WO2004092368A1 - 肥満又は痩せの検査方法 - Google Patents

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WO2004092368A1
WO2004092368A1 PCT/JP2004/003452 JP2004003452W WO2004092368A1 WO 2004092368 A1 WO2004092368 A1 WO 2004092368A1 JP 2004003452 W JP2004003452 W JP 2004003452W WO 2004092368 A1 WO2004092368 A1 WO 2004092368A1
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mcp
protein
test
obesity
expression level
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PCT/JP2004/003452
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Hidehito Kotani
Hiraku Itadani
Hiromitsu Araki
Kazuhiko Takahashi
Satoshi Mashiko
Akane Ishihara
Akio Kanatani
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for testing obesity or leanness using a MCP-1 (Monocyte Chemoatractant protein-1: monocyte chemotactic factor) gene or protein, and a test agent containing the gene or protein. Etc.
  • MCP-1 Monocyte Chemoatractant protein-1: monocyte chemotactic factor
  • Etc a test agent containing the gene or protein.
  • the present invention also relates to a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity or leanness using the gene or protein.
  • Obesity is a risk factor for various adult diseases represented by hypertension, diabetes, hyperlipidemia, ischemic heart disease and the like. In addition, many of these are chronic diseases, which are thought to cause a rise in medical expenses in the future, and are a major social problem.
  • BMI Body mass index: weight (kg) height (m) / height (m)
  • MCP-1 is a protein belonging to the CC chemokine subfamily with an open reading frame consisting of 99 amino acids (in the case of human) (accession number: human rabbit 002982 ( SEQ ID NO: 9 and 10), mouse Marauder 011333 (SEQ ID NOS: 11 and 12)). MCP-1 was cloned in 1989 (Yoshimura T et al., FEBS Letters, 244, 487-493 (1989); Furutani Y et al., Biochem. Biophys. Res.
  • chemokines are a group of proteins having chemotactic activity on leukocytes, and are apparently involved in the onset, progression, and ashamed of the disease state in the acute and chronic phases of inflammation. I'm familiar. Among them, MCP-1 is known to have a strong chemotactic and activating effect on monocytes, and it is thought that it can be used for applications such as an immune activating effect and an antitumor effect. I have.
  • MCP-1 is involved in various biological phenomena in a living body.
  • leptin which is known as a satiety factor
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the related art, and provides an obesity or leanness test method that can be determined at a molecular level, and an obesity or leanness test using the molecule.
  • the purpose is to provide medicine.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating a compound, such as screening for a therapeutic agent for obesity or leanness, and a compound which is evaluated as an effective therapeutic agent for obesity or leanness by the evaluation method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that there is a certain correlation between the change in body weight and the expression level or blood concentration of MCP-1, The present invention has been completed.
  • the method for testing obesity or leanness of the present invention is characterized by measuring the expression level of the MCP-1 gene in a test tissue or test cell. That is, obesity can be tested based on the MCP-1 gene expression level.
  • the expression level is measured using a DNA microarray.
  • the method for testing obesity or leanness of the present invention is characterized by measuring the expression level of MCP-1 protein in a test tissue or test cell. That is, obesity can be examined based on the expression level of MCP-1 protein.
  • the method for testing obesity or leanness of the present invention is characterized by detecting a change in the expression level of the MCP-1 gene in a test tissue or test cell. That is, comparing the initial value of the expression level of the MCP-1 gene with the measured value of the expression level after a predetermined period (for example, the difference or ratio between the initial value and the measured value), a method of examining or predicting the degree of obesity Is provided.
  • a predetermined period for example, the difference or ratio between the initial value and the measured value
  • the method for testing obesity or leanness of the present invention is characterized by detecting a change in the expression level of MCP-1 protein in a test tissue or test cell. That is, a method for examining or predicting the degree of obesity is provided in which the initial value of the expression level of the MCP-1 protein is compared with the measured value of the expression level after a predetermined period (for example, the difference or ratio between the initial value and the measured value). You.
