WO2004106548A2 - Verfahren zur snp-analyse auf biochips mit oligonukleotid-arealen - Google Patents

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WO2004106548A2
WO2004106548A2 PCT/EP2004/006002 EP2004006002W WO2004106548A2 WO 2004106548 A2 WO2004106548 A2 WO 2004106548A2 EP 2004006002 W EP2004006002 W EP 2004006002W WO 2004106548 A2 WO2004106548 A2 WO 2004106548A2
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molecule
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Dirk Fischer
Jörg GEISTLINGER
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Array-On Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for the multiparallel detection of nucleotide polymorphisms on a polydimensional array. Furthermore, the invention relates to a method for the detection of many individual nucleotide polymorphisms, the nucleotide polymorphisms of multiple individuals on the array being able to be detected multiparallel.
  • the hybridization of one probe molecule each with one sample molecule in each case takes place in a hybridization field on the array, which is separated from surrounding hybridization fields.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • An SNP is a single DNA base exchange or an insertion / deletion of individual bases in a specific position within a genomic section, such as a gene. For example, some individuals in a population may have base adenine, while other individuals may have base cytosine in the same location within a gene. It is believed that more than 5 million of such SNPs exist in the human genome, whose allele with the rarer nucleotide occurs in more than 10% of the individuals examined. Around 90,000 of these are said to be located in protein-coding regions, which makes these SNPs particularly interesting with regard to medical and pharmacological issues. If you look at several SNPs in an individual, this offers the possibility of creating a genetic fingerprint for the individual concerned.
  • SNPs DNA microarrays specially designed for SNP analysis.
  • the Analysis of SNPs is generally useful for answering molecular genetic questions. For example, the result of an SNP analysis can provide valuable information about an individual's predisposition to a particular disease. In this way it is possible to estimate how the patient will react to a certain class of active ingredient before medication to a patient.
  • SNP analysis is not only of particular interest for medical genetics and pharmacogenetics, the determination of whether a certain SNP and thus a certain property is present or absent in an individual is general for them Characterization of individuals, be they human, animal, vegetable or microbial, useful. For example, SNP genotyping has been an integral part of modern plant breeding for several years.
  • the SNP analysis is now routinely carried out, particularly in the field of biomedicine, and is offered as a service by appropriately oriented companies. Suitable reaction kits from various providers for SNP analysis are already available on the market, but not for arrays.
  • oligonucleotides which are arranged on the chip in the form of a so-called array, i.e. a predetermined arrangement, in order to detect individual base polymorphisms in a DNA sample to be examined either by hybridization or by hybridization followed by a DNA polymerase Detect dependent primer extension of the arranged oligonucleotides.
  • the probe is the respective oligonucleotide arranged and fixed on the chip in a specific position, while the nucleic acid molecules to be examined in the sample are in the form of a hybridization solution.
  • This solution is brought into contact with the chip and incubated, as a result of which the DNA molecules of the sample contained in the solution find their suitable hybridization partners, namely the oligonucleotide probe suitable for the respective molecule, on the surface of the biochip and hybridize with them.
  • DNA chip biochip and (micro) array are often used interchangeably, as is also the case in the present application.
  • microarray simply means that molecules are arranged in a high density at certain positions within an array or raster.
  • microarrays can have up to several hundred thousand positions (often referred to as spots) on a support or matrix.
  • the chip is the actual array substrate, i.e. the carrier of one or usually many microarrays.
  • Slides or other substrates made of glass and wafers are used.
  • sample molecules or loci to be examined must be from the same individual originate, since when two or more individuals or their samples are used, cross-hybridization of the homologous sample molecules would automatically take place with the same probe and the signals would thus no longer be distinguishable and assignable.
  • a typical example of such methods is the use of microarrays for the detection of microorganisms in samples in biomedical diagnostics.
  • rRNA ribosomal RNA
  • These species-characteristic sequences are applied to a microarray in the form of single-stranded DNA oligonucleotides.
  • the target DNA molecules to be examined are first isolated from the sample to be examined and provided with fluorescent markers.
  • the labeled target DNA molecules are then incubated in a solution with the probes applied to the microarray, interactions which occur unspecifically are removed by appropriate washing steps and specific interactions are detected by fluorescence-optical evaluation.
  • the object of the invention is therefore to make the parallel analysis of several nucleic acids possible simultaneously and comparably on an array by hybridization, the sources of error (e.g. cross-hybridization) being eliminated as far as possible and no high demands being placed on the analysis parameters such as e.g. B. Sample concentration can be provided.
  • sources of error e.g. cross-hybridization
  • sample concentration can be provided.
  • the invention is based on the fact that in separate hybridization fields on the biochip only one sample molecule (in the sense of a certain nucleic acid sequence) hybridizes with a complementary probe molecule immobilized on the chip (in the sense of a certain nucleic acid sequence).
  • a locally targeted hybridization takes place, in which undesired hybridization reactions are excluded by the spatial distance of the individual hybridization fields and areas from one another and by optional drying of the hybrids formed.
  • the methods of the prior art also require that the sample molecules of a single individual are pooled in the hybridization solution and the hybridization solution is brought into contact with the chip on which the oligonucleotide probes are arranged, which leads to different sample molecules of an individual have to find their hybridization partner under numerous probes, which is particularly problematic when the number of loci analyzed increases.
  • the invention is based on the fact that no sample pool is brought to hybridization with the respective probe, but rather each individual sample molecule (in the sense of a specific nucleic acid sequence) is hybridized exclusively with the probe molecule complementary to it in a separate hybridization field.
  • hybridization In this way, hybridizations with other sample molecules (in the sense of a specific nucleic acid sequence) (cross hybridization) are prevented.
  • the hybridization therefore takes place in a targeted manner between a sample molecule and the complementary probe molecule without the different sample molecules being able to mix.
  • the hybrid of the probe molecule and the sample molecule is formed individually for each locus to be examined and each individual to be examined.
  • the hybridization takes place in hybridization fields on the chip that are spatially separated from one another. The fact that the position of the oligonucleotide probe was determined beforehand enables the hybrid formation of the probe and sample to be reliably established.
  • the hybrids formed can be stabilized by adding, for example, spermidine or polyethylene glycol or preserved under alcohol.
  • the stabilization of the hybrid structure i.e. the cohesion of the single strands in the double strand, is also supported by drying, that is to say by reducing the volume.
  • the hybrids of oligonucleotide probe and sample molecule are dried in order to obtain further protection against the mixing of the different sample molecules. These dried hybrids are rehydrated as part of the detection reaction.
  • the hybridization areas are additionally separated from one another by applying a separating matrix made of plastic, which can be removed again before the detection reaction.
  • the method according to the invention for SNP detection can in principle also be extended to other microarray-based detection methods.
  • the target molecules amplified by PCR can also be hybridized on the chip with a microorganism-specific rDNA probe without the target molecules mixing.
  • competition reactions from different probes for targets can be eliminated in a simple manner and cross-hybridizations can be avoided.
  • hybridization can also be carried out more efficiently, which leads to better signal-to-noise ratios in the evaluation.
  • problems that arise due to the simultaneous diffusion of many targets to many probes in evaluations according to the prior art are eliminated.
  • mRNA ie the expressed genetic information
  • mRNA is first quantitatively converted into corresponding cDNAs by reverse transcription.
  • an amplified cDNA with a probe in each case can then spatially in a method according to the invention by hybridization defined hybridization field and evaluation of the hybridization can be concluded on the gene activity of the respective cell etc.
  • single-stranded mRNA e.g. of highly expressed or strongly induced genes
  • probe molecules used directly as a sample molecule and hybridized with the probe molecules in order to examine the expression of these genes.
  • the use of the method according to the invention for analyzes at the RNA level is therefore expressly provided.
  • the invention thus relates to a method for the detection of nucleic acids, comprising the following steps in the order given:
  • the hybrids forming in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field.
  • the hybrids which form in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field, a separation matrix being applied between the individual hybridization areas and separating the hybridization areas from one another.
  • the method of the invention is suitable for the parallel detection of e.g. several sample molecules in a mixture, for the parallel detection of several organisms, preferably microorganisms in one sample, for analyzing the
  • Gene activity of several genes of an organism or e.g. a cell or to detect the expression of a gene is also possible.
  • the invention relates to a method for detecting a nucleotide polymorphism (SNP), comprising the following steps in the order given:
  • the hybrids forming in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field.
  • the hybrids forming in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field, a separation matrix being applied between the individual hybridization areas and separating the hybridization areas from one another.
  • the method of the invention is thus suitable for the detection or genotyping of the presence, absence or identity of an individual nucleotide polymorphism in a specific position within the genome of an individual.
  • several to many individuals are examined simultaneously on a common support for a specific nucleotide variation.
  • a very large number of individuals are particularly preferably examined simultaneously with regard to a few nucleotide variations.
  • the method of the invention is also suitable for the detection or genotyping of the presence, absence or identity of insertions or deletions of one or more bases in a specific position within the genome of an individual.
  • the invention further relates to a method for multiparallel SNP analysis of several individuals and several loci in the genome of an individual, comprising the following steps in the order given:
  • Nucleic acid molecules the sequence of which represents a specific locus in the genome of an individual, in hybridization areas with a minimum size of 0.5 mm on a support, b) mixing and hybridizing in each case a specific probe molecule in a spatially defined hybridization field within the
  • Hybridization areas each with a second single-stranded nucleic acid molecule (sample molecule) which has the SNP to be detected and whose sequence is at least partially complementary to that of the probe molecule, so that the two nucleic acid molecules can hybridize with one another at least via the complementary sequence, sample molecules of the same locus being located within a hybridization area , but of different origins in different hybridization fields can hybridize with the same probe molecule, c) enzymatic template-dependent extension of the probe molecule, which acts as a primer within the hybrid, with the incorporation of a nucleotide or analog leading to chain termination, whereby probe molecules, each having different loci represent, and sample molecules from several individuals are used for parallel analysis.
  • the hybrids forming in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field.
  • the hybrids which form in a hybridization field are dried during or before the probe and sample molecule are brought into contact with one another in the adjacent hybridization field, a separation matrix being applied between the individual hybridization areas and separating the hybridization areas from one another.
  • each hybridization area only one sample molecule is hybridized in each hybridization area with the probe molecule present in the area, it being possible for each area to be spatially delimited from the other areas by a separation matrix.
  • probe molecules which each represent different loci of different individuals, can also be used for parallel analysis.
  • locus is understood to mean a genomic section in which the genetic polymorphism to be examined, such as e.g. the SNP, the insertion or deletion, lies.
  • immobilization refers to the process by which a molecule is carried on or on a solid support stabilized layer or surface is applied by covalent or non-covalent interaction such that the molecule can no longer move freely on the support or diffuse away from the support in solution.
  • the immobilization of the probe molecules in areas creates a flat coating with the oligonucleotide probe in the context of the present invention.
  • carrier refers to devices on which molecules can be applied by covalent or non-covalent interactions.
  • carrier or substrate for nucleic acid molecules come e.g. Slides or others
  • Materials made of glass, plastic, ceramic or metal which can be coated planar, two-dimensional, three-dimensional or spherical, as well as wafers. Three or four dimensional coatings for substrates are commercially available e.g. under the names CodeLink Bioarray (from Amersham Pharmacia) or MGX TM 4D-Array (from Metrigenix).
  • the different hybridization areas are separated from one another by a separation matrix made of chemically inert material, in contrast to supports with wells (wells) or other depressions, as are known in the prior art.
  • hybridization area refers to the area of the chip in which an oligonucleotide probe of a certain sequence has been arranged and immobilized.
  • a chip preferably contains a maximum of 192 areas, particularly preferably a maximum of 96 areas, particularly preferably a maximum of 48 areas and most preferably a maximum of twelve areas
  • the area of the areas is at least 0.5 mm, preferably it is at least 4 mm, particularly preferably it is at least 16 mm and most preferably it is at least 256 mm within these areas, several hybridizations can be spaced apart from one another Hybridization fields take place.
  • the localization on the carrier, the matrix or the substrate takes place in a defined spatial arrangement, this arrangement is often also referred to as an array.
  • a specific position of the array, in this case the hybridization field, is usually also referred to as a spot.
  • chip usually denotes the arrangement of a molecule in array format on a carrier.
  • the height of the separation matrix is preferably 0.2 to 2 mm, particularly preferably 0.8 to 1.8 mm and most preferably 1.2 to 1.6 mm.
  • the detection of an SNP in a sample molecule hybridized with the probe and immobilized on a support can be carried out by various detection methods familiar to the person skilled in the art.
  • the most established and most frequently used method for the detection of SNPs in sample-probe hybrids is the so-called primer extension.
  • the primer extension i.e. the extension of the probe molecule serving as a primer in a template-dependent manner, the sample molecule being the template, can be carried out in a conventional manner, as described, for example, in EP 0648 280 B1, EP 0 705 349 B1 and WO 98 / 59066 AI. Reference is hereby expressly made to the disclosure of primer extension contained in these documents.
  • primer molecules which have a polynucleotide sequence complementary to one or more nucleotide sequences of a genomic DNA segment of an individual, the genomic segment being immediately 3 ′ distal to an SNP , Y, is localized by template-dependent extension of the nucleic acid primer molecule by a single nucleotide or nucleotide analog R which is complementary to the nucleotide Y of the SNP allele.
  • the template-dependent extension of the primer which is often referred to in the art as an intergration primer, in the presence of one or more dideoxynucleoside triphosphate derivatives or analogs selected from the group consisting of ddATP, ddTTP, ddCTP and ddGTP, or other base analogues leading to chain termination, but in the absence of dATP, dTTP, dCTP and dGTP instead, the non-renewable dideoxynucleotide triphosphate derivative can be detected in the position of the SNP and thus the SNP itself in a conventional manner.
  • the step of primer extension which enables SNP detection directly, has been described many times in the prior art and can also be carried out by a person skilled in the art using reagents and reaction kits available for this purpose on the market.
  • the oligonucleotide which is used as a probe molecule for the formation of the hybrid of probe molecule and sample molecule, usually also represents the primer, which, depending on the polymerase, extends the nucleotide in question by the nucleotide in question, which corresponds to the SNP allele becomes.
  • detection methods known to the person skilled in the art for detecting the SNPs in the hybrid are e.g. the allele-specific primer extension (see below), the allele-specific hybridization (see below) and the mass spectrometry.
  • this analysis can be carried out by the user himself, by prefabricated chips, which carry the probe molecules immobilized in hybridization areas and possibly a removable separation matrix, are hybridized by the user himself with his previously amplified sample molecules and the polymorphism is detected.
  • This is made possible by spatially separated hybridization fields, which allow the sample molecules to be applied to the chip using a handheld pipette or a pipetting robot, without these mixing up and resulting in cross-hybridizations. This makes it possible for the user to be inexpensive, time-saving and reproducible perform the analysis of a large number of individuals yourself.
  • the method according to the invention also enables a certain degree of automation, since the probe molecules can be applied to the matrix with a microarray or pipetting robot in hybridization areas and the sample molecules not necessarily with a handheld pipette, but also with a pipetting or a microarray robot can be placed in any hybridization field. Up to now, such automation was only possible if the poly-dimensionality was lost.
  • the sample nucleic acid here also called the target nucleic acid or target nucleic acid, which is suspected to contain the variable nucleotide residue, i.e. the SNP, and which should therefore be analyzed for this, can be a human, animal, vegetable act fungal or microbial nucleic acid (DNA or RNA).
  • the sample nucleic acid can be isolated from biological samples using conventional nucleic acid purification methods, or can also be present in an unpurified form within a biological sample.
  • RNA can first be transcribed into a cDNA by reverse transcription, which is then again used as a template in e.g. can serve a PCR.
  • PCR-independent enrichment steps can also be carried out, which are based, for example, on affinity chromatography, NAT (Nucleic Acid Amplification Testing), Ampliphi or Genomiphi amplification techniques (see product information from Amersham Pharmacia) or magnetic microparticles (eg Dynabeads TM).
  • Samples that are not purified, enriched or amplified can also be used under certain circumstances, but later require an amplification step for the fluorescence signals (signal amplification). For more effective hybridization of the sample and probe molecule, it is advantageous if the sample molecule is single-stranded.
  • primer modifications are e.g. B. 5'-PTO (5'-phosphoro-thioate nucleotides), in which the phosphate groups 5 '-terminal nucleotides of the primer are replaced by phosphoro-thioate groups.
  • modified primers are not degraded by the T7 Gen 6 5'-exonuclease or the 5'-exonuclease of the lambda phage.
  • other 5 'protecting groups or PNA (peptide nucleic acid) primers can also be used to protect the hybridizing strand.
  • asymmetric PCR Another method for producing largely single-stranded sample molecules that is not based on modification followed by enzymatic degradation is the so-called "asymmetric PCR".
  • the primer of the required strand is added in multiple excess to the primer of the strand not required. This leads to the preferred synthesis of the strand required for the hybridization.
  • the hybridization is not hindered by the essentially non-amplified counter strand.
  • sample material does not necessarily have to be a separate single strand, but can also be obtained by denaturation and be available together with its complement. The same applies to asymmetric DNA.
  • the probe molecules are oligonucleotides or polynucleotides, which due to their nucleotide sequence can hybridize with sample molecules present in the sample.
  • the molecules can be DNA or RNA.
  • the probe molecules can be made using techniques well known in the art. They can also be obtained from suppliers who commercially produce oligonucleotides and polynucleotides.
  • the probe molecules are usually artificially synthesized single-stranded oligonucleotides which, if the primer extension is used as the detection method, end with their last 3'-nucleotide directly in front of the polymorphic position in the sequence of the individual to be examined. They are complementary to at least part of the protected amplified PCR strand in order to guarantee the matching of probe and sample. Furthermore, the extension primers have a modification at their 5 'end, with which they are bound to the chip surface, via which the binding takes place.
