CA2531235A1 - Applications d'une nouvelle classe d'enzymes : les sulfiredoxines. - Google Patents

Abstract

Applications d'une nouvelle classe d'enzymes, les sulfirédoxines (Srx), qui catalyse la réduction des dérivés Cys-SO2#191H (cystéine-acide sulfinique) e t notamment la réduction de la peroxyrédoxine (Prx) sous sa forme Cys-SO 2#191 H en dérivé thiol.

Description

APPLICATIONS D'UNE NOUVELLE CLASSE D'ENZYMES : LES
SULFIREDOXINES
La présente invention est relative aux applications d'une nouvelle classe d'enzymes, les sulfirédoxines (Srx), qui catalyse la rëduction des dérivés Cys-S02H (eystéine-acide sulfinique) et notamment la réduction de la peroxyrédoxine (Prx) sous sa forme Cys-S02H en dérivé thiol.
Dans les protéines, certains groupes thiols de cystéine (Cys-SH), ayant une activité rédox, peuvent être oxydés par du peroxyde d'hydrogène (H2O2) en acide sulfénique (Cys-SOH). Celui-ci étant instable, réagit soit avec n'importe quel groupe thiol proche pour former un pont Bisulfure (C-S-S-C), soit, en l'absence de groupe thiol proche accessible, le composé Cys-SOH peut être davantage oxydé
en acide sulfurique (Cys-SOZH) stable ou acide cystéique (Cys-SO3H).
Les peroxyrédoxines (Prxs) sont des enzymes antioxydantes comportant de telles cystéines à activité redox. Par exemple, les 2-Cys Prxs sont des homodimères inversés avec 2 eystéines à activité rédox par sous-unité. Elles eata-lysent la réduction du peroxyde d'hydrogène.
Le site catalytique de ces enzymes comprend deux cystéines à acti-vité redox (cystéine N-terminale peroxydatique (CysP) et cystéine C-terminale de résolution (CysR)).
De manière plus précise le cycle catalytique de ces peroxyrédoxines comprend (Wood ZA et al., Science, 2003, 300, 650-653 ; Wood et al., Trends in Biochemical Sciences, 2003, 2~, l, 32-40) - l'oxydation de la CysP-SH en CysP-SOH (acide sulfénique) par H202;
- la formation d'un pont Bisulfure entre la CysP et la CysR de la deuxième sous-unité de Prx (CysP-S-S-CysR) (processus lent) ;
- la réduction de ce pont Bisulfure par des réducteurs cellulaires classiques tels que le glutathion ou la thiorédoxine (Trx), pour obtenir le produit de départ Cys-SH.
Dans certains cas, les Prxs peuvent être inactivées, par super-oxyda-tion de la ÇysP-SOH en acide sulfinique (CysP-SOaH) ; cette réaction de super-oxyda-tion était considérée jusqu'à présent comme irréversible, (Wood ZA et al., Science,

2 2003, 300, 650-653). Récemment (Woo HA et al., Science, 2003, 300, 653-656 ;
Georgiou G. et al., Science, 2003, 300, 592-594), la réversion de la Cys-acide sulfinique en composé Cys-SH a été montré in vivo dans le cas de la peroxyrëdoxine à
deux cystéines (2-Cys Prx) de mammifère, indiquant l'existence d'une réductase spécifique, qui n'a cependant pas été identifiée. Plus précisément, ces auteurs ont montré que, par marquage métabolique de cellules de mammifères avec du 355, la forme sufinique de la peroxidine I, produite lors de l'exposition des cellules au H202, est rapidement réduite en forme thiol catalytiquement active. Ces auteurs pensent que la réduction de l'acide sulfinique observée lors de ces études nécessite l'intervention d'enzymes spécifiques, qui n'ont pas été identifiées. Etant donné que les Prxs de mammifères régulent la signalisation médiée par H20a, leur inactivation réversible pourrait servir dans le processus de régulation.
Les peroxyrédoxines (Chae et al., P.N.A.S., 1994, 91, 7022-7026) sont des antioxydants ubiquitaires, qui contr~lent, dans de nombreuses espèces (microorganismes, plantes et organismes supérieurs y compris les mammifères), les taux de H202, qui régulent les cascades de signalisation conduisant à une prolifération cellulaire, une différentiation et une apoptose (Fujü J. et al., Redox Rep., 2002, 7, 123-130).
Les Inventeurs ont maintenant identifié la famille d'enzymes qui réduisent les Prxs CysP-SOZH. Il s'agit d'une protéine qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S et qui a un poids moléculaire d'environ 8 à 14 kDa.
Cette enzyme est conservée chez les eucaryotes et est dénommée ci-après sulfirédoxine (Srx). Chez la levure et en particulier chez Saccharomyces cerevisiae, cette enzyme est dénommée Srxl et a un poids moléculaire de 13 kDa.
Chez l'homme, cette enzyme est dénommée hSrxl et a un poids moléculaire de 13,6 kDa.
Des séquences polypeptidiques identiques à celles de la suIfi-rédoxine ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes figurent dans la base de données de séquences NCBI ou GenBank, sous les numéros d'accës suivants :
S.
cerevisiae : YKL086W, Honzo sapiens : AAH47707, CAC28314, M. musculus BAB24939, AAH11325, Arabielopsis thaliana : AAD21682, AA042977, ~ryza

3 sativa : BAA95812, Schizosacchat~omyces ponabe : SPBC106.02c, TheYmosyne-claococcus. elongatus : BAC07716, Dy~osophila melanogaster~ : AAF48773, Nostoc sp.
(PCC7120) : NP 488186.
En revanche, aucune fonction n' a été attribuée à ces séquences poly-peptidiques, dans la base de données de séquences NCBI ou GenBank.
Les Inventeurs ont maintenant trouvé un point commun entre ces différentes protéines : le site catalytique précité et une fonction : la catalyse de la réduction des Prxs CysP-S02H.
La réaction catalysée par la sulfirédoxine (Srx) est résumée à la figure 1.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une protéine dénommée sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S, pour catalyser la réduction des peroxyrédoxines (Prxs) sous leur forme super-oxydée Prx-CysP-S02H (peroxy-rédoxine cystéine acide sulfinique) en dérivé thiol (SH).
La sulfirédoxine joue donc un rôle très important dans la fonction antioxydante des peroxyrédoxines et est impliquée dans la réparation ou le contrôle des protéines modifiées par la formation d'une cystéine-acide sulfinique.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite sulfirédoxine est une sulfirédoxine de microorganisme, de plante ou d'organisme supérieur, qui comprend génëralement entre 80 et 170 acides aminés et au moins le site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S. Elles présen-tent entre elles les pourcentages d'identité et de similarité suivants levurelhomme : 31 % d'identité et 67 % de similarité
. levure/plantes : 23 % d'identité et 39 % de similarité
levure/s0uris : 31 % d'identité et 51 % de similarité
levure/champignons : 80 % d'identité et 90 % de similarité.
Conformément à l'invention, l'identité d'une séquence par rapport à
une séquence de référence (SEQ ID NO :l correspondant à la séquence de la Srxl de S. cer~evisiae) s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les séquences correspondant à la région catalytique telle que

4 définie ci-dessus sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec la séquence de référence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente invention comme une protéine qui peut inclure jusqu'à 100-X
altérations pour 100 acides aminés de la séquence SEQ ID NO: 1. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique.
La similarité d'une séquence par rapport à la séquence de référence SEQ ID NO: 1 s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives, lorsque les séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles. Au sens de la présente invention, on entend par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques simi-laires (taille, charge ou polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 1 est définie, dans la présente inven-tion comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à 100-X
altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Au sens de la présente invention, le terme altérations non-conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence SEQ ID NO: 1.
Ladite sulfirédoxine est notamment sélectionnée parmi les protéines dont les séquences correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 1 à
10, illustrées aux figures 2 et 3 ou représentées dans la liste de sëquences : S.
eerevisiae SEQ ID NO :1 ; C. albicaTis : SEQ ID NO :2 ; S. pombe : SEQ ID NO :3 ; H.
sapiens SEQ ID NO :4 ; M. rnusculus : SEQ ID NO :5 ; D. melanogaster : SEQ ID NO :6 ;
A.
thaliana : SEQ ID NO :7 ; T. elougatus : SEQ ID NO :~ ; Nostoc sp. : SEQ ID NO
:9 et Or~yza sativa : SEQ ID NO :10.