  • the obesity or leanness test method of the present invention is characterized by detecting a polymorphism present in the MCP-1 gene in a test tissue or a test cell. That is, it becomes possible to test or predict the degree of obesity based on the MCP-1 gene polymorphism. Further, the method for testing obesity or leanness of the present invention provides a method for producing a protein that affects the expression level of the MCP-1 gene by interacting with the MCP-1 protein. It is characterized by detecting the present amount or activity. That is, it becomes possible to examine or predict the degree of obesity based on the expression level or activity of a protein that affects the expression level of the MCP-1 gene.
  • the obesity or lean test agent of the present invention is characterized by containing an antibody against MCP-1 protein as an active ingredient.
  • the kit for detecting obesity or leanness of the present invention is characterized by containing an antibody against the MCP-1 protein.
  • the kit preferably comprises the antibody
  • the method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity or leanness comprises a step of administering or contacting a test compound with a test animal or a test cell; Confirming whether the test compound modulates the expression level of the MCP-1 gene or a gene functionally equivalent to the gene in the test animal or test cell. I do.
  • the method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity or leanness comprises the steps of: administering or contacting a test compound with a test animal or a test cell; Confirming whether the compound regulates the expression level of the MCP-1 protein or a protein functionally equivalent to the protein in the test animal or test cell.
  • the method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity or leanness comprises the steps of: contacting a test compound with an MCP-1 protein; And confirming whether or not it has an effect.
  • the compound of the present invention is characterized in that it has been evaluated by the method of evaluating the compound of the present invention to be effective in treating or preventing Mitsuru Tsukimae or leanness.
  • FIG. 1 is a graph comparing the blood levels of MCP-1 between DI0 mice and a control group.
  • FIG. 2 is a graph comparing the body weights of the DI0 mouse and the control group.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between body weight and blood concentration of MCP-1 in DI0 mice.
  • FIG. 4 is a graph comparing the weights of model mice before and after dietary restriction.
  • FIG. 5 is a graph comparing the expression levels of MCP-1 in white adipocytes of model mice before and after dietary restriction.
  • FIG. 6 is a graph comparing the blood levels of MCP-1 in model mice before and after dietary restriction.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the administration of an obesity-suppressing compound and the expression level of MCP-1 in DI0 mice.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the administration of an obesity-suppressing compound and the blood concentration of MCP-1 in DI0 mice.
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between the administration of an obesity-suppressing compound and the blood concentration of MCP-1 before and after dietary restriction.
  • FIG. 10 are graphs each showing the relationship between the fluorescence intensity of CDllb and the number of cells in various cells.
  • (C) and (F) are graphs showing the number of CDllb-positive cells in various cells.
  • “Expression level” in the present invention refers to the absolute amount or relative amount of a transcript of the MCP-1 gene.
  • the gene includes either DNA or mRNA.
  • the “expression level” refers to the absolute or relative amount of the translation product of the MCP-1 gene.
  • the "MCP-1 protein” in the present invention includes a precursor protein having a signal peptide and a mature protein V and a shift having no sidanal peptide, but is preferably a mature protein.
  • human MCP-1 protein is a precursor protein consisting of 99 amino acids (SEQ ID NO: 10) having a signal peptide consisting of 23 amino acids (amino acids 1 to 23 of SEQ ID NO: 10).
  • mouse MCP-1 protein is a precursor protein consisting of 148 amino acids (SEQ ID NO: 12) having a signal peptide consisting of 23 amino acids (1st to 23rd amino acids of SEQ ID NO: 12). Quality protein and mature protein consisting of 125 amino acids without the signal peptide (24th to 14th amino acids of SEQ ID NO: 12).
  • the “test tissue” in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue that can be extracted from a living body when an obesity or lean test is performed.
