WO2005015211A1 - 核酸分子を固定化するための固体支持体 - Google Patents

核酸分子を固定化するための固体支持体 Download PDF

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nucleic acid
solid support
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immobilized
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Teruhisa Ichihara
Michifumi Tanga
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Toyo Kohan Co Ltd
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Toyo Kohan Co Ltd
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the present invention relates to a solid support for immobilizing a nucleic acid molecule, a method for immobilizing a nucleic acid molecule, a solid support on which a nucleic acid molecule is immobilized, and a method for detecting a nucleic acid molecule using the same.
  • a DNA chip is used as an analysis means.
  • a DNA chip is in the form of a microarray in which a large number of DNA fragments are aligned and immobilized on a solid support such as a slide glass, and a DNA fragment sample complementary to the DNA fragments immobilized on the DNA chip is used. It is immobilized on a DNA chip by hybridization and used for detection.
  • a means for detecting the formed hybrid a method using a fluorescent label or a radioactive label previously bound to a DNA fragment sample, a method using an intercalator having a fluorescence-generating group or a conductive group incorporated into the hybrid, etc. It has been known
  • the method for immobilizing the DNA fragment on the surface of the solid support includes the following methods depending on the type of the DNA fragment and the type of the solid support.
  • the DNA fragment to be immobilized is a cDNA (complementary DNA obtained by converting mRNA to type II) or a PCR product (a DNA fragment obtained by amplifying cDNA by PCR), these are prepared on a DNA chip.
  • a spotter device provided on the device, spotting is performed on the surface of a solid support that has been surface-treated with polycations (polylysine, polyethylenimine, etc.), and is electrostatically coupled to the solid support using the charge of DNA.
  • polycations polylysine, polyethylenimine, etc.
  • a method for treating the surface of a solid support a method using a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, or the like is also used (for example, see Non-Patent Document 1).
  • amino groups, aldehyde groups, etc. are introduced into the surface of the solid support by covalent bonds. Therefore, they exist on the surface of the solid support more stably than in the case of polycations.
  • a solid support in which a surface treatment layer and a chemically modified layer having a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid molecule are sequentially provided on the surface of a substrate has been developed (for example, see Patent Documents 11 to 13).
  • the DNA fragment to be immobilized is a synthetic oligonucleotide
  • a method of synthesizing an oligonucleotide into which a reactive group has been introduced, spotting the oligonucleotide on the surface of a surface-treated solid support, and covalently binding the oligonucleotide is known. It is known (for example, see Non-Patent Document 2).
  • a method in which an amino group-introduced oligonucleotide is reacted with an amino group-introduced slide glass in the presence of PDC (p-phenylenediisothiosinate), and an aldehyde group-introduced oligonucleotide is reacted with the slide glass is known. In these two methods, the oligonucleotide is stably immobilized on the surface of the solid support as compared with the above-mentioned method using the charge of DNA.
  • the detection limit is important. Therefore, the development of technology to stably immobilize DNA fragments in a sufficient amount on the surface of a solid support will greatly contribute to improving the detection limit of hybridization between the immobilized DNA fragments and labeled sample nucleic acid fragments. .
  • the amount of immobilized DNA and the binding strength of DNA of the conventional solid support are not necessarily sufficient, and it is desired to develop a solid support having a higher amount of DNA immobilized and higher DNA binding strength. ing.
  • Patent Document 1 WO 00/22108 pamphlet
  • Patent Document 2 WO 02/12891 pamphlet
  • Patent Document 3 JP 2002-82116 A
  • Non-Patent Document 1 Geo, Z. et al "Nucleic Acid Research, 22, 5456-5465 (1994)
  • Non-Patent Document 2 "Protein / Nucleic Acid 'Enzyme", Vol. 43, (1998), 2004-2011
  • An object of the present invention is to provide a solid support in which the amount of immobilized nucleic acid molecules is higher and the binding strength of nucleic acid molecules is higher.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have formed a diamond-like carbon layer on a substrate and introduced a maleimide group via an amino group into this layer.
  • the inventors have found that the amount of immobilized molecules and the binding strength of nucleic acid molecules are significantly improved, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • n is an integer from 1 to 12
  • a solid support to which a group represented by is covalently bonded is covalently bonded.
  • a nucleic acid molecule-immobilized solid support obtained by binding a nucleic acid molecule having an SH group introduced to a maleimide group on the solid support according to (1).
  • n is an integer from 1 to 12
  • the method for producing a solid support according to (1) which comprises reacting the compound represented by the formula or a salt thereof.
  • a method for detecting a nucleic acid molecule comprising:
  • FIG. 1 shows the results of ESCA analysis of the surface of the solid support of the present invention prepared in Example 1.
  • FIG. 2 shows the result of taking an image of the solid support after hybridization in Example 2-5 with a fluorescent scanner.
  • the solid support of the present invention has a structure in which a diamond-like carbon layer is provided on a substrate, and a chemical modifying group is bonded to the surface thereof.
  • Examples of the material of the substrate used in the present invention include silicon, glass, fiber, wood, paper, ceramics, and plastics (eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin)) , Nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, and vinyl chloride resin.
  • a silicon substrate it is preferable to use a silicon substrate.
  • a surface treatment layer of diamond-like carbon is formed on the substrate.
  • Diamond-like carbon (DLC) is a general term for imperfect diamond structures, which are mixtures of diamond and carbon, and the mixing ratio is not particularly limited.
  • the thickness of the surface treatment layer is preferably lnm-100zm.
