WO2005012518A1 - 核酸検出用キット - Google Patents

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WO2005012518A1
WO2005012518A1 PCT/JP2004/010851 JP2004010851W WO2005012518A1 WO 2005012518 A1 WO2005012518 A1 WO 2005012518A1 JP 2004010851 W JP2004010851 W JP 2004010851W WO 2005012518 A1 WO2005012518 A1 WO 2005012518A1
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WO
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nucleic acid
reagent composition
amplification
reaction vessel
chamber
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/010851
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasumasa Mitani
Takanori Oka
Yoshihide Hayashizaki
Toshizo Hayashi
Original Assignee
Riken
Kabushiki Kaisha Dnaform
Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to US10/566,134 priority patent/US20060194207A1/en
Priority to EP04748062A priority patent/EP1661988A4/en
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    • B01L3/5082—Test tubes per se

Definitions

  • the present invention relates to a reaction container capable of extracting a nucleic acid having a sample ability and amplifying a target nucleic acid in a single container in a genetic test, a nucleic acid detection kit including the reaction container, and a reaction container. It relates to a nucleic acid detection method to be used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genetic testing in the clinic requires special biological operations, which are usually performed using multiple containers or devices, and in multiple areas in a laboratory. It is often done in. Therefore, genetic testing requires that biological samples and reagents be transferred to other containers or transported to other areas, thus contaminating the sample with other clinical samples and amplification products, as well as dispersing the sample.
  • contamination of other samples due to air sol formation has become a problem. Also, it is unknown what pathogens are contained in the samples, so care must be taken when handling them.
  • genetic testing must be performed using special and expensive instruments and equipment. Also, if many samples are processed at the same time, the samples may be mixed up.
  • US Pat. No. 2,659,89 describes an apparatus for nucleic acid amplification.
  • This device is designed to move the introduced sample using the air suction Z discharge means. Therefore, the sample is introduced into the reaction chamber and the reaction solution is taken out.
  • This device requires the use of special air suction and Z discharge means.
  • this device does not include means for detecting an amplification product, and requires another step such as electrophoresis for detection.
  • US Patent No. 5,229,297 describes a cuvette for gene amplification and detection that also provides a passage force that connects a sample, amplification reagent and waste.
  • the sample is squeezed in a certain direction using a special device called a roller, whereby the septum separating the sample and the detection reagent is broken, and these mixtures pass through the passage and the detection section passes through the detection section. It is configured to be pushed out to the waste part.
  • This cuvette also requires the use of special and complex means and containers.
  • WO 95Z11083 describes a disposable reaction tube used for a nucleic acid amplification assay.
  • This reaction tube is made to be able to penetrate the lid for sealing, so that after the amplification reaction, the pipette can be passed through the lid and the sample can be moved to the detection unit without opening the lid. Becomes possible.
  • This reaction tube prevents sample splashing and aerosol generation from contaminating other samples, which further reduces the possibility of false positives, but reduces the risk of transmission of pathogens contained in the sample. It does not rule out the complexity of operation, the need for special equipment, etc.
  • the present inventors have found that nucleic acid extraction and amplification of a target nucleic acid from a sample can be performed in a single reaction container containing the reagent groups required for each in a separated state. .
  • the present invention is based on this finding.
  • an object of the present invention is to provide a reaction vessel for performing operations of nucleic acid extraction and nucleic acid amplification having different work steps in a single vessel, a nucleic acid detection kit including the same, and the reaction vessel.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid detection method used.
  • the reaction container according to the present invention is a reaction container for detecting a target nucleic acid as well as a sample, and includes a first chamber containing an extraction reagent composition for extracting the nucleic acid from the sample, and a target.
  • a second chamber containing an amplification reagent composition for amplifying nucleic acids, separation means for separating the first chamber and the second chamber, and the sample in only the first chamber.
  • At least an opening that allows introduction of the first chamber and the second chamber by applying physical energy from the outside of the reaction vessel to thereby separate the first chamber and the second chamber.
  • a reaction vessel which enables mixing of the extraction reagent composition in the first chamber and the amplification reagent composition in the second chamber.
  • the nucleic acid detection kit according to the present invention comprises at least the reaction container according to the present invention and a sampling instrument for collecting a sample.
  • the nucleic acid detection method according to the present invention is a method for detecting a target nucleic acid from a sample using the reaction container according to the present invention
  • nucleic acid extraction at a sample level and amplification of a target nucleic acid can be performed in a single reaction vessel, thereby contaminating the sample by transferring the reaction mixture to another vessel. And the likelihood of contamination of other samples or the environment is reduced.
  • the reaction container can be disposable, thereby eliminating the possibility of sample contamination due to repeated use of the same container.
  • complicated biological operations are not required, and even a non-skilled person can quickly and highly sensitively detect a target nucleic acid.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a reaction vessel containing an extraction reagent composition and an amplification reagent composition and a sampling probe according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the shape of the sample attached to the tip of the swab when the sample was brought into contact with the extraction reagent composition in the reaction vessel using the reaction vessel and sampling probe shown in FIG. It is sectional drawing.
  • FIG. 3 is a perspective view showing a reaction vessel containing an extraction reagent composition, a pH adjustment reagent composition, and an amplification reagent composition, and a sampling probe according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram of a gene analysis method according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an electrophoresis photograph for confirming amplification of a target nucleic acid in a reaction vessel according to the present invention.
  • the reaction vessel according to the present invention comprises, first, a first chamber containing an extraction reagent composition for extracting nucleic acids from a sample.
  • the reagents contained in this extraction reagent composition are particularly restricted. Without limitation, various nucleic acid extraction methods known to those skilled in the art may be feasible. Those skilled in the art can appropriately determine the composition of the extraction reagent composition according to the nucleic acid extraction method to be used.
  • nucleic acid extraction method examples include an alkali extraction method, a phenol extraction method, a chaotropic reagent extraction method, a chromatographic purification method (WO 95Z01359), and an ultracentrifugation method (Maniatis et al., 1982, Molecular loning: A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) is known. Also known is a method for extracting nucleic acids by decomposing proteins in a sample using a non-specific proteolytic enzyme such as proteinase 1 ⁇ , protease, and subtilisin. However, when a protease is used, it is necessary to inactivate the protease by heat denaturation or the like before mixing the extraction reagent composition and the amplification reagent composition.
  • a non-specific proteolytic enzyme such as proteinase 1 ⁇ , protease, and subtilisin.
  • the extraction reagent composition is a reagent composition for alkali extraction, preferably an aqueous sodium hydroxide solution.
  • the pH of the alkali extraction reagent composition is preferably at least 8, more preferably at least 11, and even more preferably at least 12.
  • the reagent composition for alkali extraction may contain a surfactant.
  • a surfactant any of cationic, anionic, zwitterionic and nonionic surfactants may be used.
  • Such surfactants include, for example, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium N-lauroylsarcosine, C HAPS (3-[(3-coramidopropyl) -dimethyl Ammo] -1 Propanesulfonic acid), polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20) and the like.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • C HAPS 3-[(3-coramidopropyl) -dimethyl Ammo] -1 Propanesulfonic acid
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaurate
  • the nucleic acid extraction method a method of extracting a nucleic acid by decomposing or denaturing a protein and other contaminants in a sample using a protein denaturant can be used. This is effective when extracting.
  • the protein denaturant is not particularly limited as long as it can solubilize the protein, and examples thereof include guanidine salts such as guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, and guanidine carbonate, and urea. And the like. In particular, guadin hydrochloride, Azinthiocyanate and the like are preferred.
  • a chelating agent such as sodium citrate or EDTA, which can suppress the action of nuclease, or a reducing agent such as dithiothreitol (DTT) or ⁇ -mercaptoethanol may be used! ,.
  • the reaction container according to the present invention further comprises a second chamber containing an amplification reagent composition for amplifying the target nucleic acid.
  • the reagent contained in the amplification reagent composition is not particularly limited, and can be any of various nucleic acid amplification methods known to those skilled in the art. A person skilled in the art can appropriately determine the composition of the amplification reagent composition according to the nucleic acid amplification method to be used.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited as long as it can amplify a target nucleic acid of interest from a solution containing nucleic acid (ie, RNA or DNA) extracted from a sample. It is known (see generally, D. Kwoh and T. Kwoh, Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25, 1990).
  • Suitable nucleic acid amplification methods include, for example, polymerase chain reaction (PCR method; U.S. Pat.No. 4,683,195, U.S. Pat.No. 4,683,202, U.S. Pat.No. 4,800,159 and U.S. Pat.
  • RT Reverse transcription PCR
  • LCR ligase chain reaction
  • SDA strand displacement amplification method
  • G. Walker et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396, 1992
  • G. Walker et al. Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696, Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177, 1989
  • self-sustaining sequence replication method (3SR method; J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • thermostable DNA polymerase and nucleic acids at both ends of a target nucleic acid are used.
  • a buffer solution containing a pair of oligonucleotide primers, dNTPs and the like designed based on the nucleotide sequence is used. Therefore, when the PCR method is used, the amplification reagent composition contains these reagents.
  • the three-step force of dissociation (denaturation) of double-stranded nucleic acid that becomes type I into single-stranded nucleic acid, annealing of primer to single-stranded nucleic acid, and synthesis of complementary strand from primer (extension) By repeating such a reaction, amplification of a target nucleic acid with DNA power is enabled. In this method, a total of three steps of adjusting the reaction solution to a temperature suitable for each of the above three steps are repeated.
  • the LCR method two pairs of oligonucleotide probes are usually used. One pair binds to one strand of the target nucleic acid, and the other pair binds to the other strand of the target nucleic acid. Each pair together completely overlaps the corresponding strand.
  • the reaction is performed by first denaturing (i.e., separating) the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid sample and then reacting the two pairs of oligonucleotide probes with the strand in the presence of thermostable ligase.
  • the pair of oligonucleotide probes are ligated together, then the reaction products are separated and cycled until the sequence is amplified to the desired degree. Therefore, when the LCR method is used, the amplification reagent composition contains the above-mentioned two pairs of oligonucleotide probes, a thermostable ligase, a buffer and the like.
  • the amplification reagent composition enables amplification of a target nucleic acid at a constant temperature. Accordingly, the amplification reagent composition is capable of performing an isothermal amplification method.
  • an isothermal amplification method include the above-described 3SR method, Q ⁇ replicase method, NASBA method, SDA method, LAMP method, and the like.
  • Examples include the ICAN method.
  • Preferred isothermal amplification methods include the SDA method, the LAMP method, and the ICAN method.
  • a pair of amplification primers having a restriction enzyme recognition site and a further pair of bumper primers sandwiching the amplification region are used, so that a total of four primers can be used.
  • the restriction enzyme nicks the restriction site on the amplification primer, and then the DNA polymerase performs elongation synthesis from the lock to the 3 'side of the amplification primer, displacing the downstream complementary strand of the previously formed target strand. You. This process is repeated indefinitely, because the restriction enzymes This is because the site force also nicks the new complementary strand continuously, and the restriction site force containing the DNA polymerase force continuously forms the new complementary strand. Therefore, when the SDA method is used, the amplification reagent composition contains the above four primers, a restriction enzyme, a DNA polymerase, a buffer and the like.
  • an amplification method using an isothermal amplification primer developed by the present inventors can also be suitably used.
  • This method uses a special primer (isothermal amplification primer) in a nucleic acid amplification method using a strand displacement reaction.
  • the primer comprises a sequence (Ac ′) that hybridizes to the sequence (A) at the 3 ′ end of the target nucleic acid sequence in the first strand of the double-stranded ⁇ nucleic acid at the 3 ′ end,
  • the sequence ( ⁇ ′) that hybridizes to the complementary sequence (Be) of the sequence (B) existing 5 ′ to the sequence (A) relative to the sequence (A) is included at the 5 ′ side of the sequence (Ac ′).
  • X is the number of bases in the sequence (Ac ′).
  • (X—Y) ZX is in the range of ⁇ 1.00-1.00.
  • X and ⁇ are as described above, and the number of bases of the intervening sequence is Is the first primer, where-- ⁇ ,) ⁇ 7 is in the range of -1.00-1.00.
  • a second primer similar to this is prepared for the other strand of the double-stranded ⁇ nucleic acid, and the second primer is a target nucleic acid sequence of the second strand of the double-stranded ⁇ nucleic acid.
  • a sequence (Cc) that hybridizes to the sequence (C) at the 3′-terminal portion is included in the 3′-terminal portion, and is complementary to the sequence (D) located 5 ′ to the sequence (C) in the target nucleic acid sequence.
  • a second primer comprising a sequence (D ′) hybridizing to the sequence (Dc) on the 5 ′ side of the sequence (Cc), wherein the sequence (Cc) and the sequence (D ′) are included in the primer.
  • the above isothermal amplification primer has a (X- ⁇ ) 1. 1.00 or more, preferably 0, when there is no intervening sequence between the sequence (Ac) and the sequence ( ⁇ ') constituting the primer. 0.00 or more, more preferably 0.05 or more, more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, preferably 0.75 or less, more preferably 0.50 or less, and further preferably 0.25 or less. It is designed to be as follows. Further, ( ⁇ + ⁇ ) is preferably at least 15, more preferably at least 20, more preferably at least 30, and also preferably at most 50, more preferably at most 48, even more preferably at most 42. It is said.
