WO2005005627A2 - Applications d'une nouvelle classe d'enzymes : les sulfiredoxines. - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to applications of a new class of enzymes, sulfiredoxins (Srx), which catalyzes the reduction of Cys-SO 2 H derivatives (cysteine-sulfinic acid) ) and in particular the reduction of peroxyredoxin (Prx) in its Cys-SO 2 H form as a thiol derivative.
  • Srx sulfiredoxins
  • Cys-SO 2 H derivatives cysteine-sulfinic acid
  • Prx peroxyredoxin
  • Cys-SOH compound can be further oxidized to sulfinic acid ( Cys-SO 2 H) stable or cysteic acid (Cys-SO 3 H).
  • Peroxyredoxins are antioxidant enzymes comprising such cysteines with redox activity.
  • 2-Cys Prxs are reverse homodimers with 2 cysteines with redox activity per subunit. They catalyze the reduction of hydrogen peroxide.
  • the catalytic site of these enzymes includes two cysteines with redox activity (peroxidic N-terminal cysteine (Cysp) and resolution C-terminal cysteine (Cys R )). More specifically, the catalytic cycle of these peroxyredoxins includes (Wood ZA et al., Science, 2003, 300, 650-653; Wood et al., Trends in Biochemical Sciences, 2003, 28, 1, 32-40): - the oxidation of Cysp-SH to Cysp-SOH (sulfenic acid) with H 2 O 2 ; - the formation of a disulfide bridge between Cysp and Cys R of the second Prx subunit (Cysp-SS-Cysj (slow process); - reduction of this disulfide bridge by conventional cellular reducers such as glutathione or thioredoxin (Trx), to obtain the starting material Cys-SH.
  • Cysp peroxidic N-terminal cysteine
  • Prxs can be inactivated, by super-oxidation of Cysp-SOH to sulfinic acid (Cysp-SO 2 H); super-oxidation was considered until now as irreversible, (Wood ZA et al., Science, 2003, 300, 650-653). Recently (Woo HA et al., Science, 2003, 300, 653-656; Georgiou G.
  • Peroxyredoxins (Chae et al., PNAS, 1994, 91, 7022-7026) are ubiquitous antioxidants, which control, in many species (microorganisms, plants and higher organisms including mammals), the levels of H 2 O 2 , which regulate the signaling cascades leading to cell proliferation, differentiation and apoptosis (Fujii J. et al., Redox Rep., 2002, 7, 123-130).
  • the inventors have now identified the family of enzymes which reduce the Prys Cysp-SO 2 H.
  • It is a protein which comprises at least one catalytic site having the following motif: FXGCHR, with X G or S and which has a molecular weight of about 8 to 14 kDa.
  • This enzyme is conserved in eukaryotes and is hereinafter called sulfiredoxine (Srx). In yeast and in particular in Saccharomyces cerevisiae, this enzyme is called Srxl and has a molecular weight of 13 kDa. In humans, this enzyme is called hSrxl and has a molecular weight of 13.6 kDa.
  • Polypeptide sequences identical to those of sulfiredoxine as well as the corresponding nucleotide sequences can be found in the NCBI or GenBank sequence database, under the following access numbers: S. cerevisiae: YKL086W, Homo sapiens: AAH47707, CAC28314, M. musculus: BAB24939, AAH11325, Arabidopsis thaliana: AAD21682, AAO42977, Oryza sativa: BAA95812, Schizosaccharomyces pombe: SPBC106.02c, Thermosyne- chococcus.
  • Sulfiredoxine therefore plays a very important role in the antioxidant function of peroxyredoxins and is involved in the repair or control of proteins modified by the formation of a cysteine-sulfinic acid.
  • a protein having an amino acid sequence having at least X% identity with the reference sequence SEQ ID NO: 1 is defined, in the present invention as a protein which can include up to 100-X alterations per 100 amino acids of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • alteration includes deletions, substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the reference sequence. This definition applies, by analogy, to nucleic acid molecules.
  • SEQ ID NO: 1 is assessed according to the percentage of amino acid residues which are identical or which differ by conservative substitutions, when the sequences are aligned so as to obtain the maximum correspondence between them.
  • conservative substitution is intended to mean the substitution of one amino acid with another which has similar chemical properties (size, charge or polarity), which generally does not modify the functional properties of the protein.
  • a protein having an amino acid sequence having at least X% similarity to the sequence SEQ ID NO: 1 is defined, in the present invention as a protein whose sequence can include up to 100-X non-conservative alterations per 100 amino acids of the reference sequence.
  • non-conservative alterations includes deletions, non-conservative substitutions or consecutive or dispersed insertions of amino acids in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • Said sulfiredoxin is especially selected from the proteins whose the sequences correspond respectively to the sequences SEQ ID NO: 1 to 10, illustrated in FIGS. 2 and 3 or represented in the list of sequences: S. cerevisiae: SEQ ID NO: 1; C. albicans: SEQ ID NO: 2; S. pombe: SEQ ID NO: 3; H. sapiens: SEQ ID NO: 4; M. musculus: SEQ ID NO: 5; D. melanogaster: SEQ ID NO: 6; A.
  • Said antibodies are either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the present invention also relates to a medicament, characterized in that it comprises an effective amount of a protein defined by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO- 1-3 and 5-10 and optionally at least a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention also relates to the use of a protein as defined above for the preparation of an antioxidant medicament intended for treating cancers, neurodegenerative disorders and neuromuscular diseases, in which a failure is observed of the Prx / Srx antioxidant system.
  • the present invention also relates to a method for screening for diseases linked to cancer, aging, neurodegenerative diseases and neuromuscular diseases, which method is characterized in that it comprises, for evaluating the involvement of the antioxidant system Prx / Srx : (1) bringing the cells of a biological sample into vitro with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), (2) detecting the Prx-Cysp-SO 2 H formed, between 1 hour and 4 hours after said contacting according to step (1), and (3) establishing the report of the quantities of Prx-Cysp-SO 2 H and Prx-Cysp-SH, from 4 hours after said contacting in contact according to step (1).
  • the biological sample consists in particular of blood cells.
  • Prx-Cysp-SO 2 H / Prx-Cysp-SH> 1 ratios are a sign of a pathology of the Prx / Srx antioxidant system, linked to a dysfunction of Srx.
  • said screening method comprises: A. the genotyping of sulfiredoxine, from total RNA of a suitable biological sample, in particular blood cells.
  • said method comprises: (1) extracting the total RNA from a suitable biological sample, (2) preparing cDNA specific for sulfiredoxin, by amplification of the RNA to using the following two primers: GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO: 11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO: 12), these sequences being located respectively upstream and downstream of the human sulfiredoxine ORF (GenBank n ° AAH47707), (3) establishment of its nucleotide sequence and (4) comparison with a DNA sequence coding for a protein Srx, as defined above, originating from the same species as that of the biological sample to analyze.
  • GTCCCGCGGCGGCGGCGACG SEQ ID NO: 11
  • AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG SEQ ID NO: 12
  • said method comprises a step of extracting total RNA.
  • said quantification comprises: (al) the preparation of cDNA from total RNA by reverse transcription with appropriate primers and in particular random hexa-nucleotide primers; (a2) the amplification of said cDNA in the presence of the primer pair: GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO: 11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO: 12), in the presence of a fluorescent reporter and simultaneously or sequentially, (a3 ) detecting the amount of the amplimer (or amplicon) by measuring the fluorescent signal.
  • the amplification of the mRNA is carried out by RT-PCR; the reverse transcription and PCR amplification steps are either dissociated and in this case the quantification is carried out by PCR-quantitative, or they are coupled and in this case the quantification is carried out by quantitative RT-PCR.
  • said quantification is carried out using an internal standard such as, for example, the 18S subunit of ribosomal RNA.
  • the fluorescent reporter is selected from the group consisting of agents binding to double-stranded DNA and fluorescent probes.
  • said quantification is carried out in real time, that is to say that the detection and quantification of the fluorescent signal emitted are carried out during the amplification process, insofar as the increase in the signal is directly proportional to the amount of amplimers produced during the reaction.
  • fluorescent reporter when said fluorescent reporter is a probe, it is preferably selected from the group constituted by the probes defined by the following sequences: TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO: 13) and TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGAT ID NO: 14).
  • RNA extraction, cDNA preparation and sequence establishment are performed using conventional techniques, according to standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000 , Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA).
  • the present invention also relates to the use of the sequence coding for a Srx protein, as defined above or of a vector containing said coding sequence, for obtaining plants whose capacity for resistance to stress (drought , cold, toxic heat oxidants present in the environment) are significantly increased.
  • the sequences coding for the protein Srx can be easily obtained from the abovementioned sequence databases.
  • the present invention also relates to host cells, characterized in that they are transformed by a recombinant vector containing a sequence coding for a protein Srx, defined by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO J-3, 5-6 and 8-10.
  • said host cell it consists of a strain of S. cerevisiae overexpressing the SRXL gene.
  • it consists of a mammalian cell modified by an overexpressing vector. the hSrxl gene.
  • the vector is advantageously a shuttle vector E. colils. cerevisiae comprising at a cloning site, the sequence coding for the protein Srx and the promoter of the Srx gene. They are in particular the plasmid pRS316 (n ° ATCC 77145).
  • the promoter of the Srx gene is 400 base pairs upstream of the translation initiation site; it can be found on the site http://www.yeastgenome.org/ (access number YKL086W).
  • These host cells transformed by such a vector are particularly interesting for the study of the Prx / Srx antioxidant system and the in vitro screening of drugs modulating the activity of the Prx / Srx antioxidant system.
  • the subject of the present invention is also a method for screening for medicaments capable of modulating the activity of the antioxidant system Prx / Srx, characterized in that it comprises: (1) bringing the substance to be screened into contact with host cells according to the invention, in the presence of hydrogen peroxide, (2) the detection of the Prx-Cysp-SO 2 H formed, between 1 hour and 4 hours after said contacting according to step (1) , (3) establishing the report of the quantities of Prx-Cysp-SO 2 H and of Prx-Cysp-SH, from 4 hours after said contacting according to step (1).
