WO2005017200A1 - galectin-2遺伝子内一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 - Google Patents

galectin-2遺伝子内一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing an inflammatory disease, which comprises detecting a gene polymorphism present in the galectin-2 (galectin-1) gene, an oligonucleotide used in the method, an inflammatory disease containing the oligonucleotide. Diagnostic kits and their use. Background art
  • Ps can directly affect the quality or quantity of gene products or increase the risk of serious side effects from certain diseases or drugs. Therefore, many SNPs can be searched. This is expected to contribute to the identification of disease-related genes and the establishment of diagnostic methods to avoid side effects of drugs.
  • galectin-2 has a high homology of 43% to galectin-1. Like galectin-1, galectin-2 forms a noncovalent dimer consisting of two 14 kDa subunits, and self-aggregates and loses activity in the absence of a reducing agent. The tissue distribution of galectin-2 is narrower than that of galectin-1. In the case of galectin-1, galectin-2 is abundant in various cell lines, including mesenchymal tissues such as muscle, but galectin-2 is frequently found in epithelial cells mainly in the lower small intestine in normal adult tissues. The detailed function of galectin-2 is clearly described as it is (Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 9, No. 45, (1997) pp. 87-93). Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to identify a novel single nucleotide polymorphism (SNP) involved in the development of inflammatory diseases such as myocardial infarction. Further, the present invention has an object to provide a method for diagnosing an inflammatory disease such as myocardial infarction or a method for developing a therapeutic agent for an inflammatory disease using the identified SNP.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, the galectin-l and galectin-2 gene products bind to the myocardial infarction susceptibility gene product lymphotoxin-alpha (LTA), and the galectin-2 gene
  • LTA myocardial infarction susceptibility gene product lymphotoxin-alpha
  • the present invention has been completed by identifying that a novel single nucleotide polymorphism (SNP) is associated with the development of myocardial infarction o
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a method for determining an inflammatory disease comprising detecting at least one gene polymorphism present in the galectin-2 gene.
  • a method for determining an inflammatory disease comprising detecting at least one single nucleotide polymorphism present in the galectin-2 gene.
  • a method for determining an inflammatory disease comprising detecting a CZT polymorphism at the 279th base in the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1. .
  • the inflammation 1 "live disease is myocardial infarction.
  • a sequence of at least 10 consecutive bases including the 3279th base in the base sequence of intron 1 of galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof is An oligonucleotide capable of being soyed and used as a probe in the method according to any one of claims 1 to 4 is provided.
  • a sequence of at least 10 consecutive bases including the 3279th base in the base sequence of intron 1 of galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1, and Z Alternatively, the oligonucleotide can be used as a primer in the method according to any one of claims 1 to 4, which can amplify the complementary sequence.
  • the primer is a forward primer and / or a reverse primer.
  • kits for diagnosing an inflammatory disease comprising at least one of the oligonucleotides described in any of the above.
  • the inflammatory disease is a myocardial infarction.
  • the method comprises detecting a polymorphism of CZT at the 279th base in the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a method for analyzing the expression state of -2.
  • the expression level of galectin-2 gene or galectin-1 gene in a cell is analyzed in the presence of a trapping substance, and a substance that changes the expression level is selected.
  • a method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease comprising the steps of:
  • the method comprises analyzing the expression level of the galectin-2 gene or galectin-1 gene in the cell in the presence of the candidate substance, and selecting a substance that increases the expression level. And a method of screening for a therapeutic agent.
  • lymphotoxin-a LTA
  • galectin-2 gene product or galectin-1 gene product is measured in the presence of a candidate substance, and a substance that inhibits the binding is selected.
  • a method for screening a therapeutic agent for an inflammatory disease comprising the step of:
  • a galectin-2 gene fragment containing a CZT polymorphism at nucleotide 279 in the base sequence of intron 1 of galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1 Culturing the cells, and analyzing the expression of the gene.
  • a galectin-2 gene fragment containing a polymorphism of CZT at the 279th base in the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1 Culturing the cells in the presence of a candidate substance that inhibits or promotes the transcriptional activity of galectin-2, and analyzes the expression of the gene, thereby inhibiting or promoting the transcriptional activity of galectin-2 Methods for screening substances are provided.
  • a transcription unit in which a reporter gene is bound downstream of the galectin-2 gene fragment is introduced into cells, the cells are cultured, and the reporter activity is measured to express the gene.
  • said reporter gene is a luciferase gene.
  • a method for screening a galectin-2 transcription factor comprising contacting a sample in which the presence of a transcription factor is expected to be present, and detecting the binding of the fragment to the transcription factor.
  • the detection is performed by gel shift assay.
  • FIG. 1 shows the results of an experiment in which binding of LTA to galectin-1 and -2 in vitro was confirmed.
  • FIG. 2 shows the results of examining the effect of SNP of intron 1 of 3279 C> T on transcription activity in the galectin-2 gene.
  • FIG. 3 shows the results of examining the interaction between galectin-2 and microtubules.
  • a shows isolation of a protein that interacts with the TAG tag galectin-2.
  • b shows the results of experiments on co-immunoprecipitation of endogenous ⁇ -tubulin with galectin-2 or LTA tagged with Flag.
  • c shows the experimental results of co-localization of endogenous ⁇ -tubulin with endogenous galectin-2 or LTA in U937 cells.
  • FIG. 4 shows the results of examining the expression and co-localization of galectin-2 and LTA in coronary atherectomy sections.
  • a stained with anti-human LTA b stained with anti-human galectin-2
  • the galectin-1 and galectin-2 gene products are known as susceptibility gene products for inflammatory diseases such as myocardial infarction, such as lymphotoxin-alpha (LTA) (Ozaki K et al. Nature Genetics 32, 650-654, 2002) was identified as binding to the product. Furthermore, novel single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the galectin-2 gene were identified, and approximately 20
  • the galectin-1 and galectin-2 proteins were identified. Furthermore, we have identified that a novel SNP in the galectin-2 gene has a biological function and is related to diseases such as myocardial infarction. Therefore, by using the novel SNP of the galectin-2 gene identified according to the present invention, it is possible to develop a new diagnosis, prevention method and therapeutic agent for inflammatory diseases such as myocardial infarction.
  • embodiments of the present invention will be described more specifically.
  • the method of the present invention detects the occurrence of an inflammatory disease by detecting a gene polymorphism, particularly a single nucleotide polymorphism (SNPs) present in the galectin-2 gene which is associated with an inflammatory disease.
  • a gene polymorphism particularly a single nucleotide polymorphism (SNPs) present in the galectin-2 gene which is associated with an inflammatory disease.
  • SNPs single nucleotide polymorphism
  • “to detect at least one gene polymorphism (such as a single nucleotide polymorphism) present in the galect in-2 gene” means (i) directly detecting the gene polymorphism (referred to as gene-side polymorphism) And (ii) a polymorphism present on the complementary sequence side of the gene.
  • complementary polymorphism Referred to as complementary polymorphism
  • inferring the gene polymorphism from the detection result it is more preferable to directly detect the gene-side polymorphism because the base on the gene side and the base on the complementary sequence are not always in a completely complementary relationship.
  • Preferred specific examples of the gene polymorphism present in the galectin-2 gene include the C / T polymorphism at the 3279th base in the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1. be able to.
  • the 279th base in the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1 is the 3449th base in the genomic sequence of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 2. Corresponds to a base.
  • determination refers to determination of the occurrence of a disease, determination of the possibility of developing a disease (predicting the risk of morbidity), elucidation of genetic factors of a disease, and the like.
  • the “determination” of the disease can also be performed by combining the result obtained by the above-described method for detecting a single nucleotide polymorphism with another polymorphism analysis (VNTR or RFLP) and / or another detection result, if desired. .
  • the term “inflammatory disease” is not particularly limited as long as it is a disease in which induction of cell adhesion factors and cytokines known to be correlated with an inflammatory condition is recognized. Examples include rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, various allergic reactions, bacterial shock, arteriosclerotic diseases such as myocardial infarction and stroke, and particularly myocardial infarction.
  • Genome polymorphisms are preferably detected using genomic DNA, but in some cases (ie, when the sequence of the polymorphic site and its adjacent region is identical or completely complementary to the genome) c DNA, Alternatively, mRNA can also be used.
  • c DNA e.g., mRNA can also be used.
  • the sample from which the subject is collected include any biological sample, for example, body fluids such as blood, bone marrow fluid, semen, peritoneal fluid, and urine; tissue cells such as liver; and body hair such as hair. Genomic DNA and the like can be extracted, purified, and prepared from these samples according to a conventional method.
  • a portion containing the gene polymorphism is first amplified.
