WO2004099215A1

WO2004099215A1 - ビンカアルカロイドおよびその塩の利用

Info

Publication number: WO2004099215A1
Application number: PCT/JP2004/006567
Authority: WO
Inventors: Kazuo Umezawa; Hisako Ohgawara; Itaru Kojima; Takashi Koyano
Original assignee: Keio University
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2004-05-10
Publication date: 2004-11-18
Also published as: EP1623986A1; US20090239301A1; JP4696303B2; US8394629B2; EP1623986A4; US20070232533A1; JPWO2004099215A1

Abstract

ビンカアルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する薬剤は、膵臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成及び／又は分泌を誘導することができる。

Description

明細書ビン力アル力ロイドおよびその塩の利用関連文献とのクロスリファレンス

本願は、 2 0 0 3年 5月 9日付けで出願した日本国特願 2 0 0 3 - 1 3 1 2 5 6号に基づく優先権、及び 2 0 0 3年 1 0月 3 1日付けで出願した日本国特願 2 0 0 3 - 3 7 3 6 6 5号に基づく優先権を主張する。これらの文献を本明細書に援用する。技術分野

本発明は、ビン力アルカロイドおよびその塩の利用に関し、より詳細には、瞵臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成及び z又は分泌能を増加させる薬剤、糖尿病治療薬、血糖値低下剤、膝臓由来の非腫瘍細胞の分化を誘導する方法、睥臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成及び Z又は分泌能を増加させる方法、インスリン生成能が増加した膝臓由来の非腫瘍細胞を製造ザる方法、膝臓由来の非腫瘍細胞の培養方法、インスリンの製造方法、分化が誘導された膝臓由来の非腫瘍細胞、並びにィンスリン生成及び z又は分泌能が増加した膝臓由来の非腫瘍細胞に関する。背景技術

糖尿病は血中ィンスリンの不足や作用不全のため血中の糖濃度が増加し、合併症として神経障害、視覚障害、腎障害などが起こる疾患である。日本だけでも約

7 0 0万人の糖尿病患者が存在する。糖尿病には 1型と 2型があり、 1型はインスリンを生産する瞵細胞が自己免疫疾患的に破壌され、絶対的なインスリン不足により起こる。一方、 2型糖尿病は、筋、脂肪、肝など標的組織のインスリン抵抗性が発現すること、および膝細胞の機能低下による血中ィンスリン量の低下が原因である。そこで 1型、 2型いずれの糖尿病の場合も瞵 0細胞の作用不全によるものということができる。従来の技術.として血糖値を下げるため 1型にはィンスリン注射が殆どのケースで用いられている。この時、 1日約 4回の注射が患者にとって苦痛になっているのはいうまでもない。 2型の治療には、例として、インスリン抵抗性を低減させる PPAR v阻害剤が使われているが、効果は不充分であり、副作用として肥満が指摘されている。さらに細胞からインスリン放出を促進するスルホエルユレァ剤などが使われているが効果は充分でない。

薬剤を用いて糖尿病を治療することに対し、近年、全く新しい方法である細胞や組織の移植による治療は再生治療として期待されている。 1型糖尿病患者に大量のィンスリン放出能を持つ細胞を移植できれば、長期間、 1日 4度のィンスリン注射を行わないですむ。一方、 2型糖尿病でも、標的組織のインスリン抵抗性があってもインスリンが正常に生産されれば血糖値は上がらないので、インスリン放出細胞の移植は有効である。移植による効果はスルホニルュレアなど現在使われている β細胞からインスリンを放出させる薬剤より格段に優れていることが期待される。

手に入れることの容易さや免疫学的特性などからブタ膝細胞は糖尿病再生治療への利用が期待されている細胞であるが、今までいずれの細胞系でも大量の細胞を集め、充分にィンスリン生産 ·放出細胞に分化誘導する技術は知られていなかった。

膝臓の J3細胞は胎児期にそのほとんどが形成された後は非常にゆつくりと増殖-分化している（Herrera, P. L. ら Development 127 : 2317—2322 (2000) )が、膝臓がダメージを受けた場合にはその分化や増殖が活発になることが実験でも証明されており、大人のマウスにおいて膝を 90。/。切除したマウスにおいてもァロキサンによって J3細胞を破壌し耐糖能異常を起こしたマゥスにおいても膝臓の導管細胞から ]3細胞の分化増殖と残存の細胞の増殖が起こることなどから成人の膝臓においても幹細胞が存在し、再生能力を有することが知られてきた（Bo nner-Wier, S.ら Diabetes 42： 1715 - 1720 (2000) )。そのため、導管から幹細胞を取り出しインスリン生成細胞に分化させる実験が行われた（Ramiya, V. K.ら N ature Med. 6 : 278—282 (2000)及び Bonner - Weir, S.ら Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97： 7999-8004 (2000) )。し力し、脖臓の幹細胞のマーカーは不明であったが、神経前駆細胞に発現するマーカーである nest inが膝幹細胞のマーカーであると昨年報告され、成人の膝臓の導管にもあることが確認された（Hunziker, E.ら Biochem. Biophys. Res. Commun. 271： 116— 119 (2000) ) 。さらに in vitro での培養、インスリン生成細胞を含む表現形細胞への分化に成功し（Zulewski, H.ら Diabetes 50 : 521— 533 (2001) )、また ES細胞から腌島様の組織への分化にも成功しており（Lumelysky, N.ら Science 292： 1389-1394 (2001) )、薛臓の再生医療として臨床での応用が期待されている。

