WO2005021043A2 - Prodrogues a haut poids moleculaire - Google Patents

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WO2005021043A2
WO2005021043A2 PCT/FR2004/002162 FR2004002162W WO2005021043A2 WO 2005021043 A2 WO2005021043 A2 WO 2005021043A2 FR 2004002162 W FR2004002162 W FR 2004002162W WO 2005021043 A2 WO2005021043 A2 WO 2005021043A2
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leu
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André Trouet
Vincent Dubois
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Diatos
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the field of prodrugs and more particularly prodrugs intended for the treatment and / or diagnosis of cancerous tumors and / or inflammatory reactions.
  • Prodrugs are pharmacologically inactive molecules capable of transforming in vivo into drugs (active therapeutic agents) after certain chemical or enzymatic changes in their structure. Prodrugs allow the release of the drug, that is, the transformation of the prodrug into a drug, at an action site or target tissue rather than in the circulatory system or tissue non-target.
  • prodrugs have so far been developed in order to obtain a high specificity of action, reduced toxicity and improved stability in the blood and / or serum.
  • Prodrugs having the following basic structure have been described in the prior art: therapeutic agent, oligopeptide cleavable by an enzyme present in the extracellular environment of target cells, stabilizing or masking group.
  • PCT patent application publication number WO 96/05863 describes in particular a prodrug of formula beta- Alanyl-Leucyl-Alanyl-Leucyl-Doxorubicin (or beta-ALA-LEU-ALA-LEU-Dox or beta-ALAL-Dox).
  • This prodrug is stable in the blood, that is to say relatively insensitive to cleavage by peptidases from the blood, and is reactivated in vivo by peptidases secreted by a large number of tumor cells.
  • the prodrug is successively hydrolyzed to Ala-Leu-Dox and then to Leu-Dox in the peritumoral extracellular environment.
  • Leu-Dox enters the cell by diffusion where it is activated in the form of Doxorubicin (Trouet et al. 2001).
  • the in vivo toxicity and activity studies with the above prodrug show a reduction in toxicity and a greater inhibition of tumor growth compared to Doxorubicin alone.
  • pharmacokinetic studies show that its renal elimination half-life is short.
  • the prodrug appears to be eliminated rapidly through the urinary tract (Dubois et al. 2002).
  • PCT patent application publication number WO 00/33888 proposes the addition to the beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox prodrug of a group masking the positive charge of beta-Alanine in order to improve its effectiveness.
  • This masking group can be, for example, a polyethylene glycol (PEG).
  • PCT patent application publication number WO 01/91798 describes prodrugs with improved stability in the circulatory system.
  • the prodrugs can be PEGylated, i.e. PEG is used as a stabilizing and / or masking group.
  • PEG PEGylated
  • the binding of this polymer (PEG) leads to an improvement in the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the prodrugs and therefore a reduction in renal elimination, due to the size of the molecule. Indeed, the more the molecule is the greater the slower its elimination (Harris & Chess, 2003).
  • the Applicant has prepared PEGylated prodrugs from a prodrug of Doxorubicin (described in patent application WO 96/05863) using different sizes of PEG, in order to to decrease its renal ultrafiltration by the bulky size of the compound, while retaining its prodrug properties
  • the Applicant has coupled PEGs of increasing sizes (molecular weights from 350 to 20,000 passing through 750, 2000, 5000) to the beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox prodrug.
  • PEGs of increasing sizes (molecular weights from 350 to 20,000 passing through 750, 2000, 5000)
  • cleavage tests were carried out in vi tro. The purpose of these tests was to evaluate the reactivation of PEGylated derivatives by the enzymes secreted by tumor cells (LS-174T and MCF-7/6) compared to the beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox which is hydrolyzed in Leu-Dox in the presence of the conditioned medium of these cancer cells.
  • the object of the present invention is precisely to offer a new prodrug structure in order to eliminate this phenomenon of steric bulk and to allow or facilitate the cleavage of the oligopeptide when the masking and / or stabilizing group is of large size, while by maintaining a high specificity of action, reduced toxicity and stability in the blood and / or serum, preferably in a mammal.
  • This object is achieved by inserting a “molecular arm” or “molecular spacer” between the masking and / or stabilizing group (for example PEG) and the peptide sequence cleavable by an enzyme “specific” for this sequence.
  • the molecular spacers according to the invention also referred to below as "spacers”, were chosen taking into account the hydrophilic properties of the units constituting the spacer.
  • the present invention therefore firstly relates to a compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m : in which: I is a substance of active interest on target cells, - A is a group increasing the half-life time of BI in the blood circulation, - EB is a linking group between A and I, where: - B is a structure selectively cleavable by an enzyme present only or preferably near or at the level of said cells targets - E is a hydrophilic spacer group, stable in the circulatory system, which moves A away from B so as to allow or facilitate the cleavage of B near or at the level of said target cells and thus allow or facilitate the release of I or the release of I with a remainder of B, - n is an integer between 1 and either the total number of reactive functions of I on which the EB bonding groups can be attached, or the total number of reactive functions of A on which the EB link groups can be attached - m is an integer between 1 and the total number of reactive functions of
  • p, n and m are equal to 1.
  • the compound is then represented by the formula according to AEBI.
  • m is equal to 1 and n and p are identical and greater than 1.
  • the compound is then represented by the following formula (AEB) t > ⁇ ⁇ I ⁇ where t represents a integer between 2 and the total number of reactive functions of I on which the AEB- group can be fixed.
  • I can be represented by a polypeptide, such as a TNF-alpha cytokine molecule to which several AEB- groups are connected.
  • p is equal to 1 and n and m are identical and greater than 1.
  • A- (EBI) k> ⁇ or k represents an integer between 2 and the total number of reactive functions of A on which the group -EBI can be fixed.
  • A can be represented by a polymer, such as a branched PEG molecule, to which several groups - EBI are connected.
  • the active substance of interest (I) can be attached either directly to one or more structures B by a covalent bond, or indirectly via a “link arm”.
  • the covalent bond can then be produced at the N-terminal or C- end end of the amino acid sequence according to its orientation, or at any other site of the oligopeptide (for example at the side chain of one of the amino acids).
  • the link arm can have several functions such as facilitating the cleavage between B and I, providing an appropriate chemical bonding means between B and I, improving the process of synthesis of the compound , improve the physical properties of the substance of interest (I), provide an additional mechanism for intracellular or extracellular release of the substance of interest (I).
  • This connection indirect can be carried out by any chemical, biochemical, enzymatic or genetic coupling process known to those skilled in the art.
  • a homo- or heterofunctional bridging reagent of the succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate type (SMCC), bi or multifunctional agents containing groups alkyl, aryl, aralkyl or peptide, esters, aldehydes or acids of alkyl, aryl or arylalkyl, anhydride, sulfhydrile or carboxy groups such as derivatives of maleymil benzoic acid, maleymil propionic acid and derivatives succynimidyl, groups derived from bromide .
  • SMCC succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate type
  • the spacer (E) links the group A to the structure B. It is preferably hydrophilic and stable in the circulatory system.
  • a spacer is "stable in the circulatory system" when less than 20%, preferably less than 10%, more preferably less than 2%, of the spacer is degraded or cleaved (especially by enzymes) in the blood circulating or during its storage in human blood at 37 ° C, for more than 2 hours.
  • the spacer allows or facilitates the cleavage of the structure B near or at the level of the target cells and thus allows or facilitates the release of I or the release of I with a remainder of B.
  • the spacer may have a size in length which may be the equivalent of the order of 1 to 100 amino acids.
  • the size of the spacer can vary according to the molecular weight of the group A. According to this aspect, the size of
  • the spacer is all the more important that the molecular weight of A is important.
  • the spacer according to the present invention consists of or comprises at least one group chosen from: amino acid sequences; peptidomimetics; pseudopeptides; peptoids; alkyl, aryl or substituted arylalkyl chains; polyalkylglycols; polysaccharides; polyols; polycarboxylates; poly (hydro) esters.
  • the spacer can also consist of a combination of at least two of these groups.
  • the spacer is made up or comprises from 1 to 100, preferably from 1 to 20 and most preferably from 2 to 10, identical or different amino acids, chosen from the group comprising natural amino acids in D conformation, amino acids not genetically coded or synthetic amino acids and not cleavable by an enzyme present in the circulatory system, such as beta or gamma amino acids or the like.
  • natural amino acids in D conformation is meant amino acids which are normally coded by the genetic code but which, instead of being naturally in L conformation, are synthesized in D conformation.
  • amino acids not genetically encoded can be prepared synthetically or be derived from a natural source.
  • the spacer consists of or comprises a sequence of identical amino acids chosen from: (D-serine) x or (D-threonine) x , where x is an integer between 1 and 20, preferably between 2 and 10, and most preferably between 2 and 6.
  • the spacer is: (D-serine) - (D-serine) - (D-serine) - (D-serine), noted indifferently DSeryl-DSeryl-DSeryl-DSeryl, or (D-threonine) - (D-threonine) - (D-threonine) - (D-threonine), noted indifferently DThreonyl-DThreonyl-DThreonyl-DThreonyl.
  • Amino acids are noted in the present invention either in three letter code or in one letter code, well known to those skilled in the art.
  • the group A is a group which increases in vi vo the half-life time of BI in the circulatory system.
  • This object is notably achieved when A reduces the renal elimination of the substance of interest I or of the compound BI; this elimination being based on the ultrafiltration by the kidneys of the compounds as a function of the size.
  • the larger the compound the slower its elimination; renal elimination is ineffective for compounds with a molecular weight of at least 50,000 Dalton.
  • This object can also be achieved by reducing the degradation by the hepatic metabolism of the compounds according to the invention.
  • increasing the half-life time means increasing the residence time means of compounds in the blood or decrease blood or plasma clearance.
  • the term “circulatory system” is understood to mean bodily fluids, more particularly the blood, and preferably the circulatory system of a mammal.
  • the group A is hydrophilic or amphipatic.
  • Groups A which are stable in the circulatory system are preferred (that is to say when less than 20%, preferably less than 2%, of the compound of formula (A) p - (E- B) n - (I) m is degraded or cleaved in the circulating blood (in particular by enzymes), during its conservation in human blood at 37 ° C for more than 2 hours), non-toxic for healthy cells, non-immunogenic, not - coagulants, or masking (that is to say preventing the substance of interest (I) from acting on the surface of a cell until it has been released from the prodrug).
  • group A can also have one or more of the following properties: preventing non-specific cleavage and / or degradation of the EB linking group; inhibit the biological effects of the substance of interest until the substance of interest has been released from the prodrug; increase the stability of the compound in the circulatory system; solubilization properties (or increase solubilization) in water, blood and / or serum of the compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m; targeting properties (or favoring targeting) of the compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m towards the target cells.
  • targeting properties of the compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m towards the target cells it is meant that the group A allows the compound of formula (A) p - (EB) n - ( I) m to accumulate near or at the level of the target cells.
  • This group A will then be said to be “biospecific”, that is to say capable of developing specific biological interactions and therefore of being recognized by biological entities of the living system.
  • it can be grafted onto the surface of group A of peptide sequences such as antibodies, antigens or amino acid motifs such as arginine-glycine-aspartic acid (RGD) making it possible to selectively increase the adhesion of the compound according to the invention on the surface of certain cell types.
  • RGD arginine-glycine-aspartic acid
  • the group A can also consist of a biospecific copolymer by functionalization of pre-existing macromolecular chains by appropriate chemical groups with the aim of being recognized or also by copolymerization of functionalized monomers.
  • group A is chosen from: polypeptides (such as polyglutamate, polyaspatate), immunoglobulins, albumin, polysaccharides, polymers or copolymers.
  • Polymers can include polyvinylpyrrolidone, pyran copolymer, polyhydroxypropyl-methacrylamide-phenol, polyhydroxy-ethyl-aspanamide-phenol, poly (ethylene oxide) - polylysine substituted by palmitoyl residues, pol (lactic acid), poly (epsilon-caprolactone), poly (hydroxybutyric acid), polyorthoesters, polyacetals, polydihydropyranes, polycyanoacrylates and crosslinked or amphipatic block hydrogel copolymers.
  • the group A is chosen from: a polyalkylene glycol, polyalkylene oxide, polyalkylene imine, copolymers of vinyl chloride.
  • the group A is a copolymer of vinyl chloride
  • the presence of sulfonate groups, or sulfonate and carboxylate is necessary so that the polymer does not develop a coagulating activity.
  • the group A is chosen from a polyethylene oxide, a polyethylene imine, sodium styrene sulfonate (NaSS), sodium butyl maleate (MMBE), hydroxypropyl methacrylate or N- (2-hydroxypropyl ) methacrylamide (HPMA), methyl methacrylate (MMA), poly- [N- (2-hydroxyethyl) -L-glutamine] (PHEG), poly- [N- (hydroxyethyl) -DL-aspartamide] (PHEA ).
  • the group A is a polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the size of the PEG can be between 200 and 50,000 Da, preferably between 350 and 20,000 Da and more preferably between 1,000 and 10,000 Da.
  • the presence of these PEGs makes it possible to improve the pharmacokinetic (Duncan et al., 1994), pharmacodynamic properties and therefore a reduction in the renal elimination of the compounds according to the invention.
  • another advantage known from the prior art is that PEG allows preferential accumulation in tumors. Indeed, PEGs with a molecular weight of 10 4 Da or more show a greater accumulation in tumors than in normal tissues (Greenwald et al., 2003, Seymour et al, 1995).
  • the group A can also be an agent with therapeutic activity or agent with diagnostic activity.
  • a group A having properties of agent with diagnostic activity may have elements with paramagnetic properties, that is to say possess in its electronic layers single electrons such as gadolinum, manganese and iron which in particular strengthen the contrast in magnetic resonance imaging (MRI).
  • MRI magnetic resonance imaging
  • polystyrene sulfonate to which iron is fixed.
  • the subject of the invention is also compounds using one or more targeting substances capable of vectorizing the compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m towards the target cells.
  • the targeting substances can be antibodies, antigens, liposomes.
  • the targeting substance (s) is (are) coupled (s) to the compound of formula (A) p - (EB) n - (I) m at the level of one or more group (s) A .
  • structure B is selectively cleavable by an enzyme present only or preferably in the environment of the target cells.
  • target cells is understood more particularly to mean cells which are involved in a pathology or which are of therapeutic or diagnostic interest. These target cells are preferably chosen from the group comprising primary or secondary tumor cells (metastases), stromal cells of primary or secondary tumors, neoangiogenic endothelial cells of tumors or tumor metastases, macrophages, monocytes, lymphocytes or polynuclear cells infiltrating tumors and tumor metastases. More particularly by
  • “Selectively cleavable” means a cleavage which is dependent on the sequence to be cleaved.
  • the sequence to be cleaved is preferably recognized by an enzyme present in the environment of the target cells and it is little or not degraded in the circulatory system or near non-target cells.
  • the expression "in the environment of the target cells” means that the enzyme is present either only or preferably near or at the level of the target cells. It should be noted that even if the cleavage is not carried out only near or at the level of the target cells, the fact that the cleavage is preferably performed (or for the most part or in the majority of cases) near or at the level of the cells targets, makes this cleavage selective.
  • the cleavage is said to be selective when the enzyme is found in greater concentration near or at the level of the target cells compared to the rest of the organism.
  • the term “enzyme” more particularly means a hydrolase.
  • the enzyme can be chosen from the group comprising peptidases, endopeptidases, lysosomal enzymes, lipases, glycosidases.
  • the enzyme is a peptidase specific for tumor cells, tumor stromal cells, neoangiogenic endothelial cells, macrophages or monocytes.
  • specific enzyme means a membrane enzyme or secreted only or preferably by the target cells in the extracellular medium of these target cells.
  • the enzyme when the enzyme is specific for tumor cells, this can be chosen from the group comprising neprilysine (CD10), Thi and oligopeptidase (TOP), Prostate Specifies Antigen (PSA), plasmin , legumaine, collagenases, urokinase, cathepsins, matrix metallopeptidases.
  • CD10 neprilysine
  • TOP Thi and oligopeptidase
  • PSA Prostate Specifies Antigen
  • plasmin plasmin
  • legumaine collagenases
  • urokinase urokinase
  • cathepsins matrix metallopeptidases
  • structure B will comprise an amino acid sequence (or oligopeptide) cleavable by this peptidase; if the enzyme is a glycosidase (for example a sucrase), then structure B will comprise an oligosaccharide cleavable by this glycosidase; if the enzyme is a lipase, then structure B will comprise a lipid chain cleavable by this lipase, and so on.
  • the invention preferably targets structures B comprising or consisting of an oligopeptide selectively cleavable by an enzyme present in the environment of tumor cells. These oligopeptides preferably comprise between 2 and 10 amino acids, and more preferably from 3 to 7.
  • the invention relates to the following sequences (preferably in L conformation): Ala-Phe-Lys (SEQ ID n ° l), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID n ° 2) or beta-Ala-Leu-Ala-Leu, Ala-Leu-Lys-Leu-Leu (SEQ ID n ° 3), Ala-Tyr- Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID No.4), His-Ser-Ser-Lys- Leu-Gln-Leu (SEQ ID No.5), Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly- Gln (SEQ ID No.
  • the enzymes according to the invention are capable of selectively cleaving the structure B so as to allow the release of I or the release of I with a residue of B.
  • the expression "release of I with a residue of B” is explained by l 'next example. If structure B is an amino acid sequence whose sequence is Ala-Leu-Ala- Leu, the substance of interest doxorubicin (BI being Ala- Leu-Ala-Leu-Dox) and the enzyme CD10, then this enzyme will cleave the amino acid sequence between Ala-Leu-Ala and
  • Reactivation in the extrasanguinal compartment means the cleavage of the peptide link B of the prodrug of structure (A) p- (EB) n- (I) m by specific endopeptidases present in any organ or tissue (healthy or tumor for example) other than blood and preferably at the level of the target cells.
  • the cleavage of structure B (for example a peptide) resulting in the release of an active form of the substance of interest I (for example a therapeutic agent).
  • a substance of interest active on target cells (I) means a substance whose site of action is located or whose effect will be exerted on the surface or in target cells.
  • such a substance of interest can be chosen from the group comprising a chemical agent, a polypeptide, a protein, a nucleic acid (DNA, sense or antisense RNA, single or double strand, complementary DNA, interfering RNA , and the like), an antibiotic, a virus or a marker, optionally coupled to a carrier substance (eg an antibody).
  • Said substance of interest (I) is preferably an agent with therapeutic activity and more preferably an agent with therapeutic anti-tumor, anti-angiogenic or anti-inflammatory activity.
  • the agent can have an extracellular or intracellular target (eg receptor) or site of action. It can also include a penetrating peptide sequence such as a sequence described in PCT patent application number WO 01/64738.
  • I is chosen from the group of agents to anti-tumor therapeutic activity, comprising: vinca alkaloids such as vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine; taxanes or taxoids such as paclitaxel, docetaxel, 10-deacetyltaxol, 1-epitaxol, baccatin III, xylosyltaxol; alkylating agents (or alkylating agents) such as ifosfamide, melphalan, chloraminophene, procarbazine, chlorambucil, thiophosphoramide, busulfan, dacarbazine (DTIC), mitomycins including mitomycin C, nitrosoureas and their derivatives (eg estramustine, BCNU, CCNU, fotemustine); platinum derivatives such as cisplatin and the like (e.g.