  • the modification is a so-called spacer (placeholder; mostly 6 to 24 C atoms; but also polyA or polyT spacers are known), at the end of which is remote from the primer there is an amino modification ,
  • This amino group reacts under UV Irradiation with the epoxy coating of the chip and thus chemically covalently binds the probe molecule to the coating.
  • the support is provided with a three-dimensional layer, such as the CodeLink bioarray from Amersham Pharmacia, a spacer may also be dispensed with and the modification may be applied directly to the probe.
  • the probe molecules represent the so-called interrogation primers, also called detection step primers in the prior art, which are extended by primer extension through the activity of a polymerase in a template-dependent manner.
  • the primer ie the probe molecule, is complementary to the nucleotide sequence 3 'of the variable nucleotide (SNP) in the associated sample molecule.
  • the primer which thus acts as the starting point for the template-dependent elongation by a DNA polymerase, is selected in such a way that it hybridizes with a nucleotide sequence immediately next to or in the vicinity of the variable nucleotide which is to be detected in the context of the SNP analysis .
  • the primer ie the probe molecule, can be selected so that it is complementary to either the coding or the non-coding strand of a double-stranded target molecule, depending on which strand is to be present in the hybrid of probe molecule and sample molecule ,
  • the selection of the probe molecule is determined by the nature of the nucleotide variation to be analyzed.
  • the interrogation primer is selected and produced in such a way that it lies directly next to the variable nucleotide to be detected when the hybrid has formed from the primer and the sample molecule.
  • the interrogation primer is selected such that it hybridizes n nucleotide residues to a probe molecule away from the SNP to be detected.
  • the number n of nucleotide residues between the 3 'end of the primer and the variable nucleotide it should only be noted that there is no nucleotide residue within the n nucleotide residues that is identical to the nucleotide to be detected.
  • the single-stranded extension primers used can themselves have hybrid nature in the simia that they are complementary only in their 3 'area of the sample, but in their 5' area they have additional sequences (again approx. 20 bp) that only go to the PCR primers used are complementary (artificially complementary sequences).
  • a so-called address system can be set up which supports hybridization and strengthens the nucleotide pairings (due to the increased amount of hydrogen bonds).
  • oligonucleotides synthetic probe molecules
  • the immobilization of oligonucleotides (synthetic probe molecules) on biochips is largely standardized.
  • the cheapest alternative is amino-modified probes that react with the epoxysilane (3-glycidoxypropyltrimethoxysilane) coated surface of fluorescence-free microscope slides.
  • Other coatings and associated modifications of the probes are commercially available. These coatings include e.g. Aldehyde, aminosilane (3-aminopropyltrimethoxysilane), polylysine or isothiocyanate coatings.
  • the substrates mentioned preferably react with amino groups at the end of the spacers of probe molecules or the probe molecules themselves. Another alternative would be a hybrid bond via the biotin-streptavidin system. It is clear to the person skilled in the art that the functional groups of the coatings and the linker could also be interchanged accordingly.
  • the chemical bonding of amino groups of the probe molecules and epoxy groups on the chip is done by simple UV crosslinking.
  • the chips can also be incubated in a moist chamber or baked hot.
  • not only microscope slides made of glass can be surface-coated, but also other materials, primarily plastic or ceramic, can be used for coating.
  • the materials are typically optically transparent or mirrored.
  • the probe molecules are immobilized in surface-coated hybridization areas with a minimum size of 0.5 mm 2 , which in a preferred embodiment are separated from one another by a separation matrix.
  • this is applied to the chip before or after coating the chip with the probe molecules, so that areas separated from one another are formed on the chip, in each of which a probe molecule with a defined nucleic acid sequence is immobilized over the surface.
  • a separation matrix it can either be pressed onto the carrier in solid form or applied in liquid form in order to then allow it to harden.
  • the separation matrix can be removed again, e.g. is pulled off the chip in its entirety with tweezers. This enables a common detection reaction for all hybrids.
  • hybridization means that two strands of nucleic acid molecules form hydrogen bonds in a sequence-dependent manner.
  • complementary nucleotide sequences can hybridize with one another to form double-stranded DNA or RNA, or a double-stranded hybrid of RNA and DNA. See also Sambrook et al., Vide supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989); or Higgins and Hames, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, EAL Press Oxford, Washington DC (1985), which are expressly attached here for reference.
  • hybridization means the formation of double-stranded nucleic acid molecules from complementary single-stranded nucleic acid molecules, the complementarity resulting from the base sequences of the single-stranded molecules.
  • the double-stranded nucleic acid molecules can e.g. are DNA-DNA, DNA-RNA or RNA-RNA duplex molecules. Hybridization experiments are usually used to demonstrate complementarity between different single-stranded nucleic acid molecules.
  • annealing is the process in which two single-stranded nucleic acid molecules are attached to one another due to their base complementarity, interact with one another and form double-stranded structures or a double-stranded helix or a duplex.
  • the interaction between the single-stranded nucleic acid molecules is based on the hydrogen bond between complementary base pairs in the individual strands. In this way, double-stranded DNA-DNA helices, DNA-RNA helices or RNA-RNA helices can be formed.
  • a hybrid is referred to as a double-stranded nucleic acid molecule, the single strands of which come from different nucleic acid molecules and which is formed by forming a hydrogen bond between these complementary single strands.
  • the individual sample molecules that are single-stranded by the 5'-exonuclease treatment are preferably synthesized with the appropriate single-stranded with the help of a microarray robot Probe molecules in spatially defined hybridization fields within the hybridization areas brought into contact on the chip.
  • the hybrids that form are dried by allowing the reaction liquid to evaporate slowly. This can be done under normal conditions, by gentle heating (25 to 45 ° C) or by vacuum application.
  • the aforementioned primer extension that is to say the enzymatic extension of the primer, which preferably represents the probe molecule, takes place in a template-dependent manner.
  • the primer extension is generally carried out as described in the prior art, it being possible to use commercially available enzymes, reagents and kits.
  • a dried hybrid is rehydrated by adding the extension mixture.
  • the probe-sample hybrid is contacted with one or more nucleoside triphosphates, including at least one labeled or modified nucleoside triphosphate, together with a polymerizing agent under conditions that favor extension of the primer.
  • a polymerizing agent Either labeled deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) or labeled chain-terminating dideoxyribonucleoside triphosphates (ddNTPs) can be used.
  • the polymerizing agent will extend the primer with the nucleoside triphosphate complementary to the variable nucleotide next to the primer.
  • labeled nucleoside triphosphate includes any nucleoside triphosphate, deoxy or dideoxynucleoside triphosphate which is provided with a detectable label or which is modified such that it comprises a group or a residue which is capable of a detectable label to tie. It does not matter in the context of the invention which marker is used for the detection. However, different markers naturally differ in terms of their manageability, their cost and their sensitivity. It is important, however, that the detectable marker does not hinder or make incorrect the incorporation of the labeled nucleoside triphosphate during the polymerization reaction, which leads to the extension of the primer.
  • cyanine e.g. Cy3 or Cy5
  • Renaissance e.g. ROX or Rl
  • fluorescein dyes e.g. FAM or FITC
  • Radioactive labels such as P 32 , the biotin-streptavidin system or antigen-antibody systems which are coupled to enzymes such as horseradish peroxidase can be used as alternative labels.
  • the detection can be carried out with different numbers of labeled nucleotides or nucleotide analogs.
  • Fluorescence markers are usually used as markers (see above), usually either 2 or 4 labeled nucleotides or analogs being used. Accordingly, one speaks of the 2-color and 4-color approach.
  • probe extension protocols are also used.
  • a very important method is the allele-specific primer extension. The most important difference from that already shown The method can be seen in the probes used.
  • the 5'-amino-modified probe molecules are designed in such a way that they do not end a nucleotide 3 'before the polymorphic position, but with their last 3' nucleotide they lie exactly on the polymorphic position.
  • 4 probes of identical sequence are required for each locus to be analyzed, which differ only in the last 3 'nucleotide (the SNP nucleotide).
  • extension primers After application to four different areas and hybridization with the sample molecule in the four different hybridization areas, only one of these 4 extension primers is extended during the extension reaction, namely the one with the complementary SNP nucleotide at its 3 'end. The other 3 extension primers are not extended either because the last 3 'nucleotide cannot pair with the sample molecule (extension does not occur).
  • dNTPs nucleotides A, C, G and T
  • the identity of the SNP nucleotide is determined by which of the 4 extension primers emits a fluorescence signal, ie which carries the correct nucleotide in the last 3 'position.
  • the specificity of the hybridization is regulated via so-called swj ⁇ tc / z oligonucleotides (WO89 / 10977; Southern et al. (1992), Genomics, 13, 1008-1017). Up to 20 oligonucleotides are required per locus to be analyzed (due to permutation of the mismatch positions).
  • This detection method is also suitable for the method according to the invention.
  • Insertion or deletions can also be detected by primer extension analysis.
  • the deletion it should be noted that the first base in the deletion is not identical to the first base after the deletion.
  • the first base of the insertion is not identical to the first base after the insertion.
  • polymerizing agent stands for any enzyme that is capable of extending nucleic acids in a template-dependent manner. Suitable enzymes include e.g. Sequenase, T7 DNA polymerase, T4 DNA polymerase, the Klenow fragment of DNA polymerase from Escherichia coli and other suitable DNA polymerases, reverse transcriptase and polymerases from thermophilic microorganisms such as Thermos aquaticus and Thermos thermophilus.
  • the polymerizing agent is Sequenase TM.
  • the hybrids for the template-dependent primer extension are firmly bound in array format on the chip surface and can also be stored in the dried state.
  • the implementation of the multiparallel primer extension in which thousands of analyzes in e.g. 50 ⁇ l volume can be carried out on the chip represents an effective rationalization and cost reduction process. If the extension were carried out in the MTP, much larger amounts of expensive reagents such as Sequenase TM and fluorescence-labeled ddNTPs would have to be used.
  • the extension on the biochip begins by bringing the array and extension solution into contact in an evaporation-proof chamber on the chip.
  • the reaction mixture which contains, for example, 0.2 units of Sequenase TM per ⁇ l and 6-8 ⁇ M fluorescence-labeled ddNTPs in a reaction buffer supplied with the Sequenase TM, and the array are kept for approx. 1 h at the optimum temperature for the polymerizing agent used under these circumstances, which, however, should not be higher than 5 ° C below the melting temperature of the area complementary between the probe molecule and the sample molecule, and the primer extension is carried out.
  • the extension solution can contain all four ddNTPs or analogues labeled with four different dyes, or only two ddNTPs labeled with different dyes, since SNPs are often binary markers and in many applications the aim is only to determine which of the two possible nucleotide states is present. Since the labeled ddNTPs are firmly attached to the extension primer (probe molecule) by the polymerizing agent and the probe is firmly attached to the support (the chip), the attached ddNTP is also irreversibly bound to the chip.
  • Excitation / detection system that analyzes the fluorochromes, typically a resolution of 2 ⁇ m and a sensitivity of 0.5 fluorochromes per ⁇ m.
  • two (or four) fluorochrome types are chosen whose excitation or emission wavelengths are as far apart as possible.
  • Cy5 is excited at 650 nm and emitted at 667 nm (filter 675 nm ⁇ 10)
  • Rl 10 is excited with a 488 nm laser and emitted at 525 nm (filter 512nm ⁇ 15). This ensures that the signals of the two dyes do not overlap, since they can be clearly separated from one another by the corresponding filter systems.
  • the analysis program compatible with the scanner recognizes the wavelength (color) and intensity of each sample point and stores the results directly in a database. As already stated, several genomic loci of several individuals can be detected simultaneously in the method according to the invention.
  • probes which can each be used for the detection of different genomic loci and which have been immobilized in different hybridization areas, are hybridized with the complementary sample molecule in each case on the carrier of the chip in hybridization fields within the hybridization areas, which are at a distance from one another.
  • a maximum of 192 different probes preferably a maximum of 96 different probes, particularly preferably a maximum of 48 different probes, particularly preferably a maximum of different probes, most preferably a maximum of twelve different probes are immobilized on the carrier.
  • the maximum number of probes that can be applied to an array is determined by the synthesis method of the array and the minimum size of the hybridization areas.
  • the probe molecules have a length of at least 10 to 100 nucleotides, preferably of at least 15 to 75 nucleotides, particularly preferably of at least 18 to 50 nucleotides, particularly preferably of at least 20 to 40 nucleotides, likewise particularly preferably of 20 to 35 nucleotides and most preferably from at least 20 to 30 nucleotides.
  • the sample molecules have a length of at least 40 to 500 nucleotides, preferably of at least 50 to 250 nucleotides, particularly preferably of at least 50 to 150 nucleotides, particularly preferably of at least 50 to 100 nucleotides and most preferably of at least 50 to 90 nucleotides.
  • at least 48 different individuals preferably at least 150 different individuals, particularly preferably at least 625 different individuals, likewise particularly preferably at least 1250 different individuals, particularly preferably at least 2500 different individuals and most preferably at least 5000 different individuals, are examined on the carrier ,
  • At least 48 different individuals preferably at least 150 different individuals, particularly preferably at least 625 different individuals, likewise particularly preferably at least 1250 different individuals, particularly preferably at least 2500 different individuals, most preferably at least 5000 different individuals with respect to a maximum of 192 different loci, are used in the method , preferably a maximum of 96 different loci, particularly preferably a maximum of 48 different loci, particularly preferably a maximum of 24 different loci and most preferably a maximum of twelve different loci examined in parallel.
  • SNPs genetic polymorphisms
  • SNPs genetic polymorphisms
  • These include e.g. Microorganisms, preferably E. coli and / or human pathogens
  • Microorganisms fungi, preferably Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe and / or phytopathogenic fungi, rats, cattle, mice, humans or plants.
  • Useful, ornamental, food or feed plants characterized by the method according to the invention.
  • Examples of monocotyledonous plants are plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum (wheat), Seeale (rye), Hordeum (barley), Oryza (rice), Panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (corn ) and the like.
  • Dicotyledons include cotton, Legumes such as legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, potato, goat plants and trees.
  • Other useful plants can include fruit (in particular apples, pears, cherries, grapes, citrus, pineapples and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and, in the case of medicinal plants, rauwolfia and digitalis.
  • the cereals wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar beet, rapeseed, soybeans, tomato, potatoes and tobacco are particularly preferred.
  • Further useful plants can be found in US Pat. No. 6,137,030.
  • Arabidopsis are most preferably investigated according to the invention as a model system for dicotyledonous plants and rice as a model system for monocotyledonous plants.
  • One or more human individuals can be examined, for example, with regard to one or more polymorphisms, inter alia in the genes for 5-lipoxygenase or cytochrome P450, which result in a modified metabolism of active substances. This would allow the drug therapy to be individually adapted to the genotype of the individual concerned.
  • the spatially defined hybridization of one sample molecule each with one probe molecule in each case in a hybridization field can of course also be carried out for nucleic acid analogs such as PNAs.
  • the sample and probe can also be of a completely different nature, e.g. Proteins or peptides in antibody screening or carbohydrates such as sugar chains on glycoproteins for screening low molecular weight ligands (antigens) of all classes of substances.
  • the method according to the invention can thus be applied to all detection methods in which the specific interaction between two molecules (probe and sample), which have mutually complementary binding properties, is detected by hybrid formation.
  • the method according to the invention is not limited to the detection of SNPs, but can also be used to detect several species in parallel in a sample, for example by rDNA hybridization.
  • the gene activity of a cell and the expression of certain genes can also be detected by the method according to the invention.
  • the detection of the hybrids on the chip can be carried out by a number of additional detection methods which have not previously been mentioned.
  • the sample molecules can e.g. by using appropriately labeled primers already during amplification e.g. be labeled with the fluorophores already mentioned.
  • the detection method consists of determining whether labeled hybrids can be detected on the microarray. The same detection method can be used in the analysis of gene activity if appropriately labeled primers are used during the PCR amplification of the cDNA (see above). Other detection methods are known to the person skilled in the art.
  • a method according to the invention can usually comprise the following steps:
  • SNPs are determined using bioinformatics and public sequence databases. Different genome projects mean that millions of sequences of expressed genes (cDNAs) as well as entire genomes are available. In addition, there are databases (e.g. at NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) that explicitly state the position of SNPs in the genome of different organisms. Based on these SNP databases or by comparing your own sequence data with the corresponding reference sequences in publicly accessible databases, SNPs can be identified.
  • primers for a PCR are then derived, which amplify the genomic fragment which bears the polymorphism to be detected.
  • a partial area of one of the two primers must be sequence-identical to a partial area of the future extension primer (the probe) in order to guarantee the hybridization of the probe with the target with 100% certainty.
  • the primer used to amplify the strand required for hybridization can carry a modification that prevents it from being degraded by a 5'-exonuclease (e.g. a phosphoro-thioate modification).
  • Primers can e.g. with the software Primer3 (Whitehead Institute, MIT, Steve Rozen, Helen J. Skaletsky, 1996 and 1997; available at http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software /other/primer3.html).
  • a comparative sequencing of the amplified fragments can be carried out in different genetic backgrounds for verification, quality control and selection of suitable markers.
  • 5'-amino-modified probe molecules are also designed and synthesized using the Primer3 software.
  • the order is placed with well-known manufacturers such as Metabion, Martinsried, Germany.
  • the probes are selected so that they end at their 3 'end exactly one nucleotide in front of the polymorphic position of the polymorphism to be examined.
  • the single-stranded probe molecules are used to coat biochips in areas. This coating is carried out by companies that specialize in the coating of surfaces with DNA molecules, such as the RoboScreen, für, Germany.
  • epoxy-modified biochip blanks e.g. epoxy slides, from Quantifoil, Jena
  • a separation matrix e.g. B. made of silicone rubber, which additionally separates the hybridization areas from each other.
  • the different genomic loci of the various individuals to be examined are then amplified by PCR.
  • the annealing temperature of the primers is between 50 and 68 ° C, preferably between 55 and 60 ° C.