このように、脖 i3細胞の材料となりうる細胞の研究が進む一方、藤臓の β細胞の分化を誘導するような生理活性物質は再生医療の分野で応用できることが期待される。現在までに細胞への分化を誘導する物質として知られているのは TG F— スーハ。一ファミリーに属する activin A (Demeterco， C. J.ら Clin. Endo. 85: 3892 - 3897 (2000) )や EGFファミリーに属する betacellulin (BTC) (Ishiyaraa, N.ら Diabetologia 41： 623-628 (1998)及び Yatnamoto, K.ら Diabetes 49： 2021 - 2027 (2000) )、肝細胞成長因子 (HGF： hepatocyte growth factor) (Ocana, A. G.ら J. Biol. Chem. 275 : 1226 - 1232 (2000) )、 basic fibroblast growth fact or (bFGF) (Assady, S. ら Diabetes 50： 1691-1697 (2001) )などがある。これらはタンパク質である点から経口投与には適さず、また注射による導入は免疫的な問題や不安定さから難しい。一方、低分子化合物ではニコチンアミドがポリ AD Pリポース合成酵素の阻害剤として働き、脖 ]3細胞の再生を促進させること（Wata nabe, T.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91： 3589—3592 (1994)及び Sjohorm, A. ら Endocrinology 135 : 1559- 1565 (1994) )や同時に瞵 ]3細胞の増殖と分化を促進する Reg蛋白（Akiyama, T.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98： 48-53 (2001) )の発現を促進させることが報告されている（Watanabe, T.ら Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 91： 3589-3592 (1994) )。また酪酸ナトリウム（sodium butyrate) や d examethasone (Korsgren, 0.ら、 Upsala J. Med. Sci. 98： 39—52 (1993) )にも f etal porcine pancreatic islet-like cell cluster (ICC)をィンスジン生成細胞に分化させることが報告されているが特異性が低いため実用化は低い。

一方、マレーシアやタイのキヨゥチクトウ科の植物の葉から単離されるアル力ロイドのコノフィリン（Umezawa, K.ら、 Anticancer Res. 14： 2413-2418 (199 4) )およびコノフイリジン（Kam， T. S.ら、 J. Nat. Prod. 56： 1865-1871 (199 ³))の構造が図 1のように知られている。コノフィリンは動物で抗癌活性を示すことが知られている（Umezawa, K.ら、 Drugs Exptl. Clin. Res. 22： 35-40 (199 6))。

また、コノフイリンが瞵腺房腫瘍細胞 AR42J- B13のィンスリン生成を誘導することが知られている（第 4 5回日本糖尿病学会年次学術集会（東京、 2002年 5月 1 8日）要旨集 01- 21) )。しかし、この癌細胞は培地にィンスリンを放出しなかつた。本発明は、膝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成及び/又は分泌を誘導する 'ことができる薬剤を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意努力した結果、ビン力アル力ロイドが正常な滕細胞に対して in vitroで顕著にィンスリン生成 ·放出細胞への分化を誘導することを見い出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の要旨は以下の通りである。

1 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、脖臓由来の非腫瘍細胞のインスリンの生成能を増加させる薬剤。前記ビンカアルカロイドとしては、コノブイリンを用いることが好ましい。なお、前記薬剤は、さらに、ニコチンアミド、又は、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含んでいることが好ましい。

2 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩、及びニコチンアミドを有効成分として含有する、膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリンの分泌能を増加させる薬剤。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。なお、前記薬剤は、さらに、肝細胞成長因子（HGF) を含んでいることが好ましい。

3 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、インスリンの欠乏が関与する疾患の予防及ぴ Z又は治療薬。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。また、前記インスリンの欠乏が関与する疾患は、糖尿病、動脈硬化、及びこれらの疾患による合併症からなる群から選ばれるいずれかの疾患である。なお、前記インスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び又は治療薬は、さらに、ュコチンアミド、又は、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含んでいることが好ましい。

4 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、血糖値低下剤。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。なお、前記血糖値低下剤は、さらに、ェコチンアミド、又は、ニコチンアミドと月干細胞成長因子（HGF) とを含んでいることが好ましい。

5 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、瞻臓由来の非腫瘍細胞からインスリン生成細胞への分化誘導剤。前 fSビンカアルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。なお、前記分化誘導剤は、さらに、ニコチンアミド、又は、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含んでいることが好ましい。

6 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩、及びニコチンアミドを有効成分として含有する、降臓由来の非腫瘍細胞からィンスリン分泌細胞への分化誘導剤。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。なお、前記分化誘導剤は、さらに、肝細胞成長因子（HGF) を含んでいることが好ましい。

7 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩からなる、膝臓由来の非腫瘍細胞からインスリン分泌細胞への分化誘導促進剤。前記ビン力アル力口イドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。

8 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞の分化を誘導する方法。このように、膝臓由来の非腫瘍細胞をビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩の存在下で培養することにより、膝臓由来の非腫瘍細胞は、インスリン生成細胞ゃィンスリン分泌細胞に分化する。なお、膝臓由来の非腫瘍細胞の分化誘導は、ニコチンアミド、又はニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを用いることが好ましい。また、前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。

9 . 睦臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする脖臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成能を増加させる方法。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。なお、前記膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成能を増加させるために、ニコチンアミド、又はニコチンアミドと肝細胞成長因子 (HGF) とを添加することが好ましい。

1 0 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする瞵臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン分泌能を増加させる方法。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフイリンを用いることが好ましい。なお、前記膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成能を増加させるために、ニコチンアミド、又はュコチンアミドと肝細胞成長因子 (HGF) とを添加することが好ましい。

1 1 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩の存在下で勝臓由来の非腫瘍細胞を培養することを含む、インスリン生成及び又は分泌能が増加した膝臓由来の非腫瘍細胞を製造する方法。このように、勝臓由来の非腫瘍細胞をビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩の存在下で培養することにより、インスリン生成能が増加した勝臓由来の非腫瘍細胞（インスリン生成細胞）や、インスリン分泌能が増加した瞻臓由来の非腫瘍細胞（インスリン分泌細胞）を製造することができる。なお、脾臓由来の非腫瘍細胞の分化誘導は、ェコチンアミド、又はニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを用いることが好ましい。また、前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。

1 2 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩、及びニコチンァミドの存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養物（培養細胞又は培養液）カらインスリンを単離'精製することを含む、インスリンの製造方法。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。

1 3 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩、ニコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養細胞又は培養液からィンスリンを単離■精製することを含む、インスリンの製造方法。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。 1 4 . 上記 8に記載の方法により分化が誘導された膝臓由来の非腫瘍細胞（インスリン生成細胞又はィンスリン分泌細胞）。

