WO2005021745A1 - 肝細胞癌に関連する遺伝子 - Google Patents

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WO2005021745A1
WO2005021745A1 PCT/JP2004/012425 JP2004012425W WO2005021745A1 WO 2005021745 A1 WO2005021745 A1 WO 2005021745A1 JP 2004012425 W JP2004012425 W JP 2004012425W WO 2005021745 A1 WO2005021745 A1 WO 2005021745A1
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cancer
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recurrence
genes
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Mariko Esumi
Tadatoshi Takayama
Keiko Takagi
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Nihon University
Nippon Flour Mills Co., Ltd.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene associated with hepatocellular carcinoma, particularly a gene associated with recurrence of hepatocellular carcinoma.
  • hepatocellular carcinomas develop from chronic hepatitis due to viral hepatitis.
  • the causative viruses are hepatitis C virus and hepatitis B virus.
  • Interferon is used as a treatment for hepatitis, but only 30% of cases are effective and are not necessarily sufficient.
  • the virus cannot be eliminated, if the progression of the disease state can be suppressed, it will lead to the prevention of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Therefore, it is important to clarify the pathological factors at the molecular level.
  • liver cancer 5 years after surgery is 51% nationwide, and it is reported that relapse occurs in about 25% 1 year after hepatectomy, 50% 2 years after, and 80% 5 years after hepatectomy .
  • the remaining liver tissue cannot be said to be normal liver tissue, and it is thought that there is already a bud of hepatocellular carcinoma recurrence.
  • recurrence risk factors such as tumor maximum diameter, number, portal vein tumor thrombus, preoperative AFP value, intrahepatic metastasis, and presence or absence of cirrhosis are reported.
  • Gene expression analysis by DNA microarray is considered to be a powerful method for knowing the prognosis of such cancers.
  • An object of the present invention is to provide a gene associated with hepatocellular carcinoma, particularly a gene that predicts recurrence of cancer.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result of examining gene expression profiles from cases in which hepatocellular carcinoma has recurred and cases in which hepatocellular carcinoma has not recurred, Was successfully identified, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • a method for evaluating cancer comprising the following steps:
  • the method comprising:
  • PSMB8 gene for example, PSMB8 gene, RALGDS gene, GBP1 gene, RPS14 gene, CXCL9 gene, DKFZp564F212 gene, CYP1B1 gene, TNFSF10 gene, NR0B2 gene, MAFB gene
  • At least one gene selected from the group consisting of BF530535 gene, MRPL24 gene, QPRT gene, VNN1 gene and IRS2 gene can be used.
  • at least one gene selected from the group consisting of PZP gene, MAP3K5 gene, TNFSF14 gene, LMNA gene, CYP1A1 gene and IGFBP3 gene can be used.
  • Each gene included in the set can also be used.
  • a gene set consisting of VNN1, CXCL9, GBP1, and RALGDS genes, or LMNA gene a gene included in the gene set consisting of the gene, COL1A2 gene and PZP gene can also be used.
  • Evaluation of cancer predicts the presence or absence of metastasis or recurrence.
  • Examples of the cancer include hepatocellular carcinoma.
  • the expression level of the gene is measured by a gene set consisting of the VNN1 gene and the MRPL24 gene, a gene set consisting of the PRODH gene, the LMNA gene and the MAP3K12 gene, a gene set consisting of the VNN1 gene, the CXCL9 gene, the GBP1 gene, and the RALGDS gene.
  • Genes are amplified using a combination of primers for amplifying each gene contained in at least one gene set selected from the group consisting of the LMNA gene, LTBP2 gene, COL1A2 gene, and PZP gene. It can be done by doing.
  • a primer set comprising at least one combination of primers consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 2n-1 and 2n (n represents an integer of 1 to 114).
  • a primer set comprising a combination of primers for amplifying each gene contained in at least one gene set selected from the group consisting of a COL1A2 gene and a PZP gene.
  • a cancer evaluation kit comprising any one of the genes shown in Tables 1 to 8.
  • Examples of the gene shown above include at least one gene selected from the group consisting of RALGDS gene, GBP1 gene, DKFZp564F212 gene, TNFSF10 gene and QPRT gene.
  • the above-mentioned genes include, for example, a gene set consisting of VNN1 gene and MRPL24 gene, a gene set consisting of PRODH gene, LMNA gene and MAP3K12 gene, a gene set consisting of VNN1 gene, CXCL9 gene, GBP1 gene and RALGDS gene.
  • the kit of the present invention can include the primer set.
  • a gene useful for predicting the recurrence of hepatocellular carcinoma is provided. By analyzing the state of enhanced expression of this gene, cancer can be evaluated. In particular, by using the gene of the present invention, recurrence of hepatocellular carcinoma can be predicted, and the obtained prediction information is useful for a subsequent treatment plan. In addition, using these genes and gene products, it is possible to develop therapeutic methods for preventing recurrence.
  • FIG. 1 is a diagram showing a sample phylogenetic tree prepared from all gene expression profiles. Genes were rearranged based on the similarity of expression between samples, and the similarity of expression between all genes rearranged the samples to show a close relationship as a phylogenetic tree.
  • the present invention is based on the long-term follow-up clinical data after resection of hepatocellular carcinoma, from the group of patients with poor prognosis (for example, those who relapse within 1 year and die within 2 years) and those with good prognosis ( For example, a gene group that expresses poor prognosis or improves prognosis (e.g., genes involved in promoting recurrence and ).
  • the present invention is based on the clinical data, classifying cases of hepatocellular carcinoma type B and cases of hepatocellular carcinoma by causative virus, and prognostic correlation between non-cancerous tissue and cancerous tissue, respectively. Is identified.
  • the gene of the present invention analyzes the correlation between the tissue actually collected from a patient and the disease state, in which case, in which disease state, and which gene is examined to find out the correlation between the gene and the disease state. It was clarified.
  • test samples are observed in the course of liver cancer surgery and classified into early recurrence and late recurrence groups.
  • the early recurrence group means a group of patients who relapse within a certain period after resection and die later.
  • the period until the recurrence is not particularly limited, and may be, for example, within one year or within two years.
  • the period until death is not particularly limited, but may be, for example, within one year, two years, or three years after recurrence.
  • the delayed group refers to a group of cases that have not recurred for a certain period of time (eg, 3 years or more, preferably 4 years or more).
  • 51 sge I and sge II hepatocellular carcinoma surgery cases were targeted. This includes 16 cases of hepatocellular carcinoma type B and 35 cases of hepatocellular carcinoma type C. Based on these follow-up clinical data, patients with type B hepatocellular carcinoma Two cases, three cases from type C hepatocellular carcinoma, 2 cases from type B hepatocellular carcinoma, and three cases from type C hepatocellular carcinoma were selected as the recurrence delay group. The following expression profiles were analyzed for the RNAs of non-cancerous and cancerous tissues of these 10 cases. 2.
  • Total RNA is extracted from the liver tissues of the groups classified as described above, and the gene expression profiles of each group are compared using a microphone-mouth array. Extraction of total RNA can be performed by using a commercially available reagent (for example, Trizol). The expression profile is detected, for example, using a microarray (Affymetrix).
  • a commercially available reagent for example, Trizol
  • the expression profile is detected, for example, using a microarray (Affymetrix).
  • the present invention can analyze genes that fluctuate in tissues of non-cancerous parts as well as cancerous parts.
  • the non-cancerous part refers to a part of the liver tissue that is included during resection of hepatocellular carcinoma and does not include cancer cells.
  • the “non-cancerous site” is not necessarily normal liver tissue, but also includes chronic hepatitis (hepatitis B and C) or liver cirrhosis.
  • a gene whose expression is upregulated in a non-cancerous part can be analyzed in a group of delayed recurrence of type B hepatocellular carcinoma cases and type C hepatocellular carcinoma cases where most such tissues are present.
  • Evaluation of cancer means evaluation of the condition and progress of cancer, and includes predicting the presence or absence of metastasis and recurrence.
  • the present invention provides a gene whose expression is promoted or suppressed, particularly in relation to recurrence.
  • Recurrence refers to the appearance of new cancerous lesions in the liver after it is determined that treatment for the primary lesion has been completed.
  • cDNA is synthesized using commercially available reverse transcriptase with the to 1 RA prepared as described above.
  • Commercially available PCR reagents can be used, and PCR conditions may be in accordance with commercially available protocols. For example, after preheating for 95 or 10 minutes, the conditions are 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C (or 65 ° C), and 60 seconds for 40 cycles.
  • the target internal standard genes include, for example, glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase (GAPDH)> 18S ribosomal RNA (18S rRNA), ⁇ -Actin, cyclophilin A, HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1), B2M (beta-2 microglobulin), Receptors such as ribosomal protein L13a, ribosomal protein L4 and the like can be used, and those skilled in the art can appropriately select them.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase
  • 18S rRNA 18S ribosomal RNA
  • ⁇ -Actin 18S ribosomal RNA
  • cyclophilin A 18S ribosomal RNA
  • HPRT1 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1
  • B2M beta-2 microglobul
  • the absolute quantification of the expression level is obtained by determining the threshold line at which the calibration curve is optimal, and determining the threshold PCR cycle number and threshold cycle (Ct) value of each sample.
  • the relative expression level is expressed by the A Ct value obtained by subtracting the Ct value of the internal standard gene (eg, GAPDH) from the Ct value of the target gene.
  • a value calculated by the formula of (2 ( _ ⁇ ) ) can be used.
  • Genes were selected from the results of the microarray in the delayed recurrence group and the early recurrence group, and the results of real-time PCR obtained using the above method showed correlation with the time to recurrence among genes that matched the microarray results.
  • the gene can be identified, for example, as a non-cancerous site expression enhancing gene.
  • genes can be selected depending on experimental conditions at the time of identification, for example, depending on an internal standard gene used, a primer sequence, an annealing temperature, and the like.
  • various statistical methods for example,
  • Mann-Whitney U test can be used to select genes that correlate with the time to recurrence.
  • the full-length sequence of the gene of the present invention can be obtained as follows. That is, it can be retrieved from a DNA database and obtained as known sequence information. Alternatively, it is isolated from a human liver cDNA library by hybridization screening.
  • the genes whose expression is enhanced in cases where recurrence was not early are shown in Tables 1 to 4, and the expression is enhanced in cases where recurrence is early. Genes include those shown in Tables 5-8. Table 1: Genes whose expression is upregulated in non-cancerous areas in the delayed recurrence group of B-cell hepatocellular carcinoma cases (24)
  • Table 3 Genes whose expression is upregulated in the cancerous part of the group with delayed recurrence in hepatocellular carcinoma type B (137)
  • Table 5 Genes that are upregulated in non-cancerous areas in the early recurrence group of type B hepatocellular carcinoma cases (48)
  • Table 7 Genes that are upregulated in the cancerous part in the early recurrence group of type B hepatocellular carcinoma cases (75)
  • Table 8 Genes that are upregulated in the cancerous part in the early recurrence group of type C hepatocellular carcinoma cases (38)
  • CTH and “AL354872” are genes encoding the same protein.
  • genes can be included alone or in appropriate combination in a kit for evaluating cancer.
  • Table 16 (to be described later) Can be mentioned.
  • the gene may be a partial sequence thereof. These genes can be used as probes for detecting the gene expression described in the table.
  • kit of the present invention may include a primer for gene amplification, a buffer, a polymerase and the like.
  • the gene amplification primer obtains the DNA sequence and mRNA sequence of each gene sequence from the database, and obtains information including the presence / absence of variants and exon intron structure.
  • Target In particular, one primer should be designed so that it spans adjacent exons so that only mRNA is detected.
  • a candidate for the design of a primer was obtained. Select a primer that avoids the ring.
  • Preferred primers are shown in the general formulas 2n-1 and 2n (n is an integer from 1 to 114).
  • the primer represented by 2n-l and the primer represented by 2n can be used as one set.
  • n is 1, the primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 can be used as one primer set, and if n is 2, the primer set of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 can be used. it can.
  • Particularly preferred primers are those indicated by n forces 2, 4, 7, 9, and 17.
  • hepatocellular carcinoma recurrence inhibitory molecules was advanced at the genetic level using human liver tissues of type B and C hepatocellular carcinoma cases.
  • TRIzol regent (Life Technologies, Gaithersburg, MD) was added to the cryopreserved tissue, and homogenized with a polytron. To the homogenate solution was added black-mouthed form, mixed well, and centrifuged. After centrifugation, the upper layer was collected: an equal volume of isopropanol was added, and the total RNA precipitate was collected by centrifugation.
  • hepatocellular carcinoma hepatitis B virus caused by hepatitis B virus
  • delayed recurrence group of two non-cancerous part and cancer part C type Hepatocellular carcinoma cases (hepatocellular carcinoma with hepatitis C virus as the causative virus) in three groups: non-cancerous part and cancer part in 3 early patients, non-cancerous part and cancer part in 3 recurrence groups Separation and expression analysis were performed.