La présente invention a également pour objet un peptide isolé, correspondant au site catalytique de la Srx, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence suivante : FXGCHR, avec X = S.
La présente invention a également pour objet des anticorps anti-Srx,

5 caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO :l-3, 5-6 et 8-10 ou Ie peptide FXGCHR, avec X = S.
Lesdits anticorps sont soit des anticorps polyclonaux, soit des anti-corps monoclonaux.
Lâ présente invention a également pour objet un médicament, carac-térisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une protéine définie par une séquence sélectionnée dans Ie groupe constitué par Ies SEQ ID NO-1-3 et 5-10 et éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une protéine telle que définie ci-dessus pour la préparation d'un médicament antioxydant destiné à
traiter les cancers, les troubles neurodégénératifs et les maladies neuromusculaires, dans lesquels l'on observe une défaillance du système antioxydant Prx/Srx.
La présente invention a également pour objet un procédé de dépis-tage de maladies liées au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer l'implication du système antioxydant Prx/Srx (1) Ia mise en contact ih vitro des cellules d'un échantillon biolo-gigue avec du peroxyde d'hydrogène (H202), (2) la détection de la Prx-CysP-S02H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), et (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-CysP-SO2H et de Prx-CysP-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1).
L'échantillon biologique est notamment constitué de cellules sanguines.
Des rapports Prx-CysP-SOzH/ Prx-CysP-SH > 1 sont le signe d'une pathologie du système antioxydant Prx/Srx , liée à un dysfonctionnement de la Srx.

6 Ainsi, un tel procédé permet d'évaluer si le système antioxydant Prx/Srx fonctionne normalement au non. La connaissance des mécanismes impliqués dans l'étiologie de la maladie permet de sélectionner le traitement le plus adapté à la situation, notamment dans les cas de systèmes antioxydants Prx/Srx défaillants.
En variantes, ledit procédé de dépistage comprend A. le ~énotypa~e de la sulfirédoxine, à partir de l'ARN total d'un échantillon biologique convenable, notamment des cellules sanguines.
De manière plus précise, ledit procédé comprend (1) l'extraction de l'ARN total, à partir d'un échantillon biologique convenable, (2) la préparation d'ADNc spécifique de la sulfirédoxine, par ampli-fication de l'ARN à l'aide des deux amorces suivantes GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), ces séquences étant situées respectivement en amont et en aval de l' ORF de la sulfi-rédoxine humaine (GenBank n° AAH47707), (3) l'établissement de sa séquence nucléotidique et (4) la comparaison par rapport à une séquence d'ADN codant pour une protéine Srx, telle que définie ci-dessus, issue de la même espèce que celle de l'échantillon biologique à analyser.
B. la quantification relative, par tout moyen approprié, de l'ARNm codant pour la sulféridoxine humaine (hSrxl) à partir des ADNc totaux préparés à
partir d'un échantillon biologique humain, par comparaison avec un échantillon de référence.
L'ëchantillon de référence est en particulier un échantillon obtenu à
partir d'un sujet témoin sain.
Conformément à l'invention, préalablement à ladite quantification, ledit procédé comprend une étape d'extraction des ARN totaux.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ladite quantification comprend

7 PCT/FR2004/001727 (al) la préparation d'ADNc à partir de l'ARN total par transcription inverse avec des amorces appropriées et notamment des amorces aléatoires hexa-nucléotidiques ;
(a2) l'amplification dudit ADNc en présence de la paire d'amorces GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), en présence d'un reporter fluorescent et de façon ~simultanëe ou séquentielle, (a3) la détection de la quantité de I'amplimère (ou amplicon) par mesure du signal fluorescent.
L'amplification de l'ARNm~ est effectuée par RT-PCR ; les étapes de transcription inverse et d'amplification PCR sont, soit dissociées et dans ce cas la quantification est réalisée par PCR-quantitative, soit elles sont couplées et dans ce cas la quantification est réalisée par RT-PCR quantitative.
De préférence, ladite quantification est réalisée à l'aide d'un étalon interne comme par exemple, la sous-unité 18S d'ARN ribosomal.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le reporter fluorescent est sélectionné dans le groupe constitué par des agents se liant à l'ADN double-brin et des sondes fluorescentes.
De préférence, ladite quantification est réalisée en temps réel, c'est-à-dire que la détection et la quantification du signal fluorescent émis sont effectuées pendant le processus d'amplification, dans la mesure où l'augmentation du signal est directement proportionnelle à la quantité d'amplimères produits durant Ia réaction.
Les principes généraux de la PCR et de la RT-PCR quantitatives en temps réel, ainsi que les différentes techniques de détection quantitative des ampli-mères : à l'aide d'agents se liant à l'ADN double-brin (agents intercalants :
bromure d'éthidium, SYBR Green I, YO-PRO-1 ; agents se fixant au sillon mineur :
Hoechst 33258) ou à l'aide de sondes fluorescentes, à savoir : hydrolyse de sondes par l'activité 5' nucléase de l'ADN polymérase (TaqManTM), hybridation de 2 sondes (Hybprobes), balises moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers), sont connues de l'Homme du métier et sont notamment décrites dans Poitras et al., Reviews in Biology and Biotechnology, 2002, 2, 1-11. La PCR et

8 la RT-PCR quantitative en temps réel à l'aide de sondes du type TaqManTM sont notamment décrites, respectivement dans Heid C. et al. (Genome Research, 1996, 6, 986-994) et Gibson U. et al. (Genome Research, 1996, 6, 995-1001).
Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, lorsque ledit reporter fluorescent est une sonde, il est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les sondes définies par les séquences suivantes TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID
NO :14).
L'extraction de l'ARN, la préparation de l'ADNc et l'établissement de la séquence sont réalisées en utilisant les techniques classiques, selon les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Fredef°ick M. A USUBEL, 2000, Wiley ahd son Ihc, Libf~ary of Cong~ess, USA).
La présente invention a également pour objet un procédé de dépistage de maladies liëes au cancer, au vieillissement, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend - l'immunodétection de la protéine Srx dans un échantillon biologique à tester, à l'aide d'un anticorps obtenu par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx ou le peptide FXGCHR, avec X=G ou S, après séparation des protéines totales par électrophorèse, puis - l'évaluation de la qualité et de la quantité de ladite protéine Srx par rapport à une protéine Srx contrôle.
Ladite détection-quantification est avantageusement réalisée par la méthode du Western blot.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de la séquence codant pour une protéine Srx, telle que défnie ci-dessus ou d'un vecteur contenant ladite séquence codante, pour l'obtention de plantes dont les capacités de résistance au stress (sécheresse, froid, chaleur toxiques oxydants présents dans l'environnement) sont significativement augmentées.
Les séquences codant pour la protéine Srx peuvent être aisément obtenues à partir des bases de données de séquences précitées.