  • the above isothermal amplification primer has the formula (X— ( ⁇ — ⁇ ′ ⁇ ⁇ 1.00 or more, preferably 0.000 or more, more preferably 0.05 or more, more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, preferably 0.75 or less, and It is preferably designed to be 0.50 or less, more preferably 0.25 or less, and ( ⁇ + ⁇ + ⁇ ′) is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, and further preferably 30 or more. It is preferably 100 or less, more preferably 75 or less, and still more preferably 50 or less.
  • the above isothermal amplification primers are composed of deoxynucleotides and ⁇ or ribonucleotides, and perform base pairing with a target nucleic acid while maintaining required specificity under given conditions. Having a chain length that can produce
  • the length of the above-mentioned isothermal amplification primer is preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 30 to 60 nucleotides.
  • the lengths of the sequence (Ac ′) and the sequence ( ⁇ ′) constituting the above isothermal amplification primer are preferably 5 to 50 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides, respectively. If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Ac ′) and the sequence ( ⁇ ′).
  • the DNA polymerase used in the isothermal amplification primer method by the present inventors may be any of normal temperature, medium temperature, or heat resistance as long as it has a strand displacement activity (strand displacement ability). Can also be suitably used.
  • the DNA polymerase may be either a natural form or a mutant obtained by artificially mutating. More Preferably, the DNA polymerase does not have substantially 5, ⁇ 3, exonuclease activity.
  • Such DNA polymerases include DNAs derived from thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B. st”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B. ca”). Mutants lacking the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the polymerase, and the Tarenow fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli.
  • reagents used in the isothermal amplification primer method by the present inventors include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate and magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, Tricine buffer, Buffers such as sodium phosphate buffer and potassium phosphate buffer can be used. Further, use additives such as dimethyl sulfoxide and betaine ( ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylglycine), acidic substances and cation complexes described in International Publication No. 99Z54455 pamphlet.
  • catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate and magnesium sulfate
  • substrates such as dNTP mix
  • Tris-HCl buffer Tricine buffer
  • Buffers such as sodium phosphate buffer and potassium phosphate buffer
  • use additives such as dimethyl sulfoxide and betaine ( ⁇ , ⁇ , ⁇ -trimethylglycine), acidic substances and cation complexes described in International Publication No.
  • the isothermal amplification primer method by the present inventors can amplify a target nucleic acid sequence having a double-stranded force under a constant temperature condition.
  • the principle is that first, the first and second primers anneal to the first and second strands (first and second type III nucleic acids) of the target nucleic acid, respectively, and a primer extension reaction occurs, and First and second complementary nucleic acids containing the complementary sequence of the target nucleic acid sequence are synthesized, and then the sequence ( ⁇ ′) and the sequence (D ′) present on the 5 ′ side of the first and second complementary nucleic acids are synthesized.
  • the other primers are annealed to perform the strand displacement reaction, so that The first and second complementary nucleic acids thus formed are replaced by complementary nucleic acids newly synthesized by the other primers.
  • the isothermal amplification primer anneals to the target nucleic acid, the 3 'end force of the primer also causes an extension reaction, and the extension product is used as the target. Only when the primer contains a sequence of the same sequence, the sequence at the 5 'end of the primer causes hybridization of the extension product, which allows subsequent similar isothermal amplification primers to anneal, enabling continuous amplification reaction. Become.
  • this amplification method can be said to be a highly specific amplification method compared to other amplification methods. Furthermore, because of the highly specific amplification method, the amplification product is subjected to hybridization using a DNA probe or the like to confirm whether the amplification product is the target amplification product. Not necessarily required.
  • the isothermal amplification primer method by the present inventors can be carried out by maintaining the temperature at which the activity of the enzyme to be used can be maintained.
  • the reaction temperature in order for the primer to anneal to the target nucleic acid, for example, it is preferable to set the reaction temperature to a temperature near the melting temperature (Tm) of the primer or lower. It is preferable that the stringency level is set in consideration of the melting temperature (Tm) of the primer. Accordingly, this temperature is preferably between 20 ° C and 80 ° C, more preferably between about 35 ° C and about 65 ° C.
  • the pH of the amplification reagent composition is set so that when mixed with the extraction reagent composition, the pH becomes appropriate for the amplification reaction.
  • a reagent composition for alkali extraction is used as the extraction reagent composition and the pH is too high for the amplification reaction, it is preferable to previously lower the pH of the amplification reagent composition.
  • Suitable pH for the amplification reaction is generally in the range 5-12, preferably in the range 7-10.
  • the reaction container according to the present invention comprises, between the first chamber and the second chamber, a target pH of the extraction reagent composition by the amplification reagent composition. It further comprises a third chamber containing a pH-adjusting reagent composition for making it suitable for a nucleic acid amplification reaction.
  • Acids that can be used in the pH adjusting reagent composition include mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid, carboxylic acids such as acetic acid, citric acid, phthalic acid, fumaric acid, and maleic acid, and methanesulfonic acid. Preferred are acids and organic sulfonic acids such as p-toluenesulfonic acid. Mineral acids are preferred, and hydrochloric acid is more preferred.
  • the alkali that can be used in the pH adjusting reagent composition is typically an aqueous sodium hydroxide solution.
  • the reaction vessel according to the present invention further includes a separating means for separating the first chamber and the second chamber, and when the third chamber is provided, the separation means is provided.
  • the separation between the first chamber, the second chamber, and the third chamber is released.
  • the extraction reagent composition in the first chamber, the amplification reagent composition in the second chamber, and the pH adjusting reagent composition in the third chamber can be mixed.
  • Examples of the method of releasing separation by physical energy include release by applying heat, release by irradiating light, release by applying vibration, stress, or the like by a machine or operator.
  • Preferred separation means are those that are released by the application of heat.
  • the separation means is not particularly limited as long as it does not allow water to permeate at room temperature and at the temperature used for nucleic acid extraction, but is preferably a water-impermeable film, more preferably a water-impermeable membrane. It is attributed to a permeable hydrophobic coating. Further, it is preferable that such a water-impermeable film can be melted by the above-mentioned physical energy from the outside of the reaction vessel. Further, it is preferable that the water-impermeable hydrophobic film be a liquid having a smaller density than water when it is melted.
  • a water-impermeable hydrophobic film is formed again on the uppermost portion of the reagent, so that leakage of the reagent, which is strong in the reaction container, can be prevented.
  • Examples of such a water-impermeable hydrophobic film include waxes and mixtures thereof.
  • Wax is an organic substance that melts when heated to form a liquid having a density lower than that of water (synthetic or natural, for example, mineral, wax derived from plants or animals). It is. Generally, waxes are esters of high molecular weight fatty acids and high molecular weight alcohols. Representative pure waxes include eicosane (CH) and octacosan (CH)
  • C H cetyl balmitate
  • C H O pentaerythritol tetrabehenate
  • wax mixtures include, but are not limited to, paraffin, PARAPLAST TM wax (Sherwood Medical), ULTRAFLEX TM wax (Petrolite Corporation), BESQ UAR TM 175 wax (Petrolite Corporation) And the like.
  • Waxes may be purchased or mixed with pure or mixed waxes with other waxes or by appropriate greases which retain the relative hardness, reduced wax specific tack and desired melting temperature. Alternatively, it can be produced by mixing with oils. Utilizing mixed waxes, for example, paraffins having different melting temperatures, the reagents are separated into two or three layers, and if necessary, are melted. It is also possible to mix them in combination.
  • the above grease is an organic substance, and is a solid or semi-solid at normal temperature (around 25 ° C). Force is very soft at a temperature slightly lower than about 40 ° C and melts in the range of 40-80 ° C. Liquid. The density of grease is smaller than the density of water.
  • a typical grease is white petrolatum (eg, petrolatum, petroleum jelly, etc.), which is a mixture of high molecular weight hydrocarbons.
  • the above wax is an organic substance and is solid at room temperature (around 25 ° C), but it is much harder than grease at temperatures below about 40 ° C and melts at a slightly higher temperature and has a lower density than water Become liquid. Waxes adhere less to solid (eg, plastic) surfaces than greases and oils.
  • the separation means as described above, it is possible to mix the respective reagent compositions held in a separated form in the reaction vessel according to the present invention, if necessary.
  • the water-impermeable membrane does not melt at the temperature at the time of nucleic acid extraction by the extraction reagent composition, and does not melt at the time of amplification of the target nucleic acid by the amplification reagent composition. Melts at temperature.
  • nucleic acid extraction is performed. After completion of the dispensing, by adjusting the temperature for the amplification reaction, it becomes possible to mix the respective reagents and components.
  • each reagent composition may be in a solid state. As a result, it is possible to prevent leakage of the respective reagent compositions due to vibration during transportation and transportation, or to prevent undesirable mixing of the reagent compositions.
  • the method for immobilizing the reagent composition is not particularly limited as long as the method can immobilize the reagent in a state where the reagent is uniformly dispersed in the reagent immobilizing layer. Therefore, as a material for fixing the reagent, a material that forms a matrix may be used, a material that does not form a matrix may be used, or a combination of these may be used.
  • the immobilized material may be a material that dissolves with the reaction reagent when the reaction container according to the present invention is used, or may be a material that does not dissolve. Further, as the immobilizing material, an immobilizing material is used such that the immobilizing layer of the reagent composition obtained by using the immobilizing material does not elute eluting components that impair the effects of the present invention.
  • reaction reagent Even when a material that forms a matrix and does not dissolve with the reaction reagent is used as the fixing material, since the molecules of the reaction reagent are usually much smaller than the matrix size, If the solution containing the sample comes into contact with the immobilized reagent composition, the reaction reagent can be sufficiently dissolved in the solution.
  • the reagent composition is encapsulated in a gel matrix such as agarose gel, alginic acid gel, carrageenan gel, curdlan gel, chitosan gel, and immobilized.
  • a method of shading a method of incorporating into a three-dimensional crosslinked structure such as a photocurable resin such as a photocrosslinkable polybutyl alcohol or a polyacrylamide and fixing the same, and a water-soluble and viscous material such as CMC.
  • a method of fixing and fixing are a method of these immobilization methods involve the step of adding the reagent composition to the raw materials of the immobilization material and mixing them.
  • the reagent composition is added as it is, it is added in the form of a solution. It may be done. Further, it is also possible to fix the reagent by combining these methods. According to the specific fixing method described above, since the reagent composition is fixed in a wet state, it is particularly preferable to dry it, which is advantageous when a reagent is used.
  • the reaction container according to the present invention comprises the extraction reagent set
  • the product and at least one of the amplification reagent composition are encapsulated in a gel that can be melted by physical energy from outside the reaction vessel.
  • the method of melting the gel by physical energy include melting by applying heat and melting by irradiating light.
  • Preferred gels melt on application of heat.
  • it is preferable that the gel does not melt at the temperature at the time of nucleic acid extraction by the extraction reagent composition and melts at the temperature at the time of amplification of the target nucleic acid by the amplification reagent composition.
  • the reaction container according to the present invention after the nucleic acid extraction is completed, it is possible to mix the respective reagent compositions by adjusting the temperature for the amplification reaction.
  • the reagent composition fixed by the above method may be in a dry state. This makes it possible to prevent deterioration of the reagent composition due to long-term storage.
  • the drying method include a general method, for example, drying by heating, vacuum drying, freeze drying and the like. It is also possible to use the technique for stable drying of reagents described in U.S. Pat. No. 4,891,319, and the method for stable amplification of nucleic acid amplification enzymes described in JP-T-10-503383. Wear.
  • trehalose and / or polyvinylpyrrolidone can be used as a stabilizer, and according to this, enzymes such as DNA polymerase can be stably retained, particularly when the reagent is freeze-dried.
  • a liquid such as water may be replenished as needed when using the reaction container according to the present invention.
  • the reaction container according to the present invention further includes an opening that allows the sample to be introduced only into the first chamber.
  • the sample introduced from the opening of the reaction vessel comes into contact with only the extraction reagent composition, and efficient nucleic acid extraction can be performed without contact with other reagent compositions.
  • the extraction reagent composition and the amplification reagent composition are separately held, and these are mixed after nucleic acid extraction and before nucleic acid amplification reaction.
  • Mixing of these reagent compositions can be performed by a general method such as convection of a liquid by heating or shaking of a reaction vessel.However, in order to perform mixing more efficiently, a mixing means is provided in the reaction vessel. Can also be incorporated.
  • a mixing means for example, a carrier such as beads may be put in a container in advance. Specifically, the above-described water-impermeable coating is provided on the upper part of the container, and the carrier is fixed in the coating, and the coating is melted by physical energy such as heat to lower the carrier.
  • the carrier can be formed into a propeller type shape by using nanotechnology, whereby the mixing efficiency can be increased by the rotation of the propeller when falling from the upper part to the lower part in the reaction vessel.