  • the size of the amplified fragments is between 40 to 500 base pairs, preferably between 50 and 250 base pairs, particularly preferably between 50 and 150 base pairs, in particular between 50 and 100 base pairs and most preferably between 50 and 90 base pairs.
  • Typical reaction conditions include:
  • the polymerase and the reaction buffer are usually obtained from Qiagen, Germany.
  • the PCR temperature protocol usually looks like this:
  • the unprotected amplified strand which carries the same sequence as the probe molecule, is then digested by an exonuclease which is selective with regard to the PTO modification, e.g. T7 Gen 6 5'-exonuclease, according to the manufacturer's instructions (Amersham-Pharmacia Biotech).
  • an exonuclease which is selective with regard to the PTO modification, e.g. T7 Gen 6 5'-exonuclease, according to the manufacturer's instructions (Amersham-Pharmacia Biotech).
  • the single-strand sample with the complementary probe oligonucleotide is then in a hybridization field of the hybridization area with the aid of a microarray (eg Microgrid® II 600, from Biorobotics) or pipetting robot (eg Hamilton Microlab® Star) or brought into contact by a hand pipette, thereby triggering the hybridization.
  • a microarray eg Microgrid® II 600, from Biorobotics
  • pipetting robot eg Hamilton Microlab® Star
  • the resulting hybrids are dried by allowing the liquid to evaporate.
  • the separation matrix After the hybridization, the separation matrix, if present, can be removed by pulling it off the carrier with tweezers without leaving any residue. This creates a single, large reaction field in which the detection reaction is carried out. If different extension mixtures are to be used in the individual areas, the separation matrix can remain on the slide. If the same extension mixture is to be used in more than one but not all areas, more than one separation matrix can be applied, with the extension being removed for some separation matrices and some remaining on the support. This enables the most cost-effective analysis possible.
  • the extension reaction on the chip is carried out with Sequenase TM and differently fluorescence-labeled ddNTPs in Sequenase TM buffer at 50-70 ° C, in any case below the melting temperature of the hybrid.
  • the chip with the reaction mixture is sealed against evaporation. This is done either by the remaining separation matrix or, if no separation matrix was used or the separation matrix was removed after hybridization, by a silicone rubber seal surrounding the slide (e.g. Casil 40 IT), which seals the slide against a lid (second slide or cover glass ) seals.
  • the SNP detection is carried out by extending the hybrid molecule on the chip surface by a fluorescence-labeled nucleotide (so-called “single base extension”), the probe oligonucleotide acting as a primer and the hybridized single-strand sample as a template. Because the nucleotides have different fluorescence labels are and no longer within the scope of
  • Extension reaction can be extended, only the nucleotide that is complementary to the respective SNP is inserted.
  • the chip is washed once with hot distilled water, which can contain up to 0.1-2% SDS and once with 1x SSC plus 0.1% SDS, with distilled water. Rinsed water and dried in a stream of nitrogen.
  • the chip is then placed in a laser scanner (e.g. GSI LS IV, GSI Lumonics or Typhoon, Amersham Pharmacia) or another scanner (e.g. StormReader, Molecular Dynamics or ImageScanner, Amersham Pharmacia ), which in a few seconds emitted the color ( Wavelength) of the extended probe molecule and determines the identity of the SNP at the respective sample point on the chip based on the measured wavelength.
  • the physical properties of the dyes are taken into account when selecting the laser / filter systems according to the manufacturer's recommendation (e.g. GSI Lumonics). The results are called the intensity values of the
  • Fluorescence (e.g. 65536 grayscale at the wavelengths of the fluorescence-labeled ddNTPs) is stored directly in a database.
  • the detection of 48 loci in 4 barley cultivars is described below.
  • the position of the primers used for PCR with respect to the sequence of one of the examined loci is shown as an example in FIGS. 1 to 3.
  • an SNP is examined for thymidine (T) and cytosine (C).
  • sequence information of 48 singular nucleotide polymorphisms (SNPs) from Hordeum vulgar L was determined using bioinformatics in EST and genomic sequence databases at the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the example locus has the accession code: gi9410596.
  • genomic PCR primers for the amplification of the sample molecule were designed. Compiling the source code under SuSE Linux, Kernel 2.4. was done according to the programmer in the documentation for the source code and from the website (http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html).
  • the genomic primers were designed in such a way that they amplify genomic fragments that carry the SNPs to be examined ( Figure (Fig.) 1, gray background Y). One of the two primers bears phosphorothioate binding modifications at the 5 'end and the other, unmodified primer corresponds in sequence to the later extension primer (probe, Fig. 3 and 4
  • oligonucleotide in
  • PBox in order to guarantee error-free hybridization of the probe from the 3 'end with the then single-stranded PCR fragment after the amplification.
  • the reverse primer (PTO primer) which forms the hybridizing half-strand, requires a modification in order to protect it from degradation by a 5 'exonuclease.
  • a comparative sequencing (ABI Sequencer 3700, Rhodamine Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) was then carried out on the amplified PCR fragments, each with one of the two PCR primers in different genetic backgrounds for verification, quality control and selection of suitable markers.
  • probe molecules were designed that end 3 'exactly one nucleotide before the polymorphic position (software Primer3, see above; Figs. 3 and 4,
  • the synthesis of the probes was carried out at the
  • the probe molecules carried an NH 2 group which was coupled to the probe via a C 1 spacer. These probe molecules were used to produce 48 oligonucleotide areas with an area of 16 mm 2 and a distance of 1 mm. For this purpose, a solution of at least 500 fmol / ⁇ l of the Cn-amino-modified oligonucleotide was used in order to ensure that the binding frequency of one of 1000 oligonucleotide molecules is sufficient to achieve the
  • Detection limit of the fluorescence reader (GSI scanner IV, Packard Bioscience). This solution was applied to the slide (s) using a microarray robot using 50% QMT TM buffer (from Quantifoil, Jena) in points of approximately 150 ⁇ m in diameter at a distance of 100 to 150 ⁇ m, so that the drops settled could combine and a continuous coating in square areas (a) was achieved (Fig. 5/1). As a result, a density of the probe molecules of 0.5 to 5 molecules per ⁇ m 2 was achieved.
  • the epoxy group of the chip reacts covalently with the 5'-amino groups on the Ci 2 spacer of the probe molecules and thereby fixes them on the chip surface.
  • the lattice-shaped trerm matrix (g) was applied (from the transparent and thermostable elastomer C ASIL 401 T; from the
  • Hybridization areas (a) were additionally separated from each other (Fig. 5 / II).
  • the 48 PCR fragments were then amplified from genomic DNA from the 4 cultivars.
  • An example of genomic primers at the locus is given in Fig. 2.
  • the annealing temperature was 51 ° C.
  • the amplified fragment size was 174 base pairs.
  • the PCR was carried out according to the instructions of the Polymerase manufacturer (Qiagen GmbH, Germany) according to the following protocol:
  • the amplified PCR fragments were then precipitated by adding 2 volumes (vol) of pure ethanol and 1/10 vol 3 M sodium acetate pH 4.5 at 4 ° C, and centrifuged at 14000 ⁇ m and 4 ° C for 45 min. The precipitate was then washed twice by adding 70% ethanol and again in between
  • the 5'-ex nuclease was inactivated by heating for 20 min at 85 ° C.
  • the solution with the single-stranded sample molecule in the exonuclease buffer was mixed with polyethylene glycol (with a degree of polymerization of 3000-5000 subunits) to a final concentration of 0.2%.
  • the extension reaction took place at 50 ° C for 1 h in the evaporation-proof chamber construction of the thermal cycler in situ PCR System 1,000 (Perkin Elmer in situ PCR System 1,000 plus accessories).
  • the evaporation-proof chamber construction results from the fact that the remaining separation matrix (g) seals the slide (s) against a second slide, which serves as a lid (d) (Fig. 5 / IV).
  • the lid was placed on one side of the separation matrix and the extension mixture without air bubbles and fixed with a clamp (AmpliCover Clip, PerkinElmer).
  • Fig. 4 shows the extension reaction for the described SNP Y.
  • the chip was then chilled on ice for 5 seconds and immediately after opening the
  • the chip was analyzed using the GSI LS IV laser scanner (from GSI Lumonics). For this purpose, the sample points were excited with the now fluorescence-labeled extended extension primers with monochromatic light at 488 nm and 650 nm and the emitted light at 525 nm and 667 nm measured and registered. The physical properties of the dyes were selected when selecting the laser / filter systems and the laser energies based on the recommendation of the device manufacturer (Manual from Genomic Solutions, USA) considered. The color (emitted wavelength of the fluorescence-labeled nucleotide) of the extended probe molecule and thus the identity of the SNP at the respective sample point on the chip was determined.
  • results were stored directly as intensity values of the fluorescence in a database.
  • the software used was GT Scan software, GSI Analyzer (and associated documentation).
  • Fig. 1 Hordeum vulgäre L. (barley) -EST locus from the NCBI gene bank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ database entry: gi9410596, bold, underlined: Primersite. Bold, italic , underlined: complementary PTO primer site, Y: SNP)
  • Fig. 2 Genomic PCR of the fragment containing SNP (size: 174 bp, forward primer: gray, black background, PTO reverse primer: gray background; nucleotides linked by phosphorothioate bonds: white, bold, black background)
  • Fig. 3 Attachment (PTO-protected fragment to the extension primer fixed on the area) in the hybridization field of the area and before the extension: formation of a hybrid molecule between extension primer (
  • Fig. 5 Process steps that are carried out with the slide (note: the drawing is true to scale with the exception of the vertical extent of the area (a) in Fig. 5 / IV and V, which is only shown for clarification) I. Surface coating of the Slide (s) with oligonucleotide probes in

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum multiparallelen Nachweis von Nukleotidpolymorphismen auf einem polydimensionalen Array. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis vieler einzelner Nukleotidpolymorphismen, wobei die Nukleotidpolymorphismen multipler Individuen auf dem Array multiparallel nachgewiesen werden können. Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt die Hybridisierung von jeweils einem Sondenmolekül mit jeweils einem Probenmolekül in einem Hybridisierungsfeld auf dem Array, das von umliegenden Hybridisierungsfeldern getrennt ist.

Description

Verfahren zur SNP -Analyse auf Biochips mit Oligonukleotid- Arealen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum multiparallelen Nachweis von Nukleotidpolymorphismen auf einem polydimensionalen Array. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis vieler einzelner Nukleotidpolymorphismen, wobei die Nukleotidpolymorphismen multipler Individuen auf dem Array multiparallel nachgewiesen werden können. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Hybridisierung von jeweils einem Sondenmolekül mit jeweils einem Probenmolekül in einem Hybridisierungsfeld auf dem Array, das von umliegenden Hybridisierungsfeldern getrennt ist.
Bereits seit einigen Jahren werden natürliche DNA- Variationen zwischen Individuen in den Bereichen Pharmakogenomik und Pharmakogenetik sowie allgemein zur Genotypisierung menschlicher, tierischer, mikrobieller, pilzlicher und pflanzlicher Individuen untersucht. Eine Form von Variationen in DNA-Sequenzen, die die DNA eines Individuums von der eines anderen Individuums unterscheiden, stellen die so genannten singulären Nukleotid-Polymorphismen (SNPs, „single nucleotide polymorphisms") dar, die auch zwischen Individuen der gleichen Spezies existieren.
Ein SNP ist ein einzelner DNA-Basenaustausch oder eine Insertion/Deletion einzelner Basen in einer bestimmten Position innerhalb eines genomischen Abschnitts wie z.B. einem Gen. Zum Beispiel können einige Individuen in einer Population die Base Adenin aufweisen, während andere Individuen an der gleichen Stelle innerhalb eines Gens die Base Cytosin besitzen. Man nimmt an, dass mehr als 5 Millionen von solchen SNPs im humanen Genom existieren, deren Allel mit dem seltener vorkommenden Nukleotid in mehr als 10% der untersuchten Individuen auftritt. Davon sollen etwa 90.000 SNPs in proteinkodierenden Regionen liegen, was diese SNPs im Hinblick auf medizinische und pharmakologische Fragestellungen besonders interessant macht. Betrachtet man mehrere SNPs in einem Individuum, so bietet dies die Möglichkeit, einen genetischen Fingerabdruck für das jeweilige Individuum zu erstellen. Diese Unterschiede können mittels speziell auf die SNP- Analyse ausgerichteter DNA-Mikroarrays untersucht und ausgewertet werden. Die Analyse von SNPs ist allgemein zur Beantwortung molekulargenetischer Fragestellungen nützlich. Zum Beispiel kann das Ergebnis einer SNP-Analyse wertvolle Informationen über die Prädisposition eines Individuums für eine bestimmte Erkrankung liefern. Auf diese Weise ist es möglich, vor der Medikation eines Patienten abzuschätzen, wie der Patient auf eine bestimmte Wirkstoffklasse reagieren wird.
Die SNP-Analyse, häufig auch als Genotypisierung bezeichnet, ist aber nicht nur für die medizinische Genetik und die Pharmakogenetik von besonderem Interesse, die Feststellung, ob ein bestimmter SNP und damit eine bestimmte Eigenschaft in einem Individuum vorhanden oder abwesend ist, ist allgemein für die Charakterisierung von Individuen, seien sie menschlicher, tierischer, pflanzlicher oder mikrobieller Natur, nützlich. So ist die SNP-Genotypisierung bereits seit einigen Jahren ein fester Bestandteil der modernen Pflanzenzüchtung.
Die SNP-Analyse wird inzwischen besonders im Bereich der Biomedizin routinemäßig durchgeführt und von entsprechend ausgerichteten Firmen als Serviceleistung angeboten. Auch sind bereits geeignete Reaktionskits verschiedener Anbieter für die SNP-Analyse auf dem Markt erhältlich, allerdings nicht für Arrays.
Auf einem DNA-Chip bzw. Mikroarray, dessen Verwendung zur SNP-Analyse als Serviceleistung von verschiedenen Firmen angeboten wird, werden vorwiegend zwei Methoden zum Nachweis der Punktmutationen eingesetzt, zum einen die Allel- spezifische Hybridisierung, zum anderen die Primer-Extension. Diese Nachweis- methoden basieren auf Oligonukleotiden, die auf dem Chip in Form eines so genannten Arrays, also einer vorbestimmten Anordnung, angeordnet sind, um einzelne Basenpolymorphismen in einer zu untersuchenden DNA-Probe entweder durch Hybridisierung oder durch Hybridisierung gefolgt von einer DNA- Polymerase-abhängigen Primer-Extension der angeordneten Oligonukleotide nachzuweisen. Bei beiden Techniken ist die Sonde, also das jeweilige Oligonukleotid auf dem Chip in einer bestimmen Position angeordnet und fixiert, während die zu untersuchenden Nukleinsäuremoleküle der Probe in Form einer Hybridisierungs- lösung vorliegen. Diese Lösung wird mit dem Chip in Kontakt gebracht und inkubiert, wodurch die in der Lösung enthaltenen DNA-Moleküle der Probe ihre passenden Hybridisierungspartner, nämlich die zu dem jeweiligen Molekül passende Oligonukleotidsonde, auf der Oberfläche des Biochips finden und mit diesen hybridisieren.
Die Begriffe DNA-Chip, Biochip und (Mikro-)Array werden häufig austauschbar untereinander verwendet, so auch in der vorliegenden Anmeldung. Streng genommen bedeutet Mikroarray lediglich, dass Moleküle an bestimmten Positionen innerhalb einer Anordnung (Array) oder Rasters in einer hohen Dichte angeordnet sind.
Tatsächlich können Mikroarrays bis zu mehrere hunderttausend Positionen (häufig als Spots bezeichnet) auf einem Träger oder einer Matrix aufweisen. Der Chip ist das eigentliche Arraysubstrat, also der Träger eines oder in der Regel vieler Mikroarrays.
Als Träger werden u.a. Objektträger oder andere Substrate aus Glas und Wafer verwendet.
Bei der Genotypisierung, also dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines SNP unter Einsatz der gegenwärtig üblichen Mikroarray-Technologien müssen in der Regel zahlreiche DNA-Moleküle bzw. Loci eines einzelnen Individuums ihre verschiedenen Hybridisierungspartner finden. Es ist ersichtlich, dass hieraus einige Probleme entstehen, insbesondere mit steigender Anzahl der zu untersuchenden Loci. Häufig finden Probenmoleküle ihre passenden Sonden nicht, insbesondere wenn das Experiment komplex ist und viele Probenmoleküle in der Lösung enthalten sind und sich viele immobilisierte Oligonukleotidsonden auf der Chipoberfläche befinden, z.B. 1000 Sonden oder mehr. Hier ist das Hybridisierungsergebnis häufig schlecht, und viele Probenmoleküle finden niemals ihren Sondenpartner, was zwangsläufig zu fehlenden Signalen und falschen Ergebnissen führt. Des Weiteren müssen die Probenmoleküle bzw. zu untersuchenden Loci von ein und demselben Individuum stammen, da bei der Verwendung von zwei oder mehr Individuen bzw. deren Proben automatisch Kreuzhybridisierung der homologen Probenmoleküle mit der gleichen Sonde stattfinden würde und die Signale somit nicht mehr unterscheidbar und zuordenbar wären.
Ähnliche Probleme treten nicht nur bei dem parallelen Nachweis mehrerer SNPs von vielen Individuen auf, sondern auch bei allen anderen Mikroarray-basierten Verfahren, die auf vielen parallelen Hybridisierungsereignissen zwischen Sonden und Targets beruhen. Dies gilt insbesondere beim Nachweis ähnlicher Sequenzen.