  • the present invention also relates to a method of screening for medicaments useful in the treatment of cancers, neurodegenerative diseases and neuromuscular diseases, linked to a failure of the Prx / Srx antioxidant system, characterized in that it comprises: a) bringing the test substance into contact with an extract of modified host cells as defined above or a biological sample of a non-human transgenic animal, in particular mice, selected from the group consisting of animals in which the Srx protein gene is disabled and animals in which the Srx protein gene is overexpressed in the presence of hydrogen peroxide, b) measurement by any appropriate means of the antioxidant activity of the Prx / Srx system of mixture obtained in a), and c) the selection of substances capable of stimulating or inhibiting said activity.
  • the measurement of said activity is in particular carried out by the detection of the Prx-Cysp-SO 2 H formed, between 1 hour and 4 hours after said contacting according to step (a) and the establishment of the report of the quantities of Prx -Cysp-SO 2 H and Prx-Cysp-SH, from 4 hours after said contacting according to step (a).
  • the present invention also relates to a method of screening for medicaments useful in the treatment of cancers, neurodegenerative diseases and neuromuscular diseases, linked to a failure of the Prx / Srx antioxidant system, characterized in that it comprises: (1) bringing the substance to be screened into contact with non-human transgenic mammals, in particular mice, selected from the group consisting of animals in which the gene for the protein Srx is disabled and animals in which the gene for the protein Srx is overexpressed, and (2) measuring the animal's survival.
  • non-human transgenic mammals is carried out using conventional methods and in particular according to the protocols described in Transgenic animais generation and use (CM. Houdebine Ed., Harwood academy publishers, Amsterdam).
  • Srx sulfiredoxine
  • the reduction of the product comprising at least two cysteines with redox activity involves its activation by phosphorylation followed by a reduction in sulfur, these two activities being catalyzed by sulfiredoxine.
  • the present invention also relates to a process for the synthesis of a product comprising Cys-SH residues from products comprising Cys-SO 2 H residues, characterized in that it comprises a step of reducing the product comprising the residues Cys-SO 2 H in product comprising Cys-SH residues, in the presence of a sulfiredoxine, ATP and magnesium.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention as well as to the accompanying drawings, in which: - Figure 1 illustrates the reaction catalyzed by Srxl.
  • Figures 2 and 3 show the comparison of Srxl sequences in different species;
  • Figure 2 S. cerevisiae, C. albicans, S. pombe, H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster and A. thaliana; identical regions are framed; the catalytic site is around the conserved cysteine, indicated by an asterisk;
  • Figure 3 S. cerevisiae, H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster, A.thaliana, T. elongatus and Nostoc sp ..
  • GenBank access numbers are shown in this figure. The alignment of the sequences was carried out using the CLUSTALW software.
  • FIGS. 4a and 4b 2D PAGE analysis of the reduced (SH) and oxidized (SO 2 H) forms of Tsal marked with S-Met in wild cells and ⁇ srxl cells exposed to H 2 O 2 (500 ⁇ M) during period indicated;
  • FIGS. 4a and 4b 2D PAGE analysis of the reduced (SH) and oxidized (SO 2 H) forms of Tsal marked with S-Met in wild cells and ⁇ srxl cells exposed to H 2 O 2 (500 ⁇ M) during period indicated;
  • 4c and 4d correspond to Western blots of reduced (2xAMS) and oxidized (lxAMS) forms of Tsal from WT cells (c) or ⁇ srxl (d) cells treated with H 2 O 2 after alkylation in vitro with AMS. After induction of the expression of Srxl for 15 min with H 2 O 2 (100 ⁇ M), the cells are treated with cycloheximide (CHX) 5 min before treatment with HO 2 (500 ⁇ M).
  • CHX cycloheximide
  • FIG. 5 illustrates the role played by the protein Srxl in the resistance of cells to stress induced by hydrogen peroxide; sensitivity tests are carried out by growing a wild strain (WT) and an invalidated cell (Asrxl) or a mutant strain srxl C84S in petri dishes containing increasing concentrations (in raM) of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) (FIGS. 5a and 5b): FIG. 5a: resistance to H 2 O 2 of the wild strain (WT), of the invalidated strain (Asrxl) and of the mutant strain srxl C84S ; FIG.
  • FIG. 5b Western blot (overlay) and QT-RT PCR of the Srxl protein labeled with HA and of the mRNA in cells treated with hydrogen peroxide (400 ⁇ M).
  • - Figure 6 illustrates the role played by the protein Srxl in the resistance of cells to stress induced by t-butyl hydroperoxide; sensitivity tests are performed by growing a wild strain (WT), an invalidated cell (Asrxl), a wild strain overexpressing Tsal or Srxl, an invalidated cell (Asrxl) expressing Tsal, an invalidated cell (Atsal) and an invalidated cell (Atsal) overexpressing Srxl in Petri dishes containing increasing concentrations of t-butyl hydroperoxide (tBOOH); the concentrations are expressed in mM.
  • tBOOH t-butyl hydroperoxide
  • Srxl labeled HA (lanes 1, 2 and 3) or Srxl labeled HA (lane 4) expressed in a wild strain (WT) (lanes 1, 2, 4) or in Atsal cells (lane 3) treated 15 min with H 2 O 2 (500 ⁇ M) after SDS-PAGE electrophoresis carried out under reducing (R) (lane 2) or non-reducing (NR) (lanes 1, 3, 4) conditions;
  • WT wild strain
  • NR non-reducing
  • FIG. 8 shows that the protein Srxl and ATP are necessary for the reduction of Tsal oxidized in vitro by Srxl;
  • Figures 8 a and b Western blot analysis of the reduced (SH) and super-oxidized (SO 2 H) forms of Myc-Tsal in lysates AtsaX cells incubated for 15 min at 30 ° C with purified Srxl and ATP, at the concentrations indicated;
  • FIG. 8c Western blot analysis of the reduced (SH) and super-oxidized (SO 2 H) forms of 6His-Tsal incubated for 15 min at 30 ° C. with purified Srxl, ATP (1 mM) and Mg ++ (1 mM), as indicated.
  • - Figure 9 illustrates the role of hSrxl in reducing 6His-
  • Prxl and 6His-Prx2 in their superoxidized forms. It should be understood, however, that these examples are given only by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
  • Example 1 Materials and Methods.
  • the strains of S. cerevisiae used are the strain YPH98 (Sikorski R. et al., Genetics, 1989, 122, 19-27) (MATa, ura3-52, lys2-801 amber , ade2- 101 ocher trpl- ⁇ l Ieu2- ⁇ l) and its isogenic derivatives.
  • the Asrxl, ⁇ trrl and ⁇ tsal strains are produced by replacing the coding region of SRXl (sulfiredoxine) and TRRl (thioredoxin reductase) with KANMX4 and the open reading frame TSA1 with TRP1 (tyrosinase-related protein 1).
  • the strains overexpressing Tsal and Srxl are identical to the preceding ones, except that they each carry a deletion of the Tsal or Sr 7 gene and carry the multiple copy plasmid psRS426 (No. ATCC 77107); The cells are cultured at 30 ° C.
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% bactopeptone and 2% glucose
  • CASA medium 0.67% nitrogen yeast base, 0.1 amino casamino acids %, 2% glucose
  • Plasmids The following fusion proteins: - Srxl -HA: fusion protein comprising the fusion of two HA epitopes in the C-terminal of Srxl and - 6His-Srxl: fusion protein between Srxl and at its N- terminal six labels histidine, are constructed by PCR in two stages: the nucleotide primers used for the PCR incorporate the sequence of one or the other of the epitopes HA (defined by the commercial antibody recognizing the epitope HA 12CA5, Babco, MMS-101 R) and 6His (6 histidines) and amplify the complete coding sequence of Srxl, flanked by 400 and 200 base pairs upstream and downstream of their sequence and clone at the EcoRI site of the plasmid pRS316 (no.
  • Myc-Tsal a fusion protein comprising at the N-terminus of Tsal, a Myc epitope (defined by the anti-Myc antibody, 9E10, Babco, MMS-150R) is constructed and cloned similarly to the EcoRI site of plasmid pRS316.
  • the directed mutagenesis for the generation of the Cys> Ser mutants is carried out by a standard PCR amplification protocol using primer oligonucleotides comprising the modified sequence. 1.3. Protein analysis * For 2D PAGE analysis.
  • the precipitated proteins are dissolved in buffer A [Tris-Ci, pH 8 (100 mM), SDS (1%), EDTA (1 mM)] containing N-ethylmaleimide (NEM) (50 mM).
  • the extracts are separated by SDS-PAGE at 17% under reducing and non-reducing conditions and Srxl -HA is detected by the above-mentioned monoclonal antibody 12CA5.
  • the cell extracts are treated under the same conditions as those of the TCA lysis protocol, except that the precipitated proteins are first solubilized in buffer A containing DTT (50 mM) for 1 h at 37 ° C., precipitated by TCA suspended in buffer A containing AMS (15 mM) for 2 h at 37 ° C.
  • the cell extracts are separated by SDS-PAGE at 20% under reducing conditions and Myc-Tsal is immunodetected with the anti-Myc 9E10 monoclonal antibody, mentioned above.
  • the 6His-Tsal is oxidized to cysteine-sulfinic acid by incubation in the RM buffer containing DTT (10 mM) and H 2 O 2 (1 mM) for 30 min and diluted 16 times with the reaction medium.
  • 6His-Tsal is expressed in E. coli BL21 cells from the plasmid pET28a-Tsal after induction with isopropyl-thio- ⁇ -D-galactopyranoside, in accordance with the manufacturer's recommendations (Stratagene).
  • the cells are suspended in a lysis buffer [Tris-Cl pH 6.8 (50 mM), KCl (100 mM), DTT (2 mM), imidazole (20 mM)], supplemented with phenylmethane-sulfonyl fluoride (PMSF) (1 mM), lysed by freeze-thaw and sonication cycles.