  • RNA transcript labeling kit (Affymetrix, Inc, CA) to synthesize biotin-labeled cRNA.
  • genes with a difference of 2.5 times or more between non-cancerous areas with / without recurrence were up34 and down58, and genes with a 3-fold or more difference between cancer areas were up215.
  • the number of genes whose expression was increased without recurrence for both type B / C was 0 in non-cancerous parts and 26 in cancerous parts.
  • the number of genes whose expression was increased by recurrence for both type B / C was 2 in non-cancerous parts and 3 in cancerous parts.
  • there was a gene whose expression was upregulated in both cancerous and non-cancerous parts 5 without recurrence and 10 with recurrence.
  • the total in Table 9 is 401, but this is 401 instead of 402 because the overlap of GLUL is special.
  • the difference in the prognosis for recurrence is that the gene expression change is greater in the cancerous part than in the non-cancerous part, and the difference in gene expression 4 is greater in ⁇ type hepatocellular carcinoma cases than in type C hepatocellular carcinoma cases.
  • Table 1 OA shows the clinicopathological findings and the time to recurrence (the period without recurrence) for each case.
  • CH chronic hepatitis
  • LC cirrhosis
  • the number of months without recurrence is the number of months until recurrence
  • CH chronic hepatitis
  • LC cirrhosis
  • NL normal liver
  • the number of months without recurrence is the number of months until recurrence
  • Table 2 shows the genes (CNgood) that are upregulated in non-cancer The relationship between the recurrence period and the expression level was examined for a total of 21 genes, including 9 genes and 12 genes (CNbad) whose expression is enhanced in the non-cancerous part of the early recurrence group in Table 6.
  • to1 RNA was extracted from the non-cancerous liver tissue of each case in the same manner as in Example 1 above.
  • DNase I DNase I (TAKARA SHUZO, Kyoto, Japan) at 37 ° C for 20 minutes, and then repurified with TRIzol regent.
  • a reverse transcription reaction was carried out using 100 units of a reaction mixture containing 25 units of AMV reverse transcriptase XL (TAKARA) and 250 pmol of a 9-mer random primer.
  • Real-time PCR was performed using 0.25 to 50 ng of each of the synthesized cDNAs.
  • ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) was used for preheating at 95 ° C for 10 minutes using a 25 x 1 reaction solution of SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), and then 15 at 95 PCR was performed under the conditions of 60 ° C (or 65) followed by seconds and 40 to 45 cycles for 60 seconds.
  • Relative quantitative analysis was performed using glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase (GAPDH) or 18S rRA as the internal standard gene of each sample, and some were subjected to absolute quantitative analysis. Serial dilutions of the standard samples were measured at the same time and used for the calibration curve. The threshold line at which the calibration curve was optimal was determined, and the number of threshold PCR cycles and the threshold cycle (Ct) value of each sample were determined. The A Ct value was calculated by subtracting the Ct value of GAPDH or 18S rRNA from the Ct value of the target gene, and this was used as the relative expression level of the target gene. Furthermore, the value calculated using the formula of 2 ( _A Ct) was used for evaluation of the linear expression level.
  • GAPDH glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase
  • 18S rRA 18S rRA
  • the ratio between the delayed recurrence group (case numbers 59, 18, 6) and the early group (case numbers 14, 15, 44) was determined from the results of quantitative PCR of This means that the result was the same as the result of the microarray of Example 1;
  • the ratio is preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more.
  • the number in the box next to “ ⁇ ” indicates the value of the ratio (ratio of the average of three cases).
  • An “X” in the “Match microarray” column indicates a discrepancy with the microarray results. “XX” indicates an inverse correlation with the microarray result.
  • ⁇ correlation '' refers to the relationship between the gene expression level and the time to recurrence in 22 cases or 31 cases for which the number of months of recurrence has been determined. Means a correlation between the two, and when the correlation is significant, the ⁇ or r value is indicated, and the p value is described.
  • Table 11B and Table 12B in the column of “significant difference between the two groups”, 19 cases with recurrence within 24 months and 6 cases without recurrence for more than 40 months (Table 11B and Table 12B Difference), or 4 cases without recurrence for more than 58 months (Table 11B, Table 12B “Significant difference between two groups” column, lower column). The value (Mann-Whitney, U test) is shown.
  • the primer sequences (sense strand (order) and antisense strand (reverse)) used in the test are shown in Table 11A, Table 11B, Table 12A and Table 12B (SEQ ID NOS: 1 to 88).
  • Table 11A and Table 11B show the results of analysis of nine gene candidates (CNgood) whose expression is upregulated in the non-cancerous part in the recurrence delay group of type C hepatocellular carcinoma cases.
  • Table 11A shows the results of quantitative PCR performed on the cases shown in Table 1OA using GAPDH as the internal standard gene under the conditions shown in Table 11A.
  • Table 11A Results of quantitative PCR of "genes whose expression is upregulated in non-cancerous areas in the group with delayed recurrence of hepatitis C"
  • the ratio of the delayed recurrence group / early group was calculated, and those that were 1.5 or more were marked as ⁇ .
  • the correlation is indicated by an O and a p-value is shown for those showing a correlation between the gene expression level of 22 cases and the period until recurrence.
  • eight genes were in agreement with the results of the microarray, of which four genes (RALGDS, GBP1, DKFZp564F212, TNFSF10) showed a correlation with the time to recurrence.
  • Table 1 IB results of determination of hepatitis that expression is upregulated in non-cancerous areas in the group with delayed recurrence of hepatitis type *
  • the expression ⁇ of each gene according to the standard is determined by using as a control gene and the relative value to the expression position.
  • the agreement with the microarray was determined by calculating the ratio of the delayed recurrence group / early group from the results of the constant SPCR of the 6 cases used in the microarray analysis.
  • Table 12A and Table 12B show the results of analysis of 12 gene traps (CNbad) whose expression is upregulated in non-cancerous areas in the early recurrence group of type C hepatocellular carcinoma cases.
  • Table 12A shows the results of quantitative PCR performed on the cases shown in Table 1OA using GAPDH as the internal standard gene under the conditions shown in Table 12A.
  • Table 12A ⁇ Genes whose expression is upregulated in non-cancerous areas in the early relapse group of patients with hepatitis C '' Quantitative PGR results
  • the QPRT gene was a gene showing an inverse correlation. As a result, seven genes were in agreement with the microarray results, but none of the genes significantly correlated with the time to recurrence. However, the QPRT gene showed a significant inverse correlation. Therefore, this gene was identified as a gene whose expression is upregulated in non-cancerous sites in the recurrence delay group.
  • Table 12B shows the results of quantitative PCR performed on the cases shown in Table 10B under the conditions shown in Table 12B using GAPDH or 18S rRNA as the internal standard gene.
  • PSMB8 gene also called LMP7 gene: gene for proteasome subunit, beta type, 8
  • RALGDS rejection is child: ral guanine nucleotide dissociation stimulator; rito child GBP1 direct transduction na: guanylate-binding protein 1 remains 1s child
  • RPS14 gene ribosomal protein S14 gene
  • CXCL9 gene gene for chemokine (C-X-C motif) ligand 9
  • DKFZp564F212 gene An expressed gene found in the German Genome Project, for which no gene product has been identified and its function has not been predicted.
  • CYP1B1 family 1ST cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1 family,
  • TNFSFIO Abbreviation for TNF (ligand) super family, member 10, a ji gene of TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)
  • NR0B2 1 child nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2
  • MAFB j3 ⁇ 4fe-f v-maf mus culo ap oneur o tic fibrosarcoma oncogene homolog B gene
  • BF530535 gene Gene product whose gene product has not been identified and whose function cannot be predicted
  • MRPL24 reprinted copy mitochondrial ribosomal protein L24 gene
  • VNNl gene vanin 1 gene
  • CH chronic hepatitis
  • LC cirrhosis
  • NL normal liver.
  • stage I / H is unknown though it is either.
  • the number of months without recurrence includes the number of months up to recurrence, as well as those without recurrence at the time of the survey.
  • the relationship between the recurrence period and the expression level was examined for a total of 71 genes, of which 47 are genes (BNbad) whose expression is enhanced in the non-cancerous part of the early recurrence group in Table 5, and in Table 5.
  • RNA was extracted from the non-cancerous liver tissue of each case in the same manner as in Example 1 above.
  • the cells were treated with DNase I (DNase I (TAKARA SHUZO, Kyoto, Japan) at 37 ° C for 20 minutes, and then re-purified with TRIzol regent.
  • Reverse transcription was performed using 100 units of a reaction solution containing 25 units of AMV reverse transcriptase XL (TAKA A) and 250 pmol of a 9-mer random primer.
  • DNase I DNase I (TAKARA SHUZO, Kyoto, Japan)
  • TRIzol regent Reverse transcription was performed using 100 units of a reaction solution containing 25 units of AMV reverse transcriptase XL (TAKA A) and 250 pmol of a 9-mer random primer.
  • Real-time PCR was performed using 0.25 to 50 ng of each synthesized cDNA.
  • ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) was used for preheating for 95 and 10 minutes using 251 reaction solutions of SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), and then at 95 ° C for 15 seconds. Subsequently, PCR was performed under the conditions of 60 ° C (or at 65) for 60 seconds for 40-45 cycles.
  • Absolute quantitative analysis was performed using GAPDH or 18S rRNA as an internal standard gene in each sample. Standard samples were serially diluted and measured at the same time and used for the calibration curve.
  • the absolute expression levels of the target gene and the internal standard gene were determined, and the ratio of the target gene expression level to the internal standard gene expression level for each sample was calculated and used for evaluation. All measurements were performed in duplicate.
  • “Match with microarray” in Tables 14 and 15 refers to the four cases (case numbers 67, 60, 13, and 9 in Table 13) used in the microarray analysis, as described in Example 2. From the results of the quantitative PCR, the ratio between the delayed recurrence group (Case Nos. 67 and 60) and the early group (Case Nos. 13 and 9) was calculated, and the ratio of 1.5 or more was consistent with the microarray result of Example 1. Means that. A sample having the above ratio of 1.5 or more, preferably 2 or more was rated as ⁇ . The numbers in and adjacent to “ ⁇ ” indicate the value of the ratio. The “X” in the “Match microarray” column indicates a discrepancy with the microarray results. “XX” indicates an inverse correlation with the result of the microarray.
  • the “correlation” column in Tables 14 and 15 shows the r-value and p for the correlation between the gene expression level and the period until recurrence in 10 cases for which the number of months of recurrence has been determined. The values are described.
  • the primer sequences (sense strand (order), antisense strand (reverse)) used in the test are shown in Tables 14 and 15 (SEQ ID NOS: 89 to 228).
  • Table 14 shows the results of analyzing 24 gene candidates (BNgood) whose expression is upregulated in non-cancerous areas in the group with delayed recurrence of type B hepatocellular carcinoma cases.
  • Table 14 shows the results of quantitative PCR performed on the cases shown in Table 13 using GAPDH or 18S rNA as the internal standard gene under the conditions shown in Table 14. 5'-3 ') one one ⁇ , ⁇
  • the number of genes that matched the results of the microarray was 19 when GAPDH was used as the internal standard gene, of which the phase was equivalent to the time to recurrence There were no genes.
  • the number of genes that matched the results of the microarray was 9 when 18srRNA was used as the internal standard gene, and one of them (PZP gene) showed a correlation with the time to recurrence.
  • the agreement with the microarray was determined by calculating the ratio of the early recurrence group to the late delay group based on the results of the fixed rack in the example used for the microarray analysis.
  • MAP3K5 Regression is: mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Remission is child TNFSF14 to tocolate: tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 14
  • LMNA gene lamin A / C gene
  • CYPIAI ⁇ ⁇ cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1
  • IGFBP3 is islet: a gene for insulin-like growth factor binding protein 3
  • Example 4
  • the expression level of each gene in the VNN1, CXCL9, GBP1, and RALGDS gene sets may be examined. The expression level of each gene is substituted into a discriminant using a discriminant function coefficient obtained for each gene, and the value is used for discrimination.
  • the classification rate between the early recurrence group and the late recurrence group is 88% for GAPDH correction and 100% for 18S rRNA.
  • the expression level may be determined. If the above discrimination is corrected using 18S rRNA as an internal standard gene, the expression level of each gene in the LMNA, LTBP2, COL1A2, and PZP gene sets may be examined. As described above, these expression levels are substituted into a discriminant, and the values are used for discrimination.
  • the classification rate between the early recurrence group and the late recurrence group by analyzing the expression level of the gene group is 100% in both the case of GAPDH correction and the case of 18S rRNA.