  • the amplification is performed, for example, by the PCR method, but may be performed by other known amplification methods, for example, the NASBA method, the LCR method, the SDA method, the LAMP method, or the like.
  • the selection of the primer may be performed, for example, in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3), at least 10 or more continuous nucleotides including the single nucleotide polymorphism site, preferably 10 to 100 nucleotides, More preferably, it is performed so as to amplify a sequence of 10 to 50 bases and Z or its complementary sequence.
  • the primer can function as a primer for amplifying a sequence having a predetermined number of bases including the single nucleotide polymorphism site, one or more substitutions, deletions, It may also contain a sticky rice cake.
  • Primers used for amplification may be selected such that either the fore-primed primer or the reverse primer hybridizes to a single nucleotide polymorphism site so that amplification is performed only when the sample is of one allele type.
  • the primer can be labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like, if necessary.
  • the detection of a genetic polymorphism can be performed by hybridization with a probe specific to one allele.
  • the probe may be labeled by an appropriate means such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary.
  • the probe is not particularly limited as long as it contains the single nucleotide polymorphism site, hybridizes with the test sample, and gives a detectable specificity under the detection conditions employed.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • Oligonucleotides that can hybridize to a sequence of 50 bases or their complementary sequence can be used.
  • the oligonucleotide can function as a probe, that is, as long as it hybridizes under the conditions that hybridize to the sequence of the allele of interest but do not hybridize to the sequence of the other allele, Or may contain more substitutions, deletions, and additional calories.
  • a probe that satisfies the above-described probe conditions by being annealed with genomic DNA and becoming circular such as a single-stranded probe (padlock probe) used for amplification by the RCA (rolling circle am lification) method, may be used. Is included.
  • stringent conditions J include, for example, Molecular Clawing 'Laboratory Manual 2nd Edition (Sam brooketa 1., 1989). Specifically, for example, 6 XSSC (1 XSSC composition: 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 X denhardt and 10 Omg / m 1 Conditions such as incubation at 65 ° C. with a probe in a solution containing the two-sperm DNA are included.
  • the probe can be used as a DNA chip by fixing one end to a substrate. In this case, only probes corresponding to one allele type may be immobilized on the DNA chip, or probes corresponding to both allele types may be immobilized on the DNA chip. Detection of gene polymorphism, restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP:.
  • R es tri C tionfra gme ntlengthpol ymo rphismi Koyori line Ukoto may in this way, take any genotype single nucleotide polymorphic site
  • the digestion of the sample nucleic acid with the restriction enzyme which differs depending on whether or not the sample is cleaved by the restriction enzyme, determines whether the sample nucleic acid has been cleaved by the restriction enzyme by examining the size of the digested fragments. And analyze the polymorphism of the sample accordingly.
  • the detection of the gene polymorphism may be performed by directly sequencing the amplified product (direct sequencing method).
  • the sequencing can be performed by a known method such as the dideoxy method or the MaXam-Gi1b ert method.
  • Detection of gene polymorphisms is also performed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP), PCR (allele-specific PCR), hybridization method using ASO (allele-specific oligonucleotide), chemical cleavage of mismatches (CCM), HET (neteroduplex method), PEX (primer extension), An RCA (rolling circle amplification) method or the like can be used.
  • DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
  • SSCP single-strand conformation polymorphism analysis
  • PCR allele-specific PCR
  • hybridization method using ASO allele-specific oligonucleotide
  • CCM chemical cleavage of mismatches
  • HET neteroduplex method
  • PEX primer extension
  • An RCA rolling circle amplification
  • the oligonucleotide as the primer or the probe can be provided as a kit for diagnosing an inflammatory disease containing the same.
  • the kit includes a restriction enzyme, a polymerase, a nucleoside triphosphate, a label, and a buffer, which are used in the method for analyzing the polymorphism described above. Contains liquids, etc. May be.
  • the expression state of galectin-2 can be analyzed by detecting the aforementioned single nucleotide polymorphism.
  • the expression level of galectin-2 Is low.
  • the base at position 3279 of the base sequence of intron 1 of the galectin-2 gene shown in SEQ ID NO: 1 is C (galectin-2 intron 13279C)
  • the expression level of galectin-2 is high.
  • treatment of an inflammatory disease is performed by analyzing the expression level of the galectin-2 gene or galectin-1 gene in the cell in the presence of a candidate substance and selecting a substance that changes the expression level.
  • Drugs can be screened.
  • the expression level of the galectin-2 gene or galectin-1 gene in the cell can be determined in the presence of a target substance, and a substance that increases or decreases the expression level can be selected. Substances that increase the amount can be selected.
  • lymphotoxin-a LTA
  • the galectin-2 gene product or galectin-1 gene product in the presence of a candidate substance, and selecting a substance that inhibits the binding, Therapeutic agents for inflammatory diseases can be screened.
  • Examples of the above screening include a step of contacting a cell with a candidate substance, a step of analyzing the expression level of the galectin-2 gene or galectin-1 gene in the cell, and a comparison with conditions in the absence of the candidate substance. And selecting a candidate substance that changes the expression level of the gene as a therapeutic agent for an inflammatory disease.
  • the type of candidate substance is not particularly limited, and may be an individual low-molecular-weight synthetic compound, a compound present in a natural product extract, or a compound library, a phage display library, or a combinatorial library.
  • the candidate substance is preferably a low molecular compound. Therefore, a compound library of low molecular weight compounds is preferred. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • the transcription activity of galectin-2 is measured by introducing the galectin-2 gene fragment containing the single nucleotide polymorphism into cells, culturing the cells, and analyzing the expression of the gene. be able to.
  • a transcription unit obtained by binding a reporter gene to the downstream of the galectin-2 gene fragment is introduced into a cell, the cell is cultured, and the reporter activity is measured to express the gene. To analyze.
  • a single nucleotide polymorphism when a single nucleotide polymorphism is present at the promoter site, cells into which a reporter gene-introduced system has been introduced downstream of the gene containing the single nucleotide polymorphism can be cultured, and the reporter activity measured. The difference in transcription efficiency due to single nucleotide polymorphism can be measured.
  • the reporter gene genes such as luciferase, chloramphenicol, acetyltransferase, and galactosidase are used.
  • the galectin-2 gene fragment containing the single nucleotide polymorphism is introduced into a cell, and the transcriptional activity of galectin-2 is increased.
  • a substance that inhibits or promotes galectin-2 transcription activity can be screened by analyzing the expression of the gene.
  • a transcription unit in which a reporter gene is bound downstream of the galectin-2 gene fragment is introduced into a cell, the cell is cultured, and the reporter activity is measured to express the gene. To analyze.
  • a system was introduced in which a reporter gene was inserted downstream of a gene having a single nucleotide polymorphism (eg, galectin-2 intron 13279 T) in which the expression level of galectin-2 was significantly higher.
  • a reporter gene was inserted downstream of a gene having a single nucleotide polymorphism (eg, galectin-2 intron 13279 T) in which the expression level of galectin-2 was significantly higher.
  • a reporter gene inserted downstream of a gene having a single nucleotide polymorphism (eg, galectin-2 intron 13279 T) in which the expression level of galectin-2 was significantly higher.
  • a single nucleotide polymorphism eg, galectin-2 intron 13279 T
  • the genes listed above are used. Any substance can be used as the candidate substance.
  • the kind of the catching substance is not particularly limited, and may be an individual low-molecular-weight synthetic compound, a compound present in a natural product extract, or a compound library, a phage display library, a combinatorial library. But
  • the candidate substance is preferably a low molecular compound, and a compound library of low molecular compounds is preferred. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • Substances which inhibit or promote the transcription activity of galectin-2 obtained by the above-mentioned screening method are also within the scope of the present invention. Such a substance that inhibits or promotes the transcriptional activity of galectin-2 is useful as a candidate substance for various drugs such as a therapeutic agent for myocardial infarction, an anti-inflammatory agent, and an immunosuppressant.
  • the above-described gene fragment containing a single nucleotide polymorphism is brought into contact with a sample in which the presence of a galectin-2 transcription factor is expected to be detected, and the binding between the fragment and the transcription factor is detected.
  • transcription factors for galectin-2 can be screened. Detection of the binding between the gene fragment containing the single nucleotide polymorphism and a substance that is expected to contain a galectin- 2 transcription factor is determined by a gel shift method (electrophoretic mobility shift assay: EMSA). ), DNase I footprint, etc., but the gel shift method is preferred.
  • the gel shift method the protein (transcription factor) binds, the mobility of DNA in the electrophoresis molecular size is increased is reduced, 3 2 ze mixed labeled gene fragment and transcription factors in P, gel Apply to electrophoresis. Looking at the position of the DNA by autoradiography, the DNA to which the factor is attached moves slowly, and is detected as a band that moves later than the normal band.