  • the surface treatment layer of the substrate is formed by a known method, for example, microwave plasma CVD.
  • C_ and VD Electrode Vapor Deposit and C_ and VD (Electnc and yclotron Resonance and chemical Vapor D mark osit) method, ICPQnductive Coupled Plasma) method, DC sputtering method, ECR (Electric Cyclotron Resonance) sputtering method, ion plating method, Arcio It can be performed by a plating method, an EB (Electron Beam) evaporation method, a resistance heating evaporation method, an ionization evaporation method, an arc evaporation method, a laser evaporation method, or the like.
  • EB Electrode
  • An example of the surface-treated substrate is a substrate obtained by forming a diamond-like carbon film on a silicon substrate.
  • a substrate is preferably prepared by ion-deposition evaporation in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas remaining. .
  • solid support of the present invention not only the structure having the surface treatment layer formed as described above, but also a laminate or a composite of diamond-like carbon and a substrate material (for example, diamond-like carbon and another substance) Complex, (eg, a two-phase body).
  • a laminate or a composite of diamond-like carbon and a substrate material for example, diamond-like carbon and another substance
  • Complex eg, a two-phase body
  • DNA By forming a diamond-like carbon layer on a substrate, DNA can be immobilized at a high density and a high S / N ratio can be obtained, thus enabling highly sensitive detection. Also, it can be used repeatedly.
  • the shape and size of the substrate are not particularly limited.
  • examples of the shape include a plate shape, a thread shape, a spherical shape, a polygonal shape, and a powder shape.
  • a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, Cr, TiC, TiN or the like or a composite film thereof may be formed as a reflective layer on the front surface or the back surface of the substrate.
  • the thickness of the reflective layer is preferably 10 nm or more, more preferably 100 nm or more, because it is necessary that the thickness be uniform throughout.
  • the surface is intentionally roughened in Ra (JIS B 0601) in the range of lnm 1000 ⁇ m. Such a roughened surface This is advantageous in that the surface area of the DNA probe increases and a large amount of DNA probes and the like can be immobilized at high density.
  • an amino group is introduced into the substrate provided with the diamond-like carbon layer.
  • the introduction of the amino group can be carried out by irradiating the substrate provided with the diamond-like carbon layer with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the surface, and then irradiating the substrate with ultraviolet rays in ammonia gas.
  • it can be carried out by subjecting the substrate provided with the diamond-like carbon layer to a plasma method in an ammonia atmosphere.
  • the plasma method is a method in which plasma is generated in a DC or AC discharge under vacuum conditions, for example, benzene or methane is used as a source gas, and a biased substrate is treated with an ionized gas. It is.
  • n is an integer from 1 to 12, preferably from 4 to 6, more preferably 5.
  • formula The salt of the compound represented by II is not particularly limited, but, for example, a sodium salt, a potassium salt and the like can be used. It is preferred to use the sodium salt.
  • the reaction is carried out by immersing the solid support having the amino group introduced therein in a solution containing the compound of the formula II at a concentration of usually 0.1 to 100 mM in a buffer.
  • a nonophore PBS, triethanolamine buffer, sodium borate buffer and the like can be used.
  • PBS PBS (pH 69) is used.
  • the reaction temperature is usually 10 to 80 ° C, preferably ⁇ 25 to 30 ° C, and the reaction time is usually 1 to 300 minutes, and preferably ⁇ 30 to 60 minutes.
  • the chemical modifying group having a maleimide group is strongly bonded to the carbon in the diamond-like carbon layer by a covalent bond, so that it is also exfoliated by a change in washing temperature. It is also possible to store the solid support for a long period of time.
  • the nucleic acid molecule having the SH group introduced therein can be effectively bound to the solid support. Further, since the maleimide group has high selectivity for the SH group, the nucleic acid molecule having the SH group introduced therein can be specifically bound to the solid support.
  • Introduction of SH groups into the nucleic acid molecules can be carried out by conventional methods used in the art (BA Connally and P. Rider, Nucleic Acids Research, 1985, 13, 4485-4502) 0 guide of the SH group The insertion is generally introduced at the 5 'end or 3' end of the nucleic acid molecule chain, but the introduction site is not limited to the end unless it hinders the hybridization.
  • the nucleic acid molecule Since the SH group reacts with the maleimide group to form a covalent bond, the nucleic acid molecule is firmly bound to the chemical modifying group of the present invention. That is, the nucleic acid molecule is covalently bonded to the 3-position of the maleimide group via an iodo atom.
  • Any nucleic acid molecule such as DNA and RNA can be immobilized on the solid support of the present invention by introducing an SH group, and the type thereof can be selected according to the purpose.
  • polynucleotides such as cDNA, cDNA fragments, and ESTs. These polynucleotides may be of unknown function, but generally Specifically, it is prepared by amplifying by PCR using a cDNA library, genomic library or whole genome as a template based on the sequences registered in the database. Those that do not amplify can also be used.
  • oligonucleotides corresponding to the mutations and polymorphisms are synthesized based on a known sequence as a standard, and use them. Further, in the case of nucleotide sequence analysis, it is preferable to use 4 n (n is the length of base) oligonucleotides synthesized.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment is preferably determined in advance by a general nucleotide sequencing method.
  • the number of bases in the nucleic acid molecule to be immobilized is usually 11 to 200, preferably 5 to 150.
  • DNA can be immobilized in either a single strand or a double strand.