1 5 . 上記 9に記載の方法によりインスリン生成能が増加した、膝臓由来の非'腫瘍細胞。

1 6 . 上記 1 0に記載の方法によりインスリン分泌能が增加した、膝臓由来の非腫瘍細胞。

1 7 . ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とするィンスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び Z又は治療方法。前記ビン力アルカロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。また、前記ィンスリンの欠乏が関与する疾患は、糖尿病、動脈硬化、及びこれらの疾患による合併症からなる群から選ばれるいずれかの疾患である。なお、前記インスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び Z又は治療薬は、さらに、ュコチンアミド、又は、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含んでいることが好ましい。

1 8 . ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩、及ぴェコチンァミドの存在下で脖臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養した前記脖臓由来の細胞を用いることを特徴とするインスリンの欠乏が関与する疾患の予防及びノ又は治療方法。なお、ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩、ェコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) の存在下で勝臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養した前記膝臓由来の細胞を用いることとしてもよい。前記ビン力アル力ロイドとしては、コノフィリンを用いることが好ましい。また、前記インスリンの欠乏が関与する疾患は、糖尿病、動脈硬化、及びこれらの疾患による合併症からなる群から選ばれるいずれかの疾患である。

本明細書において、「ビン力アル力ロイド」とは、キヨゥチクトウ科植物 Vinca rosea から単離されたビンプラスチンおょぴビンクリスチン、ならびに、広義には以下の構造式：

で示す骨格を含むアルカロイドをいう。なお、アルカロイドとは植物の産生する環状化合物で環の中に窒素原子（N) を含むものをいう。ビン力アルカロイドの具体例としては、図 1に示すビンプラスチン、ビンクリスチン、コノフィリン、コノフイリジン、コノフォリン、コノフイリエン、タべノレハニン、パチシフィンなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。

「瞎臓由来の非腫瘍細胞」とは、生物個体の膝臓に由来し、腫瘍形成能のない細胞をいい、これには、生物個体の膝臓から採取した細胞、該当する細胞を培養したもの（すなわち、培養細胞）が含まれる。培養細胞には、初代培養の細胞も継代培養の細胞も含まれる。

「細胞のインスリン生成及び Z又は分泌能を増加させる」とは、インスリン生成及び/又は分泌能を持たなかった細胞がインスリン生成及び Z又は分泌能を持つようになること、インスリン生成及び又は分泌能を持つ細胞のィンスリン生成及び/又は分泌能が上昇することを含む概念である。

「i3 細胞に分化する」とは、 β 前駆細胞がインスリンを生成おょぴ分泌するようになることを意味する。

前述のように、ビン力アル力ロイドの一種であるコノブイリンが瞵腺房腫瘍細胞 AR42J-B13のィンスリン生成を誘導することは知られているが、 AR4²J細胞はインスリンを生成するものの、細胞の外に放出することはできなかった。このように弱い作用しか知られていない条件で、細胞を膝臓由来の非腫瘍細胞に代えた場合に、ビン力アルカロイドがインスリン生成を誘導すること、さらにはインスリンを細胞外に放出させられることまでは予想できることではなかった。

また、 AR42J細胞にインスリンをつくらせることができるァクチビンはブタ膝細胞では効果を示さない。 ES 細胞にインスリンを作らせるには LAF (leukocyte activating factor)を含むたくさんの因子と段階が必要である。個々の細胞でィンスリンをつくらせるための分化をさせる条件は異なる。従って、ビン力アル力ロイドが膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成を増加させること、インスリンを細胞外に分泌させることはいかに当業者と言えども予想できることではなかつた。

さらに、 AR42J細胞は癌細胞であるため、そのィンスリン生成能を増加させても、安全性の観点から再生医療に利用することはできなかった。本発明により、膝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成 ·分泌能を増加させる技術が確立されたことによって、再生医療に利用可能な細胞を大量に準備できるようになった。図面の簡単な説明

図 1は、ビン力アル力ロイドに属するいくつかの化合物の化学構造式を示す。図 2は、無添加（1)、ェコチンアミド（10 raM)のみ（2)、ュコチンアミド（10 raM) と HGF (10 ng/ral) (4)、コノブイリン（0. 1 μ g/ml)のみ（5)、コノフィリン（0. 1 i g/ml)と HGF (10 ng/ml) (7)、コノフィリン（0. 1 g/ml)とニコチンアミド（10 mM)と HGF (10 ng/ml) (8)を添加した培地で 3週間培養した仔プタ膝細胞を免疫染色法で染色した結果を示す。図中、 Nはュコチンアミドを、 CNP はコノフィリンを意味する。

図 3は、無添加（〇）、ュコチンアミドと HGF (△：)、コノフィリンのみ（き）、コノフィリンとニコチンアミドと HGF (▲)を添加した培地で培養した仔ブタ膝細胞が生成するインスリンの量を ELISAで測定した結果を示す。図中、 Nはニコチンアミドを、 CNPはコノフィリンを意味する。

図 4は、コノフイリンがストレブトゾトシン投与ラットの血糖値に与える効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及ぴ実施例に特に説明がない場合には、 J. Sarabrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed. )， Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition)， Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)； F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとつて明らかである。

以下、本発明の一態様を詳細に説明する。

1 . ビン力アルカロイドおよびそ塩の製造

ビン力アル力ロイドに属するいくつかの化合物の化学構造式を図 1に示す。ビンブラスチンおよびビンクリスチンは、 Neuss N， Gorman M, Hargrove W， et al & Manning RE (1964) J. Am. Chem. Soc. 86: 1440-1442に記載の方法で、 Vinca rosea Linnから単離精製することができる。

コノフィリンは、キヨゥチクトゥ科の植物である Ervatamia microphyllaの葉から後述の製造例 1のようにして、単離精製することができる（Umezawa, K.ら Anticancer Res. 14： 2413-2418 (1994) より改変した方法）。 Ervatamia microphyllaの葉約 4 kg からコノフイリンの結晶約 500 mgが得られる。