  • a lysis buffer [Tris-Cl pH 6.8 (50 mM), KCl (100 mM), DTT (2 mM), imidazole (20 mM)]
  • PMSF phenylmethane-sulfonyl fluoride
  • the extracts are centrifuged for 30 min at 30,000 g and the supernatant is passed through a column of Ni-NTA agarose (Qiagen). After washing the column with the lysis buffer, the Tsal is eluted with lysis buffer supplemented with imidazole (150 mM). The purity and the concentration of the purified proteins is determined by staining with Coomassie blue after SDS-PAGE and Bradford test (Biorad). 1.5. Purification of the Srxl reaction partners 6His-Srxl and Srxl are expressed from the plasmid pRS426 in the ⁇ trrl strain, lacking the thioredoxin reductase gene which stabilizes the disulfide bridges. The cells are cultured until the middle of the exponential phase
  • RNA analysis Total RNA is extracted as described in Lee et al. (J. Biol. Chem., 1999, 274,4537-4544) and the cDNA is synthesized by reverse transcription with random hexanucleotide primers, from ⁇ g of total RNA.
  • Tsal appears as a double spot: an intense corresponding to approximately 85% of the total enzyme at a pi position of 4.8 (+/- 0.05), which corresponds to a reduced Tsal (the theoretical pi of the Tsa is 4.87); the other finer spot located at a more acid pi position of 4.7 (+/- 0.05), which corresponds to oxidized Tsal (the theoretical value of the sulfinic acid form of cysteine from Tsal is 4.75).
  • H 2 O 2 500 ⁇ M
  • the proportion of oxidized Tsal increases at the expense of reduced Tsal, up to a proportion of approximately 90% of total proteins.
  • the reduced Tsal / oxidized ratio returns to that of the untreated cells.
  • the reappearance of the reduced Tsal task comes from oxidized Tsal and not from Tsal synthesized de novo, since the labeling of proteins is interrupted before analysis.
  • Identical results are observed when the cells are treated with t-butyl hydroperoxide (t-BOOH).
  • t-BOOH t-butyl hydroperoxide
  • the Tsal migrates like a double band modified by the AMS (FIGS. 4c and 4d); and 15 minutes after treatment with H 2 O 2 , Tsal migrates as singular or double species modified by AMS, presenting a mixture of reduced and oxidized forms in a ratio of approximately 1: 3.
  • Tsal After a period of 120 minutes of this treatment, the Tsal is completely returned to its initial state, that is to say in the form of a doublet alkylated by AMS, demonstrating the reduction of the sulfinate to Cys-SH.
  • the reduction in Tsal is delayed compared to that observed by 2D- PAGE ( Figure 4a), which is likely due to inhibition of protein synthesis.
  • Example 3 Identification of a 13 kDa protein in S. cerevisiae linked to a Prx by disulfide bridge ( Figure 7). 3.1 Materials and Methods (see Example 1) (A) Cells containing a labeled copy (HA) of the protein Srxl are treated with 500 ⁇ M of H 2 O 2 for 15 minutes.
  • HA labeled copy
  • the proteins are extracted according to a method allowing the conservation of the intracellular redox state of the thiols (see example 1) then separated on SDS-PAGE gel under reducing conditions for the cells of the wild strain (WT) containing a labeled copy (HA) of the protein Srxl (lane 1) and under non-reducing conditions for the wild-type (WT) cells (lane 2), the Atsal mutant strain carrying a labeled copy of the SRN7 gene (lane 3), and the Asrxl strain carrying a labeled copy of the C84S mutated SRX1 gene (lane 4); reference molecular weights (MW) are expressed in kDa.
  • WT wild strain
  • HA labeled copy
  • Srxl a labeled copy of the protein Srxl
  • la 2 wild-type cells
  • MW reference molecular weights
  • the purified proteins are then separated on a reducing or non-reducing SDS-PAGE gel.
  • the identification of the various proteins indicated was carried out by mass spectrometry; the purified proteins separated under non-reducing and reducing conditions come from the Atrrl mutant strain containing a copy of the SRXl gene (wells 1 and 3), and the Atrrl mutant strain containing a labeled copy (HA) of the SRXl gene ( wells no. 2 and 4), the reference molecular weights (MW) are expressed in kDa.
  • FIG. 7a illustrates the existence of an inter-molecular disulfide bridge between Tsal and Srxl, implying the conserved cysteine (Cys84) of Srxl (see Figures 2 and 3). It also shows that Srxl can be in two forms: a 13 kDa monomer and a 55 kDaparticularlyr linked by disulfide bridge ( Figure 7a, lane 2).
  • FIG. 7b illustrates the fact that the copurification of Tsal, Tsa2 and Ahpl shows that Srxl interacts with three of the five peroxyredoxins existing in yeast and that the interaction with Tsal can be redox or non-covalent.
  • the purified unreduced material contains several major bands of sizes 80, 55, 40, 35, 20 and 13 kDa ( Figure 7b) which are limited to 2 main bands of 13 and 20 kDa and one minor band 18 kDa after reduction (last well).
  • Mass spectrometry of the MALDI-TOF type applied to the reduced material made it possible to identify the proteins Srxl, Tsal and the protein Ahpl which is the second major 2-Cys Prx of yeast, in the bands of 13, 20 and 18 respectively.
  • kDa. Tsa2, which is a third 2-Cys Prx, is also present as traces in the 20 kDa band.
  • FIG. 6 shows that the overexpression of TSA1 completely corrects the defect in resistance of the ⁇ srxl strain, showing that this sensitivity is due to a defect in peroxidase activity.
  • the overexpression of SRX1 in an Atsal yeast has no effect, unlike the same overexpression in a wild strain. This shows that the presence of Tsal is essential to the function of Srxl.
  • the function of the SRXl gene is linked to the TSAL gene.
  • TSA1 restores the lack of tolerance to H 2 O 2 and to t-BOOH in the Atsal strain, but the overexpression of the SRXl gene does not cause any such effect in the strain. Atsal, although it slightly increases the tolerance of the wild strain to t-BOOH.
  • Example 5 ATP is necessary to reduce the Cys-SO 2 H form of Tsal.
  • 5.2 Results In order to study in more detail the reduction of the Cys-SO 2 H form of Tsal by Srxl, the recombinant Srxl protein expressed by baculovirus was produced. It shows that the purified Srxl allows the reduction of the SO 2 H form of the purified Tsal, and that this reduction occurs only in the presence of ATP and of lysates originating from wild type cells (FIG. 8). These data show that Srxl catalyzes the reduction of the sulfinate form of Tsal.
  • the Srxl protein allows the reduction of the Cys-SO 2 H form of the Tsal protein present in the lysates of the ⁇ Srxl cells treated with HO 2 in a dose-dependent manner, only when ATP is added (FIG. 8a and b).
  • GTP and AMP-P ⁇ P which is a non-hydrolyzable ATP homolog, has no effect on catalysis.
  • Adding EDTA to the lysate inhibits the reduction in Srxl-dependent Tsal and the reintroduction of Mg ++ or Mn ++ but not Fe ++ , Ca ++ , Cu ++ , or Zn, restores the reduction .
  • the activity of the Srxl mutants was tested by the substitution of each of its 3 cysteines.
  • the substitution of Cys84 (Srxl Cys84s ), which is conserved among the Srxl homologs in other eukaryotes, completely suppresses the formation of the disulfide bridge between Srxl and Tsal and the reduction of the Cys-SO H form of Tsal, then that the other cysteine mutants show no effect for Srxl Cysl06S or a minor effect for Srxl Cys48S .
  • Srxl-Tsal bond comes from Cys84 of Srxl and that it is essential for the reduction of Tsa Cys-SO 2 H mediated by Srxl.
  • the reduction of the cysteine sulfinic acid probably requires its initial activation, which can be carried out by formation of a phosphorylated sulfinic ester, as the need for ATP and Mg 44 " indicates.
  • This modification allows the attack of the sulphide residue by cysteine at the activated site of Srxl, then the temporary formation of an intermolecular thiolsufinate between Srxl and Tsal. Thiolsulfinate exists during oxidative stress and is accessible to thiol-dependent reduction.
  • the thiolsulfinate between Srxl and Tsal is converted into two Cys-SH by successive thiol-redox exchanges initially involving the reductive cleavage of the thiolsulfinate bridge into a sulfenate and into a disulfide bridge thanks to the electrons supplied by the DTT in vitro and probably by the thioredoxin in vivo.
  • Example 6 Identification of human sulfiredoxine (hSrxl) and demonstration of its catalytic activity.
  • hSrxl human sulfiredoxine
  • SEQ ID NO: 4 Materials and methods The hSrx gene (SEQ ID NO: 4) was cloned by PCR from cDNAs prepared by reverse transcription from cells of a human tumor line MCF-7, using the oligonucleotides:

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Abstract

Applications d'une nouvelle classe d'enzymes, les sulfirédoxines (Srx), qui catalyse la réduction des dérivés Cys-SO2#191H (cystéine-acide sulfinique) et notamment la réduction de la peroxyrédoxine (Prx) sous sa forme Cys-SO 2#191H en dérivé thiol.