9 La présente invention a également pour objet des cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant contenant une séquence codant pour une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les SEQ ID NO :1-3, 5-6 et 8-10.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte, elle est constituée par une souche de S. cerevisiae surexprimant le gène SR~YI.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte, elle est constituëe par une cellule de mammifère modifiée par un vecteur surexprimant le géne hSrxl .
Le vecteur est avantageusement un vecteur navette E. colilS. cerevi-.riae comprenant au niveau d'un site de clonage, la séquence codant pour la protéine Srx et le promoteur du gène Srx. Il s'agit notamment du plasmide pRS316 (n°ATCC
77145).
Le promoteur du gène Srx est 400 paires de bases en amont du site d'initiation de la traduction ; il est repérable sur le site http://www.yeastgenome.or:g/
(n° d'accès YKL086V~.
Ces cellules hôtes transformées par un tel vecteur sont particulière-ment intéressantes pour l'étude du système antioxydant Prx/Srx et le criblage in vitro de médicaments modulant l'activité du système antioxydant Prx/Srx.
En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments aptes à moduler l'activité du systéme antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des cellules hôtes selon l'invention, en présence de peroxyde d'hydrogène, (2) la détection de la Prx-CysP-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-CysP-SOaH et de Prx-CysP-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1).
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend a) la mise en contact de la substance à tester avec un extrait de cellules hôtes modifiées telles que définies ci-dessus ou un échantillon biologique d'un animal transgénique non humain, notamment des souris, sëlectionné dans le groupe constitué par des animaux dans lesquels le gène de la protëine Srx est invalidé et des 5 animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx, est surexprimé en présence de peroxyde d'hydrogène, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité antioxydante du système PrxlSrx du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables de stimuler ou d'inhiber ladite

10 activité.
La mesure de ladite activité est notamment effectuée par la détection de la Prx-CysP-S02H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a) et l'ëtablissement du rapport des quantités de Prx-CysP-SOZH
et de Prx-CysP-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a).
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend (1) la mise en contact de la substance à cribler avec des mammifères transgéniques non-humains, notamment des souris, sélectionné dans le groupe consti-tué par des animaux dans lesquels le gëne de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est surexprimé, et (2) la mesure de la survie de l'animal.
L'obtention de mammifères transgéniques non-humains est réalisée en utilisant des méthodes classiques et notamment selon les protocoles décrits dans Transgenic animals generation and use (C.M. Houdebine Ed., Harwood academic publishers, Amsterdam).
La présente invention a également pour objet un procédé de réduc-tion d'un produit comprenant au moins deux cystéines à activité redox, lequel procédé
est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite protéine avec une sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S, en présence d'ATP et de magnésium.

11 La réduction du produit comprenant au moins deux cystéines à acti-vité redox implique son activation par phosphorylation suivie d'une réduction du soufre, ces deux activités étant catalysées par la sulfirédoxine.
La présente invention a également pour objet un procédé de synthèse d'un produit comprenant des résidus Cys-SH à partir de produits comportant des rësi dus Cys-S02H, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réduction du produit comportant les résidus Cys-S02H en produit comprenant des résidus Cys-SH, en présence d'une sulfirédoxine, d'ATP et de magnésium.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 illustre la réaction catalysée par Srxl .
- les figures 2 et 3 représentent la comparaison des séquences de Srxl dans différentes espèces ; figure 2 : S cerevisiae, C. albicarrs, S
porrZbe, H.
sapier~s, M. nausculus, D. melanogaster et A. tlzaliaha ; les régions identiques sont encadrées ; le site catalytique se trouve autour de la cystéine conservée, indiquée par un astérisque ; figure 3 : S cerevisiae, H. sapie~zs, M. rnusculus, D.
melafzogaster, A.thaliaha, T. elorZgatus et Nostoc sp.. Les n° d'accès GenBank sont indiqués sur cette figure. L'alignement des séquences a été réalisé à l'aide du logiciel CLUSTALW. Les acides aminës identiques dans environ 65 % des séquences sont encadrés. Le site actif Srxl comprenant une cystéine (flëche noire) et les autres cystéines (flèche blanche) sont indiqués.
- la figure 4 illustre Ie recyclage de la forme cystéine-acide suIfinique de la Tsal, dépendant de la Srxl ; figures 4a et 4b : analyse PAGE
2D des formes réduite (SH) et oxydée (S02H) de la Tsal marquée à la 35S-Met dans des cellules sauvages et des cellules dsrxl exposées au Hz02 (500 ~M) pendant la période indiquée ; les figures 4c et 4d correspondent à des Western blot de formes réduite (2xAMS) et oxydée (lxAMS) de Tsal à partir de cellules WT (c) ou de cellules dsr~xl (d) traitées au H202 aprës alkylation i~c vitro avec de l'AMS. Après induction de l'expression de Srxl pendant 15 min avec de l'H202 (100 ~.M), les cellules sont

12 traitées avec de la cycloheximide (CHX) 5 min avant le traitement à l' HZO2 (500 ~M).
- la figure 5 illustre le rôle joué par la protéine Srxl dans la résis-tance des cellules au stress induit par du peroxyde d'hydrogène ; des tests de sensibi-lité sont réalisés en faisant croître une souche sauvage (WT) et une cellule invalidée (dsfxl ) ou une souche mutante srx 1 o84s dans des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes (en mM) de peroxyde d'hydrogène (HZOa) (figure Sa et Sb) : figure Sa : résistance à H202 de la souche sauvage (WT), de la souche invalidée (d srxl ) et de la souche mutante srxl CBas ; figure Sb : Western blot (incrustation) et QT-RT PCR de la protéine Srxl étiquetée à HA et de l'ARNm dans des cellules traitées au peroxyde d'hydrogène (400 ~.M).
- la figure 6 illustre le rôle joué par la protéine Srxl dans la résis-tance des cellules au stress induit par du t-butyl hydroperoxyde ; des tests de sensibi-lité sont réalisés en faisant croître une souche sauvage (WT), une cellule invalidée (dsfxl), une souche sauvage surexprimant Tsal ou Srxl, une cellule invalidée (dsr~xl) exprimant Tsal, une cellule invalidée (dtsal) et une cellule invalidée (dtsal) surexprimant Srxl dans des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes de t-butyl hydroperoxyde (tBOOH) ; les concentrations sont exprimées en mM.
- la figure 7 illustre l'interaction entre Tsal et Srxl de façon covalente (pont disulfure) et non-covalente ; Figure 7a : Western blot de la protéine Srxl étiquetée HA (pistes l, 2 et 3) ou de la Srxlo84s étiquetée HA (piste 4) exprimées dans une souche sauvage (WT) (pistes l, 2, 4) ou dans des cellules dtsal (piste 3) traitées 15 min avec H2O2 (500 ~M) après une électrophorèse SDS-PAGE réalisée en conditions réductrices (R) (piste 2) ou non réductrices (NR) (pistes 1, 3, 4) ; figure 7b : les protéines co-purifiées avec la Srxl étiquetée avec la 6His (pistes 2,4) ou la Srxl non étiquetée (pistes l, 3) dans des conditions non-réductrices, sont séparées par SDS-PAGE dans des conditions non-réductrices (pistes 1, 2) ou réductrices (pistes 3, 4) et visualisées par coloration au bleu de Coomassie. Les bandes de protéines sont identifiées par spectrométrie de masses MALDI-TOF comme indiqué.
- la figure 8 montre que la protéine Srxl et I'ATP sont nécessaires à
Ia réduction de la Tsal oxydée in vitro par Srxl ; figures 8 a et b : Analyse en Western blot des formes réduite (SH) et super-oxydée (SOZH) de la Myc-Tsal dans des lysats

13 de cellules dual incubées 15 min à 30°C avec de la Srxl purifiée et de l'ATP, aux concentrations indiquées ; figure 8c : Analyse en Western blot des formes réduite (SH) et super-oxydée (S02H) de la 6His-Tsal incubée pendant 15 min à
30°C avec de la Srxl purifiée, de l'ATP (1 mM) et du Mg++ (1 mM), comme indiqué.
- la figure 9 ïllustre le rôle de la hSrxl dans la réduction des 6His-Prxl et 6His-Prx2 dans leurs formes superoxydées.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Matériel et Méthodes.
l.l. Souches Les souches de S. cerevisiae utilisées sont la souche YPH98 (Sikorski R. et al., Genetics, 1989, 122, 19-27) (MATa, ura3-52, lys2-801 ~"'bre, ade2-1 O 1 °°'e trp 1-O1 leu2-~ 1 ) et ses dérivés isogéniques. Les souches ~srxl , ~trrl et ~tsal sont réalisées en remplaçant la région codante de SRX1 (sulfirédoxine) et de TRRl (thiorédoxine réductase) par I~ANMX4 et le cadre ouvert de lecture TSA1 par (tyrosinase-relateel pr~otei~ 1).
Les souches surexprimant Tsal et Srxl sont identiques aux précé-dentes, sauf qu'elles portent chacune une délétion du gëne Tsal ou Srxl et portent le plasmide à copies multiples psRS426 (n°ATCC 77107) ;
Les cellules sont cultivées à 30°C dans un milieu YPI) (extrait de levure à 1 %, bactopeptone à 2 % et glucose à 2 %) ou un milieu CASA (base azotée de levure à 0,67 %, casaminoacides à 0,1 %, glucose à 2 %), complémenté en adénine, tryptophane et uracile.
1.2. Plasmides Les protéines de fusion suivantes - Srxl-HA : protéine de fusion comprenant la fusion de deux épi-topes HA en C-terminal de Srxl et - 6His-Srxl : protëine de fusion entre Srxl et à son extrémité N-terminale six étiquettes histidine, sont construites par PCR en deux étapes : les amorces nucléo-tidiques utilisées pour la PCR incorporent la séquence de l'un ou l'autre des épitopes