  • the test was performed using a BacterioMach TM Two Hybrid System construction kit (manufactured by Stratagene). Cultured human coronary artery vascular smooth muscle cells (HCASMC) for library generation were purchased from BioWhittaker. 1 X 1 0 7 or by cells Ri FastTrack 2. 0 kit (invitrogen, Inc.) was used to prepare the mR NA, using HCASMC mR NA of 5 g, to prepare a c D NA library according to the attached protocol, attached Two-hybrid screening was performed according to the protocol.
  • HCASMC human coronary artery vascular smooth muscle cells
  • recombinants were prepared using pET28 vector system (Novagen) for the entire length, and expressed and purified in Escherichia coli according to the attached protocol.
  • LTA was prepared using the pET29 system (Novagen).
  • Anti-LTA antibody R & D system was cross-linked to Hi Trap NHS-activated HP sepharose (Amersham) according to the attached protocol.
  • LTA was added to the pFLAG-CMV-5a vector (Cosmo Vio), and pCMV-Myc vector (Clontech) ) was transfected with galectin-2 as a recombinant, and transfection was performed on C0S7 cells using FuGene reagent (Kuchish). 36 After 6 hours, collect the cells and extract with a cell protein extraction buffer [10 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0.5%
  • NP-40 extract the protein, and then use this extract to suppress non-specific adsorption. Then, 50 ⁇ l of protein A sepharose (Amersham) was added thereto, stirred for 1 hour, centrifuged at 1600 rpm for 10 minutes, and the supernatant was used as a sample for immunoprecipitation. Add anti-LTA antibody (5) to the sample, stir at 17 ° C for 1 hour, add protein A sepharose 50 ⁇ 1 and stir at 17 for 1 hour, centrifuge at 1,600 rpm for 10 minutes, and wash the precipitate with wash buffer. Samples were washed three times with [lOraM Tris / HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% NP-40]. After SDS-PAGE, the cells were transferred to a nitrocellulose membrane, and signals were detected with an anti-Myc-tag antibody (SANTA CRUZ) and an anti-FLAG-tag antibody (SIGMA).
  • SANTA CRUZ anti-Myc-tag antibody
  • the region containing the intron 1 3279 C or T SNP from 3188 to 3404 of the galectin-2 gene was amplified by PCR using genomic DNA as type I, and cloned downstream of the galectin-2 promoter-pGL3-enhancer vector of Noreciferase. . 2 ⁇ g of these plasmids and 10 Omg of pRL-TK vector (promega; an internal standard vector for adjusting transfection efficiency) were transferred to HeLa cells (Human Science Research Resource Bank, JCRB 9004) and Hep G2 cells were transfected using FuGene reagent. After 24 hours, cells were collected and luciferase activity was measured.
  • a fusion cassette encoding His tag, TEV cleavage site, and Stag as a TAPtag sequence was constructed in pCMV-Myc vector (Sigma).
  • This TAP vector contains the carboxy-terminal TAP tag and the amino-terminal Myc in mammalian cells under the control of the cytomegalovirus promoter. Expresses the tagged target protein.
  • the TAP vector was transiently transfected into HeLa cells (Human Science Research Resource Bank, J CRB 9004). The target protein band was analyzed using the MALDI / TOF mass spectrum analyzer of APRO Life Science.
  • a co-immunoprecipitation experiment was performed using endogenous tubulin and galectin-2 or LTA tagged with Flag as follows. LTA tagged with Flag or S, galectin-2, and lacZ (negative control) were transfected into HeLa cells using Fugene. Immunoprecipitation was performed in lysis buffer (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Nonident P-40). Twenty-four hours after transfection, cells were lysed and immunoprecipitation was performed using anti-Flag tag M2 agarose (Sigma). HRP-bound S-protein
  • the immune complexes were visualized using anti-Flag M2 peroxidase conjugate (Sigma) or a mouse monoclonal antibody against human ⁇ -tubulin (Molecular Probes), and an anti-HRP conjugated anti-mouse IgG antibody.
  • a polyclonal anti-human galectin-2 antiserum was made in egrets using a recombinant protein synthesized in E. coli. This antiserum did not show cross-reactivity with galectin-l and galectin-3 having similar structures by Western blot analysis.
  • Polyclonal anti-galectin-2 antiserum, goat anti-human LTA IgG (R & D System) or mouse anti-human ⁇ -tubulin monoclonal IgM antibody was used with Alexa secondary antibody (Molecular Probes).
  • U937 cells Human Science Research Resource Punk, J CRB 9021
  • PMA phorbol myristate acetate
  • Tissue samples were obtained by directional coronary atherectomy from 16 patients with myocardial infarction. Immunohistochemical analysis was performed using goat anti-human LTA IgG (R & D Systems) and heron polyclonal. A report using a single nanoliter anti-human galectin-2 antibody (Minami, M et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21, 1796-1800 (2001); and Shi, SR, et al., Hum. Mutat. 15, 7-12 (2000)). Staining of adjacent sections was performed using a human cell type-specific monoclonal antibody (DAK0) against SMC-2 actin and CD68.
  • DAK0 human cell type-specific monoclonal antibody
  • sections were first incubated with anti-LTA antibody, then incubated with piotinylated porcine anti-goat IgG, and with avidin-biotin-peroxidase complex, and 3,3,1-diamino Visualization was performed using benzidine tetrahydrochloride (Vector Labs). The sections were then incubated with egret polyclonal anti-human galectin-2 antibody, and incubated with alkaline phosphatase-conjugated porcine anti-egg IgG, to give 5-bromo-14-chloro-3-indoxyl phosphate and nitrobu ⁇ /-1. Visualization was performed using a tetrazolium chloride (BC IP / NB T) substrate system.
  • BC IP / NB T tetrazolium chloride
  • galectin-1 was identified as a binding protein of LTA from two hybrid-library derived from vascular smooth muscle cells using E. coli two hybrid-system.
  • galectin-1 T7 tag attached to the N-terminal side
  • LTA LTA
  • Glectin-1 was detected by Western blotting using an anti-T7 antibody (Fig. 1a).
  • galectin-1 was immunoprecipitated using anti-LTA antibody Sepharose (negative control).
  • galectin-1 and LTA were incubated and the complex was immunoprecipitated using anti-LTA antibody Sepharose.
  • 100 ng of recombinant galectin-1 was used as a positive control.
  • the asterisks indicate the immunoglobulin (Ig) heavy and light chains in the anti-LTA antibody Sepharose. Non-specific bands derived are shown.
  • Recombinant proteins were also prepared from Escherichia coli for galectin-2 and 1-3, which have a high homology to galectin-1, and binding to LTA was confirmed using the same method.Galectin-2 also binds to LTA. (Fig. 1b).
  • Galectin co-precipitated with LTA was detected by Western blot analysis using an anti-T7tag monoclonal antibody and a horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG.
  • galectin-3 and LTA were incubated, and immunoprecipitation was performed using anti-LTA antibody Sepharose.
  • galectin-2 and LTA were incubated and the complex was immunoprecipitated using anti-LTA antibody Sepharose.
  • galectin-2 was immunoprecipitated using anti-LTA antibody Sepharose (negative control).
  • galectin-3 (lane 4) or galectin-2 (lane 5) was used as a positive control.
  • the asterisks indicate non-specific bands from the immunoglobulin (Ig) heavy and light chains in the anti-LTA antibody Sepharose.
  • FIG. 1C shows the results of co-immunoprecipitation of LTA and galectin-2 using an anti-LTA antibody.
  • LTA horseradish rust peroxidase conjugate
  • Galectin-1 was found to bind to LTA, suggesting that a change in the function of these gene products could be linked to a change in LTA function, which might be related to susceptibility to myocardial infarction.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • nucleotide sequence around the novel SNP at the 3279th OT of intron 1 of the galectin-2 gene newly identified this time (SEQ ID NO: 3, where Y represents C or T in SEQ ID NO: 3) is shown below.
  • [C / T] indicates the SNP of 3279th C> T of intron1.
  • CTGCGCCTTTGACTCTGTT and TCTTTGTCAGTGAGAGACTG indicate PCR primer
  • underlined CCTATCCTGGCCTGACTGTT indicate sequence primers.
  • the reporter gene Atsushi (Luciferase Atsee) was used.
  • Galectin A DNA fragment consisting of up to 3404 nucleotides of intron 1 188 of the two genes, and cloning in the direction 5 to 3 downstream of the SV40 enhancer in the pGL 3—enhancer vector.
  • a reporter vector was prepared. These reporter vectors were transfected into HeLa cells and HepG2 cells, and 24 hours later, the / luciferase activity was measured using a Dual-Lucif erase Reporter Assay System (Promega). The results are shown in FIG. 2 (left figure shows the results with HeLa cells, right figure shows the results with HepG2 cells).