  • nucleic acid molecule into which the SH group has been introduced is dissolved in a spotting buffer, and spotted on the solid support of the present invention, whereby the nucleic acid molecule can be immobilized.
  • the nucleic acid molecule into which the SH group has been introduced is dissolved in a spotting buffer so as to have a concentration of usually 0.1 to 500 ⁇ M, preferably 5 to ⁇ ⁇ M, to prepare a spotting solution.
  • a buffer for spotting 50% PEG (polyethylene glycol) solution, PBS (phosphate buffered saline), 50% DMSO (dimethyl sulfoxide), 3X SSC (saline sodium citrate), pure water, etc. Can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the maleimide group has the best reaction efficiency at around pH 7 as soon as it is hydrolyzed.
  • the prepared spotting solution can be dispensed into a 96- or 384-well plastic plate, and the dispensed solution can be spotted on a solid support by a spotter or the like. At this time, by arranging various types of nucleic acid molecules in an array as independent spots, it is possible to simultaneously detect whether or not the plurality of types of nucleic acid molecules hybridize with the target nucleic acid.
  • Incubation is usually performed at a temperature of 10 to 80 ° C, preferably 25 30 ° C, for a period of usually 0.5 to 10 hours, preferably 112 hours. Incubation is preferably performed in a high-humidity atmosphere, for example, at a humidity of 50 to 90%. Following the incubation, washing is preferably performed using a washing solution (eg, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS) to remove nucleic acid molecules that are not bound to the solid support.
  • a washing solution eg, 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS
  • the present invention also relates to a method for immobilizing a nucleic acid molecule sample having complementarity to a nucleic acid molecule immobilized on a solid support as described above on a solid support by hybridization and detecting the same.
  • RNA fragment sample As a nucleic acid molecule used as a sample, it is preferable to use a DNA fragment sample or an RNA fragment sample whose sequence and function are unknown.
  • the sample nucleic acid molecule is preferably isolated from eukaryotic cell or tissue samples for the purpose of examining gene expression. If the sample is mRNA, it is preferably extracted from a tissue sample in which mRNA is expressed.
  • mRNA is labeled dNTP by reverse transcription reaction ("dNTP" means deoxyribonucleotide whose base is adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or thymine (T)).
  • dNTP means deoxyribonucleotide whose base is adenine (A), cytosine (C), guanine (G) or thymine (T)).
  • dNTP means deoxyribonucleotide whose base is adenine (A), cytosine (C),
  • the sample nucleic acid molecule is preferably prepared by PCR of the target region in a reaction system containing a labeled primer or labeled dNTP.
  • the hybridization is performed.
  • Labeling of a sample nucleic acid molecule can be easily carried out, for example, by using a labeled primer to which a label has been preliminarily bound as a primer when a target nucleic acid molecule is amplified by PCR.
  • the label is not particularly limited as long as it can be incorporated into a nucleic acid molecule. FAM, HEX, ROX, etc.) and radioactive labels ( ⁇ _32 ⁇ , y_32P, 35S etc.).
  • a fluorescently labeled nucleic acid molecule it can be detected as an image by taking a fluorescence image of the solid support after the hybridization.
  • a sample of the sample nucleic acid molecule is prepared as a hybridization solution by dissolving in a hybridization buffer such that the concentration is usually 0.01 ⁇ M, preferably 110 ⁇ M.
  • the solution for hybridization is dropped on the solid support on which the nucleic acid molecules prepared above are immobilized, followed by incubation to allow hybridization.
  • Incubation is carried out usually at 30 to 70 ° C, preferably 45 to 60 ° C, usually for 0.5 to 16 hours, preferably for 114 hours. No. It is also preferable to carry out the incubation in a high-humidity atmosphere in the hybridization step. Finally, after washing and drying the solid support, detection is performed by reading the label.
  • the solid support of the present invention can also be used for an extension reaction of a nucleic acid molecule, for example, DNA.
  • a primer is immobilized on a solid support, and single-stranded or double-stranded DNA is hybridized. Thereafter, a DNA complementary to the DNA hybridized to the primer is extended by a DNA extension reaction.
  • the primer may be peeled off by heat treatment in the extension reaction.
  • the primer does not peel off even when heat is applied, and the primer is attached to the solid support.
  • the extension reaction can be allowed to proceed in the immobilized state.
  • the labeled nucleic acid is incorporated, and after the extension reaction, the signal derived from the label is read to determine whether the specific DNA has hybridized to the primer and whether the extension reaction has proceeded. Can be detected. Therefore, it is possible to determine whether or not the tested sample contains a hybridizable DNA in the primer on the immobilized support, which can be a useful detection means in research and medical care.
  • the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • a DLC layer having a thickness of 100 ⁇ m was formed on a silicon substrate cut into a 3 mm square by using the gas obtained by mixing 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen at an accelerating voltage of 0.5 kV by ion ion deposition. After that, amination was performed for 10 minutes by a plasma method in an ammonia gas atmosphere.
  • a reaction solution having the following composition was prepared, and the aminated solid support was immersed in the reaction solution for 30 minutes. Thereafter, the substrate was washed three times with pure water and vacuum dried at 100 ° C for 30 minutes.