Description

APPLICATIONS D'UNE NOUVELLE CLASSE D'ENZYMES : LES SULFIREDOXINES La présente invention est relative aux applications d'une nouvelle classe d'enzymes, les sulfirédoxines (Srx), qui catalyse la réduction des dérivés Cys- S02H (cystéine-acide sulfinique) et notamment la réduction de la peroxyrédoxine (Prx) sous sa forme Cys-SO2H en dérivé thiol. Dans les protéines, certains groupes thiols de cystéine (Cys-SH), ayant une activité rédox, peuvent être oxydés par du peroxyde d'hydrogène (H2O2) en acide sulfénique (Cys-SOH). Celui-ci étant instable, réagit soit avec n'importe quel groupe thiol proche pour former un pont disuliure (C-S-S-C), soit, en l'absence de groupe thiol proche accessible, le composé Cys-SOH peut être davantage oxydé en acide sulfinique (Cys-SO2H) stable ou acide cystéique (Cys-SO3H). Les peroxyrédoxines (Prxs) sont des enzymes antioxydantes comportant de telles cystéines à activité redox. Par exemple, les 2-Cys Prxs sont des homodimères inversés avec 2 cystéines à activité rédox par sous-unité. Elles catalysent la réduction du peroxyde d'hydrogène. Le site catalytique de ces enzymes comprend deux cystéines à activité redox (cystéine N-terminale peroxydatique (Cysp) et cystéine C-terminale de résolution (CysR)). De manière plus précise le cycle catalytique de ces peroxyrédoxines comprend (Wood ZA et al., Science, 2003, 300, 650-653 ; Wood et al., Trends in Biochemical Sciences, 2003, 28, 1, 32-40) : - l'oxydation de la Cysp-SH en Cysp-SOH (acide sulfénique) par H2O2 ; - la formation d'un pont disulfure entre la Cysp et la CysR de la deuxième sous-unité de Prx (Cysp-S-S-Cysj (processus lent) ; - la réduction de ce pont disulfure par des réducteurs cellulaires classiques tels que le glutathion ou la thiorédoxine (Trx), pour obtenir le produit de départ Cys-SH. Dans certains cas, les Prxs peuvent être inactivées, par super-oxydation de la Cysp-SOH en acide sulfinique (Cysp-SO2H) ; cette réaction de super-oxydation était considérée jusqu'à présent comme irréversible, (Wood ZA et al., Science, 2003, 300, 650-653). Récemment (Woo HA et al., Science, 2003, 300, 653-656 ; Georgiou G. et al., Science, 2003, 300, 592-594), la réversion de la Cys-acide sulfinique en composé Cys-SH a été montré in vivo dans le cas de la peroxyrédoxine à deux cystéines (2-Cys Prx) de mammifère, indiquant l'existence d'une réductase spécifique, qui n'a cependant pas été identifiée. Plus précisément, ces auteurs ont montré que, par marquage métabolique de cellules de mammifères avec du 35S, la forme sufinique de la peroxidine I, produite lors de l'exposition des cellules au H2O2, est rapidement réduite en forme thiol catalytiquement active. Ces auteurs pensent que la réduction de l'acide sulfinique observée lors de ces études nécessite l'intervention d'enzymes spécifiques, qui n'ont pas été identifiées. Etant donné que les Prxs de mammifères régulent la signalisation médiée par H2O2, leur inactivation réversible pourrait servir dans le processus de régulation. Les peroxyrédoxines (Chae et al., P.N.A.S., 1994, 91, 7022-7026) sont des antioxydants ubiquitaires, qui contrôlent, dans de nombreuses espèces (microorganismes, plantes et organismes supérieurs y compris les mammifères), les taux de H2O2, qui régulent les cascades de signalisation conduisant à une prolifération cellulaire, une différentiation et une apoptose (Fujii J. et al., Redox Rep., 2002, 7, 123- 130). Les Inventeurs ont maintenant identifié la famille d'enzymes qui réduisent les Prxs Cysp-SO2H. Il s'agit d'une protéine qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S et qui a un poids moléculaire d'environ 8 à 14 kDa. Cette enzyme est conservée chez les eucaryotes et est dénommée ci- après sulfirédoxine (Srx). Chez la levure et en particulier chez Saccharomyces cerevisiae, cette enzyme est dénommée Srxl et a un poids moléculaire de 13 kDa. Chez l'homme, cette enzyme est dénommée hSrxl et a un poids moléculaire de 13,6 kDa. Des séquences polypeptidiques identiques à celles de la sulfirédoxine ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes figurent dans la base de données de séquences NCBI ou GenBank, sous les numéros d'accès suivants : S. cerevisiae : YKL086W, Homo sapiens : AAH47707, CAC28314, M. musculus : BAB24939, AAH11325, Arabidopsis thaliana : AAD21682, AAO42977, Oryza sativa : BAA95812, Schizosaccharomyces pombe : SPBC106.02c, Thermosyne- chococcus. elongatus : BAC07716, Drosophila melanogaster : AAF48773, Nostoc sp. (PCC7120) : NP_488186. En revanche, aucune fonction n'a été attribuée à ces séquences poly- peptidiques, dans la base de données de séquences NCBI ou GenBank. Les Inventeurs ont maintenant trouvé un point commun entre ces différentes protéines : le site catalytique précité et une fonction : la catalyse de la réduction des Prxs Cysp-SO H. La réaction catalysée par la sulfirédoxine (Srx) est résumée à la figure 1. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une protéine dénommée sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S, pour catalyser la réduction des peroxyrédoxines (Prxs) sous leur forme super-oxydée Prx-Cysp-SO2H (peroxy- rédoxine cystéine acide sulfinique) en dérivé thiol (SH). La sulfirédoxine joue donc un rôle très important dans la fonction antioxydante des peroxyrédoxines et est impliquée dans la réparation ou le contrôle des protéines modifiées par la formation d'une cystéine-acide sulfinique. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite sulfirédoxine est une sulfirédoxine de microorganisme, de plante ou d'organisme supérieur, qui comprend généralement entre 80 et 170 acides aminés et au moins le site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S. Elles présentent entre elles les pourcentages d'identité et de similarité suivants : . levure/homme : 31 % d'identité et 67 % de similarité . levure/plantes : 23 % d'identité et 39 % de similarité . levure/souris : 31 % d'identité et 51 % de similarité . levure/champignons : 80 % d'identité et 90 % de similarité. Conformément à l'invention, l'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence (SEQ ID NO :1 correspondant à la séquence de la Srxl de S. cerevisiae) s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les séquences correspondant à la région catalytique telle que définie ci-dessus sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec la séquence de référence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente invention comme une protéine qui peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence SEQ ID NO: 1. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique. La similarité d'une séquence par rapport à la séquence de référence
SEQ ID NO: 1 s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques similaires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine. Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente inven- tion comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X altérations non- conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence SEQ ID NO: 1. Ladite sulfirédoxine est notamment sélectionnée parmi les protéines dont les séquences correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 1 à 10, illustrées aux figures 2 et 3 ou représentées dans la liste de séquences : S. cerevisiae : SEQ ID NO :1 ; C. albicans : SEQ ID NO :2 ; S. pombe : SEQ ID NO :3 ; H. sapiens : SEQ ID NO :4 ; M. musculus : SEQ ID NO :5 ; D. melanogaster : SEQ ID NO :6 ; A. thaliana : SEQ ID NO :7 ; T. elongatus : SEQ ID NO :8 ; Nostoc sp. : SEQ ID NO :9 et Oryza sativa : SEQ ID NO :10. La présente invention a également pour objet un peptide isolé, correspondant au site catalytique de la Srx, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence suivante : FXGCHR, avec X *= S. La présente invention a également pour objet des anticorps anti-Srx, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO :l-3, 5-6 et 8-10 ou le peptide FXGCHR, avec X = S. Lesdits anticorps sont soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. Là présente invention a également pour objet un médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une protéine définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO- 1-3 et 5-10 et éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une protéine telle que définie ci-dessus pour la préparation d'un médicament antioxydant destiné à traiter les cancers, les troubles neurodégénératifs et les maladies neuromusculaires, dans lesquels l'on observe une défaillance du système antioxydant Prx/Srx. La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer l'implication du système antioxydant Prx/Srx : (1) la mise en contact in vitro des cellules d'un échantillon biologique avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2), (2) la détection de la Prx-Cysp-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), et (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1). L'échantillon biologique est notamment constitué de cellules sanguines. Des rapports Prx-Cysp-SO2H/ Prx-Cysp-SH > 1 sont le signe d'une pathologie du système antioxydant Prx/Srx , liée à un dysfonctionnement de la Srx. Ainsi, un tel procédé permet d'évaluer si le système antioxydant Prx/Srx fonctionne normalement au non. La connaissance des mécanismes impliqués dans l'étiologie de la maladie permet de sélectionner le traitement le plus adapté à la situation, notamment dans les cas de systèmes antioxydants Prx/Srx défaillants. En variantes, ledit procédé de dépistage comprend : A. le génotypage de la sulfirédoxine, à partir de TARN total d'un échantillon biologique convenable, notamment des cellules sanguines. De manière plus précise, ledit procédé comprend : (1) l'extraction de l'ARN total, à partir d'un échantillon biologique convenable, (2) la préparation d'ADNc spécifique de la sulfirédoxine, par amplification de l'ARN à l'aide des deux amorces suivantes : GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), ces séquences étant situées respectivement en amont et en aval de l'ORF de la sulfirédoxine humaine (GenBank n° AAH47707), (3) l'établissement de sa séquence nucléotidique et (4) la comparaison par rapport à une séquence d'ADN codant pour une protéine Srx, telle que définie ci-dessus, issue de la même espèce que celle de l'échantillon biologique à analyser. B. la quantification relative, par tout moyen approprié, de l'ARNm codant pour la sulféridoxine humaine (hSrxl) à partir des ADNc totaux préparés à partir d'un échantillon biologique humain, par comparaison avec un échantillon de référence. L'échantillon de référence est en particulier un échantillon obtenu à partir d'un sujet témoin sain. Conformément à l'invention, préalablement à ladite quantification, ledit procédé comprend une étape d'extraction des ARN totaux. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, ladite quantification comprend : (al) la préparation d'ADNc à partir de l'ARN total par transcription inverse avec des amorces appropriées et notamment des amorces aléatoires hexa- nucléotidiques ; (a2) l'amplification dudit ADNc en présence de la paire d'amorces : GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO : 11 ) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), en présence d'un reporter fluorescent et de façon simultanée ou séquentielle, (a3) la détection de la quantité de l'amplimère (ou amplicon) par mesure du signal fluorescent. L'amplification de l'ARNm est effectuée par RT-PCR ; les étapes de transcription inverse et d'amplification PCR sont, soit dissociées et dans ce cas la quantification est réalisée par PCR-quantitative, soit elles sont couplées et dans ce cas la quantification est réalisée par RT-PCR quantitative. De préférence, ladite quantification est réalisée à l'aide d'un étalon interne comme par exemple, la sous-unité 18S d'ARN ribosomal. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, le reporter fluorescent est sélectionné dans le groupe constitué par des agents se liant à l' ADN double-brin et des sondes fluorescentes. De préférence, ladite quantification est réalisée en temps réel, c'est-à- dire que la détection et la quantification du signal fluorescent émis sont effectuées pendant le processus d'amplification, dans la mesure où l'augmentation du signal est directement proportionnelle à la quantité d'amplimères produits durant la réaction. Les principes généraux de la PCR et de la RT-PCR quantitatives en temps réel, ainsi que les différentes techniques de détection quantitative des ampli- mères : à l'aide d'agents se liant à l'ADN double-brin (agents intercalants : bromure d'éthidium, SYBR Green I, YO-PRO-1 ; agents se fixant au sillon mineur : Hoechst 33258) ou à l'aide de sondes fluorescentes, à savoir : hydrolyse de sondes par l'activité 5' nucléase de l'ADN polymérase (TaqMan™), hybridation de 2 sondes (Hybprobes), balises moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers), sont connues de l'Homme du métier et sont notamment décrites dans Poitras et al., Reviews in Biology and Biotechnology, 2002, 2, 1-11. La PCR et la RT-PCR quantitative en temps réel à l'aide de sondes du type TaqMan™ sont notamment décrites, respectivement dans Heid C. et al. (Génome Research, 1996, 6, 986-994) et Gibson U. et al. (Génome Research, 1996, 6, 995-1001). Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en œuvre, lorsque ledit reporter fluorescent est une sonde, il est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les sondes définies par les séquences suivantes : TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID NO :14). L'extraction de l'ARN, la préparation de l'ADNc et l'établissement de la séquence sont réalisées en utilisant les techniques classiques, selon les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA). La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : - l'immunodétection de la protéine Srx dans un échantillon biologique à tester, à l'aide d'un anticorps obtenu par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx ou le peptide FXGCHR, avec X=G ou S, après séparation des protéines totales par électrophorèse, puis - l'évaluation de la qualité et de la quantité de ladite protéine Srx par rapport à une protéine Srx contrôle. Ladite détection-quantification est avantageusement réalisée par la méthode du Western blot. La présente invention a également pour objet l'utilisation de la séquence codant pour une protéine Srx, telle que définie ci-dessus ou d'un vecteur contenant ladite séquence codante, pour l'obtention de plantes dont les capacités de résistance au stress (sécheresse, froid, chaleur toxiques oxydants présents dans l'environnement) sont signifîcativement augmentées. Les séquences codant pour la protéine Srx peuvent être aisément obtenues à partir des bases de données de séquences précitées. La présente invention a également pour objet des cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant contenant une séquence codant pour une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO J-3, 5-6 et 8-10. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte, elle est constituée par une souche de S. cerevisiae surexprimant le gène SRXL Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte, elle est constituée par une cellule de mammifère modifiée par un vecteur surexprimant le gène hSrxl . Le vecteur est avantageusement un vecteur navette E. colilS. cerevisiae comprenant au niveau d'un site de clonage, la séquence codant pour la protéine Srx et le promoteur du gène Srx. Il s'agit notamment du plasmide pRS316 (n°ATCC 77145). Le promoteur du gène Srx est 400 paires de bases en amont du site d'initiation de la traduction ; il est repérable sur le site http://www.yeastgenome.org/ (n° d'accès YKL086W). Ces cellules hôtes transformées par un tel vecteur sont particulièrement intéressantes pour l'étude du système antioxydant Prx/Srx et le criblage in vitro de médicaments modulant l'activité du système antioxydant Prx/Srx. En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments aptes à moduler l'activité du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des cellules hôtes selon l'invention, en présence de peroxyde d'hydrogène, (2) la détection de la Prx-Cysp-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1). La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec un extrait de cellules hôtes modifiées telles que définies ci-dessus ou un échantillon biologique d'un animal transgénique non humain, notamment des souris, sélectionné dans le groupe constitué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx, est surexprimé en présence de peroxyde d'hydrogène, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité antioxydante du système Prx/Srx du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables de stimuler ou d'inhiber ladite activité. La mesure de ladite activité est notamment effectuée par la détection de la Prx-Cysp-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a) et l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a). La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des mammifères transgéniques non-humains, notamment des souris, sélectionné dans le groupe constitué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est surexprimé, et (2) la mesure de la survie de l'animal. L'obtention de mammifères transgéniques non-humains est réalisée en utilisant des méthodes classiques et notamment selon les protocoles décrits dans Transgenic animais génération and use (CM. Houdebine Ed., Harwood académie publishers, Amsterdam). La présente invention a également pour objet un procédé de réduction d'un produit comprenant au moins deux cystéines à activité redox, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite protéine avec une sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S, en présence d'ATP et de magnésium. La réduction du produit comprenant au moins deux cystéines à activité redox implique son activation par phosphorylation suivie d'une réduction du soufre, ces deux activités étant catalysées par la sulfirédoxine. La présente invention a également pour objet un procédé de synthèse d'un produit comprenant des résidus Cys-SH à partir de produits comportant des résidus Cys-SO2H, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réduction du produit comportant les résidus Cys-SO2H en produit comprenant des résidus Cys-SH, en présence d'une sulfirédoxine, d'ATP et de magnésium. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre la réaction catalysée par Srxl . - les figures 2 et 3 représentent la comparaison des séquences de Srxl dans différentes espèces ; figure 2 : S. cerevisiae, C. albicans, S. pombe, H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster et A. thaliana ; les régions identiques sont encadrées ; le site catalytique se trouve autour de la cystéine conservée, indiquée par un astérisque ; figure 3 : S. cerevisiae, H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster, A.thaliana, T. elongatus et Nostoc sp.. Les n° d'accès GenBank sont indiqués sur cette figure. L'alignement des séquences a été réalisé à l'aide du logiciel CLUSTALW. Les acides aminés identiques dans environ 65 % des séquences sont encadrés. Le site actif Srxl comprenant une cystéine (flèche noire) et les autres cystéines (flèche blanche) sont indiqués. - la figure 4 illustre le recyclage de la forme cystéine-acide sulfinique de la Tsal, dépendant de la Srxl ; figures 4a et 4b : analyse PAGE 2D des formes réduite (SH) et oxydée (SO2H) de la Tsal marquée à la S-Met dans des cellules sauvages et des cellules Δsrxl exposées au H2O2 (500 μM) pendant la période indiquée ; les figures 4c et 4d correspondent à des Western blot de formes réduite (2xAMS) et oxydée (lxAMS) de Tsal à partir de cellules WT (c) ou de cellules Δsrxl (d) traitées au H2O2 après alkylation in vitro avec de l'AMS. Après induction de l'expression de Srxl pendant 15 min avec de l'H2O2 (100 μM), les cellules sont traitées avec de la cycloheximide (CHX) 5 min avant le traitement à l' H O2 (500 μM). - la figure 5 illustre le rôle joué par la protéine Srxl dans la résistance des cellules au stress induit par du peroxyde d'hydrogène ; des tests de sensibi- lité sont réalisés en faisant croître une souche sauvage (WT) et une cellule invalidée (Asrxl) ou une souche mutante srxlC84S dans des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes (en raM) de peroxyde d'hydrogène (H2O2) (figure 5a et 5b) : figure 5a : résistance à H2O2 de la souche sauvage (WT), de la souche invalidée (Asrxl) et de la souche mutante srxlC84S ; figure 5b : Western blot (incrustation) et QT-RT PCR de la protéine Srxl étiquetée à HA et de l'ARNm dans des cellules traitées au peroxyde d'hydrogène (400 μM). - la figure 6 illustre le rôle joué par la protéine Srxl dans la résistance des cellules au stress induit par du t-butyl hydroperoxyde ; des tests de sensibilité sont réalisés en faisant croître une souche sauvage (WT), une cellule invalidée (Asrxl), une souche sauvage surexprimant Tsal ou Srxl, une cellule invalidée (Asrxl) exprimant Tsal, une cellule invalidée (Atsal) et une cellule invalidée (Atsal) surexprimant Srxl dans des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes de t-butyl hydroperoxyde (tBOOH) ; les concentrations sont exprimées en mM. - la figure 7 illustre l'interaction entre Tsal et Srxl de façon covalente (pont disulfure) et non-covalente ; Figure 7a : Western blot de la protéine
Srxl étiquetée HA (pistes 1, 2 et 3) ou de la Srxl étiquetée HA (piste 4) exprimées dans une souche sauvage (WT) (pistes 1, 2, 4) ou dans des cellules Atsal (piste 3) traitées 15 min avec H2O2 (500 μM) après une électrophorèse SDS-PAGE réalisée en conditions réductrices (R) (piste 2) ou non réductrices (NR) (pistes 1, 3, 4) ; figure 7b : les protéines co-purifiées avec la Srxl étiquetée avec la 6His (pistes 2,4) ou la Srxl non étiquetée (pistes 1, 3) dans des conditions non-réductrices, sont séparées par SDS-PAGE dans des conditions non-réductrices (pistes 1, 2) ou réductrices (pistes 3, 4) et visualisées par coloration au bleu de Coomassie. Les bandes de protéines sont identifiées par spectrométrie de masses MALDI-TOF comme indiqué. - la figure 8 montre que la protéine Srxl et l'ATP sont nécessaires à la réduction de la Tsal oxydée in vitro par Srxl ; figures 8 a et b : Analyse en Western blot des formes réduite (SH) et super-oxydée (SO2H) de la Myc-Tsal dans des lysats de cellules AtsaX incubées 15 min à 30°C avec de la Srxl purifiée et de l'ATP, aux concentrations indiquées ; figure 8c : Analyse en Western blot des formes réduite (SH) et super-oxydée (SO2H) de la 6His-Tsal incubée pendant 15 min à 30°C avec de la Srxl purifiée, de l'ATP (1 mM) et du Mg++ (1 mM), comme indiqué. - la figure 9 illustre le rôle de la hSrxl dans la réduction des 6His-