  • PRODH miKTp Proline dehydrogenase (oxidase) 1
  • LTBP2 relapse: latent transrormmg growth factor oeta binding protein 2; mfe child
  • COL1A2 gene collagen, type I, alpha 1 gene
  • MAP3K12 remains: mitogen-activated protein kinase kinase kinase 12 remains to ⁇
  • SEQ ID NOS: 1-28 Synthetic DNA

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Abstract

本発明は、癌の評価方法であって、以下のステップ：　(a) 検体からtotal RNAを採取し、　(b) 表１～８に示される遺伝子の中の少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること　を含む前記方法を提供する。

Description

明 細 書 肝網胞癌に関連する遺伝子 技術分野
本発明は、 肝細胞癌に関連する遺伝子、 特に肝細胞癌の再発に関連する遺伝子 に関する。 背景技術
肝細胞癌のほとんどは、 ウィルス性肝炎による慢性肝炎から発症する。 その原 因ウィルスは、 C型肝炎ウィルスと B型肝炎ウィルスである。 いずれも持続感染 すると治療法はなく、 肝硬変、 肝細胞癌発症の恐怖と立ち向かうほかない。 イン ターフェ口ンが肝炎治療薬として使用されているが、有効例はわずか 30 %であり、 必ずしも十分な治療薬とはいえない。 特に慢性肝炎ではほとんど有効例を見ない のが現状である。 しかし、 たとえウィルスが排除できなくとも、 病態の進展を抑 えることができれば、 肝硬変や肝細胞癌の予防につながるため、 病態の進展因子 を分子レベルで明らかにすることが重要となる。
一方、 一度肝細胞癌が発生すると、 外科的根治術がなされても、 残肝再発は高 頻度に出現する。 肝癌の術後 5年生存率は全国集計で 51%であり、 肝切除後 1年 で約 25%、 2年で 50%、 5年では 80%の症例で再発が起こることが報告されてい る。 こうなると、 残肝組織は正常肝組織とはいえず、 すでに肝細胞癌再発の芽が 存在するとも考えられる。 現在、 再発危険因子として、 腫瘍最大径、 個数、 門脈 腫瘍栓、 術前 AFP値、 肝内転移、 肝硬変の有無などが報告されている。 しかし、 肝細胞癌再発の予測および予防法を開発するには、これら危険因子にも関連する、 再発の有無を決定する因子を分子レベルでとらえる必要がある。 この分子レベル の因子は、 再発だけでなく、 肝細胞癌発症や病態の進展そのものにも関わる因子 であると考えられる。 近年、 DNA マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析によ り、 病態を遺伝子全体の発現パターンの違いにより、 より詳細に分類できるよう になってきた。 これまで癌の分類には主に組織学的、 免疫学的手法が用いられて きたが、 同じ型に分類された癌でも臨床経過、 治療効果が症例によって異なって いる。これらを詳細に分類でき^)手法があれば、個々に応じた治療が可能となる。
DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析は、このような癌の予後を知る上で、 強力な方法と考える。
今までに、 肝細胞癌に関わる DNAマイクロアレイ解析では、
(i) 癌部、 非癌部間において、 どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？ (Shirota Y, Kaneko S， Honda M, et al. Identification of differentially expressed gene in hepatocellular carcinoma with cDNA micro arrays. Hepatology 2001; 33： 832-840、 Xu X, Huang J, Xu Z, et al. Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver. Proc. Nat. Acad. Sci. USA . 2001; 98: 15089-15094)
(ii) 癌組織の分化度において、 どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？ (Shirota Y， Kane O ¾， Honda M, et al. Identification or differentially expressed gene in hepatocellular, carcinoma with cDNA micro arrays. Hepatology 2001; 33： 832-840、 Okabe H, Satoh S, Kato T, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA micro array： Identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer res. 2001； 61： 2129- 2137)
(iii) B型肝炎由来の肝細胞癌と、 C型肝炎由来の肝細胞癌とでは、 どのような 遺伝子に発現の違いが見られるか？（Okabe H, Satoh S， Kato T, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA micro array ： Identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer res. 2001； 61 : 2129- 2137)
(iv) 肝細胞癌血管浸潤の有無により、 どのような遺伝子に発現の違いが見られ る力、？ (OKaoe H, Satoh S, Kato T, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA micro array： Identification of genes involved, in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer res. 2001； 61： 2129- (v) 多結節性肝細胞癌のクローン解析を行い、 肝内転移癌に共通して見られる 遺伝子の発現変化は何か？.. (Cheung S, Chen X, Guan X, et al. Identify metastasis-associated gene in hepatocellular carcinoma through clonality delineation for multinodular tumor. Cancer res. 2002； 62： 4711- 4721)
などが明らかにされている。 しかしながら、 再発に関与する遺伝子に関しては、 飯 ¾ら (lizuka N, Oka M, Yamada-Okabe H, et al. Oligonucleotide microarray for prediction of early intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma after curative resection. Lancet 2003; 361: 923-929) の癌組織での解析にとどまる。 残肝組織を 反映する非癌部肝組織での解析は、 未だなされていない。 発明の開示
本発明は、 肝細胞癌に関連する遺伝子、 特に癌の再発を予知する遺伝子を提供 することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 肝細胞癌の再発 を起こした症例と再発のなかった症例から遺伝子発現のプロファイルを検討した 結果、 肝細胞癌に関連する遺伝子を同定することに成功し、 本発明を完成するに 至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total RNAを採取し、
(b) 表 1〜8に示される遺伝子の中の少なくとも 1つ以上の遺伝子の発現量を 測定し、
(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
本発明においては、 表 1〜 8に示される遺伝子のうち、例えば PSMB8遺伝子、 RALGDS遺伝子、 GBP1遺伝子、 RPS14遺伝子、 CXCL9遺伝子、 DKFZp564F212 遺伝子、 CYP1B1 遺伝子、 TNFSF10 遺伝子、 NR0B2 遺伝子、 MAFB 遺伝子、 BF530535遺伝子、 MRPL24遺伝子、 QPRT遺伝子、 VNN1遺伝子及び IRS2遺伝 子からなる群から選ばれる少なぐとも 1つの遺伝子を用いることができる。 ある いは、表 1〜 8に示される遺伝チのうち、例えば、 PZP遺伝子、 MAP3K5遺伝子、 TNFSF14遺伝子、 LMNA遺伝子、 CYP1A1遺伝子及び IGFBP3遺伝子からなる 群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子を用いることができる。
また、 内部標準遺伝子として GAPDHを用いて測定する際には、 表 1〜8に示 される遺伝子のうち、 VNN1遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 又は PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝子からなる遺伝子セッ トに含まれる各遺伝子を用いることもできる。
さらにまた、 内部標準遺伝子として 18S rRNAを用いて測定する際には、 表 1 〜 8に示される遺伝子のうち、 VNN1遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子及び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セット、 又は LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子を用 いることもできる。
癌の評価は、 転移の有無又は再発の有無を予測するというものである。 また、 癌としては、 例えば肝細胞癌が挙げられる。
遺伝子の発現量の測定は、配列番号 2n-l及び 2n (nは 1〜114の整数を表わす） で示される塩基配列からなるプライマ一の組合せを少なくとも 1組用いて、 遺伝 子を増幅することにより行なうことができる。 あるいは、 遺伝子の発現量の測定 は、 VNN1遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 PRODH遺伝子、 LMNA 遺伝子及び MAP3K12 遺伝子からなる遺伝子セット、 VNN1 遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子及び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セット、 並び に LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子からなる遺伝 子セッ卜からなる群から選択される少なくとも 1つの遺伝子セットに含まれる各 遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを用いて、 遺伝子を増幅することに より行うことができる。
( 2 ) 配列番号 2n-l及び 2n (nは 1〜114の整数を表わす） で示される塩基配列 からなるプライマ一の組合せを少なくとも 1組含むプライマ一セット。 ( 3 )VNN1遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12 遺伝子からなる遺伝子セット、 VNN1 遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子 び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セット、 並び に LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子からなる遺伝 子セッ卜からなる群から選択される少なくとも 1つの遺伝子セッ卜に含まれる各 遺伝子を増幅するためのプライマ一の組合せを含むプライマーセット。
( 4 ) 表 1〜8に示されるいずれかの遺伝子を含む、 癌の評価用キット。
上記示される遺伝子としては、 例えば RALGDS 遺伝子、 GBP1 遺伝子、 DKFZp564F212遺伝子、 TNFSF10遺伝子及び QPRT遺伝子からなる群から選ばれ る少なくとも 1つの遺伝子が挙げられる。
または、 上記示される遺伝子としては、 例えば VNN1遺伝子及び MRPL24遺 伝子からなる遺伝子セット、 PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝 子からなる遺伝子セット、 VNN1 遺伝子、 CXCL9 遺伝子、 GBP1 遺伝子及び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セット、 並びに LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択され る少なくとも 1つの遺伝子セッ卜に含まれる各遺伝子が挙げられる。
また、 本発明のキットには前記プライマーセットを含めることができる。 本発明により、 肝細胞癌の再発を予知するために有用な遺伝子が提供される。 この遺伝子の発現亢進状態を解析することで、癌を評価することができる。特に、 本発明の遺伝子を用いることにより、 肝細胞癌の再発を予知することができ、 得 られた予知情報はその後の治療方針に有用である。 また、 これらの遺伝子および 遺伝子産物を用いて、 再発予防の治療法を開発することが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 全遺伝子発現プロファイルより作製したサンプル系統樹を示す図であ る。 サンプル間の発現様式の類似性で遺伝子が再配列され、 さらに全遺伝子の発 現様式の類似性から、 サンプルが再配列されて、 近縁関係が系統樹として示され る。 発明を実施するための最良,の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明は、肝細胞癌切除後の長期間のフォローアップ臨床データから、予後不良 の症例群 （例えば 1年以内に再発して 2 年以内に死亡する症例群） と、予後良好 の症例群 （例えば 4 年以上再発がない症例群） とに分け、切除した肝組織に発現 する遺伝子群の特徴から、 予後を不良にする遺伝子又は予後を良好にする遺伝子 (例えば再発促進に関わる遺伝子と再発抑制に関わる遺伝子） を同定することを 特徴とする。 本発明は、 臨床データをもとにして、 原因ウィルス別に B型肝細胞 癌症例と C型肝細胞癌症例とに分け、各々非癌部の組織及び癌部の組織から、 予 後の相関関係を有する遺伝子を同定するというものである。