  • Snoreho EMCS (Dojindo Laboratories, Inc.) is a sodium salt in which n is 5 in the compound of the above formula II. Sulfo EMCS 12.3mg [lmM]
  • ESCA analysis of the surface of the solid support before and after the reaction showed that the peak intensities of O and N increased after the reaction (Fig. La). From the narrow scan after the reaction, a new peak appears at around 289 eV (Fig. Lb). ⁇ and N peaks are considered to be derived from maleimide groups 0 and N. The peak newly appearing at around 289 eV is considered to be derived from the imide moiety of maleimide. From the above, it can be seen that a maleimide group was introduced on the surface of the solid support.
  • R-WT (5,1-ACTGGCCGTCGTT TTACAACGT-3 ′) (SEQ ID NO: 1), 5 ′ terminal SH-modified R—WT in which an SH group was introduced was used.
  • F_WT (3′_TGACCGG CAGCAAAATGTTGCA-5 ′) (SEQ ID NO: 2) labeled with Cy5 was used. All of these modified oligo DNAs were obtained from SIGMA GENOSYS.
  • the spotting solution was prepared by dissolving the 5 ′ terminal SH-modified R—WT in 1 ⁇ PBS solution (pH 7.4) using the force of a 20% PEG solution to prepare a spotting solution. DNA hybridization was detected in the same manner as described above.
  • the spotting solution is prepared by dissolving the 5 'terminal SH-modified R-WT in lXPBS (pH 7.4) solution by the force of the 20% PEG solution. Instead, DNA hybridization was detected in the same manner as in Example 2 except that spotting was performed in a total of two points of 0.3 ⁇ 1 each using a micropitor.
  • FIG. 2 shows the results of the fluorescence images obtained in Examples 2-5.
  • the results of Example 5 show that the solid support of the present invention binds SH-modified oligo DNA more selectively than NH-modified oligo DNA.
  • a nucleic acid molecule can be immobilized firmly and at a high density on a solid support. Therefore, the use of the solid support of the present invention enables production of a DNA chip having a high detection limit. By performing hybridization with a sample nucleic acid molecule using such a DNA chip, a nucleic acid molecule complementary to a DNA fragment immobilized on the DNA chip can be detected with high sensitivity.
  • a DNA chip useful for monitoring gene expression, determining a nucleotide sequence, analyzing a mutation, analyzing a polymorphism, and the like can be provided.

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Abstract

　核酸分子の固定化量が高く、核酸分子の結合強度が高い固体支持体、核酸分子の固定化方法、核酸分子固定化固体支持体及びこれを用いた核酸分子検出方法を提供することを目的とする。基板上にダイヤモンドライクカーボン層を有し、その表面に式I： 【化１】 ［式中、ｎは１～１２の整数である］ で表される基が共有結合した固体支持体、あるいは固体支持体上のマレイミド基に、ＳＨ基が導入された核酸分子が結合させることにより核酸分子を固定化する方法。

Description

明 細 書
核酸分子を固定化するための固体支持体
技術分野
[0001] 本発明は、核酸分子を固定化するための固体支持体、核酸分子の固定化方法、 核酸分子固定化固体支持体及びこれを用いた核酸分子検出方法に関する。
背景技術
[0002] 多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、 その解析手段として、 DNAチップが利用されている。 DNAチップは通常、スライドガ ラス等の固体支持体に多数の DNA断片を整列固定化させたマイクロアレイの形態 にあり、 DNAチップに固定化されている DNA断片と相補性を持つ DNA断片試料を ノ、イブリダィゼーシヨンによって DNAチップ上に固定化し、検出する方法に利用され る。形成されたハイブリッドの検出手段としては、 DNA断片試料に予め結合させた蛍 光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光 発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている
[0003] DNAチップ利用技術を実用化するためには、多数の DNA断片やオリゴヌクレオチ ドを固体支持体表面に整列固定化する技術が必要とされる。 DNA断片を固体支持 体表面に固定化する方法としては、 DNA断片の種類や固体支持体の種類に応じて 下記のような方法がある。