Prxl et 6His-Prx2 dans leurs formes superoxydées. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Matériel et Méthodes. l.L Souches Les souches de S. cerevisiae utilisées sont la souche YPH98 (Sikorski R. et al., Genetics, 1989, 122, 19-27) (MATa, ura3-52, lys2-801ambre, ade2- 101ocre trpl-Δl Ieu2-Δl) et ses dérivés isogéniques. Les souches Asrxl, Δtrrl et Δtsal sont réalisées en remplaçant la région codante de SRXl (sulfirédoxine) et de TRRl (thiorédoxine réductase) par KANMX4 et le cadre ouvert de lecture TSA1 par TRP1 (tyrosinase-related protein 1). Les souches surexprimant Tsal et Srxl sont identiques aux précédentes, sauf qu'elles portent chacune une délétion du gène Tsal ou Sr 7 et portent le plasmide à copies multiples psRS426 (n° ATCC 77107) ; Les cellules sont cultivées à 30°C dans un milieu YPD (extrait de levure à 1 %, bactopeptone à 2 % et glucose à 2 %) ou un milieu CASA (base azotée de levure à 0,67 %, casaminoacides à 0,1 %, glucose à 2 %), complémenté en adénine, tryptophane et uracile. 1.2. Plasmides Les protéines de fusion suivantes : - Srxl -HA : protéine de fusion comprenant la fusion de deux épi- topes HA en C-terminal de Srxl et - 6His-Srxl : protéine de fusion entre Srxl et à son extrémité N- terminale six étiquettes histidine, sont construites par PCR en deux étapes : les amorces nucléo- tidiques utilisées pour la PCR incorporent la séquence de l'un ou l'autre des épitopes HA (défini par l'anticorps commercial reconnaissant l'épitope HA 12CA5, Babco, MMS-101 R) et 6His (6 histidines) et amplifient la séquence codante complète de Srxl, flanquée par 400 et 200 paires de bases en amont et en aval de leur séquence et clone au site EcoRI du plasmide pRS316 (n°ATCC77145) ou du plasmide pRS426 (n°ATCC 77107). Myc-Tsal, une protéine de fusion comprenant à l'extrémité N- terminale de Tsal, un épitope Myc (défini par l'anticorps anti-Myc, 9E10, Babco, MMS-150R) est construite et clonée de manière similaire au site EcoRI du plasmide pRS316. La mutagénèse dirigée pour la génération des mutants Cys>Ser est réalisée par un protocole standard d'amplification par PCR à l'aide d'oligonucléotides amorces comportant la séquence modifiée. 1.3. Analyse des protéines * Pour l'analyse en PAGE 2D. les cultures cellulaires en début de phase exponentielle (DO6oonm =0,3) sont marquées avec de la S-Met (100 μCi) 20 min à 30°C, suivie d'une chasse de la méthionine marquée par de la méthionine froide (1 mM final) et de la cystéine (0,1 mM final) et traitées avec de l'H2O2 (500 μM). Les cellules sont soumises à une analyse PAGE 2D comme décrit dans Maillet et al. (J. Biol. Chem., 1996, 271, 10263-10270). * Pour l'analyse de l'état redox in vivo de Srxl -HA. des lysats de cultures de cellules en début de phase exponentielle de culture (DO6oonm =0,3) sont préparés par le protocole de lyse à l'acide trichloroacétique (Delaunay et al., EMBO J., 2000, 19, 5157-5166). Les protéines précipitées sont solubilisées dans un tampon A [Tris-Ci, pH 8 (100 mM), SDS (1 %), EDTA (1 mM)] contenant du N- éthylmaléimide (NEM) (50 mM). Les extraits sont séparés par SDS-PAGE à 17 % dans des conditions réductrices et non réductrices et la Srxl -HA est détectée par l'anticorps monoclonal 12CA5 précité. * Pour la dérivatisation de la cystéine de Mvc-Tsal par AMS. les extraits cellulaires sont traités dans les mêmes conditions que celles du protocole de lyse TCA, sauf que les protéines précipitées sont d'abord solubilisées dans le tampon A contenant du DTT (50 mM) pendant 1 h à 37°C, précipitée par le TCA mises en suspension dans un tampon A contenant de l'AMS (15 mM) pendant 2 h à 37°C. Les extraits cellulaires sont séparés par SDS-PAGE à 20 % dans des conditions réductrices et Myc-Tsal est immunodétecté avec l'anticorps monoclonal anti-Myc 9E10, précité. * Pour la réduction in vitro, soit 3 μl de lysat (2 mg/ml) de cellules Δsrxl traitées à l'H2O2 comprenant de la Myc-Tsal oxydée, soit de la 6His-Tsal oxy- dée et purifiée (0,5 mg) sont ajoutés dans le tampon de réaction (RM) (80 μl final) [Tris-Cl pH 6,8 (50 mM), KCl (100 mM)] contenant de la Srxl purifiée exprimée par un baculovirus, de l'ATP et du MgCl2 aux concentrations indiquées et incubés 15 min à 30°C. La 6His-Tsal est oxydée en cystéine-acide sulfinique par incubation dans le tampon RM contenant du DTT (10 mM) et de l'H2O2 (1 mM) pendant 30 min et diluée 16 fois de le milieu réactionnel. 1.4. Purification des protéines recombinantes . La Srxl et la hSrxl sont exprimées dans des cellules d'insecte High Five en utilisant le système d'expression en baculovirus Bac-To-Bac® (Invitrogen) et purifiées successivement par chromatographe d'échanges d'ion, chromatographie d'affinité et HPLC (8ml-Poros® 50HS, 8ml-Poros® 50HE, 0,8ml- Poros® 20HS) (Applied Biosystems). . La 6His-Tsal est exprimée dans des cellules E. coli BL21 à partir du plasmide pET28a-Tsal après induction à l'isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, conformément aux recommandations du fabricant (Stratagène). Les cellules sont mises en suspension dans un tampon de lyse [Tris-Cl pH 6,8 (50 mM), KCl (100 mM), DTT (2 mM), imidazole (20 mM)], supplémenté en fluorure de phénylméthane- sulfonyle (PMSF) (1 mM), lysées par des cycles congélation-décongélation et sonica- tion. Les extraits sont centrifugés 30 min à 30.000 g et le surnageant est passé dans une colonne d'agarose Ni-NTA (Qiagen). Après lavage de la colonne avec le tampon de lyse, la Tsal est éluée par du tampon de lyse supplémenté en imidazole (150 mM). La pureté et la concentration des protéines purifiées est déterminée par coloration au bleu de Coomassie après SDS-PAGE et test Bradford (Biorad). 1.5. Purification des partenaires de réaction de la Srxl La 6His-Srxl et la Srxl sont exprimées à partir du plasmide pRS426 dans la souche Δtrrl, dépourvue du gène de la thiorédoxine réductase qui stabilise les ponts disulfures. Les cellules sont cultivées jusqu'au milieu de la phase exponentielle
(DO6oonm = 0,8) et traitées par H2O2 (5 mM) pendant 5 min, lavées deux fois dans de l'eau supplémentée en NEM (10 mM), congelées et lysées dans une presse Eaton dans un tampon C [Tris-Cl pH 8 (100 mM), NaCl (50 mM) EDTA-sans inhibiteur de protéase (Roche-Boerhinger), PSMF (1 mM), imidazole (20 mM), NEM (10 mM)]. L'extrait cellulaire est centrifugé lh30 à 10.000 g et le surnageant est passé dans une colonne Ni-NTA (Qiagen). Après lavage, de la colonne avec un tampon D [Tris-Cl pH 8 (100 mM), NaCl (50 mM)] + imidazole (20 mM), les protéines sont éluées avec le tampon D + imidazole (300 mM). 1.6. Analyse de l'ARN L'ARN total est extrait comme décrit dans Lee et al. (J. Biol. Chem., 1999, 274,4537-4544) et l'ADNc est synthétisé par transcription inverse avec des amorces aléatoires hexanucléotidiques, à partir d' μg d' ARN total. Une PCR quantitative (Biorad iCycler) est réalisée en utilisant la méthode au SYBR Green I fluorescent, avec les amorces spécifiques de SRX1 ou ACT1, trois fois séparément, conformément aux recommandations du fournisseur. Exemple 2 : Réversibilité de la sur-oxydation de la cystéine de la Tsal par l'activité catalytique de la Srxl. 2.1 Matériel et méthodes L'une des 5 Prxs de S. cerevisiae, la Tsal, est une 2-Cys Prx et constitue l' antioxydant principal chez la levure avec une spécificité de substrat large envers à la fois H2O2 et les peroxydes organiques. L'oxydation de Tsal et la réversibilité de cette réaction en présence de Srx ont été analysées selon deux techniques : (A) séparation selon le point isoélectrique de la protéine en gel à deux dimensions (électrophorèse PAGE en 2D) ; les cellules de souche sauvage (WT) et la souche invalidée Asrxl sont initialement soumises à un marquage radioactif in vivo des protéines suivie d'une chasse de l'élément radioactif avant d'être traitées au H2O2, pendant des durées différentes (0, 2, 30 et 90 minutes de traitement) ; la tâche de gauche (figure 4a) représente la forme native de la protéine et la tâche de droite (figure 4a) la forme acide (acide sulfinique). (B) alkylation différentielle des thiols ; les cellules de souche sauvage (WT) et souche invalidée Asrxl portant une copie étiquetée de Tsal sont traitées à la cycloheximide (CHX) pour bloquer la synthèse protéique de novo en cours d'analyse, puis traitées à l'H2O2. Les protéines sont extraites, réduites au DTT puis les thiols sont alkylés par un composé de 500Da, l'acide 4-acétamido-4'- maléimidylstilbène-2,2'-disulfonique (AMS) qui alkyle les cystéines au niveau des groupes SH libres mais pas sous forme de sulfinate, augmentant le poids moléculaire de la protéine de 0,5 kDa par cystéine alkylée (AMS) ; la différence de taille entre les protéines portant deux thiols alkylés (cystéines réduites ou pont disulfure, indiqué « 2 AMS » sur les figures 4c et 4d ou un thiol alkylé (acide sulfinique, indiqué « 1 AMS » sur les figures 4c et 4d) est observée après séparation selon leur taille sur un gel SDS-PAGE. La protéine est révélée par Western Blot ; 2J Résultats Les résultats sont présentés aux figures 4a et 4b. Dans les extraits cellulaires non-traités, Tsal apparaît comme une tache double : l'une intense correspondant à environ 85% de l'enzyme totale à une position de pi de 4,8 (+/- 0,05), ce qui correspond à une Tsal réduite (le pi théorique de la Tsa est 4,87) ; l'autre tache plus fine se situant à une position de pi plus acide de 4,7 (+/- 0,05), ce qui correspond à la Tsal oxydée (la valeur théorique de la forme acide sulfinique de la cystéine de la Tsal est 4,75). Après deux minutes de traitement par H2O2 (500μM), la proportion de Tsal oxydée augmente au détriment de la Tsal réduite, et ce jusqu'à une proportion d'environ 90% des protéines totales. Après 30 minutes de traitement, le rapport Tsal réduit/oxydé revient à celui des cellules non- traitées. La réapparition de la tâche de Tsal réduite provient de la Tsal oxydée et non de Tsal synthétisée de novo, étant donné que le marquage de protéines est interrompu avant l'analyse. Des résultats identiques sont observés lorsque les cellules sont traitées avec du t-butyl hydroperoxyde (t-BOOH). Dans les extraits cellulaires non-traités par l'H2O2, la Tsal est en grande partie réduite et migre comme une bande double modifiée par l'AMS (Figures 4c et 4d) ; et 15 minutes après traitement par H2O2, la Tsal migre comme des espèces singulières ou doubles modifiées par l'AMS, présentant un mélange de formes réduite et oxydée selon un rapport d'environ 1 :3. Après une durée de 120 minutes de ce traitement, la Tsal est complètement revenue à son état initial, c'est à dire sous forme de doublet alkylé par l'AMS, mettant en évidence la réduction du sulfinate en Cys- SH. La réduction de la Tsal est différée comparativement à celle observée par 2D- PAGE (Figure 4a), ce qui est probablement dû à l'inhibition de la synthèse de protéines. Ces deux expériences montrent que la forme sur-oxydée de Tsal (acide sulfinique) est réductible en thiol libre dans une souche sauvage et que la présence de Srxl est indispensable à cette réduction.