本発明の遺伝子は、 どの症例の、 どの病態のときの、 どの遺伝子を調べると、 遺伝子と病態との相関関係がわかるのかについて、 実際に患者から採取した組織 と病態との相関関係を解析することによって、 明らかにされたものである。
1 . 被検サンプルの分類
被検サンプルは、 肝癌手術後の経過を観察し、 再発早期群と遅延群とに分類す る。
再発早期群とは、 切除術後、 一定期間内に再発してその後死亡する症例群を意 味する。 再発までの期間としては特に限定されるものではないが、 例えば 1年以 内又は 2年以内を例示することができる。 死亡するまでの期間も特に限定される ものではないが、 例えば、 再発から 1年以内、 2年以内又は 3年以内などが挙げ られる。 遅延群とは、 一定期間以上 （例えば 3年以上、 好ましくは 4年以上） 再 発がない症例群を意味する。
実際には 51症例の s ge Iおよび s ge IIの肝細胞癌手術症例を対象とした。そ の内訳は、 B型肝細胞癌症例が 16例、 C型肝細胞癌症例が 35例を含む。 これら のフォローアツプ臨床データをもとに、 再発早期群として B型肝細胞癌症例から 2例、 C型肝細胞癌症例から 3例を、 再発遅延群として B型肝細胞癌症例から 2 例、 C型肝細胞癌症例から 3例を選んだ。 これら 10例の非癌部および癌部組織の RNAについて、 以下の発現プ Pファイル解析を行った。 2 . 遺伝子の解析
前記の通り分類された群の肝組織から total RNAを抽出し、 各群間のマイク口 アレイによる遺伝子発現プロファイルを比較する。 total RNAの抽出は、 市販の 試薬 （例えばトリゾール） を用いることにより行うことができる。 発現プロファ ィルの検出は、 例えばマイクロアレイ（ァフィメトリクス社)を用いる。
さらに、 本発明は、 癌部のほか非癌部の組織において変動する遺伝子を解析す ることができる。 ここで、 非癌部とは、 肝細胞癌切除術時に含まれる肝組織であ つて、 癌細胞が含まれていない部分を意味する。 但し、 「非癌部」 は必ずしも正常 肝組織であるとは限らず、 慢性肝炎 （B型肝炎や C型肝炎） 又は肝硬変を呈する 組織も含まれる。 例えば、 このような組織がほとんどである B型肝細胞癌症例や C型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子を解析の 対象とすることができる。 慢性肝炎又は肝硬変を呈する組織の場合は、 壊死炎症 反応や肝再生結節、 脱落肝細胞を補う繊維化などが観察され、 中には肝細胞癌発 生に向けて予備軍となりうる細胞も存在する。 従って非癌部組織にこそ予後と関 係する遺伝子発現が存在すると考えられ、その遺伝子発現を指標として（例えば、 遺伝子発現の変動を解析することで）、 予後（例えば再発） を予知することができ る。
遺伝子発現の変動と表現型 （再発、 早期進行等） との相関関係から、 癌を評価 するための遺伝子を同定する。 癌の評価とは、 癌の病態や進行度に関する評価を 意味し、 転移の有無、 再発の有無などを予測することが挙げられる。
本発明では、特に再発に関連して発現が促進又は抑制される遺伝子を提供する。 再発とは、 原発病巣に対する治療が完了したと判断された後に、 新たな癌と考え られる病巣が肝内に出現することをいう。 3 . 遺伝子の評価
同定された遺伝子について、 病態進展を抑える因子として使えるか、 病態モデ ル細胞や動物で、 評価する。 すなわち、 （1)予後のわかっている残りの肝細胞癌症 例について遺伝子発現定量解析を行い、 予後と相関するか否かを検討する。
(2)肝細胞癌培養細胞株に遺伝子導入して発現させ、 その細胞増殖性、 悪性度の 変化を、 軟寒天培地下でのコロニー形成能やヌードマウスでの腫瘍形成能で評価 する。 （3)慢性肝炎患者より樹立した肝細胞培養株を用いて、 遺伝子導入し発現さ せ、 その細胞増殖性、 悪性転換を、 上記 (2)の方法と同様の方法で評価する。 （4) 肝細胞癌発癌モデル動物の肝臓に遺伝子導入して発現させ、 肝発癌までの経過で 評価する。
上記 （1 ) において、 遺伝子発現の定量解析は、 例えばリアルタイム PCR に より行う。すなわち、上記のように作製した to 1 R Aに市販の逆転写酵素を用い て cDNAを合成する。 PCR試薬は市販のものを用いることができ、 PCRの条件も 市販のプロトコールにしたがってよい。例えば、予備加熱を 95 、 10分行ったのち、 95°C 15秒に続けて 60°C (または 65°C)、 60秒を 40サイクルという条件である。対象 とする内部標準遺伝子としては、 例えば、 glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase(GAPDH) > 18S ribosomal RNA (18S rRNA)、 β -Actin、 cyclophilin A、 HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1)、 B2M (beta-2 microglobulin)、 ribosomal protein L13a、 ribosomal protein L4等のノ、ウスキ一ヒノグ退 1 子を用レ ることができ、 当業者であれば適宜選択することができる。 解析方法は発現量の 絶対的定量解析または相対的定量解析が採用されるが、 好ましくは絶対的定量解 析である。ここで、発現量の絶対的定量とは、検量線が最適となる閾値線 (threshold line)を決定し、各サンプルの閾値 PCRサイクル数、 threshold cycle(Ct)値を求める ことにより得られるものであり、 発現量の相対的発現量は、 標的遺伝子の Ct値 から内部標準遺伝子 （例えば GAPDH) の Ct値を差し引いた A Ct値で表される ものである。 線形発現量の評価には、 （2 (_ Δ α)) の計算式で計算したものを用い ることができる。
検量線を作成する場合には、標準試料の系列希釈を行って同時に測定したもの (同じ反応溶液を使って、 同じプレートに入れ、 同時期に測定したもの） を用い てよい。
検量線より絶対発現量を換算:!?きる場合は、 標的遺伝子および内部標準遺伝子 の絶対発現量を求めて、 サンプルごとに標的遺伝子発現量 Z内部標準遺伝子発現 量の比を算出することにより、 評価に用いることができる。
再発遅延群および再発早期群のマイクロアレイの結果から遺伝子を選択して、 上記の方法を用いて得られたリアルタイム P C Rの結果がマイクロアレイの結果 と一致する遺伝子のうち、 再発までの期間と相関を示した遺伝子を、 たとえば非 癌部発現亢進遺伝子と同定することができる。
上記のように発現亢進遺伝子と同定される遺伝子は、 同定する際の実験条件に よって、 例えば用いる内部標準遺伝子、 プライマ一配列、 アニーリング温度など によって、種々のものを選択することができる。また、各種の統計方法（例えば、
Mann-Whitney U test) を用いて、 再発までの期間と相関する遺伝子を選別するこ ともできる。
本発明の遺伝子の全長配列は、以下のようにして得ることができる。すなわち、 DNA データベースより検索し、 既知の配列情報として得ることができる。 ある いは、 ヒト肝臓 cDNAライブラリ一より、 ハイブリダィゼーシヨンスクリーニン グにより単離する。
本発明において、 再発が早期になかった症例 （再発遅延） において発現が亢進 される遺伝子としては、 表 1〜表 4に示されるものがあり、 再発が早期にあった 症例において発現が亢進される遺伝子としては、表 5〜 8に示されるものがある。 表 1 : B 型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 (24)
表 2 ： C 型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 (10)
表 3 :B型肝細胞癌症例の再発遅延群で、癌部において発現亢進する遺伝子 （137) 表 4 ： C 型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 癌部において発現亢進する遺伝子 (104) 表 5 : B 型肝細胞癌症例の再発早期群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 (48)
表 6 ： C 型肝細胞癌症例の再 早期群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 (12)
表 7 : B型肝細胞癌症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子 （75) 表 8： C型肝細胞癌症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子 （38)
表 1 B型肝炎症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子 （24) (BNgood) 畨 oate子 重複グループ
1 TNFSF14
2 MMP2
3 SAA2 B型癌遅延群
4 COL1 A1
5 COL1A2
6 DPYSL3
7 PPARD
8 LUM
9 MSTP032
10 CRP
1 1 TRIM38
12 S100A6
13 PZP
14 EMP1
15 A 90053
16 AP3K5
17 TI P1
18 GST 1 B型癌遅延群 C型癌遅延群
19 CSDA
20 GST 2 B型癌遅延群 C型癌遅延群
21 SGK B型癌遅延群
22 L NA
23 MGP
24 LTBP2 炎症例の再発連延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子（10) (CNgood) 退伝ナ 重複グループ
M 10098 B型癌遅延群 G型癌遅延群
PSMB8 RALGDS
APOL3 GBP1 RPS14
CXCL9 DKFZp564F212 CYP1 B1
TNFSF10
B型肝炎症例の再発遅延群で、癌部において発現亢進する遺伝子 （137) (BTgood) isfa子 重複グル —プ
35 HP
25 Μΐυυϋο 开1ョ
し S^asJ^ SiE 平 し ョ 千 6 し Yド cl
37 HDL
38 GPX4
39 G0S2
40 HA02
41 ATF5 C型 ί遅延群
42 MT1 F
43 CYP3A4 姓群
44 Scd
45 SERPINA7
46 AKR1 D1
47 AL031602
48 TSC501
18 GSTM1 B型非癌遅延群 c型癌遅延群
3 SAA2 B型非攝; ι 延群
49 BHMT c型癌遅延群
50 HADHSC
51 FBX09
52 KIAA0442
53 K1AA0293 C型癌遅延群
54 IGHG3
55 ADH2 c型癌遅延群
20 GSTM2 B型非癌遅延群 C型癌涯延群
56 PPIF
57 ALDH8A1
58 IGし
59 HCN3
60 ADH6 c型癌遅延群
61 AK02720 G型癌遅延群
62 NET - 6
63 CYP2D6
64 MAFB
65 GHR
66 KHK
67 ADFP
68 LCE
69 PDZ c型癌遅延群
70 TEM6
71 KIAA0914
72 Kし KB1
73 1167 c型癌遅延群
21 SGK B型非癌遅延君羊
フ 4 EHHADH
75 BL2
76 APP
77 T1 G
78 TPD52L1 C型癌遅延群
79 CXCL10
80 AI972416
81 FCGR2B
82 IGL@
83 Fし J10134
84 PPAP2B
85 CDC42
86 HBA2
87 CYP1A2
88 CYP2DO
QQ
90 MTP
91 X07868
92 RNAHP G型癌遅延群
93 HLF C型癌遅延群
94 PPP1 R3C
95 GDC2し 2
96 NRI 1
97 GPD1 (表 3の続き） 重複グループ
98 KIAA1053
99 CCL19
100 CRI1
101 THBS1 c型癌遅延群
102 SLC5A3
103 GADD45B
104 AGし
105 ADK
106 IGKC
107 CYP2A6 C型癌遅延群
108 GADD45A C型癌遅延群
109 Fし J20701
■J 10 LOC57826
111 SLC2A2
112 CIRBP
1 13 CGI-26
1 14 DEFB1
1 15 HMGCS1
11G ODC1
117 GLUし B型非癌早期群 C型癌遅延群
118 CYP27A1
1 19 SULT2A1 C型癌遅延群
120 AK024828
121 PHLDA1
122 NR1I2
■(23 MSRA
■(24 RNASE4
Ί25 ΑΙ339732
-)26 HBA2
127 AL050025
128 CSAD
129 SID 6-306
130 NM024561
131 BCKDK
•J32 SLC6A1
Ί33 CG018
134 GNE
135 CKLFSF6
136 GOMT
137 AL135960
Ί38 KIAA0179
139 c— maf
■)40 OSBPL1 1
141 R06655 C型癌遅延群
142 KIAA04461
143 IGF1 C型癌遅延群
-{44 HBA1
145 LOC55908
146 ENPEP
147 TXNIP
148 KIAA0624
149 ENPP1
150 CYP4F3
151 CAV2
152 BE908931
153 LECT2
154 MLLT2
155 Fし R1
156 TF
157 DAO
158 AI620911
159 GBP1
160 UGP2
161 GADD45B
162 SC4MOL
163 BE908931
164 TUBB
165 EPHX2
166 SORD 1242S
C型肝炎症例の再発遅延群で、癌部において発現亢進する遺伝子（104) (CTgood)