14 HA (défini par l'anticorps commercial reconnaissant l'épitoge HA 12CA5, Babco, MMS-101 R) et 6His (6 histidines) et amplifient la séquence codante complète de Srxl, flanquée par 400 et 200 paires de bases en amont et en aval de leur séquence et cloné au site EcoRI du plasmide pRS316 (n°ATCC77145) ou du plasmide pRS426 (n°ATCC 77107).
Myc-Tsal, une protéine de fusion comprenant à l'extrémité N-terminale de Tsal, un épitoge Myc (défini par l'anticorps anti-Myc, 9E10, Babco, MMS-150R) est construite et clonée de manière similaire au site EcoRI du plasmide pRS316. La mutagénèse dirigée pour la génération des mutants Cys>Ser est réalisée par un protocole standard d'amplification par PCR à l'aide d'oligonucléotides amorces comportant la séquence modifiée.
1.3. Analyse des protéines * Pour l'analyse en PAGE 2D, les cultures cellulaires en début de phase exponentielle (D06oo°m 0,3) sont marquées avec de la 35S-Met (100 ~Ci) 20 min à 30°C, suivie d'une chasse de la méthionine marquée par de la méthionine froide (1 mM final) et de la cystéine (0,1 mM final) et traitées avec de l'H202 (500 ~M). Les cellules sont soumises à une analyse PAGE 2D comme décrit dans Maillet et al.
(J.
Biol. Chem., 1996, 271, 10263-10270).
* Pour l'analyse de l'état redox in vivo de Srxl-HA, des lysats de cultures de cellules en début de phase exponentielle de culture (D06oo°m 0,3) sont préparés par le protocole de lyse à l'acide trichloroacétique (Delaunay et al., EMBO
J., 2000, 19, 5157-5166). Les protéines précipitées sont solubilisées dans un tampon A [Tris-Cl, pH 8 (100 mM), SDS (1 %), EDTA (1 mM)] contenant du N-éthylmaléimide (NEM) (50 mM).
Les extraits sont séparés par SDS-PAGE à 17 % dans des conditions réductrices et non réductrices et la Srxl-HA est détectée par l'anticorps monoclonal 12CA5 précité.
* Pour la dérivatisation de la cvstéine de Myc-Tsal nar AMS, les extraits cellulaires sont traités dans les mêmes conditions que celles du protocole de lyse TCA, sauf que les protéines précipitées sont d'abord solubilisées dans le tampon A contenant du DTT (50 mM) pendant 1 h à 37°C, précipitée par le TCA
mises en suspension dans un tampon A contenant de l'AMS (15 mM) pendant 2 h à
37°C. Les extraits cellulaires sont séparés par SDS-PAGE à 20 % dans des conditions réductrices et Myc-Tsal est immunodétecté avec l'anticorps monoclonal anti-Myc 9E10, précité.
* Pour la réduction ih vitf~o, soit 3 ~l de lysat (2 mg/ml) de cellules ~srxl traitées â l'H202 comprenant de la Myc-Tsal oxydée, soit de la 6His-Tsal oxy-5 dée et purifiée (0,5 mg) sont ajoutés dans le tampon de réaction (RM) (80 ~l final) [Tris-CI pH 6,8 (50 mM), KCI (100 mM)] contenant de la Srxl purifiée exprimée par un baculovirus, de l'ATP et du MgCl2 aux concentrations indiquées et incubés

15 min à 30°C. La 6His-Tsal est oxydée en cystéine-acide sulfinique par incubation dans le tampon RM contenant du DTT (10 mM) et de l'H202 (1 mM) pendant 30 min et 10 diluée 16 fois de le milieu réactionnel.
1.4. Purification des protéines recombinantes . La Srxl et la hSrxl sont exprimées dans des cellules d'insecte High Five en utilisant le système d'expression en baculovirus Bac-To-Baç
(Invitrogen) et purifiées successivement par chromatographe d'échanges d'ion, l5 chromatographie d'affinité et HPLC (8m1-Poros~ SOHS, 8ml-PorosR SOHE, 0,8m1-Poros 20HS) (Applied Biosystems).
. La 6His-Tsal est exprimée dans des cellules E. soli BL21 à partir du plasmide pET28a-Tsal après induction à l'isopropyl-thio-(3-D-galactopyranoside, conformément aux recommandations du fabricant (Stratagène). Les cellules sont mises en suspension dans un tampon de lyse [Tris-Cl pH 6,8 (50 mM), KCl (100 mM), DTT (2 mM), imidazole (20 mM)], supplémenté en fluorure de phénylméthane-sulfonyle (PMSF) (1 mM), lysées par des cycles congélation-décongélation et sonica-tion. Les extraits sont centrifugés 30 min à 30.000 g et le surnageant est passé dans une colonne d'agarose Ni-NTA (Qiagen). Après lavage de la colonne avec le tampon de lyse, la Tsal est éluée par du tampon de lyse suppIémenté en imidazole (150 mM).
La pureté et la concentration des protéines purifiées est déterminée par coloration au bleu de Coomassie après SDS-PAGE et test Bradford (Biorad).
1.5. Purification des partenaires de réaction de la Srx 1 La 6His-Srxl et la Srxl sont exprimées à partir du plasmide pRS426 dans la souche ~trrl, dépourvue du gène de la thiorédoxine réductase qui stabilise les ponts disulfures. Les cellules sont cultivées jusqu'au milieu de la phase exponentielle (D06oonm = 0,8) et traitées par H242 (5 mM) pendant 5 min, lavées deux fois dans de

16 l'eau supplémentée en NEM (10 mM), congelées et lysées dans une presse Eaton dans un tampon C [Tris-Cl pH 8 (100 mM), NaCI (50 mM) EDTA-sans inhibiteur de protéase (Roche-Boerhinger), PSMF (1 mM), imidazole (20 mM), NEM (10 mM)].
L'extrait cellulaire est centrifugé 1h30 à 10.000 g et le surnageant est passé
dans une colonne Ni-NTA (Qiagen). Après lavage, de la colonne avec un tampon D [Tris-Cl pH
8 (100 mM), NaCI (50 mM)] + imidazole (20 mM), les protéines sont éluées avec le tampon D + imidazole (300 mM).
1.6. Analyse de l'ARN
L'ARN total est extrait comme décrit dans Lee et al. (J. Biol. Chem., 1999, 274,4537-4544) et l'ADNc est synthétisé par transcription inverse avec des amorces aléatoires hexanucléotidiques, à partir d' h ~.g d'ARN total.
Une PCR quantitative (Biorad iCycler) est réalisée en utilisant la méthode au SYBR Green I fluorescent, avec les amorces spécifiques de SRXl ou ACTl, trois fois séparément, conformément aux recommandations du fournisseur.
Exemple 2 : Réversibilité de la sur-oxydatitin de la cystéine de la Tsal par l'activité catalytique de la Srxl.
2.1 Matériel et méthodes L'une des 5 Prxs de S. cef~evisiae, la Tsal, est une 2-Cys Prx et constitue l'antioxydant principal chez la levure avec une spécificité de substrat large envers à la fois H202 et les peroxydes organiques.
L'oxydation de Tsal et la réversibilité de cette réaction en présence de Srx ont été analysées selon deux techniques (A) séparation selon le point isoélectrique de la protéine en gel à
deux dimensions (éIectrophorèse PAGE en 2D) ; les cellules de souche sauvage (WT) et la souche invalidée dsyxl sont initialement soumises à un marquage radioactif in vivo des protéines suivie d'une chasse de l'élément radioactif avant d'être traitées au H202, pendant des durées diffërentes (0, 2, 30 et 90 minutes de traitement) ;
la tâche de gauche (figure 4a) représente la forme native de la protéine et la tâche de droite (figure 4a) la forme acide (acide sulfinique).
(B) alkylation différentielle des thiols ; les cellules de souche sauvage (WT) et souche invalidée dsrxl portant une copie étiquetée de Tsal sont traitées à la cycloheximide (GHX) pour bloquer Ia synthèse protéique de ~ovo en