  • the reagent composition can be mixed by moving the magnetic beads in the reaction vessel by the magnetism of an external force.
  • the above-mentioned water-impermeable film may be fixed in advance at the lower portion of the reaction vessel. In this case, the film is formed by physical energy such as heat. By melting, the melted film moves to the upper part, so that the reagent composition can be mixed. Therefore, it is preferable that the reaction vessel according to the present invention has a portion whose internal cross-sectional area decreases in the direction from the opening to the bottom. By adopting such a shape, the melted film easily moves to the upper part.
  • the target nucleic acid amplified using the reaction container according to the present invention may be detected by a general method, for example, a method using a specific probe with a detectable label. It is also possible to configure the reaction vessel such that a signal can be generated based on the presence of the amplification product. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the reaction container according to the present invention further comprises a signal generating means based on the amplification product. In such a case, the reaction container according to the present invention is preferably capable of transmitting the signal of the nucleic acid amplification product. This makes it possible to detect the amplification product without removing it from the container.
  • the signal generating means those known to those skilled in the art can be used, and are not particularly limited.
  • an intercalator such as ethidium amide or SYBR Green I (Molecular Probe) is used. be able to. Since these intercalators bind to double-stranded DNA, their fluorescence intensity is directly proportional to the concentration of double-stranded DNA. Therefore, if the fluorescence from the intercalator is strong, it indicates that the amplification product is present at a high concentration. Thus, the target nucleic acid is detected. Therefore, by mixing such an intercalator in the amplification reagent composition in advance, it becomes possible to generate a signal based on the amplification product.
  • an intercalator such as ethidium amide or SYBR Green I (Molecular Probe) is used. be able to. Since these intercalators bind to double-stranded DNA, their fluorescence intensity is directly proportional to the concentration of double-stranded DNA. Therefore, if the fluorescence from the intercalator is strong,
  • a signal generation means such as Fluorescence Resornance Energy Transfer (FRET) may be used.
  • FRET occurs only when the two probes hybridize to the amplification product in close proximity, and when the hybridization probes are not adjacent to each other and there is no specific DNA that can be hybridized. Does not occur. Therefore, two probes capable of specifically hybridizing to two adjacent regions of the target nucleic acid may be mixed in the amplification reagent composition in advance.
  • the substrate (dNTPs) also releases pyrophosphate ions, which are combined with magnesium ions in the amplification reagent composition to produce magnesium pyrophosphate, which makes the reaction solution cloudy. I do.
  • the primer may be previously bound to a carrier such as beads or colloidal gold particles. In this case, since the carrier aggregates when the target nucleic acid is amplified, the amplification product can be detected by visually confirming the aggregation.
  • the material of the reaction vessel may be transparent or translucent, for example, a thermoplastic polymer or the like.
  • a thermoplastic polymer polypropylene, polystyrene, polymethylpentene, and copolymers or mixtures thereof can be used.
  • a transparent glass may be used.
  • a material having the same material strength is used.
  • ultraviolet rays, infrared rays, etc. those that transmit them are preferable.
  • the reaction container according to the present invention can be used as a nucleic acid detection kit together with other tools used for amplifying a target nucleic acid having a sample capacity.
  • Other utensils typically include sampling utensils. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting a nucleic acid, comprising at least the reaction container according to the present invention and a sampling instrument for collecting a sample.
  • a sampling instrument a pipette or a dropper for sucking a liquid, a force that can be a general one such as a spatula, etc.
  • a sample such as a human oral mucosal cell and sputum should be a swab. Can be easily collected.
  • the swab may be a general one in which the sampling part is made of a material such as cotton, the handle part is slender, and the material is also a material such as a tubular member made of polystyrene. It is preferable that the reaction container can be covered by being inserted into the reaction container. Further, it is preferable that the swivel is one that plugs into an opening of the reaction vessel to close a gap with the reaction vessel. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the swab is capable of bringing the collected sample into contact with the extraction reagent composition in the reaction container according to the present invention, and seals the opening of the reaction container. It can be done.
  • the swab is more preferably processed with a thermoplastic polymer such as plastic.
  • a thermoplastic polymer such as plastic.
  • the thermoplastic polymer polypropylene, polystyrene, polymethylpentene, and copolymers or mixtures thereof can be used.
  • the swivel used for simultaneous testing of a large number of specimens can be separated into two at the elongated part of the handle, and the same reference number etc. should be entered at both ends and stored. Can also identify the sample in the reaction vessel.
  • the tip of the sampling portion of the swab preferably has a protrusion so that more sample can be collected.
  • the kit according to the present invention further comprises a detachment preventing means for preventing detachment of the above-mentioned sleeve from the above-mentioned reaction vessel.
  • a detachment preventing means for preventing detachment of the above-mentioned sleeve from the above-mentioned reaction vessel.
  • the detachment preventing means includes a convex portion or a concave portion provided on the sleeve and the reaction vessel fitted in the convex portion or the concave portion. This is due to the concave portions or convex portions.
  • the swab is one in which the swab is bonded to the lid of a reaction vessel, and the sample is collected by the swab and the lid is used to simultaneously contact the extraction reagent composition in the reaction vessel according to the present invention. It can also be made hermetically sealed.
  • the kit according to the present invention may include a lid for closing the opening of the reaction container, separately from the above-mentioned swivel.
  • the lid need not be strong, and any lid may be used as long as it prevents foreign substances from being mixed.
  • a lid may be, for example, a cellophane tape, a laminate, a wrap, a seal, or the like that covers the reaction vessel to prevent the entry of foreign substances, or a water-impermeable material such as a wax for covering the reaction vessel. It may be a film.
  • FIGS. 13 and 14 show a combination of a reaction vessel and a slave according to a preferred embodiment of the present invention.
  • the lid-cum-swing 1 shown in FIG. 1 has a swivel tip 3 having a projection at the lowermost end thereof, thereby enabling a sample to be efficiently collected.
  • the lid / swing 1 further includes a stopper 2.
  • the reaction vessel 4 shown in FIG. 1 contains an extraction reagent composition 7 and an amplification reagent composition 9, which are separated by a water-impermeable membrane 8. Further, the reaction vessel 4 has a stopper fitting portion 5 whose inner diameter is substantially equal to the outer diameter of the lid / swing 1 and which can be fitted with the stopper 2.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing a state in which a sample is collected by using the lid / slave 1 and applied to the reaction vessel 4.
  • the protrusion at the tip 3 of the subtube penetrates through the membrane 6, whereby the sample attached to the protrusion at the subtip 3 is in contact with the extraction reagent composition 7.
  • the reaction vessel 4 is sealed by a lid / slave 1 having an outer diameter substantially equal to its inner diameter, and the state is maintained by a stopper 2 and a stopper fitting portion 5.
  • FIG. 3 shows a reaction vessel 4 containing a pH-adjusting reagent composition 11 between an extraction reagent composition 7 and an amplification reagent composition 9 and separated by water-impermeable membranes 8 and 10, respectively, and lid Shows dual-purpose sub 1.
  • the reaction vessel according to the present invention is used for detecting a target nucleic acid as well as a sample force. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for detecting a target nucleic acid using a reaction container according to the present invention,
  • the sample is not particularly limited as long as it is suspected of containing the target nucleic acid, and examples include a sample derived from an organism, processed food, wastewater, drinking water, air, and the like.
  • the organism may be any of animals, plants, and microorganisms.
  • the animal is preferably a mammal, more preferably a human.
  • Animal samples include blood, stool, sputum, mucus, serum, urine, saliva, tears, biopsy samples, histological tissue samples, tissue cultures, and the like.
  • Plants include agricultural crops, houseplants, and natural food plants.
  • the target nucleic acid is not particularly limited as long as useful information can be obtained by detection. Examples thereof include a wild-type gene or a mutant gene or a nucleic acid having a nucleic acid sequence specific to a pathogen.
  • Can be Pathogens include, for example, viruses, bacteria, fungi and the like.
  • a wild-type gene is used as a target nucleic acid
  • a disease caused by the gene deficiency is detected by not detecting the target nucleic acid.
  • a mutant gene is used as a target nucleic acid
  • the target nucleic acid is detected, whereby a disease caused by the gene mutation is detected.
  • an infectious disease caused by the pathogen is detected by detecting the target nucleic acid.
  • the above steps in the nucleic acid detection method according to the present invention may be performed, for example, according to the configuration of the reaction container according to the present invention, for example, the nucleic acid extraction method used in the reaction container, the separation between reagent compositions, It can be easily carried out depending on the separation means and the nucleic acid amplification method.
  • the detection of a signal from the nucleic acid amplification product can be appropriately performed by those skilled in the art by a general method such as a method using a specific probe to which a detectable label is attached. When the signal generating means is present in the reaction vessel in advance, the signal can be easily detected by using this.
  • the signal detected in the above step (d) or the result obtained by the signal is input to a computer for gene analysis, and It is also possible to output an analysis result by a computer. Therefore, according to the present invention, after the steps (a) to (d),
  • a gene analysis method comprising the steps of:
  • the input to the computer in the step (e) and the output from the computer in the step (g) are preferably performed via a communication network such as the Internet.
  • a signal detection device is connected to a communication device, and the obtained signal is transmitted to a gene analysis center or the like, where a more detailed analysis is performed.
  • a communication device a personal computer, a portable terminal such as a mobile phone, or the like that can transmit and receive information via a communication network such as the Internet is suitably used.
  • FIG. 4 shows a conceptual diagram of a gene analysis method according to a preferred embodiment of the present invention.
  • a signal based on the amplification product is detected by the signal detection device 402.
  • the detected signal is input from the portable terminal 403 to the gene analysis computer 405 via the Internet 404. It is.
  • the computer for gene analysis 405 the input signal is compared with the information indicated by the presence or absence of the target nucleic acid stored in the information storage device 406 and the information related thereto, thereby characterizing the signal.
  • a search is made for information associated with and Z or the signal.
  • the characteristics of the signal and the Z or information related to the signal are output by the portable terminal 403 via the Internet 404.
  • the output information is stored in the information storage device 407 by the portable terminal 403.
  • the gene analysis method provides, for example, a method for detecting a disease or disorder and information on the disease or disorder if the target nucleic acid indicates a disease or disorder due to its presence or absence.
  • the characteristics of the output signal include the name of the disease or disorder indicated by the signal, the name of the gene containing the target nucleic acid, and the like. Or a description of the disorder, a method of coping with the disease or disorder, an effective therapeutic agent, a method for more precise diagnosis, and the like.
  • a computer for gene analysis can perform a complicated analysis, when there are a plurality of genes involved in a target disease or disorder, a nucleic acid detection method for each gene is performed. By transmitting all the results (signals), more accurate analysis results can be obtained.
  • the nucleic acid detection method according to the present invention can be performed by the subject himself, and thereafter, the subject also performs gene analysis using a communication device, thereby preventing leakage of genetic information. Is done. Furthermore, by managing personal information using a portable terminal or the like owned by an individual, it is possible to retain and manage complicated genetic information. Also, based on the genetic information, it is possible to select a hospital or store according to the individual's purpose.
  • the reaction container according to the present invention can be used for diagnosing a disease or disorder or determining a risk of developing the disease or disorder.
  • a reaction container according to the present invention in diagnosing a disease or disorder or determining a risk of developing the disease or disorder.
  • the kit for nucleic acid detection was prepared as follows. First, the amplification reagent (Tris-HCl (20 mM, pH 8.8), 10 mM KC1, 10 mM (NH) SO4 in a total of 20 L) was placed on the bottom of a cylindrical transparent reaction vessel (2-3 mm in diameter). , 2 mM MgSO, 1% TritonX—100, 4
  • amplification reagent layer 100 pmol of each primer, 8 U of Bst DNA polymerase (NEW ENGLAND BioLabs), and SYBR®-Green I (Molecular Probes) containing 10000-fold dilution) were added.
  • Amplification reagent layer 10 ⁇ L of hot-melted liquid paraffin (Kanto Iridaku: melted at 50-52 ° C) was overlaid (hydrophobic coating layer). After the norafin was solidified, 0.01 N NaOH (5 / z L) was overlaid thereon as a pretreatment reagent (pretreatment reagent layer).
  • the target sequence was also detected in the oral mucosal cell force of a human subject.
  • human oral mucosal cells were collected using a swab and added to the pretreatment reagent layer. Oral mucosal cells were denatured by allowing to stand at room temperature for 30 minutes, and human genomic DNA was extracted.
  • the amplification reaction was performed by holding the reaction vessel at 60 ° C for 1 hour. By maintaining the temperature at 60 ° C., the hydrophobic coating layer was melted and moved to the uppermost position in the reaction vessel, whereby the pretreatment reagent layer and the amplification reagent layer were mixed. The same experiment was performed on a sample to which no human mucosal cells were added.
  • amplified UV (245 nm) was applied to detect the target nucleic acid.
  • the target sequences for amplification and detection and the primer pairs used were the same as in Example 1.