コノフイリジンはコノフィリンと同じく Ervatamia microphillaの葉から、同じ方法で製造することができる（Kam， T. S. ら J. Nat. Prod. 56： 1865-1871 (1993) )。

コノフォリンおよびパチシフィンは、 Kam TS， Anuradha S. Alkaloids from Tabernaeraontana divaricata. Photochemistry (1995) 40：313-6に記載の方法で製造することができる。

コノフィリニンおよびタベルノヽニンは、 Kam TS, Pang HS, Lira TM, Biologically active indole and bisindole alkaloids from Tabernaeraontana divaricata. Org. Bioraol. Chem. (2003) 21 ; 1 (8) : 1292- 7に記載の方法で製造することができる。ビン力アルカロイドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩を挙げることができる力 S、これらの塩は、薬理学的に許容できるものである。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。

2 . ビン力アル力ロイドおよびその塩による膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成誘導

まず、瞻臓由来の非腫瘍細胞を用意する。膝臓由来の非腫瘍細胞は、哺乳動物由来のものであるとよく、哺乳動物としては、ヒト、サルなどの霊長類、ブタ、ゥシ、ィヌ、ラットなどの非霊長類を例示することができる。細胞は、健常な個体に由来するものであってもよいし、治療を必要としている患者に由来するものであってもよい。患者はヒトに限られるものではなく、健常でない非ヒト動物であってもよい。健常な個体に由来する非腫瘍細胞の場合、個体は、胎児、新生児 (例えば、ブタの場合、生後 3日以内の仔プタ）であることが好ましい。非腫瘍細胞は、外分泌細胞であっても、内分泌細胞であってもよいが、内分泌細胞であることが好ましい。また、内分泌細胞のうち、 β 細胞および前駆細胞がより好ましい。

健常な哺乳動物個体の脖臓から非腫瘍細胞を分離するには、例えば、以下のようにするとよい。哺乳動物から膝臓を摘出し、結合組織を剥がす。膝臓を細かく切り刻み、緩衝液を加え、攪拌する。攪拌後、上澄み液を捨て、酵素リベラーゼを加え、攪拌する。その後、遠心して、上澄み液を捨て、 P B Sを加える操作を繰り返す。 P B Sで懸濁して細胞を集め、この細胞液を Histopaqueに重層させ、遠心する。膝内分泌細胞は細胞懸濁液と Histopaque との境界面に白い帯状の層を形成するので、この層を採取する。その後、遠心し、上澄み液を捨て、培地を加えて懸濁したものを培養容器に移し、インキュベートする。その後、適当な時間攪拌をして、スフエロイド（細胞のゆるやかな凝集）を形成させた後、インキュベートする。培養容器から浮遊している細胞を以後の操作に用いる。

培養容器から浮遊している細胞を遠心チューブに入れ、静置してスフエロイドが底に沈んだら、上澄みを捨て、培地を加えて軽く振り、また静置しスフェロイドを底に沈ませる。この操作を 2 ~ 3回繰り返した後、遠心し、上澄みを捨てる。残った細胞を、ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩を添加した培地にて、 37°C、 5% C 0₂の条件下で培養する。培養は静置培養でよい。培地としては、 R P M I培地などを用いるとよい。ビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩の他にも、さらに、ニコチンアミド、肝細胞成長因子（HGF) を添加することがより好ましい。培地は 4〜7 3おきに交換し、 7〜35日間培養するとよい。培養期間中の適当な時間間隔で、細胞の形態を調べておくとよい。また、培地を交換する際に培養液を回収して、培養液中に含まれるインスリン量を測定しておくとよい。

上記の細胞の分離および培養方法は、患者の膝臓に由来する非腫瘍細胞を用意する場合にも適用できる。ただし、患者の脖臓に由来する非腫瘍細胞を得るには、患者の膝臓から耝織片を採取して、この組織片から上記の方法で非腫瘍細胞を分離することが考えられる。

以上のようにして、ビン力アル力ロイドまたはその塩の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養することにより、脾臓由来の非腫瘍細胞の分化を誘導することができる。好ましくは脖臓由来の非腫瘍細胞をィンスリン生成 ·放出細胞（例えば、 β細胞）に分化誘導することができる。あるいはまた、正常膝臓細胞のインスリン生成及び Ζ又は分泌能を増加させることができる。また、ビン力アルカロイドまたはその塩の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養することにより、培養物 (培養細胞又は培養液）からは、公知の方法でィンスリンを単離 ·精製することができる。

ビン力アル力ロイドまたはその塩の存在下で培養することによりインスリン生成及び Ζ又は分泌能が増加した、脾臓由来の非腫瘍細胞は、培地 l m lあたり 2. 5 10⁵個の濃度で7〜35日間培養した場合、培地 l m 1中に 10 n g以上、好ましくは 25 n g、より好ましくは 55 n g以上のインスリンを生成しうるものである。

前述のように、手に入れることの容易さや免疫学的特性などからブタ膝細胞は糖尿病再生治療への利用が期待されている細胞であるが、今までいずれの細胞系でも大量の細胞を集め、充分にィンスリン生産■放出細胞に分化誘導する技術は知られていなかった。

本発明の技術を用いれば、大量の細胞を充分にィンスリン生産 ·放出細胞に分化誘導することができる。従って、本発明の方法により得られるインスリン生産 -放出細胞を糖尿病に対する再生医療に利用することができる。

本発明の方法により得られたインスリン生成■放出細胞は、溶液に懸濁させたり、支持体マトリックに埋め込んだりしてから、被験者に投与するとよい。ィンスリン生成 ·放出細胞を懸濁させる溶液は薬理学的に許容されるキヤリヤー及ぴ希釈剤であるとよく、例えば、食塩水、緩衝水溶液などを挙げることができる。溶液には、パラォキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、チロメサールなどの保存剤、 L -アルコルビン酸などの安定剤などを添加するとよい。溶液にィンスリン生成■放出細胞を懸濁させた後、滅菌処理をしておくとよい。インスリン生成 ·放出細胞を埋め込む支持体マトリックスは、受容者に適合性でありかつ分解して受容者に有害でない生成物になるマトリックスであるとよい。マトリックスの素材としては天然高分子、合成高分子などを採用するとよい。天然高分子としては、コラーゲン、ゼラチンなどを挙げることができる。合成高分子としては、ポリダリコール酸、ポリ乳酸などを挙げることができる。マトリックスは、フィルム状、シート状、粒子状、ペースト状などの形状をとりうるが、それらに限定されるわけではない。