Ein typisches Beispiel für solche Verfahren ist die Verwendung von Mikoarrays zum Nachweis von Mikroorganismen in Proben in der biomedizinischen Diagnostik. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass die Gene für ribosomale RNA (rRNA) ubiquitär verbreitet sind und über Sequenzabschnitte verfügen, die für die jeweilige Spezies charakteristisch sind. Diese Spezies-charakteristischen Sequenzen werden in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf einen Mikroarray aufgebracht. Die zu untersuchenden Target-DNA-Moleküle werden zunächst aus der zu untersuchenden Probe isoliert und mit fluoreszierenden Markern versehen. Anschließend werden die markierten Target-DNA-Moleküle in einer Lösung mit den auf den Mikroarray aufgebrachten Sonden inkubiert, unspezifisch auftretende Wechselwirkungen werden durch entsprechende Waschschritte entfernt und spezifische Wechselwirkungen durch fluoreszenzoptische Auswertung nachgewiesen. Auf diese Art und Weise ist es möglich mit einem einzigen Test in einer Probe gleichzeitig z.B. mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen hängt bei diesem Testverfahren theoretisch nur von der Anzahl der spezifischen Sonden ab, die auf dem Mikroarray aufgebracht worden sind. Da jedoch häufig Mikroorganismen mit sehr ähnlichen rRNA-Sequenzen parallel nachgewiesen werden sollen, treten auch hier die für die SNP-Analyse beschriebenen Probleme, die auf Kompetition, Kreuzhybridisierung etc. beruhen, auf. Die technischen Möglichkeiten, die genannten Nachteile durch den Einsatz verschiedener Laser und Fluorochrome zu kompensieren, sind sehr begrenzt. Im Ergebnis bedeutet dies, dass z.B. bei der SNP-Analyse für die Genotypisierung jedes Einzelindividuums ein separater Chip hergestellt und eingesetzt werden muss. So auch beschrieben in Science (2002), 295, Seiten 160 - 172, wo ein aktueller Überblick über DNA-Chip- und Mikroarray-Technologien gegeben wird; siehe hier insbesondere Seite 172, 3. Spalte. Die Herstellung individueller Mikroarrays für jedes zu untersuchende Individuum ist derart zeit- und kostenintensiv, dass diese Vorgehensweise zum Beispiel in einer Studie mit 5000 Testindividuen, die angesichts der Notwendigkeit von 5000 SNP-Chips allein für den Hybridisierungs- Nachweisschritt fast 5 Mio. EUR kosten würde, kaum anwendbar ist.
Obwohl SNPs und die Genotypisierung von Patienten besonders in der medizinischen Genetik von zentraler Bedeutung sind, wurden bis heute keine praktikablen Ansätze entwickelt, die die Nachteile des Standes der Technik überwinden und die multiparallele Analyse vieler Loci von vielen Individuen gleichzeitig ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die parallele Analyse mehrerer Nukleinsäuren durch Hybridisierung gleichzeitig und vergleichbar auf einem Array möglich zu machen, wobei die Fehlerquellen (z. B. Kreuzhybridisierung) möglichst eliminiert werden sollen und keine hohen Anforderungen an die Analyseparameter wie z. B. Probenkonzentration gestellt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher ebenfalls, die Analyse vieler diagnostischer Mutationen oder SNPs an vielen Loci gleichzeitig und vergleichbar auf einem Array möglich zu machen. Dabei sollen möglichst keine hohen Anforderungen an die verschiedenen Analyseparameter, wie gleiche Hybridisierungstemperatur oder DNA- Probenkonzentration auf dem Array, bestehen. Vielmehr soll ein möglichst einfaches und zuverlässiges Nachweisverfahren mit möglichst wenigen Fehlerquellen bereitgestellt werden. Aus diesem Grund soll auch auf ein kompliziertes zyklisches Temperaturregime, wie es etwa bei der PCR notwendig ist, verzichtet werden.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, werden durch den Gegenstand des unabhängigen Anspruchs gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen definiert.
Die genannten Aufgaben werden durch das erfindungs gemäße Verfahren zur gleichzeitigen Genotypisierung multipler Individuen und multipler Loci auf ein und dem selben Träger (DNA-Chip bzw. Array) gelöst.
Die Methoden des Standes der Technik zum Mikroarray-basierten Nachweis von Nukleinsäuren verlangen allgemein, dass die Proben- bzw. Targetmoleküle in der Hybridisierungslösung gepoolt werden und die Hybridisierungslösung mit dem Chip, auf dem die Oligonukleotidsonden angeordnet sind, in Kontakt gebracht wird, was dazu führt, dass die verschiedenen Probenmoleküle ihren Hybridisierungspartner unter zahlreichen Sonden finden müssen, was insbesondere bei einer hohen Anzahl von Probenmolekülen problematisch ist.
Im Unterschied hierzu basiert die Erfindung darauf, dass in separaten Hybridi- sierungsfeldern auf dem Biochip jeweils nur ein Probenmolekül (im Sinne einer bestimmten Nukleinsäuresequenz) mit einem zu ihm komplementären, auf dem Chip immobilisierten Sondenmolekül (im Sinne einer bestimmten Nukleinsäuresequenz) hybridisiert. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens findet also eine örtlich gezielte Hybridisierung statt, bei der nicht erwünschte Hybridisierungsreaktionen durch die räumliche Entfernung der einzelnen Hybridisierungsfelder und -areale voneinander und durch optionales Trocknen der gebildeten Hybride ausgeschlossen werden. Bei dem Nachweis von SNPs verlangen die Methoden des Stands der Technik ebenfalls, dass die Probenmoleküle eines Einzelindividuums in der Hybridisierungslösung gepoolt werden und die Hybridisierungslösung mit dem Chip, auf dem die Oligonukleotidsonden angeordnet sind, in Kontakt gebracht wird, was dazu führt, dass verschiedene Probenmoleküle eines Individuums ihren Hybridisierungspartner unter zahlreichen Sonden finden müssen, was insbesondere bei steigender Anzahl der analysierten Loci problematisch ist. Im Unterschied hierzu basiert die Erfindung darauf, dass kein Probenpool zur Hybridisierung mit der jeweiligen Sonde gebracht wird, sondern jedes einzelne Probenmolekül (im Sinne einer bestimmten Nukleinsäuresequenz) ausschließlich mit dem zu ihm komplementären Sondenmolekül in einem separaten Hybridisierungsfeld hybridisiert wird. Auf diese Weise werden Hybridisierungen mit anderen Probenmolekülen (im Sinne einer bestimmten Nukleinsäuresequenz) (Kreuzhybridisierung) verhindert. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens findet also die Hybridisierung gezielt zwischen einem Probenmolekül und dem zu ihm komplementären Sondenmolekül statt, ohne dass sich die unterschiedlichen Probenmoleküle vermischen können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum SNP -Nachweis findet die Bildung des Hybrids aus Sondenmolekül und Probenmolekül individuell für jeden zu untersuchenden Locus und jedes zu untersuchende Individuum statt. Hierbei findet die Hybridisierung in Hybridisierungsfeldern auf dem Chip statt, die räumlich voneinander entfernt sind. Dadurch, dass die Position der Oligonukleotidsonde vorher festgelegt wurde, wird die sichere Zuordnung des sich bildenden Hybrids aus Sonde und Probe ermöglicht.
Die gebildeten Hybride können durch Zugabe z.B. von Spermidin oder Poly- ethylenglykol stabilisiert bzw. unter Alkohol konserviert werden. Die Stabilisierung der Hybridstruktur, also der Zusammenhalt der Einzelstränge im Doppelstrang, wird auch durch das Trocknen, also durch die Verringerung des Volumens, unterstützt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Hybride aus Oligonukleotidsonde und Probenmolekül getrocknet, um einen weiteren Schutz gegen das Vermischen der verschiedenen Probenmoleküle zu erhalten. Diese getrockneten Hybride werden im Rahmen der Nachweisreaktion rehydratisiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Hybridisierungsareale zusätzlich durch das Aufbringen einer Trennmatrix aus Kunststoff gegeneinander abgetrennt, die vor der Nachweisreaktion wieder entfernt werden kann.
Dem Fachmann ist klar, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum SNP-Nachweis prinzipiell auch auf andere Mikroarray-basierte Nachweisverfahren ausgedehnt werden kann. Z.B. können erfindungsgemäß zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe ebenfalls die durch PCR amplifizierten Targetmoleküle mit jeweils einer Mikroorganismus-spezifischen rDNA-Sonde auf dem Chip hybridisiert werden, ohne dass sich die Targetmoleküle vermischen. Auf diese Weise können Kompetitions- reaktionen von verschiedenen Sonden um Targets in einfacher Weise eliminiert und Kreuzhybridisierungen vermieden werden. Da nur eine Sonde zur Hybridisierung zur Verfügung steht, kann die Hybridisierung zudem effizienter durchgeführt werden, was zu besseren Signal-Rausch- Verhältnissen bei der Auswertung führt. Zudem entfallen Probleme, die durch die gleichzeitige Diffusion vieler Targets zu vielen Sonden bei Auswertungen nach dem Stand der Technik auftreten.
Bei anderen Anwendungen kann es sich z.B. um die Analyse der transkriptionellen Aktivität eines Organismus oder z.B. einer Zelle handeln. In diesem Fall wird durch reverse Transkription zunächst die mRNA, d.h. die exprimierte genetische Information, quantitativ in entsprechende cDNAs überführt. Nach der Amplifϊkation dieser cDNAs kann dann in einem erfindungsgemäßen Verfahren durch Hybridisierung jeweils einer amplifizierten cDNA mit jeweils einer Sonde in einem räumlich definierten Hybridisierungsfeld und Auswertimg der Hybridisierung auf die Genaktivität der jeweiligen Zelle etc. geschlossen werden.
Alternativ kann auch einzelsträngige mRNA, z.B. von hoch exprimierten oder stark induzierten Genen, direkt als Probenmolekül verwendet und mit den Sondenmolekülen hybridisiert werden, um die Expression dieser Gene zu untersuchen. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für Analysen auf RNA-Ebene ist somit auch ausdrücklich vorgesehen.
Dem Fachmann sind weitere Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie z.B. Mutationsanalysen, Rekombinationsanalysen, Stammbaumanalysen und Segregationsanalysen bekannt.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:
a) Flächiges Anordnen und Immobilisieren eines oder mehrerer einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle (Sondenmoleküle) in Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm auf einem Träger, b) Mischen und Hybridisieren jeweils eines bestimmten Sondenmoleküls in einem räumlich definierten Hybridisierungsfeld innerhalb des Hybridi- sierungsareals mit jeweils einem zweiten einzelsträngigen Nuklein- säuremolekül (Probemnolekül), dessen Sequenz zu der des Sondenmoleküls mindestens teilweise komplementär ist, so dass die beiden Nuklein- Säuremoleküle mindestens über die komplementäre Sequenz miteinander hybridisieren können, wobei innerhalb eines Hybridisierungsareals Probenmoleküle des gleichen Locus, aber unterschiedlichen Ursprungs in verschiedenen Hybridisierungsfeldern mit dem gleichen Sondenmolekül hybridisieren können, c) Nachweisen der Hybridisierung mit einem geeigneten Nachweisverfahren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei zwischen den einzelnen Hybridisierungsarealen eine Trennmatrix aufgebracht ist, die die Hybridisierungsareale gegeneinander abtrennt.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich zum parallelen Nachweis von z.B. mehreren Probenmolekülen in einer Mischung, zum parallelen Nachweis von mehreren Organismen, bevorzugt Mikroorganismen in einer Probe, zum Analysieren der
Genaktivität mehrerer Gene eines Organismus oder z.B. einer Zelle oder auch zum Nachweis der Expression eines Gens.
Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausfuhrungsform ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleotidpolymorphismus (SNP), umfassend die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:
a) Flächiges Anordnen und Immobilisieren eines oder mehrerer einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle (Sondenmoleküle), deren Sequenz einen bestimmten Locus im Genom eines Individuums repräsentiert, in Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm2 auf einem Träger, b) Mischen und Hybridisieren jeweils eines bestimmten Sondenmoleküls in einem räumlich definierten Hybridisierungsfeld innerhalb eines Hybridisierungsareals mit jeweils einem zweiten einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül (Probenmolekül), das den nachzuweisenden SNP aufweist und dessen Sequenz zu der des Sondenmoleküls mindestens teilweise komplementär ist, so dass die beiden Nukleinsäuremoleküle mindestens über die komplementäre Sequenz miteinander hybridisieren können, wobei innerhalb eines Hybridisierungsareals Probenmoleküle des gleichen Locus, aber unterschiedlichen Ursprungs in verschiedenen Hybridisierungsfeldern mit dem gleichen Sondenmolekül hybridisieren können, b) Nachweisen des SNPs über Auswertung der Hybridisierungsreaktion mit einem geeigneten Nachweisverfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei zwischen den einzelnen Hybridisierungsarealen eine Trennmatrix aufgebracht ist, die die Hybridisierungsareale gegeneinander abtrennt.
Das Verfahren der Erfindung eignet sich damit zum Nachweis bzw. zur Genotypisierung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Identität eines einzelnen Nukleotidpolymoφhismus in einer bestimmten Position innerhalb des Genoms eines Individuums. Bevorzugt werden mehrere bis viele Individuen gleichzeitig auf einem gemeinsamen Träger bezüglich einer bestimmten Nukleotidvariation untersucht. Besonders bevorzugt werden sehr viele Individuen bezüglich einiger weniger Nukleotidvariationen gleichzeitig untersucht. Das Verfahren der Erfindung eignet sich ebenfalls zum Nachweis bzw. zur Genotypisierung der Anwesenheit, Abwesenheit oder Identität von Insertionen oder Deletionen einer oder mehrerer Basen in einer bestimmten Position innerhalb des Genoms eines Individuums.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur multiparallelen SNP-Analyse mehrerer Individuen und mehrerer Loci im Genom eines Individuums, umfassend die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:
a) Flächiges Anordnen und Immobilisieren eines oder mehrerer einzelsträngiger
Nukleinsäuremoleküle (Sondenmoleküle), deren Sequenz einen bestimmten Locus im Genom eines Individuums repräsentiert, in Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm auf einem Träger, b) Mischen und Hybridisieren jeweils eines bestimmten Sondenmoleküls in einem räumlich definierten Hybridisierungsfeld innerhalb des
Hybridisierungsareals mit jeweils einem zweiten einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül (Probenmolekül), das den nachzuweisenden SNP aufweist und dessen Sequenz zu der des Sondenmoleküls mindestens teilweise komplementär ist, so dass die beiden Nukleinsäuremoleküle mindestens über die komplementäre Sequenz miteinander hybridisieren können, wobei innerhalb eines Hybridisierungsareals Probenmoleküle des gleichen Locus, aber unterschiedlichen Ursprungs in verschiedenen Hybridisierungsfeldern mit dem gleichen Sondenmolekül hybridisieren können, c) enzymatische Template-abhängige Extension des Sondenmoleküls, das innerhalb des Hybrids als Primer fungiert, unter Einbau eines zum Kettenabbruch führenden Nukleotids oder -analogons, wobei Sondenmoleküle, die jeweils verschiedene Loci repräsentieren, sowie Probenmoleküle mehrerer Individuen zur parallelen Analyse verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet, während oder bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden, wobei zwischen den einzelnen Hybridisierungsarealen eine Trennmatrix aufgebracht ist, die die Hybridisierungsareale gegeneinander abtrennt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird in jedem Hybridisierungs- areal nur ein Probenmolekül mit dem in dem Areal vorliegenden Sondenmolekül hybridisiert, wobei jedes Areal räumlich durch eine Trennmatrix von den anderen Arealen abgegrenzt sein kann.
Erfindungsgemäß können auch Sondenmoleküle, die jeweils verschiedene Loci jeweils verschiedener Individuen repräsentieren, zur parallelen Analyse verwendet werden.
Verschiedene Ausfuhrungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verwendung von Arrays zur multiparallelen SNP-Analyse mehrerer Individuen und mehrerer Loci im Genom eines Individuums sind in den Unteransprüchen definiert.
Unter "Locus" wird erfindungsgemäß ein genomischer Abschnitt verstanden, in dem der zu untersuchende genetische Polymoφhismus, wie z.B. der SNP, die Insertion oder Deletion, liegt.
Als "Immobilisieren" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Vorgang bezeichnet, durch den ein Molekül auf einem festen Träger oder einer darauf stabilisierten Schicht oder Oberfläche durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkung derart angebracht wird, dass das Molekül sich nicht mehr frei auf dem Träger bewegen bzw. von dem Träger weg in Lösung diffundieren kann. Durch das Immobilisieren der Sondenmoleküle in Arealen entsteht im Rahmen der vor- liegenden Erfindung eine flächige Beschichtung mit der Oligonukleotidsonde.
Als "Träger", "Matrix" oder "Substrat" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Vorrichtungen bezeichnet, auf denen Moleküle durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen aufgebracht werden können. Als Träger bzw. Substrat für Nukleinsäuremoleküle kommen z.B. Objektträger oder andere
Materialien aus Glas, Kunststoff, Keramik oder Metall, die planar, zweidimensional, dreidimensional oder sphärisch beschichtet sein können, sowie Wafer in Frage. Dreibzw, vierdimensionale Beschichtungen für Träger sind kommerziell erhältlich z.B. unter den Bezeichnungen CodeLink Bioarray (Fa. Amersham Pharmacia) oder MGX™ 4D-Array (Fa. Metrigenix).
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die unterschiedlichen Hybridisierungsareale durch eine Trennmatrix aus chemisch inertem Material voneinander abgetrennt, im Unterschied zu Trägern mit Wells (Näpfen) oder anderen Vertiefungen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.