  • galectin-2 and ⁇ -tubulin were co-localized as a reticulated filament network developed in the cytoplasm (FIG. 3c;). This result indicates that galectin-2 may be involved in intracellular transport.
  • galectin-2 is expressed in myocardial infarction injury (ie, atherosclerotic damage to coronary arteries) and, if so, to determine the site of expression, anti-LTA or anti-LTA Immunohistochemical staining analysis was performed on coronary atherectomy samples using the galeci; in-2 antibody. As shown in Figures 4a and b, immunoreactivity for LTA and galectin-2 was detected in the intimal cells of atherosclerotic plaques, some of which were spindle-shaped or limited vacuolated rounds. It was cytoplasmic.
  • a novel single nucleotide polymorphism that is involved in the development of inflammatory diseases such as myocardial infarction has been newly identified.
  • SNP single nucleotide polymorphism

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Abstract

本発明の目的は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することである。本発明によれば、galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

Description

明細書
galectin-2遺伝子内一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 技術分野
本発明は、 galectin- 2 (ガレクチン一 2 ) 遺伝子に存在する遺伝子多型を検出す ることを含む炎症性疾患の診断方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該 オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。 背景技術
ライフスタイルの変化及ぴ新しい薬理学的アブローチにも関わらず、 心筋梗塞を 含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている （Breslow, J. L. , Nature Med. 3, 600 - 601， 1997 ;Braunwald， E. , N. Engl. J. Med. , 337, 1360- 1369, 1997)。 従って、 それらの発症における遺伝的及び環境的因子を同定す ることが強く望まれている。
共通の遺伝的変異は、 糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕 著に関連していることが知られている （Risch， N. , et al. , Science, 273,
1516 - 1517， 1996； Collins, F. S. , et al. , Science, 278, 1580-1581, 1997； Lander,
E. S. , et al. , Science, 274, 536-539, 1996)。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を 同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析で は、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マ-カ （主としてマイク口サテライト）の座位が連鎖してい るかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では 特定の遺伝マーカー （主として一塩基多型： S N P ) のどの型 （アレル：対立遺伝 子） が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。 従 つて、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対す る連鎖解析のよりもずつと強力といえる。 一塩基多型 （S N P s ) は、疾患易罹患 性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。 S N
P sは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、 ある疾患や薬剤による重篤な 副作用に対する危険性を増やすことがある。 よって、多くの S N P sを探索するこ とにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄 与できることを期待される。
遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、 これまでヒトプロスタサイクリン合 成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（特開 2 0 0 2 - 1 3 6 2 9 1号公報） などがある。 しかしながら、 心筋梗塞と関連のある遺伝 子変異の解明は未だ十分なものではない。
一方、 現在までの所、 哺乳類には 1 0種類のガレクチンが知られている。 そのう ちの galectin - 2は galectin - 1に対して 4 3 %と高い相同性を示す。 galectin - 2 は galectin- 1 と同様、 1 4 k D aのサブュニット 2つからなる非共有結合性の二 量体を形成し、 還元剤非存在下では自己凝集し、 活性を失う。 また、 galectin - 2 は galectin - 1と比較して組織分布は狭レ、。 galectin - 1の場合、 筋肉等の間充組織 をはじめ様々な細胞系列に豊富に存在するが、 galectin- 2 は正常成人組織の中で は下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められる。 galectin - 2 の詳細な機能につ て fまま 角军明されてレヽなレヽ （Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 9， No. 45, (1997) pp. 87- 93)。 発明の開示
本発明は、 心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型 ( S N P ) を同定することを解決すべき課題とした。 さらに本発明は、 同定した S N P を利用して、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法 を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 galectin-l および galectin- 2遺伝子産物が心筋梗塞感受性遺伝子産物 lymphotoxin- alpha ( L T A) に結合すること、 並びに galectin-2遺伝子内の新規一塩基多型 （S N P ) が心筋 梗塞の発症進展に関連していることを同定することにより本発明を完成するに至 つた o
即ち、 本発明によれば、 galectin- 2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子 多型を検出することを含む、 炎症性疾患の判定方法が提供される。 好ましくは、 galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出 することを含む、 炎症性疾患の判定方法が提供される。
さらに好ましくは、 配列番号 1に示す galectin - 2遺伝子のィントロン 1の塩基 配列において 3 2 7 9番目の塩基における CZTの多型を検出することを含む、炎 症性疾患の判定方法が提供される。
好ましくは、 炎症 1"生疾患は心筋梗塞である。
本発明の別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基を含む連続する少なくとも 1 0塩基の 配列、又はその相補配列にハイプリダイズすることができ、請求項 1から 4の何れ かに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。 本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin - 2遺伝子のィン トロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基を含む連続する少なくとも 1 0 塩基の配列、及ぴ Z又はその相捕配列を増幅することができ、請求項 1から 4の何 れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供さ れる。
好ましくは、 プライマーはフォワードプライマー及び/又はリバースプライマー である。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記のいずれかに記載のォリゴヌクレチドの 1種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。好ましくは、炎症性疾患 は心筋梗塞である。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィン トロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基における CZTの多型を検出す ることを含む、 galectin-2の発現状態の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 候捕物質の存在下で細胞内の galectin - 2遺 伝子又は galectin - 1遺伝子の発現量を分析し、 その発現量を変化させる物質を選 択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。好ま しくは、候補物質の存在下で細胞内の galectin- 2遺伝子又は galectin- 1遺伝子の 発現量を分析し、その発現量を増大させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患 の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 候補物質の存在下でリンホトキシン - a ( L T A) と galectin - 2遺伝子産物又は galectin - 1遺伝子産物との結合を測定し、該 結合を阻害する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング 方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin - 2遺伝子のィン トロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基における C Z Tの多型を含む galectin-2遺伝子断片を細胞に導入し、 該細胞を培養し、 該遺伝子の発現を分析 することを含む、 galectin-2の転写活性の測定方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィン トロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基における C Z Tの多型を含む galectin- 2遺伝子断片を細胞に導入し、 galectin- 2の転写活性を阻害又は促進す る候補物質の存在下で該細胞を培養し、 該遺伝子の発現を分析することを含む、 galectin-2 の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法が提供され る。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記のスクリ一ユング方法により得られる galectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質が提供される。