3 . ビン力アルカロイドを用いた薬剤 '医薬品

ビン力アルカロイドおよびその薬理学的に許容される塩は、膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリン生成及び/又は分泌能を増加させることができる。また、ビン力アル力ロイドおよびその薬理学的に許容される塩は、血糖値を低下させることができる。従って、これらの化合物は、医薬品（例えば、糖尿病の治療薬）として、ヒト、その他の動物に投与してもよいし、実験用の試薬として用いてもよい。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の糖尿病治療薬）と組み合わせて使用してもよい。なお、ビン力アルカロイドを個体に投与した場合、内在性のニコチンアミド及び Z又は肝細胞成長因子（HGF) が利用されて、効果が増幅されていると考えられるが、ビン力アルカロイドを投与するに当たり、ュコチンアミド及び/又は肝細胞成長因子（HGF) を同時に投与することとしてもよい。

ビン力アル力ロイドまたはその薬理学的に許容される塩をヒトに投与する場合には、例えば、 1日あたり約 0. 1〜10 mg/kg (体重）の投与量で、 1回または数回に分けて経口投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。

ビン力アル力ロイドおよびその薬理学的に許容される塩は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤中のビン力アルカロイドまたはその薬理学的に許容される塩（有効成分）の含有率は、 1〜 9 0重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を 5〜 8 0重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、有効成分を 1〜 3 0重量％含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射剤の場合には、有効成分を 1〜1 0重量％含有させるのが好ましい。

ビン力アルカロイドおよびその薬理学的に許容される塩の製剤化は、賦形剤 (乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、ァノレギン酸ナトリウム、メチノレセノレロース、ェチノレセノレロース、ポリビュルピロリドン、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タノレク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壌剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、 CMC . Na、 CMC■ Ca、炭酸カルシウム、炭酸水素ナ小リウム、ァルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、プドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ォリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、 EDTA、チォグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、 L-ァスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラォキシ安息香酸エステル、クロロプタノール、ベンジルアルコール、フヱノール、塩化ベンザルコユウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート 8 0、 2 0など）、緩衝剤（タエン酸、酢酸、リン酸のナトリゥム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。

ビン力アル力ロイドおよびその薬理学的に許容される塩は、インスリンの欠乏が関与する疾患（例えば、糖尿病、動脈硬化）を予防およびノまたは治療するために利用することができる。また、膝細胞のィンスリンの生成及び/又は分泌の研究に利用することもできる。さらには、血糖値低下剤、その他、高血糖状態が長く続くと起こる、眼の網膜症、腎症、神経障害、壊疽、動脈硬化などの合併症の治療薬としても利用することができる。

以下、本発明を製造例及び実験例によって具体的に説明する。なお、これらの製造例及び実験例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例で用いた材料と入手先は以下の通りである。

新生仔豚：高山養豚場

Roswel Park Memorial Institute (RPMI) ¾"養液： Invitrogen

-コチンァド： Sigma Chemical Science (Sigma)

牛胎児血清 (FBS) ： Sigma

生理的リン酸緩衝液 (PBS)

Histopaque： Sigma

Hepatocyte Growth Factor (HGF) ： Sigma Cnemical Science

DMEM：日水製薬株式会社

HEPES： Sigma

カナマイシン： Sigma

グルタミン： Sigma

ペニシリン G : Sigma

トリプシン： ¾ko

EDTA：関東化学株式会社

蛍光抗体用 PBS"

BSA (Bovine Serum Albmine ： Sigma α -ィンス Vン抗体： Biogenesis

a -guinea pig-Cyanin3抗体： Jackson Immuno Research Laboratories, inc. (West Grove, PA)

activin A： R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MO)

Hoechst 33258： Polysciences, Inc.

<実施例 1 >

[製造例 1 ] コノフィリンの調製

キヨゥチクトウ科の植物である Ervataraia microphyllaの葉（タイのコンケン市で採取）から以下のようにして、コノフイリンを単離精製した。

Ervatamia micrqphyllaの葉約 4 kg からクロ口ホルム 100 L を用いて活性物質の抽出を行うと油状物質約 130 gが得られた。この油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル約 500 gを用いたカラムクロマトダラフィーを合計 5 回行うことで精製を行う）、クロロホルム一メタノール 40: 1, 20 : 1の系で順次溶出した。その後、 K-ras- NRK細胞の形態変化を活性の指標として、この生物活性が見られたフラクションを回収し、得られた粗精製物（約 40 g) を n-へキサン一酢酸ェチル 1 : 2, 0: 1の系でシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル（メルク社より購入）約 500 g使用）にかけると活性画分約 1. 5 g が得られた。続いて活性画分を n-へキサン一酢酸ェチルークロロホルム ⁹ : ³ : 1， 6: 3 : 1の系でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル約 150 g使用）にかけ、活性画分を回収、濃縮すると結晶約 500 mg が得られた。得られたコノフイリンはマススぺクトル及び丽 R スぺクトルで文献値（Umezawa，K. ら、 Anticancer Res. 14: 2413-2418 (1994) )にあっていることで同定した。使用した溶媒は関東化学より購人した。

ぐ実施例 2 >

[実験例 I及び II]