退伝ナ 重複グループ
167 LEAP-1
168 PPD
37 B型癌遅延群
43 CYP3A4 B型癌遅延群
107 CYP2A6 B型癌遅延群
25 M 10098 C型非癌遅延群 B型癌遅延群
169 RACE
170 SLC27A5
171 FLJ20581
172 FLJ 10851
53 KIAA0293 B型癌遅延群
173 C9
174 AL354872
175 AKR1 G1
176 PCK1
18 GSTM1 B型癌遅延群 B型非癌遅延群
87 CYP1 A2 B型癌遅延群
177 ANGPTL4
178 AOX1
179 SDS
20 GST 2 B型癌遅延群 B型非癌遅延群
73 1 1 167 B型癌遅延群
180 CYP2C9
181 SIPL
182 GLYAT
75 BL2 B型癌遅延群
183 CYP1 A1
184 CRP
141 R06655 B型癌遅延群
185 ACADL
93 HLF B型癌遅延群
186 NR1I3
187 CA2
188 CYP2C8
189 PON1
55 ADH2 B型癌遅延群
92 RNAHP B型癌遅延群
190 AQP9
1 19 SULT2A1 B型癌遅延群
191 SPP1
192 KIAA0934
193 AKAP12
194 APOF
195 FM03
196 SLC22A1
197 DCX
198 CYP3A7
199 SOCS2 (表 4の続き） 番号 遺伝子 重複グループ
101 THBS1 Έ ¾遅延!
41 ATF5 B型癌遅延群
200 BCRP
60 ADH6 B型癌遅延群
201 humNRDR
202 GADD45G
203 SRD5A1
204 ABCA8
61 AK026720 B型癌遅延群
205 APOC4
206 FTHFD
207 ISG15
208 IGFBP2
49 BHMT B型癌遅延群
209 DNASE1し 3
210 SRD5A1
21 1 E2IG4
212 COL1A2
213 C20orf46
214 ESR1
215 BLVRB
216 LRP16
217 SLC1A1
218 ABCB6
69 MPDZ B型癌遅延群
219 FBP1
220 ALAS1
221 IFIT1
222 PPARGC1
223 Id-1 H
224 RBP1
225 CSHMT
226 LOC155066
42 MT1 F B型癌遅延群
227 AGXT2L1
228 TIM 17A
229 SEC14L2
230 AOA
231 YC
232 ACAA2
233 AL109671
234 ABCA6
143 IGF1 B型癌遅延群
235 GRHPR
236 HADH2
237 AFM
238 COUA1
239 MTHFD1
240 NMT2
108 GADD45A B型癌遅延群
241 UGT2B15
242 AR
78 TPD52L1 B型癌遅延群
243 sMAP
1 17 GLUL B型非癌早期群 B型癌遅延群
244 dJ657E1 1.4 P T/JP2004/012425 表 5 B型肝炎症例の再発早期群で、非癌部において発現宂進する遺伝子（48) (BNbad) 畨号 伝子 重複グループ
245 CTH B型癌早期群
246 OAT
247 PRODH B型癌早期群
248 CYP3A7
249 DDT B型癌早期群
250 PGRMC1
251 AKR1 C1
252 HGD B型癌早期群
253 FHR-4
254 AL354872
255 FST B型癌早期群
256 COX4
257 APP
258 PSPHし
259 CYP1A1
260 ZNF216
261 し EPR B型癌早期群
262 TOM1 L1
263 PECR
264 ALDH7A1
265 GN T
266 OATP-C
267 AKR1 B10 C型非癌早期群 B型癌早期群
268 ANGPTL3
269 AASS
270 GAし R
271 BAAT
272 PMM1 '
273 RAB-R
1 17 GLUL C型癌遅延群 B型癌遅延群
274 CSH T
275 UGT1A3
276 HSPG1
277 QPRT C型非癌早期群
278 DEPP
279 CA2 B型癌早期群
280 FTHFD
281 LA P1
282 FKBP1A
283 BNIP3
284 MAP3K12
285 ASS B型癌早期群
286 ACTB
287 PLAB B型癌早期群
288 EN01 L1
289 IGFBP3
290 UK1 14
291 ERF - 1 表 6 C型肝炎症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子 （12) (CNbad)
重複グループ
292 ALB
293 NR0B2
267 A R1 B10 B型非癌早期群 B型癌早期群
294 AFB
295 BF530535
296 MRPL24
297 DSIPI
277 QPRT B型非癌早期群
298 VNN1
299 IRS2
300 FM05
301 DCN
7 B型肝炎症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子 （75) (BTbad) jsfe-r- 重複グループ
247 PRODH B型 S早 w
302 PLA2G2A c型癌早期群
303 SDS
304 LGALS3BP
305 BACE2
261 LEPR B型非癌早期群
306 RCN1
307 MRC1
308 T 4SF5
309 NK4
310 PABL
31 1 IGFBP2
312 GRINA
313 IFI27
314 GP2
315 GA
316 P4HA2
317 KYNU
318 PCK1
319 UQBP
320 HLA-DRB1
252 HGD B型非癌早期群
321 HTATIP2
322 GGT1
323 CTSH
324 VP
325 SLC22A1 L
326 GMNN
327 COM1
328 TM7SF2
245 CTH B型非癌早期群
329 KDELR3
330 VPS28
279 CA2 B型非癌早期群
331 SFN
332 麵 23948
333 OPLAH
(表 7の続き) 遺伝子 重複グループ
334 DGCR6
335 INSIG1
267 AKR1 B10 B型非癌早期群 C型非癌早期群
336 PTGDS C型癌早期群
337 SLC25A15
338 SEPW1
339 CD9
340 UQCRB
285 ASS B型非癌早期群
341 CPT1 A
287 PLAB B型非癌早期群
342 GPAA1
343 HF1
344 GPX2
345 COPEB
346 NDRG1
347 SYNGR2
348 GOT1
349 POLR2K
350 AATF
255 FST B型非癌早期群
351 OAZIN
352 RPL7
353 KIAA0128
354 CLDN7
355 ABCB6
356 G
357 し U C型癌早期群
358 TNFSF4
359 OSBPL9
360 GSN
361 LGALS4
249 DDT B型非癌早期群
362 EIF3S3
363 SLC12A2
364 RAMP1
365 HSPB1
366 AI201594
表 8 C型肝炎症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子（38) (CTbad)
重複グループ
367 BL34
368 AL022324
369 IGH
370 TXN1P
371 FSTL3
372 AW978896
373 NM018687
374 L48784
375 AJ275355
376 PER1
377 CYBA
302 PLA2G2A B型癌早期群
378 SGK
379 FKBP1 1
380 AI912086
381 IGLJ3
382 IGKC
336 PTGDS B型癌早期群
383 M20812
384 AGRN
385 1L2RG
386 X07868
387 PKM2
388 FGFR3
389 TRB@
390 TNFAIP3
391 TTC3
392 LPA '
393 AL049987
394 IER5
395 BSG
396 TM4SF3
397 HMGB2
357 し U B型癌早期群
398 CCL19
399 PA
400 PI 3R1
401 RANGAP1
ただし、 表 5中、 「CTH」 と 「AL354872」 は同じタンパク質をコードする遣伝 子である。
上記遺伝子は、 単独で、 又は適宜組み合わせて癌の評価用キットに含めること ができる。 遺伝子を組み合わせて遺伝子セットとしては、 例えば、表 1 6 (後述） を挙げることができる。 上記遺伝子はその一部の配列であってもよい。 これらの 遺伝子は、 表に記載の遺伝子発現を検出するためのプローブとして使用すること ができる。
また、 本発明のキットには、 遺伝子増幅用プライマ一、 緩衝液、 ポリメラーゼ 等を含めてもよい。
遺伝子増幅用プライマーは、各遺伝子配列の DNA配列および mRNA配列をデ —タベースより得、特に variantの有無、ェキソンイントロン構造を含めた情報も 得るようにして、 翻訳領域に当たる部分で共通な配列をターゲットとする。 なる ベく片側プライマ一は隣接ェキソンにまたがるようにして、 mRNAだけが検出さ れるように設計する。 あるいは、 web software 「Primer3」 （provided by Steve Rozen and Whitehead Institute for Biomedical Research) を用レ てプフイマ一の設計候補 を得、 さらに BLAST (NCBI) searchでホモロジ一検索を行い、 類似配列へのミ スァ二一リングをさけるようなプライマーを選択する。
好ましいプライマーの配列番号を一般式 2n-l及び 2n (nは 1 〜； 114の整数を表 わす） に示す。 本発明においては、 2n-l により示されるプライマ一と 2nにより 示されるプライ 一とを 1組のセットとして用いることができる。 例えば、 n を 1とすると、配列番号 1と配列番号 2のプライマ一を 1組のプライマーセッ卜を、 ' nを 2とすると、 配列番号 3と配列番号 4のプライマーのセットを使用すること ができる。 特に好ましいプライマーは、 n力 2、 4、 7、 9、 17で示される場合 である。
その他、 上記 （1 ) において、 遺伝子発現の定量解析をィムノドットプロット や免疫染色等で行うことも可能である。 ィムノドットプロットや免疫染色は、 表 1〜8に示した遺伝子の発現産物に対する抗体を用い、 定法にしたがって行うこ とができる。その際、市販されている抗体を利用しても良いし、 マウス、 ラット、 ゥサギ等の動物に免疫することで得られる抗体を利用しても良い。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 ただし、 本発明はこれ ら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。 実施例 1
肝細胞癌症例中の発現亢進寧伝子の検出
以下のように、 B型および C型肝細胞癌症例のヒ卜肝組織を用いて、 肝細胞癌 再発抑制分子の同定を遺伝子レベルで進めた。
肝細胞癌術後の再発機構を知り、再発の有無を予測できる遺伝子を決めるため、 再発時期の異なる症例を用いて遺伝子発現プロファイル解析を行った。 TNM 分 類で stage I、 IIの 51症例を対象とした。 術後 4年以上再発のない 5例と、 術後 1 年以内に再発した 5例を選び、 Affymetrix社 HG-U133Aァレイで発現解析を行な つた。
凍結保存した組織に TRIzol regent(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を加え て、 ポリトロンにてホモジネートした。 ホモジネート液にクロ口ホルムを加えて よく混和し遠心した。 遠心後、 上層を回収し： イソプロパノールを等量加えて、 total RNA沈殿を遠心にて回収した。
B型肝細胞癌症例 （原因ウィルスが B型肝炎ウィルスである肝細胞癌症例） の 再発早期群 2例の非癌部と癌部、 再発遅延群 2例の非癌部と癌部、 C型肝細胞癌 症例 （原因ウィルスが C型肝炎ウィルスである肝細胞癌症例） の再発早期群 3例 の非癌部と癌部、 再発遅延群 3例の非癌部と癌部、 合計 8群に分け、 発現解析を 仃つた。
各サンプル群につき 15 ίΐ g の to l RNA を用意し、 Affymetrix社 GeneChip Expression Analysis Technical Manualに基づいて、 ビォチン標識 cRNAを合成し た。 T7-(dt)24 プライマーと Superscript II逆転写酵素 （Invitrogen Life Technology) を用いて、 1時間反応させ第一鎖 cDNAを合成した。 その後、 E. coli DNA リガ ーゼ、 E. coli DNAポリメラーゼ、 E. coli RNase Hを加え 16°C 2時間反応させ、 最後に T4 DNAポリメラ一ゼを加えて二本鎖 cDNAを合成した。 クリーンアツ フ ί つた後、 BioArray high yield RNA transcript labeling kit (Affymetrix,Inc,CA) を用いて、 4時間 in vitro 転写し、ピオチン標識 cRNAを合成した。 Technical manualに基づき、ハイプリダイゼーシヨンプローブ溶液を作製し、 プレハイプリ ダイゼーシヨンを 45°C 45分間行った GeneChip HG-U133A (Affymetrix,Inc,CA； 22283 個のヒ ト遺伝子が含まれている）に加え、 ハイプリダイゼーシヨンを 45。C 16時間行った。 その後、 GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix,Inc, CA)を用い て洗浄した後、 ス トレプトアビジンフィコエリスリンとピオチン化抗ス トレプト ア ビジンにて染色を行った。 その後、 HP GeneArray スキャナー (Affymetrixjnc, CA)にてスキャンを行った。
データ解析は、 GeneSpring ver.5.0 (SiliconGenetics, Redwood, CA)を用いて行つ た。 normalization後、 内在性定量用コント口ール遺伝子 BioBのシグナルを検出 限界 (細胞あたり数コピーに相当する）として参考にし、 100以上の輝度をもち、な おかつ、 シグナルフラッグが最低 1チップでも presentの遺伝子を対象とした。 7444遺伝子が対象となり、 非癌部では再発早期群 Z遅延群間で 2.5倍以上差のあ る遺伝子を同定した。 癌部では 3倍以上差のある遺伝子を同定した。
その結果、 絞り込んだ 7444遺伝子で、 再発なし/ありの非癌部間で 2.5倍以上 差のある遺伝子は、 up34個と down58個、 癌部間で 3倍以上差のある遺伝子は、 up215個と downl 10個であった。これらの中で B型/ C型共通に再発なしで発現 亢進する遺伝子は、 非癌部で 0個、 癌部で 26個であった。 一方、 B型/ C型共通 に再発ありで発現亢進する遺伝子は、非癌部で 2個、癌部で 3個であった。また、 癌部/非癌部共通に発現亢進する遺伝子があり、 再発なしで 5個、 再発ありで 10 個であった。 （表 9 )。
なお、表 9において合計が 401となっているが、 これは GLULの重複が特別な ものであるため 402ではなく 401である。
表 9 肝細胞癌再発に関わる遺伝子
Figure imgf000026_0001
合
表 9の結果より、 再発予後の違いは、 非癌部より癌部のほうに遺伝子発現変化 が大きく、 C型肝細胞癌症例よりは Β型肝細胞癌症例の方が遺伝子発現 4 の差が大
o
きいと言える。 また、 原因ウィルスとは無関係に共通して再発予後に関わる遺伝 子が、 見つかる場合があるが、 意外に少ない。 発癌と同様、 再発も原因ウィルス 別に異なる機構が関与していると考えられる。
サンプル系統樹解析では、 全遺伝子の発現プロファイルから、 まず非癌部と癌 部に分かれ、 各々非癌部と癌部は、 再発予後ではなく、 原因ウィルスによる近縁 関係が観察された (図 1)。 図 1において、 各試験群を示す 「： BNbad」、 「BNgood」 などの表記において、 第 1番目のアルファベットはウィルスの種類を示し、 「B」 は B型肝炎ウィルス、 「C」 は C型肝炎ウィルスを意味する。 第 2番目のアルフ ァベッ トの 「N」 は非癌部、 「T」 は癌部を意味する。 そして 「bad」 は再発早期、 「good」 は再発遅延を意味する。