[0004] 固定化する DNA断片が cDNA (mRNAを铸型にして合成した相補的 DNA)や P CR産物（cDNAを PCR法によって増幅させた DNA断片）の場合には、これらを DN Aチップ作製装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン (ポリリシン、ポ リエチレンイミン等）で表面処理した固体支持体表面にスポッティングして、 DNAの 荷電を利用して固体支持体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、固 体支持体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシラ ンカップリング剤を用いる方法も利用されている（例えば、非特許文献 1参照）。この 場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固体支持体表面に導入され るため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固体支持体表面に存在する。また 、基板の表面に表面処理層及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修 飾層を順次設けてなる固体支持体も開発されている（例えば、特許文献 1一 3参照）
[0005] 固定化する DNA断片が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入し たオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固体支持体表面に該オリゴヌクレオチド をスポッティグし、共有結合させる方法が知られている（例えば、非特許文献 2参照）。 例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、 PDC (p—フエ二レンジイソチオシァネー ト）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラス に、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの 二つの方法は、前記の DNAの荷電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが 固体支持体表面に安定に固定化される。しかし、 PDCを存在させる方法は、 PDCと アミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分 解が起こり易い）とレ、う問題点がある。
[0006] DNAチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固体支持体表面に充分 な量で安定に DNA断片を固定化する技術の開発は、固定化 DNA断片と標識した 試料核酸断片とのハイブリダィゼーシヨンの検出限界の向上に大きく寄与する。
[0007] 従来の固体支持体の DNAの固定化量及び DNAの結合強度は、必ずしも充分と はいえず、 DNAの固定化量がより高く DNA結合強度がより高い固体支持体の開発 が望まれている。
[0008] この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
特許文献 1：国際公開第 00/22108号パンフレット
特許文献 2 :国際公開第 02/12891号パンフレット
特許文献 3 :特開 2002-82116号公報
非特許文献 1 : Geo, Z. et al" Nucleic Acid Research, 22, 5456-5465(1994)
非特許文献 2 :「蛋白質 ·核酸 '酵素」、 43卷、（1998)、 2004-2011
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、核酸分子の固定化量がより高ぐ核酸分子の結合強度がより高 い固体支持体を提供することである。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、基板上にダイヤモンドライ クカーボン層を形成し、この層にアミノ基を介してマレイミド基を導入した固体支持体 により、核酸分子の固定化量及び核酸分子の結合強度が著しく向上することを見出 し、本発明を完成するに至った。
[0011] 即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)基板上にダイヤモンドライクカーボン層を有し、その表面に式 I：
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[式中、 nは 1一 12の整数である]
で表される基が共有結合した固体支持体。
[0012] (2) (1)に記載の固体支持体上のマレイミド基に、 SH基が導入された核酸分子を結 合させることにより核酸分子を固体支持体に固定化する方法。
(3) (1)に記載の固体支持体上のマレイミド基に、 SH基が導入された核酸分子が結 合してなる核酸分子固定化固体支持体。
[0013] (4)基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成した後、該ダイヤモンドライクカー ボン層にアミノ基を導入し、式 II：
[化 2]
Figure imgf000006_0001
[式中、 nは 1一 12の整数である]
で表される化合物又はその塩を反応させることを含む、（1)に記載の固体支持体の 製造方法。
[0014] (5)前記アミノ基はプラズマ法により導入することを特徴とする（4)に記載の方法。
(6) (3)に記載の核酸分子固定化固体支持体に、標識した試料核酸分子を滴下し、 固体支持体に固定化された核酸分子にハイブリダィズした試料核酸分子の標識を検 出することを含む、核酸分子の検出方法。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は実施例 1で作成した本発明の固体支持体の表面を ESCA解析した結果 を表す。
[図 2]図 2は実施例 2— 5において、ハイブリダィゼーシヨン後の固体支持体を蛍光ス キヤナ一で画像撮影した結果を表す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 固体支持体
本発明の固体支持体は、基板上にダイヤモンドライクカーボン層を有し、その表面 に化学修飾基が結合した構造を有する。
[0017] 本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セ ラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン 樹脂、 ABS樹脂 (Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フ ッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フエノーノレ 樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビュル樹脂）が挙げられる。本発明において は、シリコン基板を使用するのが好ましい。 [0018] この基板上にダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成する。ダイヤモン ドライクカーボン（DLC : Diamond Like Carbon)とは、ダイヤモンドとカーボンとの混合 体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。 表面処理層の厚みは、 lnm— 100 z mであることが好ましい。