  • liver tissue adipose tissue, muscular tissue, and blood tissue are preferable from the viewpoint that the effects of the above are easily reflected.
  • tissue from the viewpoint that the tissue can be easily isolated, it is preferable that the tissue be a blood tissue.
  • the animal species from which these tissues are derived is not particularly limited, but is preferably human because the main use of the present invention is clinical use of human.
  • test cell in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be extracted from a living body when performing an obesity or lean test.
  • hepatocytes hepatocytes, adipocytes (white adipocytes, brown adipocytes, etc.), muscle cells (myoblasts, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, etc.), knee cells (knee island cells, etc.)
  • the blood cells Preferably, the blood cells.
  • the animal species from which such a tissue is derived is not particularly limited, but is preferably human since the main use of the present invention is clinical use of human.
  • the term "obesity” in the present invention refers to an excessive accumulation of adipose tissue.
  • this includes so-called “obesity”, which is accompanied by complications such as diabetes and hypertension or visceral fat.
  • “obesity” in the present invention also means a state where the body weight has been increased relative to the original body weight when the body weight was controlled by drug administration or the like.
  • “lean” in the present invention means a concept opposite to the above-mentioned obesity, and when the weight is controlled by drug administration or diet, etc., the original weight is reduced. It also means a state in which the body weight is relatively reduced as compared with.
  • the "test” in the present invention includes not only simply determining that the subject is obese or lean, but also "predicting" the future obesity or leanness. (1) Obesity or lean examination method of the present invention
  • the test tissue or the test By detecting a change in the expression level of the MCP-1 gene in the test tissue or test cell described above, or by measuring the expression level, the test tissue or the test It is possible to detect and diagnose whether a living body (for example, a human) from which cells have been extracted is obese or lean. In addition, it is possible not only to examine obesity or leanness at the time of examination but also to predict whether obesity or leanness will occur in the future.
  • a test tissue or a test cell is extracted from a living body to be tested.
  • an extraction method There is no particular limitation on such an extraction method, and the extraction can be performed by a known method.
  • a gene whose expression level is to be measured is prepared from the extracted test tissue or test cell.
  • MCP-1 RNA total RNA or mRNA
  • RNA total RNA or mRNA
  • a gene amplification method such as RT-PCR
  • a method using a DNA microarray for example, a DNA chip manufactured by Affymetrix
  • a Northern hybridization method are used.
  • the expression level can be measured.
  • the expression level can also be measured by in situ hybridization using a test tissue or a test cell.
  • the above-mentioned measurement of the expression level is performed before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, administration of a therapeutic agent for obesity) Before and after), and the difference in expression level may be measured.
  • the expression level of the MCP-1 gene significantly increases before and after the period in which the expression level of the MCP-1 gene is predicted to change. If so, it can be diagnosed that the weight has increased or may increase in the future. On the other hand, when the expression level is significantly reduced, it can be diagnosed that the body weight has been reduced or may be reduced in the future.
  • the test tissue or test cell was extracted by detecting a change in the expression level of MCP-1 protein in the test tissue or test cell, or by measuring the expression level. It is possible to examine and diagnose whether a living body (for example, a human) is obese or lean. In addition to simply examining obesity or leanness at the time of examination, it is possible to predict whether obesity or leanness may occur in the future.
  • a method for measuring the expression level of a protein isolation from an organism There is a method for measuring the protein concentration in the blood ⁇ a method for measuring the blood concentration of the protein, and the specific method is not particularly limited.
  • an MCP-1 protein is prepared from a test tissue or a test cell.
  • a protein can be prepared by a known method, for example, by the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1850-1854 (1989).
  • the expression level is measured by, for example, a method using a protein chip (for example, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN) or an immunological method (for example, ELISA, EIA, Western blotting). be able to.
  • the expression level can also be measured by immunostaining using a test tissue or test cell.
  • a specific example of a method of measuring the blood concentration of a protein includes a method of quantifying the MCP-1 protein by the above-described immunological method using blood collected from a living body.