17 cours d'analyse, puis traitées à l'H202. Les protéines sont extraites, réduites au DTT
puis les thiols sont alkylés par un composé de SOODa, l'acide 4-acétamido-4'-maléimidylstilbène-2,2'-disulfonique (AMS) qui alkyle les cystéines au niveau des . groupes SH libres mais pas sous forme de sulfinate, augmentant le poids moléculaire de la protéine de 0,5 kDa par cystéine alkylée (AMS) ; la diffërence de taille entre les protéines portant deux thiols alkylés (cystéines réduites ou pont disulfure, indiqué
0 2 AMS » sur les figures 4c et 4d ou un thiol alkylé (acide sulfinïque, indiqué
0 1 AMS » sur les figures 4c et 4d) est observée après séparation selon leur taille sur un gel SDS-PAGE. La protéine est révélée par Western Blot ;
2.2 Résultats Les résultats sont présentés aux figures 4a et 4b.
Dans les extraits cellulaires non-traités, Tsal apparaît comme une tache double : l'une intense correspondant à environ 85% de l'enzyme totale à
une position de pI de 4,8 (+/- 0,05), ce qui correspond à une Tsal réduite (le pI
théorique de la Tsa est 4,87) ; l'autre tache plus fine se situant à une position de pI
plus acide de 4,7 (+/- 0,05), ce qui correspond à la Tsal oxydée (la valeur théorique de la forme acide sulfinique de la cystéine de la Tsal est 4,75). Après deux minutes de traitement par H202 (SOO~,M), Ia proportion de Tsal oxydée augmente au détriment de la Tsal réduite, et ce jusqu'à une proportion d'environ 90% des protéines totales.
Après 30 minutes de traitement, le rapport Tsal réduit/oxydé revient à celui des cellules non-traitées. La réapparition de la tâche de Tsal réduite provient de la Tsal oxydée et non de Tsal synthétisée de novo, étant donnë que Ie marquage de protéines est interrompu avant l' analyse. Des résultats identiques sont observés lorsque Ies cellules sont traitées avec du t-butyl hydroperoxyde (t BOOH).
Dans les extraits cellulaires non-traités par l'H~02, la Tsal est en grande partie réduite et migre comme une bande double modifiée par l'AMS
(Figures 4c et 4d) ; et 15 minutes aprës traitement par Ha02, la Tsal migre comme des espèces singulières ou doubles modifiées par l'AMS, présentant un mélange de formes réduite et oxydée selon un rapport d'environ 1:3. Après une durée de 120 minutes de ce traitement, Ia Tsal est complètement revenue à son état initial, c'est à dire sous forme de doublet alkylé par l'AMS, mettant en évidence la réduction du sulfinate en Cys-SH. La réduction de la Tsal est différée comparativement à celle observée par

18 PAGE (Figure 4a), ce qui est probablement dû à l'inhibition de la synthèse de protéines.
Ces deux expériences montrent que la forme sur-oxydée de Tsal (acide sulfinique) est réductible en thiol libre dans une souche sauvage et que la présence de Srxl est indispensable à cette réduction.
Exemple 3 : Identification d'une protéine de 13 kDa chez S. cet~evisiae liée à
une Prx par pont disulfure (figure 7).
3.1 Matériel et Méthodes (voir exemple 1) (A) Des cellules contenant une copie étiquetée (HA) de la protéine Srxl sont traitées par 500 p.M d'H202 pendant 15 minutes. Les protéines sont extraites selon une méthode permettant Ia conservation de l' état redox intracellulaire des thiols (voir exemple 1) puis séparées sur gel SDS-PAGE en conditions réductrices pour les cellules de la souche sauvage (WT) contenant une copie étiquetée (HA) de la protéine Srxl (piste 1) et en conditions non-réductrices pour les cellules de souche sauvage (WT) (piste 2), la souche mutante dual portant une copie étiquetée du gëne S.RXI
(piste 3), et la souche ~srxl portant une copie étiquetëe du gène SRXI ayant subi une mutation C84S (piste 4) ; les poids moléculaires de rëférences (MW) sont exprimés en kDa.
(B) la protëine Srxl est purifiée dans les conditions natives grâce à
une étiquette 6His, à partir de cellules d trYl traitées pendant 5 minutes avec 5 mM de H202 ; les protéines purifiées sont ensuite séparées sur gel SDS-PAGE
réducteur ou non-réducteur. L'identification des différentes protéines indiquées a été
réalisée par spectrométrie de masse ; les protéines purifiée séparées dans des conditions non-réductrices et rëductrices proviennent de la souche mutante dtrrl contenant une copie du gène SRXI (puits n° 1 et 3), et de la souche mutante 4trr1 contenant une copie étiquetée (HA) du gène SRXI (puits n°2 et 4), les poids moléculaires de références (MW) sont exprimés en kDa.
3.2 Résultats La figure 7a met en évidence l'existence d'un pont disulfure inter-moléculaire entre Tsal et Srxl, impliquant la cystéine conservëe (Cys84) de Srxl (voir figures 2 et 3).

19 Elle montre en outre que Srxl peut se trouver sous deux formes : un monomère de 13 kDa et un multimëre de 55 kDa lié par pont disulfure (Figure 7a, piste 2).
La figure 7b illustxe le fait que la copurification des Tsal, Tsa2 et Ahpl montre que Srxl interagit avec trois des cinq peroxyrédoxines existant chez la levure et que l'interaction avec Tsal peut être redox on non covalente.
De manière plus précise, le matériau non-réduit purifié contient plusieurs bandes majeures de tailles de 80, 55, 40, 35, 20 et 13 kDa (Figure 7b) qui se limitent à 2 bandes principales de 13 et 20 kDa et une bande mineure de 18 kDa après réduction (dernier puits). La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF
appliqué
sur le matëriau réduit a permis d'identifier les protéines Srxl, Tsa1 et la protéine Ahpl qui est la seconde 2-Cys Prx majeure de levure, dans les bandes respectivement de 13, 20 et 18 kDa. La Tsa2, qui est une troisième 2-Cys Prx, est aussi présente sous forme de traces dans la bande de 20 kDa. L'analyse par spectrométrie de masse de lysat non-réduit a permis d'identifier à la fois la protéine Tsal et la protëine Srxl dans la bande de 55 kDa, probablement sous forme d'hétérotrimères liés par pont disulfure contenant 2 molécules de Tsal. Cette analyse a permis également de détecter la pré-sence de la protéine Tsal dans les bandes de 40, 35 et 20 kDa, probablement sous forme de dimères et de monomères liés par pont Bisulfure. L'association des protéines Srxl et Tsal, qui sont liées par pont Bisulfure, est confirmée par immunodétection au cours de laquelle la bande de SS kDa contenant la protéine Srxl n'est pas détectée dans les lysats traités par H2O2 provenant de la souche Otsal dépourvue du gène TSA1. Ces résultats montrent que la Srxl est fortement induite par H202 et s'associe avec la Tsa1 de façon non-covalente sous forme d'hétéromères liës par pont Bisulfure.
La protéine Srxl s'associe aussi avec 2 autres Prx : Ahpl et Tsa2, mais son association est mineure dans les conditions testées.
Exemple 4 : La fonction Srxl est liée à l'activité peroxydase et à Tsal.
4.1. Matériel et Méthodes 4.1.1 Matériel La souche sauvage et les deux souches mutantes ~tsal et dsYxl sont celles déjà décrites à l'Exemple 1.