[0019] 基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマ CVD
(し hemical Vapor Deposit)法、 C_ し VD(Electnc し yclotron Resonance し hemical Vapor D印 osit)法、 ICPQnductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、 ECR (Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークィォ ンプレーティング法、 EB(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法 、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
[0020] 表面処理された基板の一例としては、シリコン基板にダイヤモンドライクカーボンを 製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素 ガス 0— 99体積％、残りメタンガス 100— 1体積％を含んだ混合ガス中で、イオンィ匕 蒸着法により作成したものであることが好ましレ、。
[0021] 本発明の固体支持体としては、前記のように表面処理層を形成した構造だけでなく 、ダイヤモンドライクカーボンと基板材料との積層体や複合体 (例えば、ダイヤモンド ライクカーボンと他の物質との複合体、（例えば 2相体)）であってもよレ、。
[0022] 基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成することにより、高密度に DNAを固 定化でき、高い S/N比が得られるため、感度の高い検出が可能になる。また、繰り 返し使用することも可能である。
[0023] 基板の形状及びサイズは特に限定されなレ、が、形状としては、平板状、糸状、球状 、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は 、幅 0. 1— 100mm、長さ 0. 1 100mm、厚み 0. 01— 10mm程度である。
[0024] また、基板の表面又は裏面に、反射層として Ti、 Au、 Pt、 Nb、 Cr、 TiC、 TiN等の 単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であること が必要なため、好ましくは 10nm以上、更に好ましくは lOOnm以上である。
[0025] 基板としてガラスを用レ、る場合、その表面は、 Ra (JIS B 0601)で lnm 1000η mの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板 の表面積が増えて、多量の DNAプローブ等を高密度で固定化できる点で好都合で ある。
[0026] 続いて、上記ダイヤモンドライクカーボン層を施した基板にアミノ基を導入する。アミ ノ基の導入は、ダイヤモンドライクカーボン層を施した基板に塩素ガス中で紫外線を 照射することにより表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射すること により実施できる。あるいはダイヤモンドライクカーボン層を施した基板を、アンモニア 雰囲気下でプラズマ法に付すことにより実施できる。ここで、プラズマ法とは、真空条 件下、直流あるいは交流による放電にプラズマを発生させ、原料ガスとして例えばべ ンゼンやメタンを用レ、、イオン化したガスでバイアスを印加した基板を処理する方法 である。
[0027] このように形成させたァミノ基と、以下の式 II：
[化 3]
Figure imgf000008_0001
で表される化合物又はその塩を反応させることにより、式 I：
[化 4]
Figure imgf000008_0002
で表されるような化学修飾基をダイヤモンドライクカーボン層上に形成することができ る。
式 I又は IIにおいて、 nは 1一 12、好ましくは 4一 6の整数、より好ましくは 5である。式 IIで表される化合物の塩としては特に限定されなレ、が、例えば、ナトリウム塩、カリウム 塩等を使用できる。ナトリウム塩を使用するのが好ましい。
[0029] 具体的には、ァミノ基が導入された固体支持体を、バッファ一中に通常 0. 1— 100 mMの濃度で式 IIの化合物を含む溶液に浸漬することにより反応させる。ノ ノファーと しては、 PBS、トリエタノールァミンバッファー、ホウ酸ナトリウムバッファ一等を使用す ることができる。 PBS (pH6 9)を使用するのが好ましい。反応温度は、通常 10— 8 0°C、好まし <は 25 30°C、反応時間は、通常 1一 300分、好まし <は 30 60分であ る。
[0030] 本発明の固体支持体において、上記のマレイミド基を有する化学修飾基は、共有 結合によってダイヤモンドライクカーボン層中の炭素と強固に結合しているため、洗 浄ゃ温度変化によっても剥離することがなぐまた固体支持体を長期間保存すること も可能である。
[0031] 核酸分子の固定化
本発明の固体支持体の表面に存在するマレイミド基は SH基との反応性が高いた め、 SH基を導入した核酸分子を固体支持体上に効果的に結合することができる。ま た、マレイミド基は、 SH基に対する選択性が高いことから、 SH基が導入された核酸 分子を固体支持体上に特異的に結合させることができる。核酸分子への SH基の導 入は、当技術分野において通常用いられる方法により実施することができる（B. A. Connally and P. Rider,Nucleic Acids Research, 1985, 13, 4485-4502) 0 SH基の導 入は、核酸分子鎖の 5 '末端や 3'末端に導入するのが一般的であるが、ハイブリダィ ゼーシヨンに際して障害とならない限り、導入部位は末端に限定されるものではない 。 SH基は、マレイミド基と反応して共有結合を形成するため、核酸分子は本発明の 化学修飾基に強固に結合する。すなわち、核酸分子は、マレイミド基の 3位にィォゥ 原子を介して共有結合する。
[0032] 本発明の固体支持体には、 DNA、 RNA等のいずれの核酸分子も SH基を導入す ることにより固定化することができ、 目的に応じてその種類を選択できる。遺伝子の発 現を調べるためには、 cDNA、 cDNAの断片、 EST等のポリヌクレオチドを使用する ことが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般 的にはデータベースに登録された配列を基にして cDNAのライブラリー、ゲノムのラ イブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとして PCR法によって増幅して調製する。 増幅しないものも使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、 標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチ ドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、 4n (n は、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。 D NA断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定さ れていることが好ましい。
[0033] 固定化する核酸分子における塩基数は、通常 1一 200、好ましくは 5— 150である。