  • antimetabolites such as methotrexate, eminopterin, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, raltitrexed, cytosine arabinoside (or cytarabine), adenosine arabinoside, gemcitabine, cladribine, pentostatin, fludarabine phosphate, hydroxyureas; topoisomerase I or II inhibitors such as camptothecin derivatives (for example irinotecan and topotecan or 9-dimé thylaminomé-hydroxy-camptothécine hydrochloride), epipodophyllotoxins (for example etoposide, teniposide), amsacrine; mitoxanthrone; L-canavanine; antibiotics such as anthracyclines and for example adriamycin or doxorubicin, THP-adriamycin, daunorubicin,
  • antimetabolites such as methotrex
  • markers enzymes, antibodies, fluorescent or phosphorescent chemical molecules, molecules which can be used in scintigraphy.
  • markers enzymes, antibodies, fluorescent or phosphorescent chemical molecules, molecules which can be used in scintigraphy.
  • coumarin 7-amido-trifluoramethyl coumarin, paranitroanilide, 8-naphthylamide and 4-methoxy naphthylamide, fluorosceine, biotin, rhodamine, tetramethylrhodamine, GFP (green fluorescent protein), agents used in scintigraphy as radioactive isotopes, and derivatives of these compounds.
  • the invention also relates to basic or pharmaceutically acceptable acid addition salts, hydrates, solvates, precursors, metabolites or stereoisomers, of said compounds according to the present invention.
  • pharmaceutically acceptable salts refers to the non-toxic salts of the compounds according to the invention which can generally be prepared by reacting a free base of the compound according to the invention with a suitable organic or inorganic acid. These salts retain the biological efficiency and the properties of the free bases.
  • water-soluble and water-insoluble salts such as acetates, ansonates (4, 4-diaminos t ilbene s -2, 2 '- disulf onates), benzenesulfonates, benzonates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates , borates, bromides, buryrates, calcium edetates, camsylates, carbonates, chlorides, citrates, clavulariates, dihydrochlorides, edetates, edisylates, estolates, esylates, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, gl co 1 y lar s any 1 ates, hexaf luorophosphates, hexylresorcinates, hydrabamines, hydrobromides, hydrochlorides, hydroxynaphtoates, iod
  • the invention also relates to a composition comprising, as active principle at least one compound according to the present invention. It also relates to the use of such compositions for the formulation and preparation of biological, pharmaceutical, cosmetic, agrifood, diagnostic or tracing products.
  • the invention relates more particularly to pharmaceutical formulations comprising at least one compound according to the present invention, which can be in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, vector, diluent or excipient.
  • a subject can be treated with a pharmaceutically effective amount of a compound according to the invention.
  • pharmaceutically effective amount means an amount capable of inducing the biological or medical response of a tissue, system, animal or human as expected by the researcher or the attending physician.
  • compositions defined above can also comprise or be associated with at least one other active drug ingredient or at least one adjuvant well known to those skilled in the art (vitamin C, antioxidant agents, etc.) for being used in synergy with the compound according to the invention to improve and prolong the treatment.
  • the compositions are particularly useful in that they have very low toxicity, or are not toxic.
  • the pharmaceutical formulations according to the invention are capable of being used in vivo for preventive or curative purposes, for example viral infections, metastases, cell apoptosis (degenerative diseases, tissue ischemia ...), infectious diseases (viral, bacterial, by mycoses, ...), cancer and pathological neo-angiogenesis.
  • the administration of the compounds according to the invention can be carried out by any of the modes of administration accepted for therapeutic agents. These methods include systemic administration for example oral, nasal, parenteral, or topical administration, for example transdermal, or even central administration, for example by intracranial surgery, or even intraocular administration.
  • Oral administration can be by means of tablets, capsules, soft capsules (including delayed or prolonged-release formulations), pills, powders, granules, elixirs, tinctures, suspensions, syrups and emulsions. This form of presentation is more particularly adapted to the passage of the intestinal barrier.
  • Parenteral administration is generally by subcutaneous, intramuscular or intravenous injection or by infusion.
  • the injectable compositions can be prepared in conventional forms, either in suspension or liquid solution or in solid form suitable for extemporaneous dissolution in a liquid.
  • One possibility for parenteral administration uses the implantation of a slow-release or prolonged-release system which ensures the maintenance of a constant level of dose, for example, according to US-A-3,710,795.
  • intranasal administration suitable intranasal vehicles can be used.
  • transdermal administration transdermal skin patches well known to those skilled in the art can be used.
  • a transdermal release system allows continuous administration.
  • Other preferred topical preparations include creams, ointments, lotions, aerosol sprays and gels.
  • the compounds can be in solid, semi-solid or liquid form.
  • the active principle can be combined with excipients such as: a) diluents, for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine; b) lubricants, for example silica, talc, stearic acid, its magnesium or calcium salt and / or polyethylene glycol; c) binders, for example magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidone; where appropriate, d) disintegrants, for example starch, agar, alginic acid or its sodium salt, or effervescent mixtures; and / or e) absorbents, colors, flavors and sweeteners.
  • excipients such as: a) diluents, for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol,
  • the excipient may, for example, be a fatty emulsion or suspension, or based on polyalkylene glycol, such as polypropylene glycol.
  • Liquid compositions in particular injectable or to be included in a soft capsule, can be prepared for example by dissolution, dispersion, etc. of the compound according to the invention in a pharmaceutically pure solvent such as, for example, water, a saline solution of sodium chloride (NaCl), physiological saline, aqueous dextrose, glycerol, ethanol, an oil and like.
  • a pharmaceutically pure solvent such as, for example, water, a saline solution of sodium chloride (NaCl), physiological saline, aqueous dextrose, glycerol, ethanol, an oil and like.
  • the compounds according to the invention can also be administered in the form of delivery systems of the liposome or lipoplex type, such as in the form of small unilamellar vesicles, large unilamellar vesicles and multilamellar vesicles.
  • Liposomes can be formed from a variety of phospholipids, containing cholesterol, stearylamine or phosphatidylcholines.
  • a film of liquid components can be hydrated with an aqueous solution of the drug to form a lipid layer encapsulating the drug, as described in US-A-5,262,564.
  • compositions according to the invention can be sterilized and / or contain non-toxic adjuvants and auxiliary substances such as preserving, stabilizing, wetting or emulsifying agents, agents promoting dissolution, salts for regulating the osmotic pressure and / or buffers. In addition, they may also contain other substances of therapeutic interest.
  • auxiliary substances such as preserving, stabilizing, wetting or emulsifying agents, agents promoting dissolution, salts for regulating the osmotic pressure and / or buffers.
  • auxiliary substances such as preserving, stabilizing, wetting or emulsifying agents, agents promoting dissolution, salts for regulating the osmotic pressure and / or buffers.
  • agents promoting dissolution such as preserving, stabilizing, wetting or emulsifying agents, agents promoting dissolution, salts for regulating the osmotic pressure and / or buffers.
  • they may also contain other substances of therapeutic interest.
  • the compositions are prepared, respectively, by conventional methods
  • the dosage for the administration of the compounds according to the invention is chosen according to a variety of factors including the type, species, age, weight, sex and medical condition of the subject; the severity of the condition to be treated; the route of administration; the state of the renal and hepatic functions of the subject and the nature of the particular compound, or salt, used.
  • a normally experienced doctor or veterinarian will readily determine, and prescribe, the effective amount of the compound desired to prevent, reverse, or halt the progress of the medical condition to be treated.
  • Any of the above pharmaceutical compositions can contain from 0.1 to 99%, preferably 1 to 70% of active ingredient.
  • the oral dosages of the compounds according to the invention when they are used for the effects indicated will be 'between about 0.05 and 5000 mg / day, preferably between 5 and 1000 mg / day orally and preferably provided in the form of tablets containing 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 and 1000.0 mg of active ingredient.
  • the effective levels of the compounds according to the invention will be in the range from 0.002 mg to 500 mg per kg of body weight per day.
  • the compounds according to the invention can be administered in the form of single daily doses, or the total daily dosage can be administered in two, three or four doses per day.
  • the present invention relates to a diagnostic agent, for implementation in vitro, consisting of or containing at least one compound according to the present invention.
  • the compound according to the invention will then have as a substance of interest (I) a marker.
  • a diagnostic agent can also be used in vivo.
  • the present invention therefore also relates to a diagnostic kit which comprises said diagnostic agent. More particularly, the diagnostic kit comprises, in one or more containers, a predetermined quantity of a composition according to the invention.
  • Figure 1 schematically represents the two methods of synthesis of PEGylees prodrugs of Doxorubicin.
  • Figure 2 shows the cytotoxicity tests for Doxorubicin, beta-ALAL-Dox, PEG 2 ooo ⁇ beta-ALAL-Dox, PEG 20 oo-DSer-beta-ALAL-Dox and PEG 200 o- ( oSer) 4- beta-ALAL- Dox on MCF-7/6 cells.
  • Cell survival was estimated by a cell viability test (WST-1, Roche Molecular Diagnostic).
  • Graphs 2 A, B, C, D and E represent the survival of MCF 7/6 type cells (in% of the control) as a function respectively of the logarithm of the concentration of doxorubicin (A), beta-ALAL-Dox (B ), PEG 2 ooo-beta-ALAL-Dox (C), PEG 20 oo-DSer-beta-ALAL-Dox (D) and PEG 20 oo- (DSer) 4 -beta-ALAL-Dox (E).
  • Figure 3 graphically shows the evolution of the average body weight of xenografted mice carrying LS-174-T tumors. The results are expressed as a percentage of the weights measured at the start of the treatment.
  • Figure 4 graphically shows the change in the median of relative tumor volumes (RTV) in percentage from the start of treatment in days, groups of athymic mice carrying tumors of LS-174-T human colon carcinoma treated relative control (NaCl).
  • RTV relative tumor volumes
  • H Doxorubicin 6.69 ⁇ mol / kg
  • A Doxorubicin 8.6 ⁇ mol / kg
  • o Su-beta-ALAL-Dox 45 ⁇ mol / kg
  • Figure 5 shows the inhibition of the first and the second phase of growth of LS-174T tumors Doxorubicin (Dox), PEG 20O Q- (DSer) 4 -ALAL-Dox and Su-beta-Dox to ALAL respective doses of 6.69 ⁇ mol / kg, 1 x 50 + 3 x 35 ⁇ mol / kg, and 50 ⁇ mol / kg, in comparison with the 0.9% NaCl control solution (/ v). All the mice received 4 iv injections on days 0, 7, 14, and 21.
  • the minimum median T / C ratios (min T / C) of the relative tumor volumes (RTV) are given as a parameter of maximum efficiency.
  • the time differences for a doubling of the medians of the RTVs of the treated groups compared to the control group (T - C) as well as the SGD (specific growth retardation) are calculated from the linear regression of the growth phase to determine the degree of activity according to the criteria established by the EORTC.
  • the ratio of the slopes of the linear regressions of the evolution of the medians of the RTVs of the treated groups compared to the control group (Slope T / C), expressed in percent, are given as a growth speed comparison parameter.
  • FIG. 6 represents an in vitro stability test for beta-ALAL-Dox (A), PEG 2 ooo-beta-ALAL-Dox (B) and PEG 2 ooo ⁇ (DSer) 4-beta-ALAL-Dox (C) in the serum medium.
  • the results represent, as a function of time, the concentrations of the conjugates determined by HPLC.
  • FIG. 7 represents an in vitro stability test of the compounds ALAL-Dox (A), beta-ALAL-Dox (B), PEG 2 ooo-beta- ALAL-Dox (C) and PEG 20 oo- (DSer) 4 - beta-ALAL-Dox (D) in human whole blood.
  • the results represent the evolution as a function of time of the concentrations of the conjugates and of the possible metabolites formed, determined by HPLC.
  • Figure 8 graphically represents the evolution of the average body weight of athymic mice carrying HCT-116 human colon carcinoma tumors. The results are expressed as a percentage of the weights measured at the start of the treatment.
  • A PEG2000- (oSer) 4 -ALAL-Dox 53 ⁇ mol / kg;
  • FIG. 9 represents the inhibition of HCT-116 tumor growth by the evolution of the ratio between the median of the RTV of the treated groups (T) and that of the control group (C) expressed as a percentage (T / C (%)) .
  • Treatments (•) NaCl, (+) Su-beta-ALAL-Dox 30 ⁇ mol / kg; (A) PEG 2 ooo ⁇ (oSer) 4 -ALAL-Dox 53 ⁇ mol / kg; (*) PEG2000- (DSer) 4 -ALAL-Dox 110 ⁇ mol / kg.
  • Figure 10 graphically shows the evolution of the survival of xenografted mice carrying HCT-116 tumors (in%).
  • Figure 11 represents the inhibition of HCT-116 tumor growth by the evolution of the ratio between the median of the RTV of the treated groups (T) and that of the control group (C) expressed as a percentage (T / C (%)) .
  • NaCl (- • -) PEG2 0 00- (DSer) 4-ALAL-D0X 200 ⁇ mol / kg (A), PEGooo-ALAL-Dox 200 ⁇ mol / kg (u).
  • Figure 12 graphically represents the evolution of the survival of xenografted mice carrying melanoma B16-BL6 tumors (%).
  • PBS control (•); (PEG 50 oo-ALAL) n -TNF ⁇ (m); (PEG5000- (DSer) 4 -ALAL) n ⁇ TNF ⁇ (A); (PEGsooo) n -TNF ⁇ ().
  • Figure 13 graphically shows the evolution of the average body mass of xenografted mice carrying melanoma B16-BL6 tumors. The results are expressed as a percentage of the masses measured at the start of the treatment.
  • PBS control (•); (PEG 50 o 0 -ALAL) n -TNF (B); (PEG 5 ooo- (DSer) 4 -ALAL) n -TNF ⁇ (A); (PEG 5000 ) n -TNF ⁇ ( ⁇ ).
  • Figure 14 represents the inhibition of the growth of B16-BL6 tumors by the evolution of the ratio between the median of the RTV of the treated groups (T) and that of the control group (C) expressed in percentage (T / C (%) ).
  • Example 1 Material & Methods 1.1) Cell Lines MCF 7/6 Cells: a variant of the MCF-7 line (Michigan Cancer Foundation Engel et al., 1978) which was obtained in 1970 from a pleural effusion in a patient with breast adenocarcinoma (Soûle et al, 1973). These cells come from Professor Mareel's laboratory in Ghent (Laboratory of Experimental Cancerology, University Hospital of Ghent, Belgium).
  • LNCaP cells isolated in 1977 by Horosze ic et al. , from a biopsy of the supraclavicular lymph nodes of a patient with metastatic carcinoma of the prostate. This line comes from the ATCC (American Type Culture Collection. USA).
  • LS-1 74 T cell line variant of the LS180 line, from a woman with colon adenocarcinoma. These cells very quickly form tumors after inoculation in athymic mice. These cells come from ECACC (European Collection of Cells Cultures. UK).
  • HCT-11 cells 6 cell line established from a primary culture of human colon carcinoma cells. These cells form tumors after subcutaneous injection in athymic mice. These cells come from the ATCC (American Type Culture Collection. USA).
  • Doxorubicin is supplied by Meiji Seika Kaisha Ltd. (Tokyo, Japan), succinyl-beta-Ala-Leu-Ala-Leu- Doxorubicin (Su-beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) (Fernandez et al., 2001), PEG 20 oo-Ala- Leu-Ala-Leu-Dox and PEG 2 ooo- (DSer) 4 -Ala-Leu-Ala-Leu-Dox were synthesized.
  • PEGylated derivatives of Doxorubicin prodrugs were carried out using two different methods "A" and "B” ( Figure 1).
  • the PEGylated derivatives of prodrugs of Doxorubicin synthesized according to one or the other of the two methods are the following: - PEG 2 ooo- (DSer) 4 -beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (1) - PEG2000 - (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin (2) - PEG 2 ooo _ (DSer) -beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin (3) - PEG2ooo _ beta-Ala-Leu- Ala-Leu-Doxorubicin (4) - PEG 20 oo _ Ala-Leu
  • Synthesis method "B” peptide synthesis on solid support (SPPS) by Fmoc chemistry (Fluorenyl-L-methoxycarbonyl) The principle of this method is the synthesis of the PEGylated peptide sequence on solid polymeric support (Wang type resin ) and then the coupling between the
  • PEG 2 ooo "" peptide-OH obtained and Doxorubicin.
  • the principle of SPPS is to successively hang on a solid support (Wang type resin) the different amino acids of the expected peptide according to procedures known to those skilled in the art (Merrifield, 1963 and 1965; Steward and Young, 1969).
  • Peptide synthesis on solid support The synthetic peptides are obtained by peptide synthesis on solid support in a manual synthesis reactor (AnaSpec), by the chemistry of the Fmoc group, for example.
  • All the resins used (AnaSpec or Novabiochem) during the synthesis on solid support are Wang resins having the first protected amino acid pre-attached with an initial substitution given by the supplier between 0.4 and 0.7 mmol / g of resin.
  • the amino acids Fmoc were supplied by AnaSpec or Novabiocem, with the protective groups on the side chain as follows: trityl (Asn, Cys, Gin, and His), Acm (Cys), Boc (Lys and Trp), O-tert -Butyl (Asp and Glu), tert-Butyl (Ser, Thr, Tyr) and Pbf (Arg).
  • PEG-SPA polyethylene glycols of desired molecular weight
  • OSu pre-activated hydroxysuccinimidyl ester
  • DMF dimethylformamide
  • the coupling agent used during the synthesis is HCTU (3-oxide of ÎH-Benzotriazolium 1- [bis (dimethylamino) methylene] -5chlorohexafluorophosphate (1-)) or HBTU (2- (1H-benzotriazole-1 - yl) -1, -1, -3, -3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate) or HATU (O- (7-Azabenzotriazol-l-yl) -N, -N, -N ', -N' - tetramethyluroniumhexafluorophosphate) in DMF .
  • Standard amino acid coupling cycles are performed as follows: 3 x 30 seconds, washing with DMF; 3 x 2 minutes then 1 x 7 minutes, deprotection with piperidine diluted to 20% in DMF; 5 x 20 seconds, washes with DMF; 2 x 15 minutes of coupling with the amino acid (2 eq.), The coupling agent (2 eq.) And DIPEA (4 eq.) followed by 3 x 30 seconds of washing with DMF.
  • the lowering of the substitution of the initial commercial resin is carried out by the addition of 0.5 to 0.3 molar equivalents of the first Fmoc-AA-OH to be coupled according to the desired sequence (desired final substitution of the order of 0 , 1 to 0.22 mmol / g) followed by acetylation of the remaining amino groups (Virender et al., 1981).
  • the coupling of each amino acid is verified by a Kaiser test well known to those skilled in the art (Kaiser et al. 1970).
  • PEGylation on the Wang solid support is obtained by coupling 2 x 2 days of the active form of PEG-SPA ester (Nektar) and DIPEA.