本発明の方法で好ましくは、 前記 galectin-2遺伝子断片の下流にリポーター遺 伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、 リポーター活性 を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。 さらに好ましくは、前記リポ 一ター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
本発明のさらに別の側面によれば、 配列番号 1に示す galectin - 2遺伝子のィン トロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩基における C Z Tの多型を含む galectin-2遺伝子断片と galectin- 2の転写制御因子の存在が予想される試料とを 接触させ、 上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、 galectin - 2 の転写制御因子のスクリ一二ング方法が提供される。好ましくは、検出はゲルシフ トアツセィにより行われる。 図面の簡単な説明
図 1は、 L T Aと galectin- 1及ぴ- 2とのインビトロでの結合を確認した実験の 結果を示す。
図 2は、 galectin- 2遺伝子のイントロン 1の 3 2 7 9 C > Tの S N Pが転写活 性に与える影響を調べた結果を示す。
図 3は、 galectin - 2と微小管との相互作用を調べた結果を示す。 aは T A Pの タグの galectin- 2と相互作用タンパク質の単離を示す。 bは、 内因性 α—チュー ブリンと Flagのタグのついた galectin - 2又は LTAとの共免疫沈降の実験結果を示 す。 cは、 U937細胞における内因性 α—チューブリンと内因性 galectin-2又は LTA との共局在の実験結果を示す。
図 4は、 冠状動脈粥腫切除切片における galectin- 2と LTAの発現及び共局在を 調べた結果を示す。 aは抗ヒト LTAで染色、 bは抗ヒト galectin - 2で染色、 cは モノクロ一ナル抗 S M C α—ァクチンで染色、 dはモノクロ一ナル抗 CD68で染色 した。 eは、抗 LTA抗体及ぴ抗 galectin - 2抗体で二重染色した。 f は、抗ヒト LTA で染色した。 発明を実施するための最良の形態
本発明では、 galectin- 1および galectin- 2遺伝子産物が心筋梗塞等の炎症性疾 患感受性遺伝子産物として知られている lymphotoxin- alpha ( L T A) (Ozaki K et al. Nature Genetics 32， 650-654, 2002) 産物と結合することを同定した。 さら に、 galectin- 2遺伝子内の新規一塩基多型 （S N P ) を同定し、 それぞれ約 2 0
0 0人の心筋梗塞患者群とコントロール群について P C R— D NAシークェンス 法によりタイピングし、相関角旱析 （カイ二乗検定など） を行った結果、 この新規 S
N Pの頻度が統計学的に有意に心筋梗塞患者で少ないことを見出した。さらにルシ フェラーゼァッセィ法を用いた実験により、この新規 S N Pが実際に生物学的機能 を有し、 この galectin-2遺伝子産物量の変化が心筋梗塞に限らず様々な炎症性疾 患を引き起こすことを明らかにした。
上記の通り、 本発明では、 L T Aタンパク質に結合する新たな分子として galectin- 1および galectin- 2タンパク質を同定した。 さらに galectin- 2遺伝子 内の新規 S N Pが生物学的な機能を有し、心筋梗塞等の疾患に関連することを同定 した。 従って、 本発明により同定された galectin- 2遺伝子の新規 S N Pを利用す ることにより、 心筋梗塞等の炎症性疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可 能になる。 以下、 本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
[ 1 ] 炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、 炎症性疾患と関連性を示す galectin - 2遺伝子に存在する遺伝 子多型、 特には一塩基多型 （S N P s ) を検出することによって、 炎症性疾患の発 症の有無、 あるいは炎症"生疾患の発症の可能性を判定する方法である。
本発明において 「galect in - 2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型 （一 塩基多型など） を検出する」 とは、 （i ) 当該遺伝子多型 （遺伝子側多型と称する） を直接検出すること、及ぴ（i i )前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型
(相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定すること の双方を指すものとする。 ただし、遺伝子側の塩基と相捕配列側の塩基とが完全に 相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出するこ とがより好ましい。
galectin- 2遺伝子に存在する遺伝子多型の好ましい具体例としては、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列において 3 2 7 9番目の塩 基における C/Tの多型を挙げることができる。
本明細書において、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基 配列において 3 2 7 9番目の塩基は、 配列番号 2に示す galectin-2遺伝子のゲノ ム配列の 3 4 4 9番目の塩基に相当する。
例えば、 後記表 1に示すように、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィント ロン 1の塩基配列の 3 2 7 9番目の塩基が Cである場合 （galectin- 2 イントロン 1 3 2 7 9 C ) は、 炎症性疾患が発症している、 あるいは発症の可能性が高いと 判定できる。
これに対し、 配列番号 1に示す galectin-2遺伝子のィントロン 1の塩基配列の
3 2 7 9番目の塩基が Tである場合 （galectin- 2イントロン 1 3 2 7 9 T) は、 炎症性疾患が発症していない、 あるいは発症の可能性 低レヽと判定できる。
本明細書において、 疾患の 「判定」 とは疾患発症の有無の判断、 疾患発症の可能 性の判断 （罹患危険性の予想） 、 疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
また、 疾患の 「判定」 は、 上記の一塩基多型の検出法による結果と、 所望により 他の多型分析（VN T Rや R F L P )及び/又は他の検查結果と合わせて行うこと もできる。
また、 本明細書において、 「炎症性疾患」 とは、 炎症性病態との相関が知られて いる細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はさ れないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマト一デス、炎症性腸炎、種々の アレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが 挙げられ、 特には心筋梗塞が挙げられる。
(検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、 ゲノム D NAが好ましいが、 場合によっては （つま り多型部位及ぴその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になってい る場合） c D NA、 又は mR N Aを使用することもできる。 また、 上記対象を採取 する試料としては、 任意の生物学的試料、 例えば血液、 骨髄液、 精液、 腹腔液、 尿 等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。 ゲノム D NA等は、 これらの試料より常法に従い抽出、 精製し、 調製することができる。
(増幅)
遺伝子多型を検出するにあたっては、 まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。 増 幅は、例えば P C R法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えば NA S B A法、 L C R法、 S D A法、 L AMP法等で行ってもよレヽ。
プライマーの選択は、 例えば、 配列番号 1 (又は配列番号 3 ) に示される配列に おける、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも 1 0塩基以上、好ましく は 1 0〜 1 0 0塩基、 より好ましくは 1 0〜 5 0塩基の配列、及び Z又はその相補 配列を増幅するように行う。
プライマーは、 前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するための プライマーとして機能し得る限り、その配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、 付カ卩を含んでいてもよい。
増幅のために用いるプライマーは、 試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅さ れるようにフォヮ一ドプライマ一又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部 位にハイプリダイズするように選択してもよレ、。プライマーは必要に応じて蛍光物 質や放射性物質等により標識することができる。
(遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、 一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダィゼ ーシヨンにより行うことができる。 プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性 物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を 含み、被検試料とハイブリダィズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異 性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号 1
(又は配列番号 3 )に示す配列における前記の一塩基多型部位を含む連続する少な くとも 10塩基以上、好ましくは 10〜100塩基の配列、 より好ましくは 10〜
50塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴ ヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心 部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌタレ ォチドは、 プローブとして機能し得る限り、即ち、 目的の対立遺伝子型の配列とハ イブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下で ハイブリダィズする限り、その配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、付カロを 含んでいてもよい。 また、 プローブには、 RCA (r o l l i n g c i r c l e am l i f i c a t i o n)法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロ ックプローブ） のように、 ゲノム DNAとァニールし、環状になることによって上 記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