また、 DNAは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。
[0034] SH基を導入した核酸分子をスポッティグ用バッファーに溶解し、本発明の固体支 持体上にスポッティングすることにより、核酸分子を固定化することができる。
[0035] SH基を導入した核酸分子を、濃度が通常 0. 1— 500 μ Μ、好ましくは 5— ΙΟ μ Μ となるようにスポッティング用バッファーに溶解し、スポッティング用溶液を調製する。 スポッティング用バッファ一としては、 1一 50 %の PEG (ポリエチレングリコール）溶液 、 PBS (リン酸緩衝化生理食塩水）、 50%DMSO (ジメチルスルホキシド）、 3 X SSC (saline sodium citrate)、純水等を使用することができる。本発明においては、 PBS ( リン酸緩衝化生理食塩水）を使用するのが好ましい。マレイミド基は加水分解されや すぐ pH7付近で反応効率が最も良い。
[0036] 調製したスポッティング用溶液を、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注 し、分注した溶液をスポッター装置等によって固体支持体上にスポッティングすること ができる。このとき、多種類の核酸分子を互いに独立したスポットとしてアレイ状に配 列することにより、この複数種の核酸分子と標的核酸とがそれぞれハイブリダィゼー シヨンするか否かを同時に検出することができる。
[0037] スポッティング後、核酸分子が固体支持体に結合する反応を進行させるため、イン キュベーシヨンを行うことが好ましい。核酸分子の固定化は化学反応による共有結合 の生成であるため、反応を確実に進めるベぐスポッティング後速やかにインキュベー シヨンを行うのが好ましい。 [0038] インキュベーションは、通常 10— 80°C、好ましくは 25 30°Cの温度で、通常 0. 5 一 10時間、好ましくは 1一 2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰 囲気下、例えば、湿度 50— 90%の条件で行うのが望ましレ、。インキュベーションに 続き、固体支持体に結合していない核酸分子を除去するため、洗浄液 (例えば、 2 X SSC/0. 2%SDS)を用いて洗浄を行うことが好ましい。
[0039] ハイブリダィゼーシヨン
本発明はまた、上記のように固体支持体に固定化された核酸分子に相補性を持つ 核酸分子試料をハイブリダィゼーシヨンによって固体支持体上に固定化し、これを検 出する方法に関する。
[0040] 試料として用いる核酸分子としては、その配列や機能が未知である DNA断片試料 あるいは RNA断片試料を用いることが好ましい。試料核酸分子は、遺伝子発現を調 ベる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料 が mRNAならば、 mRNAが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。 mRNAは、逆転写反応により標識 dNTP (「dNTP」は、塩基がアデニン (A)、シトシ ン (C)、グァニン (G)もしくはチミン (T)であるデォキシリボヌクレオチドを意味する。 ) を取り込ませて標識 cDNAとすることが好ましい。 dNTPとしては、化学的な安定性 のため、 dCTPを用いることが好ましレ、。 1回のハイブリダィゼーシヨンに必要な mRN A量は、液量や標識方法によって異なるが、数 z g以下であることが好ましい。尚、固 体支持体上の核酸分子がオリゴヌクレオチドである場合には、試料核酸分子は低分 子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、 mRNAの選択的な抽出が困難 なため、全 RNAを標識することが好ましい。試料核酸分子は、遺伝子の変異や多型 を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識 dNTPを含む反応系で標的領域の PCRを行って調製することが好ましい。
[0041] 上記のような試料核酸分子を標識して、固体支持体上に固定化された核酸分子と 反応させ、ハイブリダィズした試料核酸分子に由来する標識を読みとることにより、ハ イブリダィゼーシヨンの有無を検出することができる。試料核酸分子の標識は、例え ば、 PCR法を用いて目的の核酸分子を増幅する際、そのプライマーとして標識を予 め結合させた標識プライマーを用いることで、簡便に実施できる。 [0042] 標識としては、核酸分子に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが 、例えば、蛍光標識（Cy3及び Cy5などの CyDye、 FITC、 RITC、ローダミン、テキ サスレッド、 TET、 TAMRA、 FAM、 HEX, ROXなど）、放射能標識（ α _32Ρ、 y _32P、 35Sなど)などが挙げられる。蛍光標識核酸分子を用いた場合は、ハイブリダ ィゼーシヨン後の固体支持体を蛍光撮影することにより、画像として検出することがで きる。
[0043] この試料核酸分子のサンプルは、濃度が通常 0. 01 100 μ Μ、好ましくは 1一 10 μ Μとなるようにハイブリダィズ用バッファーに溶解することによって、ハイブリダィズ 用溶液として調製する。このノ、イブリダィズ用溶液を、上記で調製した核酸分子が固 定化された固体支持体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリダィズ させる。
[0044] インキュベーションは、通常 30— 70°C、好ましくは 45— 60°Cで、通常 0· 5— 16時 間、好ましくは 1一 4時間で行う。ノ、イブリダィゼーシヨン工程においても、高湿度雰囲 気下でインキュベーションを行うのが好ましい。最後に、固体支持体を洗浄し、乾燥 後、標識を読みとることにより検出を行う。
[0045] 伸長反応
また、本発明の固体支持体は、核酸分子、例えば、 DNAの伸長反応に用いること もできる。この場合、まず、固体支持体上にプライマーを固定化して、一本鎖又は二 本鎖 DNAをハイブリダィズさせる。その後、 DNA伸長反応によりプライマーにハイブ リダィズした DNAと相補的な DNAを伸長させる。
[0046] 従来の固体支持体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離する ことがある力 本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、ブラ イマ一を固体支持体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。
[0047] この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシ グナルを読みとることによって、プライマーに特定の DNAがハイブリダィズして伸長 反応が進行したか否力、を検出することができる。従って、試験した試料中に、固定化 支持体上のプライマーにハイブリダィズしうる DNAが含まれているかどうかを判定す ることができ、研究及び医療における有用な検出手段となりうる。 [0048] 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな レ、。
実施例
[0049] (実施例 1)マレイミド基を導入した固体支持体の作成