  • the chemical cleavage of the covalent link connecting the PEGylated peptide to the solid Wang support is obtained with a mixture consisting of t rifluoroacetic acid (TFA): water: triisopropylsilane (TIS) in the proportions 95: 2.5: 2.5, added to the resin well dried in the manual synthesis reactor and for three hours.
  • TSA t rifluoroacetic acid
  • TIS triisopropylsilane
  • the acid peptide is analyzed by HPLC chromatography with a column (reverse phase) of VYDAC type (C8, 5 ⁇ m, 250 x 4.6 mm), with a first solvent (solvent A) consisting of 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) in water and a second solvent (solvent B) consisting of 0.1% TFA in acetonitrile (ACN), with a gradient from 0% to 70% in 25 minutes for the solvent B.
  • solvent A consisting of 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) in water
  • solvent B consisting of 0.1% TFA in acetonitrile (ACN)
  • the mixture is protected from light and stirred for 15 minutes at room temperature before the addition of 1.3 molar equivalents of HATU (coupling agent, PE Biosystem).
  • the reaction is followed by analysis by HPLC chromatography (point 2.3. Above) for approximately 3 hours.
  • the solvent is evaporated in vacuo.
  • the residual product is taken up in water and extracted with dichloromethane.
  • the product (2) preferably accumulates in the organic phase while the product (5) is mainly recovered in the aqueous phase.
  • the organic phase containing the product (2) is concentrated by evaporation under vacuum and the product is precipitated with ether at room temperature.
  • the precipitate obtained is dissolved in water before being lyophilized.
  • the aqueous phase containing product 5 is recovered, frozen in an acetone and dry ice bath and lyophilized. Before lyophilization, the products were analyzed by HPLC (see point 2.2 above).
  • the products are dissolved in a minimum volume of water and sterilized by filtration through a filter with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • the culture medium used for the tests described below is RPMI 1 640 with Glutamax-1 containing 10% fetal bovine serum (serum medium) (SBF; Gibco-BRL).
  • Cytotoxicity tests Cytotoxicity tests for Doxorubicin and derivatives were carried out with MCF-7/6 cells and LNCaP cells. The cells are removed by trypsinization, counted and then seeded in 96-well plates in 200 ⁇ L of serum medium. The cells are incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • the conditioned medium is recovered, centrifuged for 10 minutes at 300 g, buffered with 1 M Tris-HCl pH 7.5 (1 vol buffer + 19 vol medium) and concentrated 20 times by ultrafiltration (threshold of 10 kDa cut-off) (Tris: Trishydroxymethyl-aminomethane).
  • Reactivation of PEGylated derivatives of the prodrug "peptide of Doxorubicin (beta-SAFER-Dox) by peptidases secreted by tumor cells was compared to that of the initial prodrug, beta-SAFER-Dox, which is hydrolysed in Leu- Dox and Doxorubicin during an incubation in medium conditioned by tumor cells.
  • the compounds are diluted to 20 ⁇ M in the conditioned medium and incubated for 6 to 18 hours at 37 ° C. in a thermostated bath.
  • the hydrolysis of the compounds is quantified by HPLC analysis (see point 7.1 below)
  • the following PEGylee prodrugs were used: PEG 35 o-beta-ALAL-Dox PEG 75 o-beta-ALAL-Dox PEG 2 ooo-beta-ALAL-Dox PEG 50 oo-beta-ALAL-Dox 6.2) Stability in the culture medium PEG 2 000- (DSer) 4 -beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (1), PEG 2 0 00 - beta-Ala-Leu- Ala-Leu-Dox.
  • beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (control) are diluted to 20 ⁇ M in 500 ⁇ L of medium containing 10% calf serum fetal (serum environment). samples are distributed in 24-well plates and incubated at 37 ° C in an atmosphere saturated with water and containing 5% of CO 2 . For each product, an extraction (Extraction method with acetonitrile see point 7.3 below) is carried out in triplicate at time 0 and after 1, 2, 6 and 24 hours of incubation. The samples are then analyzed by HPLC chromatography (see point 7.3 below).
  • the samples are dissolved by adding 500 ⁇ L of a mixture containing 30% acetonitrile and 10% ammonium formate buffer (pH 4). The samples are then filtered and analyzed by HPLC chromatography (see point 7.3 below). 7.2) Extraction with acetonitrile In tubes containing 50 ⁇ L of sample to be extracted, 10 ⁇ L of internal standard (prolyl-daunorubicin) and 50 ⁇ M and 150 ⁇ L of acetonitrile are added. The tubes are shaken and centrifuged for 10 minutes at 13,000 g. The supernatant is diluted 4 times in formate buffer pH 4, centrifuged, then analyzed by HPLC chromatography (see point 7.3 below).
  • internal standard prolyl-daunorubicin
  • the clinical signs are monitored regularly (every hour during the first day and daily until the end of the study), as well as the weight which is measured at the same time as the tumor volume (mm 3 ).
  • the growth of the tumor is checked twice a week by measuring with a caliper two diameters (or “diagonals") perpendicular to the tumor (the largest and the smallest “diagonal”).
  • the median of the relative tumor volumes (RTV for "relative tumor volume") which express in percent the evolution of the medians of the tumor volumes compared to day 0 is calculated.
  • growth inhibition is determined by calculating the ratio between the median of the RTV of the treated groups (T) and that of the control group (C) expressed as a percentage (T / C (%) ). The lowest T / C value is used as a parameter to estimate the maximum efficiency of the products used.
  • the duration of tumor growth inhibition was evaluated by calculating the growth retardation between the treated groups and the control group (T - C) for a doubling (DT ("Doubling Time")) of the medians of the RTV (l '200% indication in Figure 5 representing the doubling time of the control group).
  • the specific growth retardation (SGD for “Specifies Growth Delay”) is also calculated from the time necessary for a doubling of the median of the RTV in the different study groups.
  • SGD is equal to (DT tra ity - DT Roie cont) / (U ⁇ control) •
  • the activity of the various products tested was also evaluated based on the criteria recommended by the EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) (Boven et al., 1992; Langdon et al., 1994) and presented in Table I. However, the way to estimate the effectiveness of the compounds has been adapted since the criteria proposed in the literature (Boven et al., 1992) are only valid for tumors which exhibit linear monophasic growth.
  • the LS-174-T tumor used is characterized by growth in 2 phases; the terminal phase (phase 2) being much faster than the first phase (phase 1).
  • T - C growth retardation
  • SGD specific growth retardation
  • the conjugates (PEG 50 oo) n-TNF, (PEGsooo-Ala-Leu-Ala- Leu) n-TNF ⁇ and (PEG5000- (DSer) 4 -Ala-Leu-Ala-Leu) n-TNF ⁇ were synthesized.
  • N varies from 1 to 18 (18 being the total number of lysine per molecule of TNF ⁇ in its trimer form, knowing that each TNF monomer contains 6 lysine residues).
  • the rhTNF ⁇ dissolved in 20 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 1% mannitol is then added and the reaction mixture is stirred at room temperature overnight.
  • the coupling product is recovered and the excess PEG-peptide-OH is removed by ultracentrifugation.
  • the concentration of the final products is determined by a protein assay. 1.3)
  • Male C57BL / 6J mice (from 5 weeks to delivery by Charles River Laboratories, France) were used.
  • mice All animal handling is done in accordance with the recommendations of the UKCCCR (United Kingdom Co-ordinating Committee on Cancer Research; Workman et al., 1998) and FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associ a ti ons; Nicklas et al., 2002; Rehbinder et al., 2000; Rehbinder et al., 1996) on the use and welfare of animals in experimental chemotherapy studies.
  • the experimental chemotherapy study is carried out on conventional male mice of type C57BL / 6J carrying tumors of murine origin B16-BL6 (murine melanoma) previously grafted intradermally. The mice are selected and distributed in the different study groups so as to have an equitable distribution of tumor volumes.
  • the different treatments are assigned to groups formed randomly.
  • the treatments are administered by the iv route on days 0 and 3.
  • the animals receive a constant volume of 10 ⁇ l / g of product (Workman et al., 1998).
  • the clinical signs are followed regularly (every hour during the first day and daily until the end of the study), as well as the weight which is measured at the same time as the tumor volume.
  • the growth of the tumor is checked twice a week by measuring with a caliper two diameters (or "diagonals") perpendicular to the tumor (the largest and the smallest "diagonal").
  • the antitumor efficacy is quantified by the value of the T / C ratio (the lower corresponding to the maximum efficiency).
  • Example 2 Effect of PEGylation on the Reactivation of a Doxorubicin Prodrug, Beta-ALAL-Dox, by Peptidases Secreted by Tumor Cells Beta-ALAL-Dox, PEG 3 5o-beta-ALAL-Dox Compounds , PEG 750 -beta-ALAL-Dox, PEG 20 oo-beta-ALAL-Dox and PEG 5 ooo-beta-ALAL-Dox (20 ⁇ M) were incubated for 6 hours in conditioned medium of MCF-7 tumor cells / 6 or LS-174T.
  • Example 3 In Vivo Study of the Tumor Reactivation of PEGylated Derivatives of a Doxorubicin Prodrug
  • the In Vivo Tumor Reactivation of PEGylated Derivatives of a Doxorubicin Prodrug was evaluated using an athymic mouse model carrying xenografts of LS-174T human colon carcinoma tumors.
  • Table 3 below represents the average (obtained from 18 mice) of the concentrations of Dox and Leu-Dox accumulated in tumors at 2 and 72 hours after the injection of the test compound. Table 3
  • EXAMPLE 4 Effect of the Insertion of a Spacer on the Reactivation by the Peptidases Secreted by the Tumor Cells of Doxorubicin PEGylee Prodrugs Beta-ALAL-Dox prodrugs (20 ⁇ M) were incubated for 6 to 18 hours conditioned medium of LS-174T or LNCaP tumor cells. The reactivation of the prodrugs (release of Doxorubicin and Leu-Dox) was measured by HPLC chromatography.
  • Example 5 Cytotoxicity Tests of PEGylated Derivatives of a Doxorubicin Prodrug
  • the MCF-7/6 tumor cells were cultured for 48 hours in a serum medium containing increasing concentrations of Doxorubicin, beta-ALAL-Dox, PEG 2000 - beta -ALAL-Dox, PEG 2 ooo-DSer-beta-ALAL-Dox or PEG2000- (DSer) 4 -beta-AL ⁇ L-Dox. They are then post-incubated for 24 hours in the presence of serum medium.
  • the cytotoxicity of the products is estimated by a cell viability test (WST-1, Roche Molecular Diagnostic). The results of 3 independent experiments are presented in Figure 2.
  • IC 50 values (inhibitory concentration at 50%) of Doxorubicin and of the beta-ALAL-Dox compound are respectively 0.045 ⁇ M and 158.48 ⁇ M which confirms the character beta-ALAL-Dox prodrug.
  • Comparison of mean IC 50 values obtained for beta compounds ALAL-Dox and PEG 2 ooo _ beta-ALAL-Dox indicate that PEGylation inhibits the reactivation of the prodrug since PEG 2 ooo ⁇ beta-ALAL-Dox is not cytotoxic up to a concentration of 500 ⁇ M.
  • the prodrug comprising a DSer between PEG and beta-ALAL-Dox (PEG 2 ooo-DSer-beta-ALAL-Dox) is not cytotoxic either.
  • the prodrug comprising the molecular spacer (DSer) 4 between the PEG and beta-ALAL-Dox, (PEG 2 ooo _ (dare) 4 -beta-ALAL-Dox) is cytotoxic
  • EXAMPLE 6 Efficacy Study of a PEGylated Derivative of a Doxorubicin Prodrug, Beta-ALAL-Dox, in a Xenograft Model of Human Colon Carcinoma LS-174T
  • the Anti-Tumor Activity of Doxorubicin, succinyl-beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, and PEG20 0 0- (DSer) 4 -Ala- Leu-Ala-Leu-Dox was tested in an athymic mouse model (nu / nu NMRI ) carrying ectopic LS-174T human tumor xenografts.
  • PEG2000- (oSer) 4-ALAL-D0X was administered for the first time by iv bolus at doses of 50 ⁇ mol / kg and 45 ⁇ mol / kg. Mortality was observed at the two doses administered. The doses administered were reduced from day 7.
  • PEG2000- (DSer) -ALAL-Dox was injected at 35 ⁇ mol / kg and 25 ⁇ mol / kg (once a week, 3 injections).
  • Figure 4 represents the evolution of the median of the relative tumor volumes (RTV) of the groups of treated mice (T) compared to the control (C) (NaCl). Although administered in doses below the maximum tolerated dose (BAT), all the products tested have anti-tumor activity.
  • RTV relative tumor volumes
  • C control
  • BAT maximum tolerated dose
  • two phases of tumor growth were observed ( Figure 5).
  • the activity of PEG 2 ooo _ (oSer) -ALAL-Dox (1 x 50 + 3 x 35 ⁇ mol / kg) is comparable to that of Doxorubicin (6.69 ⁇ mol / kg) and is lower than that of Succinyl-beta-ALAL-Dox (50 ⁇ mol / kg).
  • Example 8 Stability of PEGylated Derivatives of Doxorubicin Prodrugs in Human Whole Blood.
  • the beta-ALAL-Dox, PEG 2 ooo _ ALAL-Dox, PEG 2 ooo _ beta-ALAL-Dox and PEG 2 ooo ⁇ (Dser) 4 -ALAL-Dox compounds were diluted to 20 ⁇ M in citrated human blood and incubated at 37 ° C. At different time points, the concentrations of the conjugates and of the possible metabolites formed were evaluated by HPLC.
  • Figure 7 illustrates the evolution of the concentration of the products as a function of the incubation time.
  • the ALAL-Dox compound was used as a control. The latter is not stable in the blood.
  • the stability of the PEGylated derivatives tested may be due to the presence of unnatural amino acids (_Alanine or dSerine) but also to the PEG used as stabilizing group.
  • Example 9 Efficacy study of a PEGylated derivative of a prodrug of Doxorubicin, beta-ALAL-Dox, in a xenograft model of human colon carcinoma HCT-116 The antitumor efficacy of PEG 2 ooo _ ( DSer) 4 -ALAL-Dox was compared to that of Succinyl-_ALAL-Dox in a model of human colon carcinoma xenograft HCT-116 implanted subcutaneously in Swiss nu / nu mice.
  • PEG2000- (DSer) 4 -ALAL-Dox is toxic at 300 and 400 ⁇ mol / kg and induces weight loss and animal death (Figure 10). This toxicity suggests a greater reactivation in the extrasanguin compartment of PEG2000- (DSer) 4 -ALAL-Dox compared to PEG 2 ooo-ALAL-Dox. At an equimolar and non-toxic dose (200 ⁇ mol / kg), PEG2000- (DSer) -ALAL-Dox has better anti-tumor efficacy than PEG 2 ooo-ALAL-Dox ( Figure 10).
  • TNF- ⁇ ⁇ The anti-tumor activity of (PEG 50 oo ⁇ (oSer) 4 -ALAL) n -TNF ⁇ was compared with that of (PEG5000) n-TNF ⁇ , and (PEG 5 ooo-Ala-
  • FIG. 13 shows the evolution of the average body weight in percent from the start of treatment as a function of time.
  • the day after the first injection significant weight loss was observed in the groups treated with (PEG 50 oo-ALAL) n -TNF ⁇ and (PEG 50 oo- (DSer) 4 -ALAL) n-TNF ⁇ (from 15 and 28%, respectively).
  • this weight loss was accentuated in the group treated with (PEG 5 ooo _ (oSer) 4 -ALAL) n -TNF ⁇ .
  • the toxicity is low or zero (in weight loss) in the absence of a peptide between PEG and TNF ⁇ .
  • the insertion of an ALAL link between these two parts induces a greater toxicity of the product reflecting its greater extrasanguine reactivation.
  • the extension of this peptide (ALAL) by the insertion of a hydrophilic spacer (DSer) 4 induces a significant increase in the toxicity of the conjugate probably resulting from its increased sensitivity to reactivation in the extrasanguin compartment.

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Abstract

La présente invention a pour objet une forme modifiée d'une prodrogue. Une forme typique de prodrogue selon l'invention comprend un groupe encombrant, un espaceur, une structure clivable dans l'appareil circulatoire et un agent thérapeutique ou un marqueur; l'espaceur permettant ou facilitant le clivage de la structure clivable.

Description

POTENTIALISATION DE L'ACTIVATION DE PRODROGUES DE HAUT POIDS MOLECULAIRE
La présente invention concerne le domaine des prodrogues et plus particulièrement les prodrogues destinées au traitement et/ou au diagnostic de tumeurs cancéreuses et/ou de réactions inflammatoires. Les prodrogues sont des molécules pharmacologiquement inactives susceptibles de se transformer in vivo en drogues (agents thérapeutiques actifs) après certaines modifications chimiques ou enzymatiques de leur structure. Les prodrogues permettent la libération de la drogue, c'est-à-dire la transformation de la prodrogue en drogue, au niveau d'un site d'action ou d'un tissus cible plutôt que dans l'appareil circulatoire ou dans un tissu non-cible. Elles permettent aussi d'augmenter in vivo l'index thérapeutique (c'est-à-dire le rapport activité sur toxicité) d'agents thérapeutiques tels que les agents anti-tumoraux comme les anthracyclines (telle la doxorubicine) et les alcaloïdes vinca ou des agents anti-tumoraux ayant des effets antiinflammatoires comme le méthotrexate . Ainsi, plusieurs prodrogues ont jusqu'à présent été développées dans le but d'obtenir une spécificité d'action élevée, une toxicité réduite et une stabilité améliorée dans le sang et/ou le sérum.
Il a été décrit dans l'art antérieur des prodrogues présentant la structure de base suivante : agent thérapeutique, oligopeptide clivable par une enzyme présente dans l'environnement extracellulaire de cellules cibles, groupe stabilisant ou masquant. La demande de brevet PCT numéro de publication WO 96/05863 décrit notamment une prodrogue de formule bêta- Alanyl-Leucyl-Alanyl-Leucyl-Doxorubicine (ou encore bêta- ALA-LEU-ALA-LEU-Dox ou bêta-ALAL-Dox) . Cette prodrogue est stable dans le sang, c'est-à-dire relativement insensible au clivage par les peptidases du sang, et est réactivée in vivo par des peptidases sécrétées par un grand nombre de cellules tumorales. La prodrogue est successivement hydrolysée en Ala-Leu-Dox puis en Leu-Dox dans l'environnement extracellulaire péritumoral . La Leu-Dox pénètre dans la cellule par diffusion où elle est activée sous la forme Doxorubicine (Trouet et al . 2001) . Les études de toxicité et d'activité in vivo avec la prodrogue ci-dessus montrent une réduction de la toxicité et une inhibition de la croissance tumorale plus importante par rapport à la Doxorubicine seule. Cependant, les études de pharmacocinétique montrent que son temps de demi-vie d'élimination rénale est court. La prodrogue semble être éliminée rapidement par les voies urinaires (Dubois et al . 2002) . La demande de brevet PCT numéro de publication WO 00/33888 propose l'adjonction à la prodrogue bêta-Ala-Leu- Ala-Leu-Dox d'un groupe masquant la charge positive de la bêta-Alanine afin d'améliorer son efficacité. Ce groupe masquant peut être, par exemple, un polyéthylène glycol (PEG) . La demande de brevet PCT numéro de publication WO 01/91798 décrit des prodrogues présentant une stabilité dans l'appareil circulatoire améliorée. Par exemple, les prodrogues peuvent être PEGylées, c'est-à-dire que le PEG est utilisé en tant que groupe stabilisant et/ou masquant. La liaison de ce polymère (PEG) entraîne une amélioration des propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des prodrogues et donc une réduction de l'élimination rénale, de par la taille de la molécule. En effet, plus la molécule est grande plus son élimination est lente (Harris & Chess, 2003) .