  • the kit for nucleic acid detection was prepared as follows. First, the amplification reagent (Tris-HCl (20 mM, pH 8.8), 10 mM KC1, 10 mM (NH) SO4 in a total of 20 L) was placed on the bottom of a cylindrical transparent reaction vessel (2-3 mm in diameter). , 8 mM MgSO, 0.1% Tween20, 0.1%
  • the target sequence was also detected in the oral mucosal cell force of a human subject.
  • human oral mucosal cells were collected using a swab and added to the pretreatment reagent layer. Oral mucosal cells were denatured by allowing to stand at room temperature for 30 minutes, and human genomic DNA was extracted.
  • the amplification reaction was performed by holding the reaction vessel at 60 ° C for 1 hour. By maintaining the temperature at 60 ° C., the hydrophobic coating layer was melted and moved to the uppermost position in the reaction vessel, whereby the pretreatment reagent layer and the amplification reagent layer were mixed. The same experiment was performed on the sample without adding human mucosal cells.
  • lane 1 is a 20 bp DNA Lader size marker
  • lane 2 is a sample to which human mucosal mucosal cells were added
  • lane 3 is a control sample to which no human mucosal mucosal cells were added.
  • no band was observed except for the unreacted primer stained.

Abstract

　本発明は、相互に作業行程の異なる核酸抽出および核酸増幅の操作を単一の容器において実施するための反応容器を提供するものである。本発明による反応容器は、サンプルから標的核酸を検出するための反応容器であって、前記サンプルから核酸を抽出するための抽出試薬組成物を含有する第一室、標的核酸を増幅するための増幅試薬組成物を含有する第二室、該第一室と該第二室とを分離するための分離手段、および前記第一室のみに前記サンプルを導入することを可能とする開口部を少なくとも含んでなるものである。前記分離手段は、反応容器外部からの物理的エネルギーによって、前記第一室と前記第二室との分離を解き、これにより前記第一室中の抽出試薬組成物と前記第二室中の増幅試薬組成物との混合を可能とするものである。

Description

明 細 書
核酸検出用キット
発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は、遺伝子検査において、サンプル力もの核酸の抽出および標的核酸の増 幅を一の容器中で行なうことのできる反応容器、該反応容器を含んでなる核酸検出 用キット、ならびに該反応容器を用いる核酸検出法に関する。
[0002] 背景 術
遺伝子検査は疾患または障害の診断方法として有効であり、様々な技術が臨床の 場において実用化されている。これらの技術の多くは、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 等の核酸増幅法を利用するものである。
[0003] 臨床における遺伝子検査には、特殊な生物学的操作が必要とされ、このような操作 は、通常、複数の容器または装置を用いて行われており、また、実験室内の複数の 領域において行なわれることも多い。従って、遺伝子検査においては、生物学的サン プルや試薬を他の容器に移したり、または他の領域に輸送する必要があるため、他 の臨床サンプルや増幅産物によるサンプルの汚染、ならびにサンプルの飛散、エア 口ゾル化等による他のサンプルの汚染が問題となっている。また、サンプルにはいか なる病原体が含まれているか不明であるため、その取り扱いには十分に注意する必 要がある。さらに、遺伝子検査は、特殊かつ高価な器具および装置を用いて行なう必 要がある。また、多くのサンプルを同時に処理する場合には、サンプルを取り違える 可能性もある。
[0004] とりわけ、上述のサンプルの汚染は偽陽性の結果をもたらす可能性があるため、こ れを防ぐことは重要な課題となっている。特に、核酸増幅法を利用する遺伝子検査に おいては、サンプルは、同じ器具および装置を用いて行なわれた先の増幅反応によ る増幅産物 (アンプリコン）により容易に汚染され、これにより偽陽性を示す。
[0005] 従来、これらの問題点を解決するためにいくつかの試みがなされてきた。例えば、 米国特許第 2675989号明細書には、核酸増幅のための装置が記載されている。こ の装置は、導入されたサンプルを空気吸引 Z排出手段を使用して移動させること〖こ よって、サンプルの反応チャンバ一への導入および反応液の取り出しを行うものであ る。この装置は、特殊な空気吸引 Z排出手段を使用する必要がある。また、この装置 には増幅産物の検出手段が含まれておらず、検出のためには電気泳動などの別の 工程を必要とする。
[0006] 米国特許第 5229297号明細書には、サンプル、増幅用試薬および廃物部を連結 する通路力もなる遺伝子増幅および検出のためのキュベットが記載されている。これ は、ローラーという特殊な装置を用いて、サンプルを一定方向に圧搾'圧迫していくこ とにより、サンプルおよび検出試薬を隔離していた隔壁が破れ、これらの混合物が通 路を通って検出部、さらには廃物部へ押し出されるように構成されている。このキュべ ットもまた、特殊で複雑な手段および容器を使用する必要がある。
[0007] 国際公開第 95Z11083号パンフレットには、核酸増幅アツセィに用いられる使い 捨て反応チューブが記載されている。この反応チューブは、密閉するための蓋が貫 通可能なものとされており、これにより、増幅反応の後にピぺッターを蓋に貫通させ、 蓋を開けることなくサンプルを検出部に移動させることが可能となる。この反応チュー ブは、サンプルの飛散およびエアロゾルの発生による他のサンプルへの汚染を防止 し、さら〖こは、偽陽性の可能性も低減するが、サンプル中に含まれる病原体の感染の 危険性、操作の複雑性、特殊な装置の必要性などは排除していない。
発明の概要
[0008] 本発明者らは、サンプル力ゝらの核酸抽出および標的核酸の増幅が、それぞれに必 要となる試薬群を分離した状態で含有する一つの反応容器において可能となること を見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
[0009] 従って、本発明の目的は、相互に作業行程の異なる核酸抽出および核酸増幅の 操作を単一の容器において実施するための反応容器、これを含む核酸検出用キット 、ならびに前記反応容器を用いた核酸検出法を提供することにある。
[0010] そして、本発明による反応容器は、サンプル力も標的核酸を検出するための反応 容器であって、前記サンプルカゝら核酸を抽出するための抽出試薬組成物を含有する 第一室、標的核酸を増幅するための増幅試薬組成物を含有する第二室、該第一室 と該第二室とを分離するための分離手段、および前記第一室のみに前記サンプルを 導入することを可能とする開口部を少なくとも含んでなり、前記分離手段が、反応容 器外部から物理的エネルギーを与えることによって、前記第一室と前記第二室との 分離を解き、これにより前記第一室中の抽出試薬組成物と前記第二室中の増幅試 薬組成物との混合を可能とするものである、反応容器である。
[0011] また、本発明による核酸検出用キットは、本発明による反応容器と、サンプルを採取 するためのサンプリング用器具とを少なくとも含んでなるものである。
[0012] さらに、本発明による核酸検出法は、本発明による反応容器を用いてサンプルから 標的核酸を検出する方法であって、
(a)サンプルを前記反応容器中の抽出試薬組成物と接触させ、該サンプル中の核酸 を抽出する工程、
(b)前記反応容器外部からの物理的エネルギーにより前記反応容器中の複数の試 薬組成物を混合する工程、
(c)前記反応容器中で増幅反応を行なう工程、および
(d)核酸増幅産物からのシグナルを検出する工程
を含んでなるものである。
[0013] 本発明によれば、サンプル力 の核酸の抽出および標的核酸の増幅が単一の反 応容器中で実行可能となり、これにより、反応混合物を他の容器に移すことによるサ ンプルの汚染の可能性ならびに他のサンプルまたは環境の汚染の可能性が減少す る。また、反応容器を使い捨てとすることが可能となり、これにより、同じ容器を繰り返 して使用することによるサンプルの汚染の可能性がなくなる。さらに、本発明による核 酸検出法によれば、煩雑な生物学的操作が必要とされず、熟練者でなくとも、迅速か つ高感度な標的核酸の検出が可能となる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、本発明の好ましい実施態様による、抽出試薬組成物および増幅試薬組 成物を含む反応容器およびサンプリング用スヮブを示した斜視図である。
[図 2]図 2は、図 1に示す反応容器およびサンプリング用スヮブを用いて、スヮブ先端 に付着したサンプルを反応容器中の抽出試薬組成物に接触させたときのこれらの形 状を示した断面図である。 [図 3]図 3は、本発明の好ましい実施態様による、抽出試薬組成物、 pH調整試薬組 成物および増幅試薬組成物を含む反応容器およびサンプリング用スヮブを示した斜 視図である。
[図 4]図 4は、本発明の好ましい実施態様による遺伝子解析法の概念図である。
[図 5]図 5は、本発明による反応容器における、標的核酸の増幅を確認するための電 気泳動写真である。
符号の説明
[0015] 1 蓋兼用スヮブ
2 ストッノ一
3 スヮブ先端部
4 反応容器
5 ストッパー嵌合部
6 膜
7 抽出試薬組成物
8 水非透過性皮膜
9 増幅試薬組成物
10 水非透過性皮膜
11 pH調整試薬組成物
401 本発明による反応容器
402 シグナル検出装置
403 携帯用端末
404 インターネット
405 遺伝子解析用コンピュータ
406 情報記憶装置
407 情報記憶装置
発明の具体的説明
[0016] 本発明による反応容器は、まず、サンプル力も核酸を抽出するための抽出試薬組 成物を含有する第一室を含んでなる。この抽出試薬組成物に含まれる試薬は特に制 限されるものではなぐ当業者に知られている様々な核酸抽出法を実行可能なものと することができる。抽出試薬組成物の組成は、利用する核酸抽出法に応じて、当業 者であれば適宜決定することができる。
[0017] 核酸抽出法としては、例えば、アルカリ抽出法、フ ノール抽出法、カオトロピック試 薬抽出法、クロマトグラフィー精製法 (WO 95Z01359)および超遠心分離法（ Maniatisら, 1982, Molecularし loning: A Laboratory Manual, Cold bpnng Haroor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)が知られている。また、プロティナ一ゼ1^、プロ テアーゼ、スブチリシン等の非特異的なタンパク質分解酵素を用いてサンプル中のタ ンパク質を分解することにより核酸を抽出する方法も知られている。ただし、タンパク 質分解酵素を用いる場合には、抽出試薬組成物と増幅試薬組成物とを混合する前 に、熱変性等によりそのタンパク質分解酵素を失活させる必要がある。
[0018] 本発明の好ましい実施態様によれば、前記抽出試薬組成物はアルカリ抽出用の試 薬組成物、好ましくは水酸ィ匕ナトリウム水溶液とされる。アルカリ抽出用試薬組成物の pHは、好ましくは 8以上、より好ましくは 11以上、さらに好ましくは 12以上とされる。
[0019] アルカリ抽出用試薬組成物は、界面活性剤を含むものとしてもよい。界面活性剤と しては、陽イオン性、陰イオン性、両イオン性および非イオン性のいずれのものを用 いてもよい。このような界面活性剤としては、例えば、臭化セチルトリメチルアンモ-ゥ ム（CTAB)、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 N ラウロイルサルコシンナトリウム、 C HAPS (3— [ (3—コラミドプロピル)—ジメチルアンモ-ォ ]—1 プロパンスルホン酸）、 ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween 20)等が例示される力 これらに 限定されない。組成物中の界面活性剤の濃度は特に制限されないが、好ましくは 0. 005— 5% (w/v)、より好ましくは 0.01— 2% (w/v)とされる。
[0020] 核酸抽出法としては、タンパク質変性剤を用いて、サンプル中のタンパク質および その他の混在物を分解または変性することにより核酸を抽出する方法を利用すること もでき、この方法は、特に RNAを抽出する場合に有効である。タンパク質変性剤とし ては、タンパク質を可溶ィ匕しうるものであればよぐ特に制限されないが、例えば、グ ァニジン塩酸塩、グァニジンチォシアン酸塩、グァニジン炭酸塩などのグァニジン塩 、尿素などを含むカオトロピック物質などが挙げられる。特に、グァ-ジン塩酸塩、グ ァ-ジンチォシアン酸塩などが好ましい。タンパク質変性剤を用いることにより、生体 試料に混在する可能性のある RNaseの作用を効率よく抑制することが可能である。 また、核酸分解酵素の作用を抑制しうるクェン酸ナトリウム、 EDTA等のキレート剤や 、ジチオスレィトール（DTT)、 βメルカプトエタノール等の還元剤を用いてもよ！、。
