WO2005004926A1

WO2005004926A1 - 樹状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤

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Publication number: WO2005004926A1
Application number: PCT/JP2003/008720
Authority: WO
Inventors: Masanobu Kobayashi
Original assignee: Oncorex, Inc.
Priority date: 2003-07-09
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2005-01-20
Also published as: JPWO2005004926A1; CA2531636A1; AU2003248255A8; EP1647256A1; EP1647256A4; US20060275268A1; WO2005004926A8; AU2003248255A1

Abstract

本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物はレチノイドを含有する。レチノイドは、樹状細胞が浸潤能を発揮するために必要なＭＭＰ−９の産生を増大し、それにより、樹状細胞の浸潤能を活性化する。従って、免疫賦活化作用を有し、動物の感染症、癌の予防・治療に用いることができる。

Description

明細書榭状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤技術分野

本発明は、榭状細胞の浸潤能を活性化するための組成物、免疫賦活剤等に関する。背景技術

これまでの腫瘍免疫療法では、インターロイキン一 2 ( I L - 2 ) 等を投与する免疫賦活療法や、患者の末梢リンパ球から誘導されたリンホカイン活性化キラー細胞（L A K ) や腫瘍內浸潤リンパ球（T I L ) を輸注する養子免疫療法、抗腫瘍抗原モノクローナル抗体を用いたミサイル療法等、種々の免疫療法が試みられている。また、癌に対する遺伝子治療も盛んに行われており、特に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM— C S F ) 等のサイト力イン遺伝子を導入した癌細胞を移植して、癌に対する免疫を誘導し、癌を治療する細胞ワクチン療法が注目されている。一方、榭状細胞は代表的な抗原提示細胞として知られている。榭状細胞は造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞集団であり、生体内に広く分布している。へルパー T細胞の活性化は、榭状細胞による抗原提示に依存しており、樹状細胞は、末梢血液中の抗原をとらえ、リンパ節に移動し、最終的にリンパ節で成熟すると考えられている。

一般に、未成熟榭状細胞は、抗原となる異物を取り込み、その抗原を消化する能力が高いが、抗原提示能は低い。これに対し、成熟榭状細胞は、抗原の取り込み能が低いが、抗原提示能が高いということが知られている。生体内においては、未成熟榭状細胞が異物を取り込み、細胞内においてその異物を消化し、その刺激によつて分化した成熟樹状細胞は、消化した異物の一部を細胞外に提示して、リンパ球に特定の抗原情報を伝えると考えられている。

生体内において、樹状細胞は骨髄の造血幹細胞から誘導されることが知られている。樹状細胞の前駆細胞及び未成熟榭状細胞は、血液及ぴリンパ球中に存在しており、成熟樹状細胞は脾臓及びリンパ節に存在している。末梢組織の単核が顆粒球コ口エー刺激因子（GM—C S F ) 、インターロイキン一 4 ( I L - 4 ) で刺激されると、未成熟樹状細胞へ分化することが知られており、更に未成熟樹状細胞を腫瘍壊死因子（T N F ) で刺激すると成熟榭状細胞へと分化することが知られている。異物が生体内に侵入した場合、樹状細胞が異物を貧食し、抗原を T細胞に提示する機能を有しており、抗原を提示された T細胞が抗原を貧食する。このような機能を発揮するために、榭状細胞は、生体内に異物が侵入した時に、末梢組織から所属リンパ節まで移動し、異物が侵入したことを提示している。

一般に、癌患者の癌細胞中の酸素濃度は正常細胞に比較して 2 0 %程度に低下していることが知られている。このような低酸素状態で分化した樹状細胞は、細胞外マトリックスタンパク質を溶解するマトリックスメタ口プロティナーゼー 9 (MM P— 9 ) の産生が低下している。生体內においては、榭状細胞が末梢組織を移動する時や、血管やリンパ管を通り抜ける時にも、このマトリックスメタ口プロティナーゼー 9が必要であることが知られている。

従って、低酸素状態下で分化した榭状細胞は末梢組織からリンパ節に移動することができず、上述したような抗原提示能を発揮することができなくなる。このため、癌細胞内では樹状細胞の抗原提示能が発揮されないため、 τ細胞が癌細胞を死滅することができない。