Dans le cadre des travaux de recherche ayant conduit à la présente invention, la Demanderesse a préparé des prodrogues PEGylées à partir d'une prodrogue de la Doxorubicine (décrite dans la demande de brevet WO 96/05863) en utilisant différentes tailles de PEG, afin de diminuer son ultrafiltration rénale par la taille volumineuse du composé, tout en gardant ses propriétés de prodrogues
(réactivation par les enzymes sécrétées par les cellules tumorales) . La Demanderesse a couplé des PEGs de tailles croissantes (poids moléculaires de 350 à 20000 en passant par 750, 2000, 5000) à la prodrogue bêta-Ala-Leu-Ala-Leu- Dox. Afin de tester la réactivation des dérivés PEGylés de cette prodrogue, des tests de clivage ont été réalisés in vi tro . Ces tests avaient pour but d'évaluer la réactivation des dérivés PEGylés par les enzymes sécrétées par les cellules tumorales (LS-174T et MCF-7/6) par rapport à la bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox qui est hydrolysee en Leu-Dox en présence de milieu conditionné de ces cellules cancéreuses. Les résultats de ces tests ont montré 1) que quelle que soit la taille du PEG, la réactivation de la drogue par clivage de la séquence peptidique (Ala-Leu-Ala-Leu) est moins efficace, comparé à la prodrogue sans le groupement PEG et 2) une corrélation entre la taille du PEG et le clivage de la prodrogue PEGylée : plus le PEG couplé était de grande taille, moins la prodrogue était clivée par les enzymes présentes dans l'environnement extracellulaire des cellules cibles. La Demanderesse a émis l'hypothèse que la réduction du clivage du lien peptidique de la prodrogue était certainement due à un phénomène d'encombrement stérique du PEG. En d'autres termes, plus la prodrogue comprend un groupement stabilisant ou masquant de haut poids moléculaire, moins elle est réactivée, ce qui va à 1' encontre du but recherché pour une prodrogue possédant une longue demi-vie.
La présente invention a précisément pour but d'offrir une nouvelle structure de prodrogue afin d'éliminer ce phénomène d'encombrement sterique et de permettre ou faciliter le clivage de l' oligopeptide lorsque le groupe masquant et/ou stabilisant est de taille volumineuse, tout en gardant une spécificité d'action élevée, une toxicité réduite et une stabilité dans le sang et/ou le sérum, préférentiellement chez un mammifère. Ce but est atteint en insérant un « bras moléculaire » ou « espaceur moléculaire » entre le groupe masquant et/ou stabilisant (par exemple le PEG) et la séquence peptidique clivable par une enzyme « spécifique » de cette séquence. Les espaceurs moléculaires selon l'invention, aussi désignés ci-après « espaceurs », ont été choisis en tenant compte des propriétés hydrophiles des unités constituant l' espaceur .
La présente invention a donc tout d'abord pour objet un composé de formule (A)p- (E-B) n- (I)m : dans laquelle : I est une substance d' intérêt active sur des cellules cibles, - A est un groupement augmentant le temps de demi-vie de B-I dans la circulation sanguine, - E-B est un groupe de liaison entre A et I, où : - B est une structure clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement à proximité ou au niveau desdites cellules cibles, - E est un groupe espaceur hydrophile, stable dans l'appareil circulatoire, qui éloigne A de B de façon à permettre ou faciliter le clivage de B à proximité ou au niveau desdites cellules cibles et ainsi permettre ou faciliter la libération de I ou la libération de I avec un reste de B, - n est un nombre entier compris entre 1 et soit le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, soit le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - m est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - p est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de I, sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, avec quand p = 1, n = m et quand m = 1, n = p. Selon une première forme de réalisation préférée de la présente invention, p, n et m sont égaux à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivant A-E-B-I. Selon une deuxième forme de réalisation préférée de la présente invention, m est égal à 1 et n et p sont identiques et supérieurs à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivante (A-E-B) t>ι~I ι où t représente un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles le groupement A-E-B- peut être fixé. Avantageusement, I peut être représenté par un polypeptide, tel qu'une molécule de cytokine TNF-alpha sur laquelle sont branchés plusieurs groupements A-E-B- . Selon une troisième forme de réalisation préférée de la présente invention, p est égal à 1 et n et m sont identiques et supérieurs à 1. Le composé est alors représenté par la formule suivante A- (E-B-I) k>ι, ou k représente un nombre entier compris entre 2 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles le groupement -E-B-I peut être fixé. Avantageusement, A peut être représenté par un polymère, tel une molécule de PEG branché, sur laquelle sont branchés plusieurs groupements - E-B-I. Selon une quatrième forme de réalisation préférée de la présente invention, p et m sont supérieurs à 1 et n peut être différent de p et de m. A titre d'exemple, si p = 2, n = 3 et m = 2, le composé peut être représenté par la formule suivante : (I) - (B-E) - (A) - (E-B) - (I) - (B-E) - (A)
La substance d'intérêt active (I) peut être fixée soit directement à une ou plusieurs structures B par une liaison covalente, soit indirectement par l'intermédiaire d'un « bras de liaison ». A titre d'exemple, lorsque la structure B est une séquence d'acides aminés, et qu'elle est fixée directement à la substance d'intérêt I, la liaison covalente peut alors être réalisée à l'extrémité N-terminale ou C- terminale de la séquence d'acides aminés selon son orientation, ou à tout autre site de l' oligopeptide (par exemple au niveau de la chaîne latérale d'un des acides aminés) . Par ailleurs, lorsque la liaison entre B et I est indirecte, le bras de liaison peut avoir plusieurs fonctions telles que faciliter le clivage entre B et I, fournir un moyen de liaison chimique approprié entre B et I, améliorer le procédé de synthèse du composé, améliorer les propriétés physiques de la substance d'intérêt (I), fournir un mécanisme supplémentaire de libération intracellulaire ou extracellulaire de la substance d'intérêt (I). Cette liaison indirecte peut être réalisée par tout procédé de couplage chimique, biochimique, enzymatique ou génétique connu de l'homme de l'art. A titre d'exemple de tels bras de liaison, on peut citer un réactif de pontage homo- ou hétérofonctionnel du type 4- (N-maléimidométhyl) cyclohexane- 1-carboxylate de succinimidyle (SMCC) , des agents bi ou multifonctionnels contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d' alkyle, aryle ou arylalkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure . ou chlorure de cyanogène, carb ony 1 di imi da z o 1 e , thiocarbonyldiimidazole des esters de succinimide ou des halogénures sulphoniques , phosgène, thiophosgène, des espaceurs auto-réarrangeables (ou « self-immolative ») (Schmidt et al . , 2001) .
L' espaceur (E) selon la présente invention lie le groupement A à la structure B. Il est préférentiellement hydrophile et stable dans l'appareil circulatoire. Un espaceur est « stable dans l'appareil circulatoire» lorsque moins de 20%, de préférence moins de 10%, de préférence encore moins de 2%, de l' espaceur est dégradé ou clivé (en particulier par des enzymes) dans le sang circulant ou pendant sa conservation dans du sang humain à 37 °C, pendant plus de 2 heures. Avantageusement, en éloignant le groupement A de la structure B et de par son caractère préférentiellement hydrophile, l' espaceur permet ou facilite le clivage de la structure B à proximité ou au niveau des cellules cibles et ainsi permet ou facilite la libération de I ou la libération de I avec un reste de B. L' espaceur peut présenter une taille en longueur pouvant être l'équivalent de l'ordre de 1 à 100 acides aminés. Selon un autre aspect de la présente invention, la taille de l' espaceur peut varier en fonction du poids moléculaire du groupement A. Selon cet aspect, la taille de
1' espaceur est d'autant plus importante que le poids moléculaire de A est important. L' espaceur selon la présente invention est constitué ou comprend au moins un groupement choisi parmi : les séquences d'acides aminés ; les peptidomimétiques ; les pseudopeptides ; les peptoïdes ; les chaînes alkyles, aryles ou arylalkyles substituées ; les polyalkylglycols ; les polysaccharides ; les polyols ; les polycarboxylates ; les poly (hydro) esters . L' espaceur peut aussi être constitué d'une combinaison d'au moins deux de ces groupements. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l' espaceur est constitué ou comprend de 1 à 100, de préférence de 1 à 20 et tout préférentiellement de 2 à 10, acides aminés identiques ou différents, choisi (s) dans le groupe comprenant les acides aminés naturels en conformation D, les acides aminés non codés génétiquement ou acides aminés synthétiques et non clivables par une enzyme présente dans l'appareil circulatoire, tel les acides aminés bêta ou gamma ou similaires. Par « acides aminés naturels en conformation D » on entend les acides aminés qui sont normalement codés par le code génétique mais qui, au lieu d'être naturellement en conformation L, sont synthétisés en conformation D. D'une manière générale, les acides aminés non codés génétiquement peuvent être préparés par voie de synthèse ou être dérivés d'une source naturelle. On préfère, parmi les acides aminés naturels en conformation D, les acides aminés hydrophiles choisis parmi : la D-glutamine, la D-asparagine, le D-acide aspartique, le D-acide glutamique, la D-lysine, la D- arginine, la D-histidine et plus particulièrement la D- sérine et la D-thréonine. Selon un mode préférentiel de la présente invention, l' espaceur est constitué ou comprend une séquence d'acides aminés identiques choisie parmi : (D-sérine)x ou (D-thréonine) x, où x est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 2 et 10, et tout préférentiellement entre 2 et 6. Plus particulièrement, l' espaceur est : (D-sérine) - (D-sérine) - (D-sérine) - (D-sérine) , noté indifféremment DSéryl-DSéryl-DSéryl-DSéryl, ou (D-thréonine) - (D-thréonine) - (D-thréonine) - (D- thréonine), noté indifféremment DThréonyl-DThréonyl- DThréonyl-DThréonyl . Les acides aminés sont notés dans la présente invention soit en code à trois lettres, soit en code à une lettre, bien connus du l'homme de l'art. Le groupement A est un groupement qui augmente in vi vo le temps de demi-vie de B-I dans l'appareil circulatoire. Ce but est notamment atteint lorsque A réduit l'élimination rénale de la substance d'intérêt I ou du composé B-I ; cette élimination étant basée sur l' ultrafiltration par les reins des composés en fonction de la taille. Ainsi, plus le composé est grand plus son élimination est lente ; l'élimination rénale étant inefficace pour les composés ayant une masse moléculaire d'au moins 50 000 Dalton. Ce but peut aussi être atteint en diminuant la dégradation par le métabolisme hépatique des composés selon l'invention. En d'autres termes, augmenter le temps de demi-vie, c'est augmenter le temps de résidence moyen des composés dans le sang ou diminuer la clairance sanguine ou plasmatique. On entend par « appareil circulatoire » les fluides corporels, plus particulièrement le sang, et préférentiellement l'appareil circulatoire d'un mammifère. De préférence, le groupement A est hydrophile ou amphipatique . On préfère les groupements A qui sont stables dans l'appareil circulatoire (c'est-à-dire lorsque moins de 20%, de préférence moins de 2%, du composé de formule (A) p- (E- B)n-(I)m est dégradé ou clivé dans le sang circulant (en particulier par des enzymes) , pendant sa conservation dans du sang humain à 37°C pendant plus de 2 heures), non toxiques pour les cellules saines, non-immunogènes, non- coagulants, ou masquant (c'est-à-dire empêchant la substance d'intérêt (I) d'agir à la surface d'une cellule tant que celle-ci n'a pas été libérée de la prodrogue) . Avantageusement, le groupement A peut en outre présenter l'une ou plusieurs des propriétés suivantes : prévenir le clivage non spécifique et/ou la dégradation du groupe de liaison E-B ; inhiber les effets biologiques de la substance d'intérêt tant que la substance d'intérêt n'a pas été libérée de la prodrogue ; accroître la stabilité du composé dans l'appareil circulatoire ; des propriétés de solubilisation (ou augmenter la solubilisation) dans l'eau, le sang et/ou le sérum du composé de formule (A)p-(E-B)n- (I)m ; des propriétés de ciblage (ou favoriser le ciblage) du composé de formule (A) p- (E-B) n- (I) m vers les cellules cibles . Par « propriétés de ciblage du composé de formule (A)p- (E-B) n- (I)m vers les cellules cibles » on entend que le groupement A permet au composé de formule (A) p- (E-B) n- (I) m de s'accumuler à proximité ou au niveau des cellules cibles. Ce groupement A sera dit alors « biospécifique », c'est-à-dire capable de développer des interactions biologiques spécifiques et par conséquent d'être reconnu par des entités biologiques du système vivant. En particulier, il peut être greffé sur la surface du groupement A des séquences peptidiques tels des anticorps, antigènes ou des motifs d'acides aminés tels que arginine-glycine-acide aspartique (RGD) permettant d'augmenter sélectivement l'adhésion du composé selon l'invention à la surface de certains types cellulaires. Le groupement A peut aussi consister en un copolymère biospécifique par f onctionnalisation de chaînes macromoléculaires pré-existantes par des groupements chimiques appropriés dans le but d'être reconnus ou encore par copolymérisation de monomères fonctionnalisés. En particulier, le groupement A est choisi parmi : les polypeptides (tels que le polyglutamate, le polyaspatate) , les immunoglobulines, l'albumine, les polysaccharides, les polymères ou copolymeres . Les polymères peuvent comprendre la polyvinylpyrrolidone , le copolymère pyrane, le polyhydroxypropyl-méthacrylamide-phénol, le polyhydroxy- éthyl-aspanamide-phénol, le poly (oxyde d'éthylène)- polylysine substitué par des résidus palmitoyle, le pol (acide lactique) , la poly (epsilon-caprolactone) , le poly (acide hydroxybutyrique) , les polyorthoesters , les polyacétals, les polydihydropyranes, les polycyanoacrylates et les copolymeres d'hydrogel séquences réticulés ou amphipatiques . De préférence, le groupement A est choisi parmi : un polyalkylene glycol, polyalkylene oxide, polyalkylene imine, des copolymeres du chlorure de vinyle . A titre d'exemple, lorsque le groupement A est un copolymère du chlorure de vinyle, la présence de groupements sulfonate, ou sulfonate et carboxylate est nécessaire pour que le polymère ne développe pas une activité coagulante. De préférence encore, le groupement A est choisi parmi un polyéthylène oxide, un polyéthylène imine, le styrène sulfonate de sodium (NaSS) , le maléate de sodium et de butyle (MMBE) , le méthacrylate d' hydroxypropyle ou N- (2- hydroxypropyl) méthacrylamide (HPMA) , le méthacrylate de méthyle (MMA) , le poly- [N- (2-hydroxyéthyl) -L-glutamine] (PHEG) , le poly- [N- (hydroxyéthyl) -DL-aspartamide] (PHEA) . En particulier et de manière préférentielle, le groupement A est un polyéthylène glycol (PEG) . La taille du PEG peut être comprise en 200 et 50000 Da, de préférence entre 350 et 20000 Da et de préférence encore entre 1000 et 10000 Da. La présence de ces PEG permet une amélioration des propriétés pharmacocinétiques (Duncan et al . , 1994), pharmacodynamiques et donc une réduction de l'élimination rénale des composés selon l'invention. Par ailleurs, un autre avantage connu de l'art antérieur, est que le PEG permet une accumulation préférentielle dans les tumeurs . En effet, les PEGs d'un poids moléculaire de 104 Da ou plus montrent une accumulation plus importante dans les tumeurs que dans les tissus normaux (Greenwald et al . , 2003, Seymour et al , 1995) . Le groupement A peut en outre être un agent à activité thérapeutique ou agent à activité diagnostique. Avantageusement, un groupement A ayant des propriétés d'agent à activité diagnostique pourra posséder des éléments à propriétés paramagnétiques, c'est-à-dire posséder dans ses couches électroniques des électrons célibataires comme le gadolinum, le manganèse et le fer qui renforcent notamment le contraste en imagerie par résonance magnétique (IRM) . A titre d'exemple, on peut citer le sulfonate de polystyrène sur lequel est fixé du fer. L'invention a également pour objet des composés mettant en œuvre une ou plusieurs substances de ciblage capables de vectoriser le composé de formule (A)p-(E-B)n- (I)m vers les cellules cibles. A titre d'exemple, les substances de ciblage peuvent être des anticorps, des antigènes, des liposomes. De préférence, la ou les substance (s) de ciblage est (sont) couplée (s) au composé de formule (A) p- (E-B) n- (I)m au niveau d'un ou plusieurs groupement (s) A.