このことは、 再発予後に影響する遺伝子発現は、 限られた遺伝子の発現変化で もたらされるものと考えられる。 以上のことから、 再発の機構解明や有無を予測できる候補遺伝子が見出された
(表 1〜8 )。 実施例 2
C型肝細胞癌症例における各群の遺伝子の再発期間と発現量の相関の検討 以下のとおり、 C型肝細胞癌症例のうち、 再発遅延群と再発早期群各々の非癌 部において発現亢進する遺伝子について、 再発までの期間と発現量との相関を検 討した。
遺伝子発現プロファイル解析に用いた C型肝細胞癌症例 6例を含め、 計 22例 の非癌部のサンプルを対象とした。 各症例の臨床病理学的知見と再発までの期間 (再発なしの期間） を表 1 O Aに示す。
表 1 0A C型肝細胞癌症例
症例番号 性別 年齢 非癌部 stage 再発なしの月数 マイクロアレイ
59 M 66 CH I 84 遅延群
18 M 68 LC I 58 遅延群
6 M 65 CH Π 51 遅延群
25 M 51 CH I 45
29 M , 70 CH Π 43
12 M 66 CH Π 41
4 M 65 CH I 40
48 F 65 LC I 39
31 M 60 し C l or II 38
16 M 70 CH I 37
22 M 65 CH I 34
3 F 71 LC I 29
65 M 60 LC I 29
30 F 62 し C Π 28
10 M 56 LC I 26
23 M 62 CH Π 16
26 M 70 LC I 16
14 M 62 CH Π 14 早期群
62 M 66 LC I 13
17 M 54 し C I 12
15 F 68 LC Π 8 早期群
44 M 58 CH I 4 早期群
CH:慢性肝炎、 LC:肝硬変
症例 31の stageは、未決定。
再発なしの月数とは、再発までの月数の他、
調査期間中再発がみられないものも含む。 また、 追跡調査により表 1 O A .に示す症例を変更又は更新し、 さらに、 本実施 例の対象として症例を追加した計 3 5例についての、 臨床病理学的知見と再発ま での期間 （再発なしの期間） を表 1 0 Bに示す。
表 10B G型肝細胞癌症例
症例番号 性別 年齢 非癌部 sta e 再発なしの月数 マイクロアレイ
M OH I >94
u M 遅 ®群
M n T > 58
o ββ T 58 遅延群
n TT 41
M ΠΗ T >40
π
M T z
F T 37
T 37
M 34
M 65 T 33
o 71
65 60 し G I 28
F ΤΓ 26
M T ク 5
7Π M 1 n TT
79 M 73 し c I 22
73 M 50 CH Π 20
81 F 69 LC I 17
26 M 70 し C I 16
72 71 し C Π 16
69 M 66 LC Π 15
14 M 62 CH Π 14 早期群
78 F 66 CH I 13
82 71 CH I 13
17 M 54 LC I 12
71 57 し C Π 12
77 F 65 LC I 10
62 M 66 し G I 9
74 M 67 CH Π 9
15 F 68 し C Π 8 早期群
76 M 72 Nし I 7
75 M 65 CH Π 6
44 M 58 CH I 4 早期群
CH:慢性肝炎、 LC:肝硬変、 NL:正常肝
再発なしの月数とは、再発までの月数の他、
調査時点で未だ再発がみられないものも含む。 表 2における再発遅延群の非癌部において発現亢進する遺伝子 （CNgood) の 9個、 及び表 6における再発早期群の非癌部において発現亢進する遺伝子 (CNbad) の 12個の、 合計 21個の遺伝子に関して、 再発期間と発現量との関係 を検討した。
まず、 各症例非癌部肝組織から、 上記実施例 1と同様の方法で to 1 RNAを抽 出した。
total RNA 中に混在する DNA の影響を除去するため、 DNase I (DNase I (TAKARA SHUZO, Kyoto, Japan)で 37°C、 20分処理した後、 TRIzol regentで 再精製した。 10 x gの total RNAを用いて 25 unitの AMV reverse transcriptase XL(TAKARA)と 250 pmolの 9-mer ランダムプライマ一を含む 100 1の反応液に より逆転写反応を行った。
リアルタイム PCRには、合成 cDNA を各々 0.25~50ng相当ずつ用いて行つた。 SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) の 25 x 1の反 応溶液を用いて ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems)により、予備加熱を 95°C、 10分行ったのち、 95で15秒に続けて 60°C (または 65 ）、 60秒を 40ないし 45サ ィクルという条件で PCRを行った。
各サンプルの内部標準遺伝子と して、 glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase (GAPDH) 又は 18S rR Aを用いて相対的定量解析、 および一部 は絶対的定量解析を行った。 標準試料の系列希釈を行って同時に測定したものを 検量線作成に用いた。 検量線が最適となる閾値線 （threshold line) を決定し、 各 サンプルの閾値 PCRサイクル数、 threshold cycle(Ct)値を求めた。 標的遺伝子の Ct値から GAPDH又は 18S rRNAの Ct値を差し引いた A Ct値を求め、 これをそ の標的遺伝子の相対的発現量とした。 さらに、 2 (_ A Ct)の計算式で計算したもの を、 線形発現量の評価に用いた。
一方、 検量線より絶対発現量を換算できる遺伝子については、 標的遺伝子およ び内部標準遺伝子の絶対発現量を求め、 サンプルごとに標的遺伝子発現量/内部 標準遺伝子発現量の比を算出して評価に用いた。測定はすべて duplicateで行った。 表 1 1 A、 表 1 1 B、 表 1 2 Aおよび表 1 2 Bにおいて、 「マイクロアレイと一 致」とは、マイクロアレイ解析に用いた 6例（表 1 0 A又は Bの症例番号 59、 18、 6、 14、 15、 44) の定量 PCRの結果から、 再発遅延群 （症例番号 59、 18、 6) と 早期群 （症例番号 14、 15、 44) との比を求め、 1.5以上であったものが、 実施例 1のマイクロアレイの結果と一致としたことを意味し、 一致したものについて 「〇」 を付した。 なお、 上記比は 1.5以上、 好ましくは 2以上であることが好ま しい。 「〇」 に隣接するかつこ内の数字は比の値（3例の平均値の比） を示す。 「マ イクロアレイと一致」 の欄の 「X」 はマイクロアレイの結果と不一致なものを示 す。 「XX」 は、 マイクロアレイの結果とは逆相関したものを示す。
表 1 1 A、 表 1 1 B、 表 1 2 Aおよび表 1 2Bにおいて、 「相関」 とは、 22症例 又は再発月数が確定している 31症例の遺伝子発現量と再発までの期間との間で、 相関を意味し、 有意に相関を示した場合に〇あるいは r値を示し、 さらに p値を 記載した。
表 1 1Bおよび表 1 2B において、 「2群間の有意差」 の欄に、 24ヶ月以内再 発 19症例と 40ヶ月以上再発のない 6症例（表 1 1B、表 12B「2群間の有意差」 欄上段） もしくは 58ヶ月以上再発のない 4症例 （表 1 1B、 表 12B 「2群間の 有意差」 欄下段） との間で、 有意に発現量の違いのあったものについて、 p 値 (Mann-Whitney ,U test)を示し 7こ。
試験に用いたプライマー配列 （センス鎖 （順）、 アンチセンス鎖 （逆）） を表 1 1A、 表 1 1B、 表 12 Aおよび表 12Bに示す （配列番号 1〜 88)。
C 型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子候補 (CNgood)の 9個を解析した結果を表 1 1A及び表 1 1Bに示す。表 1 1Aは、 表 1 OAに示す症例を対象に、内部標準遺伝子に GAPDHを用いて表 1 1Aに示 す条件で定量 PCRを行つた解析結果を示す。 表 11A 「C型肝炎症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子」定量 PCRの結果
S w , ill百 プ イマ一 C -T") アニーリング温度 マイクロアレイと一致 相閲
26 PSMB8 III AGACTGTCAGTACTGGGAGC 1 60°C 0(2.52)
逆 GTCCAGGAC'CCTTCTTATCC 2
27 RALGDS III GACGTGGGAAGACGTTTCCA 3 60°C 0(4.13) O(P=0.0118) 逆 TGGATGATGCCCGTCTCCTT 4
28 APOL3 順 AATTGCGGAGGGATGAGGCA 5 60°C 〇(2.69)
逆 TGGACTCGTGGATCTTCCTG 6
29 GBP1 III GAGAACTCAGCTGCAGTGCA 7 65°C 0(6.00) O(p=0.0031) 逆 TTCTAGCTGGGCCGCTAACT 8
30 RPS14 III GACGTGCAGAAATGGCACCT 9 60°C x (0.96)
逆 CAGTCACACGGCAGATGGTT 10
31 CXCし 9 順 CCTGCATCAGCACCAACCAA 11 65°C O01.5)
逆 TGGGTGACCTGTTTCTCCCA 12
32 DKFZp564F212 順 CCACATCCACCACTAGACAC 13 60°C 0(4.75) O(p=0.0541) 逆 TGACAGATGTCCTCTGAGGC 14
33 CYP1B1 順 CCTCTTCACCAGGTATCCTG 15 60°C 0(2.33)
逆 CCAGAGTGTCCTTGGGAATG 16
34 TNFSF10 III GCTGAAGCAGATGCAGGACA 17 60°C 0(2.50) O(p=0.0424) 逆 CTAACGAGCTGACGGAGTTG 18
マイクロアレイと一致とは、マイクロアレイ解析【こ用いた 6例の定量 F>CRの結果から、
再発遅延群/早期群の比を求め、 1.5以上であったものを〇とした。
相関とは、 22症例の遗伝子発現量と再発までの期間との間で、相関を示したものについて、 Oで示し、 p値を記載しだ。 その結果、 マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は 8個であり、 そのうち、 再発までの期間と相関を示した遺伝子は 4個 (RALGDS、 GBP1、 DKFZp564F212、 TNFSF10)であった。
同様に、表 1 I Bは、表 1 O Bに示す症例を対象に、内部標準遺伝子に GAPDH 又は 18S rRNAを用いて表 1 1 Bに示す遺伝子 1 0個を、 表中の条件で定量 PCR を行った解析結果を示す。 表 「 型肝炎症例の再発遅延群で *非癌部において発現亢進する逸伝子定 の結果
群間有意差 群間有意差 番号 逍伝子 順/逆 ブライ 配列 '_3') 配列番号 一 4相関 相関
m
逆
顺 0
逆
順 OC8
逆 Cp=0.0361)
11 OC1 0
逆
順 OCe 0
逆 Cp
順 0
逆 Cp
順 0
逆
順
逆
II
逆
順
逆
準
定 による各逸伝子の発現显は、 をコント口一ル逸伝子として用い、その発現置に対する相対値で 価しお。
マイクロアレイと一致とは、マイクロアレイ解析に用いた 6例の定 SPCRの結果から、再発遅延群/早期群の比を求め、 1.5以上であったものを Oとした。
相閲とは、再発月数が確定している 31症例の 伝子発現量と再発までの期間との間で相閱を示したものについて， と p値を 82載した。
群間の有意差とは、 ヶ月以内再発 症例と ヶ月以上もしくは ヶ月以上再発のない 6症例 (上段)もしくは症例 (下段)との間で、
有意に発現置の違いのあったものについて、 値 を示した。 その結果、 発現亢進する.遺伝子候補 9個のうち、 GAPDHを内部標準遺伝子に 用いたときには、 マイクロア kィの結果と一致した遺伝子は 9個全てであり、 そ のうち、 再発までの期間と相関を示した遺伝子は 5個であった。 さらに、 上記候 補遺伝子 9個のうち、 18srRNAを内部標準遺伝子に用いたときにも、 マイクロア レイの結果と一致した遺伝子は 9個全てであり、 そのうち、 再発までの期間と相 関を示した遺伝子は 8個であった。
再発遅延群と早期再発群の 2群間有意差検定を行った結果、 有意に差のあった 遺伝子は、 標準遺伝子に GAPDHを用いたときは 3個であり、 18S rRNAを用い たときは 5個であった。 次に、 C型肝細胞癌症例の再発早期群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 候捕 （CNbad) の 1 2個を解析した結果を表 1 2 A及び表 1 2 Bに示す。 表 1 2 Aは、表 1 O Aに示す症例を対象に、 内部標準遺伝子に GAPDHを用いて表 1 2 Aに示す条件で定量 PCRを行った解析結果を示す。 表 12A 「C型肝炎症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子」定量 PGRの結果
番号 子 順/逆 プライマー配列（5' - 3') 配列番号アニーリング温度マイクロアレイと一 相関
292 ALB III CAAAGCATGGGCAGTAGCTC 41 60°C 0(2.19)
逆 CAAGCAGATCTCCATGGCAG 42
293 NR0B2 順 TCTTCAACCCCGATGTGCCA 43 60。C 0(1.48)
逆 AGGCTGGTCGGAATGGACTT 44
267 AKR1 B10 III CTTGGAAGTCTCCTCTTGGC 45 60°C 0(2.44)
逆 ATGAACAGGTCCTCCCGCTT 46
294 MAFB 順 ACCATCATCACCAAGCGTCG 47 60°C 0(1.56)
逆 TCACCTCGTCCTTGGTGAAG 48
295 BF530535 III GTCGCCTCACCATCTGTACA 49 65°C O0.74)
逆 CTGGAGGACAGCTGCCAATA 50
296 RPL24 III TCCTAGAAGGGAAGGATGCC 51 60°C X (0.92)
逆 GTGGGTTTCCTGTCCATAGG 52
297 DSIPI 順 AACAGGCCATGGATCTGGTG 53 65°C 0(1.85)
逆 AGGACTGGAACTTCTCCAGC 54
279 QPRT 順 AGGATAACCATGTGGTGGCC 55 60°C x X (0.413) O (p=0.0092)
逆 TGCAGCTCCTCTGGCTTGAA 56
298 VNN1 順 GCTGGAACTTCAACAGGGAC 57 60°C x (1.11)
逆 CTGAGGATCACTGGTATCGC 58
299 I S2 順 TGAAGCTCAACTGCGAGCAG 59 60°C 0(1.57)
逆 ACGATTGGCTCTTACTGCGC 60
300 F 05 III ACACAGAGCTCTGAGTCAGC 61 60°C X (1.13)
逆 TCCAGGTTAGGAGGGAAGAC 62
301 DCN CCTCAAGGTCTTCCTCCTTC 63 60°C x (0.74)
逆 CACCAGGTACTCTGGTAAGC 64
QPRT遺伝子は、逆相関を示す遺伝子であった。 その結果、 マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は、 7 個であつたが、 有意 に再発までの期間との相関を示した遺伝子はなかった。しかし、 QPRT遺伝子は、 有意に逆の相関を示した。 従ってこの遺伝子を、 再発遅延群において、 非癌部に おいて発現亢進する遺伝子と同定した。
同様に、表 1 2 Bは、表 1 0 Bに示す症例を対象に、内部標準遺伝子に GAPDH または 18S rRNAを用いて表 1 2 Bに示す条件で定量 PCRを行った解析結果を示 す。
一 一
Figure imgf000033_0001