Als „Hybridisierungsareal" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Bereich des Chips bezeichnet, in dem eine Oligonukleotidsonde bestimmter Sequenz flächig angeordnet und immobilisiert wurde. Bevorzugt enthält ein Chip maximal 192 Areale, besonders bevorzugt maximal 96 Areale, insbesondere bevorzugt maximal 48 Areale und am meisten bevorzugt maximal zwölf Areale. Die Fläche der Areale ist mindestens 0,5 mm , bevorzugt ist sie mindestens 4 mm , besonders bevorzugt ist sie mindestens 16 mm und am meisten bevorzugt ist sie mindestens 256 mm . Innerhalb dieser Areale können mehrere Hybridisierungen in räumlich voneinander entfernten Hybridisierungsfeldern stattfinden. Als „Hybridisierungsfeld" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Bereich innerhalb des Hybridisierungsareals bezeichnet, in dem ein Probenmolekül mit einer definierten Nukleinsäuresequenz aus einem bestimmten Individuum mit einem Sondenmolekül hybridisiert wird, dessen Nukleinsäuresequenz zumindest teilweise zu der des Probemnoleküls komplementär ist. Diese Hybridisierungsfelder sind bei manuellem Aufbringen des Probenmoleküls mindestens 1,5 bis 2 mm voneinander entfernt, bei automatisiertem Aufbringen kann der Abstand 0,1 bis 1 mm betragen.
Erfolgt die Lokalisierung auf dem Träger, der Matrix oder dem Substrat in einer definierten räumlichen Anordnung, so wird diese Anordnung häufig auch als Array bezeichnet. Eine spezifische Position des Arrays, in diesem Fall das Hybridisierungsfeld, wird üblicherweise auch als Spot bezeichnet. Dem Fachmann ist klar, dass die Begriffe "Array", "Substrat", "Matrix" etc. im Stand der Technik häufig synonym füreinander verwendet werden und voneinander durch Definitionen nicht strikt getrennt werden können.
Der Begriff "Chip", "DNA-Chip", "Biochip" oder "Gen-Chip" bezeichnet üblicherweise die Anordnung eines Moleküls im Arrayformat auf einem Träger.
Als „Trennmatrix" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Gitter bezeichnet, das auf dem Chip separate Hybridisierungsareale gegeneinander abtrennt. Das Material der Trennmatrix kann jedes chemisch inerte Material sein, das den Durchtritt von Flüssigkeit wirksam verhindert und ein zuverlässiges Abdichten der separaten Areale gegenüber dem Träger gewährleistet. Zudem sollte das Material reversibel am Träger haften, reißfest sein und sich nach der Hybridisierung bevorzugt in seiner Gesamtheit rückstandsfrei entfernen lassen. Bevorzugt sind chemisch inerte Polymere und Kunststoffe. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Material der Trennmatrix um Silikonkautschuk. Die Breite der Trennmatrix beträgt bevorzugt 0,2 bis 5 mm, besonders bevorzugt 0,5 bis 3 mm und am meisten bevorzugt 0,8 bis 1 mm. Die Höhe der Trennmatrix beträgt bevorzugt 0,2 bis 2 mm, besonders bevorzugt 0,8 bis 1,8 mm und am meisten bevorzugt 1,2 bis 1,6 mm. Nach der Hybridisierung kann die Trennmatrix wieder entfernt werden, um eine gemeinsame Nachweisreaktion für den gesamten Chip zu ermöglichen.
Der Nachweis eines SNPs in einem mit der Sonde hybridisierten und auf einem Träger immobilisierten Probenmolekül kann durch verschiedene dem Fachmann geläufige Nachweisverfahren erfolgen. Das etablierteste und am häufigsten verwendete Verfahren zum Nachweis von SNPs in Proben-Sonden-Hybriden ist die so genannte Primer-Extension.
Die Primer-Extension, also die Verlängerung des als Primer dienenden Sondenmoleküls in Template-abhängiger Weise, wobei das Probenmolekül das Template darstellt, kann auf herkömmliche Weise erfolgen, wie zum Beispiel beschrieben in EP 0648 280 Bl, EP 0 705 349 Bl und WO 98/59066 AI. Auf die in diesen Dokumenten enthaltene Offenbarung zur Primer-Extension wird hiermit ausdrücklich verwiesen.
Bei der für die SNP-Analyse inzwischen üblich gewordenen Methode der Primer- Extension werden Primermoleküle, die eine zu einer oder mehreren Nukleotid- sequenzen eines genomischen DNA-Segments eines Individuums komplementäre Polynukleotidsequenz aufweisen, wobei das genomische Segment unmittelbar 3'- distal zu einem SNP, Y, lokalisiert ist, durch Template-abhängige Extension des Nukleinsäureprimermoleküls durch ein einziges Nukleotid oder Nukleotidanalogon R, das zu dem Nukleotid Y des SNP-Allels komplementär ist, verlängert. Findet die Template-abhängige Extension des Primers, der in der Technik häufig als Inter- rogations-Primer bezeichnet wird, in Anwesenheit von einem oder mehreren Didesoxynukleosidtriphosphat-Derivaten oder -Analoga, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddTTP, ddCTP und ddGTP, oder anderen zum Kettenabbruch führenden Basenanaloga, aber in Abwesenheit von dATP, dTTP, dCTP und dGTP statt, so kann das nicht verlängerbare Didesoxynukleotidtriphosphat-Derivat in der Position des SNP und somit der SNP selbst auf herkömmliche Weise nachgewiesen werden. Wie oben erwähnt, ist der Schritt der Primer-Extension, die den SNP- Nachweis unmittelbar ermöglicht, im Stand der Technik vielfach beschrieben und kann vom Fachmann auch mittels hierfür auf dem Markt erhältlicher Reagenzien und Reaktionskits durchgeführt werden.
Dabei stellt das Oligonukleotid, das als Sondenmolekül für die Bildung des Hybrids aus Sondenmolekül und Probenmolekül eingesetzt wird, in der Regel auch den Primer dar, der durch eine Polymerase Template-abhängig um das in Rede stehende Nukleotid, das dem SNP-Allel entspricht, verlängert wird.
Bei anderen, dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren zur Detektion der SNPs im Hybrid handelt es sich z.B. um die Allel-spezifische Primer-Extension (siehe unten), um Allel-spezifische Hybridisierung (siehe unten) und die Massen- spektrometrie.
Die auf dem Chip gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten Hybride aus Sondenmolekül und Probenmolekül werden zu keinem Zeitpunkt vor der Extension denaturiert, sondern stellen vielmehr unmittelbar das Substrat für die Polymerase dar, die ein nachweisbares, in der Regel markiertes Nukleotid an das in Rede stehende Sondenmolekül anfügt. Da die zu untersuchenden Probenmoleküle einzeln und voneinander getrennt mit den jeweiligen Sondenmolekülen hybridisieren und nicht, wie im Stand der Technik, in einer Hybridisierungslösung gepoolt vorliegen, ist jegliche Kreuzhybridisierung ausgeschlossen. Hieraus bietet sich erstmals die
Möglichkeit, verschiedene Hybride aus Sondenmolekül und Probenmolekül, die verschiedene Positionen innerhalb eines Genoms, also verschiedene Loci repräsentieren, von verschiedenen Individuen, sogar von verschiedenen Spezies oder Populationen, parallel auf einem einzigen Chip zu analysieren. Es können dank der vorliegenden Erfindung somit erstmals mehrere Loci von mehreren Individuen parallel auf ein und demselben Chip zuverlässig untersucht und ausgewertet werden.
Während die Analyse mehrerer diagnostischer Mutationen oder SNPs an vielen Loci gleichzeitig und vergleichbar auf einem Array bisher nur durch serielle Analyse, entweder einzelner Proben, also jeweils ein Individuum und ein SNP in einem Arbeitsgang, oder eingeschränkt parallel, also ein Individuum mit mehreren Loci in einem Arbeitsgang bzw. einem Reaktions- oder Hybridisierungsraum, möglich war, können jetzt erstmals viele Individuen parallel bezüglich verschiedener Loci effizient, kostengünstig und reproduzierbar in einem Experiment auf einem einzigen Chip analysiert werden. Dies ist möglich, weil bei einer bevorzugten Ausführungs- form des erfindungsgemäßen Verfahrens jeder zu untersuchende Locus jedes Individuums einzeln durch PCR amplifiziert und mit jeweils einer für einen Locus charakteristischen Sonde getrennt von den anderen Sonden und Proben in verschiedenen Hybridisierungsfeldern innerhalb der Areale auf dem Chip hybridisiert wird.
Des Weiteren ist diese Analyse vom Anwender selbst durchführbar, indem vorgefertigte Chips, die die in Hybridisierungsarealen immobilisierten Sonden- moleküle und eventuell eine entfernbare Trennmatrix tragen, vom Anwender selbst mit seinen vorher amplifizierten Probenmolekülen hybridisiert werden und der Polymoφhismus nachgewiesen wird. Dies wird durch räumlich voneinander entfernte Hybridisierungsfelder ermöglicht, die es erlauben, die Probenmoleküle mit einer Handpipette oder einem Pipettierroboter auf den Chip aufzutragen, ohne dass diese sich vermischen können und es dadurch zu Kreuzhybridisierungen kommt Dadurch ist es dem Anwender möglich, kostengünstig, zeitsparend und reproduzierbar die Analyse einer großen Zahl von Individuen selbst durchzuführen. Es ist daher z.B. möglich, Chips mit bekannten, zu Krankheiten prädisponierenden SNPs herzustellen, so dass in diagnostischen Labors mit Hilfe eines Chips mit einfachen Mitteln viele Individuen im Hinblick auf ihre Prädisposition zu verschiedenen Krankheiten untersucht werden können. Gleiches gilt natürlich auch für die moderne Pflanzenzüchtung, bei der man viele Pflanzenindividuen z.B. im Hinblick auf einen ertragssteigernden SNP untersuchen möchte.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch einen gewissen Grad der Automatisierung, da die Sondenmoleküle mit einem Mikroarray- oder Pipettier- Roboter in Hybridisierungsarealen auf die Matrix aufgebracht werden können und die Probemnoleküle nicht unbedingt mit einer Handpipette, sondern auch mit einem Pipettier- oder einem Mikroarray-Roboter in jedes Hybridisierungsfeld gegeben werden können. Eine solche Automatisierung war bisher nur unter Verlust der Poly- dimensionalität möglich.
Außerdem schließt das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Kits ein, die einen vorgefertigten, mit einem oder mehreren Sondenmolekülen in Hybridisierungsarealen beschichteten Chip, optional mit abnehmbarer Trennmatrix, enthalten. Zusätzlich kann dieser Kit auch Primer für die PCR-Amplifikation der Probenmoleküle sowie die Reagenzien zur Erzeugung von Einzelsträngen aus den PCR-Produkten enthalten. Außerdem kann der Kit auch die Reagenzien für die template-abhängige Extension des Sondenmoleküls enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält ein Kit einen vorgefertigten, mit einem oder mehreren Sondenmolekülen in Hybridisierungsarealen beschichteten Chip mit abnehmbarer Trennmatrix, Primer für die PCR-Amplifikation der Probenmoleküle sowie die Reagenzien zur Erzeugung von Einzelsträngen aus den PCR-Produkten und Reagenzien für die template-abhängige Extension des Sondenmoleküls.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von SNPs bzw. zur Herstellung multiparalleler SNP- Arrays wird im Folgenden hinsichtlich der einzelnen Schritte und Hybridisierungspartner genauer beschrieben. Bei der Probennukleinsäure, hier auch Target-Nukleinsäure oder Ziel-Nukleinsäure genannt, von der man vermutet, dass sie den variablen Nukleotidrest, also den SNP, enthält und die deshalb hierauf hin analysiert werden soll, kann es sich um eine menschliche, tierische, pflanzliche, pilzliche oder mikrobielle Nukleinsäure (DNA oder RNA) handeln. Dabei kann die Probennukleinsäure aus biologischen Proben mittels konventioneller Nukleinsäurereinigungsmethoden isoliert werden, oder auch in ungereinigter Form innerhalb einer biologischen Probe vorliegen.
Einzelne DNA-Fragmente, die vermutlich einen variablen Nukleotidrest, einen SNP, tragen, werden mit entsprechenden PCR-Primern aus einer isolierten (aufgereinigten) DNA oder RNA oder auch direkt aus der nicht extra aufgereinigten biologischen Probe (z.B. Zellsaft oder Quetschpräparat; sog. Rohextrakte) amplifiziert. Dies ist möglich, wenn die Probe sog. DNA-fähiges Material enthält. Dem Fachmann ist bekannt, dass RNA durch Reverse Transkription zunächst in eine cDNA umgeschrieben werden kann, die dann wieder als Template in z.B. einer PCR dienen kann.
Die Methoden zur enzymatischen Anreicherung von Nukleinsäuren (wie z.B. PCR) und deren spezifische Ausführungsformen sind dem Fachmann wohl vertraut und gut in der Literatur dokumentiert (Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Es können aber auch PCR-unabhängige Ameicherungsschritte durchgeführt werden, die z.B. auf Affinitätschromatographie, NAT (Nucleic Acid Amplification Testing), Ampliphi- bzw. Genomiphi-Amplifikationstechniken (vgl. Produktinformationen der Firma Amersham Pharmacia) oder magnetischen Mikropartikeln (z.B. Dynabeads™) basieren. Proben, die nicht aufgereinigt, angereichert oder amplifiziert werden, können unter Umständen auch verwendet werden, benötigen später aber einen Verstärkungsschritt der Fluoreszenzsignale (Signal-Amplifikation). Zur effektiveren Hybridisierung von Proben- und Sondenmolekül ist es vorteilhaft, wenn das Probenmolekül einzelsträngig ist. Dies kann z.B. erreicht werden, indem einer der beiden PCR-Primer (und zwar der Primer, der den Strang synthetisiert, der zur Hybridisierung genutzt wird) eine chemische Modifikation trägt, die ihn davor schützt, von einer 5'-Exonuklease abgebaut zu werden. Ist diese Modifikation am ersten 5'-Nukleotid des Primers eingefügt, wird dieser Strang nicht abgebaut, während der gesamte komplementäre Gegenstrang, der zur Hybridisierung mit dem Sondenmolekül nicht benötigt wird, vom Primer aus in 5'-3'-Richtung von einer 5'- Exonuklease abgebaut, also eliminiert, wird. Es ist auch möglich, ein entsprechendes System mit 3'-Exonukleasen zu entwickeln.
Gängige Primer-Modifikationen sind z. B. 5'-PTO (5'-Phosphoro-Thioat- Nukleotide), bei denen die Phosphatgruppen 5 '-endständiger Nukleotide des Primers durch Phosphoro-Thioat-Gruppen ersetzt sind. Solche modifizierten Primer werden durch die T7 Gen 6 5'-Exonuklease oder die 5'-Exonuklease des Lambda Phagen nicht abgebaut. Aber auch andere 5'-Schutzgruppen oder PNA (Peptide Nucleic Acid) Primer können zum Schutz des hybridisierenden Strangs verwendet werden.
Eine weitere Methode zur Herstellung weitgehend einzelsträngiger Probenmoleküle, die nicht auf Modifikation gefolgt von enzymatischen Abbau basiert, ist die sog. "asymmetrische PCR". Hier wird der Primer des benötigten Strangs in vielfachem Überschuss zum Primer des nicht benötigten Strangs hinzugegeben. Dies führt zur bevorzugten Synthese des für die Hybridisierung benötigten Strangs. Die Hybridisierung wird durch den im wesentlichen nicht amplifizierten Gegenstrang nicht behindert.
Einzelsträngige Probenmoleküle können aber auch durch Anreicherungsmethoden mit magnetischen Partikeln oder Affinitätschromatographie erhalten werden. Diese Substrate enthalten zu der Zielsequenz komplementäre Nukleotide auf ihrer Oberfläche und fischen die gewünschten Sequenzen aus einer denaturierten, fragmentierten genomischen DNA heraus und reichern sie an (z.B. das Kingfischer- System von Hybaid).
Natürlich ist es aber auch möglich, doppelstränigige Nukleinsäuremoleküle, die entweder direkt aus einer Probe stammen oder durch PCR-Amplifikation entstanden sind, zu denaturieren und das dadurch erhaltene Gemisch von zueinander komplementären Einzelsträngen für die Hybridisierung einzusetzen. Das Probenmaterial muss also nicht unbedingt als separater Einzelstrang vorliegen, sondern kann auch durch Denaturierung erhalten werden und gemeinsam mit seinem Komplementär vorliegen. Das Gleiche gilt für asymmetrische DNA.
Bei den Sondenmolekülen handelt es sich um Oligo- oder Polynukleotide, die aufgrund ihrer Nukleotidsequenz mit in der Probe vorhandenen Probenmolekülen hybridisieren können. Bei den Molekülen kann es sich um DNA oder RNA handeln. Die Sondenmoleküle können nach im Stand der Technik wohl bekannten Techniken hergestellt werden. Sie können auch von Anbietern bezogen werden, die Oligo- und Polynukleotide kommerziell herstellen.
Bei den Sondenmolekülen handelt es sich üblicherweise um künstlich synthetisierte einzelsträngige Oligonukleotide, die, wenn als Nachweisverfahren die Primer- Extension verwendet wird, mit ihrem letzten 3'-Nukleotid direkt vor der poly- moφhen Position in der Sequenz des zu untersuchenden Individuums enden. Sie sind komplementär zu mindestens einem Teil des geschützten amplifizierten PCR- Strangs, um das Zusammenpassen von Sonde und Probe zu garantieren. Weiterhin tragen die Extensionsprimer an ihrem 5'-Ende, mit dem sie an die Chipoberfläche gebunden werden, eine Modifikation, über die die Bindung erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Modifikation um einen sog. Spacer (Platzhalter; meist 6 bis 24 C- Atome; aber auch polyA- oder polyT-Spacer sind bekannt), an dessen vom Primer abgewandten Ende sich eine Amino- Modifikation befindet. Diese Aminogruppe (der sog. Linker) reagiert unter UV- Bestrahlung mit der Epoxy-Beschichtung des Chips und bindet somit das Sondenmolekül chemisch kovalent an die Beschichtung. Wenn der Träger mit einer dreidimensionalen Schicht versehen ist, wie etwa der CodeLink Bioarray von Amersham Pharmacia, kann unter Umständen auch auf einen Spacer verzichtet werden und die Sonde direkt mit der Modifikation versehen werden.