1 . 方法

生後 72 時間以内の新生仔ブタを（高山）養豚所より入手した。手術室に搬送後、直ちに全身麻酔下にて全膝（腹側、背側膝）を摘出した。摘出膝臓のまわりの結合組織や付着血液を取り除いたのち、 10 ml ビーカーに移し眼科用ハサミにて細切した。細切した膝組織片を 100 ml三角フラスコに移し、 50- ⁶0 mlのリン酸緩衝液（PBS) を加え、低回転スターラーにて 110 rpmで 3分間回転させた後、静置し上清を捨てた。続いて、 2. 5 mg/ml 濃度リベラーゼ PI (Roche) 含有リン酸緩衝液を 40 ml加え低回転スターラーにて 110 rpmで 8分間回転させた後、静置し細胞混濁上清液を集めた。この操作を 5回繰り返し、集めた細胞混濁液を 1200 rpmで 5分間遠心分離にて細胞を集めた。遠心沈渣にて集めた細胞を 25-50 ml PBS にて懸濁し、 10 ml Histopaque 1077 (Sigma) に対して 25 ml細胞懸濁液を静かに重層させ、 1800 rpm で 10分間遠心した。膝（内分泌）細胞は細胞懸濁液と Histopaque の境界面に帯状の層を形成する（細胞の分離 ·精製法)。

境界面に集まった細胞をパスツールを用いて採取し、 10 mM nicotinamide おょぴ 10% heat inactivated FBS添加 RPMI 1640に懸濁し、 1200 rpmで 5分間の遠心にて細胞を集め、再度同じ培養液にて懸濁し、 75 ml培養フラスコにて一昼夜静置培養を行った（⁵ %C0₂- incubator, 37°C)。

培養条件：

フラスコに浮遊している細胞を除去し、フラスコの底面に接着している細胞を EDTA- Trypsinにて剥離 ·採集した。細胞をそれぞれの培養液（グループ 1〜 8 ) に懸濁し、細胞 (1. 25 X 10³ cel ls/ml) を 2 mlずつ、カルチャー■チャンバ一にてまいて静置培養を行った（5 %C0₂- incubator, 37°C) ₀

培養液グループ 1 ： RPMI 1640 with 10% FBS (Control)

2 ： Control+10 mM nicotinamide

3 ： Control+10 ng/ml HGF

4 ： Control+0. 1 μ g/ml コノフィリン

5 : 2 + 3

6 ： 2 + 4

7 : 3 + 4

8 : 2 + 3 + 4

培養液は 4日毎に交換し、 3週間の観察を行った。この間、一週間毎に細胞の形態を観察し、ペルォキシダーゼを用いた酵素抗体法にて膝 13 細胞の出現を確認した（実験例 1)。なお、基質として 3 -ァミノ -9-ェチルカルパゾール (AEC； 0. 75mg/ml)を用い、染色を行った。また、培養液を 4日毎の交換時に回収し、培養液中に分泌されたィンスリン量を ELISA法により測定した（実験例 11)。

2 . 結果

実験例 Iの結果を図 2に示す。ュコチンアミド (Akiyama, T.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98： 48-53 (2001) )や HGF (Ocana, A. G.ら、 J. Biol. Chem. 275： 1226-1232 (2000) )は限られた実験系でィンスリン生成細胞の分化を促進することが報告されているが効果は弱い。図 2に示すように無添加（1)、ニコチンアミド（10 mM)のみ（2)、ニコチンアミドと HGF (10 ng/ml) (4)、コノフィリン（0. 1 W g/ml)のみ（5)、コノフィリンと HGF (7)、では、 3週間後、赤く染色されるィンスリン生成細胞はごくわずかしかあらわれない。しかしニコチンアミドと HGF とコノフィリンの 3者混合（8)では顕著に赤色で示されるインスリン生成細胞の数が増加した。なお、ニコチンアミドとコノフィリンとの混合物（6)は、上記 3 者混合物（8)に比べ、インスリン生成細胞の数は劣るものの、その他のものに比ベ、顕著に増加していた（図には示さない）。

実験例 II の結果を図 3に示す。図 3に示すように、 8〜 2 0日の培養でニコチンアミドに HGFかコノフィリンが加われば、若干のインスリンを培地中に見い出すことができる。さらに、ニコチンアミド、 HGF とコノブイリンを組み合わせると、ほかの組み合わせ、あるいは単独の添加に比べて、放出されたインスリンの量は顕著に増加した。

まとめ

仔プタの脖細胞においてィンスリン生成細胞の分化を誘導する技術はなかつたが、コノブイリン、ニコチンアミドと HGFの組み合わせでインスリンを生産する細胞の割合を飛躍的に向上させ、インスリン放出においても大量になることがわかった。仔ブタ膝は大量の供給が可能であり、インスリンを充分に放出する移植可能な細胞を大量に準備できることになる。この技術により糖尿病の将来の期待される治療である再生医療が可能になると考えられる。

また、コノフイリジンは、コノフィリンと同様、膝腺房腫瘍細胞 AR42Jのインスリン生成に関与する形態変化を誘導することを確認した。従って、コノフイリジンも、コノフィリンと同様、膝臓由来の非 β重瘍細胞のインスリン生成及び/又は分泌能を増加させる作用を有すると考えられる。

ぐ実施例 3 >

[比較例 1 ] ラット脖腺房腫瘍細胞 AR42J- B13細胞においてコノフイリンがィンスリン生成細胞を分化誘導する効果

1 . 方法

細胞の培養

DMEMを 20 mM HEPES-NaOH存在下で pH 7. 4 に調整した後、ろ過滅菌し、 100 mg/1 カナマイシン、 0. 6 g/1 グルタミン、 100 unit/ml ぺニシリン G、 5 raM NaHC0₃、 10 % FBSを加えた培養液 20 ml とともに、膝腺房腫瘍細胞 AR42Jの HGF感受性の良いサブクローンである AR42J-B13細胞（群馬大学医学部生体調節細胞分野の小島至博士より供与）を 37 °C、 5% C0₂ のインキュベータ一中で培養した。細胞の密集による形質転換を防ぐため、また細胞の分化能を保持するために 2. 5〜 5%中 2〜3 日で継代を行った。継代は、培養液を除去した後 PBS_ (Ca²⁺, Mg²⁺-free PBS； 8g/l NaCl、 0. 2g/l KC1、 0. 916g/l Na₂HP0₄、 0. 2g/l KH₂P0₄) で細胞を 2 回洗浄後、トリプシン— EDTA溶液 2 mlで細胞をはがし、培養液 8 mlで失活させた。その後、細胞を遠心分離機で 1000 r_Pm、 5 分間かけることで沈降させ、トリプシンを取り除き、新しい培養液 10 mlを加え、その 2. 5〜5。/。の細胞数で継代をおこなった。凍結は 7. 5% dimethyl sulfoxide (DMS0)の条件下で行った。