[0021] 本発明による反応容器は、さらに、標的核酸を増幅するための増幅試薬組成物を 含有する第二室を含んでなる。この増幅試薬組成物に含まれる試薬は特に制限され るものではなぐ当業者に知られている様々な核酸増幅法を実行可能なものとするこ とができる。増幅試薬組成物の組成は、利用する核酸増幅法に応じて、当業者であ れば適宜決定することができる。
[0022] 核酸増幅法は、サンプルより抽出された核酸 (すなわち、 RNAまたは DNA)を含む 溶液から目的とする標的核酸を増幅させうる方法であればよぐこのような方法として は様々なものが知られている（一般的には、 D.Kwohと T.Kwoh, Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25, 1990を参照されたい)。適切な核酸増幅法としては、例えば、ポリメラーゼ 連鎖反応法 (PCR法;米国特許第 4683195号明細書、米国特許第 4683202号明 細書、米国特許第 4800159号明細書および米国特許第 4965188号明細書)、逆 転写 PCR法（RT— PCR法； Trends in Biotechnology 10, ppl46- 152, 1992)、リガ一 ゼ連鎖反応法 (LCR法;欧州特許出願公開第 0320308号明細書、 R.Weiss, Science 254, 1292, 1991)、鎖置換増幅法（SDA法； G.Walkerら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396, 1992 ; G.Walkerら， Nucleic Acids Res. 20, 1691—1696, 1992) 、転写に基づく増幅法（D.Kwohら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177, 1989 )、自己維持配列複製法（3SR法; J.Guatelliら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878, 1990)、 Q j8レプリカーゼ法（P丄 izardiら， BioTechnology 6, 1197-1202, 1988)、核酸配列に基づく増幅法（NASBA法； R丄 ewis, Genetic Engineering News 12(9), 1, 1992)、修復鎖反応法（RCR法； R丄 ewis, Genetic Engineering News 12(9), 1, 1992)、ブーメラン DNA増幅法（BDA法； R丄 ewis, Genetic Engineering News 12(9), 1, 1992)、 LAMP法（国際公開第 00Z28082号パンフレット）、 ICAN法（国 際公開第 02Z16639号パンフレット）などが挙げられる。
[0023] 例えば、 PCR法では、通常、熱安定性 DNAポリメラーゼ、標的核酸の両端のヌクレ ォチド配列に基づ 、て設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマー、 dNTPなどを 含む緩衝液が用いられる。従って、 PCR法を利用する場合には、前記増幅試薬組成 物はこれらの試薬を含むものとされる。 PCR法では、铸型となる二本鎖核酸の一本 鎖核酸への解離 (変性）、一本鎖核酸へのプライマーのアニーリング、およびプライマ 一からの相補鎖合成 (伸長）の 3つの段階力 なる反応を繰り返すことにより、 DNA 力 の標的核酸の増幅が可能とされる。この方法では、反応溶液を上記 3段階のそ れぞれに適した温度に調節する計 3工程が繰り返される。
[0024] また、 LCR法では、通常、 2対のオリゴヌクレオチドプローブが用いられ、一つの対 は標的核酸の一方の鎖に結合し、他方の対は標的核酸の他方の鎖に結合する。各 対は共に対応する鎖と完全にオーバーラップする。反応は、第一に、核酸試料中の 二本鎖核酸を変性 (即ち、分離)し、次に、熱安定性リガーゼの存在下で 2対のオリゴ ヌクレオチドプローブを鎖に反応させることにより、各対のオリゴヌクレオチドプローブ が共に連結され、次に反応産物を分離し、そして配列が所望の程度に増幅されるま で、循環して繰り返される。従って、 LCR法を利用する場合には、前記増幅試薬組成 物は、上記の 2対のオリゴヌクレオチドプローブ、熱安定性リガーゼ、緩衝液等を含む ちのとされる。
[0025] 本発明の好ましい実施態様によれば、前記増幅試薬組成物は、一定の温度下で の標的核酸の増幅を可能とするものとされる。従って、前記増幅試薬組成物は等温 増幅法を実行可能なものとされ、このような等温増幅法としては、例えば、上述の 3S R法、 Q βレプリカーゼ法、 NASBA法、 SDA法、 LAMP法、 ICAN法などが挙げら れる。好ましい等温増幅法としては、 SDA法、 LAMP法、および ICAN法が挙げら れる。
[0026] 例えば、 SDA法では、制限酵素認識部位を有する一対の増幅プライマーと、その 増幅領域をはさむような、さらにもう一対のバンパープライマーの合計 4本のプライマ 一を用いることにより、等温条件下で標的核酸を増幅することができる。制限酵素に より増幅プライマー上の制限部位にニックが入り、次いで DNAポリメラーゼにより該- ックから増幅プライマーの 3'側に伸長合成がなされ、前に形成された標的鎖の下流 相補鎖が置換される。この工程は無限に繰り返されるが、それは、制限酵素が制限 部位力も形成される新たな相補鎖に連続してニックを入れ、そして DNAポリメラーゼ 力 ックの入った制限部位力も新たな相補鎖を連続して形成するからである。従って 、 SDA法を利用する場合には、前記増幅試薬組成物は、上記の 4本のプライマー、 制限酵素、 DNAポリメラーゼ、緩衝液等を含むものとされる。
等温増幅法としては、また、本発明者らにより開発された等温増幅プライマーを用 いる増幅法も好適に利用することができる。この方法は、鎖置換反応を利用した核酸 の増幅法において、特殊なプライマー（等温増幅プライマー）を用いるものである。こ のプライマーは、二本鎖铸型核酸の第一鎖における標的核酸配列の 3'末端部分の 配列 (A)にハイブリダィズする配列 (Ac')を 3'末端部分に含んでなり、前記標的核酸 配列にぉ 、て前記配列 (A)よりも 5'側に存在する配列（B)の相補配列（Be)にハイブ リダィズする配列（Β')を前記配列 (Ac')の 5 '側に含んでなる第一のプライマーであつ て、プライマー中において前記配列 (Ac )と前記配列（Β')との間に介在配列が存在 しない場合には、前記配列 (Ac')の塩基数を Xとし、標的核酸配列中における前記 配列 (A)と前記配列 (B)に挟まれた領域の塩基数を Yとしたときに、（X— Y) ZXがー 1 . 00-1. 00の範囲にあり、プライマー中において前記配列 (Ac')と前記配列（Β')と の間に介在配列が存在する場合には、 Xおよび Υを前記の通りとし、該介在配列の 塩基数を γ，としたときに、 - -丫，）}7 が—1. 00-1. 00の範囲にある、第一 のプライマーである。前記二本鎖铸型核酸のもう一方の鎖についても、これと同様の 第二のプライマーが用意され、該第二のプライマーは、二本鎖铸型核酸の第二鎖に おける標的核酸配列の 3'末端部分の配列（C)にハイブリダィズする配列（Cc )を 3' 末端部分に含んでなり、前記標的核酸配列において前記配列 (C)よりも 5'側に存在 する配列（D)の相補配列（Dc)にハイブリダィズする配列（D')を前記配列（Cc )の 5' 側に含んでなる第二のプライマーであって、プライマー中において前記配列（Cc )と 前記配列 (D')との間に介在配列が存在しない場合には、前記配列 (Cc')の塩基数 を Xとし、標的核酸配列中における前記配列 (C)と前記配列 (D)に挟まれた領域の 塩基数を Yとしたときに、（X-Y) ZXカ 1. 00-1. 00の範囲にあり、プライマー中 において前記配列（Cc )と前記配列（D')との間に介在配列が存在する場合には、 X および Yを前記の通りとし、該介在配列の塩基数を Y'としたときに、 {X— (Y— Υ' : Xが— 1. 00-1. 00の範囲にあるプライマーである。これらの第一のプライマーおよ び第二のプライマーをプライマーペアとして用いることが好まし 、。
[0028] 上記の等温増幅プライマーは、プライマーを構成する配列 (Ac )と配列（Β')の間に 介在配列が存在しない場合において、（X— Υ) ΖΧカ 1. 00以上、好ましくは 0. 00 以上、さらに好ましくは 0. 05以上、さらに好ましくは 0. 10以上となり、また、 1. 00以 下、好ましくは 0. 75以下、さらに好ましくは 0. 50以下、さらに好ましくは 0. 25以下と なるように設計される。さらに、（Χ+Υ)は、好ましくは 15以上、さらに好ましくは 20以 上、さらに好ましくは 30以上とされ、また、好ましくは 50以下、さらに好ましくは 48以 下、さら〖こ好ましくは 42以下とされる。
[0029] また、プライマーを構成する配列 (Ac )と配列 (Β')の間に介在配列 (塩基数は Y' ) が存在する場合には、上記の等温増幅プライマーは、 {X— (Υ— Υ' ΜΖΧカ 1. 00 以上、好ましくは 0. 00以上、さらに好ましくは 0. 05以上、さらに好ましくは 0. 10以 上となり、また、 1. 00以下、好ましくは 0. 75以下、さらに好ましくは 0. 50以下、さら に好ましくは 0. 25以下となるように設計される。さらに、（Χ+Υ+Υ' )は、好ましくは 15以上、さらに好ましくは 20以上、さらに好ましくは 30以上とされ、また、好ましくは 1 00以下、さらに好ましくは 75以下、さらに好ましくは 50以下とされる。
[0030] 上記の等温増幅プライマーは、デォキシヌクレオチドおよび Ζまたはリボヌクレオチ ドにより構成されており、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸 との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。上記の等温増幅 プライマーの鎖長は、好ましくは 15— 100ヌクレオチド、より好ましくは 30— 60ヌクレ ォチドとする。また、上記の等温増幅プライマーを構成する配列 (Ac')と配列 (Β')の 長さは、それぞれ、好ましくは 5— 50ヌクレオチド、より好ましくは 10— 30ヌクレオチド である。また、必要に応じて、配列 (Ac')と配列（Β')の間に、反応に影響を与えない 介在配列を挿入してもよ ヽ。
[0031] 本発明者らによる等温増幅プライマー法において使用する DNAポリメラーゼは、 鎖置換 (strand displacement)活性 (鎖置換能）を有するものであればよぐ常温性、 中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、この DNAポリメラ ーゼは、天然体もしくは人工的に変異をカ卩えた変異体のいずれであってもよい。さら に、この DNAポリメラーゼは、実質的に 5，→3，ェキソヌクレアーゼ活性を有しないも のであることが好ましい。このような DNAポリメラーゼとしては、バチルス 'ステアロサ ーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「B. st」という）、バチルス'カルドテ ナックス（Bacilluscaldotenax、以下「B. ca」という）等の好熱性バチルス属細菌由来 D NAポリメラーゼの 5 '→3 'ェキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌 . co li)由来 DNAポリメラーゼ Iのタレノウフラグメント等が挙げられる。
[0032] 本発明者らによる等温増幅プライマー法において使用するその他の試薬としては、 例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、 dNTPミ ックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファ 一、リン酸カリウムバッファ一等の緩衝液を使用することができる。さら〖こ、ジメチルス ルホキシド (dimethyl sulfoxide)やべタイン（Ν,Ν,Ν- trimethylglycine)等の添加物、国 際公開第 99Z54455号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用して ちょい。
[0033] 本発明者らによる等温増幅プライマー法は、一定の温度条件のもと、 目的とする二 本鎖力 なる核酸配列を増幅することが可能である。その原理は、まず、前記第一お よび第二のプライマーがそれぞれ標的核酸の第一および第二の鎖 (第一および第二 の铸型核酸）にアニーリングし、それぞれプライマー伸長反応が起こって前記標的核 酸配列の相補配列を含む第一および第二の相補核酸が合成され、次いで、これら第 一および第二の相補核酸の 5 '側に存在する配列（Β')および配列（D') i 同相補核 酸上に存在する配列（Be)および配列（Dc)にそれぞれハイブリダィズし、これにより、 第一および第二の铸型核酸上の前記配列 (A)および配列 (C)の部分が一本鎖とさ れ、次!、で一本鎖とされた第一および第二の铸型核酸上の前記配列 (A)および配 列（C)の部分に、前記プライマーと同一の配列を有する他のプライマーがァニーリン グして鎖置換反応が行なわれることにより、先に合成された第一および第二の相補 核酸力 前記他のプライマーにより新たに合成される相補核酸によって置換される、 というものである。