従って、本発明の目的は、癌細胞等の酸素濃度の低い状態で産生された樹状細胞がリンパ節まで移動することを可能にする、すなわち榭状細胞浸潤能を活性化する組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、免疫賦活剤を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、レチノイドが樹状細胞の浸潤能を活性化することを見出し、本発明を完成させた。

本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、レチノイドを含有する、榭状細胞浸潤能活性化組成物を提供するものである。また、本発明は、哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、榭状細胞の浸潤能を活性化する方法を提供するものである。

また、本発明は、哺乳動物に対して、上記樹状細胞浸潤能活性化組成物を投与することを特徴とする、榭状細胞の浸潤能を活性化する方法を提供するものである。また、本発明は、レチノイドを含有する、免疫賦活剤を提供するものである。また、本発明は、レチノイド及び樹状細胞を含有する、免疫賦活剤を提供するものである。

また、本発明は哺乳動物細胞に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法を提供するものである。

また、本発明は哺乳動物に対して、上記免疫賦活剤を投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法を提供するものである。

また、本発明は上記樹状細胞浸潤能活性化組成物、又は上記免疫賦活剤を、投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防 ·治療方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1はフローサイトメ一ターによる表面抗原解析の結果を示す図である。

図 2は、リアルタイム P C Rの結果を示す図である。

図 3は、ウェスタンブロット解析の結果である。

図 4は、ゼラチンザィモグラフィ一法の結果である。

図 5は、ゼラチンザィモグラフィ一法の結果である。

図 6は、リアルタイム P C Rの結果を示す図である。

図 7は未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能の活性を測定した結果を示すグラフである。

図 8は、 T I M P— 1タンパク質による榭状細胞の浸潤能活性の変化を調べた結果を示すグラフである。

図 9は、分化誘導後、細胞中の MM P— 9の m R N A濃度を測定した結果を示すグラフである。図 1 0は、低酸素下で分化した樹状細胞の浸潤能活性を測定した結果である発明を実施するための最良の形態

以下、先ず本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物について説明する。

本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物はレチノイドを含有する。本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物に用いられるレチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおょぴ脂肪酸レチュルエステル、ならびにデヒドロレチノ一ル、デヒドロレチノール、脂肪酸デヒドロレチュルエステル等が挙げられる。

上記レチノイン酸としては、以下のレチノイン酸の異性体、すなわち全トランスレチノイン酸、 1 3—シスレチノイン酸、 1 1—シスレチノイン酸、 9一シスレチノイン酸、 3 , 4—デヒドローレチノイン酸等が挙げられる。

また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノ一ノレ、 1 3 —シスレチノ一ノレ、 1 1一シスレチノ一ノレ、 9—シスレチノ一ノレ、 3 , 4—デヒドローレチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、 1 3一シスレチノール、全トランスレチノィン酸及ぴ 1 3—シスレチノイン酸が好適である。

本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物中のレチノィドの含有量は、必要な患者に投与した際に、榭状細胞浸潤能を活性化するための量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物の投与量は、レチノイドの量として、約 2 O m g /m ²〜約 5 O m g Zm ²程度である。なお、投与量は、投与方法、賦形剤の量、他の薬剤を併用する場合には変えることが好ましい。

本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物は、皮下、腹膜腔内、筋肉内、静脈等の非経口的に投与することができる。非経口投与製剤の形態の例として、例えば等張塩溶液中に、 5 %程度の濃度のグルコース又は他の公知の医薬的に使用可能な賦形剤と、活性剤を含む水溶液が挙げられる。シクロデキストリン等の可溶化剤や当業者に公知の他の可溶剤を賦形剤として添加してもよい。

次に、本発明の免疫賦活剤について説明する。本発明の免疫賦活剤は、レチノイドを含有する。本発明の免疫賦活剤に用いられるレチノィドとしては、上述した樹状細胞浸潤能活性化組成物に用いられるものが使用可能である。