イオンィ匕蒸着法によって、 3mm角に切断したシリコン基板上に、メタンガス 95体積 %と水素 5体積％を混合したガスを原料として、加速電圧 0. 5kVで DLC層を 100η mの厚みに形成した。その後、アンモニアガス雰囲気でプラズマ法により 10分間アミ ノ化を実施した。
[0050] 以下の組成の反応液を調製し、これにァミノ化した固体支持体を浸漬させ、 30分間 浸透した。その後、純水で 3回洗浄し、 100°Cにて 30分間真空乾燥した。ここでスノレ ホ— EMCS (株式会社同仁化学研究所）は、上記の式 IIの化合物において、 nが 5で あるナトリウム塩である。 スルホ— EMCS 12. 3mg[lmM]
10 X PBS (pH7. 4) 3ml
超純水 27ml
合計 30ml
[0051] micro_i^Sし A (Electron spectroscopy for chemical analysis: Perkm-Elmer社 を 用いて反応前後の固体支持体表面を解析した。結果を図 1に示す。
[0052] 反応前後の固体支持体表面の ESCA解析から、反応後に Oと Nのピーク強度が増 加していることがわかった（図 la)。また反応後の narrowスキャンから約 289eV付近 に新たなピークが現れていることがわかる（図 lb)。〇、 Nのピークについてはマレイミ ド基の 0、 Nに由来するものであると考えられる。また、 289eV付近に新たに出現した ピークについてはマレイミドのイミド部分に由来するものであると考えられる。以上から 、固体支持体表面には、マレイミド基が導入されていることがわかる。
[0053] (実施例 2) SH基を導入した DNAの固定化及びハイブリダィゼーシヨン
固体支持体に結合させるオリゴ DNAとして、 R— WT (5，一 ACTGGCCGTCGTT TTACAACGT-3' ) (配列番号 1)に SH基を導入した 5'末端 SH修飾 R— WTを使 用した。また、これにハイブリダィズさせるオリゴ DNAとして F_WT (3' _TGACCGG CAGCAAAATGTTGCA-5 ' ) (配列番号 2)を Cy5で標識した、 5'末端 Cy5標識 F—WTを使用した。これらの修飾オリゴ DNAはいずれも SIGMA GENOSYSから入手 した。
[0054] (1) 20%PEG溶液に、 5'末端 SH修飾 R—WTを 5 μ Μで溶解し、スポッティング用 溶液を 10 μ ΐ調製した。実施例 1で製造した固体支持体上に、 SPBIO (日立ソフトゥェ ァ社製スポッター装置)を用いて、このスポッティング用溶液を 4点にスポッティングし た。その後室温で 1時間反応させた。固体支持体を 2 X SSC/0. 2%SDSで室温に て 15分間洗浄し、次いで 95°Cに温めた 2 X SSC/0. 2%SDSで 5分間洗浄し、ェ アブローで乾燥させた。
(2) 5 X SSC/0. 5%SDS溶液に 5 '末端 Cy5標識 F—WTを 1 μ Μで溶解し、ハイ ブリダィズ用溶液 50 μ 1を調製した。 5'末端 SH修飾 R— WTを固定化した固体支持 体をハイブリダィズ用溶液に浸漬し、 60°Cで 1時間ハイブリダィズさせた。 2 X SSC/ 0. 2%SDSで室温にて 10分間洗浄し、 0. 1 X SSCでリンスした。
(3)エアブローで乾燥後、蛍光スキャナー (富士写真フィルム社製、 FLA— 8000)に て画像を読みとつた。
[0055] (実施例 3)
(1)の工程で、 20%PEG溶液の力わりに 1 X PBS溶液（pH7. 4)に 5 '末端 SH修 飾 R— WTを溶解してスポッティング用溶液を調製する点以外は、実施例 2と同様にし て、 DNAハイブリダィゼーシヨンの検出を行った。
[0056] (実施例 4)
(1)の工程で、 20%PEG溶液の力わりに l X PBS (pH7. 4)溶液に 5 '末端 SH修 飾 R— WTを溶解してスポッティング用溶液を調製する点、及びスポッター装置のかわ りにマイクロピぺッターを用いて 0. 3 μ 1ずつ計 2点スポッティングを行った点以外は、 実施例 2と同様にして、 DNAノヽイブリダィゼーシヨンの検出を行った。
[0057] (実施例 5)
本実施例では、 5 '末端 SH修飾 R— WT、及び R— WTの 5'末端をァミノ基で修飾し た 5 '末端 NH修飾 R— WTの双方をスポッティングし、両者を比較した。 l X PBS (p
H7. 4)溶液に、 5 '末端 SH修飾 R - WT又は 5 '末端 NH修飾 R - WTをそれぞれ 5 μ Μで溶解し、スポッティング用溶液を 10 μ ΐずつ調製した。実施例 1で調製した固 体支持体に、この 2種類のスポッティング用溶液を、マイクロピぺッターでそれぞれ 0. 4 μ 1ずつスポッティングした（図 2において、左上及び右下のスポットが 5'末端 SH修 飾 R— WT)。スポッティング後、固体支持体を湿箱 (飽和食塩水を入れて、湿度を飽 和状態にしてスポッティング溶液の蒸発を防いだ）に入れ、室温にて 1時間反応させ た。あとは実施例 2と同様に行った。
[0058] 実施例 2— 5で得られた蛍光画像の結果を図 2に示す。実施例 5の結果から、本発 明の固体支持体が NH修飾オリゴ DNAよりも SH修飾オリゴ DNAを選択的に結合 することがわかる。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明により、固体支持体上に核酸分子を強固かつ高密度に固定化することがで きる。従って、本発明の固体支持体を用いることにより、検出限界の高い DNAチップ の製造が可能になる。このような DNAチップを用いて、試料核酸分子とのハイブリダ ィゼーシヨンを行うことにより、 DNAチップに固定化された DNA断片に相補性を有 する核酸分子を感度よく検出することができる。
また SH基と特異的に結合するマレイミド基を導入することで、 DNA塩基のアミノ基 が固体支持体と反応することを防ぎ、純粋に DNA末端にて固体支持体に固定化す ることが可能となる。
このように、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異の解析及び多型解 析等において有用な DNAチップを提供することができる。

Claims

請求の範囲
基板上にダイヤモンドライクカーボン層を有し、その表面に式 I：
Figure imgf000016_0001
[式中、 nは 1一 12の整数である]
で表される基が共有結合した固体支持体。
[2] 請求項 1に記載の固体支持体上のマレイミド基に、 SH基が導入された核酸分子を 結合させることにより核酸分子を固体支持体に固定化する方法。
[3] 請求項 1に記載の固体支持体上のマレイミド基に、 SH基が導入された核酸分子が 結合してなる核酸分子固定化固体支持体。
[4] 基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成した後、該ダイヤモンドライクカーボ ン層にアミノ基を導入し、式 II：
[化 2]
Figure imgf000016_0002
[式中、 nは 1一 12の整数である]
で表される化合物又はその塩を反応させることを含む、請求項 1に記載の固体支持 体の製造方法。
[5] 前記アミノ基はプラズマ法により導入することを特徴とする請求項 4に記載の方法。
[6] 請求項 3に記載の核酸分子固定化固体支持体に、標識した試料核酸分子を滴下 し、固体支持体に固定化された核酸分子にハイブリダィズした試料核酸分子の標識 を検出することを含む、核酸分子の検出方法。
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