  • obesity or leanness of a subject can be examined by measuring the expression level of the gene or protein of MCP-1 and analyzing the result. That is, since the present invention revealed that the expression level of MCP-1 protein and body weight have a certain correlation, the above test results and the expression level of MCP-1 protein in the control group (normal persons, etc.) By comparing the values, it is possible to determine the degree of obesity or leanness. Further, according to the test method of the present invention, it is possible to predict not only the obesity or leanness at the time of the test but also the possibility of obesity or leanness in the future.
  • the above-described measurement of the expression level is carried out before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, fertilization). Before and after the administration of the full therapeutic drug) and measure the difference in the expression level.
  • the expression level of the MCP-1 protein significantly increased before and after the period in which the expression level of the MCP-1 protein was predicted to change. In this case, it can be diagnosed that the weight has increased or may increase in the future. On the other hand, when the expression level is significantly reduced, it can be diagnosed that the body weight has been reduced or may be reduced in the future.
  • the expression level of the MCP-1 gene or protein changes depending on the presence or absence of the polymorphism and the type, or the activity of the protein is abnormal. May occur. Therefore, by detecting such a genetic polymorphism, knowledge on the expression and activity of MCP-1 can be obtained, and further, a test for obesity or leanness of the test tissue or test subject from which the test cells are derived is performed. be able to.
  • Specific examples of such genetic polymorphism include minisatellite, microsatellite, and SNP (single nucleotide polymorphism).
  • Detection of a polymorphism in the MCP-1 gene can be performed as follows. That is, in the MCP-1 gene, a base sequence is determined for an obese or lean subject to be tested for a region whose expression level is controlled, and a polymorphic site is detected. The allele frequency of the detected polymorphic site is calculated and polymorphisms that are correlated with obesity or leanness are identified by finding alleles that are significantly increased or decreased in the subject population. Genetic polymorphisms detected in this way include, for example, analysis of the base sequence at the polymorphic site in genomic DNA from the subject, and the physical properties of DNA that vary depending on the type of bases present at the polymorphic site. It can be detected clinically by a method using a difference in chemical properties or a restriction enzyme site, a method using a detection probe suitable for detecting the polymorphic site, a method using mass spectrometry, or the like.
  • MCP-1 protein is produced in vascular endothelial cells and smooth muscle cells, and is known to promote chemotaxis of monocytes, lymphocytes, and basophils via its receptor, CCR2. ing. Therefore, there is a certain correlation between the MCP-1 protein and the expression level and the activity of the protein that affects the expression level of the MCP-1 gene by interacting with the MCP-1 protein. By detecting one behavior, the other behavior can be inferred.
  • interaction means that the MCP-1 protein and another protein act directly or indirectly.
  • the MCP-1 protein interacts with another protein.
  • examples include an action that causes modification of amino acids and the like by physical contact, and an action that interacts via a third protein and indirectly affects the expression of MCP-1 protein.
  • proteins include, for example, proteins that exert physiological functions upstream or downstream of MCP-1 protein in signal transduction via MCP-1 protein. More specifically, for example, MCP-1 CCR2, a receptor for proteins, and signaling molecules located downstream of CCR2.
  • a suitable means may be appropriately selected depending on the type of the target protein. The means is not particularly limited.
  • the obesity or leanness test method of the present invention as described in the above (A) to (D) makes it possible to diagnose obesity or leanness at the molecular level, and it will be used in the future.
  • the possibility of obesity or leanness can also be predicted, and a more accurate diagnosis can be made as compared with conventional diagnostic methods.
  • the expression level of the MCP-1 protein is dependent on the change in weight based on obesity or leanness. It has a correlation. Therefore, obesity or leanness can be easily tested by detecting and measuring the amount of protein in test cells or test tissue using an antibody against the protein.