また、免疫賦活剤中のレチノィドの含有量、投与量、投与形態等についても、上述した榭状細胞浸潤能活性化組成物と同様である。

本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質である MM P— 9の産生を促進することにより、樹状細胞の浸潤能を活性化する作用を有する。樹状細胞の浸潤能が活性化され、樹状細胞がリンパ節までの移動が活性化され免疫賦活作用を発揮する。このような作用を有するため、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ネコ、ィヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等）に対して用いられる。各種白血病、悪性リンパ腫、睥癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウィルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。

本発明の免疫賦活剤は、更に榭状細胞を含有していてもよい。

樹状細胞は、樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を培養することによって得ることができる。樹状細胞の前駆細胞である単核細胞の原料としては、例えば末梢血、骨髄液、臍帯血等が使用可能である。本発明の免疫賦活剤に用いられる樹状細胞は、成熟樹状細胞であっても未成熟樹状細胞であってもよい。例えば、単核細胞を G M — C S F、 I L一 4及ぴ T N F— αで刺激して培養することにより、成熟細胞へと分化誘導することができる。

本発明の免疫賦活剤に用いられる樹状細胞は、上記単核細胞を、分化誘導剤の存在下で培養することにより得ることができる。榭状細胞の原料として、例えば末梢血の単核細胞を用いる。樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を、採血等により採取し、採取した血液より分離精製することができる。単核細胞を赤血球から分離する方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法が用いられる。

例えば、末梢血単核細胞をフイコール—パック（Ficoll- Paqul) 密度勾配又は溶出を利用する方法が一般的に用いられる。また、その他に血液細胞を、成人の赤血球を選択的に溶解する溶液、例えばアンモニゥムクロライド一カリウム、アンモニゥムォキサレート等に懸濁し、分離することができる。

榭状細胞の分化誘導の培養には、 R PM I— 1 640 培地、ダルベッコ改変ィーダル培地（DMEM)、イスコフ培地（ I MDM) 等、適当な市販されている培地を用いることができる。培地中には血清を加えてもよく、例えば、 5-20%程度の牛血清、牛胎児血清、もしくはヒト血清などが使用しうる。無血清で培養してもよいが、必要に応じ牛アルブミン（B SA：)、ヒトアルブミン（H SA) などを添加してもよい。また、培地には、必要に応じ適当な抗生物質、抗体、ピノレビン酸 (0. ：!〜 5mM程度）、グルタミン（0. 5〜5 mM程度）、 2—メルカプトエタノール

( 1 0〜1 00 μΜ程度）を含んでいてもよレ、。これらの培地に分化誘導剤を添加し、約 3 7°C、約 5 %炭酸ガス雰囲気下で 5日〜 2 1 日程度培養する。培養日数は 7日〜1 4日程度が好ましい。培養温度（34〜3 8°C)、ガスの混合比（炭酸ガス 2〜 1 0%、さらには窒素ガス、もしくは酸素ガスを適宜混合しうる。）は、適切な条件を設定し行うことができる。

樹状細胞の前駆細胞を含む細胞群から樹状細胞へ分化誘導するには、適切な誘導剤を使用する必要がある。誘導剤としては、サイトカイン類を用いることができる。サイト力インとして、適当なもの使用すれば良いが、例えば GM- CSF、 IL-4、ステムセルフアクター（S C F) 、インターロイキン一 1 3 ( I L— 1 3)、 TNF- a , Flt3-Ligand等が使用可能である。上記サイトカインの濃度は、培地中、好ましくは 1〜1000ng/ml 程度である。

培養に用いられるサイトカインは、マウスなどの異種動物由来の因子も使用可能であるが、ヒト由来の因子を用いることが好ましい。

本発明の免疫賦活剤に用いる樹状細胞は、ヒト体内に接種して用いられるものであるため、細胞增殖性をなくしておくとより安全である。単核細胞は、分化誘導することにより増殖能が低下することが知られているが、より安全に利用するために加熱処理、放射線処理又はマイトマイシン Cで処理しておくことが好ましい。