4.1.2 Méthodes Les tests de sensibilité des souches sauvage et mutantes au t-BOOH
et au H20a sont effectués comme suit (voir également exemple 1 ) - Test de sensibilité au tBOOH ou à l'HaOa 5 Des cellules sauvages ou invalidées pour le géne SRXI sont dépo-sées sur des boîtes de Pétri contenant des concentrations croissantes de peroxyde d'hydrogène (H2Oa) ou de t-butyl hydroperoxyde (tBOOH). La croissance des cellules est observée après 48 heures d'incubation à 30°C.
- Extraction des protéines tout en préservant leur état redox 10 cellulaire (voir exemple 1).
4.2. Résultats Les Figures Sa et Sb montrent que la souche invalidée pour le gène SRXl présente une hypersensibilité au peroxyde.
La figure 6 montre également que la protéine Srxl est nécessaire à la 15 rësistance contre le stress au peroxyde.
En particulier, cette figure 6 montre que la surexpression de TSA 1 corrige totalement le défaut de résistance de la souche ~srx 1 montrant que cette sensi-bilité est due à un défaut d'activité peroxydase. La surexpression de SRXl dans une levure dtsal n'a aucun effet, contrairement à la même surexpression dans une souche

20 sauvage. Ceci montre que la présence de Tsal est indispensable à la fonction de Srxl .
La fonction du gène SRXI est liée au gène TSAl. La surexpression de TSAI restaure le défaut de tolérance au H20a et au t-BOOH dans la souche Otsal, mais la surexpression du gène SRXI ne provoque aucun effet de ce genre dans la souche Otsal , bien qu'elle augmente légèrement la tolérance de la souche sauvage au t-BOOH. Ces données indiquent que Srxl agit par l'intermédiaire de Tsal, alors que la surexpression de Tsal peut compenser un défaut en protéine Srxl.
La substitution en sérine de Cys84 (SrxlCyssas) supprime complète-ment la fonction de la Srxl dans la tolérance au peroxyde d'hydrogène (Figure Sa) et la formation de pont Bisulfure Srxl-Tsal, indiquant que cette liaison est essentielle pour la fonction de Srxl et est due à la Cys84.

21 Exemple 5 : L'ATP est nécessaire pour réduire la forme Cys-SOZH de la Tsal.
5.1 Matériel et Méthodes Voir Exemple 1.
5.2 Résultats Afin d'étudier plus en détails la réduction de la forme Cys-S02H de la Tsal par Srxl, la protéine Srxl recombinante exprimée par baculovirus a été
produite. Elle montre que la Srxl purifiée permet la réduction de la forme S02H de la Tsal purifiée, et que cette réduction se produit seulement en présence d'ATP
et de lysats provenant de cellules de type sauvage (Figure 8). Ces données montrent que Srxl catalyse la réduction de la forme sulfinate de la Tsal.
En effet, la protéine Srxl permet la réduction de la forme Cys-S02H
de la protéine Tsal présente dans les lysats des cellules ~Srxl traitées à
H202 selon une manière dose-dépendante, seulement lorsque l'ATP est ajouté (Figure 8a et b). Le GTP et l'AMP-PNP, qui est un homologue de l'ATP non-hydrolysable, n'a aucun effet sur la catalyse. L'ajout d'EDTA au lysat inhibe la réduction de la Tsal Srxl-dépendante et la réintroduction de Mg+f ou de Mn~ mais pas de Fer, Cap, Cu~, ou Zn~, restaure la réduction. Finalement, la Srxl purifiée réduit complètement la forme Tsal purifiée et oxydée ifz vitro en présence d'ATP, de Mg++ ou de Mn~ et de DTT
(Figure 8c), démontrant que la Srxl elle-méme catalyse la réduction de la forme Cys-SO2 en la forme Cys-SH. Le couplage d'hydrolyse de l'ATP et le besoin spécifique en Mg++ ou Mn++ suggèrent fortement que Ia phosphorylation du substrat est réalisée par la Srxl, comme étant une étape dans le processus réducteur de Cys-SOZH, bien qu'un intermédiaire n'ait pas encore été détecté, probablement à cause de la nature haute-ment instable de celui-ci. La liaison disulfure entre Srxl et Tsal suggère aussi qu'un mécanisme fonctionnant à base de groupe thiol existe comme ëtant une autre étape dans ce processus. L'activité des mutants Srxl a été testée par la substitution de chacune de ses 3 cystéines. La substitution de la Cys84 (Srxl~Ys$as), qui est conservée parmi les homologues de la Srxl chez d'autres eukaryotes supprime totalement la formation du pont Bisulfure entre Srxl et Tsal et la réduction de la forme Cys-SOZH
de la Tsal, alors que les autres mutants cystéine ne présentent aucun effet pour la SrxlCYSioss ou un effet mineur pour la SrxlCYsass. Ces dormées indiquent que la liaison Srxl-Tsal provient de Cys84 de la Srxl et qu'elle est essentielle pour la réduction de

22 la Tsa Cys-S02H médiée par la Srxl. La substitution de la Cys84 en sérine supprime aussi le rôle de la Srxl in vivo dans la tolérance au peroxyde d'hydrogène, indiquant de plus que la réduction Srxl-dépendante de la Tsal Cys-SO2H est importante pour que la peroxydase fonctionne.
L'acide sulfinique des cystéines dans les protéines ne peut pas être réduit par des réducteurs mono- ou dithiol.
Le mécanisme d'action suivant est proposé
La sulfirédoxine catalyse cette réduction selon un processus à multi-étapes en agissant à la fois comme mle phosphotransférase spécifique et comme une thioltransférase (Figure 8). La réduction de l'acide sulfinique de la cystéine nécessite vraisemblablement son activation initiale, qui peut être réalisée par formation d'un ester sulfinique phosphorylé, comme le besoin en ATP et en Mgr l'indique.
Cette modification permet l'attaque du résidu sulfure par la cystéine au site activé
de la Srxl, puis la formation temporaire d'un thiolsufinate intermoléculaire entre Srxl et Tsal. Le thiolsulfinate existe au cours du stress oxydatif et est accessible à
la réduc-tion thiol-dépendante. Ainsi, une fois formé, le thiolsulfinate entre Srxlet Tsal est converti en deux Cys-SH par des échanges thiol-rédox successifs impliquant initiale-ment le clivage réducteur du pont thiolsulfmate en un sulfénate et en un pont disulfure grâce aux électrons fournis par le DTT iyz vitro et probablement par la thiorédoxine in vivo.
Exemple 6: Identification de la sulfirëdoxine humaine (hSrxl) et mise en évidence de son activité catalytique.
6.1. Matériel et méthodes Le gène hSrx (SEQ ID NO :4) a étë cloné par PCR à partir d'ADNc préparés par rétrotranscription à partir de cellules d'une lignée humaine tumorale MCF-7, en utilisant les oligonucléotides TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID
NO :14) La séquence codante hSrxl a été clonée dans le vecteur pFastBacl (Invitrogen) puis exprimée dans des cellules d'insecte High Five (voir exemple l, point 1.4).

