und den zu bindenden Einheiten oder zwischen der festen Oberfläche und den bindungsfähigen Funktionalitäten ein Spacer-Molekül vorgesehen wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 und 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, folgende Schritte eingesetzt werden:

- Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäteninsbesondere Maleimid-Funktionalitäten,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit thiolhältigem Reagenzien, insbesondere beta-Mercaptoethanol, welche die Funktionalitäten, insbesondere die Maleimid-Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren,

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit einem physikalischen oder chemischen Stimulus, wie erhöhte Temperatur, welche die molekulare Erkennung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten rückgängig macht, und

- Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, folgende Schritte eingesetzt werden:

- Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Moleküle, einer kombinatorischen Bibliothek, mit aktivierbaren Funktionalitäten, insbesondere photoaktivierbare Phenylazide, tragen, die an die Funktionalitäten, insbesondere an die Amin-Funktionalitäten, der festen Oberfläche binden können, sofern sie, insbesondere durch einen UV-Licht-Beleuchtungsschritt, aktiviert werden, wobei die Einheiten über chemisch spaltbare Funktionalitäten, insbesondere Disulfid-Brücken, an die Hilfsstrukturen gebunden sind,

- lokalisiertes Einwirken eines äußeren Stimulus, insbesondere UV-Licht, auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die Einheiten insbesondere mit den photoaktivierten Phenylaziden an die Funktionalitäten, insbesondere die Amin-Funktionalitäten, binden und damit die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, wobei der äußere Stimulus, insbesondere in Form eines evanes- zierenden Feldes von UV-Licht, eingesetzt wird und wirkt lokalisiert auf Funktionalitäten an der festen Oberfläche wirkt sowie an jenen Teilen der Hilfsstrukturen, die im Bereich des evanszierenden Feldes sind

- Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfs Strukturen mit Mitteln, insbesonder Dithiothreitol, welche die Disulfid-Brücken zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und

32. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Aufbringen von nanoskopischen Inseln auf der Oberfläche eines festen Substrates durch eine Oberflächenstrukturierungsmetho- de, insbesondere Scanning Tunneling Microscopie (STM) , Dip Pen Nanolithographie (DPN) , Electro Beam Lithographie (EBL) , Ionenstrahl-Lithographie (IL) oder Mikro-Contact-Printen (μCP), Aufbringen von Adaptern auf die nanoskopischen Inseln, Kopplung von Einzelmolekülen an die Adaptoren, die an den nanoskopischen Inseln gebunden sind, Absättigen von eventuell vorhandenen unbelegten Inseln durch Varianten von Adaptoren, die keine Moleküle tragen.

33. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Aufbringen von nanoskopischen Inseln auf der Oberfläche eines festen Substrates durch einen Oberflächenstrukturierungsmetho- de, insbesondere Scanning Tunneling Microscopy, Dip Pen Nano- lithography, Electro Beam Lithography, Ionenstrahl-Lithographie oder Mikro-Contact-Printen, Kopplung von Molekülen an Adaptoren in Lösung,

- Abscheiden der ungekoppelten Adaptoren bzw. ungekoppelten Molekülen durch Reinigungsschritte,

- Aufbringen der mit einzelnen Molekülen gekoppelten Adaptoren auf das mit nanoskopischen Inseln strukturierte feste Substrat.

34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche eingesetzt wird.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung von Einzelmolekülen, folgende Schritte eingesetzt werden: Aufbringen von nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold-Dots auf der Oberfläche des festen Substrates aus Glas durch Scanning Tunneling Mikroskopie, Aufbringen der Adaptoren, insbesondere Dendrons, auf die Inseln, wobei ein Dendron an der Peripherie nichtaktivierte Di- sulfidgruppen trägt, welche an die nanoskopische Insel, insbesondere an ein Gold-Dot, binden, und der Dendronkern eine einzelne Funktionalität, insbesondere N-Hydroxy-Succinimid- Funktionalität, trägt, die mit der 5' -Amin-Funktionalität eines Einzelmoleküls, insbesondere eines modifizierten DNA- Oligonukleotides, koppeln kann, Kopplung der Einzelmoleküle an die Adapter, insbesondere durch Reaktion der Amin-Funktionalität der DNA-Oligonukleotide an die N-Hydroxy-Succinimid-Funktionalität der Dendrons, welche an die nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold-Dots, gebunden haben, Entfernen jener Adapter und Einzelmoleküle, die nicht an die nanoskopischen Inseln gebunden haben, insbesondere durch Waschen.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung von Einzelmolekülen, folgende Schritte eingesetzt werden: Aufbringen von nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold-Dots auf der Oberfläche des festen Substrates aus Glas durch Scanning Tunneling Mikroskopie, Kopplung der Einzelmoleküle an die Adapter in Lösung, insbesondere durch Reaktion der Amin-Funktionalität der DNA-Oligonukleotide an die einzelne Funktionalität des Dendronkerns, insbesondere eine N-Hydroxy-Succinimid-Funktionalität, - Aufreinigen der Adapter-Einzelmolekül-Konjugate, insbesondere Dendron-DNA, und Entfernen der nicht gekoppelten Einzel olekü- le oder nicht gekoppelten Adaptoren durch Aufreinigungsmethoden, insbesondere Gelpermeations-Chromatographie,

- Aufbringen der Adapter-Einzelmolekuel-Konjugate, insbesondere Dendron-DNA, auf die nanoskopischen Inseln, insbesondere Gold- Dots, wobei ein Dendron an der Peripherie nichtaktivierte Disulfidgruppen trägt, welche an die Insel binden,

Entfernen jener Adapter-Einzelmolekül-Konjugate, die nicht an die nanoskopischen Inseln gebunden haben, insbesondere durch

Waschen.

37. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 36.

38. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 bei der Fluoreszenz-Mikroskopie-Untersuchung, insbesondere der "Single Dye Tracing" -Scan oder "Time delayed Integration"- Methode .

39. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Bindung von Biomolekülen, insbesondere zur Bindung von Antigenen, Liganden, Proteinen, DNS, mRNS, Toxinen, Viren, Bakterien, Zellen oder Kombinationen davon.

40. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Untersuchung von cDNS von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte cDNSs an die Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden binden, und die Bindung für jede gebundene cDNS-Art ausgelesen werden kann.

41. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Untersuchung der Proteine von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte Proteine an die Anordnung von verschiedenen Antikörpern binden und die Bindung für jede gebundene Protein-Art ausgelesen werden kann.

42. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Visualisierung einzelner Fluoreszenz-markierter Moleküle.

43. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit ultrasensitiver Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei durch die räumliche Nähe der Inseln aus Metall das Fluoreszenz-Signal der einzelnen Insel-gekoppelten Moleküle verstärkt wird im Vergleich zu jenen Moleküle, die gegebenenfalls in den Bereichen zwischen den Inseln unspezifisch angelagert sind.