例えば、 X線照射をする場合、 X線照射器の管球の下に榭状細胞を含む容器を置き、総放射線量 1 0 0 0〜3 3 0 0 R a d程度で照射することが好ましい。マイトマイシン Cで処理する場合、例えば、樹状細胞を 1〜3 X 1 0 ⁷細胞 Zm 1 の密度で懸濁して細胞浮遊液を得、この細胞浮遊液 l m 1当たりマイトマイシン Cを 2 5〜 5 0 gの比で添加して、 3 7 °Cの温度で 3 0 ~ 6 0分程度保温する。また、加熱処理方法は、例えば樹状細胞を 1 X 1 0 ⁷細胞/ m 1程度に懸濁して細胞浮遊液を得、この細胞浮遊液を 5 0〜 6 5 °Cの温度で 2 0分程度加熱処理を行う。

上述した、本発明の、樹状細胞を含有する免疫賦活剤は、レチノ一ルによって榭状細胞の浸潤能が活性化され、免疫賦活作用が発揮される。従って、上記免疫賦活剤は哺乳動物（例えば、マウス、ネコ、ィヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等）の各種白血病、悪性リンパ腫、膝癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宫癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウィルス、細菌等による感染症等に対して用いられる。樹状細胞を含有する免疫賦活剤の投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等によって異なり、一概には決定できないが、例えば投与は週に一度、患者一人あたり、榭状細胞が 1 X I 0 ⁷細胞となるような量を、 1 0週間にわたって投与する方法が挙げられる。

次に、本発明の榭状細胞の浸潤能を活性化する方法について説明する。

本発明の榭状細胞の浸潤能を活性化する方法は、哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする。本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法において用いられるレチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおよび脂肪酸レチュルエステル、ならびにデヒドロレチノール、デヒドロレチノ一ル、脂肪酸デヒドロレチュルエステル等が挙げられる。

また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノ一ノレ、 1 3—シスレチノーノレ、 1 1一シスレチノーノレ、 9一シスレチノーノレ、 3 , 4—デヒドローレチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、 1 3—シスレチノール、全トランスレチノィン酸及び 1 3 —シスレチノイン酸が好適である。

本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法に用いられるレチノィドとしては、上述した本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物を用いることができる。

本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法が適用される哺乳動物としては、例えばマウス、ネコ、ィヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等が挙げられる。本発明の榭状細胞の浸潤能を活性化する方法において用いられるレチノィドの量としては、必要な患者に投与した際に、榭状細胞浸潤能を活性化するための量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物の投与量は、レチノイドの量として、約 2 O m g /m ²〜約 5 O m g /m ²程度である。なお、投与量は、投与方法、賦形剤の量、他の薬剤を併用する場合には変えることが好ましい。投与方法としては、皮下、腹膜腔内、筋肉内、静脈等の非経口的な投与が好ましい。

本発明の榭状細胞の浸潤能を活性化する方法によれば、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質である MM P— 9の産生が促進され、樹状細胞の浸潤能が活性化され、榭状細胞のリンパ節への移動が活性化されることにより、免疫賦活作用を発揮する。従って、本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法は、上記哺乳動物に対して用いることができ、各種白血病、悪性リンパ腫、膝癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウィルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物を投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防 ·治療方法が提供される。

次に、本発明の免疫を賦活化する方法について説明する。

本発明の免疫を賦活化するする方法は、哺乳動物に対して、レチノィドを投与することを特徴とする。本発明の免疫を賦活化する方法において用いられるレチノィドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおよび脂肪酸レチュルエステル、ならびにデヒドロレチノ一ル、デヒドロレチノール、脂肪酸デヒドロレチュルエステル等が挙げられる。

上記レチノイン酸としては、以下のレチノイン酸の異性体、すなわち全トランスレチノイン酸、 1 3—シスレチノイン酸、 1 1一シスレチノイン酸、 9一シスレチノイン酸、 3， 4—デヒドロ一レチノイン酸等が挙げられる。

また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノ一ノレ、 1 3—シスレチノ一ノレ、 1 1 -シスレチノ一ノレ、 9—シスレチノー/レ、 3 , 4ーデヒドロ一レチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、 1 3—シスレチノール、全トランスレチノィン酸及ぴ 1 3—シスレチノイン酸が好適である。

本発明の免疫を賦活化する方法に用いられるレチノイドとしては、上述した本発明の免疫賦活剤を用レ、ることができる。

本発明の免疫を賦活化する方法が適用される哺乳動物としては、上述した、本発明の榭状細胞浸潤能活性化方法が適用される哺乳動物が挙げられる。また、使用されるレチノィドの量、投与方法などについても、上述した、榭状細胞浸潤能活性化方法と同様である。