Exemple 3 : Identification d'une protéine de 13 kDa chez S. cerevisiae liée à une Prx par pont disulfure (figure 7). 3.1 Matériel et Méthodes (voir exemple 1) (A) Des cellules contenant une copie étiquetée (HA) de la protéine Srxl sont traitées par 500 μM d'H2O2 pendant 15 minutes. Les protéines sont extraites selon une méthode permettant la conservation de l'état redox intracellulaire des thiols (voir exemple 1) puis séparées sur gel SDS-PAGE en conditions réductrices pour les cellules de la souche sauvage (WT) contenant une copie étiquetée (HA) de la protéine Srxl (piste 1) et en conditions non-réductrices pour les cellules de souche sauvage (WT) (piste 2), la souche mutante Atsal portant une copie étiquetée du gène SRN7 (piste 3), et la souche Asrxl portant une copie étiquetée du gène SRXl ayant subi une mutation C84S (piste 4) ; les poids moléculaires de références (MW) sont exprimés en kDa. (B) la protéine Srxl est purifiée dans les conditions natives grâce à une étiquette 6His, à partir de cellules Atrrl traitées pendant 5 minutes avec 5 mM de
H2O ; les protéines purifiées sont ensuite séparées sur gel SDS-PAGE réducteur ou non-réducteur. L'identification des différentes protéines indiquées a été réalisée par spectrométrie de masse ; les protéines purifiée séparées dans des conditions non- réductrices et réductrices proviennent de la souche mutante Atrrl contenant une copie du gène SRXl (puits n°l et 3), et de la souche mutante Atrrl contenant une copie étiquetée (HA) du gène SRXl (puits n°2 et 4), les poids moléculaires de références (MW) sont exprimés en kDa. 3.2 Résultats La figure 7a met en évidence l'existence d'un pont disulfure inter- moléculaire entre Tsal et Srxl, impliquant la cystéine conservée (Cys84) de Srxl (voir figures 2 et 3). Elle montre en outre que Srxl peut se trouver sous deux formes : un monomère de 13 kDa et un ultimère de 55 kDa lié par pont disulfure (Figure 7a, piste 2). La figure 7b illustre le fait que la copurification des Tsal, Tsa2 et Ahpl montre que Srxl interagit avec trois des cinq peroxyrédoxines existant chez la levure et que l'interaction avec Tsal peut être redox on non covalente. De manière plus précise, le matériau non-réduit purifié contient plusieurs bandes majeures de tailles de 80, 55, 40, 35, 20 et 13 kDa (Figure 7b) qui se limitent à 2 bandes principales de 13 et 20 kDa et une bande mineure de 18 kDa après réduction (dernier puits). La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF appliqué sur le matériau réduit a permis d'identifier les protéines Srxl, Tsal et la protéine Ahpl qui est la seconde 2-Cys Prx majeure de levure, dans les bandes respectivement de 13, 20 et 18 kDa. La Tsa2, qui est une troisième 2-Cys Prx, est aussi présente sous forme de traces dans la bande de 20 kDa. L'analyse par spectrométrie de masse de lysat non-réduit a permis d'identifier à la fois la protéine Tsal et la protéine Srxl dans la bande de 55 kDa, probablement sous forme d'hétérotrimères liés par pont disulfure contenant 2 molécules de Tsal . Cette analyse a permis également de détecter la présence de la protéine Tsal dans les bandes de 40, 35 et 20 kDa, probablement sous forme de dimères et de monomères liés par pont disulfure. L'association des protéines Srxl et Tsal, qui sont liées par pont disulfure, est confirmée par immunodétection au cours de laquelle la bande de 55 kDa contenant la protéine Srxl n'est pas détectée dans les lysats traités par H2O2 provenant de la souche Atsal dépourvue du gène TSAL Ces résultats montrent que la Srxl est fortement induite par H2O2 et s'associe avec la Tsal de façon non-covalente sous forme d'hétéromères liés par pont disulfure. La protéine Srxl s'associe aussi avec 2 autres Prx : Ahpl et Tsa2, mais son association est mineure dans les conditions testées. Exemple 4 : La fonction Srxl est liée à l'activité peroxydase et à Tsal. 4.L Matériel et Méthodes 4.1.1 Matériel La souche sauvage et les deux souches mutantes Atsal et Asrxl sont celles déjà décrites à l'Exemple 1. 4.1.2 Méthodes Les tests de sensibilité des souches sauvage et mutantes au t-BOOH et au H O2 sont effectués comme suit (voir également exemple 1) : - Test de sensibilité au tBOOH ou à l'H2O2 Des cellules sauvages ou invalidées pour le gène SRXl sont déposées sur des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes de peroxyde d'hydrogène (H2O2) ou de t-butyl hydroperoxyde (tBOOH). La croissance des cellules est observée après 48 heures d'incubation à 30°C. - Extraction des protéines tout en préservant leur état redox cellulaire (voir exemple 1). 4.2. Résultats Les Figures 5a et 5b montrent que la souche invalidée pour le gène SRXl présente une hypersensibilité au peroxyde. La figure 6 montre également que la protéine Srxl est nécessaire à la résistance contre le stress au peroxyde. En particulier, cette figure 6 montre que la surexpression de TSA1 corrige totalement le défaut de résistance de la souche Δsrxl montrant que cette sensibilité est due à un défaut d'activité peroxydase. La surexpression de SRXl dans une levure Atsal n'a aucun effet, contrairement à la même surexpression dans une souche sauvage. Ceci montre que la présence de Tsal est indispensable à la fonction de Srxl . La fonction du gène SRXl est liée au gène TSAL La surexpression de TSA1 restaure le défaut de tolérance au H2O2 et au t-BOOH dans la souche Atsal, mais la surexpression du gène SRXl ne provoque aucun effet de ce genre dans la souche Atsal, bien qu'elle augmente légèrement la tolérance de la souche sauvage au t-BOOH. Ces données indiquent que Srxl agit par l'intermédiaire de Tsal, alors que la surexpression de Tsal peut compenser un défaut en protéine Srxl . La substitution en serine de Cys84 (SrxlCys 4S) supprime complètement la fonction de la Srxl dans la tolérance au peroxyde d'hydrogène (Figure 5a) et la formation de pont disulfure Srxl -Tsal, indiquant que cette liaison est essentielle pour la fonction de Srxl et est due à la Cys84. Exemple 5 : L'ATP est nécessaire pour réduire la forme Cys-SO2H de la Tsal. 5.1 Matériel et Méthodes Noir Exemple 1. 5.2 Résultats Afin d'étudier plus en détails la réduction de la forme Cys-SO2H de la Tsal par Srxl, la protéine Srxl recombinante exprimée par baculovirus a été produite. Elle montre que la Srxl purifiée permet la réduction de la forme SO2H de la Tsal purifiée, et que cette réduction se produit seulement en présence d'ATP et de lysats provenant de cellules de type sauvage (Figure 8). Ces données montrent que Srxl catalyse la réduction de la forme sulfinate de la Tsal . En effet, la protéine Srxl permet la réduction de la forme Cys-SO2H de la protéine Tsal présente dans les lysats des cellules ΔSrxl traitées à H O2 selon une manière dose-dépendante, seulement lorsque l'ATP est ajouté (Figure 8a et b). Le GTP et l'AMP-PΝP, qui est un homologue de l'ATP non-hydrolysable, n'a aucun effet sur la catalyse. L'ajout d'EDTA au lysat inhibe la réduction de la Tsal Srxl- dépendante et la réintroduction de Mg++ ou de Mn++ mais pas de Fe++, Ca++, Cu++, ou Zn , restaure la réduction. Finalement, la Srxl purifiée réduit complètement la forme Tsal purifiée et oxydée in vitro en présence d'ATP, de Mg++ ou de Mn'1 et de DTT (Figure 8c), démontrant que la Srxl elle-même catalyse la réduction de la forme Cys- SO2 en la forme Cys-SH. Le couplage d'hydrolyse de l'ATP et le besoin spécifique en Mg+ ou Mn+ suggèrent fortement que la phosphorylation du substrat est réalisée par la Srxl, comme étant une étape dans le processus réducteur de Cys-SO2H, bien qu'un intermédiaire n'ait pas encore été détecté, probablement à cause de la nature hautement instable de celui-ci. La liaison disulfure entre Srxl et Tsal suggère aussi qu'un mécanisme fonctionnant à base de groupe thiol existe comme étant une autre étape dans ce processus. L'activité des mutants Srxl a été testée par la substitution de chacune de ses 3 cystéines. La substitution de la Cys84 (SrxlCys84s), qui est conservée parmi les homologues de la Srxl chez d'autres eukaryotes supprime totalement la formation du pont disulfure entre Srxl et Tsal et la réduction de la forme Cys-SO H de la Tsal, alors que les autres mutants cystéine ne présentent aucun effet pour la SrxlCysl06S ou un effet mineur pour la SrxlCys48S. Ces données indiquent que la liaison Srxl-Tsal provient de Cys84 de la Srxl et qu'elle est essentielle pour la réduction de la Tsa Cys-SO2H médiée par la Srxl . La substitution de la Cys84 en serine supprime aussi le rôle de la Srxl in vivo dans la tolérance au peroxyde d'hydrogène, indiquant de plus que la réduction Srxl -dépendante de la Tsal Cys-SO2H est importante pour que la peroxydase fonctionne. L'acide sulfinique des cystéines dans les protéines ne peut pas être réduit par des réducteurs mono- ou dithiol. Le mécanisme d'action suivant est proposé : La sulfirédoxine catalyse cette réduction selon un processus à multi- étapes en agissant à la fois comme une phosphotransférase spécifique et comme une thioltransférase (Figure 8). La réduction de l'acide sulfinique de la cystéine nécessite vraisemblablement son activation initiale, qui peut être réalisée par formation d'un ester sulfinique phosphorylé, comme le besoin en ATP et en Mg44" l'indique. Cette modification permet l'attaque du résidu sulfure par la cystéine au site activé de la Srxl, puis la formation temporaire d'un thiolsufinate intermoléculaire entre Srxl et Tsal. Le thiolsulfînate existe au cours du stress oxy datif et est accessible à la réduction thiol-dépendante. Ainsi, une fois formé, le thiolsulfînate entre Srxl et Tsal est converti en deux Cys-SH par des échanges thiol-rédox successifs impliquant initialement le clivage réducteur du pont thiolsulfînate en un sulfénate et en un pont disulfure grâce aux électrons fournis par le DTT in vitro et probablement par la thiorédoxine in vivo.