本発明に用いるハイブリダィゼーシヨン条件は、 対立遺伝子型を区別するのに十 分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズする
1S 他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズしないような条件、例えばストリ ンジェントな条件である。 ここで、 「ストリンジェントな条件 J としては、例えば、 例えば、 モレキュラークローユング'ァ ·ラボラトリーマニュアル第 2版 （S am b r o o k e t a 1., 1989) に記載の条件等が挙げられる。 具体的に は、 例えば、 6 X S S C ( 1 X S S Cの組成： 0. 15M Na C l、 0. 015 Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0)、 0. 5%SDS、 5 Xデンハート及び 10 Omg/m 1二シン精子 DN Aを含む溶液中プローブとともに 65 °Cでー晚保温 するという条件等が挙げられる。
プローブは、 一端を基板に固定して DNAチップとして用いることもできる。 こ の場合、 DNAチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定され ていても、 両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。 遺伝子多型の検出は、 制限酵素断片長多型分析法 （RFLP : Re s t r i C t i o n f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r p h i s m iこより行 うこともできる。 この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるか.によ つて制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化 し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断され たか否かを調べ、 それによつて試料の多型を分析する。
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによつて行つてもよい（ダ ィレクトシークェンシング法) 。配列決定は、例えばジデォキシ法、 Ma X a m- G i 1 b e r t法等の公知の方法により行うことができる。
遺伝子多型の検出はまた、 変性勾配ゲル電気泳動法 （DGGE ： denaturing gradient gel electrophoresis)、一本鎖コンフオメーション多型解析（ S S C P ： single strand conformation polymorpnism) 、
Figure imgf000010_0001
P C R (allele- specific PCR) 、 A S O (allele - specific oligonucleotide) によるハイブリダ ィーゼーション法、 ミスマッチ部位の化学的切断 (CCM： chemical cleavage of mismatches) 、 HE T (neteroduplex method) 法、 P E X (primer extension) 法、 RCA (rolling circle amplification) 法等を用いることができる。
[2] 炎症 ¾ί疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、 これを含む炎症 疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用さ れる制限酵素、 ポリメラーゼ、 ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでい てもよい。
[ 3 ] galectin-2の発現状態の分析方法
本発明によればまた、 前記した一塩基多型を検出することによって、 galectin-2 の発現状態を分析することができる。
例えば、 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 3 2 7 9番目の塩基が Cである場合 （galectin - 2 イントロン 1 3 2 7 9 C ) は、 galectin-2 の発現量が低いと判断できる。 これに対し、 配列番号 1に示す galectin-2遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 3 2 7 9番目の塩基が Tである場 合 （galectin- 2 イントロン 1 3 2 7 9 T) である場合は、 galectin - 2 の発現 量が高いと判断できる。
[ 4 ] 炎症性疾患の治療薬のスクリ一二ング方法
本発明によれば、 候補物質の存在下で細胞内の galectin- 2 遺伝子又は galectin- 1遺伝子の発現量を分析し、 その発現量を変化させる物質を選択するこ とによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、候 捕物質の存在下で細胞内の galectin- 2遺伝子又は galectin- 1遺伝子の発現量を分 祈し、その発現量を増大又は減少させる物質を選択することができ、特に好ましく はその発現量を増大させる物質を選択することができる。 さらに本発明によれば、 候補物質の存在下でリンホトキシン - a ( L T A) と galectin-2遺伝子産物又は galectin- 1遺伝子産物との結合を測定し、 該結合を阻害する物質を選択すること によって、 炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニングの一例としては、 細胞と候補物質とを接触させる工程、 細胞 内における galectin- 2遺伝子又は galectin- 1遺伝子の発現量を分析する工程、及 ぴ候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を変化させる候補物 質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。 候補物質の種類は特に限 定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物 でもよく、 あるいは化合物ライブラリー、 ファージディスプレーライブラリー、 コ ンビナトリアルライブラリ一でもよレ、。候補物質は、好ましくは低分子化合物であ り、低分子化合物の化合物ライブラリ一が好ましい。化合物ライブラリ一の構築は 当業者に公知であり、 また市販の化合物ライブラリ一を使用することもできる。
[ 5 ] galectin-2の転写活性の測定方法
本発明によればまた、 前記した一塩基多型を含む galectin- 2遺伝子断片を細胞 に導入し、 該細胞を培養し、 該遺伝子の発現を分析することによって galectin-2 の転写活性を測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、 前記 galectin-2遺伝子断片の下流にリポータ 一遺伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、 リポーター 活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、 一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、 その一塩基多型を含 む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を揷入した系を導入した細胞を培養し、レポ一 ター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。 ここでリポーター遣伝子としては、 ルシフェラーゼ、 クロラムフエ二コール、 ァ セチルトランスフェラーゼ、 ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
[ 6 ] galectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリ一ユング方法 本発明においては、 前記した一塩基多型を含む galectin- 2遺伝子断片を細胞に 導入し、 galectin- 2 の転写活性を阻害又は促進する候捕物質の存在下で該細胞を 培養し、 該遺伝子の発現を分析することによって galectin- 2転写活性を阻害又は 促進する物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、 前記 galectin- 2遺伝子断片の下流にリポータ 一遺伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、 リポーター 活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、 galectin - 2の発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば、 galectin-2 イントロン 1 3 2 7 9 T) を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝 子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合に ついて培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、 その候補物質は galectin- 2転写活性阻害物質として選択することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、 上記に挙げた遺伝子が用いられる。 候補物質としては任意の物質を使用することができる。 候捕物質の種類は特に限 定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物 でもよく、 あるいは化合物ライブラリー、 ファージディスプレーライプラリー、 コ ンビナトリアルライブラリーでもよレ、。候補物質は、好ましくは低分子化合物であ り、低分子化合物の化合物ライブラリ一が好ましレ、。化合物ライプラリ一の構築は 当業者に公知であり、 また市販の化合物ライブラリ一を使用することもできる。 上記のスクリ一二ング法により得られる galectin - 2の転写活性を阻害又は促進す る物質もまた本発明の範囲内である。このような galectin- 2の転写活性を阻害又は 促進する物質は、 心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物 質として有用である。
[ 7 ] galectin- 2の転写制御因子のスクリ一ユング方法
本発明においてはまた、 前記した一塩基多型を含む遺伝子断片と galectin- 2の 転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結 合を検出することによって、 galectin- 2 の転写制御因子をスクリーニングするこ ともできる。 前記の一塩基多型を含む遺伝子断片と galectin -2の転写制御因子の 存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解 析： electrop oretic mobility shift assay, EMSA) 、DNase I フットプリント 等によって行うことがきるが、 ゲルシフト法が好ましい。 ゲルシフト法では、 タン パク質（転写制御因子） が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動における D N Aの移動度が低下するので、 3 2 Pで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混 ぜ、 ゲル電気泳動にかける。 オートラジオグラフィ一で D N Aの位置を見ると、 因 子の結合した D NAはゆつくり動くので、通常のパンドよりも遅れて移動するバン ドとして検出される。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。 実施例
(A) 方法 ·材料 ( 1 ) E. coli two hybrid system