Selon la présente invention, la structure B est clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement dans l'environnement des cellules cibles. On entend plus particulièrement par « cellules cibles » les cellules qui sont impliquées dans une pathologie ou qui présentent un intérêt thérapeutique ou de diagnostic. Ces cellules cibles sont préférentiellement choisies dans le groupe comprenant les cellules tumorales primaires ou secondaires (les métastases) , les cellules stromales des tumeurs primaires ou secondaires, les cellules endothéliales néoangiogéniques des tumeurs ou des métastases tumorales, les macrophages, les monocytes, lymphocytes ou polynucléaires infiltrants les tumeurs et les métastases tumorales. On entend plus particulièrement par
« clivable sélectivement», un clivage qui est dépendant de la séquence à cliver. En d'autres termes, la séquence à cliver est préférentiellement reconnue par une enzyme présente dans l'environnement des cellules cibles et elle est peu ou pas dégradée dans l'appareil circulatoire ou à proximité des cellules non-cibles. L'expression « dans l'environnement des cellules cibles » signifie que l'enzyme est présente soit uniquement soit préférentiellement à proximité ou au niveau des cellules cibles . Il est à remarquer que même si le clivage ne se réalise pas uniquement à proximité ou au niveau des cellules cibles, le fait que le clivage soit réalisé préférentiellement (ou en grande partie ou dans la majorité des cas) à proximité ou au niveau des cellules cibles, rend ce clivage sélectif. En d'autres termes encore, le clivage est dit sélectif lorsque l'enzyme se trouve en plus grande concentration à proximité ou au niveau des cellules cibles par rapport au reste de 1' organisme . On entend plus particulièrement par « enzyme », une hydrolase . L'enzyme peut être choisie dans le groupe comprenant les peptidases, les endopeptidases, les enzymes lysosomiales, les lipases, les glycosidases . Selon un mode préféré de la présente invention, l'enzyme est une peptidase spécifique des cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques, macrophages ou monocytes . On entend par « enzyme spécifique » une enzyme membranaire ou sécrétée uniquement ou préférentiellement par les cellules cibles dans le milieu extracellulaire de ces cellules cibles. A titre d'exemple, lorsque l'enzyme est spécifique des cellules tumorales, celle-ci peut être choisie dans le groupe comprenant la Néprilysine (CD10), la Thi et oligopeptidase (TOP) , le Prostate Spécifie Antigen (PSA) , la plasmine, la légumaïne, les collagènases, l'urokinase, les cathepsines, les métallopeptidases de matrice. Le choix de la structure B est bien entendu fonction de l'enzyme présente dans l'environnement des cellules cibles. Ainsi, si l'enzyme est une peptidase, la structure B comprendra une séquence d'acides aminés (ou oligopeptide) clivable par cette peptidase ; si l'enzyme est une glycosidase (par exemple une saccharase) , alors la structure B comprendra un oligosaccharide clivable par cette glycosidase ; si l'enzyme est une lipase, alors la structure B comprendra une chaîne lipidique clivable par cette lipase, et ainsi de suite. L' invention vise à titre préféré les structures B comprenant ou constituées d'un oligopeptide clivable sélectivement par une enzyme présente dans l'environnement des cellules tumorales. Ces oligopeptides comprennent de préférence entre 2 et 10 acides aminés, et de préférence encore de 3 à 7. A titre d'exemple, l'invention vise les séquences suivantes (préférentiellement en conformation L) : Ala-Phe-Lys (SEQ ID n°l), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID n°2) ou bêta-Ala-Leu-Ala-Leu, Ala-Leu-Lys-Leu-Leu (SEQ ID n°3), Ala-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID n°4) , His-Ser-Ser-Lys- Leu-Gln-Leu (SEQ ID n°5), Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (SEQ ID n°6), Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (SEQ ID n°7) . Cependant, l'homme de l'art connaît d'autres séquences d'acides aminés clivables sélectivement par une enzyme spécifique de cellules tumorales, telles celles décrites dans les demandes de brevet PCT numéro de publication WO 96/05863, WO 00/33888, WO 01/68145, WO 01/91798, WO 01/95943, WO 01/95945, WO 02/00263, WO 02/100353, WO 02/07770 ou WO 99/28345.
Les enzymes selon l'invention sont susceptibles de cliver sélectivement la structure B de manière à permettre la libération de I ou la libération de I avec un reste de B. L'expression « libération de I avec un reste de B » est expliquée par l'exemple suivant. Si la structure B est une séquence d'acides aminés dont la séquence est Ala-Leu-Ala- Leu, la substance d'intérêt la doxorubicine (B-I étant Ala- Leu-Ala-Leu-Dox) et l'enzyme la CD10, alors cette enzyme clivera la séquence d'acides aminés entre Ala-Leu-Ala et
Leu, libérant ainsi un produit Leu-doxorubicine . Ce produit est donc défini comme « I avec un reste de B ». On entend par « réactivation extrasanguine » ou
« réactivation dans le compartiment extrasanguin », le clivage du lien peptidique B de la prodrogue de structure (A) p- (E-B) n- (I )m par des endopeptidases spécifiques présentes dans n'importe quel organe ou tissus (sains ou tumoraux par exemple) autre que le sang et préférentiellement au niveau des cellules cibles. Le clivage de la structure B (par exemple un peptide) entraînant la libération d'une forme active de la substance d'intérêt I (par exemple un agent thérapeutique) . On entend par « une substance d'intérêt active sur des cellules cibles » (I), une substance dont le site d'action se situe ou dont son effet s'exercera à la surface ou dans des cellules cibles. A titre d'exemple, une telle substance d'intérêt peut être choisie parmi le groupe comprenant un agent chimique, un polypeptide, une protéine, un acide nucléique (ADN, ARN sens ou antisens, simple ou double brin, ADN complémentaire, ARN interférant, et analogues), un antibiotique, un virus ou un marqueur, éventuellement couplé à une substance vectrice (par exemple un anticorps) . Ladite substance d'intérêt (I) est préférentiellement un agent à activité thérapeutique et plus préférentiellement un agent à activité thérapeutique anti-tumorale, anti- angiogénique ou anti-inflammatoire. L'agent peut avoir une cible (par exemple un récepteur) ou site d'action extracellulaire ou intracellulaire. Il peut aussi comprendre une séquence peptidique pénétrante telle qu'une séquence décrite dans la demande de brevet PCT numéro WO 01/64738. A titre d'exemple, I est choisie dans le groupe des agents à activité thérapeutique anti-tumorale, comprenant : les alcaloïdes vinca tels que la vincristine, la vinblastine, la vindésine, la vinorelbine ; les taxanes ou taxoïdes tels que le paclitaxel, le docétaxel, le 10-déacetyltaxol, le 1-epi- taxol, la baccatine III, le xylosyltaxol ; les agents alkylants (ou alcoylants) tels que l' ifosfamide, le melphalan, le chloraminophène, la procarbazine , le chlorambucil , la thiophosphoramide, le busulfan, la dacarbazine (DTIC) , les mitomycines dont la mitomycine C, les nitroso-urées et leurs dérivés (par exemple estramustine, BCNU, CCNU, fotémustine) ; les dérivés du platine tels que le cisplatine et les analogues (par exemple carboplatine, oxaliplatine) ; les antimétabolites tels que le méthotrexate, l' éminoptérine, le 5-fluorouracile, la 6- mercaptopurine, le raltitrexed, la cytosine arabinoside (ou cytarabine) , l'adénosine arabinoside, la gemcitabine, la cladribine, la pentostatine, la fludarabine phosphate, les hydroxyurées ; les inhibiteurs de topoisomérases I ou II tels que les dérivés de la camptothécine (par exemple l'irinotécan et le topotécan ou hydrochlorure de 9- dimé thylaminomé thyle-hydroxy- camptothécine ) , les epipodophyllotoxines (par exemple l'étoposide, le téniposide) , l'amsacrine ; la mitoxanthrone ; la L- canavanine ; les antibiotiques tels que les anthracyclines et par exemple l' adriamycine ou doxorubicine, la THP-adriamycine, la daunorubicine, l' idarubicine, la rubidazone, la pirarubicine , la zorubicine et l' aclarubicine, les analogues d' anthracyclines et par exemple l' épiadriamycine (4' épi-adriamycine ou épirubicine) et la mitoxantrone, les bléomycines, les actinomycines dont l' actinomycine D, la streptozotocine, la calichéamycine, les duocarmycines, la combretastatine ; la L-asparaginase ; les hormones ; les inhibiteurs purs de l'aromatase ; les androgènes ; les analogues-antagonistes de la LH-RH ; les cytokines tels que l'interféron alpha (IFN-alpha), l'interféron gamma ( IFN-gamma) , l' interleukine 1 (IL-1), l'IL-2, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-10, l'IL-12, l'IL-15, le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-alpha), les antagonistes de l'IGF-1 (insuline like growth factor) ; les inhibiteurs du protéasome ; les inhibiteurs de la farnesyl- transférase (FTI) ; les épothilones ; les maytansinoïdes ; le discodermolide ; la fostrécéine ; les peptides BH3 ; les peptides p53 ; les caspases ; le granzyme B ; les ribozymes ; les anticorps monoclonaux tels que le rituximab, le tastuzumab ; les inhibiteurs de tyrosine kinases tels que le STI 571 (imatinib mesylate) ; les andostatines ; les protéines, peptides, cytokines anti-inflammatoires.
Par « marqueurs », on entend des enzymes, des anticorps, des molécules chimiques fluorescentes ou phosphorescentes, des molécules utilisables en scintigraphie . On peut citer à titre d'exemple, la coumarine, la 7-amido-trifluoraméthyle coumarine, la paranitroanilide, la 8-naphtylamide et la 4-méthoxy naphtylamide, la fluoroscéine, la biotine, la rhodamine, la tétraméthylrhodamine, la GFP (green fluorescent protein) , les agents utilisés en scintigraphie comme des isotopes radioactifs, et les dérivés de ces composés.
L'invention vise aussi des sels d'addition basique ou acide pharmaceutiquement acceptables, hydrates, solvates, précurseurs, métabolites ou stéréoisomères, desdits composés selon la présente invention. L'expression "sels pharmaceutiquement acceptables" se réfère aux sels non toxiques des composés selon l'invention qui peuvent être généralement préparés en faisant réagir une base libre du composé selon l'invention avec un acide organique ou inorganique convenable. Ces sels conservent l'efficacité biologique et les propriétés des bases libres. Comme exemples représentatifs de tels sels, on peut citer les sels hydrosolubles et hydroinsolubles, tels que les acétates, ansonates ( 4 , 4 -diaminos t ilbène s -2 , 2 ' - disulf onates) , benzènesulfonates, benzonates, bicarbonates, bisulfates, bitartrates, borates, bromures, buryrates, édétates de calcium, camsylates, carbonates, chlorures, citrates, clavulariates , dichlorhydrates , édétates, édisylates, estolates, ésylates, fumarates, gluceptates, gluconates, glutamates, gl co 1 y lar s any 1 a t e s , hexaf luorophosphates , hexylrésorcinates , hydrabamines , bromhydrates, chlorhydrates, hydroxynaphtoates, iodures, isothionates, lactates, lactobionates, laurates, malates, maléates, mandélates, mésylates, méthylbromures , méthylnitrates , méthylsulf ates , mucates, napsylates, nitrates, 3-hydroxy-2-naphtoates , oléates, oxalates, palmitates, pamoates (1 , l-méthylène-bis-2-hydroxy-3- naphtoates, emboates), pantothénates , phosphates/ diphosphates, picrates, les polyglucuronates (tels que les polygalacturonates et polyglucuronates) , propionates, p- toluènesulf onates, salicylates, stéarates, subacétates, succinates, sulfates, sulfosalicylates, suramates, tannâtes, tartrates, teoclates, tosylates, triethiodides, valerates et les sels de N-méthylglucamine ammonium.
L'invention vise aussi une composition comprenant, comme principe actif au moins un composé selon la présente invention. Elle a aussi pour objet l'utilisation de telles compositions pour la formulation et la préparation de produits biologiques, pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, de diagnostique ou de traçage. L'invention vise plus particulièrement les formulations pharmaceutiques comprenant au moins un composé selon la présente invention, pouvant être en association avec un véhicule, vecteur, diluant ou excipient pharmaceutiquement acceptables .
Un sujet peut être traité avec une quantité pharmaceutiquement efficace d'un composé selon l'invention. L'expression "quantité pharmaceutiquement efficace" signifie une quantité capable d'induire la réponse biologique ou médicale d'un tissu, système, animal ou humain telle qu'attendue par le chercheur ou le médecin traitant. Les compositions définies ci-dessus peuvent également comprendre ou êtres associées à au moins un autre principe actif médicament ou au moins un adjuvant bien connu de l'homme de l'art (vitamine C, agents antioxydants, etc.) pour êtres utilisés en synergie avec le composé selon l'invention pour améliorer et prolonger le traitement. Les compositions sont particulièrement utiles en ce sens qu'elles ont une très faible toxicité, ou ne sont pas toxiques . Les formulations pharmaceutiques selon l'invention sont susceptibles d'être utilisées in vivo à des fins préventives ou curatives, par exemple des infections virales, des métastases, de l'apoptose cellulaire (maladies dégénératives , ischémie tissulaire ... ) , des maladies infectieuses (virales, bactériennes, par mycoses,... ), du cancer et de la néo-angiogénèse pathologique. L'administration des composés selon l'invention peut se faire par l'un quelconque des modes d'administration accepté pour les agents thérapeutiques. Ces procédés comprennent l'administration systémique par exemple orale, nasale, parentérale, ou l'administration topique, par exemple transdermique, ou encore l'administration centrale, par exemple par voie chirurgicale intracrânienne, ou encore l'administration intraoculaire . L'administration orale peut se faire au moyen de comprimés, gélules, capsules molles (y compris les formulations à libération différée ou prolongée) , pilules, poudres, granules, élixirs, teintures, suspensions, sirops et émulsions. Cette forme de présentation est plus particulièrement adaptée au passage de la barrière intestinale . L'administration parentérale se fait généralement par injection sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse ou par perfusion. Les compositions injectables peuvent être préparées sous des formes classiques, soit en suspension ou solution liquide soit sous forme solide convenant à une dissolution extemporanée dans un liquide. Une possibilité pour l'administration parentérale utilise l'implantation d'un système à libération lente ou libération prolongée qui assure le maintien d'un niveau constant de dose, par exemple, selon US-A-3 710 795. Pour l'administration intranasale, on peut utiliser des véhicules intranasaux convenables. Pour l'administration transdermique, on peut utiliser des timbres cutanés transdermiques bien connus de l'homme de l'art. Un système à libération transdermique permet une administration continue. D'autres préparations topiques préférées comprennent les crèmes, les onguents, les lotions, les sprays aérosols et les gels. En fonction du mode prévu d'administration, les composés peuvent être sous forme solide, semi-solide ou liquide . Pour les compositions solides, telles que comprimés, pilules, poudres ou granulés à l'état libre ou inclus dans des gélules, le principe actif peut être combiné avec des excipients tels que : a) des diluants, par exemple le lactose, le dextrose, le sucrose, le mannitol, le sorbitol, la cellulose et/ou la glycine ; b) des lubrifiants, par exemple la silice, le talc, l'acide stéarique, son sel de magnésium ou de calcium et/ou le polyéthylèneglycol ; c) des liants, par exemple le silicate de magnésium et d'aluminium, la pâte d'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique et/ou la poly-vinylpyrrolidone ; le cas échéant, d) des désintégrants, par exemple l'amidon, l'agar, l'acide alginique ou son sel de sodium, ou des mélanges effervescents ; et/ou e) des absorbants, colorants, aromatisants et édulcorants. Pour les compositions semi-solides, telles que suppositoires, l'excipient peut, par exemple, être une émulsion ou suspension grasse, ou à base de polyalkylèneglycol, tel que de polypropylène-glycol . Les compositions liquides, en particulier injectables ou à inclure dans une capsule molle, peuvent être préparées par exemple par dissolution, dispersion, etc. du composé selon l'invention dans un solvant pharmaceutiquement pur tel que, par exemple, l'eau, une solution saline de chlorure de sodium (NaCl) , le sérum physiologique, le dextrose aqueux, le glycérol, l'éthanol, une huile et analogues. Les composés selon l'invention peuvent également être administrés sous la forme de systèmes de libération du type liposomes ou lipoplexes, tels que sous la forme de petites vésicules unilamellaires , de grandes vésicules unilamellaires et de vésicules multilamellaires . Les liposomes peuvent être formés à partir d'une diversité de phospholipides, contenant du cholestérol, de la stéarylamine ou des phosphatidylcholines . Dans une forme d'exécution, un film de composants liquides peut être hydraté avec une solution aqueuse du médicament pour former une couche lipidique encapsulant le médicament, comme décrit dans US-A- 5 262 564. Les compositions selon l'invention peuvent être stérilisées et/ou contenir des adjuvants et substances auxiliaires non toxiques tels que des agents de conservation, de stabilisation, de mouillage ou d' émulsification, des agents favorisant la dissolution, des sels pour régler la pression osmotique et/ou des tampons. En outre, elles peuvent également contenir d'autres substances présentant un intérêt thérapeutique. Les compositions sont préparées, respectivement, par des procédés classiques de mélange, granulation ou enrobage.
La posologie pour l'administration des composés selon l'invention est choisie selon une diversité de facteurs y compris le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du sujet ; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; l'état des fonctions rénale et hépatique du sujet et la nature du composé particulier, ou sel, employé. Un médecin ou vétérinaire normalement expérimenté déterminera facilement, et prescrira, la quantité efficace du composé voulue pour prévenir, contrarier ou stopper le progrès de l'état médical à traiter. L'une quelconque des compositions pharmaceutiques ci-dessus peut contenir de 0,1 à 99%, de préférence 1 à 70% de principe actif. A titre d'exemples, les posologies orales des composés selon l'invention lorsqu'ils sont utilisés pour les effets indiqués, seront' comprises entre environ 0,05 et 5000 mg/jour, préférentiellement entre 5 et 1000 mg/jour par voie orale et, de préférence fournies sous la forme de comprimés contenant 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 et 1000,0 mg de principe actif. Par voie parentérale, les niveaux efficaces des composés selon l'invention seront compris dans la gamme allant de 0,002 mg à 500 mg par kg de poids corporel et par jour. Les composés selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de doses quotidiennes uniques, ou la posologie quotidienne totale peut être administrée en deux, trois ou quatre doses par jour.
Dans une application particulière, la présente invention est relative à un agent de diagnostic, pour mise en oeuvre in vi tro, constitué par ou renfermant au moins un composé selon la présente invention. Le composé selon l'invention possédera alors comme substance d'intérêt (I) un marqueur. Un tel agent de diagnostic peut également être utilisé in vivo .