24 wellプレートに、 4 X 10⁵ cel ls/ml になるように調製した細胞を 500 μ ΐ ずつまき、 37 °C、 5 % C0₂の条件下でインキュベートし、翌日、コノブイリン 0. 1 〜0. 3 z g/ml単独あるいはコノブイリン 0. 1 Ai g/mlと HGF ΙΟΟ ρΜを添加し、 37 °C、 5 % C0₂のインキュベーターで要時インキュベートさせた後、培地を 1. 5 ml のエツペンドルフチューブにとり、 PBS- 200 1で細胞を 1 回洗浄後、新しく PBS- 200 を加え生存した細胞の形態を観察し、顕微鏡に接続したカメラで 150倍の倍率で写真をとつた。その後、トリプシンで細胞をはがし、その液はすべて前述のエツペンドルフチューブに移しトリパンブルー細胞外排出試験を行った。さらに細胞の形態は写真を 250%に拡大し、細胞の全長が細胞直径の 1. 5倍以上を形態変化とし、形態変化率を算出した。

蛍光抗体法まず 8 wellプラスチックプレートに 2 X 10⁵ cells/ml になるように調製した細胞を 500 ^ 1 ずつまき、コノフィリン 0. 1 /z g/ml あるいはコノブイリン 0. 1 μ g/ml と HGF ΙΟΟρΜを添加した後、 37 °C、 5 °/。 C0₂のインキュベーターで 72 時間インキュベートして分化させた、培地を取り除き、蛍光抗体用 PBS— (8g/l NaCl、 0. 45g/l NaH₂P0₄ · 2H₂0、 1. 28g/l Na₂HP0₄) で 1 回洗い、 3 % ホルムアルデヒドを用いて over night 4 °C (または室温で 30 分）で細胞を固定化させた。次に、蛍光抗体用 PBS—で 2 回洗い、 1 °/。 BSA (蛍光抗体用 PBS—の溶液）を 1 mlずつ加え室温で 1 時間静置してブロッキングし、 50 mM glysine (蛍光抗体用 PBS—の溶液）でタエンチするために、静置で 5 分、 3 回洗った。次に、プラスチックのゥェルの壁面を取り除き、 10倍に希釈したブロッキング液により 100倍希釈した a -insulin抗体を 50 μ 1ずつ細胞が乾かないようにしてのせ、室温で 1 時間放置した。ここで、 activin A 2nMと HGF 100pMで分化させた細胞のゥエルを 1 穴用意し、 2次抗体の非特的な結合による影響を比較するために 1 次抗体は乗せずに保存した。次に、スライドグラスを容器に移し、蛍光抗体用 PBS—で 5 分、 3 回シェーカー上でしんとうさせながら洗った。次に 10倍に希釈したブロッキング液により 100倍希釈した a - guinea pig- cyanin3抗体に Hoechst33258を 100 倍希釈になるように添加し 1 次抗体と同様にしてのせ、遮光して室下で 1 時間静置し、再ぴスライドグラスをアルミホイルで遮光した容器に入れ TNT buffer (0. 1 M Tris- HC1, 0. 15 M NaCl, 0. 05 % T een 20 ; pH 7. 5)でシェーカー上で遮光の状態で 10 分、 3 回洗った。このスライドグラスに 50 % グリセロール入り PBS— をのせ、カバーグラスでカバーし、顕微鏡で写真を撮った。コノフイリン単独および HGF併用時に、 0. 1〜0. 3 μ g/mlの濃度において濃度依存的に神経細胞様の突起伸張が誘導され、さらに HGF併用時には細胞死はやや増強され、形態変化率は上昇した。

蛍光抗体法の結果、 72 時間後では、 HGF 100 pM単独ではインスリンを示す赤い染色は細胞内に見られなかったが、コノフィリン 0. 1 /i g/mlと HGF 100 pM併用時には核を除いた細胞質中に赤いインスリンの染色が見られ、さらに細胞質中で顆粒中に閉じ込められているように粒々に見られた。放出に関与する細胞膜周辺にはインスリン染色はみられなかった。一方、 activin A 2 nM と HGF 100 M 併用時では同じくィンスリンの赤い染色が顆粒状に見られたが、その局在は少し異なり、 2極に分かれた突起の軸に沿って見られ、突起の先端に蓄積しているものも見られた。

また、分化した細胞のインスリンの分泌を ELISA法により定量化しようと試みたところ、検出外のレベルであった。

まとめ

以上のことから、コノフィリンは、 ARJ42細胞の形態変化を誘導し、 ARJ42細胞にィンスリン生成を誘導することができるが、インスリンを細胞外に分泌させることはできないことがわかった。

ぐ実施例 4 >

コノフィリンの in vivo血糖値低下効果

実施例 2により、 in vitroにおいてコノフイリンが膝細胞にィンスリンの生成及び放出を誘導させる作用を有することが明らかになった。そこで、コノフイリンを投与することにより、 in vivo においてもインスリン生成が誘導されるかどうかを確認するために、 in vivo でコノフィリン投与による血糖値の変化を調べた。