BacterioMach™ Two Hybrid System construction kit (Stratagene社製)を用レヽ て行った。ライブラリ一作製のための培養ヒト冠状動脈血管平滑筋細胞 (HCASMC)は、 BioWhittaker 社よ り購入した。 1 X 1 0 7個の細胞よ り FastTrack 2. 0 kit (invitrogen社）を用いて mR NAを調製し、 5 gの HCASMC mR NAを用い、 添付プロトコールに従って c D NAライブラリーを作製し、添付プロトコールに従 つて Two-hybridスクリ一二ングを施行した。
( 2 ) リコンビナント galectin- 1、 -2、 - 3及ぴ L T Aの作製、 免疫沈降による L T Aと galectinの結合確認
galectin- 1、 -2、 -3は、 全長を pET 28 vector system (Novagen社）で組み換え 体を作製し、添付プロトコールに従って大腸菌で発現、精製した。 また、 L T Aは pET29 system (Novagen社）により作製した。抗 L T A抗体（R&D system社）は Hi Trap NHS- activated HP sepharose (Amersham社） に添付プロトコールに従って架橋した
(抗 L T A抗体セファロース）。 L T A - galectin の結合実験は、 lOmlbinding buffer [lOmM Tris/HCl (pH7. 5) , 150mM NaCl] 中に 5 gの galectin- 1あるいは galectin- 2あるいは galectin- 3を加え、 さらに 1時間攪拌した。 1 6 0 0回転で
1 0分間遠心し、 上清を捨て、 沈殿を wash buffer [10mM Tris/HCl (pH7. 5) , 150mM NaCl, 0. 1% NP-40]で 3回洗浄し、 5 0 l の 5 X SDS- sample buffer (125mM Tris/HCl, % SDS, 20% glycerol, 10% beta-mercaptoethanol, 0. 04% bromophenol blue, pH6. 8)で溶解しサンプルとした。
S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動後、 ニトロセルロース膜に移し、 抗 T 7 抗体（Novagen社）を用いて、 E C L法（Amersham社）によりシグナルを検出した。
C0S7細胞（Riken cell bank)を用いた強制発現系による LTAと galectin - 2の相互 作用（結合）の確認では、 pFLAG- CMV- 5a vector (コスモバイォ社）に L T Aを、 pCMV-Myc vector (Clontech社）に galectin- 2を組み換え体として導入し、 C0S7細 胞に FuGene reagent (口ッシュ社）を用いてトランスフエクシヨンした。 3 6時間後 の細胞を回収、細胞タンパク抽出パッファ [10mM Tris/HCl, 150mM NaCl, 0. 5%
NP-40]によりタンパクを抽出した後、非特異的吸着を抑制するために、この抽出液 に 50μ 1の protein A sepharose (Amersham社）を加え 1時間攪拌し、 1600回転 で 10分間遠心し、上清を免疫沈降のサンプルとした。サンプルに 5 の抗 LTA抗 体を加え 17 °Cで 1時間攪拌後、 protein A sepharose 50^1を加え 17でで 1時 間攪拌し、 1 600回転で 1 0分間遠心し、 沈殿を wash buffer [lOraM Tris/HCl (pH7.5) , 150mM NaCl, 0.1% NP-40]で 3回洗浄してサンプルとした。 SDS— PA GE後、 ニトロセルロース膜に移し、 抗 My c - t a g抗体 （SANTA CRUZ社）、 抗 FLAG- t a g抗体 （SIGMA社） によりシグナルを検出した。
( 3 ) galectin-2遺伝子内 S N P sと心筋梗塞との相関解析
心筋梗塞患者とコントロール群、 その DN Aの採取方法、 DN Aのシークェンス 法、 DNAタイピング法、相関解析の統計学的手法は既報に従っている（OzakiKet al. Nature Genetics 32, 650-654, 2002)。 galectin- 1およぴ galectin- 2遺伝子 領域の SNP sは、それぞれ 16人の心筋梗塞およびコントロールからの DNAを 用いた PCRダイレク トシークェンス法により同定 ·発見した。
(4) ルシフェラーゼアツセィ法
galectin-2遺伝子の 3188力 ら 3404までの i n t r o n 1 3279 Cあるいは Tの SNPを含む領域をゲノム DNAを铸型として PCRにより増幅 し galectin— 2 promoter— pGL3— enhancerベクターのノレシフェラーセの下流にクロー ユングした。 これらのプラスミド 2 μ g及び 10 Omgの p RL— TKベクター (promega社； トランスフエクシヨン効率を合わせるための内部標準ベクター） を He L a細胞 （ヒューマンサイエンス研究資源バンク、 J CRB 9004) および H e p G 2細胞に FuGene reagentを用いてトランスフエクシヨンした。 24時間 後細胞を集め、 ルシフェラーゼ活性を測定した。
(5) タンデムアブイ二ティー精製
タンデムァフィ二ティー精製は、 Rigaut, G et al. Nature Biotechnol, 17,
1030- 1032 (1999)に記載の方法に準じて行った。 His tag、 TEV切断部位、及ぴ Stag を TAPtag配列としてコードする融合カセットを p CMV-My cベクター （シグ マ社） 中に構築した。 この TAPベクターは、サイトメガロウィルスプロモーターの 制御下で哺乳動物細胞中に、 カルボキシ末端に TAP タグを有しアミノ末端に Myc タグのついた標的タンパク質を発現する。 TAPベクターを He L a細胞 （ヒユーマ ンサイエンス研究資源バンク、 J CRB 9004)に一過性にトランスフエクショ ンした。 標的タンパク質のパンドを APRO Life Scienceの MALDI/TOF massスぺク トル測定装置により分析した。
(6) 共免疫沈降実験
内因性 一チューブリンと Flagのタグのついた galectin-2又は LTAを用いて共 免疫沈降実験を以下の通り行った。 Flag又は Sのタグのついた LTA、 galectin-2, そして lacZ (陰性対照） を HeLa細胞に Fugeneを用いてトランスフエクシヨンし た。 免疫沈降は、 溶解緩衝液 (20mMTrispH7.5, 150mMNaCl, 0.1% Nonident P-40) 中で行った。 トランスフ クシヨンの 24時間後、 細胞を溶解し、 免疫沈降を抗 -Flag tag M2 ァガロース （シグマ社） を用いて行った。 HRP結合 S-プロテイン
(Novagen) 抗- Flag M2ペルォキシダーゼ結合体 （Sigma) 又はヒ ト αチューブリ ンに対するマウスモノクローナル抗体 （Molecular Probes)、 及ぴ HRP結合抗マゥ ス IgG抗体を用いて、 免疫複合体を可視化した。
(7) 共焦点顕微鏡分析
ポリクローナル抗ヒト galectin- 2抗血清を、 大腸菌で合成した組み換えタンパ ク質を用いてゥサギで作成した。この抗血清は、ウェスタンプロット分析によれば、 構造が類似している galectin-l及ぴ galectin - 3との交差反応性を示さなかった。 ポリクローナル抗 galectin - 2抗血清、 及ぴャギ抗ヒト LTA IgG (R&D System) 又はマウス抗ヒト αチューブリンモノクローナル IgM抗体を、 Alexa 二次抗体 (Molecular Probes) と一緒に使用した。 U937細胞 （ヒューマンサイエンス研 究資源パンク、 J CRB 9021) を、 ホルボールミリステートアセテート （PM A) (20 n g/ml) で 30分間刺激し、 固定した。 その後、 3%ゥシ血清アル ブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中で対応する一次抗体、そして対応する Alexa 二次抗体と一緒にィンキュペートした。
(8) 免疫組織化学分析
組織試料は、 16名の心筋梗塞患者から方向性冠状動脈粥腫切除術により取得し た。 免疫組織化学分析は、 ャギ抗ヒト LTA IgG (R&D Systems)及ぴゥサギポリクロ 一ナノレ抗 ヒ ト galectin- 2 抗体 を用 いて既報 （ Minami, M et al. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21, 1796-1800 (2001) ；及び Shi, S. R. , et al. , Hum. Mutat. 15, 7 - 12 (2000)) の通り行った。 隣接する切片の染色は、 SMC - 2ァク チン及ぴ CD68に対するヒト細胞型特異的モノクローナル抗体 （DAK0) を用いて行 つた。 二重標識した免疫組織化学分析としては、切片を先ず抗 LTA抗体とインキュ ベートし、 それからピオチン化ブタ抗ャギ IgG、 そしてァビジン ·ピオチン ·ペル ォキシダーゼ複合体とインキュベートし、 3, 3， 一ジァミノべンジジンテトラヒ ドロクロライド （Vector Labs) で可視化した。 続いて切片をゥサギポリクローナ ル抗ヒ ト galectin-2抗体とインキュベートし、 そしてアルカリホスファターゼ結 合ブタ抗ゥサギ IgGとインキュベートし、 5—ブロモ一4一クロロー 3—インドキ シルホスフェートおよびニトロブ^/一テトラゾリゥムクロライド（BC I P/NB T) 基質系で可視化した。
(B) 結果
( 1 ) 心筋梗塞感受性遺伝子産物 L T Aに結合するタンパク質の同定（スクリー二 ング）
L T Aに結合する新規タンパクをスクリ一二ングするために E.coli two hybrid-systemを利用し血管平滑筋細胞由来 two hybrid-libraryより、 LTAの 結合候 タンパク質として galectin- 1を同定した。
(2) L T Aと galectin - 1， 2のインビトロでの結合の確認
リコンビナント galectin- 1 (T 7 t a gを N末端側に結合） 及び LTAをそれ ぞれ個別に大腸菌で発現、精製後、抗 LTA抗体架橋セファロースとこれらを反応 し、 洗浄後、 SDS— PAGEを行い、 抗 T 7抗体を用いたウェスタンプロット法 により galectin- 1を検出した （図 1 a)。
図 l aにおいて、 レーン 1では、 galectin- 1 を抗 L T A抗体セファロースを用 いて免疫沈降した （陰性コントロール)。 レーン 2では、 galectin- 1と LTAとを インキュベートし、複合体を抗 LT A抗体セファロースを用いて免疫沈降した。 レ ーン 3では、 100 n gの組換え galectin- 1を陽性コントロールとして用いた。 星印は、抗 LTA抗体セファロース中のィムノグロブリン （I g) 重鎖及ぴ軽鎖に 由来する非特異的バンドを示す。
また、 galectin - 1と高いホモロジーを有する galectin - 2および一 3についても 大腸菌よりリコンビナントプロティンを作製して、同様の手法により L T Aとの結 合を確認したところ、 galectin- 2 も L T Aと結合することが明らかとなった （図 1 b)。
図 l bでは、 LT Aと共沈降した Galectinを、 抗 T 7 t a gモノクローナル抗 体と西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合抗マウス I g Gを用いたウェスタンブロッ ト分析により検出した。 レーン 1では、 galectin— 3と L T Aとをインキュベート し、 抗 LTA抗体セファロースを用いて免疫沈降を行った。 レーン 2では、 galectin - 2 と L T Aとをインキュベートし、 複合体を抗 L T A抗体セファロース を用いて免疫沈降した。 レーン 3では、 galectin- 2 を抗 L T A抗体セファロース を用いて免疫沈降した （陰性コントロール）。 レーン 4及ぴ 5では、 l O O n gの galectin- 3 (レーン 4) 又は galectin- 2 (レーン 5) を陽性コントローノレとし て用いた。 星印は、抗 LTA抗体セファロース中のィムノグロブリン （I g) 重鎖 及び軽鎖に由来する非特異的バンドを示す。
さらに、 galectin - 2 については、 LTA Th r 26及ぴ LTA A s n 26 (Ozaki K et al. Nature Genetics 32, 650 - 654, 2002) との COS 7細胞 （サル 腎臓細胞株）への共強制発現系を用いた実験系により、その結合を培養細胞レベル でも確認した （図 1 c)。