La présente invention a donc aussi pour objet un kit de diagnostic qui comprend ledit agent de diagnostic. Plus particulièrement, le kit de diagnostic comprend, dans un ou plusieurs récipients, une quantité prédéterminée d'une composition selon l'invention.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe, dans lesquels : La Figure 1 représente schématiquement les deux méthodes de synthèse de prodrogues PEGylees de la Doxorubicine . La Figure 2 montre les tests de cytotoxicité de la Doxorubicine, de la bêta-ALAL-Dox, du PEG2ooo~bêta-ALAL-Dox, du PEG20oo-DSer-bêta-ALAL-Dox et du PEG200o- (oSer) 4-bêta-ALAL- Dox sur les cellules MCF-7/6. La survie des cellules a été estimée par un test de viabilité cellulaire (WST-1, Roche Molecular Diagnostic) . Les graphiques 2 A, B, C, D et E représentent la survie des cellules de type MCF 7/6 (en % du contrôle) en fonction respectivement du logarithme de la concentration de doxorubicine (A) , bêta-ALAL-Dox (B) , PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox (C) , PEG20oo-DSer-bêta-ALAL-Dox (D) et PEG20oo- (DSer)4-bêta-ALAL-Dox (E) . La Figure 3 représente graphiquement l'évolution de la moyenne des poids corporels de souris xenogreffees portant des tumeurs LS-174-T. Les résultats sont exprimés en pourcentage des poids mesurés au début du traitement. (•) NaCl, (B) Doxorubicine 6,69 μmol/kg, (A) Doxorubicine 8,6 μmol/kg, (o) Su-bêta-ALAL-Dox 45 μmol/kg, (+) Su-bêta- ALAL-Dox 50 μmol/kg, (x) PEG20o0- (oSer) 4-ALAL-Dox 1x45 ; 3 x 25 μmol/kg, (*) PEG20oo- (oSer) 4-ALAL-Dox 1 x 50 ; 3 x 35 μmol/kg. La Figure 4 représente graphiquement l'évolution de la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV) en pourcentage à partir du début du traitement en jour, des groupes de souris athymiques portant des tumeurs de carcinome de colon humain LS-174-T traités par rapport au contrôle (NaCl) . (•) NaCl, (H) Doxorubicine 6,69 μmol/kg, (A) Doxorubicine 8,6 μmol/kg, (o) Su-bêta-ALAL-Dox 45 μmol/kg, ( + ) Su-bêta-ALAL-Dox 50 μmol/kg, (x) PEG20oo~ (DSer)4-ALAL-Dox 1x45 ; 3 x 25 μmol/kg, (*) PEG20oo~ (oSer) 4- ALAL-Dox 1 x 50 / 3 x 35 μmol/kg. La Figure 5 représente l'inhibition de la première et de la seconde phase de croissance de tumeurs LS-174T par la Doxorubicine (Dox) , PEG20OQ- (DSer) 4-ALAL-Dox et Su-bêta- ALAL-Dox aux doses respectives de 6,69 μmol/kg, 1 x 50 + 3 x 35 μmol/kg, et 50 μmol/kg, en comparaison avec la solution contrôle de NaCl 0,9% ( /v) . Toutes les souris ont reçu 4 injections i.v. aux jours 0, 7, 14, et 21. Les rapports T/C minimals des médianes (T/C min.) des volumes tumoraux relatifs (RTV) sont donnés comme paramètre d'efficacité maximale. Les différences des temps pour un doublement des médianes des RTV des groupes traités en comparaison au groupe contrôle (T - C) ainsi que les SGD (retards de croissance spécifiques) sont calculés à partir de la régression linéaire de la phase de croissance pour déterminer le degré d'activité selon les critères établis par l'EORTC. Le rapport des pentes des régressions linéaire de l'évolution des médianes des RTV des groupes traités par rapport au groupe contrôle (Pente T/C) , exprimé en pourcent, sont donnés à titre de paramètre de comparaison de vitesse de croissance. La figure 6 représente un test de stabilité in vitro de la bêta-ALAL-Dox (A) , du PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox (B) et du PEG2ooo~ (DSer) 4-bêta-ALAL-Dox (C) dans le milieu sérique . Les résultats représentent en fonction du temps, les concentrations des conjugués déterminées par HPLC. La figure 7 représente un test de stabilité in vitro des composés ALAL-Dox (A) , bêta-ALAL-Dox (B) , PEG2ooo-bêta- ALAL-Dox (C) et PEG20oo- (DSer) 4-bêta-ALAL-Dox (D) dans du sang total humain. Les résultats représentent l'évolution en fonction du temps des concentrations des conjugués et des éventuels métabolites formés, déterminées par HPLC. La Figure 8 représente graphiquement l'évolution de la moyenne des poids corporeles des souris athymiques portant des tumeurs de carcinome de colon humain HCT-116. Les résultats sont exprimés en pourcentage des poids mesurés au début du traitement. (•) NaCl, (+) Su-bêta-ALAL-Dox 30 μmol/kg; (A) PEG2000- (oSer) 4-ALAL-Dox 53 μmol/kg; (*) PEG2000- (DSer)4-ALAL-Dox 110 μmol/kg. La Figure 9 représente l'inhibition de la croissance tumorale HCT-116 par l'évolution du rapport entre la médiane du RTV des groupes traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage (T/C (%)). Traitements : (•) NaCl, (+) Su-bêta-ALAL-Dox 30 μmol/kg; (A) PEG2ooo~ (oSer) 4-ALAL-Dox 53 μmol/kg; (*) PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox 110 μmol/kg. La Figure 10 représente graphiquement l'évolution de la survie des souris xenogreffees portant des tumeurs HCT-116 (en %) .Traitements : NaCl (-•-), PEG20oo- (oSer) 4-ALAL-Dox 200 μmol/kg ( A ), 300 μmol/kg ( —A—), 400 μmol/kg (-A-)
PEG2000-ALAL-D0X 200 μmol/kg ( u ), 300 μmol/kg ( --u—), 400 μmol/kg ( m ) . La Figure 11 représente l'inhibition de la croissance tumorale HCT-116 par l'évolution du rapport entre la médiane du RTV des groupes traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage (T/C (%) ) . NaCl (-•-), PEG2000- (DSer) 4-ALAL-D0X 200 μmol/kg ( A ), PEGooo-ALAL-Dox 200 μmol/kg ( u ) . La Figure 12 représente graphiquement l'évolution de la survie des souris xenogreffees portant des tumeurs de mélanome B16-BL6 (%) . Traitements : Contrôle PBS (•) ; (PEG50oo-ALAL)n-TNFα (m) ; (PEG5000- (DSer) 4-ALAL) n~TNFα (A) ; (PEGsooo)n-TNFα ( ) . La Figure 13 représente graphiquement l'évolution de la moyenne des masses corporelles des souris xenogreffees portant des tumeurs de mélanome B16-BL6. Les résultats sont exprimés en pourcentage des masses mesurées au début du traitement. Contrôle PBS (•); (PEG50o0-ALAL) n-TNF (B) ; (PEG5ooo-(DSer)4-ALAL)n-TNFα (A); (PEG5000) n-TNFα (Φ) . La Figure 14 représente l'inhibition de la croissance des tumeurs B16-BL6 par l'évolution du rapport entre la médiane du RTV des groupes traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage (T/C (%)). Contrôle PBS
(•); (PEG5ooo-ALAL)n-TNFcc (m ) ; ( PEG5000- (DSer) 4-ALAL) n-TNFα (A); (PEG5ooo)π-TNF ( ) . Exemple 1 : Matériel & méthodes 1.1) Les lignées cellulaires Cellules MCF 7/6 : un variant de la lignée MCF-7 (Michigan Cancer Foundation Engel et al . , 1978) qui a été obtenue en 1970 à partir d'une effusion pleurale chez une patiente atteinte d'un adénocarcinome du sein (Soûle et al , 1973) . Ces cellules proviennent du laboratoire du Professeur Mareel à Gand (Laboratoire de Cancérologie Expérimentale, Hôpital universitaire de Gand, Belgique) . Cellules LNCaP : isolées en 1977 par Horosze ic et a l . , à partir d'une biopsie au niveau de nodules lymphatiques supraclaviculaires d'un patient atteint d'un carcinome métastatique de la prostate. Cette lignée provient de l'ATCC (American Type Culture Collection. USA) . Lignée cellulaire LS-1 74 T : variant de la lignée LS180, provenant d'une femme atteinte d'un adénocarcinome du colon. Ces cellules forment très rapidement des tumeurs après une inoculation dans des souris athymiques. Ces cellules proviennent de l'ECACC (European Collection of Cells Cultures. UK) . Cellules HCT-11 6 : lignée cellulaire établie à partir d'une culture primaire de cellules de carcinome du colon humain. Ces cellules forment des tumeurs après injection sous-cutanée sur des souris athymiques. Ces cellules proviennent de l'ATCC (American Type Culture Collection. USA) . 1.2) Les agents anticancéreux pour les études chimiothérapeutiques La Doxorubicine est fournie par Meiji Seika Kaisha Ltd. (Tokyo, Japon), la succinyl-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu- Doxorubicine (Su-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) (Fernandez e t a l . , 2001), le PEG20oo-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox et le PEG2ooo- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ont été synthétisés. 1.3) Les animaux Des souris femelles NMRI ou SWISS, n u /n u (de 5 semaines à la livraison par les élevages JANVIER) ont été utilisées . Toutes les manipulations des animaux se font conformément aux recommandations de l'UKCCCR (United Kingdom Co-ordinating Committee on Cancer Research ; Workman et al . , 1998) et de la FELASA (Fédéra tion of European Labora tory Animal Sci ence Associa ti ons ; Nicklas et al . , 2002 ; Rehbinder et al . , 2000 ; Rehbinder et al . , 1996) sur l'utilisation et le bien-être des animaux dans les études de chimiothérapie expérimentales . 2 ) Synthèse de dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine La synthèse de dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine a été réalisée en utilisant deux méthodes différentes "A" et "B" (Figure 1) . Les dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine synthétisés selon l'une ou l'autre des deux méthodes sont les suivants : - PEG2ooo- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (1) - PEG2000- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (2) - PEG2ooo_ (DSer) -bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (3) - PEG2ooo_bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (4) - PEG20oo_Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (5) Les composés 1, 3 et 4 ont été synthétisés selon la méthode « A ». Les composés 2 et 5 selon la méthode « B ». Remarque : les prodrogues Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine et bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine ont été décrites dans la demande de brevet WO 96/05863.
2.1) Méthode de synthèse « A » Le principe de cette méthode est la PEGylation en solution d'un composé NH2-peptide-Doxorubicine . Au produit
NH2-peptide-Doxorubicine (préalablement obtenu après trois étapes de synthèse, voir figure 1) dissout dans un mélange chloroforme /méthanol (4:1), sont ajoutés 1,5 équivalents molaires de mPEG2ooo~SPA (mPEG2ooo-succinimidyl propionate ester) (Nektar) dissout dans le mélange chloroforme/méthanol (4:1) et 5 μL de diisopropyléthylamine (DIPEA) . Après environ 48 à 72 heures, le produit final de la réaction est analysé par chromatographie HPLC (voir paragraphe 2.2 ci-dessous) . Les produits (3) et (4) sont extraits au dichlorométhane à pH 4 (utilisation de l'acide lactique).
Les produits s'accumulent dans la phase organique. Ils sont ensuite concentrés par évaporation sous vide avant d'être lyophilisés . 2.2) Méthode de synthèse « B » : synthèse peptidique sur support solide (SPPS) par la chimie Fmoc (Fluorenyl-L- methoxycarbonyl) Le principe de cette méthode est la synthèse de la séquence peptidique PEGylée sur support polymérique solide (résine de type Wang) et ensuite le couplage entre le
PEG2ooo""peptide-OH obtenu et la Doxorubicine. Le principe de la SPPS est d'accrocher successivement sur un support solide (résine de type Wang) les différents acides aminés du peptide attendu selon des procédures connues de l'homme de l'art (Merrifield, 1963 et 1965 ; Steward et Young, 1969) . Synthèse peptidique sur support solide. Les peptides synthétiques sont obtenus par synthèse peptidique sur support solide dans un réacteur de synthèse manuelle (AnaSpec) , par la chimie du groupe Fmoc, par exemple. Toutes les résines utilisées (AnaSpec ou Novabiochem) lors de la synthèse sur support solide sont des résines Wang possédant le premier acide aminé protégé préattaché avec une substitution initiale donnée par le fournisseur entre 0,4 et 0,7 mmol/g de résine. Les acides aminés Fmoc ont été fournis par AnaSpec ou Novabiocem, avec les groupement protecteurs sur la chaîne latérale comme suit : trityl (Asn, Cys, Gin, et His) , Acm (Cys) , Boc (Lys et Trp) , O-tert-Butyl (Asp et Glu) , tert-Butyl (Ser, Thr, Tyr) et Pbf (Arg) . Les différents polyéthylèneglycols de poids moléculaire désiré (PEG-SPA) sont obtenus sous forme d'un ester pré-activé hydroxysuccinimidyl (OSu) chez Nektar. La déprotection du groupe Fmoc est effectuée par traitement à la pipéridine dans la diméthylformamide (DMF) . L'agent de couplage utilisé lors de la synthèse est le HCTU (3-oxide de ÎH-Benzotriazolium 1- [bis (diméthylamino) méthylène] -5chloro- hexafluorophosphate (1-)) ou HBTU (2- (lH-benzotriazole-1- yl) -1 , -1 , -3 , -3-tétraméthyluroniumhexafluorophosphate) ou HATU (O- (7-Azabenzotriazol-l-yl) -N, -N, -N' , -N' - tétraméthyluroniumhexafluorophosphate) dans la DMF. Des cycles standards de couplage des acides aminés sont effectués comme suit : 3 x 30 secondes, lavages à la DMF ; 3 x 2 minutes puis 1 x 7 minutes, déprotection par la pipéridine diluée à 20% dans la DMF ; 5 x 20 secondes, lavages à la DMF ; 2 x 15 minutes de couplage avec l'acide aminé (2 eq.), l'agent de couplage (2 eq.) et DIPEA (4 eq.) suivi de 3 x 30 secondes de lavages à la DMF. L'abaissement de la substitution de la résine initiale commerciale est effectuée par l'ajout de 0,5 à 0,3 équivalents molaires du premier Fmoc-AA-OH à coupler selon la séquence voulue (substitution finale souhaitée de l'ordre de 0,1 à 0,22 mmol/g) suivi de 1 ' acétylation des groupes aminés restants (Virender et al . , 1981) . Le couplage de chaque acide aminé est vérifié par un test de Kaiser bien connu de l'homme de l'art (Kaiser et al . 1970). Après ajout de tous les acides aminés selon la séquence désirée, la PEGylation sur le support solide Wang est obtenue par couplage de 2 x 2 jours de la forme active ester PEG-SPA (Nektar) et DIPEA. La coupure chimique du lien covalent rattachant le peptide PEGylé du support solide Wang est obtenue avec un mélange constitué d'acide t rifluoroacétique ( TFA) : eau : triisopropylsilane (TIS) dans les proportions 95:2,5:2,5, ajouté sur la résine bien sèche dans le réacteur de synthèse manuelle et pour trois heures. Le peptide PEGylé est précipité à l'éther glacé, centrifugé, lavé à l'éther avant d'être lyophilisé. Analyse par chromatographie HPLC Le peptide acide est analysé par chromatographie HPLC avec une colonne (phase inverse) de type VYDAC (C8, 5 μm, 250 x 4,6 mm), avec un premier solvant (solvant A) constitué de 0,1 % d'acide Trifluoroacétique (TFA) dans de l'eau et un second solvant (solvant B) constitué de 0,1 % de TFA dans l' acétonitrile (ACN) , avec un gradient de 0 % à 70 % en 25 minutes pour le solvant B. 2.3) Exemples de synthèse : synthèses du PEG2OOQ- (DSer) -Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (2) et du PEG∑ooo-Ala- Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (5) Au PEG20oo-peptide-OH (PEG2ooo- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu-OH ou PEG2ooo~Ala-Leu-Ala-Leu-OH) obtenu par synthèse sur support solide sont ajoutés 1,2 équivalents molaires de Doxorubicine . HC1 dissoute dans la DMF et 3,2 équivalents molaires de DIPEA. Le mélange est protégé de la lumière et agité pendant 15 minutes à température ambiante avant l'ajout d'1,3 équivalents molaires d'HATU (agent de couplage, PE Biosystem) . La réaction est suivie par analyse par chromatographie HPLC (point 2.3. ci-dessus) pendant environ 3 heures. Lorsque la réaction est complète, le solvant est évaporé sous vide. Le produit résiduel est repris dans l'eau et extrait au dichloromethane. Le produit (2) s'accumule préférentiellement dans la phase organique tandis que le produit (5) est principalement récupéré dans la phase aqueuse. La phase organique contenant le produit (2) est concentrée par évaporation sous vide et le produit est précipité à l'éther à température ambiante. Le précipité obtenu est dissout dans l'eau avant d'être lyophilisé. La phase aqueuse contenant le produit 5 est récupérée, congelée dans un bain d'acétone et de carboglace et lyophilisée. Avant lyophilisation, les produits ont été analysés par HPLC (voir point 2.2 ci-dessus) .
3) Préparation des solutions de produits pour les cultures cellulaires Les produits utilisés pour les expériences de culture cellulaire in vi tro sont la Doxorubicine, la bêta-Ala-Leu-
Ala-Leu-Doxorubicine, le PEG2ooo_ (oSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-
Leu-Dox. (1), le PEG2ooo_ (DSer) -bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox. ( 3 ) , le PEG20oo-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ( 4 ) et PEG2ooo-Ala-
Leu-Ala-Leu-Dox . (5 ) . Les produits sont dissouts dans un volume minimum d'eau et stérilisés par filtration au travers d'un filtre d'une porosité de 0,22 μm. La concentration des solutions est déterminée par mesure de l'absorbance (détermination à 495 nm basée sur le coefficient d'extinction molaire de la doxorubicine ε = 10837 M-l cm-1) .
4) Cultures cellulaires Le milieu de culture utilisé pour les tests décrits ci-dessous est le RPMI 1 640 avec Glutamax-1 contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (milieu sérique) (SBF; Gibco-BRL) .
5) Tests de cytotoxicité Les tests de cytotoxicité de la Doxorubicine et dérivés ont été réalisés avec les cellules MCF-7/6 et les cellules LNCaP. Les cellules sont décrochées par trypsinisation, comptées puis ensemencées dans des plaques à 96 puits dans 200 μL de milieu sérique. Les cellules sont incubées durant 24 heures à 37°C avant de recevoir les produits à tester : Doxorubicine, Bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, PEG2ooo-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (5) , PEG2ooo-bêta~Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (4) , PEG2ooo-DSer-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (3) , PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (1) dilués à différentes concentrations dans du milieu de culture sérique. Après une incubation de 48 heures en présence des différents composés, les cellules sont finalement post-incubées à 37 °C durant 24 heures en présence de milieu sérique uniquement. Après cette période d'incubation, un test de viabilité cellulaire est effectué (WST-1, Roche Molecular Biochemical) .