[0034] また、本発明者らによる等温増幅プライマー法は、等温増幅プライマーが目的核酸 にアニーリングし、プライマーの 3 '端側力も伸長反応を起こし、その伸長産物が目的 の配列を含む場合のみ、そのプライマーの 5'端の配列が、その伸長産物にハイプリ ダイゼーシヨンを起こし、これにより次に同様な等温増幅プライマーがアニーリングす ることができ、連続した増幅反応が可能となる。逆に、誤って等温増幅プライマーが 目的核酸以外にアニーリングし、プライマーの 3'端側力も伸長反応を起こした場合、 その伸長産物は目的の配列を含まないので、そのプライマーの 5'端の配列が、その 伸長産物にハイブリダィズできなくなり、これにより次に同様な等温増幅プライマーが アニーリングしにくくなり、連続した増幅反応が困難となるため、目的とする増幅産物 が得られない。そのため、この増幅法は、他の増幅法に比べ、非常に特異性の高い 増幅法といえる。さらに、非常に特異性が高い増幅法であることにより、増幅産物を D NAプローブ等を用い、ハイブリダィゼーシヨンを行い、増幅産物が目的の増幅産物 であるかどうか確認するような作業が必ずしも必要とされない。
[0035] 本発明者らによる等温増幅プライマー法は、使用する酵素の活性を維持できる温 度に保つことにより実施することができる。また、本発明による核酸合成方法において 、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプ ライマーの融解温度 (Tm)付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましぐ さら〖こは、プライマーの融解温度 (Tm)を考慮し、ストリンジエンシーのレベルを設定 することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは 20°C— 80°C、さらに好ましくは 約 35°C—約 65°Cとする。
[0036] 前記増幅試薬組成物は、前記抽出試薬組成物と混合されたときに、増幅反応にと つて適切な pHとなるように、その pHが設定される。例えば、抽出試薬組成物としてァ ルカリ抽出用試薬組成物を用いる場合において、その pHが増幅反応にとって高す ぎるときは、増幅試薬組成物の pHを予め低めのものとしておくことが好ましい。増幅 反応にとって適切な pHは、概ね 5— 12の範囲、好ましくは 7— 10の範囲である。
[0037] 本発明の他の実施態様によれば、本発明による反応容器は、前記第一室と前記第 二室との間に、前記抽出試薬組成物の pHを前記増幅試薬組成物による標的核酸 の増幅反応に適したものとするための pH調整試薬組成物を含有する第三室をさら に含んでなるものとされる。これにより、前記抽出試薬組成物の pHと増幅反応に適し た pHとの差が大きい場合でも、適切な増幅反応を行なうことが容易となる。 [0038] pH調整試薬組成物に用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等 の鉱酸、酢酸、クェン酸、フタル酸、フマル酸、マレイン酸等のカルボン酸、メタンスル ホン酸、 p—トルエンスルホン酸などの有機スルホン酸が挙げられる力 好ましくは鉱 酸とされ、さらに好ましくは塩酸とされる。また、 pH調整試薬組成物に用いることので きるアルカリとしては、典型的には水酸ィ匕ナトリウム水溶液が挙げられる。
[0039] 本発明による反応容器は、さらに、前記第一室と前記第二室とを分離するための分 離手段を含んでなり、また、前記第三室が設けられる場合には、これと前記第一室お よび前記第二室とを分離するための分離手段を含んでなる。この分離手段は、反応 容器外部から物理的エネルギーを与えることによって、前記第一室と前記第二室と の分離を解き、これにより前記第一室中の抽出試薬組成物と前記第二室中の増幅 試薬組成物との混合を可能とするものであり、また、前記第三室が設けられる場合に は、前記第一室、前記第二室、および前記第三室の間の分離を解き、これにより前 記第一室中の抽出試薬組成物と、前記第二室中の増幅試薬組成物と、前記第三室 中の pH調整試薬組成物との混合を可能とするものである。物理的エネルギーによる 分離の解除法としては、例えば、熱を加えることによる解除、光を照射することによる 解除、機械または操作者により振動、応力等を加えることによる解除などが挙げられ る。好ましい分離手段は、熱を加えることにより解除されるものである。
[0040] 前記分離手段は、常温および核酸抽出に用いられる温度において水を透過させな い手段であればよぐ特に制限されないが、好ましくは水非透過性皮膜によるもの、よ り好ましくは水非透過性の疎水性皮膜によるものとされる。また、このような水非透過 性皮膜は、反応容器外部からの上記物理的エネルギーにより融解しうるものとするこ とが好ましい。さらに、水非透過性の疎水性皮膜としては、融解したときに水よりも密 度の小さい液体となるものが好ましい。これにより、本発明による反応容器における増 幅反応が終わった後、試薬の最上部で水非透過性の疎水性皮膜が再度形成される ため、反応容器力もの試薬の漏洩を防止することができる。このような水非透過性の 疎水性皮膜としては、例えば、ワックス類およびその混合物が挙げられる。
[0041] ワックスは、加熱することにより融解して水の密度よりも低密度を有する液体を形成 する有機物質 (合成または天然、例えば、鉱物、植物または動物に由来するワックス） である。一般的には、ワックス類は高分子量脂肪酸と高分子量アルコールとのエステ ル類である。代表的な純粋なワックス類としては、エイコサン (C H )、ォクタコサン（
20 42
C H )、セチルバルミテート（C H O )、ペンタエリトリトールテトラべへナート（C H
28 58 32 64 2 93
O )などが挙げられる。また、多くの有用なワックス混合物力 純粋なワックス類の性
180 8
質と同様の性質を提供する物質類 (例えば、エステル類、脂肪酸類、高分子量アル コール類、炭化水素類等）の混合物として知られている。このようなワックス混合物とし ては、限定されるものではないが、パラフィン、 PARAPLAST (商標）ワックス（ Sherwood Medical)、 ULTRAFLEX (商標）ワックス（Petrolite Corporation) , BESQ UAR (商標） 175ワックス（Petrolite Corporation)などが挙げられる。ワックス類は、購 入するか、あるいは純粋または混合ワックスを別のものと混合することにより、または 相対硬度、低減されたワックス類特有の粘着性および所望の融解温度を保持する適 当なグリース類もしくは油状物類と混合することにより製造できる。混合ワックス類、例 えば、融解温度の異なるパラフィンを利用して、試薬を二層または三層に分離し、必 要に応じて融解させ、本発明による反応容器中の各試薬組成物を所望の組み合わ せで混合することも可能である。
[0042] 上記のグリースは有機物質であり、常温（25°C前後）では固体または半固体である 力 約 40°Cよりもやや低い温度で非常にやわらかぐ 40— 80°Cの範囲で溶けて液 体となる。グリースの密度は、水の密度よりも小さい。典型的なグリースは白色ペトロラ 一タム (例えば、ワセリン、石油ゼリー等)であり、これは高分子量炭化水素の混合物 である。上記のワックスは有機物質であり、常温（25°C前後）では固体であるが、約 4 0°C以下の温度でグリースよりはるかに硬ぐ少し高い温度で溶けて、水より密度の小 さい液体となる。ワックスは、グリースや油に比べ、固体 (例えば、プラスチック）表面 への付着は少ない。
[0043] 上記のような分離手段により、本発明による反応容器中に分離した形で保持されて いる各試薬組成物を、必要に応じて混合することが可能となる。また、本発明の好ま しい実施態様によれば、前記水非透過性皮膜は、前記抽出試薬組成物による核酸 抽出時の温度では融解せず、かつ前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の 温度で融解するものとされる。これにより、本発明による反応容器において、核酸抽 出が終了した後、増幅反応のために温度を調整することによって、各試薬糸且成物を 混合することが可能となる。
[0044] 本発明による反応容器においては、さらに、各試薬組成物を固形状としてもよい。こ れにより、輸送 ·運搬時の振動などによる各試薬組成物の漏洩または望ましくない試 薬組成物相互の混合を防止することができる。
[0045] 試薬組成物を固定ィ匕する（固形状とする）方法としては、試薬固定ィ匕層内に試薬が 均一に分散された状態で固定ィ匕できる方法あればよぐ特に制限されない。従って、 試薬を固定ィ匕するための固定ィ匕材料としては、マトリックスを形成する材料を用いて もよいし、マトリックスを形成しない材料を用いてもよぐさらにこれらを組み合わせて 用いてもよい。また、前記固定化材料は、本発明による反応容器の使用時に反応試 薬と共に溶解する材料であっても、溶解しない材料であってもよい。また、前記固定 化材料としては、これを用いて得られる試薬組成物の固定ィ匕層が、本発明の効果を 損なうような溶出成分を溶出しないような固定ィ匕材料が用いられる。
[0046] なお、上記固定ィ匕材料として、マトリックスを形成し、かつ反応試薬とともに溶解しな い材料を用いた場合でも、通常、反応試薬の分子はマトリックスサイズに比べて遙か に小さいので、固定ィ匕された試薬組成物にサンプルを含む溶液が接触すれば、反 応試薬はその溶液中に十分に溶解することができる。
[0047] 試薬組成物を固定ィ匕する具体的な方法としては、例えば、試薬組成物を、ァガロー スゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、カードランゲル、キトサンゲル等のゲル マトリックス中に封入して固定ィ匕する方法、光架橋性ポリビュルアルコール等の光硬 化性榭脂またはポリアクリルアミド等の三次元架橋構造体中に組み込んで固定ィ匕す る方法、 CMC等の水溶性で粘性のある材料で固定ィ匕する方法などが挙げられる。こ れら固定ィ匕方法の多くは、試薬組成物を固定ィ匕材料の原料に添加し、混合する工程 を含むが、その際、試薬組成物はそのまま添加されても、溶液の形で添加されてもよ い。さらに、これらの方法を組み合わせて試薬を固定することも可能である。上述の 具体的な固定ィ匕方法によれば、試薬組成物が湿潤状態で固定化されるため、特に 乾燥することが好ましくな 、試薬を用いる場合に有利である。
[0048] 本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による反応容器は、前記抽出試薬組 成物および前記増幅試薬組成物の少なくとも一つが、反応容器外部からの物理的ェ ネルギ一により融解しうるゲルに封入されたものとされ、前記 pH調整試薬組成物が 含まれる場合には、これも同様のゲルに封入されたものとすることができる。物理的ェ ネルギ一によるゲルの融解法としては、例えば、熱を加えることによる融解、光を照射 すること〖こよる融解などが挙げられる。好ましいゲルは、熱を加えることにより融解する ものである。さらに、前記ゲルは、前記抽出試薬組成物による核酸抽出時の温度で は融解せず、かつ前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の温度で融解する ものとすることが好ましい。これにより、本発明による反応容器において、核酸抽出が 終了した後、増幅反応のために温度を調整することによって、各試薬組成物を混合 することが可能となる。
[0049] 上述の方法により固定ィ匕された試薬組成物は、乾燥状態としてもよい。これにより、 長期間の保存による試薬組成物の変質を防ぐことが可能となる。乾燥の手法としては 、一般的な手法、例えば、加温による乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等が挙げられる。ま た、米国特許第 4891319号明細書に記載されている試薬の安定な乾燥ィ匕技術、特 表平 10— 503383号公報に記載の核酸増幅用酵素の安定ィ匕法を利用することもで きる。さらに、トレハロースおよび/またはポリビニールピロリドンを安定化剤として用 いることができ、これによれば、特に試薬を凍結乾燥した場合において、 DNAポリメ ラーゼなどの酵素が安定に保持できる。固定化された試薬組成物を乾燥させた場合 には、本発明による反応容器を使用する際に、必要に応じて、水などの液体を補充 すればよい。
[0050] 本発明による反応容器は、さらに、前記第一室のみに前記サンプルを導入すること を可能とする開口部を含んでなる。これにより、反応容器の開口部から導入されるサ ンプルは、抽出試薬組成物のみに接触し、他の試薬組成物に接触することなぐ効 率のよい核酸抽出が可能となる。
[0051] 本発明による反応容器では抽出試薬組成物と増幅試薬組成物とが別々に保持さ れており、これらは、核酸抽出の後、核酸増幅反応の前に混合される。これら試薬組 成物の混合は、加熱による液体の対流、反応容器の振盪などの一般的な方法により 行なうことができるが、混合をさらに効率よく行なうために、反応容器中に混合手段を 組み込むこともできる。このような混合手段としては、例えば、容器内に予めビーズ等 の担体を入れておくことが挙げられる。具体的には、容器内の上部に前述の水非透 過性皮膜を設け、その皮膜中に担体を固定しておき、熱などの物理的エネルギーに よって該皮膜が融解することにより担体が下部に落下し、試薬組成物が混合される。 また、ナノテクノロジーを用いて前記担体をプロペラ型の形状とすることもでき、これに より、反応容器内の上部から下部に落下する際のプロペラの回転により混合の効率 を上げることもできる。また、前記担体として磁気ビーズを用いてもよぐその場合には 、外部力ゝらの磁気によって反応容器内の磁気ビーズを動かすことにより試薬組成物 を混合することができる。さらに、他の混合手段としては、反応容器の下部に前述の 水非透過性皮膜を予め固定しておいてもよぐその場合には、熱などの物理的エネ ルギ一によつて該皮膜が融解することにより、融解した皮膜が上部に移動するため、 試薬組成物を混合することができる。従って、本発明による反応容器は、開口部から 底部に向力う方向において、その内部断面積が減少する部分を有するものであるこ とが好ましい。このような形状とすることにより、融解した皮膜が上部に移動しやすくな る。