Wie oben dargestellt, stellen die Sondenmoleküle in einer Ausführungsform der Erfindung die so genannten Interrogations-Primer, im Stand der Technik auch Nachweisschritt-Primer genannt, dar, die durch Primer-Extension durch die Aktivität einer Polymerase in template-abhängiger Weise verlängert werden. In diesem Fall ist der Primer, also das Sondenmolekül, komplementär zu der Nukleotidsequenz 3' des variablen Nukleotids (SNP) im dazu gehörigen Probenmolekül. Der Primer, der somit als Startpunkt für die template-abhängige Elongation durch eine DNA- Polymerase fungiert, wird derart ausgewählt, dass er mit einer Nukleotidsequenz unmittelbar neben oder in der Nähe des variablen Nukleotids, das im Rahmen der SNP-Analyse nachzuweisen ist, hybridisiert. Dabei kann der Primer, also das Sondenmolekül, so gewählt werden, dass es komplementär zu entweder dem kodierenden oder dem nicht-kodierenden Strang eines doppelsträngigen Target- Moleküls ist, in Abhängigkeit davon, welcher Strang in dem Hybrid aus Sonden- molekül und Probenmolekül vorliegen soll.
Die Auswahl des Sondenmoleküls, das zugleich der Interrogations-Primer ist, wird durch die Natur der Nukleotidvariation, die analysiert werden soll, bestimmt. Dabei wird der Interrogations-Primer in einer Aufuhrungsform der Erfindung derart gewählt und hergestellt, dass er unmittelbar neben dem nachzuweisenden variablen Nukleotid liegt, wenn sich das Hybrid aus Primer und Probenmolekül gebildet hat.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird der Interrogations-Primer so ausgewählt, dass er n Nukleotidreste entfernt von dem nachzuweisenden SNP an ein Sondenmolekül hybridisiert. Dabei ist bezüglich der Anzahl n von Nukleotidresten zwischen dem 3 '-Ende des Primers und dem variablen Nukleotid lediglich zu beachten, dass innerhalb der n Nukleotidreste kein Nukleotidrest vorkommt, der mit dem nachzuweisenden Nukleotid identisch ist.
Weiterhin können die eingesetzten einzelsträngig synthetisierten Extensionsprimer selbst Hybridnatur in dem Simie aufweisen, dass sie nur in ihrem 3 '-Bereich der Probe komplementär sind, in ihrem 5 '-Bereich jedoch zusätzliche Sequenzen besitzen (nochmals ca. 20 bp), die nur zu den verwendeten PCR-Primern komplementär sind (künstlich komplementäre Sequenzen). Dadurch kann ein sog. Adressensystem aufgebaut werden, welches die Hybridisierung unterstützt und die Nukleotidpaarungen verstärkt (durch die erhöhte Menge an Wasserstoffbrücken).
Die Immobilisierung von Oligonukleotiden (synthetischen Sondenmolekülen) auf Biochips ist weitgehend standardisiert. Die kostengünstigste Alternative sind aminomodifizierte Sonden, die mit der Epoxysilan- (3-Glycidoxypropyl- trimethoxysilan-) beschichteten Oberfläche von fluoreszenzfreien Mikroskop- Objektträgern reagieren. Im Handel sind noch weitere Beschichtungen und dazugehörige Modifikationen der Sonden erhältlich. Diese Beschichtungen umfassen z.B. Aldehyd-, Aminosilan- (3-Aminopropyltrimethoxysilan), Polylysin- oder Isothiocyanat-Beschichtungen.
Die genannten Substrate reagieren bevorzugt mit Aminogruppen am Ende der Spacer von Sondenmolekülen oder der Sondenmoleküle selbst. Eine weitere Alternative wäre eine Hybridbindung über das Biotin-Streptavidin-System. Dem Fachmann ist klar, dass die funktionellen Gruppen der Beschichtungen und des Linkers auch entsprechend vertauscht werden könnten.
Die chemische Verbindung von Aminogruppen der Sondenmoleküle und Epoxy- gruppen auf dem Chip erfolgt durch einfaches UV-Crosslinking. Alternativ können die Chips auch in einer feuchten Kammer inkubiert oder heiß gebacken werden. Hier ist anzumerken, dass nicht nur Mikroskop-Objektträger aus Glas oberflächenbeschichtet werden können, sondern auch andere Materialien, vornehmlich Plastik oder Keramik, zur Beschichtung eingesetzt werden. Typischerweise sind die Materialien optisch transparent oder verspiegelt. Die Sondenmoleküle werden in flächig beschichteten Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm2 immobilisiert, die in einer bevorzugten Ausführungsform durch eine Trennmatrix voneinander abgetrennt sind.
In einer erfindungsgemäßen Anwendung der Trennmatrix wird diese vor oder nach dem Beschichten des Chips mit den Sondenmolekülen auf den Chip aufgebracht, so dass auf dem Chip voneinander abgetrennte Areale entstehen, in denen jeweils ein Sondenmolekül mit definierter Nukleinsäuresequenz flächig immobilisiert ist. Wenn eine Trennmatrix verwendet wird, kann diese entweder in fester Form auf den Träger aufgedrückt werden oder flüssig aufgebracht werden, um sie anschließend aushärten zu lassen.
Nach der Hybridisierung und dem Trocknen des Chips kann die Trennmatrix wieder entfernt werden, indem sie z.B. mit einer Pinzette in ihrer Gesamtheit vom Chip abgezogen wird. Dadurch wird eine gemeinsame Nachweisreaktion für alle Hybride ermöglicht.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff „Hybridisierung" oder „hybridisieren", dass zwei Stränge von Nukleinsäuremolekülen in einer sequenz-abhängigen Weise Wasserstoffbrücken ausbilden. Zum Beispiel können unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander hybridisieren, um doppelsträngige DNA oder RNA zu bilden, oder ein doppel- strängiges Hybrid aus RNA und DNA. Siehe im Zusammenhang mit Hybridisierung auch Sambrook et al., vide supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989); oder Higgins and Hames, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, EAL Press Oxford, Washington D.C. (1985), die hier ausdrücklich als Referenz beigefügt sind.
Erfindungsgemäß wird unter Hybridisierung die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäure- molekülen verstanden, wobei sich die Komplementarität aus den Basensequenzen der einzelsträngigen Moleküle ergibt. Bei den doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen kann es sich z.B. um DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-RNA- Duplexmoleküle handeln. Hybridisierungsexperimente werden üblicherweise eingesetzt, um Komplementarität zwischen verschiedenen einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.
Als "annealing" wird definitionsgemäß der Vorgang bezeichnet, bei dem sich zwei einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle aufgrund ihrer Basenkomplementarität aneinander lagern, miteinander wechselwirken und doppelsträngige Strukturen bzw. eine doppelsträngige Helix bzw. eine Duplex ausbilden. Die Wechselwirkung zwischen den einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen basiert auf der Wasser- stoffbrückenbindung zwischen komplementären Basenpaaren in den einzelnen Strängen. Auf diese Weise können doppelsträngige DNA-DNA-Helices, DNA-RNA- Helices oder RNA-RNA-Helices ausgebildet werden.
Als Hybrid wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül bezeichnet, dessen Einzelstränge aus verschiedenen Nukleinsäuremolekülen stammen und das durch Ausbildung einer Wasser- stoffbrückenbindung zwischen diesen komplementären Einzelsträngen entstanden ist.
Die bei einer bevorzugten Ausführungsform durch die 5'-Exonukleasebehandlung einzelsträngig vorliegenden individuellen Probenmoleküle werden bevorzugt mit Hilfe eines Mikroarray-Roboters mit den passenden einzelsträngig synthetisierten Sondenmolekülen in räumlich definierten Hybridisierungsfeldern innerhalb der Hybridisierungsareale auf dem Chip in Kontakt gebracht.
Durch die Positionierung der Sonde während der Hybridisierung am 3'-Ende des genomischen Einzelstrangs (Probe) ist Komplementarität gewährleistet.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die sich bildenden Hybride getrocknet, indem man die Reaktionsflüssigkeit langsam verdunsten lässt. Dies kann unter Normalbedingungen, durch leichte Erwärmung (25 bis 45°C) oder durch Vakuum- Applikation erfolgen.
Im nächsten Schritt findet bei einer bevorzugten Ausführungsform die bereits erwähnte Primer-Extension, also die enzymatische Verlängerung des Primers, der bevorzugt das Sondenmolekül darstellt, in Template-abhängiger Weise statt. Dabei wird die Primer-Extension allgemein so durchgeführt, wie sie im Stand der Technik beschrieben ist, wobei im Handel erhältliche Enzyme, Reagenzien und Kits eingesetzt werden können. Ein getrocknetes Hybrid wird durch die Zugabe des Extensionsgemisches rehydratisiert.
Allgemein wird das Hybrid aus Sonde und Probe mit einem oder mehreren Nukleosidtriphosphaten, einschließlich mindestens einem markierten oder modifizierten Nukleosidtriphosphat, zusammen mit einem Polymerisierungsmittel unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Extension des Primers begünstigen. Es können entweder markierte Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) oder markierte kettenabbrechende Didesoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs) eingesetzt werden. Das Polymerisierungsmittel wird den Primer mit dem zu dem variablen Nukleotid neben dem Primer komplementären Nukleosidtriphosphat verlängern. Der Begriff "markiertes Nukleosidtriphosphat" schließt jedes Nukleosidtriphosphat, Desoxy- oder Didesoxynukleosidtriphosphat ein, das mit einem nachweisbaren Marker versehen ist oder das derart modifiziert ist, dass es eine Gruppe oder einen Rest umfasst, die bzw. der in der Lage ist, einen detektierbaren Marker zu binden. Dabei spielt es im Rahmen der Erfindung keine Rolle, welcher Marker für den Nachweis eingesetzt wird. Allerdings unterscheiden sich verschiedene Marker natürlich hinsichtlich ihrer Handhabbarkeit, ihrer Kosten und ihrer Sensitivität. Wichtig ist allerdings, dass der nachweisbare Marker den Einbau des markierten Nukleosidtriphosphats während der Polymerisationsreaktion, die zur Verlängerung des Primers führt, nicht behindert oder fehlerhaft macht.
Als Fluoreszenzmarkierung der ddNTPs oder dNTPs werden hauptsächlich Cyanin- (z.B. Cy3 oder Cy5), Renaissance- (z.B. ROX oder Rl 10) oder Fluorescein- Farbstoffe (z.B. FAM oder FITC) verwendet, also z. B. Cyanin-5-ddATP oder Renaissance- 110-ddGTP oder entsprechende dNTPs. Weitere zur Fluoreszenz anregbare Farbstoffe werden ständig entwickelt und sind dem Fachmann bekannt.
Als alternative Markierungen können radioaktive Markierungen wie P32, das Biotin- Streptavidin-System oder Antigen-Antiköφer-Systeme, die an Enzyme wie z.B. Meerrettich-Peroxidase gekoppelt sind, verwendet werden.
Erfindungsgemäß kann der Nachweis mit unterschiedlich vielen markierten Nukleotiden bzw. Nukleotidanaloga erfolgen. Üblicherweise werden als Markierungen Fluoreszenzmarker verwendet (siehe oben), wobei in der Regel entweder 2 oder 4 markierte Nukleotide bzw. Analoga eingesetzt werden. Entsprechend spricht man vom 2-Color- und 4-Color Approach.
Alternativ zu dieser Versuchsabfolge werden auch andere Primer-Extensions- protokolle angewandt. Eine sehr wichtige Methode stellt die Allel-spezifische Primer-Extension dar. Der wichtigste Unterschied zu dem bereits dargestellten Verfahren ist in den verwendeten Sonden zu sehen. Die 5'-aminomodifizierten Sondenmoleküle werden so entworfen, dass sie nicht ein Nukleotid 3' vor der polymoφhen Position enden, sondern sie liegen mit ihrem letzten 3 '-Nukleotid genau auf der polymoφhen Position. Zu diesem Zweck werden pro zu analysierendem Locus 4 Sonden identischer Sequenz benötigt, die sich lediglich im letzten 3 '-Nukleotid (dem SNP -Nukleotid) unterscheiden. Nach dem Aufbringen in vier unterschiedliche Areale und der Hybridisierung mit dem Probenmolekül in den vier unterschiedlichen Hybridisierungsarealen wird bei der Extensionsreaktion nur einer dieser 4 Extensionsprimer verlängert, nämlich der mit dem komplementären SNP -Nukleotid an seinem 3'-Ende. Die anderen 3 Extensionsprimer werden dadurch, dass das letzte 3 '-Nukleotid mit dem Probenmolekül nicht paaren kann, auch nicht verlängert (Extension bleibt aus). Zum Nachweis, welcher Extensionsprimer verlängert wurde, werden hier mit ein und dem selben Fluorochrom markierte dNTPs (Nukleotide A, C, G und T) verwendet. Die Identität des SNP-Nukleotids wird dadurch ermittelt, welcher der 4 Extensionsprimer ein Fluoreszenzsignal emittiert, also das korrekte Nukleotid in der letzten 3 '-Position trägt.
Nicht verwechselt werden sollten die genannten Nachweismethoden mit der Allel- spezifischen Hybridisierung, bei der keine Extension einer Nukleinsäure, sondern lediglich Hybridisierung von Sondenoligonukleotiden und markierter Probe in der Hybridisierungslösung zum Nachweis durchgeführt werden. Die Spezifizität der Hybridisierung wird in diesem Fall über so genannte swjαtc/z-Oligonukleotide geregelt (WO89/10977; Southern et al. (1992), Genomics, 13, 1008-1017). Dabei sind bis zu 20 Oligonukleotide pro zu analysierendem Locus notwendig (wegen Permutation der Mismatch-P osiύonen). Dieses Nachweisverfahren eignet sich ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren.
Auch der Nachweis von Insertionen oder Deletionen kann durch Primer-Extensions- analyse erfolgen. Dabei ist im Falle der Deletion zu beachten, dass die erste Base in der Deletion nicht mit der ersten Basen nach der Deletion identisch ist. Beim Nachweis von Insertionen ist zu beachten, dass die erste Base der Insertion nicht mit der ersten Base nach der Insertion identisch ist.
Der Begriff "Polymerisationsmittel" steht für jedes Enzym, das in der Lage ist, Nukleinsäuren in Template-abhängiger Weise zu verlängern. Geeignete Enzyme schließen ein z.B. Sequenase, T7 DNA-Polymerase, T4 DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aus Escherichia coli und andere geeignete DNA-Polymerasen, Reverse Transkriptase und Polymerasen aus thermophilen Mikroorganismen wie Thermos aquaticus und Thermos thermophilus.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Polymerisationsmittel um Sequenase™.
Die Hybride für die Template-abhängige Primer-Extension liegen fest gebunden im Array-Format auf der Chipoberfläche vor und sind im getrockneten Zustand auch lagerbar. Die Durchführung der multiparallelen Primer-Extension, bei der Tausende von Analysen in z.B. 50μl Volumen auf dem Chip durchgeführt werden können, stellt einen effektiven Rationalisierungs- und Kostensenkungsprozess dar. Würde die Extension in der MTP vorgenommen, müssten weitaus größere Mengen teurer Reagenzien wie Sequenase™ und fluoreszenzmarkierte ddNTPs verbraucht werden.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform beginnt die Extension auf dem Biochip mit dem in Kontakt bringen von Array und Extensionslösung in einer verdunstungssicheren Kammer auf dem Chip. Das Reaktionsgemisch, das z.B. 0,2 Units Sequenase™ pro μl und 6-8 μM fluoreszenzmarkierte ddNTPs in einem mit der Sequenase™ gelieferten Reaktionspuffer enthält, und der Array werden für ca. lh, bei unter diesen Umständen optimaler Temperatur für das verwendete Polymerisationsmittel, die jedoch nicht höher als 5°C unterhalb der Schmelztemperatur des zwischen Sondenmolekül und Probenmolekül komplementären Bereichs liegen sollte, inkubiert und so die Primer-Extension durchgeführt. Die Extensionslösung kann alle vier mit vier verschiedenen Farbstoffen markierten ddNTPs oder Analoga enthalten, oder aber nur zwei mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten ddNTPs, da SNPs oft binäre Marker darstellen und bei vielen Anwendungen nur festgestellt werden soll, welcher der beiden möglichen Nukleotidzustände vorliegt. Da die markierten ddNTPs durch das Polymerisationsmittel fest an die Extensionsprimer (Sondenmolekül) angefügt werden und die Sonde fest mit der Unterlage (dem Chip) verbunden ist, ist das angefügte ddNTP ebenfalls irreversibel an den Chip gebunden.
Dies eröffnet die Möglichkeit eines stringenten Waschens des Chips z.B. mit H2O, (Bidest, 80°C, 10min.), um Hintergrundrauschen zu eliminieren und nicht eingebaute ddNTPs zu entfernen. Hierdurch ist die spezifische Verlängerung der Sondenmoleküle im Probenpunkt eindeutig festzustellen, da die Wellenlänge (Farbe) der Fluoreszenz verrät, um welches ddNTP der Extensionsprimer am Probenpunkt verlängert wurde. Die Probenpunkte haben bei automatisierter Beladung typischerweise einen Durchmesser von ca. 80 bis 160 μm, bei manueller Beladung beträgt der Durchmesser 0,5 bis 2 mm.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat das eingesetzte laserbasierte
Anregungs-/Detektionssystem, welches die Fluorochrome analysiert, typischerweise eine Auflösung von 2 μm und eine Sensitivität von 0,5 Fluorochromen pro μm . Meist werden zwei (oder vier) Fluorochromtypen gewählt, deren Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen möglichst weit auseinander liegen. So wird z.B. Cy5 bei 650 nm angeregt und emittiert bei 667 nm (Filter 675 nm ±10), Rl 10 wird mit einem 488 nm Laser angeregt und emittiert bei 525 nm (Filter 512nm ±15). Dies stellt sicher, dass sich die Signale der beiden Farbstoffe nicht überlagern, da sie durch die entsprechenden Filtersysteme eindeutig voneinander trennbar sind. Das mit dem Scanner kompatible Analyseprogramm erkennt Wellenlänge (Farbe) und Intensität jedes Probenpunktes und legt die Ergebnisse direkt in einer Datenbank ab. Wie bereits ausgeführt, können beim erfindungsgemäßen Verfahren mehrere genomische Loci mehrerer Individuen gleichzeitig nachgewiesen werden.