23 Le lysat des cellules High Five surexprimant hSrxl a été utilisé in vitro pour tester son activité de réduction des peroxyrédoxines humaines Prxl et Prx2 suroxydées dans la forme acide sulfinique (Figure 9). 6HIS-Prxl et 6HIS-Prx2 ont été
exprimés, purifiés et suroxydés selon la même méthode que la Tsal de chez S
cerevisiae. Le protocole et la méthode sont identiques à ceux de l'exemple 1 (points 1.3 et 1.4).
6.2. Résultats La figure 9 illustre les résultats obtenus et montre la capacité de la hSrxl, exprimée à partir du Baculovirus dans les cellules High Five, à réduire les peroxyrédoxines humaines 6His-Prxl et 6His-Prx2 suroxydées dans la forme cystéine acide sulfinique.. Cette réduction nécessite la présence des cofacteurs ATP (1 mM) et Mg++ (1 mM) et le dithiotreitol (2 mM).
Les extraits de Baculovirus expriment soit hSrxl (h Srx), soit la protéine Taul38 (control). La méthode et le protocole de cette expérience sont I S identiques à ceux précisés à l'exemple 5.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viemient d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

0263-100-SEQ.ST25 SEQUENCE LISTING
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<Z13> Candida albicans <400> 2 Met Ser Met Tyr Thr Ser Arg Leu Ala Thr Glu Tyr Val Pro Leu Ser Glu Ile Lys Arg Pro Ile Pro Pro Val Leu Asp Tyr Gln Lys Ile Asp Ala Met Leu Ser Thr Leu Lys Gly Val Pro Met Glu Ser Ala Thr Cys Lys Val Glu Asp Ile Thr Ala Gly Glu Leu Pro Pro Ile Asp Val Phe Lys Ile Arg Glu Asn Gly Lys Asn Phe Tyr Phe Ala Phe Gly Gly Cys His Arg Phe Gln A1a Tyr Asp Arg Ile Ser Lys Glu Thr Glu Lys Glu Val Met Val Lys Ser Arg Ile Leu Pro Ala Thr Arg Lys Ser Leü Arg Ile Tyr Leu Gly Ala Ser Val Asp <210> 3 <Z11> 124 <21Z> PRT
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<213>Homo sapiens <400> 4 Met Gly Leu Arg Ala Gly Gly Thr Leu Gly Arg Ala Gly Ala Gly Arg Gly Ala Pro Glu Gly Pro Gly Pro Ser Gly Gly Ala Gln Gly Gly Ser Ile His Ser Gly Arg Ile Ala Ala Val His Asn Val Pro Leu Ser Val Leu Ile Arg Pro Leu Pro Ser Val Leu Asp Pro Ala Lys Val Gln Ser Leu Val Asp Thr Ile Arg Glu Asp Pro Asp Ser Val Pro Pro Ile Asp Val Leu Trp Ile Lys Gly Ala Gln Gly Gly Asp Tyr Phe Tyr Ser Phe Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Glu Thr 0263-100-SEQ.ST25 Ile Pro Ala Lys Leu Val Gln Ser Thr Leu Ser Asp Leu Arg Val Tyr Leu Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln <210> 5 <211> 136 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 5 Met Gly Leu Arg Ala Gly Gly Ala Leu Arg Arg Ala Gly Ala Gly Pro Gly Ala Pro Val Val His Gly Pro Gly Gly Ala Gln Gly Gly Ser Ile His Ser Gly Cys Ile Ala Thr Val His Asn Val Pro Ile Ala Val Leu Ile Arg Pro Leu Pro Ser Val Leu Asp Pro Ala Lys Val Gln Ser Leu Val Asp Thr Ile Leu Ala Asp Pro Asp Ser Val Pro Pro Ile Asp Val Leu Trp Ile Lys Gly Ala Gln Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Ser Phe Gly Gly Cys His Arg Tyr Ala Ala Tyr Gln Gln Leu Gln Arg Glu Thr Ile Pro Ala Lys Leu Val Arg Ser Thr Leu Ser Asp Leu Arg Met Tyr Leu 1l5 120 125 Gly Ala Ser Thr Pro Asp Leu Gln <210> 6 <211> 162 <212> PRT
<213> Drosophila melanogaster <400> 6 0263-100-sEQ.ST25 Met G1u Phe Ile Ser His Phe Leu Arg Ala Thr Ser Arg Arg Thr Ala Ala Leu Gly Pro Ile Leu Gln Arg Asn Arg Ser Glü Ile Ile Gln Lys Gln Ser Leu Thr Asn Arg Gln Ala Phe Arg Arg Tyr Arg Ser Ser Cys Ser Thr Met Asp Thr Thr Val His Ser Ala Gly Ile Asp Glu Thr His Leu Val Pro Met Ser Val Ile Gln Arg Pro Ile Pro Ser Val Leu Asp Glu Gln Lys Val Gln Ser Leu Met Glu Thr Ile Lys Asn Glu Thr Ser Glu Asp Glu Val Pro Pro Ile Asp Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ser Glu Gly Gly Asp Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Gly Cys His Arg Phe Glu Ala Tyr Lys Arg Leu Gln Arg Pro Thr Ile Lys Ala Lys Leu Val Lys Ser Thr Leu Gly Asp Leu Tyr His Tyr Met Gly Ser Ser Ala Pro Lys Tyr Leu Ala <210> 7 <211> 125 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 7 Met Ala Asn Leu Met Met Arg Leu Pro Ile Ser Leu Arg Ser Phe Ser Val Ser Ala Ser Ser Ser Asn Gly Ser Pro Pro Val Ile Gly Gly Ser Ser Gly G1y Val Gly Pro Met Ile Val Glu Leu Pro Leu Glu Lys Ile 0263-100-SEQ.ST25 Arg Arg Pro Leu Met Arg Thr Arg Ser Asn Asp Gln Asn Lys Val Lys Glu Leu Met Asp Ser Ile Arg Gln Ile Gly Leu Gln Val Pro Ile Asp Val Ile Glu Val Asp Gly Thr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Cys His Arg Tyr Glu Ala His Gln Lys Leu Gly Leu Pro Thr Ile Arg Cys Lys Ile Arg Lys Gly Thr Lys Glu Thr Leu Arg His His Leu Arg <210> 8 <211> 86 <212> PRT
<213> Thermosynechococcus elongatus <400> 8 Met Arg Val Leu Asp Leu Pro Leu Asn Ala Ile Arg Arg Pro Leu Val Arg Gln Thr Asp Pro Ala Lys Val Ala Ala Leu Met Ala Ser Ile Ala Glu I1e Gly Gln Gln Glu Pro Ile Asp Val Leu Glu Val Glu Gly His Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Cys His Arg Tyr Glu Ala Cys Gln Arg Leu Gly Leu Pro Thr Ile Arg Ala Arg Val Arg Arg Ala Pro Arg Ser Val Leu Asn Leu His Leu Ala <210> 9 <211> 87 <212> PRT
<213> Nostoc sp <400> 9 0263-100-SEQ.ST25 Met Val Arg Val Gln Glu Ile Pro Leu Asn Gln Ile Arg Arg Pro Leu Pro Arg Gly Asn Asp Pro Tyr Lys Val Gln Ala Leu Met Glu Ser Ile Ala Ala Ile Gly Gln Gln Glu Pro Ile Asp Val Leu Glu Val Asp Gly Gln Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Cys His Arg Tyr Glu Ala Cys Gln Arg Leu Gly Lys Glu Thr Ile Leu Ala Arg Val Arg Lys Ala Pro Arg Ser Val Leu Lys Met His Leu Ala <210> 10 <211> 141 <212> PRT
<213> Oryza sativa <400> 10 Met Ala Ala Ser Gly Phe Leu Leu Arg Cys Pro Ala Ala Pro Ser Ala Val Pro Leu Trp Gly Arg Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asn Gly Ala Ala Val Pro Ser Ser Leu Ser Asp Ser Glu Lys Lys Gly Pro Val Val Met Glu Ile Pro Leu Asp Lys Ile Arg Arg Pro Leu Met Arg Thr Arg Ala Asn Asp Pro Ala Lys Val Gln Glu Leu Met Asp Ser Ile Arg Val Ile Gly Leu Gln Val Pro Ile Asp Val Leu Glu Val Asp Gly Val Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Cys His Arg Tyr Glu Ala His Gln Arg Leu Gly Leu Pro Thr Ile Arg Cys Lys 0263-100-SEQ.sT25 Val Arg Arg Gly Thr Lys Glu Thr Leu Arg Ile Gly Cys <210> 11 <211> 20 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR
<400> 11 gtcccgcggc ggcggcgacg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR
<400> 12 agcaggtgcc aaggaggctg 20 <210> 13 <211> 3Z
<212> DNA
<213> Artificial sequence <220>
<223> amorce PCR
<4oa> 13 ttaattgaat tcatggggct gcgtgcagga gg 32 <210> 14 <211> 44 <212> DNA
<213> Artificial sequence 0263-100-SEQ.ST25 <220>
<223> amorce PCR
<400> 14 ttttcctttt gcggccgcct actactgcaa gtctggtgtg gatg 44

Claims (25)

REVENDICATIONS

1 ~) Utilisation d'une protéine dénommée sulfirédoxine (Srx), qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S, pour catalyser la réduction des peroxyrédoxines (Prxs) sous leur forme super-oxydée Prx-Cys p-SO2H (peroxyrédoxine cystéine acide sulfinique) en dérivé
thiol (SH).