6) Tests de stabilité et d'hydrolyse des dérivés PEGylees de prodrogues de la Doxorubicine 6.1) Effet de la PEGylation sur la réactivation d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales Des cultures sub-confluentes des cellules tumorales (MCF-7/6, LS-174T, LNCaP) ont été lavées deux fois avec une solution de tampon phosphate salin et du milieu de culture frais sans sérum contenant 0,02% d'albumine sérique bovine (100 μl/cm2) est ajouté. Après 24h d'incubation, le milieu conditionné est récupéré, centrifugé pendant 10 minutes à 300 g, tamponné avec du Tris-HCl 1 M pH 7,5 (1 vol tampon + 19 vol milieu) et concentré 20 fois par ultrafiltration (seuil de coupure de 10 kDa) (Tris : Trishydroxyméthyl- aminométhane) . La réactivation des dérivés PEGylés de la prodrogue " peptidique de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales a été comparée à celle de la prodrogue initiale, bêta-ALAL-Dox, qui est hydrolysee en Leu-Dox et Doxorubicine lors d'une incubation dans du milieu conditionné par des cellules tumorales. Les composés sont dilués à 20 μM dans le milieu conditionné et incubés pendant 6 à 18 heures à 37 °C dans un bain thermostaté. L'hydrolyse des composés est quantifiée par analyse HPLC (voir point 7.1 ci-dessous) . Les prodrogues PEGylees suivantes ont été utilisées : PEG35o-bêta-ALAL-Dox PEG75o-bêta-ALAL-Dox PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox PEG50oo-bêta-ALAL-Dox 6.2) Stabilité dans le milieu de culture PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ( 1 ) , PEG2000- bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox . ( 4 ) et bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (contrôle) sont dilués à 20 μM dans 500 μL de milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal (milieu sérique) . Les échantillons sont distribués dans des plaques à 24 puits et incubés à 37 °C dans une atmosphère saturée en eau et contenant 5 % de C02. Pour chaque produit, une extraction (Méthode d'extraction à l' acétonitrile voir point 7.3 ci- dessous) est réalisée en triplicat au temps 0 et après 1, 2, 6 et 24 heures d'incubation. Les échantillons sont ensuite analysés par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci- dessous) . 6.3) Stabilité dans le sang total humain PEG2000- (DSer) 4-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicine (1), PEG2ooo-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (4) , bêta-Ala-Leu-Ala-Leu- Dox et Ala-Leu-Ala-Leu-Dox ont été dilués à 20 μM dans 500 μL de sang total humain (conservé à 4°C dans un tube citrate stérile de 5 mL après la collecte) . Les tubes contenant les échantillons sont incubés à 37 °C. Une extraction (Méthode d'extraction à l' acétonitrile voir point 7.3 ci-dessous) de chaque produit est réalisée en triplicat au temps 0 et après 1, 2, 4 et 6 heures d'incubation. 7) Méthodes analytiques 7.1) Extraction basique Dans des tubes contenant 2,5 mL d'un mélange organique chloroforme/méthanol (4 :1), sont ajoutés 25 μL d'échantillon à extraire, 500 μL d'eau et 100 μL de standard interne (prolyl-daunorubicine à 3,45 μM) . Après addition du tampon basique (600 μL de tampon borate 0,5 M, pH 9,8), chaque tube est agité immédiatement pendant 5 secondes puis centrifugé pendant 10 minutes à 1800 g. La phase organique est récupérée et séchée sous flux d'air. Les échantillons sont dissous en ajoutant 500 μL d'un mélange contenant 30% d' acétonitrile et 10% de tampon formiate d'ammonium (pH 4). Les échantillons sont ensuite filtrés et analysés par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessous) . 7.2) Extraction à l' acétonitrile Dans des tubes contenant 50 μL d'échantillon à extraire, sont ajoutés 10 μL de standard interne (prolyl- daunorubicine) et 50 μM et 150 μL d' acétonitrile . Les tubes sont agités et centrifugés pendant 10 minutes à 13000 g. Le surnageant est dilué 4 fois dans du tampon formiate pH 4, centrifugé, puis analysé par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessous) . 7.3) Analyse chromatographique par HPLC Tous les échantillons de produits (PEG2ooo_bêta-Ala- Leu-Ala-Leu-Dox . (4), PEG2ooo_ (DSer) -bêta-Ala-Leu-Ala-Leu- Dox (1) , PEG2ooo~Ala-Leu-Ala-Leu-Dox (5) , bêta-Ala-Leu-Ala- Leu-Dox et Ala-Leu-Ala-Leu-Dox) sont analysés par chromatographie HPLC en utilisant le système HP1100 (Agilent) avec une colonne (phase inverse) de type VYDAC (C8, 5 μm, 250 x 4,6 mm) . La Doxorubicine et ses dérivés sont détectés par fluorescence (Lambdaexc. = 235 nm ; Lambdaem. = 560 nm) et sont identifiés grâce à leur temps de rétention relatifs respectifs par rapport à un standard interne. Leurs concentrations sont calculées en se basant sur la surface intégrée de leurs pics sur les chromatogrammes HPLC. Les courbes de stabilité obtenues (évolution de la concentration en fonction du temps) permettent d'évaluer la stabilité des produits . Et dans le cas des tests d'hydrolyse, un tableau récapitulatif de la quantité de Leu- Dox et de Dox générés après 6 heures d' incubation permet d'évaluer l'hydrolyse des dérivés PEGylés par les enzymes libérées par les cellules tumorales. 8) Etude in vivo de la réactivation tumorale des dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine La réactivation tumorale de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine (Su-bêta-ALAL-Dox) a été évaluée sur des souris athymiques portant des xénogreffes de carcinome de colon humain LS-174T. Les dérivés PEGylés suivants ont été utilisés : PEG2ooo-bêta-ALAL-Dox et PEG2ooo_ bêta-ALAL-Dox. Les souris ont reçu une injection i.v. (intra veineuse) bolus des différents composés à la dose de 69 μmol/kg. Les animaux ont été sacrifiés 2 et 72h après l'injection et les molécules actives (Leu-Dox + Dox) accumulées dans la tumeur ont été quantifiées par chromatographie HPLC (voir point 7.3 ci-dessus) .
9) Etudes chimiothérapeutiques des dérivés Pegylés d'une prodrogue de la Doxorubicine dans des modèles de xénogreffe ectopique sous-cutanée Les études de chimiothérapie expérimentales ont été réalisées sur des souris athymiques porteuses de tumeurs d'origine humaine LS-174T ou HCT-116 (carcinomes de colon humain) préalablement greffées en sous-cutané. Les souris sont sélectionnées et réparties dans les différents groupes de l'étude de façon à avoir une répartition des volumes tumoraux équitable. Les différents traitements sont assignés aux groupes formés de façon aléatoire . Les traitements sont administrés par voie i.v. dans la veine caudale. Lors de ces injections, Les animaux reçoivent un volume constant de 10 μl/g de produit (Workman et al . , 1998) . Après l'injection, les signes cliniques sont suivis régulièrement (chaque heure durant le premier jour et quotidiennement jusqu'à la fin de l'étude), ainsi que le poids qui est mesuré en même temps que le volume tumoral (mm3) . La croissance de la tumeur est contrôlée 2 fois par semaine en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse deux diamètres (ou « diagonales ») perpendiculaires de la tumeur (la plus grande et la plus petite « diagonale ») . Pour déterminer l'évolution du volume tumoral des différents groupes, la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV pour "relative tumor volume") qui expriment en pourcent l'évolution des médianes des volumes tumoraux par rapport au jour 0 est calculée. Pour estimer l'effet des différents traitements, l'inhibition de la croissance est déterminée en calculant le rapport entre la médiane du RTV des groupes traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage (T/C(%)). La valeur du rapport T/C la plus faible est utilisée comme paramètre pour estimer l'efficacité maximale des produits utilisés . La durée d' inhibition de la croissance de la tumeur a été évaluée en calculant le retard de croissance entre les groupes traités et le groupe contrôle (T - C) pour un doublement (DT pour « Doubling Time ») des médianes des RTV (l'indication 200% sur la Figure 5 représentant le temps de doublement du groupe contrôle) . Le retard de croissance spécifique (SGD pour « Spécifie Growth Delay ») est également calculé à partir du temps nécessaire pour un doublement de la médiane du RTV dans les différents groupes de l'étude. SGD est donc égal à (DTtraité - DTcontrôie) / ( U Ï contrôle) • L'activité des différents produits testés a également été évaluée en se basant sur les critères recommandés par l'EORTC (European Organisation for Research and Treatment of Cancer) (Boven et al . , 1992 ; Langdon et al . , 1994) et présentés dans le tableau I. Cependant, la façon d'estimer l'efficacité des composés a été adaptée étant donné que les critères proposés dans la littérature (Boven et al . , 1992) ne sont valables que pour des tumeurs qui présentent une croissance linéaire monophasique . La tumeur LS-174-T utilisée est caractérisée par une croissance en 2 phases ; la phase terminale (phase 2) étant beaucoup plus rapide que la première phase (phase 1) . Pour ces raisons, les retards de croissance (T - C) et les retards de croissance spécifique (SGD) ont été calculés à partir des régressions linéaires des différentes phases qui caractérisent la croissance des tumeurs. Le tableau 1 ci-dessous montre l'évaluation de l'efficacité d'un agent chimiothérapeutique selon les critères recommandés par l'EORTC (Boven et al . , 1992 ; Langdon et al . , 1994) . Echelle d'activité : - = aucune activité ; (+) = activité très faible ; + = activité faible ; ++ = activité modérée ; +++ = activité importante ; ++++ = activité très importante. Tableau 1
Figure imgf000041_0001
10) Etude chimiothérapeutique avec des dérivés PEGylés du TNF-alpha dans un modèle de xénogreffe ectopique intradermique 10.1) Lignée cellulaire Cellules B1 6-BL 6 : cellules de mélanome murin sélectionnées in vi vo pour leur capacité d'invasion au niveau de la vessie et qui ont une forte capacité à former spontanément des métastases pulmonaires. Ces cellules proviennent du « NCI-Frederick Cancer Research and Development Center », Maryland, USA. 10.2) Les agents anticancéreux pour l'étude chimiothérapeutique Le Rh TNF-α (« recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha ») est fourni par Henogen (Gosselies, Belgium) . Les conjugués ( PEG50oo) n-TNF , ( PEGsooo-Ala-Leu-Ala- Leu) n-TNFα et (PEG5000- (DSer) 4-Ala-Leu-Ala-Leu) n-TNFα ont été synthétisés. « n » varie de 1 à 18 (18 étant le nombre total de lysine par molécule de TNFα sous sa forme trimère, sachant que chaque monomère du TNF comporte 6 résidus lysines) . La synthèse des dérivés (PEG-peptide) n-TNFα se déroule comme suit : le peptide est synthétisé en phase solide, puis couplé à un polyéthylène glycol (PEG) activé sous forme N-hydroxysuccinimide en présence de diméthylformamide (DMF) et de diisopropyléthylamine (DIPEA) . Après purification, le PEG-peptide-OH dissout dans la DMF est activé en présence d'un agent de couplage bien connu de l'homme de l'art (ex : TSTU, 2-succinimido-l , 1 , 3 , 3- tetramethyluronium tetrafluoroborate) . Le rhTNFα solubilisé dans du tampon phosphate 20 mM pH 7,4 contenant 1 % de mannitol est ensuite ajouté et le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant une nuit. Le produit de couplage est récupéré et l'excédent de PEG-peptide-OH est éliminé par ultracentrifugation . La concentration des produits finaux est déterminée par un dosage de protéines. 1.3) Les animaux Des souris mâles C57BL/6J (de 5 semaines à la livraison par les élevages Charles River Laboratories, France) ont été utilisées. Toutes les manipulations des animaux se font conformément aux recommandations de l'UKCCCR (United Kingdom Co-ordinating Committee on Cancer Research ; Workman et al . , 1998) et de la FELASA ( Fédéra tion of European Laboratory Animal Science Associ a ti ons ; Nicklas et al . , 2002 ; Rehbinder et al . , 2000 ; Rehbinder et al . , 1996) sur l'utilisation et le bien-être des animaux dans les études de chimiothérapie expérimentales. L'étude de chimiothérapie expérimentale est réalisée sur des souris conventionnelles mâles de type C57BL/6J porteuses de tumeurs d'origine murine B16-BL6 (mélanome murin) préalablement greffées en intradermique. Les souris sont sélectionnées et réparties dans les différents groupes de l'étude de façon à avoir une répartition des volumes tumoraux équitable. Les différents traitements sont assignés aux groupes formés de façon aléatoire . Les traitements sont administrés par voie i.v. aux jours 0 et 3. Lors de ces injections, les animaux reçoivent un volume constant de 10 μl/g de produit (Workman et al . , 1998) . Après l'injection, les signes cliniques sont suivis régulièrement (chaque heure durant le premier jour et quotidiennement jusqu'à la fin de l'étude), ainsi que le poids qui est mesuré en même temps que le volume tumoral. La croissance de la tumeur est contrôlée 2 fois par semaine en mesurant à l'aide d'un pied à coulisse deux diamètres (ou « diagonales ») perpendiculaires de la tumeur (la plus grande et la plus petite « diagonale ») . L'efficacité antitumorale est quantifiée par la valeur du rapport T/C (la plus faible correspondant à l'efficacité maximale) . La méthode de détermination est décrite en détail au point 9 ci-dessus. Exemple 2 : Effet de la PEGylation sur la réactivation d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales Les composés bêta-ALAL-Dox, PEG35o-bêta-ALAL-Dox, PEG750-bêta-ALAL-Dox, PEG20oo-bêta-ALAL-Dox et PEG5ooo-bêta-ALAL- Dox (20 μM) ont été incubés pendant 6 heures dans du milieu conditionné de cellules tumorales MCF-7/6 ou LS-174T. La réactivation des prodrogues (libération de Doxorubicine et de Leu-Dox) a été mesurée par chromatographie HPLC. Le tableau 2 ci-dessous représente l'hydrolyse de la prodrogue bêta-ALAL-Dox et de ses dérivés PEGylés . Les résultats représentent les concentrations de Doxorubicine (Dox) et de Leucyl-Doxorubicine (L-Dox ou Leu-Dox) et sont exprimés comme la valeur moyenne obtenue à partir de trois expériences indépendantes ± l'écart type (n=9) .
Tableau 2
Figure imgf000044_0001
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessus montrent que la réactivation des prodrogues et donc la libération des molécules actives (Leu-Dox + Doxorubicine) est inhibée d'autant plus que le poids moléculaire du PEG augmente . La PEGylation de la prodrogue de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) empêche sa réactivation par les peptidases tumorales. Cette inhibition est corrélée avec la taille du PEG. Les inventeurs ont émis l'hypothèse que cette inhibition est probablement la conséquence d'un phénomène d'encombrement sterique qui limite l'accessibilité du site de clivage.
Exemple 3 : Etude in vivo de la réactivation tumorale de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine La réactivation tumorale in vivo de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine (bêta-ALAL-Dox) a été évaluée à l'aide d'un modèle de souris athymique portant des xénogreffes de tumeurs de carcinome de colon humain LS- 174T.Le tableau 3 ci-dessous représente la moyenne (obtenue sur 18 souris) des concentrations en Dox et Leu-Dox accumulées au niveau des tumeurs à 2 et 72 heures après l'injection du composé testé. Tableau 3
Figure imgf000045_0001
Le tableau ci-dessus montre que dans les deux cas, le PEG∑ooo-bêta-ALAL-Dox et le PEG20ooo_bêta-ALAL-Dox sont moins réactivés en Dox et Leu-Dox que le contrôle Su-bêta-ALAL- Dox. La PEGylation de cette prodrogue de la Doxorubicine diminue donc sévèrement la réactivation au niveau des tumeurs . Exemple 4 : Effet de l' insertion d' un espaceur sur la réactivation par les peptidases sécrétées par les cellules tumorales de prodrogues PEGylees de la Doxorubicine Des prodrogues de bêta-ALAL-Dox ( 20 μM) ont été incubées pendant 6 à 18 heures dans du milieu conditionné de cellules tumorales LS-174T ou LNCaP . La réactivation des prodrogues ( libération de Doxorubicine et de Leu-Dox) a été mesurée par chromatographie HPLC . Deux espaceurs ont été testés : - quatre résidus hydrophiles DSerine ( (DSer) 4) - insertion de résidus acide 6-aminohexanoïque (ou acide aminocaproïque qui est un acide aminé hydrophobe de plus grande longueur que la serine) , noté Ahx . Le tableau 4 ci-dessous représente l' hydrolyse de la prodrogue Su-bêta-ALAL-Dox (contrôle ) et des dérivés PEGylés de bêta-ALAL-Dox . Les résultats représentent les pourcentages de Doxorubicine et Leu-Doxorubicine libérées par rapport au contrôle (n=3 ) .
Tableau 4
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Les résultats du tableau ci-dessus montrent à nouveau que l'hydrolyse des dérivés PEGylés diminue significativement par rapport à celle de la Su-bêta-ALAL-Dox. L'insertion de quatre résidus D-sérine entre le PEG et bêta-ALAL-Dox augmente de deux fois la libération de la Doxorubicine et de Leu-Dox par rapport aux dérivés PEGylés avec un PEG2000 sans espaceur ou avec 3 résidus Ahx (groupe espaceur hydrophobe) , après incubation des composés dans le milieu conditionné de cellules LS-174T L'insertion des résidus acide aminohexanoïque (acide aminé hydrophobe) n'augmente pas la réactivation des dérivés PEGylés de la prodrogue par rapport à aux dérivés sans espaceur. Exemple 5 : Tests de cytotoxicité de dérivés PEGylés d'une prodrogue de la Doxorubicine Les cellules tumorales MCF-7/6 ont été cultivées pendant 48 heures en milieu sérique contenant des concentrations croissantes de Doxorubicine, bêta-ALAL-Dox, PEG2000- bêta-ALAL-Dox, PEG2ooo-DSer-bêta-ALAL-Dox ou PEG2000- (DSer) 4-bêta-ALΑL-Dox. Elles sont ensuite post-incubées pendant 24 heures en présence de milieu sérique. La cytotoxicité des produits est estimée par un test de viabilité cellulaire (WST-1, Roche Molecular Diagnostic) . Les résultats de 3 expériences indépendantes sont présentés à la Figure 2. Les valeurs d'ICso (concentration inhibitrice à 50%) de la Doxorubicine et du composé bêta-ALAL-Dox sont respectivement 0,045 μM et 158,48 μM ce qui confirme le caractère de prodrogue de la bêta-ALAL-Dox. La comparaison des valeurs moyennes d'ICso obtenues pour les composés bêta- ALAL-Dox et PEG2ooo_bêta-ALAL-Dox indiquent que la PEGylation inhibe la réactivation de la prodrogue puisque le PEG2ooo~bêta- ALAL-Dox n'est pas cytotoxique jusqu'à une concentration de 500 μM. La prodrogue comprenant une DSer entre le PEG et bêta-ALAL-Dox (PEG2ooo-DSer-bêta-ALAL-Dox) n'est pas cytotoxique non plus. En revanche, La prodrogue comportant l' espaceur moléculaire (DSer) 4 entre le PEG et bêta-ALAL-Dox, (PEG2ooo_ (oser) 4-bêta-ALAL-Dox) est cytotoxique, et PEGooo_ (oSer) 4-bêta- ALAL-Dox a même une activité identique (IC50 = 251,19 μM) à celle de la prodrogue non PEGylée, bêta-ALAL-Dox. Ces résultats montrent que l'insertion de 4 résidus D- sérine entre le PEG et la bêta-ALAL-Dox permet la réactivation de la prodrogue PEGylée. En revanche, la prodrogue PEGylée sans espaceur n'est pas réactivable . La toxicité de cette dernière prodrogue résulte principalement de sa réactivation extrasanguine, c'est-à-dire de la meilleure libération de la doxorubicine par rapport aux autres composés testés. Exemple 6 : Etude d'efficacité d'un dérivé PEGylé d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, dans un modèle de xénogreffe du carcinome de colon humain LS-174T L'activité anti-tumorale de la Doxorubicine, de la succinyl-bêta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox, et du PEG2000- (DSer) 4-Ala- Leu-Ala-Leu-Dox a été testée dans un modèle de souris athymiques (NMRI nu/nu) portant des xénogreffes ectopiques de tumeur humaine de type LS-174T. Les produits ont été injectés par voie i.v. (10 μl/g, 6 souris par groupe) . Le PEG2000- (oSer) 4-ALAL-D0X a été administré une première fois par i.v. bolus aux doses de 50 μmol/kg et 45 μmole/kg. Une mortalité a été observée aux deux doses administrées . Les doses administrées ont été diminuées à partir du jour 7. Le PEG2000- (DSer) -ALAL-Dox a été injecté à 35 μmol/kg et 25 μmol/kg (1 fois par semaine, 3 injections) . Les autres composés ont été administrés par injection i.v. bolus une fois par semaine aux jours 0, 7, 14 et 21 (doxorubicine 6,69 et 8,6 μmol/kg, Su-bêta-ALAL- Dox 45 et 50 μmol/kg) . La Figure 3 représente l'évolution de la moyenne des poids corporels en pourcent à partir du début du traitement en jour. A partir de la deuxième semaine, aucune perte de poids significative n'a été observée dans les groupes traités à la Doxorubicine et au PEG2ooo~ (oSer) 4-ALAL-Dox . Une légère perte de poids a été observée dans les groupes traités à la Su-bêta-ALAL-Dox. Dans ce dernier cas, la perte de poids maximale est de 10 % au jour 32 dans les deux groupes traités . La Figure 4 représente l'évolution de la médiane des volumes tumoraux relatifs (RTV) des groupes de souris traités (T) par rapport au contrôle (C) (NaCl) . Bien qu'administrés à des doses en dessous la dose maximale tolérée (MTD) , tous les produits testés ont une activité antitumorale. Durant le traitement, il a été observé deux phases de croissance tumorale (Figure 5) . Lors de la première phase de croissance, l'activité du PEG2ooo_ (oSer) -ALAL-Dox (1 x 50 + 3 x 35 μmol/kg) est comparable à celle de la Doxorubicine (6,69 μmol/kg) et est inférieure à celle de la Succinyl- bêta-ALAL-Dox (50 μmol/kg) . En revanche, lors de la deuxième phase de croissance, le PEG2000- (oSer) 4-ALAL-Dox est plus actif que la Doxorubicine et aussi actif que la Su-bêta- ALAL-Dox. Globalement, il a été observé que les produits Su-bêta-ALAL-Dox (T/C min = 26,6% ; retard de croissance spécifique (SGD = 3,02) et PEG200o- (DSer) 4-ALAL-Dox (T/C min- 38% ; SGD = 1,58) sont plus actifs que la Doxorubicine. Exemple 7. Stabilité des dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine dans le milieu sérique La stabilité des composés bêta-ALAL-Dox, PEG2ooo~bêta- ALAL-Dox et PEG20oo- (DSer) 4-ALAL-Dox, a été évaluée après une incubation de 24 heures à 37 °C dans du milieu de culture contenant 10% de sérum de veau fœtal. Les concentrations des produits de départ et les éventuels métabolites formés ont été quantifiées par HPLC. Les 3 conjugués testés sont stables dans le milieu sérique. Aucun produit de dégradation n'a été détecté (Figure 6) .