Dazu werden üblicherweise mehrere Sonden, die jeweils zum Nachweis unterschiedlicher genomischer Loci verwendet werden können und die in verschiedenen Hybridisierungsarealen immobilisiert wurden, mit dem jeweils komplementären Probenmolekül auf dem Träger des Chips in voneinander entfernten Hybridisierungsfeldern innerhalb der Hybridisierungsareale hybridisiert. Dabei werden maximal 192 unterschiedliche Sonden, bevorzugt maximal 96 unterschiedliche Sonden, besonders bevorzugt maximal 48 unterschiedliche Sonden, insbesondere bevorzugt maximal unterschiedliche Sonden, am meisten bevorzugt maximal zwölf unterschiedliche Sonden auf dem Träger immobilisiert.
Der Fachmann weiß, dass die maximale Anzahl an Sonden, die auf einem Array aufgebracht werden kann, durch die Synthesemethode des Array und die Mindestgröße der Hybridisierungsareale vorgegeben ist.
Erfindungsgemäß weisen die Sondenmoleküle eine Länge von mindestens 10 bis 100 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens 15 bis 75 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mindestens 18 bis 50 Nukleotiden, insbesondere bevorzugt von mindestens 20 bis 40 Nukleotiden, ebenfalls insbesondere bevorzugt von 20 bis 35 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von mindestens 20 bis 30 Nukleotiden auf.
Erfindungsgemäß weisen die Probehmoleküle eine Länge von mindestens 40 bis 500 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens 50 bis 250 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mindestens 50 bis 150 Nukleotiden, insbesondere bevorzugt von mindestens 50 bis 100 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von mindestens 50 bis 90 Nukleotiden auf. Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mindestens 48 unterschiedliche Individuen, bevorzugt mindestens 150 unterschiedliche Individuen, besonders bevorzugt mindestens 625 unterschiedliche Individuen, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 1250 unterschiedliche Individuen, insbesondere bevorzugt mindestens 2500 unterschiedliche Individuen und am meisten bevorzugt mindestens 5000 unterschiedliche Individuen auf dem Träger untersucht.
Erfindungsgemäß werden bei dem Verfahren mindestens 48 unterschiedliche Individuen, bevorzugt mindestens 150 unterschiedliche Individuen, besonders bevorzugt mindestens 625 unterschiedliche Individuen, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 1250 unterschiedliche Individuen, insbesondere bevorzugt mindestens 2500 unterschiedliche Individuen, am meisten bevorzugt mindestens 5000 unterschiedliche Individuen bezüglich maximal 192 unterschiedlicher Loci, bevorzugt maximal 96 unterschiedlicher Loci, besonders bevorzugt maximal 48 unterschiedlicher Loci, insbesondere bevorzugt maximal 24 unterschiedlicher Loci und am meisten bevorzugt maximal zwölf unterschiedlicher Loci parallel untersucht.
Erfindungsgemäß können verschiedene Individuen unterschiedlicher Organismen hinsichtlich genetischer Polymoφhismen wie SNPs untersucht werden. Dazu gehören z.B . Mikroorganismen, bevorzugt E. coli und/oder human-pathogene
Mirkoorganismen, Pilze, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und/oder pflanzen-pathogene Pilze, Ratte, Rind, Maus, Mensch oder Pflanzen.
Bei den Pflanzen werden bevorzugt Individuen von monokotylen oder dikotylen
Nutz-, Zier-, Nahrungs- oder Futteφflanzen durch das erfindungsgemäße Verfahren charakterisiert. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören. Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zieφflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Olpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent US 6,137,030 entnommen werden. Am meisten bevorzugt werden erfindungsgemäß Arabidopsis als Modellsystem für dikotyle Pflanzen und Reis als Modellsystem für monokotyle Pflanzen untersucht.
Eines oder mehrere menschliche Individuen lassen sich zum Beispiel bezüglich einem oder mehreren Polymoφhismen unter anderem in den Genen für 5-Lipoxy- genase oder Cytochrom P450 untersuchen, die eine veränderte Verstoffwechselung von Wirkstoffen zur Folge haben. Dadurch ließe sich die Wirkstoff-Therapie individuell an den Genotyp des jeweiligen Individuums anpassen.
Das kennzeichnende Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens, das räumlich definierte Hybridisieren von jeweils einem Probenmolekül mit jeweils einem Sondenmolekül in einem Hybridisierungsfeld, ist natürlich auch für Nuklein- säureanaloga wie etwa PNAs durchführbar. Auch können Probe und Sonde von ganz anderer Natur sein, z.B. Proteine oder Peptide im Antiköφerscreening oder auch Kohlenhydrate wie Zuckerketten an Glykoproteinen zum Screening von niedermolekularen Liganden (Antigenen) aller Stoffklassen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit auf alle Nachweisverfahren angewendet werden, bei denen parallel die spezifische Interaktion zwischen zwei Molekülen (Sonde und Probe), die zueinander komplementäre Bindungseigenschaften haben, durch Hybridbildung nachgewiesen wird. Insofern ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf den Nachweis von SNPs beschränkt, sondern kann auch verwendet werden, um parallel mehrere Spezies in einer Probe, z.B. durch rDNA-Hybridisierung nachzuweisen. Ebenfalls kann die Genaktivität einer Zelle sowie die Expression bestimmter Gene durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden.
Dabei ist dem Fachmann bekannt, dass der Nachweis der Hybride auf dem Chip durch eine Reihe von zusätzlichen, bisher nicht erwähnten Nachweismethoden erfolgen kann. Beim rDNA-basierten Nachweis von Mikroorganismen können die Probenmoleküle z.B. durch Verwendung entsprechend markierter Primer bereits während der Amplifikation z.B. mit den bereits erwähnten Fluorophoren markiert werden. Das Nachweisverfahren besteht darin festzustellen, ob markierte Hybride auf dem Mikroarray nachgewiesen werden können. Das gleiche Nachweisverfahren kann bei der Analyse der Genaktivität angewandt werden, wenn während der PCR- Amplifikation der cDNA (siehe oben) entprechend markierte Primer eingesetzt werden. Weitere Nachweismethoden sind dem Fachmann bekannt.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann üblicherweise die folgenden Schritte umfassen:
Im Folgenden wird zunächst ein Beispiel angegeben, das in exemplarischer Weise verdeutlicht, wie durch ein erfindungsgemäßes Verfahren mehrere SNPs mehrerer Individuen gleichzeitig auf einem Chip nachgewiesen werden können. Dem Fachmann ist dabei geläufig, wie er durch Optimierung und Variation der einzelnen dargestellten experimentellen Schritte das Verfahren seinen jeweiligen Bedürfnissen anpassen kann. Die Beispiele sind nicht einschränkend zu deuten.
Zunächst werden singuläre SNPs mittels Bioinformatik und öffentlichen Sequenzdatenbanken ermittelt. Durch unterschiedliche Genom-Projekte stehen Millionen von Sequenzen exprimierter Gene (cDNAs) aber auch Gesamtgenome zur Verfügung. Darüber hinaus gibt es Datenbanken (z.B. am NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), die explizit die Position von SNPs im Genom verschiedener Organismen angeben. Ausgehend von diesen SNP -Datenbanken oder durch Vergleich von eigenen Sequenzdaten mit den entsprechenden Referenzsequenzen in öffentlich zugänglichen Datenbanken können SNPs identifiziert werden.
In einem zweiten Schritt werden dann Primer für eine PCR abgeleitet, die das genomische Fragment amplifizieren, das den nachzuweisenden Polymoφhismus trägt. Dabei muss ein Teilbereich eines der beiden Primer zu einem Teilbereich des späteren Extensionsprimers (der Sonde) sequenzgleich sein, um die Hybridisierung der Sonde mit dem Target mit 100%iger Sicherheit zu garantieren. Der Primer, der zur Amplifikation des zur Hybridisierung benötigten Strangs verwendet wird, kann eine Modifikation tragen, die davor schützt, von einer 5'-Exonuklease abgebaut zu werden (z.B. eine Phosphoro-Thioat-Modifikation). Primer können z.B. mit der Software Primer3 (Whitehead Institute, MIT, Steve Rozen, Helen J. Skaletsky, 1996 und 1997; abrufbar unter http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software /other/primer3.html) entworfen werden.
Optional kann eine vergleichende Sequenzierung der amplifizierten Fragmente in verschiedenen genetischen Hintergründen zur Verifikation, Qualitätskontrolle und Auswahl geeigneter Marker durchgeführt werden.
Im nächsten Schritt werden dann 5'-amino-modifizierte Sondenmoleküle ebenfalls mit der Primer3 Software entworfen und synthetisiert. Die Bestellung erfolgt bei bekannten Herstellern wie Metabion, Martinsried, Deutschland. Die Sonden sind so gewählt, dass sie an ihrem 3 '-Ende genau ein Nukleotid vor der polymoφhen Position des zu untersuchenden Polymoφhismus enden. Die einzelsträngigen Sondenmoleküle werden dazu verwendet, Biochips in Arealen flächig zu beschichten. Diese Beschichtung wird von Firmen durchgeführt, die auf die Beschichtung von Oberflächen mit DNA-Molekülen spezialisiert sind, wie etwa der Firma RoboScreen, Leipzig, Deutschland. Alternativ kann auch die Beschichtung von Epoxy-modifizierten Biochip-Rohlingen (z. B. Epoxy-Slides, Fa. Quantifoil, Jena) vom Experimentator selbst durchgeführt werden.
Entweder vor oder nach der Beschichtung mit den Sondenmolekülen kann eine Trennmatrix, z. B. aus Silikonkautschuk, aufgebracht werden, die die Hybridisierungsareale zusätzlich gegeneinander abtrennt.
Unter Verwendung der bereits erwähnten PCR-Primer werden dann die ver- schiedenen genomischen Loci der verschiedenen zu untersuchenden Individuen durch PCR amplifiziert. Die Annealingtemperatur der Primer liegt zwischen 50 und 68°C, bevorzugt zwischen 55 und 60°C. Die Größe der amplifizierten Fragmente liegt zwischen 40 bis 500 Basenpaaren, bevorzugt zwischen 50 und 250 Basenpaaren, besonders bevorzugt zwischen 50 und 150 Basenpaaren, insbesondere zwischen 50 und 100 Basenpaaren und am meisten bevorzugt zwischen 50 und 90 Basenpaaren.
Typische Reaktionsbedingungen umfassen:
10 ng/μl genom. DNA-Template
0,2 mM dNTPs l,5 mM MgCl2 lOx Reaktionspuffer je 5 μM forward und reverse Primer 0,02 U/μl Taq-Polymerase
Die Polymerase und der Reaktionsspuffer werden üblicherweise von Qiagen, Deutschland bezogen. Das Temperatuφrotokoll der PCR sieht üblicherweise folgendermaßen aus:
1 Zyklus: 5 min bei 94°C
35 Zyklen: 20 sec bei 94°C 30 sec bei Annealingtemperatur (50 bis 68°C)
25 sec bei 72°C
1 Zyklus 2 min bei 72°C
Anschließend erfolgt der Verdau des nicht geschützten amplifizierten Strangs, der die gleiche Sequenz wie das Sondenmolekül trägt, durch eine hinsichtlich der PTO- Modifikation selektive Exonuklease, z.B. T7 Gen 6 5'-Exonuklease, nach den Herstellerangaben (Fa. Amersham-Pharmacia Biotech).
Nach Inaktivierung der 5 '-Exonuklease (z.B. Inkubation für 5 Minuten bei 90°C), wird dann die Einzelstrangprobe mit dem zu ihr komplementären Sonden-Oligo- nukleotid in einem Hybridisierungsfeld des Hybridisierungsareals mit Hilfe eines Mikroarray- (z. B. Microgrid® II 600, Fa. Biorobotics) bzw. Pipettier-Roboters (z.B. Hamilton Microlab® Star) oder durch eine Handpipette in Kontakt gebracht und dadurch die Hybridisierung ausgelöst. Die Positionen der Sonde und der untersuchten Individuen sind bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die entstehenden Hybride getrocknet, indem man die Flüssigkeit verdunsten lässt.
Nach der Hybridisierung kann die Trennmatrix, sofern vorhanden, wieder entfernt werden, indem sie mit einer Pinzette rückstandsfrei vom Träger abgezogen wird. Dadurch entsteht ein einziges, großes Reaktionsfeld, in dem die Nachweisreaktion durchgeführt wird. Sollen in den einzelnen Arealen unterschiedliche Extensions- gemische verwendet werden, kann die Trennmatrix auf dem Objektträger verbleiben. Soll in mehr als einem, aber nicht allen Arealen das gleiche Extensionsgemisch verwendet werden, kann mehr als eine Trennmatrix aufgebracht werden, wobei für manche Trennmatrizes die Extension dann entfernt werden und manche auf dem Träger verbleiben. Dadurch wird eine möglichst kostengünstige Analyse ermöglicht.
Es folgt die Extensionsreaktion auf dem Chip, die mit Sequenase™ und unterschiedlich fluoreszenzmarkierten ddNTPs in Sequenase™-Puffer bei 50-70°C, in jedem Falle unterhalb der Schmelztemperatur des Hybrids, durchgeführt wird. Dazu wird der Chip mit dem Reaktionsgemisch verdunstungssicher abgeschlossen. Dies erfolgt entweder durch die verbleibende Trennmatrix oder, wenn keine Trennmatrix verwendet wurde oder die Trennmatrix bereits nach der Hybridisierung entfernt wurde, durch eine den Objektträger umschließende Silikonkautschuk-Abdichtung (z.B. Casil 40 IT), die den Objektträger gegen einen Deckel (zweiter Objektträger oder Deckglas) abdichtet.
Der SNP -Nachweis erfolgt in diesem Fall durch die Verlängerung des Hybridmoleküls auf der Chipoberfläche um ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid (sog. „single base extension"), wobei das Sonden-Oligonukleotid als Primer und die hybridisierte Einzelstrangprobe als Template fungieren. Da die Nukleotide unterschiedlich fluoreszenzmarkiert sind und nicht weiter im Rahmen der
Extensionsreaktion verlängert werden können, wird nur das Nukleotid eingebaut, das zu dem jeweiligen SNP komplementär ist.
Nach Durchführung der Extensionsreaktion wird der Chip einmal mit heißem destillierten Wasser, das mit bis zu 0,1-2% SDS versetzt sein kann und einmal mit lx SSC plus 0,1% SDS gewaschen, mit dest. Wasser abgespült und im Stickstoffstrom getrocknet. Dann wird der Chip in einen Laserscanner (z. B. GSI LS IV, Fa. GSI Lumonics oder Typhoon, Fa. Amersham Pharmacia) oder einen anderen Scanner (z. B. StormReader, Fa. Molecular Dynamics oder ImageScanner, Fa. Amersham Pharmacia) gegeben, der in wenigen Sekunden die Farbe (emittierte Wellenlänge) des verlängerten Sondenmoleküls erkennt und aufgrund der gemessenen Wellenlänge die Identität des SNPs am jeweiligen Probenpunkt auf dem Chip feststellt. Hierbei werden die physikalischen Eigenschaften der Farbstoffe bei der Wahl der Laser/Filter-Systeme nach Empfehlung der Hersteller (z. B. Fa. GSI Lumonics) berücksichtigt. Die Ergebnisse werden als Intensitätswerte der
Fluoreszenz (z.B. 65536 Graustufen bei den Wellenlängen der fluoreszenzmarkierten ddNTPs) direkt in einer Datenbank abgelegt.
Im folgenden wird die Erfindung an einem konkreten Beispiel erläutert. Dies ist nicht einschränkend zu deuten.
Beispiel 1 : Nachweis von 48 Loci in 4 Kultivaren
Im folgenden wird der Nachweis von 48 Loci in 4 Kultivaren der Gerste beschrieben. In Abb. 1 bis 3 sind beispielhaft die Position der zur PCR verwendeten Primer bezüglich der Sequenz eines der untersuchten Loci dargestellt. In diesem Beispiel wird ein SNP bezüglich Thymidin (T) und Cytosin (C) untersucht.
Zunächst wurden die Sequenzinformationen von 48 singulären Nukleotid-Poly- moφhismen (SNPs) von Hordeum vulgäre L mittels Bioinformatik in EST- und genomischen Sequenzdatenbanken beim NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ermittelt. Der Beispiel-Locus hat den Accession code: gi9410596.
Dann wurden mit der Software Primer3 (Whitehead Institute, Massachusetts Institute of Technology (MIT) Steve Rozen, Helen J. Skaletsky, 1996, 1997) genomische PCR Primer zur Amplifikation des Probenmoleküls entworfen. Die Kompilierung des Quellcodes unter SuSE Linux, Kernel 2.4. erfolgte nach Angaben des Programmierers in der Dokumentation beim Quellcode und von der Internetseite (http://www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html). Die genomischen Primer wurden so entworfen, dass sie genomische Fragmente amplifizieren, die die zu untersuchenden SNPs tragen (Abbildung (Abb.) 1, grau hinterlegtes Y). Einer der beiden Primer trägt Phosphorothioat-Bindungs- modifikationen am 5 '-Ende und der andere, nicht-modifizierte Primer entspricht in der Sequenz dem späteren Extensionsprimer (Sonde, Abb. 3 und 4 |Oligonukleotid in|
PBox|), um nach der Amplifikation die fehlerfreie Hybridisierung der Sonde vom 3 'Ende her mit dem dann einzelsträngigen PCR-Fragment zu garantieren. Der reverse Primer (PTO-Primer), der den hybridisierenden Halbstrang bildet, benötigt eine Modifikation, um ihn vor dem Abbau durch eine 5 '-Exonuklease zu schützen.