図 1 Cは、 抗 LTA抗体を用いた LTAと galectin- 2との共免疫沈降の結果を 示す。 COS 7細胞に M y cタグ付き galectin- 2プラスミド又は F L A Gタグ付 き LTAプラスミド (Th r 26または A s n 26) をトランスフエクシヨンし、 ライセートを調製し、プロティン Aセファロースと抗 LT A抗体とを使用して免疫 沈降に供した。 LT Aと共沈した Galectin- 2を、 My c (Galectin-2) 又は FL
AG (LTA) ー抗モノクローナル抗体一西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合体を使 用したウェスタンプロット分析により検出した。 レーン 1及び 2では、 LTA 2
6 Th r (レーン 1) 又は LTA 26 A s n (レーン 2) をトランスフエク シヨンして沈降させた （LT Aの陽性コントロール）。 レーン 3では、 galectin- 2 をトランスフエクシヨンして沈降させた （galectin- 2の陽性コントロール）。 レー ン 4及ぴレーン 5では、 galectin - 2 と LTA 26 Th r (レーン 4) 又は L TA 26 A s n (レーン 5) をコトランスフエクシヨンし、 共沈降させた。 ( 3 ) galectin-2遺伝子内一塩基多型と心筋梗塞との相関
galectin- 1 おょぴー 2が L T Aと結合することが明らかとなり、 これらの遺伝 子産物の機能変化が L T Aの機能変化に結びつき、心筋梗塞の感受性に関連してい る可能性が示唆されることから、 これら遺伝子内の一塩基多型（SNP s) を新た に同定、発見し、 その SNP sを用いて、 患者、 コントロールそれぞれ約 2300 列 ίこつレヽて case-control association studyを！ ifitrした。 その結果、 galectin-2 遺伝子内 i n t r o n 1 3279番目 C >T新規 S NPの minor homozygote (TT allele)が心筋梗塞患者で有意に少ない（χ2=25. 3, Ρ = 0. 0000005 ； o d d s r a t i o = 1. 6) ことを見出した （表 1) (塩基番号は変異命名に よる ： Dunnen JT. T他、 Hum. Mutation 15, 7—12,2000)。 このこと力、ら、 galectin - 2 i n t r o n 1 3279の S NPが心筋梗塞にプロテクティブに働く因子と考 えられ、 galectin- 2の機能変化が心筋梗塞に関連している可能性が示唆された。
心筋梗塞と Galectin- 2の S N Pとの相関
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Figure imgf000020_0001
今回新たに同定した galectin- 2遺伝子の i n t r o n 1の 3 27 9番目 OTの新規 SNPの周辺の塩基配列 （配列番号 3 ：但し、 配列番号 3において Yは C又は Tを示す） を以下に示す。
5， -CCCCCCCAGCTCTAGGGACGACCACACCCCCACCCAGTTCTGCCTGTCTCTCTCTGCGCC
TTTGACTCTGTTGGGTGGGGACAAGGCTCCCGGGCCTGCACCCTCCCGCAGCTCTCAGCA
TCCCTATTTGTCCAAGTGCACCCCTGACCCTGGACTTCCGAGTGCTTCTGCCCTGCAGCA
GCCCCCACCTCTATCCTTGGGGTTTGAGCTTTGCTGTTTCAGTCAGGCAGCCCCCAGGAG
CTGCAAGGGGAGTGTGGGTGCTTCTCTTAGTCCAGGCCCAGCTCCCCTATCCTGGCCTGA
CTGTTGCAGGGCTCGGGGTGTGGGCACAGGCTGCTGGCAGGAGGCAGGGAGCCATCTCCT
GATGCTTGGTGTTAGA [C/T] GTGTGTGTGCGCAGGGCACACGTCTGTGAGTGTCTGTGT
GGCGGGCACACCTGTCTTCTGTTTCTTGTTTGAGCCCCTTTTGGACTGTCCTCACTGGAT
AACCTCATCTCCCAGAGATAATGGTCTTTGTCAGTGAGAGACTGATTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTGAGACGGAGTCT-3，
[C/T] は、 i n t r o n 1の 3 2 7 9番目 C > Tの S N Pを示す。
下線を付した CTGCGCCTTTGACTCTGTTと TCTTTGTCAGTGAGAGACTGは P CR p r i me rを示し、 下線を付した CCTATCCTGGCCTGACTGTTはシークェンスプライマー を示す。
(4) galectin- 2遺伝子 i n t r o n 1 3 2 7 9の S N Pの galectin- 2遺 伝子転写活性に与える影響
i n t r o n 1 3 2 79の S N Pの galectin- 2遺伝子転写活性に与える 影響を測定するために、 レポーター遺伝子アツセィ （ルシフェラーゼアツセィ） を施行した。 galectin— 2遺伝子の i n t r o n 1 3 1 88力、ら 3404まで のヌクレオチドよりなる DNAフラグメントを、 p GL 3— e n h a n c e rベ クタ一の S V40ェンハンサ一の下流に、 5，から 3，の方向にクローユングし、 レポーターベクターを作製した。 これらのレポーターベクターを H e L a細胞お ょぴ H e p G 2細胞にトランスフエクシヨンし、 24時間後、 Dual- Lucif erase Reporter Assay System (Promega社） を用いて/レシフェラーゼ活性を測定した。 結果を図 2 (左図は H e L a細胞、 右図は H e p G 2細胞での結果を示す） に示す。
( 5 ) galectin- 2と微小管との相互作用
galectin-2による LTA分泌の制御機構を調べるために、 タンデムァフィ-ティ 一精製 (TAP)システムを用いて、 galectin - 2 と相互作用する細胞内分子を探索し た。その結果、 galectin- 2- TAPタグを発現させた場合のみに検出できる 2つの特 異的なパンドを同定した （図 3 a )。 MALDI/TOF mass スぺク トル分析により、 こ れらの 2つのバンドは、 微小管の重要成分であ α—及び j3—チュープリンに対応 することが示された。 Flagのタグをつけた galectin - 2を発現するプラスミドで トランスフエクシヨンした HeLa 細胞を用いて、 内因性のチューブリン及び galectin-2がー緒に免疫沈降することを確認した（図 3 b )。チューブリンは LTA とも一緒に免疫沈降した （図 3 b )。 二重免疫染色した U937細胞の共焦点顕微鏡 分析像から、 galectin- 2及ぴ α—チューブリンは、細胞質に発達した網状フイラ メントネッ トワークとして一緒に局在化していた （図 3 c；)。 この結果は galectin-2が細胞内輸送に関与している可能性を示している。
( 6 ) 冠状動脈粥腫切除術による試料における galectin - 2 と LTAの発現と共局 在
galectin- 2と が、 心筋梗塞の損傷 （即ち、 冠状動脈のァテローム硬化性損 傷） で発現しているかどうか、 そして発現している場合にはその発現部位を調べ るために、 抗 LTA又は抗 galeci;in-2抗体を用いて、 冠状動脈粥腫切除試料につ いて免疫組織化学染色分析を行った。 図 4 a及ぴ bに示す通り、 LTA 及び galectin-2についての免疫反応性が、ァテローム斑の内膜細胞に検出され、その うちの一部は紡錘体状、 又は限定的に空胞化した丸い細胞質であった。 隣接する 切片を抗平滑筋細胞 （SMC) α—ァクチン又は抗 CD68 で免疫染色した結果、 これ らの細胞の大部分は平滑筋細胞であるか、 平滑筋細胞由来の泡沫細胞であり、 マ クロファージも一部に見られた（図 4 c及び d )。二重標識免疫組織化学分析によ り、 LTA と galectin - 2の共発現が大部分の多形性の平滑筋細胞で見られた （図 4 e )。対照的に、細胞質が僅かな繊維斑の萎縮性平滑筋細胞や、正常な内側の平 滑筋細胞では、何れのタンパク質の発現も検出されなかった （図 4 f )。 これらの 結果は、 LTA と galectin - 2が、 ヒ トのァテローム硬化性斑の内膜の平滑筋細胞 及ぴマク口ファージでは共発現しているが、 静止期又は正常な内側の平滑筋細胞 では存在しないことを示している。 産業上の利用可能性
本発明により、 心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多 型 （S N P ) が新たに同定された。 本発明で同定された S N Pを利用することに より、 心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、 又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提 供することが可能になる。

Claims

請求の範囲
I . galectin- 2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出するこ とを含む、 炎症性疾患の判定方法。
2 . galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出するこ とを含む、 炎症性疾患の判定方法。
3 . 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列におい て 3 2 7 9番目の塩基における C ZTの多型を検出することを含む、 炎症性疾患 の判定方法。
4 . 炎症性疾患が心筋梗塞である、 請求項 1カゝら 3の何れかに記載の方法。
5 . 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列におい て 3 2 7 9番目の塩基を含む連続する少なくとも 1 0塩基の配列、 又はその相補 配列にハイブリダイズすることができ、 請求項 1から 4の何れかに記載の方法に おいてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
6 . 配列番号 1に示す galectin- 2遺伝子のィントロン 1の塩基配列におい て 3 2 7 9番目の塩基を含む連続する少なくとも 1 0塩基の配列、 及び/又はそ の相捕配列を増幅することができ、 請求項 1から 4の何れかに記載の方法におい てプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
7 . プライマーがフォヮ一ドプライマ一及び/又はリバースプライマーであ る請求項 6に記载のォリゴヌクレオチド。
8 . 請求項 5から 7のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの 1種以上を含む、 炎症性疾患診断用キット。
9 . 炎症性疾患が心筋梗塞である請求項 8に記載のキット。
1 0 . 配列番号 1に示す galectin-2遺伝子のィントロン 1の塩基配列にお いて 3 2 7 9番目の塩基における C Z Tの多型を検出することを含む、 galectin-2の発現状態の分析方法。
I I . 候補物質の存在下で細胞内の galectin- 2遺伝子又は galectin- 1遺伝 子の発現量を分析し、 その発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、 炎症 性疾患の治療薬のスクリ一二ング方法。
1 2 . 候補物質の存在下で細胞内の galectin- 2遺伝子又は galectin- 1遺伝 子の発現量を分析し、 その発現量を増大させる物質を選択する工程を含む、 炎症 性疾患の治療薬のスクリ一二ング方法。
1 3 . 候補物質の存在下でリンホトキシン - a ( L T A) と galectin- 2遺伝 子産物又は galectin-1遺伝子産物との結合を測定し、 該結合を阻害する物質を 選択する工程を含む、 炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
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