本発明の免疫を賦活化する方法によれば、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質である MM P— 9の産生が促進され、樹状細胞の浸潤能が活性化され、樹状細胞のリンパ節への移動が活性化されることにより、免疫賦活作用を発揮する。従って、本発明の免疫を賦活化する方法は、上記哺乳動物に対して用いることができ、各種白血病、悪性リンパ腫、滕癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウィルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明の免疫賦活剤を投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防 '治療方法が提供される。実施例

以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例 1

健常者由来の末梢単核細胞（P BMC) をフイコール一パック密度交配遠心分離により分離した。末梢単核細胞を、完全 R PM 1 - 1 6 4 0培地中に、 2 X 1 0⁶細胞 Zm 1になるように分散させ、 3 7°Cで 1時間インキュベートすることにより付着性細胞を得た。非付着性細胞は、 R PM I — 1 6 4 0培地で 5回洗浄して除去した。付着性細胞を、 1 0 0 O UZm 1の GM— C S F及ぴ 1 0 0 0 U/m 1 の I L — 4、 1 0 %F B S、 2 5 mM HE P E S、 2 mM L—グルタミン酸、 5 0 <α Μ 2— ΜΕ、 1 %非必須アミノ酸及び 2 mMピルビン酸ナトリウムを含む R PM I培地中で、低酸素状態（1 %酸素濃度、以下本明細書において、低酸素状態とは、 1 %酸素濃度状態をいう）及び正常酸素状態（2 0 %酸素濃度、以下本明細書において、正常酸素状態とは、 2 0 %酸素濃度状態をいう）で、毎日、培地を半分交換しながら 3 7°C、 5 %炭酸ガス雰囲気下で 6 日間培養した。 6 日目に、細胞を集め、 2つのグループに分けた。 1つ目のグループは I L一 4及び GM— C S Fを含む培地で 1 S培養し、未成熟樹状細胞として用いた。 2つ目のグループは L P S ( 1 μ g/m l ) で 1 日処理し、成熟樹状細胞として用いた。実施例 2

実施例 1で得られた榭状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーターを用いて行った。抗原の検出は未成熟細胞及び成熟細胞について行った。測定する細胞（5 X 1 0⁵個）を、 C D 8 3、 CD 8 0、 C D 1 4、 H LA— AB C、 H LA— D Rに対する、 F I T C結合マウスモノクローナル抗体、及ぴヒト C D 1 a及び C D 8 6 に対するマウスモノクローナル抗体と 4°Cで 3 0分ィンキュベートした。用いたモノクローナル抗体は Immunotech社から購入した。次いで、細胞を生理食塩加リン酸緩衝液（P B S、 p H 7. 0 ) で 2回洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。次いで、フルォレセィン結合抗マウス I g G + I gM(H+ L)山羊抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories社製）と 4 5分間インキュベートし、フローサイトメ一ターを用いて解析を行った。結果を図 1に示す。図 1はフローサイトメーターによる表面抗原解析の結果を示す図であり、図 1において i mD C sは未成熟榭状細胞を示し、 mDC sは成熟樹状細胞を示す。

図 1に示すように、単球細胞のマーカーである CD 14は未成熟榭状細胞及び成熟樹状細胞に発現されていなかった。榭状細胞マーカーである CD 8 3は、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に発現していた。共刺激性分子、 CD 80及び CD 8 6 は、未成熟榭状細胞及ぴ成熟樹状細胞に発現していた。 HLA— DR、 HLA— A BC及ぴ CD l aは、未成熟樹状細胞及び成熟榭状細胞に発現していた。これらの結果は、 I L一 4及び GM— C S Fの存在下で正常酸素状態及び低酸素状態で分化した細胞は未成熟榭状細胞（ i mDC s) であると判断され、正常酸素状態及び低酸素状態で分化した L P Sで処理された細胞ほ成熟榭状細胞（mDC s ) であると判断される。実施例 3