Es wurde dann eine vergleichende Sequenzierung (ABI Sequenzer 3700, Rhodamin- Sequencing-Kit, Applied Biosystems, USA) der amplifizierten PCR-Fragmente mit jeweils einem der beiden PCR Primer in verschiedenen genetischen Hintergründen zur Verifikation, Qualitätskontrolle und Auswahl geeigneter Marker durchgeführt.
Anschließend wurden 5'-aminomodifizierte Sondenmoleküle entworfen, die 3' genau ein Nukleotid vor der polymoφhen Position enden (Software Primer3, siehe oben; Abb. 3 und 4, |Oligonukleotid in Box|). Die Synthese der Sonden wurde bei der
Metabion GmbH, Deutschland in Auftrag gegeben. Die Sondenmoleküle trugen als ftinktionelle Linker-Gruppe eine NH2-Gruppe, die über einen C1 -Spacer an die Sonde gekoppelt war. Diese Sondenmoleküle wurden zur Herstellung von 48 Oligonukleotidarealen mit einer Fläche von 16 mm2 und einem Abstand von 1 mm verwendet. Dazu wurde eine Lösung von mindestens 500 fmol/μl des Cn-Amino- modifizierten Oligonukleotids verwendet, um zu gewährleisten, dass bereits die Bindehäufigkeit von einem von 1000 Oligonukleotidmolekülen ausreicht, um die
Nachweisgrenze des Fluoreszenzlesegeräts (GSI-Scanner IV, Packard Bioscience) zu überschreiten. Diese Lösung wurde mit 50% QMT™-Puffer (Fa. Quantifoil, Jena) in Punkten von ca. 150 μm Durchmesser im Abstand von 100 bis 150 μm mit einem Mikroarray-Roboter auf den Objektträger (s) aufgebracht, so dass sich die Tropfen vereinigen konnten und eine kontinuierliche Beschichtung in quadratischen Arealen (a) erreicht wurde (Abb. 5/1). Dadurch wurde eine Dichte der Sondenmoleküle von 0,5 bis 5 Molekülen pro μm2 erreicht.
Danach erfolgte die Bindereaktion:
• 5 min bei 4°C
• im sauberen (keine löslichen, pH-verändernden reaktiven Gase vorhanden) Laborraum bei Raumtemperatur (25 °C) und mind. 60% Luftfeuchte leicht beschlagen (feucht, aber nicht nass) lassen
• dann UY-Crosslinking mit 2 x 300 J/cm2 zur irreversiblen Anbindung der Hybridmoleküle an die Chipoberfläche.
Dadurch reagiert die Epoxy-Gruppe des Chips kovalent mit den 5'-Aminogruppen am Ci2-Spacer der Sondenmoleküle und fixiert diese dadurch auf der Chipoberfläche.
Nach der Bindereaktion erfolgte das Aufbringen der gitterformigen Trermmatrix (g) (aus dem transparenten und thermostabilen Elastomer C ASIL 401 T; von der
Fa. Incasil GmbH, Ludwigsburg, Deutschland maßangefertigt), so dass die einzelnen
Hybridisierungsareale (a) zusätzlich gegeneinander abgetrennt wurden (Abb. 5/II).
Zur Identifizierung des Objektträgers (s) trug dieser einen Strichcode (b), der von einem Lesegerät erfasst werden kann.
Danach wurden die 48 PCR-Fragmente aus genomischer DNA der 4 Kultivaren amplifiziert. Ein Beispiel für genomische Primer am Locus ist in Abb. 2 gegeben.
Im Beispiel betrug die Annealing-Temperatur 51°C. Die amplifϊzierte Fragment- große betrug 174 Basenpaare. Die PCR wurde gemäß den Angaben des Polymeraseherstellers (Qiagen GmbH, Deutschland) nach folgendem Protokoll durchgeführt:
lO ng/μl genomische DNA
0,2 mM dNTPs
1,5 mM MgCl2
1 Ox Taq-Reaktionspuffer (nach Hersteller- Angaben) je 5μM forward und reverse PCR-Primer
0,02 Units/μl Taq-Polymerase
Folgendes Temperatur Protokoll wurde verwendet:
35 Zyklen: 20 sec bei 94°C
30 sec bei 51°C
25 sec bei 72°C
Danach wurden die amplifizierten PCR-Fragmente durch Zugabe von 2 Volumen (Vol) reinem Ethanol und 1/10 Vol 3 M Natriumacetat pH 4,5 bei 4°C gefällt, und bei 14000 φm und 4°C für 45 min zentrifugiert. Anschließend wurde das Präzipitat zweimal durch Zugabe von 70% Ethanol gewaschen und dazwischen erneut bei
14000 φm und 4°C für 15 min zentrifugiert. Nach dem Trocknen des Pellets wurde es in 6 μl destilliertem Wasser aufgenommen.
Danach erfolgte der Abbau des nicht mit den 5'PTO-Bindungen versehenen und daher ungeschützten (Gegen-)Strangs in den Fragmenten durch die hinsichtlich PTO selektive 5 'Exonuklease T7 Gen 6 (Fa. Amersham Pharmacia-Biotech) unter Schonung des für die Analyse relevanten, zum Sondenmolekül komplementären DNA-Strangs. Das Protokoll nach Angaben des Herstellers sah folgendermaßen aus:
2 μl gefälltes PCR-Produkt
0, 1 μl Exonuklease 1,9 μl dest. Wasser
1,0 μl 5 x Exonukleasepuffer (siehe
Herstellerangaben)
Nach einer Inkubation für 60 min bei 37°C erfolgte die Inaktivierung der 5'-Exo- nuklease durch Erhitzen für 20 min bei 85°C. Die Lösung mit dem einzelsträngigen Probenmolekül im Exonukleasepuffer wurde mit Polyethylenglykol (mit einem Polymerisationsgrad von 3000-5000 Untereinheiten) zu einer Endkonzentration von 0,2% versetzt.
Anschließend wurden mit Hilfe eines Mikroarray-Roboters (Microgrid® II 600, Fa. Biorobotics) 2 μl der vom Gegenstrang befreiten Einzelstrangprobe (p) auf ein Hybridisierungsfeld (f) im durch die Trennmatrix (g) abgetrennten Hybridisierungsareal (a) pipettiert, welches das Oligonukleotid enthält, das die an den SNP angrenzende komplementäre Region umfasst (Abb. 5/III). Der Tropfen wurde getrocknet durch langsames (5 bis 15 min) Verdunsten der Flüssigkeit, wobei sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Sonden- und Probenmolekül bilden. Um das Verdunsten zu verlangsamen, wurde über einem Wasserbad gearbeitet, so dass eine Luftfeuchtigkeit von 60 bis 70% vorlag. Während des Trocknens fand die Hybridisierung von Proben- und Sondenmolekül statt (siehe Abbildung 3). Während dieser Reaktion wurden die anderen Hybridisierungsfelder des Hybridisierungsareals (in diesem Beispiel drei) in einem Abstand von 0,3 mm zueinander mit Hilfe eines Mikroarray-Roboters (siehe oben) mit den Probenmolekülen beladen. Anschließend wurden 30μl des Extensionsreaktionsgemischs mit der Zusammensetzung :
6 μl 5x Sequenase-Puffer (Amersham) 2,4 μl lμM Cy5-ddATP (NEN/PerkinElmer)
2,4 μl 1 μM Rl 10-ddGTP (PerkinElmer)
6,1U Sequenase™ ad 30 μl dest. Wasser
auf das korrespondierende Hybridisierungsareal (a) des Arrays aufgebracht. Die Extensionsreaktion erfolgte bei 50°C für lh in der verdunstungssicheren Kammerkonstruktion des Thermocycler in situ PCR System 1.000 (Perkin Eimer in situ PCR System 1.000 plus Zubehör). Die verdunstungssichere Kammerkonstruktion entsteht dadurch, dass die verbleibende Trennmatrix (g) den Objektträger (s) gegen einen zweiten Objektträger, der als Deckel (d) dient, abdichtet (Abb. 5/IV). Der Deckel wurde von einer Seite her luftblasenfrei auf die Trennmatrix und das Extensions- gemisch gelegt und mit einer Klammer (AmpliCover Clip, Fa. PerkinElmer) fixiert. Abb. 4 zeigt die Extensionsreaktion für den beschriebenen SNP Y.
Der Chip wurde dann 5 sec auf Eis gekühlt und unmittelbar nach Öffnen der
Klammer mit heißem dest. Wasser bei 80°C und mit lx SSC mit 0,1% SDS bei 60°C (Sambrook et al., 2001, vide supra) gewaschen. Nach kurzem Spülen mit dest. Wasser wurde der Chip im Stickstoffstrom getrocknet.
Der Chip wurde mit dem Laserscanner GSI LS IV (Fa. GSI Lumonics) analysiert. Dazu wurden die Probenpunkte mit den nun fluoreszenzmarkierten verlängerten Extensionsprimern mit monochromatischem Licht bei 488 nm und 650 nm angeregt und das emittierte Licht bei 525 nm und 667 nm gemessen und registriert. Die physikalischen Eigenschaften der Farbstoffe wurden bei der Wahl der Laser/Filter- Systeme und der eingesetzten Laserenergien nach Empfehlung des Geräteherstellers (Manual der Firma Genomic Solutions, USA) berücksichtigt. So wurde die Farbe (emittierte Wellenlänge des fluoreszenzmarkierten Nukleotids) des verlängerten Sondenmoleküls und damit die Identität des SNPs am jeweiligen Probenpunkt auf dem Chip festgestellt.
Die Ergebnisse (Basenzustände in der jeweiligen SNP-Position) wurden als Intensitätswerte der Fluoreszenz direkt in einer Datenbank abgelegt. Die benutzte Software war GT Scan-Software, GSI Analyzer (sowie zugehörige Dokumentation).
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 : Hordeum vulgäre L. (Gerste)-EST-Locus aus der NCBI-Genbank-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Datenbankeintrag: gi9410596, fett, unterstriehen: Primersite. fett, kursiv, unterstrichen: komplementäre PTO-Primersite, Y: SNP)
Abb. 2: Genomische PCR des SNP-enthaltenden Fragments (Größe: 174 bp, Vorwärts-Primer: grau, schwarz unterlegt, PTO-Reversprimer: grau unterlegt; durch Phosphorothioat-Bindungen verknüpfte Nukleotide: weiß, fett, schwarz unterlegt)
Abb. 3: Anlagerung (PTO-geschütztes Fragment an den auf dem Areal fixierten Extensionsprimer) im Hybridisierungsfeld des Areals und vor der Extension: Bildung eines Hybridmoleküls zwischen Extensionsprimer (|θligonukleotid in Box) mit
Amino-C12-Modifιkatϊorϊ> einerseits, und dem dazu komplementären PTO- geschützten Einzelstrang andererseits (SNP: fett, größer, grau hinterlegt) Abb. 4: Extensionsreaktion auf dem Chip
Enzymatisches Anhängen genau eines SNP-komplementären fluoreszenzmarkierten
Didesoxynukleotids o. a. Terminators (weiß, größer, grau hinterlegt: ddRTP ist ddGTP oder ddATP) an den hybridisierten [Extensionsprimerj
Abb. 5: Verfahrensschritte, die mit dem Objektträger durchgeführt werden (Anmerkung: Die Zeichnung ist maßstabsgerecht mit Ausnahme der vertikalen Ausdehnung des Areals (a) in Abb. 5/IV und V, die nur zur Verdeutlichung dargestellt ist) I. Flächige Beschichtung des Objektträgers (s) mit Oligonukleotidsonden in
Hybridisierungsarealen (a) II. Aufbringen der Trennmatrix (g) auf den in Hybridisierungsarealen (a) mit Sondenmolekülen beschichteten und mit einem Strichcode (b) versehenen Objektträger (s) III. Aufbringen der Probenmoleküle (p) in Hybridisierungsfelder (f) innerhalb der durch die Trennmatrix (g) gegeneinander abgetrennten Hybridisierungsareale (a)
IV. Befestigen des Deckels (d) zur Durchführung der Extensionsreaktion in den durch die Trennmatrix (g) gegeneinander abgetrennten Hybridi- sierungsarealen (a) auf dem Objektträger (s)
V. Abdichten des Objektträgers gegen den Deckel mit einer Silikonkautschukabdichtung (o) und Analysieren der Probenpunkte (p) nach der Primer Extension
VI. Alternative Ausführungsform zur Hybridisierung von 16 Proben- molekülen in Hybridisierungsfeldern (f) mit in 192 Hybridisierungsarealen (a) immobilisierten Sondenmolekülen
VII. Alternative Ausführungsform zur Hybridisierung von 4800 Probenmolekülen (p) in Hybridisierungsfeldern (f) mit in einem Hybridisierungsareal (a) immobilisierten Sondenmolekülen gleicher Sequenz

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend die nachfolgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge:
a) Flächiges Anordnen und Immobilisieren eines oder mehrerer einzelsträngiger Nukleinsäuremoleküle (Sondenmoleküle) in Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm auf einem Träger, b) Mischen und Hybridisieren jeweils eines bestimmten Sondenmoleküls in einem räumlich definierten Hybridisierungsfeld innerhalb des Hybridisierungsareals mit jeweils einem zweiten einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül (Probenmolekül), dessen Sequenz zu der des Sonden- moleküls mindestens teilweise komplementär ist, so dass die beiden Nukleinsäuremoleküle mindestens über die komplementäre Sequenz miteinander hybridisieren können, wobei innerhalb eines Hybridisierungsareals Probenmoleküle des gleichen Locus, aber unterschiedlichen Ursprungs in verschiedenen Hybridisierungsfeldern mit dem gleichen Sondenmolekül hybridisieren können, c) Nachweisen der Hybridisierung mit einem geeigneten Nachweisverfahren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die sich in einem Hybridisierungsfeld bildenden Hybride getrocknet werden, bevor im benachbarten Hybridisierungsfeld Sonden- und Probenmolekül miteinander in Kontakt gebracht werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Hybridisierungsareale durch eine abnehmbare Trennmatrix gegeneinander abgetrennt sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Fläche der Hybridisierungsareale mindestens 0,5 mm2 ist, bevorzugt ist sie mindestens 4 mm2, besonders bevorzugt ist sie mindestens 16 mm und am meisten bevorzugt ist sie mindestens 256 mm .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Abstand zwischen den Hybridisierungsfeldern bei manuellem Aufbringen des Probenmoleküls mindestens 1,5 bis 2 mm und bei automatisiertem Aufbringen mindestens 0,1 bis 1 mm beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Trennmatrix aus einem gegen den Träger abdichtenden, reißfesten, chemisch inerten Material besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Material für die Trennmatrix Silikonkautschuk ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis eines Nukleotidpolymoφhismus (SNP), wobei das Probenmolekül den nachzuweisenden SNP aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Sondenmoleküle, die jeweils verschiedene Loci repräsentieren, und Probenmoleküle verschiedener Individuen zur parallelen Analyse verwendet werden.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei in Schritt c) der Nachweis des
SNP über Auswertung der Hybridisierungsreaktion durch Template-abhängige Extension des Sondenmoleküls, das innerhalb des Hybrids als Primer dient, unter Einbau von markierten Nukleotiden oder -analoga erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Nachweis durch enzymatische Template-abhängige Extension des Sondenmoleküls, das innerhalb des Hybrids als Primer dient, unter Einbau eines zum Kettenabbruchs führenden markierten Nukleotids oder -analogons erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei es sich bei den Nukleotid- analoga um ddNTPs handelt und N für A, T, C, G steht.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei die zur Markierung ver- wendeten Moleküle Cyanin-Farbstoffe, bevorzugt Cy3 und/oder Cy5, Renaissance- Farbstoffe, bevorzugt ROX und/oder Rl 10 und/oder Fluorescein-Farbstoffe, bevorzugt FAM und/oder FITC umfassen.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die einzel- strängigen Probenmoleküle durch PCR-Amplifikation und selektiven enzymatischen Verdau eines Strangs, durch asymmetrische PCR und/oder durch Affinitätsreinigung eines der amplifizierten Stränge erhalten werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die einzel- strängigen Sondenmoleküle durch chemische Synthese erhalten werden.
16. Träger zum Nachweis von Nukleotidpolymoφhismen, auf dem Sondenmoleküle in Hybridisierungsarealen mit einer Mindestgröße von 0,5 mm2 flächig angeordnet und immobilisiert sind.
17. Träger nach Anspruch 16, der eine abnehmbare Trennmatrix aus chemisch inertem Material enthält, durch die die Hybridisierungsareale gegeneinander abgetrennt werden.
18. Kit zum Nachweis von Nukleotidpolymoφhismen, umfassend einen Träger nach Anspruch 16 oder 17.
19. Kit zum Nachweis von Nukleotidpolymoφhismen, umfassend einen Träger nach Anspruch 16 oder 17, einen oder mehrere Primer für die PCR-
Amplifikationen nach Anspruch 14 sowie Reagenzien zur Erzeugung von Einzelsträngen aus den PCR-Produkten nach Anspruch 14.
20. Kit zum Nachweis von Nukleotidpolymoφhismen, umfassend einen Träger nach Anspruch 16 oder 17, einen oder mehrere Primer für die PCR-
Amplifikationen nach Anspruch 14, Reagenzien zur Erzeugung von Einzelsträngen aus den PCR-Produkten nach Anspruch 14 und Reagenzien für die Template- abhängige Extension nach den Ansprüchen 10 bis 13.
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