その結果、 発現亢進する遺伝子候補 1 2個のうち、 内部標準遺伝子に GAPDH 又は 18S rRNAを用いたときには、 マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は 1 個であった。 しかし、 内部標準遺伝子に GAPDHを用いたときには、 MAFB遺伝 子、 MRPL24遺伝子、 VNN1遺伝子、 IRS2遺伝子は、 有意に逆の相関を示した。 また、 内部標準遺伝子に 18S rRNAを用いたときには NR0B2遺伝子、 MAFB遺 伝子、 BF530535遺伝子、 MRPL24遺伝子、 QPRT遺伝子、 VNN1遺伝子、 IRS2 遺伝子は、 有意に逆の相関を示した。 従って、 これらの遺伝子を、 再発遅延群に おいて、 非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。 以上のように種々の条件で検討することにより、 C型肝細胞癌症例において再 発を予測する非癌部発現遺伝子として、 PSMB8遺伝子、 RALGDS遺伝子、 GBP1 遺伝子、 RPS14遺伝子、 CXCL9遺伝子、 DKFZp564F212遺伝子、 CYP1B1遺伝子、 TNFSFIO遺伝子、 NR0B2遺伝子、 MAFB遺伝子、 BF530535遺伝子、 MRPL24 遺伝子、 QPRT遺伝子、 VNN1遺伝子及び IRS2遺伝子という 1 5個の遺伝子が 同定された。上記遺伝子名の内容を以下に示す。
PSMB8遺伝子 （LMP7遺伝子ともいう） ： proteasome subunit, beta type, 8の遺 伝子
RALGDS退 is子： ral guanine nucleotide dissociation stimulatorの; rito子 GBP1直伝ナ： guanylate-binding protein 1の遺 1s子
RPS14遺伝子：： ribosomal protein S14の遺伝子
CXCL9遺伝子： chemokine (C-X-C motif) ligand 9の遺伝子
DKFZp564F212遺伝子： ドイツゲノムプロジェクトで見いだされた発現遺伝子 で、 遺伝子産物が同定されておらず、 機能予測もできていない遺伝子
CYP1B1遺 1ST： cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1の遺 t¾ 子 ，
TNFSFIO ： TNF (ligand) super family, member 10 の略で、 TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)の ji伝子
NR0B2遺 1 子： nuclear receptor subfamily 0, group B, member 2の 伝ナ
MAFB j¾fe-f ： v-maf mus culo ap oneur o tic fibrosarcoma oncogene homolog Bの 遺伝子
BF530535 遺伝子：遺伝子産物が同定されておらず、 機能予測もできていない 遺伝子
MRPL24退伝丁 ： mitochondrial ribosomal protein L24の遺伝子
QPRT mr^~ ： quinolinate pho sphon o syltr ansfer ase の遺 to子
VNNl遺伝子： vanin 1の遺伝子
IRS2退 fe子： insulin receptor substrate 2の遺 子 実施例 3
B型肝細胞癌症例における各群の遺伝子の再発期間と発現量の相関の検討 以下のとおり、 B型肝細胞癌.症例のうち、 再発遅 ¾群と再発早期群各々の非癌 部において発現亢進する遺伝子について、 再発までの期間と発現量との相関を検
B、Jしに
遺伝子発現プロファイル解析に用いた B型肝細胞癌症例 4例を含め、 計 16例 の非癌部のサンプルを対象とした。 各症例の臨床病理学的知見と再発までの期間 (再発なしの期間） を表 1 3に示す。 表 13 B型肝細胞癌症例
症例番号 性別 年齢 非癌部 stage 再発なしの月数 マイクロアレイ
67 M 45 CH Π >99 遅延群
87 45 CH I >92
85 F 64 Nし I 84
93 M 58 CH I >67
94 F 59 し C I >66
60 M 60 I 64 遅延群
35 M 69 CH I >48
45 68 CH I >48
84 51 CH 47
54(86) M .52 CH Π 27
47 M 36 CH I 23
8 M 68 CH Π 17
13 F 51 CH I 14 早期群
42(88) M 74 CH n 14
89 M 45 CH π 9
9 M 44 CH π 7 早期群
CH:慢性肝炎、 LC:肝硬変、 NL:正常肝。
stage I/Hは、どちらかではあるが不明。
再発なしの月数とは、再発までの月数の他、調査時点で未だ再発がみられないものも含む, 表 1 における再発遅延群の非癌部において発現亢進する遺伝子 （BNgood) の 24 個、 及び表 5 における再発早期群の非癌部において発現亢進する遺伝子 (BNbad) の 47個の、 合計 71個の遺伝子に関して、 再発期間と発現量との関係 を検討した。
まず、 各症例非癌部肝組織から、 上記実施例 1と同様の方法で to1:al RNAを抽 出した。 total RNA 中に混在する DNA の影響を除去するため、 DNase I (DNase I (TAKARA SHUZO, Kyoto, Japan)で 37°C、 20分処理した後、 TRIzol regentで 再精製した。 10 の total RNAを用いて 25 unitの AMV reverse transcriptase XL(TAKA A)と 250 pmolの 9-mer ランダムプライマ一を含む 100 lの反応液に より逆転写反応を行った。
リアルタイム PCRには、合成 cDNA を各々 0.25-50 ng相当ずつ用いて行った。
SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) の 25 1の反 応溶液を用いて ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems)により、予備加熱を 95 、 10分行ったのち、 95°C 15秒に続けて 60°C (または 65で）、 60秒を 40-45サイクル という条件で PCRを行った。
各サンプルの内部標準遺伝子として、 GAPDH又は 18S rRNAを用いて絶対的 定量解析を行った。 標準試料の系列希釈を行って同時に測定したものを検量線作 成に用いた。
標的遺伝子および内部標準遺伝子の絶対発現量を求め、 サンプルごとに標的遺 伝子発現量ノ内部標準遺伝子発現量の比を算出して評価に用いた。 測定はすべて duplicateで行った。
表 1 4および表 1 5中の 「マイクロアレイと一致」 とは、 実施例 2の記載と同 様に、 マイクロアレイ解析に用いた 4例 （表 1 3の症例番号 67、 60、 13、 9) の 定量 PCRの結果から、 再発遅延群 （症例番号 67、 60) と早期群 （症例番号 13、 9) との比を求め、 1.5以上であったものが、 実施例 1のマイクロアレイの結果と 一致することを意味する。 上記比が 1.5以上、 好ましくは 2以上のものを〇とし た。 「〇」 に隣接するかつこ内の数字は比の値を示す。 「マイクロアレイと一致」 の欄の 「X」 はマイクロアレイの結果と不一致なものを示す。 「X X」 は、 マイク ロアレイの結果とは逆相関したものを示す。
表 1 4および表 1 5中の 「相関」 の欄は、 再発月数が確定している 10 症例の 遺伝子発現量と再発までの期間との間で、 相関を示したものについて r値及び p 値を記載した。
表 1 4および表 1 5中の 「2群間の有意差」 の欄は、 24ヶ月以内再発 6症例と 48ヶ月以上再発のない 8症例 （表 1 4、 表 1 5中 「2群間の有意差」 欄上段） も しくは 60ヶ月以上再発のない 6'症例 （（表 1 4、 表 1 5中 「2群間の有意差」 欄 下段） との間で、有意に発現量 違いのあったものについて、 p値 (Mann-Whitney U test)を示した。
試験に用いたプライマー配列 （センス鎖 （順）、 アンチセンス鎖 （逆）） を表 1 4および表 1 5に示す （配列番号 8 9〜2 2 8 )。
B 型肝細胞癌症例の再発遅延群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子候補 (BNgood)の 24個を解析した結果を表 1 4に示す。 表 1 4は、 表 1 3に示す症例 を対象に、 内部標準遺伝子に GAPDH又は 18S r NAを用いて表 1 4に示す条件 で定量 PCRを行った解析結果を示す。 5'-3') 一 一 Γ,Ι
OC3
OC2
94
OC2
OC2 0
III x no
0
HI 0(4.39) 0
0
CAL1
111 OC1 x .69)
111 OC2 0
0 0
III xCO
HI OC1
0
Figure imgf000037_0001
その結果、 発現亢進する遺伝子候補 24個のうち、 マイクロアレイの結果と一 致した遺伝子は、 GAPDHを内部標準遺伝子に用いたときには 19個であり、 そ のうち、 再発までの期間と相 を示した遺伝子はなかった。 また、 上記遺伝子の うち、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は 18srRNAを内部標準遺伝子に用 いたときには 9個であり、 そのうち、 再発までの期間と相関を示した遺伝子は 1 個 (PZP遺伝子)であった。
再発遅延群と早期再発群の 2群間有意差検定を行った結果、 差のあった遺伝子 は、 標準遺伝子に GAPDH を用いたときは 1個 (MAP3K5 遺伝子)であり、 18S rRNAを用いたときは 1個 (TNFSF14遺伝子)であったが、 反対に、 再発までの期 間と逆相関して有意に差のあった遺伝子が 1個 （LMNA遺伝子） あった。 従って この遺伝子を、 早期再発群において、 非癌部において発現亢進する遺伝子と同定 した。 次に、 B型肝細胞癌症例の再発早期群で、 非癌部において発現亢進する遺伝子 候補 (BNbad)の 47個を解析した結果を表 1 5に示す。 表 1 5は、 表 1 3に示す症 例を対象に、 内部標準遺伝子に GAPDH又は 18S rRNAを用いて表 1 5に示す条 件で定量 PCRを行った解析結果を示す。
表 型肝炎症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する逸伝子定量 の結果
アニ 相関 相閱 群間有意 群間有意差 番号 遺伝子 順ノ逆 プライ 配列（ 配列番号 一 一
度 差
一
顺逆逆順逆順逆順逆順逆順逆順逆逆順逆逆順逆順逆順逆逆逆逆逆順順順順逆順逆順順順逆順順逆順順逆順逆順逆順逆逆順逆順
。 。
- 一 し
〇(
。
15統き） 番号 遗伝子 プライ 列番号 一 群 有意 群間有意差 順/逆 列（ 配 差（
順
逆
順
逆
順 O0
逆
順
逆
順 Od
逆
順 0
逆
順
逆
順
逆
順 0
逆
順 0
逆
順 0
逆
順 xCO
逆
顋 0
逆
順 0
逆
順 0 (逆） 逆
順
逆
順 0
逆
伝子番号 と は と共通する遗伝子であるが、 の プライマ一は異なる配列を用いた
遗伝子番号 は を用いて を試みたが、いずれにおいても安定した増幅が得られなかった為保留とした
マイクロアレイと一致とは、マイクロアレイ解析に用いた例の定跫 の結果から、再発早期群ノ遅延群の比を求め、 以上であったものを Oとした。
は差がなかったもの、 は逆相関したものを示す。
再発月数が確定している 症例の遗伝子発現 と再発までの期間との間で相関を示したものはなかった。
群間の有意差とは、 ヶ月以内再発症例と ヶ月以上もしくは ヶ月以上再発のない症例 (上段)もしくは症例 (下段)との間で、
有意に発現置の ¾いのあったものについて， 硿 を示した。
その結果、 GAPDHを内部標準遺伝子に用いたときには、 マイクロアレイの結 果と一致した遺伝子は 16 個であつたが、 有意に再発までの期間との相関を示し た遺伝子はなかった。 しかし、 IGFBP3遺伝子は、 2群間有意差検定において有 意に逆の相関を示した。 従ってこの遺伝子を、 再発遅延群において、 非癌部にお いて発現亢進する遺伝子と同定した。
また、 18S rRNAを内部標準遺伝子に用いたときには、 マイクロアレイの結果 と一致した遺伝子は 45 個であつたが、 有意に再発までの期間との相関を示した 遺伝子はなかった。 しかし、 CYP1A1遺伝子は、 2群間有意差検定において有意 に相関を示した。 従ってこの遺伝子を、 再発早期群において、 非癌部において発 現亢進する遺伝子と同定した。 以上より、 B型肝細胞癌症例において再発を予測する非癌部発現遺伝子として、 PZP遺伝子、 MAP3K5遺伝子、 TNFSF14遺伝子、 LMNA遺伝子、 CYP1A1遺伝 子及び IGFBP3遺伝子という 6つの遺伝子が同定された。 上記遺伝子の内容を以 下に示す。
PZP遺 1 予： regnancy-zone proteinの遺伝子
MAP3K5 退 is子： mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5の退 isナ TNFSF14遺 to子： tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 14の這伝 子
LMNA遺伝子： lamin A/Cの遺伝子
CYPIAI逾伝子： cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1の這 子
IGFBP3遺 is子： insulin-like growth factor binding protein 3の退伝子 実施例 4
再発早期群と再発遅延群とを判別するための遺伝子の組合わせの選択 実施例 2及び 3の結果より得られた、 C型又は B型肝細胞癌の再発を予測する 非癌部発現遺伝子を複数組み合わせることにより、 より正確な再発予測を行うこ とが可能となる。 このような遺伝子のセットは、 多種考えられる。 前記組合わせ の 1例を表 1 6に示す。
! O| -D- > 表 1 6 肝細胞癌再発早期群と遅延群とを判別する遺伝子の組み合わせの例 原因別 早期群 遅延群 GAPDH補正 18S rRNA補正 c型肝細胞癌 く 24ヶ月 >40ヶ月 VNN1 VNN1
MRPL24 CXCL9
GBP1 RALGDS
分類率 88% 100%
B型肝細胞癌 く 24ヶ月 >48ヶ月 PRODH
LMNA AP3K12 分類率 100% 100% ( 1 ) c型肝細胞癌の予測
再発 24ヶ月までの早期再発群と、 40ヶ月以上再発のない再発遅延群とを判別 するのに、 内部標準遺伝子に, GAPDH を用いて補正する場合は VNN1 及び MRPL24の各遺伝子発現量を調べればよい。 あるいは、 上記判別を内部標準遺伝 子に 18S rRNAを用いて補正する場合は、 VNN1、 CXCL9、 GBP1及び RALGDS の遺伝子セットについての各遺伝子の発現量を調べればよい。 上記各遺伝子の発 現量を、 各遺伝子で求められていた判別関数係数を用いた判別式に代入し、 その 値を判別に用いる。 当該遺伝子群の発現レベルを解析することによる、 早期再発 群と再発遅延群との分類率は、 GAPDH補正の場合は 88%であり、 18S rRNAの 場合は 100%である。
( 2 ) B型肝細胞癌の予測
再発 24ヶ月までの早期再発群と、 48ヶ月以上再発のない再発遅延群とを判別 するのに、 内部標準遺伝子に GAPDHを用いて補正する場合は PRODH、 LMNA 及び MAP3K12の遺伝子セットについての各遺伝子発現量を調べればよい。 ある レ ま、上記判別を内部標準遺伝子に 18S rRNAを用いて補正する場合は、 LMNA、 LTBP2、 COL1A2及び PZP の遺伝子セットについての各遺伝子発現量を調べれ ばよい。上記と同様、これらの発現量を判別式に代入し、その値を判別に用いる。 当該遺伝子群の発現レベルを解析することによる早期再発群と再発遅延群との分 類率は、 GAPDH補正の場合も 18S rRNAの場合も 100%である。
上記遺伝子の内容を以下に示す。
PRODH miKTp： proline dehydrogenase (oxidase) 1の遺 tc;于
LTBP2退伝ナ： latent transrormmg growth factor oeta binding protein 2の; mfe子
COL1A2遺伝子： collagen, type I, alpha 1の遺伝子