実施例 1で得られた未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を、低酸素状態及び正常酸素状態で分化し、それぞれの細胞中の MMP— 9の mRNAの発現をリアルタイム PCR法により調べた。なお、低酸素状態及び正常酸素状態での分化は、それぞれ 1%酸素濃度、 20%酸素濃度において、培養チャンバ一を用いて 7日間行った。リアルタイム P CRは以下のように行った。細胞は、 3名のドナー由来の未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を用いた。培養して得られた細胞（1 X 1 0⁶細胞）からトリゾル試薬（TRIZOLreagent、 LIFE TECHNOLOGIES社）を用いて全 R N Aを分離した。 75 mM KC 1、 50 mM T r i s— HC 1 (p H 8. 3) 、 3 mM Mg C 1 2、 1 0 mMジチォスレイトール、 0. 5 mMの各 d NT P、 2 μΜ ランダムプライマー、及び 1 000 Uの TaqMan Reverse転写試薬を含む 50 μ 1の反応混合物中で各 RN Α試料（2 μ g) を c DNAに変換した。各 c DNA (1 0 n g) を SYBR - Green PCR assay kitを用いて 3組増幅し、 ABI PRISM 7900HT sequence Detection Systemで配列を決定した。 PCR反応は、 50°Cで 2分、 9 5°Cで 1 5分インキュペートし、次いで 9 5°Cでの 1 5サイクルの変性、 60°Cでの 30サイクルのァニ一リング、及ぴ 72 °Cでの 1分間の伸長を行った。プライマーとして配列番号 1及ぴ配列番号 2に示すものを用いた。結果を図 2に示す。図 2は、リアルタイム PCRの結果を示す図である。図 2において、 i mD C sは未成熟樹状細胞を示し、 mD C sは成熟樹状細胞を示し、 N は正常酸素状態、 Hは低酸素状態を示す。図 2に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟榭状細胞及び成熟細胞は、低酸素状態で分化したものよりも 2〜5倍高いレベルで MMP— 9の mRNAを発現した。実施例 4

実施例 1で得られた未成熟樹状細胞及び成熟榭状細胞を、 5 X 1 0⁵細胞 Zm 1になるように、血清を含まない RPM I 1 640培地で希釈し、 3 7 °Cの温度で低酸素状態及び正常酸素状態で 24時間培養を行った。培地を遠心分離して上清を集め、 — 70°Cに保存した。 MMP— 9タンパク質の生産量を定量するため、同量のタンパク質濃度の樹状細胞の培養上清を 7. 5 w/vのポリアクリルアミドゲル上に口ードし、 SDS— PAGEを行った。ヒト繊維肉腫細胞株 HT 1 0 80の培地を、ポジティブコントローノレとして用いた (J3—ァクチンを生産する）。 S D S - P AG Eの後、タンパク質を二トロセルロース膜（B i o—R e d、 He r c u l e s , C A) 上にセミドライ法によりプロッティングした。通常のブロッキング及び洗浄を行った後、その膜を濃度 1 μ g/m 1のヒト MMP— 9に対する一次抗体を用いて、室温で 1時間インキュベートした。用いた一次抗体は、ヒト MMP— ⁹に対して生じるマウスポリクローナル I g Gであり、二次抗体は 1 ： 2000の希釈率でホースラディッシュ 'ペルォキシダーゼにより標識されたゥサギ a n t i - m o u s e I g G (H&L) である。細胞内の MMP— 9プロティンを検出するために、 1 5 gのタンパク質を含むそれぞれの細胞溶解物をロードし、ウェスタンプロット解析を行った。膜はペルォキシダーゼで標識されたャギ a n t i -m o u s e I g Gを用いてィンキュベートし、 ECL検出キット（Ame r s h a m、東京、日本）を用いて現像した。

結果を図 3に示す。図 3は、ゥヱスタンプロット解析の結果であり、図 3に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟樹状細胞及び成熟榭状細胞は、低酸素状態下で分化したものよりも、高いレベルで MMP— 9タンパク質を産生していた。実施例 5