生後一日齢のウィスター系ラット（静岡巿の S L C社より購入） 1 0匹に、膝 β細胞の破壌によるインスリン産生の低下が起こつて、その結果糖尿病を誘発させるストレプトゾトシン（和光純薬より購入、 0. 05 mM タエン酸緩衝液（pH4. 5) に溶解）をそれぞれ 85 g/g—体重で腹腔内投与した。なお、ストレブトゾトシンを投与した日を 0日と定義した。翌日（1日）より、 5匹のラットに 5 /x g/g 一体重でコノフイリンの溶液（ェタノール）を 7日間毎日皮下注射し、随時血糖値を連日測定した。なお、対照群のラット 5匹には同量の溶媒を投与した（コントロール）。その結果、図 4に示すように、どのラットにおいても、ストレプトゾトシンを投与すると血糖値の著しい増加がみられたが、コノフィ Vンを投与したラット（秦）においては、コントロール（〇）に比べて明らかな血糖値の低下がみられ、コノフィリンの血糖値低下作用が示された（*: Pく 0. 05， **Pく 0. 01 vs コントローノレ）。以上のことから、コノフィリンは in vivo においてもインスリン生成を誘導することが明らかとなった。

また、 in vitroの結果と比べた場合、コノブイリンのみで作用効果が観察されたことから、コノフィリンを体内に投与した場合、内在性のニコチンアミド及ぴ又は肝細胞成長因子（HGF) が利用されていると推察される。産業上の利用の可能性

本発明により、勝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成及び又は分泌を誘導することができる薬剤が提供された。

本発明の薬剤により、滕臓由来の非腫瘍細胞の分化を誘導することができる。また、本発明の薬剤により、膝臓由来の非 S重瘍細胞のィンスリン生成及びノ又は分泌能を増加させることができる。

Claims

請求の範囲

1 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、膝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリンの生成能を增加させる薬剤。

2 . さらに、ェコチンアミドを含むことを特徴とする請求項 1に記載の脾臓由来の非腫瘍細胞のィンスリンの生成能を増加させる薬剤。

3 . さらに、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含むことを特徴とする請求項 1に記載の瞎臓由来の非腫瘍細胞のィンスリンの生成能を増加させる薬剤。

4 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、及びュコチンアミドを有効成分として含有する、膝臓由来の非腫瘍細胞のインスリンの分泌能を増加させる薬剤。

5 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、ュコチンアミド、及ぴ肝細胞成長因子（HGF) を有効成分として含有する、睦臓由来の非腫瘍細胞のィンスリンの分泌能を増加させる薬剤。

6 . コノフイリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、インスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び z又は治療薬。

7 . 前記インスリンの欠乏が関与する疾患が、糖尿病、動脈硬化、及びこれらの疾患による合併症からなる群から選ばれるいずれかの疾患であることを特徴とする請求項 6に記載のィンスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び/又は治

8 . さらに、ニコチンアミドを含むことを特徴とする請求項 6に記載のインスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び Z又は治療薬。

9 . さらに、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含むことを特徴とする請求項 6に記載のィンスリンの欠乏が関与する疾患の予防及びノ又は治療薬。

1 0 . コノフイリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、血糖値低下剤。

1 1 . さらに、ニコチンアミドを含むことを特徴とする請求項 1 0に記載の血糠値低下剤。

1 2 . さらに、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含むことを特徴とする請求項 1 0に記載の血糖値低下剤。

1 3 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、膝臓由来の非腫瘍細胞からインスリン生成細胞への分化誘導剤。

1 4 . さらに、ニコチンアミドを含むことを特徴とする請求項 1 3に記載の分化誘導剤。

1 5 . さらに、ニコチンアミドと肝細胞成長因子（HGF) とを含むことを特徴とする請求項 1 3に記載の分化誘導剤。

1 6 . コノブイリンま ^はその薬理学的に許容される塩、及びニコチンアミドを有効成分として含有する、膝臓由来の非腫瘍細胞からィンスリン分泌細胞への分化誘導剤。

1 7 . コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩、ニコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) を有効成分として含有する、脾臓由来の非腫瘍細胞からインスリン分泌細胞への分化誘導剤。

1 8 . コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩からなる、膝臓由来の非腫瘍細胞からィンスリン分泌細胞への分化誘導促進剤。

1 9 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞からインスリン生成細胞への分化誘導方法。

2 0 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、及びュコチンアミドを添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞からィンスリン分泌細胞への分化誘導方法。

2 1 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、ニコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) を添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞からィンスリン分泌細胞への分化誘導方法。

2 2 . 瞻臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン生成能を増加させる方法。

2 3 . 膝臓由来の非腫瘍細胞を培養する際、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を添加することを特徴とする膝臓由来の非腫瘍細胞のィンスリン分泌能を増加させる方法。

2 4 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養することを含む、インスリン生成細胞の製造方法。

2 5 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、及びュコチンアミドの存在下で脖臓由来の非腫瘍細胞を培養することを含む、インスリン分泌細胞の製造方法。

2 6 . コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩、ュコチンアミド、及ぴ肝細胞成長因子（HGF) の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養することを含む、インスリン分泌細胞の製造方法。

2 7 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、及びニコチンアミドの存在下で脖臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養細胞又は培養液からィンスリンを単離■精製することを含む、インスリンの製造方法。

2 8 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、ュコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養細胞又は培養液からインスリンを単離 ·精製することを含む、インスリンの製造方法。

2 9 . 請求項 1 9に記載の方法により分化が誘導された、インスリン生成細胞。

3 0 . 請求項 2 0又は 2 1に記載の方法により分化が誘導された、インスリン分泌細胞。

3 1 . 請求項 2 2に記載の方法によりインスリン生成能が増加した、膝臓由来の非腫瘍細胞。

3 2 . 請求項 2 3に記載の方法によりインスリン分泌能が増加した、膝臓由来の非腫瘍細胞。

3 3 . コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とするインスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び又は治療方法。

3 4 . コノブイリンまたはその薬理学的に許容される塩、及びニコチンアミドの存在下で膝 fl蔵由来の非腫瘍細胞を培養し、培養した前記膝臓由来の細胞を用いることを特徴とするインスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び又は治療方法。

3 5 . コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩、ニコチンアミド、及び肝細胞成長因子（HGF) の存在下で膝臓由来の非腫瘍細胞を培養し、培養した前記膝臓由来の細胞を用いることを特徴とするィンスリンの欠乏が関与する疾患の予防及び Z又は治療方法。