Exemple 8. Stabilité des dérivés PEGylés de prodrogues de la Doxorubicine dans le sang total humain. Les composés bêta-ALAL-Dox, PEG2ooo_ALAL-Dox, PEG2ooo_ bêta-ALAL-Dox et PEG2ooo~ (Dser) 4-ALAL-Dox ont été dilués à 20 μM dans du sang humain citrate et incubés à 37 °C. A différents points de temps, les concentrations des conjugués et des éventuels métabolites formés ont été évaluées par HPLC. La Figure 7 illustre l'évolution de la concentration des produits en fonction du temps d'incubation. Le composé ALAL-Dox a été utilisé comme contrôle. Ce dernier n'est pas stable dans le sang. Après 1 heure, 80 % du produit de départ sont dégradés en Leu-Dox et Dox. Les 3 autres conjugués testés sont stables pendant 6 h dans le sang total humain (Figure 7) . Au temps 6h, seule une très légère hydrolyse de la bêta-ALAL-Dox (8 % de Dox et 10 % de L-Dox) et de la PEG200o- (DSer) 4-ALAL-Dox (5% de Dox et 5 % de Leu-Dox) a été observée. Ces résultats montrent que le remplacement de l'aminé terminale de l' oligopeptide par une _Alanine empêche l'hydrolyse de la séquence par les peptidases du sang. La stabilité des dérivés PEGylés testés peut être due à la présence d'acides aminés non naturels (_Alanine ou dSérine) mais aussi au PEG utilisé comme groupe stabilisant. Exemple 9. Etude d'efficacité d'un dérivé PEGylé d'une prodrogue de la Doxorubicine, la bêta-ALAL-Dox, dans un modèle de xénogreffe du carcinome de colon humain HCT-116 L'efficacité antitumorale du PEG2ooo_ (DSer) 4-ALAL-Dox a été comparée à celle de la Succinyl-_ALAL-Dox dans un modèle de xénogreffe de carcinome de colon humain HCT-116 implanté en sous-cutané dans des souris Swiss nu/nu. Les animaux ont reçu 5 injections i.v. bolus (pendant 5 jours consécutifs) de Succinyl-_ALAL-Dox à 30 μmol/kg ou de PEG2ooo_ (oSer) 4- ALAL-Dox à 53 et 110 μmol/kg (6 souris/groupe). Aucune mortalité n'a été observée dans les groupes traités. Les résultats de la Figure 8 représentent l'évolution des poids corporels des animaux. Quelle que soit la dose administrée, aucune toxicité du PEG2ooo~ (DSer) 4-ALAL-Dox n'a été observée, tandis que les souris traitées avec la Succinyl-_ALAL-Dox ont perdu du poids (environ 20% à la fin de l'étude, jour 49) indiquant que la dose maximale tolérée (MTD) est atteinte dans ce groupe. L'efficacité antitumorale est représentée par la courbe T/C qui comporte deux phases (Figure 9) . Dans la première (jusqu'au jour 21), le PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox (110 μmol/kg) a une activité similaire à celle de la Succinyl-_ALAL-Dox (30 μmol/kg) . Dans la seconde phase, l'activité du dérivé PEGylé (110 μmol/kg) diminue par rapport à celle de la Succinyl-_ALAL-Dox . A 53 μmol/kg, le dérivé PEGylé induit une régression tumorale pendant la semaine de traitement au delà de la quelle la croissance tumorale reprend. En résumé ces résultats montrent que le PEG2000- (oSer) 4-ALAL-Dox est moins toxique que la Succinyl- _ALAL-Dox et est actif pendant la première phase de l'étude. La MTD du dérivé Pegylé n'est pas atteinte dans cette étude. Exemple 10. Etude chimiothérapeutique de PEG2000- (pSer) 4-ALAL-Dox vs PEG∑QOQ-ALAL-DOX dans un modèle de xénogreffe du carcinome de colon humain HCT-116 L'efficacité antitumorale du PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox a été comparée à celle du PEG2ooo-ALAL-Dox dans un modèle de xénogreffe de carcinome de colon humain HCT-116 implanté en sous-cutané dans des souris Swiss nu/nu. Les animaux ont reçu 5 injections i.v. bolus (pendant 5 jours consécutifs) des composés aux doses de 200, 300, et 400 μmol/kg (5 souris/groupe) . Contrairement au PEGooo_ALAL-Dox, le PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox est toxique à 300 et 400 μmol/kg et induit une perte de poids et la mort des animaux (Figure 10) . Cette toxicité suggère une réactivation plus importante dans le compartiment extrasanguin du PEG2000- (DSer) 4-ALAL-Dox comparé au PEG2ooo-ALAL-Dox . A une dose équimolaire et non-toxique (200 μmol/kg), le PEG2000- (DSer) -ALAL-Dox a une efficacité antitumorale meilleure que celle du PEG2ooo-ALAL-Dox (Figure
11) . A nouveau ces résultats supportent l'hypothèse d'une plus grande réactivation tumorale du composé comportant l' espaceur moléculaire comprenant 4 Serines en conformation D. Ces données mettent clairement en évidence l'effet positif de l'insertion des 4 D serines entre le PEG et la séquence clivable dans la réactivation de la prodrogue . Exemple 11: Etude d'efficacité de dérivés PEGylés du
TNF-α^ L ' activité anti-tumorale du (PEG50oo~ (oSer) 4-ALAL) n-TNFα a été comparée à celle du (PEG5000) n-TNFα, et du ( PEG5ooo-Ala-
Leu-Ala-Leu) n-TNF dans un modèle de souris conventionnelles mâle de type C57BL/ 6J portant des xénogreffes ectopiques (greffées en intradermique ) de tumeur murine B16BL6 (mélanome murin) . Les conjugués ont été administrés par voie i.v. à la dose de 2000 μg eq. TNF-α/kg deux fois par semaine sur une semaine (aux jours 0 et 3) . Aucun signe de toxicité immédiate n'a été observé à la dose administrée. La Figure 12 représente l'évolution de la survie des animaux. Dans les groupes traités, le (PEG50oo- (oSer) 4-ALAL) n- TNFα entraîne la mort de 40% des souris au jour 6 et de 60 % au jour 10. La mortalité observée dans les autres groupes, y compris le groupe contrôle, ne dépasse pas 20 % (1 souris sur 5) et est probablement due aux caractéristiques invasives et métastasiques des tumeurs de type B16-BL6. La Figure 13 représente l'évolution de la moyenne des poids corporels en pourcent à partir du début du traitement en fonction du temps. Le jour après la première injection, une perte de poids significative a été observée dans les groupes traités avec le (PEG50oo-ALAL)n-TNFα et le (PEG50oo- (DSer) 4-ALAL) n-TNFα (de 15 et 28 %, respectivement). Après la deuxième injection, cette perte de poids s'est accentuée dans le groupe traité avec le (PEG5ooo_ (oSer) 4-ALAL) n-TNFα. Dans ce dernier, la perte de poids maximale est de 32% au jour 6. Par contre dans le groupe traité avec le (PEG5000- ALAL)n-TNFα, une reprise de poids est observée après la seconde injection (jour 3) . Aucune perte de poids n'a été observée dans le groupe traité avec le (PEG5000) n _TNFα. L'efficacité antitumorale est représentée dans la Figure 14 par l'évolution du rapport T/C (rapport entre la médiane du RTV des groupes traités (T) et celui du groupe contrôle (C) exprimé en pourcentage) . Ces résultats montrent clairement que l'activation des prodrogues du TNFα, nécessaire à la libération d'une forme active de la protéine, varie en fonction de la structure des conjugués. Le (PEG50oo) n-TNFα n'est pas actif, et le (PEG5000-ALAL) n-TNFα est moins actif (T/C min=51,7% (j3); SGD=1,66) que le (PEG5000- (DSer) 4-ALAL) n-TNFα. (T/C min=16, 7% (j6) ; SGD=3,72). Ces résultats mettent en évidence une corrélation entre l'activation et la toxicité des conjugués. La toxicité est faible ou nulle (en perte de poids) en l'absence d'un peptide entre le PEG et le TNFα. L'insertion d'un lien ALAL entre ces deux parties induit une toxicité plus importante du produit traduisant sa plus grande réactivation extrasanguine. L'allongement de ce peptide (ALAL) par l'insertion d'un un espaceur hydrophile (DSer)4 induit une augmentation significative de la toxicité du conjugué résultant vraisemblablement de sa sensibilité accrue à une réactivation dans le compartiment extrasanguin.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Composé de formule (A)p- (E-B) n- (I)m, dans laquelle : I est une substance d' intérêt active sur des cellules cibles, - A est un groupement augmentant le temps de demi-vie de B-I dans l'appareil circulatoire, - E-B est un groupe de liaison entre A et I, où : - B est une structure clivable sélectivement par une enzyme présente uniquement ou préférentiellement à proximité ou au niveau desdites cellules cibles, - E est un groupe espaceur hydrophile, stable dans l'appareil circulatoire, qui éloigne A de B de façon à permettre ou faciliter le clivage de B à proximité ou au niveau desdites cellules cibles et ainsi permettre . ou faciliter la libération de I ou la libération de I avec un reste de B, - n est un nombre entier compris entre 1 et soit le nombre total de fonctions réactives de I sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, soit le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - m est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de A sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés - p est un nombre entier compris entre 1 et le nombre total de fonctions réactives de I, sur lesquelles les groupes de liaisons E-B peuvent être fixés, avec quand p = 1, n = m et quand m = 1, n = p.
2) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I est fixé directement à une ou plusieurs structures B par une liaison covalente. 3) Un composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que I est fixé à une ou plusieurs structures B par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
4) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la taille de E est équivalente à de l'ordre de 1 à 100 acides aminés. 5) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend de 1 à 100, de préférence de 1 à 20 et tout préférentiellement de 2 à 10, acides aminés identiques ou différents, choisi (s) dans le groupe comprenant les acides aminés naturels en conformation D et les acides aminés non codés génétiquement.
6) Un composé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le (s) dit (s) acide (s) aminé (s) est (sont) choisi (s) parmi la D-glutamine, la D-asparagine, la D-sérine, la D- histidine, la D-thréonine, le D-acide aspartique, le D-acide glutamique, la D-lysine, la D-arginine .
7) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend une séquence d'acides aminés choisie parmi : (D-sérine)x, (D-thréonine) x où x est un nombre entier compris entre 1 et 20, de préférence entre 2 et 10, et tout préférentiellement entre 2 et 6.
8) Un composé selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que E est un peptidomimétique, un pseudopeptide ou un peptoïde. 9) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend au moins un groupement choisi parmi des chaînes alkyles substituées, polyalkylglycols, polysaccharides, polyols, polycarboxylates, poly (hydro) ester .
10) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille de E est d'autant plus importante que le poids moléculaire de A est important.
11) Un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que E est constitué ou comprend un ou plusieurs acides aminés selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 et au moins un groupement selon l'une des revendications 9 ou 10.
12) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A présente en outre des propriétés de solubilisation dans l'eau, le sang ou le sérum dudit composé de formule (A)p- (E-B) n- (I)m.
13) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A présente en outre des propriétés de ciblage dudit composé de formule (A) p- (E-B) n~ (I)m vers lesdites cellules cibles.
14) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est en outre un agent à activité thérapeutique ou agent à activité diagnostique. 15) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est hydrophile ou amphipatique . 16) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que A est choisi parmi les polypeptides, immunoglobulines, albumine, polysaccharides, polymères, copolymeres. 17) Un composé selon la revendication 16, caractérisé en ce que A est choisi parmi un polyalkylene glycol, polyalkylene oxide, polyalkylene imine, des copolymeres du chlorure de vinyle. 18) Un composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que A est choisi parmi un polyéthylène glycol, un polyéthylène oxide, un polyéthylène imine, le styrène sulfonate de sodium (NaSS), le maléate de sodium et de butyle (MMBE) , le méthacrylate d' hydroxypropyle ou N- (2- hydroxypropyl) méthacrylamide (HPMA) , le méthacrylate de méthyle (MMA) , le poly- [N- (2-hydroxyéthyl) -L-glutamine] (PHEG) , le poly- [N- (hydroxyéthyl) -DL-aspartamide] (PHEA) .
19) Un composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que A est un polyéthylène glycol d'une taille comprise en 200 et 50000 Da, de préférence entre 350 et 20000 Da et tout préférentiellement entre 1000 et 10000.
20) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est clivable sélectivement par une enzyme présente dans l'environnement des cellules choisies dans le groupe comprenant les cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques des tumeurs et des métastases tumorales, macrophages, monocytes, lymphocytes ou polynucléaires infiltrants les tumeurs et les métastases tumorales .
21) Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est choisi parmi les oligopeptides, oligosaccharides, les chaînes lipidiques. 22) Composé selon la revendication 21, caractérisé en ce que la structure B est choisie parmi les séquences peptidiques suivantes : L-alanine-L-leucine-L-alanine-L- leucine, L-alanine-L-tyrosine-L-glycine-L-glycine-L- phenylalanine-L-leucine .
23) Un Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que B est clivable par une enzyme choisie dans le groupe comprenant les peptidases, les endopeptidases , les enzymes lysosomiales, les lipases, les glycosidases .
24) Un composé selon la revendication 23, caractérisé en ce que B est clivable par une peptidase sélectivement présente dans l'environnement des cellules tumorales, cellules stromales des tumeurs, cellules endothéliales néoangiogéniques, macrophages, monocytes, lymphocytes ou polynucléaires .
25) Un composé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la peptidase spécifique des cellules tumorales est choisie dans le groupe comprenant la Néprilysine (CD10) , la Thimet oligopeptidase (TOP) , le Prostate Spécifie Antigen (PSA) , la plasmine, la légumaïne, les collagènases , l'urokinase, les cathepsines, les métallopeptidases de matrice .
26) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que I est choisi dans le groupe comprenant un agent chimique, un polypeptide, une protéine, un acide nucléique, un antibiotique, un virus ou un marqueur, éventuellement couplé à une substance vectrice.
27) Un composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que I est un agent à activité thérapeutique antitumorale, anti-angiogénique ou anti-inflammatoire. 28) Un composé selon la revendication 27, caractérisé en ce que I est choisi dans le groupe comprenant les anthracyclines, la doxorubicine, la daunorubicine, les dérivés d'acide folique, les alcaloïdes vinca, la calichéamycine, la mitoxanthrone, la cytosine arabinoside, l'adénosine arabinoside, la fludarabine phosphate, le melphalan, les bléomycines, les mitomycines, la L- canavanine, les taxoïdes, la camptothécine, l' hydrochlorure de 9-diméthylaminométhyle-hydroxy-camptothécine, les inhibiteurs du protéasome, les inhibiteurs de la farnesyl- transférase (FTI), les épothilones, les maytansinoïdes, le discodermolide, la fostréicine, les dérivés du platine, les duocarmycines, la combretastatine, les épipodophyllotoxines, les peptides BH3, les peptides p53, les caspases, le granzyme B, les ribozymes, le facteur de nécrose tumorale- alpha (TNF-alpha), l'interféron alpha (IFN-alpha), l'interféron gamma (IFN-gamma) , l' interleukine 1 (IL-1) , IL- 2, IL-6, IL-12, IL-15, les antagonistes de 1 ' IGF-1. 29) Composé selon la revendication 26, caractérisé en ce que I est un marqueur choisi dans le groupe comprenant la coumarine, la 7-amido trifluoraméthyle coumarine, la paranitroanilide, la 8-naphtylamide et la 4-méthoxy naphtylamide, la fluoroscéine, la biotine, la rhodamine et leurs dérivés, les agents utilisés en scintigraphie.
30) Un composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une ou plusieurs substances de ciblage capables de vectoriser ledit composé de formule (A) p- (E-B) n- (I) m vers lesdites cellules cibles .
31) Un composé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la (ou lesdites) substance (s) de ciblage est (sont) couplée (s) au composé de formule (A) p- (E-B) n- (I)m au niveau d'un ou plusieurs groupements A.
32) Composition pharmaceutique, de diagnostic ou de traçage, caractérisée en ce quelle comprend en tant que principe actif au moins un composé selon quelconque des revendications 1 à 31.
33) Un composé choisi dans le groupe comprenant les composés, polyéthylène glycol-DSéryl-DSéryl-DSéryl-oSéryl- Alanyl-LLeucyl-iAlanyl-LLeucyl-Doxorubicine polyéthylène glycol-DSéryl-DSéryl-oSéryl-DSéryl- LAlanyl-Leucyl-iAlanyl-LLeucyl-TNFalpha polyéthylène glycol-DSéryl-DSéryl-DSéryl-DSéryl- LAlanyl-LTyrosyl-LGlycyl-Glycyl-LPhenylalanyl-LLeucyl- Doxorubicine polyéthylène glycol-DSéryl-DSéryl-DSéryl-DSéryl- LAlanyl-LLeucyl-LAlanyl-LLeucyl-TNFalpha
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