実施例 4で培養した、未成熟樹状細胞及ぴ成熟樹状細胞いついて、ゼラチンザィモグラフィ一法を実施した。その方法を以下に説明する。

ドデシル硫酸ナトリウム（SD S) 及びゼラチンを含有するポリアクリルアミドゲル中での電気泳動法によって検定した。簡単に説明すると、同じタンパク質含有物を含む細胞培養の上澄から分離した培養上清を 3倍のバッファーと混合して、 1 mg/m 1のゼラチンを含有する 10%wZvポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを 10 Om 1の再生バッファー（2. 5% T r i t o n X— 1 00 脱イオン水溶液）中で攪拌しながらインキュベートした。次に、そのゲノレを 1 00m lの d e v e l o pme n tバッファー（0. 1 5]^の a C 1、 50 mMの T r i s— HC 1、 1 0 mMの C a C l ₂、 0. 05%の N a N ₃) 中で、 37°Cでー晚インキュベートした。ゲルは、 0. 5%C o onia s s i e B l u e R— 250 40%メタノール / 1 0 %酢酸溶液で、室温で 1時間染色した。続いて 4時間、時々脱色液（40%メタノールノ 1 0%酢酸脱イオン水溶液）を換えながら脱色を行った。蛋白質分解活性のバンドは、紺青色のバックダラゥンドに対してクリァバンドとして明らかに見られた。ポジティブコントロールとして、ヒト繊維肉腫細胞株 HT 1 080の培地を用いた。

図 4に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟樹状細胞及び成熟榭状細胞は、低酸素状態下で分化したものよりも高いレベルで MMP— 9タンパク質を分泌した。 MMP— 9の活性形態は、正常酸素状態で分化した榭状細胞にのみ検出された。次いで、正常酸素状態及び低酸素状態で分化した未成熟榭状細胞及ぴ成熟榭状細胞から分泌された MM P— 9のタンパク質の分解活性を調べた。図 5に示すように、ゼラチンザィモグラフィは、低酸素状態下で分化した樹状細胞よりも正常酸素状態で分化した樹状細胞の方がより高いレベルで p r o— MMP— ⁹を分泌したことを示している。 MMP— 9タンパク質の活性形態は、正常酸素状態で分化した榭状細胞にのみ分泌された。これらの結果は、低酸素状態で分化した樹状細胞が正常酸素状態で分化した榭状細胞よりもタンパク質分解活性が低いことを示している。実施例 6 '

実施例 1で得られた未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を、低酸素状態及び正常酸素状態で分化し、それぞれの細胞中の MM P— 9の特異的阻害剤である、 T IMP 一 1、 T I MP— 2及び T IMP— 3の発現をリアルタイム P CR法により調べた。方法は実施例 3と同様に行った。 T I MP— 1のプライマーとしては配列番号 3及ぴ配列番号 4に示すものを、 T IMP— 2のプライマーとしては配列番号 5及び配列番号 6に示すものを、 T I MP— 3のプライマーとしては配列番号 7及び配列番号 8に示すものを用いた。

結果を図 6に示す。図 6は、リアルタイム P CRの結果を示す図である。図 6に示すように、 T I MP— 1は低酸素状態で分化した樹状細胞において、正常酸素状態で分化した樹状細胞よりも高いレベルで発現した。 T I MP— 2及び T I MP— 3は、正常酸素状態及び低酸素状態の両方で培養された榭状細胞において同レベルで発現した。 T I MP— 1は、 MMP— 9の特異的阻害剤であるから、この結果は、低酸素状態で分化した樹状細胞が正常酸素状態で分化した樹状細胞よりも低いタンパク質分解活性を有することを示す。実施例 7

T r a n s we l l Ch amb e r法を用いて上室と下室をくぎるメンプレン上にマトリゲルを固相化し、洗浄後、上室に樹状細胞を入れ、下室には未成熟樹状細胞の場合にはリコンビナントヒト RANTE Sを 1 00 n g/m 1入れ、成熟榭状細胞の場合にはリコンビナントヒト MCP— 3を 1 00 n g/m 1入れ、下室に移動してきた細胞数を計測し、樹状細胞の浸潤能の活性を測定した。

結果を図 7に示す。図 7は未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能の活性を測定した結果を示すグラフである。図 7に示すように、未成熟榭状細胞及び成熟細胞は、いずれも正常酸素状態で分化した方が、低酸素状態で分化したものよりも高い浸潤能の活性を有していた。実施例 8