MAP3K12遺 1 子： mitogen-activated protein kinase kinase kinase 12の遺 to亍
産業上の利用可能性
患者及び健常人由来の共通遺伝子と原因別特異遺伝子とを同定することで、 予 後の予測、再発の予測が可能になるため、診断、治療法開発、治療薬選択の戦略（テ —ラ一メード医療） に役立てることができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1〜 2 2 8 ：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total RNAを採取し、
(b) 表 1〜 8に示される遺伝子から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子の発現 量を測定し、
(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
2 . 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total RNAを採取し、
(b) PSMB8遺伝子、 RALGDS遺伝子、 GBP1遺伝子、 RPS14遺伝子、 CXCL9 遺伝子、 DKFZp564F212遺伝子、 CYP1B1遺伝子、 TNFSF10遺伝子、 NR0B2 遺伝子、 MAFB遺伝子、 BF530535遺伝子、 MRPL24遺伝子、 QPR 遺伝子、 VNN1遺伝子及び IRS2遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも 1つの遺 伝子の発現量を測定し、
(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
3 . 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total RNAを採取し、
(b) PZP遺伝子、 MAP3K5遺伝子、 TNFSF14遺伝子、 LMNA遺伝子、 CYP1A1 遺伝子及び IGFBP3遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子 の発現量を測定し、
(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
4 . 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total RNAを採取し、
(b) VNNl遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 又は PRODH 遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝子からなる遺伝子セッ卜に含まれ る各遺伝子の発現量を、 内部標準遺伝子として GAPDHを用いて測定し、 (c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。 ，
5 . 癌の評価方法であって、 以下のステップ：
(a)検体から total NAを採取し、
(b) VNNl遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子及び RALGDS遺伝子からな る遺伝子セット、 又は LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現量を、 内部標準 遺伝子として 18S rRNAを用いて測定し、
(c) 前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
6 . 癌の評価が、 転移の有無又は再発の有無の予測である請求項 1〜 5のいずれ か 1項に記載の方法。
7 . 癌が肝細胞癌である請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 遺伝子の発現量の測定が、 配列番号 2n-l及び 2n (nは 1〜114の整数を表わ す） で示される塩基配列からなるプライマーの組合せを少なくとも 1組用い て遺伝子を増幅することにより行なわれるものである請求項 2又は 3記載 の方法。
9 .遺伝子の発現量の測定が、 VNN1遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子 セット、 PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝子からなる遺伝 子セット、 VNN1遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子及び RALGDS遺伝 子からなる遺伝子セット、 並びに LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2 遺伝子及び PZP 遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少 なくとも 1つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を増幅するためのプライ マーの組合せを用いて、 遺伝子を増幅することにより行われるものである請 求項 4又は 5記載の方法。
1 0 . 配列番号 2n-l及び 2n (nは 1〜114の整数を表わす） で示される塩基配列 からなるプライマーの組合せを少なくとも 1組含むプライマーセット。
. VNNl遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝子からなる遺伝子セット、 VNN1遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺 子及び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セット、 並びに LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子から なる遺伝子セッ卜からなる群から選択される少なくとも 1つの遺伝子セッ 卜に含まれる各遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを含むプライ ト . 表 1 8に示されるいずれかの遺伝子を含む、 癌の評価用キット。
. RALGDS遺伝子、 GBP1遺伝子、 DKFZp564F212遺伝子、 TNFSFIO遺伝 子及び QPRT遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子を含む、 癌の評価用キット。
. VNN1遺伝子及び MRPL24遺伝子からなる遺伝子セット、 PRODH遺伝子、 LMNA遺伝子及び MAP3K12遺伝子からなる遺伝子セッ卜、 VNN1遺伝子、 CXCL9遺伝子、 GBP1遺伝子及び RALGDS遺伝子からなる遺伝子セッ卜、 並びに LMNA遺伝子、 LTBP2遺伝子、 COL1A2遺伝子及び PZP遺伝子から なる遺伝子セッ卜からなる群から選択される少なくとも 1つの遺伝子セッ トに含まれる各遺伝子を含む、 癌の評価用キット。
. さらに請求項 1 0又は 1 1記載のプライ セットを含む、 請求項 1 2 1 4のいずれか 1項記載のキット。
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Figure imgf000047_0001
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007139742A (ja) * 2005-11-18 2007-06-07 Chi Mei Foundation Medical Center 肝細胞癌の素因および／または予後を決定するためのバイオマーカー
JP2008000126A (ja) * 2006-05-24 2008-01-10 Kanazawa Univ 遺伝子発現プロファイルによるｃ型肝硬変及び肝癌の検出
EP2363505A3 (en) * 2007-05-04 2011-12-21 Dermtech International Diagnosis of melanoma by nucleic acid analysis
JP5299885B2 (ja) * 2005-08-12 2013-09-25 学校法人日本大学 Ｈｃｖ陽性肝細胞癌の発癌・再発に関連する遺伝子
JP2015008686A (ja) * 2013-06-28 2015-01-19 三菱レイヨン株式会社 肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価する方法、並びに、その方法に用いるプローブ又はプローブセット及びマイクロアレイ
NO20170739A1 (en) * 2017-05-04 2018-11-05 Patogen As Novel virus in Fish and Method for detection

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058623A1 (en) * 2005-11-21 2007-05-24 Singapore Health Services Pte Ltd Methods of predicting hepatocellular carcinoma recurrence by the determination of hepatocellular carcinoma recurrence-associated molecular biomarkers
FR2910147B1 (fr) * 2006-12-19 2009-02-06 Galderma Res & Dev S N C Snc Methode correctrice de traitement de resultats d'experiences transcriptomiques obtenus par analyse differentielle
JP4858344B2 (ja) * 2007-07-25 2012-01-18 ソニー株式会社 毛を用いた生体リズム情報取得方法
WO2011085271A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of angiopoietin-like 3 expression
KR20120022504A (ko) * 2010-07-30 2012-03-12 서울대학교산학협력단 간 질환의 진단, 치료 및 예방용 조성물
CN105814204B (zh) 2013-12-24 2020-04-28 Ionis制药公司 促血管生成素样3表达的调节

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEUNG S; CHEN X; GUAN X ET AL.: "Identify metastasis-associated gene in hepatocellular carcinoma through clonality delineation for multinodular tumor", CANCER RES., vol. 62, 2002, pages 4711 - 4721, XP002983776
CHEUNG, S.T. ET AL.: "Identify Metastasis-associated Genes in Hepatocellular Carcinoma through Clonality Delineation for Multinodular Tumor", CANCER RESEARCH, vol. 62, 2002, pages 4711 - 4721, XP002983776 *
IIZUKA, N. ET AL.: "Oligonucleotide microarray fpr prediction of early intrahepatic recurrence of hepato-cellular carcinoma after curative resection", THE LANCET, vol. 361, no. 9361, 15 March 2003 (2003-03-15), pages 923 - 929, XP004414663 *
OKABE H; SATOH S; KATO T ET AL.: "Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray : Identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression", CANCER RES., vol. 61, 2001, pages 2129 - 2137
OKABE H; SATOH S; KATO T ET AL.: "Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cDNA microarray: Identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression", CANCER RES., vol. 61, 2001, pages 2129 - 2137
OKABE, H. ET AL.: "Genome-wide Analysis of Gene Expression in Human Hepatocellular Carcinomas Using cDNA Microarray: Identification of Genes Involved in Viral Carcinogenesis and Tumor Progression", CANCER RESEARCH, vol. 61, 2001, pages 2129 - 2137, XP002235524 *
SHIROTA Y; KANEKO S; HONDA M ET AL.: "Identification of differentially expressed gene in hepatocellular carcinoma with cDNA microarrays", HEPATOLOGY, vol. 33, 2001, pages 832 - 840, XP009024178, DOI: doi:10.1053/jhep.2001.23003
XU, X.R. ET AL.: "Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver", PROC.NATL.ACAD.SCI. USA, vol. 98, no. 26, 2001, pages 15089 - 15094, XP002231180 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5299885B2 (ja) * 2005-08-12 2013-09-25 学校法人日本大学 Ｈｃｖ陽性肝細胞癌の発癌・再発に関連する遺伝子
JP2007139742A (ja) * 2005-11-18 2007-06-07 Chi Mei Foundation Medical Center 肝細胞癌の素因および／または予後を決定するためのバイオマーカー
JP2008000126A (ja) * 2006-05-24 2008-01-10 Kanazawa Univ 遺伝子発現プロファイルによるｃ型肝硬変及び肝癌の検出
EP2363505A3 (en) * 2007-05-04 2011-12-21 Dermtech International Diagnosis of melanoma by nucleic acid analysis
JP2015008686A (ja) * 2013-06-28 2015-01-19 三菱レイヨン株式会社 肝臓細胞又はその前駆細胞に由来する細胞の状態を評価する方法、並びに、その方法に用いるプローブ又はプローブセット及びマイクロアレイ
NO20170739A1 (en) * 2017-05-04 2018-11-05 Patogen As Novel virus in Fish and Method for detection
NO344051B1 (en) * 2017-05-04 2019-08-26 Patogen As Novel virus in Fish and Method for detection

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