2 ~) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite sulfirédoxine est une sulfirédoxine de microorganisme, de plante ou d'organisme supérieur, qui comprend généralement entre 80 et 170 acides aminés et au moins le site catalytique présentant le motif suivant : FXGCHR, avec X= G ou S ainsi que les pourcentages d'identité et de similarité suivants:

.levure/homme : 31 % d'identité et 67 % de similarité
.levure/plantes : 23 % d'identité et 39 % de similarité
.levure/souris : 31 % d'identité et 51 % de similarité
.levure/champignons : 80 % d'identité et 90 % de similarité.

3 ~) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, carac-térisée en ce que ladite sulfirédoxine est notamment sélectionnée parmi les protéines dont les séquences correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO : 1 à
10.

4 ~) Peptide isolé, correspondant au site catalytique de la Srx, telle que définie aux revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est défini par la séquence suivante : FXGCHR, avec X= S.

~) Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité effi-cace d'une protéine définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1-3 et 5-10 et éventuellement au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

6 ~) Utilisation d'une protéine telle que définie aux revendications 1 à 3, pour la préparation d'un médicament antioxydant destiné à traiter les cancers, les troubles neurodégénératifs et les maladies neuromusculaires, dans lesquels l'on observe une défaillance du système antioxydant Prx/Srx.

7 ~) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillisse-ment, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer l'implication du système antioxydant Prx/Srx :
(1) la mise en contact in vitro des cellules d'un échantillon biologique avec du peroxyde d'hydrogène (H2O2) (2) la détection de la Prx-Cys p-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), et (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cys p-SO2H et de Prx-Cys p-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1).

8~) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillisse-ment, aux maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend le génotypage de la sulfirédoxine, à partir de l'ARN total d'un échantillon biologique convenable, notamment des cellules sanguines, conformément aux étapes suivantes (1) l'extraction de l'ARN total, à partir dudit échantillon biologique, (2) la préparation d'ADNc spécifique de la sulfirédoxine, par ampli-fication de TARN à l'aide des deux amorces suivantes GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), ces séquences étant situées respectivement en amont et en aval de l' ORF de la sulfi-rédoxine humaine (GenBank n o AAH47707), (3) l'établissement de sa séquence nucléotidique et (4) la comparaison par rapport à une séquence d'ADN codant pour une protéine Srx, telle que définie ci-dessus, issue de la même espèce que celle de l'échantillon biologique à analyser.

9~) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillisse-ment, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la quantification relative, par tout moyen approprié, de l'ARNm codant pour la sulféridoxine humaine à partir des ADNc totaux préparés à partir d'un échantillon biologique humain, par comparaison avec un échan-tillon de référence.

10~) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite quantification comprend (a1) la préparation d'ADNc à partir de l'ARN total par transcription inverse avec des amorces appropriées et notamment des amorces aléatoires hexa-nucléotidiques ;
(a2) l'amplification dudit ADNc en présence de la paire d'amorces GTCCCGCGGCGGCGGCGACG (SEQ ID NO :11) AGCAGGTGCCAAGGAGGCTG (SEQ ID NO :12), en présence d'un reporter fluorescent et de façon simultanée ou séquentielle, (a3) la détection de la quantité de l'amplimère (ou amplicon) par mesure du signal fluorescent.

11°) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le reporter fluorescent est sélectionné dans le groupe constitué par des agents se liant à
l'ADN double-brin et des sondes fluorescentes.

12°) Procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, carac-térisé en ce que lorsque ledit reporter fluorescent est une sonde, il est de préférence sélectionné dans le groupe constitué par les sondes dëfinies par les séquences suivantes TTAATTGAATTCATGGGGCTGCGTGCAGGAGG (SEQ ID NO :13) et TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTACTACTGCAAGTCTGGTGTGGATG (SEQ ID
NO :14).

13°) Procédé de dépistage de maladies liées au cancer, au vieillisse-ment, aux maladies neurodégénératives et aux maladies neuromusculaires, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend - l'immunodétection de la protéine Srx dans un échantillon biologique à tester, à l'aide d'un anticorps obtenu par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx ou le peptide FXGCHR, avec X=G ou S, après séparation des protéines totales par électrophorèse, puis - l'évaluation de la qualité et de la quantité de ladite protéine Srx par rapport à une protéine Srx contrôle.

14°) Utilisation de la séquence codant pour une protéine Srx, telle que définie aux revendications 1 à 3, pour l'obtention de plantes dont les capacités de résistance au stress sont significativement augmentées.

15 o) Cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur recombinant contenant une séquence codant pour une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ
ID NO :1-3, 5, 6 et 8-10.

16 o) Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de S. cerevisiae modifiée par un vecteur surexprimant le gène SRX1.

17 o) Cellule hôte selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une cellule de mammifère modifiée par un vecteur surexprimant le gène hSrx1.

18 o) Cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que ledit vecteur est avantageusement un vecteur navette E.
coli/S.
cerevisiae comprenant au niveau d'un site de clonage EcoRI, la séquence codant pour la protéine Srx et le promoteur du gène Srx.

19 o) Procédé de criblage de médicaments aptes à moduler l'activité
du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) la mise en contact de la substance à cribler avec des cellules hôtes selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, en présence de peroxyde d'hydrogène (2) la détection de la Prx-Cys p-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1), (3) l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cys p-SO2H et de Prx-Cys p-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (1).

20 o) Procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à
une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend:
a) la mise en contact de la substance à tester avec un extrait de cellules hôtes selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 ou un échantillon biologique d'un animal transgénique non humain, notamment des souris, sélectionné
dans le groupe constitué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est surexprimé, en présence de peroxyde d'hydrogène, b) la mesure par tout moyen approprié, de l'activité antioxydante du système Prx/Srx du mélange obtenu en a), et c) la sélection des substances capables de stimuler ou d'inhiber ladite activité.

21 o) Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que la mesure de ladite activité est notamment effectuée par la détection de la Prx-Cys p-SO2H formée, entre 1 heure et 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a) et l'établissement du rapport des quantités de Prx-Cys p-SO2H et de Prx-Cys p-SH, à partir de 4 heures après ladite mise en contact selon l'étape (a).

22 o) Procédé de criblage de médicaments utiles dans le traitement des cancers, des maladies neurodégénératives et des maladies neuromusculaires, liés à
une défaillance du système antioxydant Prx/Srx, caractérisé en ce qu'il comprend:
(1) la mise en contact de la substance à cribler avec des mammifères transgéniques non-humains, notamment des souris, sélectionné dans le groupe consti-tué par des animaux dans lesquels le gène de la protéine Srx est invalidé et des animaux dans lesquels le gène de protéine Srx est surexprimé, et (2) la mesure de la survie de l'animal.

23 o) Anticorps anti-Srx, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation convenable d'un animal avec une protéine Srx, définie par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :1-3, 5, 6 et 8-10 ou le peptide FXGCHR, avec X = S selon la revendication 4.

24 o) Procédé de réduction d'un produit comprenant au moins deux cystéines à activité redox, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite protéine avec une sulfirédoxine (Srx), telle que définie aux reven-dications 1 à 3, qui comprend au moins un site catalytique présentant le motif suivant:
FXGCHR, avec X= G ou S, en présence d'ATP et de magnésium.

25 o) Procédé de synthèse d'un produit comprenant des résidus Cys-SH à partir de produits comportant des résidus Cys-SO2H, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réduction du produit comportant les résidus Cys-SO2H en produit comprenant des résidus Cys-SH, en présence d'une sulfirédoxine telle que définie aux revendications 1 à 3, d'ATP et de magnésium.