[0052] 本発明による反応容器を用いて増幅された標的核酸は、一般的な方法、例えば、 検出可能な標識を付された特異的プローブを用いる方法等、によって検出してもよ いが、増幅産物の存在に基づくシグナルの発生が可能となるように反応容器を構成 することも可能である。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による 反応容器は、増幅産物に基づくシグナル発生手段をさらに含んでなるものとされる。 また、その場合には、本発明による反応容器は、核酸増幅産物力ゝらのシグナルを透 過可能なものであることが好ましい。これにより、容器から増幅産物を取り出すことなく これを検出することが可能となる。
[0053] 前記シグナル発生手段としては、当業者に知られているものを用いることができ、特 に制限されないが、例えば、ェチジゥムブ口ミド、 SYBRグリーン I (Molecular Probe社 )などのインターカレーターを用いることができる。これらのインターカレーターは二本 鎖 DNAに結合するため、その蛍光強度と二本鎖 DNAの濃度は正比例する。よって 、インターカレーターによる蛍光が強ければ、増幅産物が高濃度で存在することが示 され、これにより標的核酸が検出される。従って、このようなインターカレーターを予め 増幅試薬組成物中に混入しておくことにより、増幅産物に基づくシグナルを発生させ ることが可能となる。また、シグナル発生手段として、蛍光共鳴エネルギー転移（ Fluorescence Resornance Energy Transfer : FRET)なと 禾1|用してもよ ヽ。 FRETは , 2つのプローブが近接して増幅産物にハイブリダィズした場合にのみ発生し、ハイ ブリダィゼーシヨンプローブが互いに隣接してノ、イブリダィズすることのできる特異的 な DNAが存在しない場合には発生しない。従って、標的核酸の近接した 2つの領域 にそれぞれ特異的にハイブリダィズしうる 2つのプローブを予め増幅試薬組成物中に 混入しておけばよい。また、核酸増幅の過程においては、基質 (dNTPs)力もピロリン 酸イオンが遊離され、これと増幅試薬組成物中のマグネシウムイオンとが結合し、ピロ リン酸マグネシウムが産生され、これにより反応溶液が白濁する。これにより、増幅産 物の有無を目視で判定することが可能である。また、増幅産物に挿入剤を挿入し、こ れを用 V、て増幅産物に電気を流すことにより、その電流や電圧の差を読み取ることに よって検出を行なうこともできる。さらに、プライマーを予めビーズや金コロイド粒子な どの担体と結合させておいてもよい。この場合には、標的核酸が増幅されると前記担 体が凝集するので、これを目視で確認することにより増幅産物を検出することができ る。
シグナルを透過することのできる反応容器は、そのシグナル発生手段に応じて、当 業者であれば容易に選択することができる。例えば、シグナルが目視で検出される場 合には、反応容器の素材は透明または半透明のものとされ、例えば、プラスチックな どの熱可塑性ポリマーとすることができる。熱可塑性ポリマーとしては、ポリプロピレン 、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、ならびにこれらのコポリマーまたは混合物を用い ることができる。あるいは、透明なガラスを用いてもよい。また、蛍光シグナル、発色シ ダナル、発光シグナルなどを読み取る場合にも、同様の素材力もなるものが好ましい 。さらに、紫外線、赤外線などを利用する場合には、それらを透過するものが好ましい 。また、反応溶液中の核酸増幅産物や核酸増幅反応の副産物を検出するために、 電気化学的な測定を用いることが可能であり、そのような場合は、電気を通す素材か らなる容器、例えば、カーボンコートされた容器などが好ましい。 [0055] 本発明による反応容器は、サンプル力もの標的核酸の増幅に用いられる他の用具 と併せて、核酸検出用キットとすることができる。他の用具としては、典型的には、サン プリング用器具が挙げられる。従って、本発明の他の態様によれば、本発明による反 応容器と、サンプルを採取するためのサンプリング用器具とを少なくとも含んでなる、 核酸検出用キットが提供される。
[0056] サンプリング用器具としては、液体を吸引するためのピペットまたはスポイト、スパー テルなどの一般的なものとすることができる力 ヒトの口腔粘膜細胞ならびに喀痰など のサンプルは、スヮブを利用することにより簡易に採取することができる。
[0057] スヮブは、採取部分が綿などの材料力 なり、ハンドル部分は細長 、ポリスチレン製 の管状部材などの材料力もなる一般的なものであってよいが、本発明による反応容 器の開口部に差し込むことにより、反応容器に蓋をすることのできるようなものが好ま しい。また、前記スヮブは、反応容器の開口部に差し込むことにより、該反応容器との 隙間を塞ぐものであることが好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、 前記スヮブは、採取したサンプルを本発明による反応容器中の抽出試薬組成物に接 触させうるものであり、かつ、前記反応容器の開口部を密閉しうるものとされる。スヮブ は、さらに好ましくは、プラスチックなどの熱可塑性ポリマーにより加工されたものであ る。熱可塑性ポリマーとしては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン、な らびにこれらのコポリマーまたは混合物を用いることができる。さらに、大量の検体を 同時に検査するような場合に用いるスヮブは、ハンドルの細長い部分において 2つに 切り離すことができ、さらには、その両端に同一の整理番号などが記入され、それを 保存することにより反応容器中のサンプルを識別することも可能である。スヮブのサン プル採取部分の先端は、サンプルをより多く採取できるように突起物を有することが 好ましい。
[0058] 本発明の好ま 、実施態様によれば、本発明によるキットは、前記スヮブの前記反 応容器からの脱離を防止するための脱離防止手段をさらに含んでなるものとされる。 これにより、本発明による反応容器にスヮブの採取部分を差し込んだ後は、そのスヮ ブの反応容器力 の意図しな 、脱離を防止することが可能となる。前記脱離防止手 段力 前記スヮブに設けられた凸部または凹部と、これに嵌合する前記反応容器中 の凹部または凸部によるものである。
[0059] あるいは、前記スヮブは、反応容器の蓋にスヮブが結合したものであって、スヮブの サンプル採取部分が本発明による反応容器中の抽出試薬組成物に接触すると同時 に蓋によって反応容器が密閉されるようなものとすることもできる。
[0060] 本発明によるキットは、前記スヮブとは別に、反応容器の開口部を塞ぐための蓋を 含むことができる。この蓋は強固なものである必要はなぐ異物の混入を防ぐものであ ればいかなるものであってもよい。このような蓋としては、例えば、反応容器をカバー して異物の混入を防ぐ程度のセロハンテープ、ラミネート、ラップ、シールなどでもよく 、あるいは、反応容器を覆うためのワックス類などの水非透過性皮膜であってもよい。
[0061] 本発明の好ましい実施態様による反応容器とスヮブの組み合わせを、図 1一 3に示 す。図 1に示す蓋兼用スヮブ 1は、その最下端に突起を有するスヮブ先端部 3を有し 、これにより効率よくサンプルを採取することが可能となる。蓋兼用スヮブ 1は、さらに ストッパー 2を備えている。一方で、図 1に示す反応容器 4は、抽出試薬組成物 7と増 幅試薬組成物 9を含んでおり、これらは水非透過性皮膜 8によって分離されている。 また、反応容器 4は、その内径が蓋兼用スヮブ 1の外径とほぼ等しぐさらには、ストッ パー 2と嵌合しうるストッパー嵌合部 5を備えている。抽出試薬組成物 7の上部表面は 、異物の混入および試薬の漏洩を防止するための膜 6によって覆われている。前記 蓋兼用スヮブ 1を用いてサンプルを採取し、これを前記反応容器 4に適用した状態の 断面図を図 2に示す。図 2においては、スヮブ先端部 3の突起が膜 6を突き破つており 、これによりスヮブ先端部 3の突起に付着したサンプルが抽出試薬組成物 7に接触し ている。また、反応容器 4は、その内径とほぼ等しい外径を有する蓋兼用スヮブ 1によ つて密閉されており、ストッパー 2とストッパー嵌合部 5によってその状態が保持されて いる。この状態で核酸抽出が行なわれ、次いで反応容器 4に熱などの物理的ェネル ギーを与えることによって水非透過性皮膜 8が融解し、これにより抽出試薬組成物 7と 増幅試薬組成物 9とが混合され、その後、蓋兼用スヮブ 1によって密閉された反応容 器 4を所定の温度下に置くことにより標的核酸の増幅が可能となる。図 3は、抽出試 薬組成物 7と増幅試薬組成物 9との間に pH調整試薬組成物 11を含み、これらが水 非透過性皮膜 8および 10によってそれぞれ分離されている反応容器 4、ならびに蓋 兼用スヮブ 1を示している。
[0062] 本発明による反応容器は、サンプル力も標的核酸を検出するために用いられる。従 つて、本発明の他の態様によれば、本発明による反応容器を用いてサンプルカも標 的核酸を検出する方法であって、
(a)サンプルを前記反応容器中の抽出試薬組成物と接触させ、該サンプル中の核酸 を抽出する工程、
(b)前記反応容器外部からの物理的エネルギーにより前記反応容器中の複数の試 薬組成物を混合する工程、
(c)前記反応容器中で増幅反応を行なう工程、および
(d)核酸増幅産物からのシグナルを検出する工程
を含んでなる方法が提供される。
[0063] サンプルとしては、標的核酸が含まれることが疑われるものであればよぐ特に制限 されないが、例えば、生物に由来するサンプル、加工食品、排水、飲料水、空気など が挙げられる。また、生物は、動物、植物および微生物のいずれであってもよい。さら に、動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトとされる。動物力ものサンプルとし ては、血液、便、痰、粘液、血清、尿、唾液、涙液、生検サンプル、組織学的組織サ ンプル、組織培養物などが挙げられる。また、植物は、農作物、観葉植物、天然の食 用植物などが挙げられる。
[0064] 標的核酸は、検出することにより有用な情報が得られるものであればよぐ特に制限 されないが、例えば、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子または病原体に特異的な 核酸配列を有するものが挙げられる。病原体としては、例えば、ウィルス、細菌、真菌 などが挙げられる。例えば、野生型遺伝子を標的核酸とした場合には、これが検出さ れないことにより、その遺伝子欠損に起因する疾患が検出される。また、変異型遺伝 子を標的核酸とした場合には、これが検出されること〖こより、遺伝子変異に起因する 疾患が検出される。さらに、病原体に特異的な配列を有する核酸を標的核酸とした 場合には、これが検出されることにより、その病原体による感染症が検出される。
[0065] 本発明による核酸検出法における上記各工程は、本発明による反応容器の構成に 応じて、例えば、該反応容器において利用される核酸抽出法、各試薬組成物間の分 離手段、および核酸増幅法に応じて、容易に実施することができる。また、核酸増幅 産物からのシグナルの検出は、検出可能な標識が付された特異的プローブを用いる 方法などの一般的な方法により、当業者であれば適宜行なうことができる。また、シグ ナル発生手段が予め反応容器中に存在する場合には、これを利用して簡便にシグ ナル検出を行なうことができる。
[0066] 本発明による核酸検出法の結果を有効に活用する手段として、上記工程 (d)にお いて検出されたシグナルまたは該シグナルにより得られた結果を遺伝子解析用コン ピュータに入力し、該コンピュータによる解析結果を出力することも可能である。従つ て、本発明によれば、上記工程 (a)—（d)の後に、
(e)検出されたシグナルを遺伝子解析用コンピュータに入力する工程、
(f)前記コンピュータにぉ 、て、前記シグナルと該コンピュータにより利用可能な情報 とが比較され、これにより前記シグナルの特徴づけおよび Zまたは前記シグナルに関 連する情報の検索がなされる工程、および
(g)前記コンピュータから、前記シグナルの特徴および Zまたは前記シグナルに関連 する情報を出力する工程、
を含んでなる、遺伝子解析方法が提供される。上記工程 (e)におけるコンピュータへ の入力および上記工程 (g)におけるコンピュータ力もの出力は、好ましくはインターネ ットなどの通信ネットワークを介して行なわれる。
[0067] 本発明による遺伝子解析方法によれば、例えば、シグナルの検出装置と通信装置 を連結させておき、得られたシグナルを遺伝子解析センターなどに送信し、そこでよ り詳細な解析を行い、その詳細な解析結果およびその関連情報を受信することにより 、より詳細な情報を得ることが可能になる。前記通信装置としては、インターネットなど の通信ネットワークを介して情報の送受信を行なうことのできる、パーソナルコンビュ ータ、携帯電話などの携帯用端末等が好適に用いられる。
[0068] 本発明の好ましい実施態様による遺伝子解析法の概念図を図 4に示す。本発明に よる反応容器 401にお 、て標的核酸の増幅反応を行なった後、シグナル検出装置 4 02により増幅産物に基づくシグナルが検出される。検出されたシグナルは、携帯用 端末 403により、インターネット 404を介して遺伝子解析用コンピュータ 405に入力さ れる。この遺伝子解析用コンピュータ 405では、入力されたシグナルと、情報記憶装 置 406に記憶されている標的核酸の存否により示される情報およびこれに関連する 情報とが比較され、これにより前記シグナルの特徴づけおよび Zまたは前記シグナ ルに関連する情報の検索がなされる。次いで、遺伝子解析用コンピュータ 405から、 前記シグナルの特徴および Zまたは前記シグナルに関連する情報力、インターネット 404を介して携帯用端末 403により出力される。出力された情報は、携帯用端末 40 3により情報記憶装置 407に記憶される。