T I MP- 1タンパク質による浸潤能活性の低下を調べるため、実施例 7で行つた系に T I MP- 1タンパク質を 1 0 n g/m 1加えて同様に試験を行った。

結果を図 8に示す。図 8は、 T I MP— 1タンパク質による榭状細胞の浸潤能活性の変化を調べた結果を示すグラフである。図 8において、 +は T IMP— 1タンパク質を加えた場合の結果であり、一は T I MP— 1タンパク質を加えない場合の結果である。図 8に示すように、正常酸素状態で分化した未成熟樹状細胞及び成熟榭状細胞の浸潤能活性は、 T I MP— 1タンパク質によって低下することがわかる。これに対し、低酸素状態で分化した未成熟榭状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能活性は T I MP— 1タンパク質によって変化しなかった。実施例 9

実施例 1で得られた成熟樹状細胞を、全トランスレチノイン酸を培地に 1 濃度になるように添加し、 3日間培養するカ全トランスレチノイン酸を培地に 5 Μ濃度になるように添加して 1 日培養し、次いで全トランスレチノイン酸を培地に 1 濃度に添加して 2日培養して、榭状細胞の分化を行った。分化誘導後、細胞中の ΜΜΡ— 9の mRNA濃度を測定した。結果を図 9に示す。図 9に示すように、 MMP— 9の mRNA濃度は、培地中に全トランスレチノイン酸を添加することにより上昇した。実施例 1 0

実施例 1で得られた成熟榭状細胞を、全トランスレチノイン酸を培地に 1 μΜ濃度になるように添加して培養を行い分化誘導を行った。次いで、実施例 7と同様に操作を行い、樹状細胞の浸潤能の活性を測定した。結果を図 1 0に示す。図 1 0は、低酸素下で分化した榭状細胞の浸潤能活性を測定した結果である。図 1 0に示すように、榭状細胞の浸潤能は培地中に全トランスレチノィン酸を添加することにより向上した。

以上詳述した通り、レチノイドである全トランスレチノイン酸は、樹状細胞が浸潤能を発揮するために必要な MM P— 9の産生を増大し、それにより樹状細胞の浸潤能を活性化することが見出された。この効果は、低酸素状態においても発揮され、酸素濃度が低下している癌細胞においても発揮される。従って、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物は免疫賦活化作用を発揮し、哺乳動物の免疫を賦活化するためにも用いられる。また、本発明の榭状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、動物の感染症、癌の予防 ·治療に用いることができる。

Claims

請求の範囲

I . レチノイドを含有する、樹状細胞浸潤能活性化組成物。

2 . レチノィドが、全トランスレチノール、 1 3 —シスレチノ一ル、全トランスレチノイン酸及び 1 3 _シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項 1に記載の樹状細胞浸潤能活性化組成物。

3 . 哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、樹状細胞の浸潤能を活性化する方法。

4 . レチノィドが、全トランスレチノール、 1 3—シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び 1 3 _シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項 3に記載の榭状細胞の浸潤能を活性化する方法。

5 . 哺乳動物に対して、請求項 1又は 2に記載の榭状細胞浸潤能活性化組成物を投与することを特徴とする、榭状細胞の浸潤能を活性化する方法。

6 . レチノイドを含有する、免疫賦活剤。

7 . レチノイド及び榭状細胞を含有する、免疫賦活剤。

8 . レチノィドが、全トランスレチノ一ル、 1 3 —シスレチノ一ル、全トランスレチノイン酸及び 1 3—シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項 6又は 7に記载の免疫賦活剤。

9 . 哺¾動物細胞に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法。

1 0 . 哺乳動物に対して、請求項 6〜 8のいずれか 1項に記載の免疫賦活剤を投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法。

I I . レチノィドが、全トランスレチノ一ル、 1 3 —シスレチノ—ル、全トランスレチノイン酸及び 1 3—シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項 1 0 に記載の哺乳動物の免疫を賦活化する方法。

1 2 . 請求項 1又は 2に記載の榭状細胞浸潤能活性化組成物、又は請求項 6〜 8 のいずれか 1項に記載の免疫賦活剤を、投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防 ·治療方法。