Exemple 6 : Identification de la sulfirédoxine humaine (hSrxl) et mise en évidence de son activité catalytique. 6.1. Matériel et méthodes Le gène hSrx (SEQ ID NO :4) a été clone par PCR à partir d' ADNc préparés par rétrotranscription à partir de cellules d'une lignée humaine tumorale MCF-7, en utilisant les oligonucléotides :
TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID NO :14) La séquence codante hSrxl a été clonée dans le vecteur pFastBacl
(Invitrogen) puis exprimée dans des cellules d'insecte High Five (voir exemple 1, point 1.4). Le lysat des cellules High Five surexprimant hSrxl a été utilisé in vitro pour tester son activité de réduction des peroxyrédoxines humaines Prxl et Prx2 suroxydées dans la forme acide sulfinique (Figure 9). 6HIS-Prxl et 6HIS-Prx2 ont été exprimés, purifiés et suroxydés selon la même méthode que la Tsal de chez S. cerevisiae. Le protocole et la méthode sont identiques à ceux de l'exemple 1 (points 13 et 1.4). 6.2. Résultats La figure 9 illustre les résultats obtenus et montre la capacité de la hSrxl, exprimée à partir du Baculovirus dans les cellules High Five, à réduire les peroxyrédoxines humaines 6His-Prxl et 6His-Prx2 suroxydées dans la forme cystéine acide sulfinique.. Cette réduction nécessite la présence des cofacteurs ATP (1 mM) et
Mg++ (1 mM) et le dithiotreitol (2 mM). Les extraits de Baculovirus expriment soit hSrxl (h Srx), soit la protéine Taul38 (control). La méthode et le protocole de cette expérience sont identiques à ceux précisés à l'exemple 5. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Utilisation d'une protéine dénommée sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec
X= G ou S, pour catalyser la réduction des peroxyrédoxines (Prxs) sous leur forme super-oxydée Prx-Cysp-SO2H (peroxyrédoxine cystéine acide sulfinique) en dérivé thiol (SH). 2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite sulfirédoxine est une sulfirédoxine de microorganisme, de plante ou d'organisme supérieur, qui comprend généralement entre 80 et 170 acides aminés et au moins le site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S ainsi que les pourcentages d'identité et de similarité suivants : . levure/homme : 31 % d'identité et 67 % de similarité . levure/plantes : 23 % d'identité et 39 % de similarité . levure/souris : 31 % d'identité et 51 % de similarité . levure/champignons : 80 % d'identité et 90 % de similarité. 3°) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que ladite sulfirédoxine est notamment sélectionnée parmi les protéines dont les séquences correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 1 à 10. 4°) Peptide isolé, correspondant au site catalytique de la Srx, telle que définie aux revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence suivante : FXGCHR, avec X= S. 5°) Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une protéine définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1-3 et 5-10 et éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. 6°) Utilisation d'une protéine telle que définie aux revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament antioxydant destiné à traiter les cancers, les troubles neurodégénératifs et les maladies neuromusculaires, dans lesquels l'on observe une défaillance du système antioxydant Prx/Srx. 7°) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer l'implication du système antioxydant Prx Srx : (1) la mise en contact in vitro des cellules d'un échantillon biologique avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2) (2) la détection de la Prx-Cysp-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), et (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1). 8°) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillisse- ment, aux maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend le génotypage de la sulfirédoxine, à partir de l'ARN total d'un échantillon biologique convenable, notamment des cellules sanguines, conformément aux étapes suivantes : (1) l'extraction de l'ARN total, à partir dudit échantillon biologique, (2) la préparation d'ADNc spécifique de la sulfirédoxine, par amplification de l'ARN à l'aide des deux amorces suivantes : GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), ces séquences étant situées respectivement en amont et en aval de l'ORF de la sulfi- rédoxine humaine (GenBank n° AAH47707), (3) l'établissement de sa séquence nucléotidique et (4) la comparaison par rapport à une séquence d'ADN codant pour une protéine Srx, telle que définie ci-dessus, issue de la même espèce que celle de l'échantillon biologique à analyser. 9°) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la quantification relative, par tout moyen approprié, de l' ARNm codant pour la sulféridoxine humaine à partir des ADNc totaux préparés à partir d'un échantillon biologique humain, par comparaison avec un échan- tillon de référence. 10°) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite quantification comprend : (al) la préparation d'ADNc à partir de l'ARN total par transcription inverse avec des amorces appropriées et notamment des amorces aléatoires hexa- nucléotidiques ; (a2) l'amplification dudit ADNc en présence de la paire d'amorces : GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), en présence d'un reporter fluorescent et de façon simultanée ou séquentielle, (a3) la détection de la quantité de l'amplimère (ou amplicon) par mesure du signal fluorescent. 11°) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le reporter fluorescent est sélectionné dans le groupe constitué par des agents se liant à l'ADN double-brin et des sondes fluorescentes. 12°) Procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, carac- térisé en ce que lorsque ledit reporter fluorescent est une sonde, il est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les sondes définies par les séquences suivantes :
TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID NO :14). 13°) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend : - l' immunodétection de la protéine Srx dans un échantillon biologique à tester, à l'aide d'un anticorps obtenu par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx ou le peptide FXGCHR, avec X=G ou S, après séparation des protéines totales par électrophorèse, puis - l'évaluation de la qualité et de la quantité de ladite protéine Srx par rapport à une protéine Srx contrôle. 14°) Utilisation de la séquence codant pour une protéine Srx, telle que définie aux revendications 1 à 3, pour l'obtention de plantes dont les capacités de résistance au stress sont significativement augmentées. 15°) Cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant contenant une séquence codant pour une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO J-3, 5, 6 et 8-10. 16°) Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de S. cerevisiae modifiée par un vecteur surexprimant le gène SRXl . 17°) Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une cellule de mammifère modifiée par un vecteur surexprimant le gène hSr l . 18°) Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que ledit vecteur est avantageusement un vecteur navette E. colilS. cerevisiae comprenant au niveau d'un site de clonage EcoRI, la séquence codant pour la protéine Srx et le promoteur du gène Srx. 19°) Procédé de criblage de médicaments aptes à moduler l'activité du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des cellules hôtes selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, en présence de peroxyde d'hydrogène (2) la détection de la Prx-Cysp-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1). 20°) Procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en contact de la substance à tester avec un extrait de cellules hôtes selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 ou un échantillon biologique d'un animal transgénique non humain, notamment des souris, sélectionné dans le groupe constitué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est surexprimé, en présence de peroxyde d'hydrogène, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité antioxydante du système Prx/Srx du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables de stimuler ou d'inhiber ladite activité. 21°) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la mesure de ladite activité est notamment effectuée par la détection de la Prx-Cysp- SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a) et l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cysp-SO2H et de Prx-Cysp-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a). 22°) Procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend : (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des mammifères transgéniques non-humains, notamment des souris, sélectionné dans le groupe consti- tué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de protéine Srx est surexprimé, et (2) la mesure de la survie de l'animal. 23°) Anticorps anti-Srx, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1-3, 5, 6 et 8-10 ou le peptide FXGCHR, avec X = S selon la revendication 4. 24°) Procédé de réduction d'un produit comprenant au moins deux cystéines à activité redox, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite protéine avec une sulfirédoxine (Srx), telle que définie aux reven- dications 1 à 3, qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant :
FXGCHR, avec X= G ou S, en présence d'ATP et de magnésium. 25°) Procédé de synthèse d'un produit comprenant des résidus Cys- SH à partir de produits comportant des résidus Cys-SO2H, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réduction du produit comportant les résidus Cys-SO2H en produit comprenant des résidus Cys-SH, en présence d'une sulfirédoxine telle que définie aux revendications 1 à 3, d'ATP et de magnésium.
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