[0069] 本発明による遺伝子解析法は、例えば、標的核酸が、その存在または不存在により 疾患または障害を示すものであれば、疾患または障害の検出方法、さらには、その 疾患または障害に関する情報を取得する方法となる。この場合には、出力される上記 シグナルの特徴としては、該シグナルにより示される疾患または障害の名称、標的核 酸を含有する遺伝子の名称等が挙げられ、出力される関連情報としては、前記疾患 または障害の説明文、該疾患または障害に対する対処方法および有効な治療薬、さ らに精密に診断するための方法等が挙げられる。特に、遺伝子解析用コンピュータ においては、複雑な解析が可能であるため、対象とする疾患または障害に関与する 遺伝子が複数存在する場合には、それぞれの遺伝子にっ ヽての核酸検出法を行な つてその結果 (シグナル)を全て送信することにより、より正確な解析結果を得ることが 可能となる。
[0070] 特に、本発明による核酸検出法は、被検者自ら実行することが可能であり、その後 、通信装置を用いた遺伝子解析をも被検者自ら行なうことにより、遺伝子情報の漏洩 が防止される。さらに、個人が所有する携帯用端末などを利用して個人情報を管理 することにより、複雑な遺伝子情報を保持'管理することが可能となる。また、その遺 伝子情報をもとに、個人の目的に応じた病院や店を選択することも可能となる。
[0071] さらに、本発明による反応容器は、上述の通り、疾患または障害の診断または発症 リスクの判定に用いることができる。従って、本発明の他の態様によれば、疾患または 障害の診断または発症リスクの判定における、本発明による反応容器の使用が提供 される。
実施例 [0072] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例 に限定されるものではない。
[0073] 実施例 1
本実施例においては、ヒトゲノム中に含まれる human STS DYS237の部分配列（配 列番号 1)の増幅および検出を行なった。また、プライマーとしては、 60°Cでの等温 反応による増幅を可能とする次のプライマーペア： SY153LP13-15：
5'- CATTTGTTCAGTAGCATCCTCATTTTATGTCCA- 3' (配列番号 2：下線部は 配列番号 1中の第 1一 20ヌクレオチドに相当し、他の部分は第 36— 48ヌクレオチド の相補配列に相当する）および SY153RP13- 15 : 5'- CTTGCAGCATCAC
CAACCCAAAAGCACTGAGTA-3' (配列番号 3：下線部は配列番号 1中の第 120— 139ヌクレオチドの相補配列に相当し、他の部分は第 92— 104ヌクレオチドに相当 する）を使用した。
[0074] 核酸検出用キットは次のようにして作製した。まず、円筒型の透明な反応容器（内 径 2— 3mm)の容器底に、増幅試薬（計 20 L中、 Tris— HCl (20mM、 pH8. 8)、 10mMの KC1、 10mMの（NH ) SO、 2mMの MgSO、 1%の TritonX— 100、 4
4 2 4 4
mMの dNTP、 lOOpmolの各プライマー、 8Uの Bst DNAポリメラーゼ（NEW ENGLAND BioLabs社製）、および SYBR (登録商標）—Green I (Molecular Probes 社製)を 10000倍に希釈したものを含む)を加えた (増幅試薬層）。この増幅試薬層 の上に、熱融解した液状のパラフィン 10 μ L (関東ィ匕学： 50— 52°Cで融解)を重層し た (疎水性皮膜層）。ノラフィンが固形になった後に、その上に、前処理試薬として、 0. 01Nの NaOH (5 /z L)を重層した（前処理試薬層）。
[0075] 次いで、上記の核酸検出用キットを用いて、ヒト被験者の口腔粘膜細胞力も標的配 列を検出した。まず、スヮブを用いてヒト口腔粘膜細胞を採取し、前処理試薬層部分 に添加した。室温で 30分間放置することによって口腔粘膜細胞を変性させ、ヒトのゲ ノム DNAを抽出した。次に、その反応容器を 60°Cで 1時間保持することによって増 幅反応を行った。 60°Cに保持することにより、疎水性皮膜層は融解し、反応容器内 の最上部に移動し、これにより、前処理試薬層と増幅試薬層が混合されていた。ヒト 粘膜細胞を添加しないサンプルについても同様に実験を行った。最後に、増幅され た目的核酸の検出を行うために、 UV (245nm)を照射した。
[0076] ヒト口腔粘膜細胞を添加した反応容器では、 SYBR (登録商標) -Green I〖こよる蛍 光シグナルが肉眼で確認された。一方で、ヒト口腔粘膜細胞を添加していない反応 容器では、蛍光シグナルは確認されなカゝつた。このことから、上記の核酸検出用キッ トにより、ヒトゲノム DNAの抽出、標的配列の増幅、および増幅産物の検出が可能で あることが示された。
[0077] 実施例 2
本実施例にぉ 、て、増幅および検出の標的配列ならびに使用するプライマーペア は、実施例 1と同一とした。
[0078] 核酸検出用キットは次のようにして作製した。まず、円筒型の透明な反応容器（内 径 2— 3mm)の容器底に、増幅試薬（計 20 L中、 Tris— HCl (20mM、 pH8. 8)、 10mMの KC1、 10mMの（NH ) SO 、 8mMの MgSO 、 0. 1%の Tween20、 0.
4 2 4 4
1%の TritonX— 100、 1. 4mMの dNTP、 0. 8%の DMSO、 1600pmolの各プライ マー、および 16Uの Bst DNAポリメラーゼ（NEW ENGLAND BioLabs社製）を含む） を加えた (増幅試薬層）。この増幅試薬層の上に、熱融解した液状のパラフィン 10 L (関東ィ匕学 : 50— 52°Cで融解)を重層した (疎水性皮膜層）。ノ フィンが固形にな つた後に、その上に、前処理試薬として、 0. 01Nの NaOH (5 L)を重層した (前処
[0079] 次いで、上記の核酸検出用キットを用いて、ヒト被験者の口腔粘膜細胞力も標的配 列を検出した。まず、スヮブを用いてヒト口腔粘膜細胞を採取し、前処理試薬層部分 に添加した。室温で 30分間放置することによって口腔粘膜細胞を変性させ、ヒトのゲ ノム DNAを抽出した。次に、その反応容器を 60°Cで 1時間保持することによって増 幅反応を行った。 60°Cに保持することにより、疎水性皮膜層は融解し、反応容器内 の最上部に移動し、これにより、前処理試薬層と増幅試薬層が混合されていた。ヒト 粘膜細胞を添加しな 、サンプルにつ!/、ても同様に実験を行った。
[0080] ヒト口腔粘膜細胞を添加した反応容器では、増幅反応により生成したピロリン酸マ グネシゥムによる反応溶液の白濁が確認された。一方で、ヒト口腔粘膜細胞を添加し ていない反応容器では、白濁は確認されな力つた。このことから、上記の核酸検出用 キットにより、ヒトゲノム DNAの抽出、標的配列の増幅、および増幅産物の検出が可 能であることが示された。
さらに、増幅反応後の反応液 5 μ 1を 3%ヌシーブ 3： 1ァガロースゲル (宝酒造社 製）にて電気泳動を行った。その結果を表す電気泳動写真を図 5に示す。図 5にお いて、レーン 1は 20bpDNA Laderサイズマーカーであり、レーン 2はヒトロ腔粘膜細 胞を添加したサンプルであり、レーン 3はヒトロ腔粘膜細胞を添カ卩していない対照サ ンプルである。対照サンプル（レーン 3)では、未反応のプライマーが染色されている 以外に、バンドは確認されな力つた。ヒト口腔粘膜細胞を添加したサンプル (レーン 2 )では、 目的増幅産物として予想される約 160bp付近のバンドが確認された。このこと から、上記の核酸検出用キットにより、ヒトゲノム DNAの抽出、標的配列の増幅、およ び増幅産物の検出が可能であることが実証された。

Claims

請求の範囲
[1] サンプル力 標的核酸を検出するための反応容器であって、
前記サンプル力 核酸を抽出するための抽出試薬組成物を含有する第一室、標的 核酸を増幅するための増幅試薬組成物を含有する第二室、該第一室と該第二室と を分離するための分離手段、および前記第一室のみに前記サンプルを導入すること を可能とする開口部を少なくとも含んでなり、
前記分離手段が、反応容器外部から物理的エネルギーを与えることによって、前記 第一室と前記第二室との分離を解き、これにより前記第一室中の抽出試薬組成物と 前記第二室中の増幅試薬組成物との混合を可能とするものである、反応容器。
[2] 前記分離手段が、反応容器外部からの物理的エネルギーにより融解しうる水非透 過性皮膜によるものである、請求項 1に記載の反応容器。
[3] 前記水非透過性皮膜が、前記抽出試薬組成物による核酸抽出時の温度では融解 せず、かつ前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の温度で融解するもので ある、請求項 2に記載の反応容器。
[4] 前記抽出試薬組成物および前記増幅試薬組成物の少なくとも一つが、反応容器 外部からの物理的エネルギーにより融解しうるゲルに封入されたものである、請求項
1に記載の反応容器。
[5] 前記ゲルが、前記抽出試薬組成物による核酸抽出時の温度では融解せず、かつ 前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の温度で融解するものである、請求 項 4に記載の反応容器。
[6] 前記第一室と前記第二室との間に、前記抽出試薬組成物の pHを前記増幅試薬組 成物による標的核酸の増幅反応に適したものとするための pH調整試薬組成物を含 有する第三室、および該第三室と前記第一室および前記第二室とを分離するための 分離手段をさらに含んでなり、
前記分離手段が、反応容器外部から物理的エネルギーを与えることによって、前記 第一室、前記第二室、および前記第三室の間の分離を解き、これにより前記第一室 中の抽出試薬組成物と、前記第二室中の増幅試薬組成物と、前記第三室中の PH 調整試薬組成物との混合を可能とするものである、請求項 1に記載の反応容器。
[7] 前記分離手段が、反応容器外部からの物理的エネルギーにより融解しうる水非透 過性皮膜によるものである、請求項 6に記載の反応容器。
[8] 前記水非透過性皮膜が、前記抽出試薬組成物による核酸抽出時の温度では融解 せず、かつ前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の温度で融解するもので ある、請求項 7に記載の反応容器。
[9] 前記 pH調整試薬組成物が、反応容器外部力もの物理的エネルギーにより融解しう るゲルに封入されたものである、請求項 6に記載の反応容器。
[10] 前記ゲルが、前記抽出試薬組成物による核酸抽出時の温度では融解せず、かつ 前記増幅試薬組成物による標的核酸の増幅時の温度で融解するものである、請求 項 9に記載の反応容器。
[11] 前記抽出試薬組成物がアルカリ抽出用の試薬組成物である、請求項 1に記載の反 応容器。
[12] 前記増幅試薬組成物が、一定の温度下での標的核酸の増幅を可能とするものであ る、請求項 1に記載の反応容器。
[13] 前記反応容器が、核酸増幅産物からのシグナルを透過可能なものである、請求項
1に記載の反応容器。
[14] 前記反応容器が、開口部から底部に向力う方向において、その内部断面積が減少 する部分を有するものである、請求項 1に記載の反応容器。
[15] 請求項 1一 14のいずれか一項に記載の反応容器と、サンプルを採取するためのサ ンプリング用器具とを少なくとも含んでなる、核酸検出用キット。
[16] 前記サンプリング用器具がスヮブである、請求項 15に記載のキット。
[17] 前記スヮブが、採取したサンプルを前記反応容器中の抽出試薬組成物に接触させ うるものであり、かつ、前記反応容器の開口部を密閉しうるものである、請求項 16に 記載のキット。
[18] 前記スヮブの前記反応容器力 の脱離を防止するための脱離防止手段をさらに含 んでなる、請求項 17に記載のキット。
[19] 前記脱離防止手段が、前記スヮブに設けられた凸部または凹部と、これに嵌合する 前記反応容器中の凹部または凸部によるものである、請求項 18に記載のキット。
[20] 請求項 1一 14のいずれか一項に記載の反応容器を用いて、サンプルから標的核 酸を検出する方法であって、
(a)サンプルを前記反応容器中の抽出試薬組成物と接触させ、該サンプル中の核酸 を抽出する工程、
(b)前記反応容器外部からの物理的エネルギーにより前記反応容器中の複数の試 薬組成物を混合する工程、
(c)前記反応容器中で増幅反応を行なう工程、および
(d)核酸増幅産物からのシグナルを検出する工程
を含んでなる、方法。
[21] 前記標的核酸が、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子または病原体に特異的な 核酸配列を有するものである、請求項 20に記載の方法。
[22] 前記病原体が、ウィルス、細菌、または真菌である、請求項 21に記載の方法。
[23] 請求項 1一 14のいずれか一項に記載の反応容器を用いて、遺伝子を解析する方 法であって、
(a)サンプルを前記反応容器中の抽出試薬組成物と接触させ、該サンプル中の核酸 を抽出する工程、
(b)前記反応容器外部からの物理的エネルギーにより前記反応容器中の複数の試 薬組成物を混合する工程、
(c)前記反応容器中で増幅反応を行なう工程、
(d)核酸増幅産物からのシグナルを検出する工程、
(e)検出されたシグナルを遺伝子解析用コンピュータに入力する工程、
(f)前記コンピュータにぉ 、て、前記シグナルと該コンピュータにより利用可能な情報 とが比較され、これにより前記シグナルの特徴づけおよび Zまたは前記シグナルに関 連する情報の検索がなされる工程、および
(g)前記コンピュータから、前記シグナルの特徴および Zまたは前記シグナルに関連 する情報を出力する工程
を含んでなる、方法。
[24] 工程 ）におけるコンピュータへの入力および工程 (g)におけるコンピュータ力もの 出力が、通信ネットワークを介して行なわれる、請求項 23に記載の方法。
[25] 疾患または障害の診断または発症リスクの判定における、請求項 1一 14のいずれ か一項に記載の反応容器の使用。
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