  • antibody refers to an entire antibody molecule or a fragment thereof capable of binding to the MCP-1 gene product as an antigen.
  • Such an antibody can be produced by a known method, and may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the immunological assay using the antibody a known method may be used, and specific examples include a fluorescent antibody method and an enzyme antibody method.
  • kits containing such an antibody may comprise, in addition to the antibody, for example, a secondary antibody labeled with a fluorescent label or a radioisotope for detecting the antibody, or a buffer used when performing an antigen-antibody reaction.
  • test compound is administered to a test animal or a test cell, and the expression level of the MCP-1 gene or MCP-1 protein, which fluctuates when the test compound is brought into contact with the test compound, is measured. By examining the effect on the activity of the protein by contact with the protein, the test compound can be evaluated.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is effective for treating or preventing obesity or leanness using the expression level of MCP-1 gene or MCP-1 protein or MCP-1 protein activity as an index. In addition to being able to evaluate compounds, it is also possible to evaluate compounds that are effective in treating or preventing arteriosclerosis via obesity.
  • a test compound is administered to or contacted with a test animal or a test cell, and the test compound is administered. By confirming whether a compound regulates the expression level of the MCP-1 gene or a gene functionally equivalent to the gene in a test animal or test cells, it is effective in treating or preventing obesity or leanness. Compounds can be evaluated.
  • test compound is evaluated according to the following procedure.
  • a test compound is administered or brought into contact with a test animal or a test cell.
  • the compound to be tested is not limited as long as it is a candidate compound for a therapeutic or prophylactic drug for obesity or leanness, regardless of its structure or properties.
  • examples of the test animal include a mouse, a rat, a heron, a dog, and a monkey.
  • the method of administering the test compound to the test animal is not particularly limited, and specifically includes, for example, oral administration, parenteral administration (eg, transdermal administration, intramuscular injection, intravenous injection) Injection, subcutaneous injection).
  • the method of bringing the test compound into contact with the test cells is not particularly limited, and specific examples include a method of mixing and contacting in a solution such as a buffer solution (phosphate buffer or the like). .
  • test compound regulates the expression level of the MCP-1 gene or a gene functionally equivalent to the gene in the test animal or test cell.
  • the method for confirming the presence or absence of regulation of the expression level of the gene is not particularly limited, and the change in the expression level of the gene is determined before administration or contact as described above as a control.
  • the detection can be performed by a gene amplification method such as RT-PCR, a method using a DNA microarray, a Northern hybridization method, or the like.
  • a gene amplification method such as RT-PCR, a method using a DNA microarray, a Northern hybridization method, or the like.
  • an animal or a cell into which a fusion gene of the expression control region of the gene and a reporter gene has been artificially introduced may be used.
  • specific examples of the reporter gene include a / 3-galactosidase gene, a luciferase gene and a green fluorescence protein gene.
  • the term “gene functionally equivalent to the MCP-1 gene” refers to a gene having a relatively high homology, although having a different base sequence from the MCP-1 gene, and is the same as or similar to MCP-1. Shows genes with similar activity.
  • the homology is not particularly limited as long as it is functionally equivalent, but the homology of the base sequence is preferably 70 to 100%, and preferably 80 to 100%. It is more preferable that the content be 90% to 100%. When the homology is lower than the lower limit, there is a high possibility that the homology does not show the same or similar function as that of MCP-1.
  • the MCP-1 gene May have similar or similar functions.
  • Such a gene may have a base sequence homology outside the above range. It can be suitably used.
  • the gene having relatively high homology may be a gene in which one or two or more bases in the MCP-1 gene are naturally or artificially substituted, deleted, added, and inserted or inserted.
  • Expression level of the MCP-1 gene or a gene functionally equivalent to the MCP-1 gene when the test compound is administered or contacted, compared to when the test compound is not administered or contacted The test compound can be evaluated as a compound that is effective for treating or preventing obesity when it decreases by 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 20% or more.
  • the expression level of the MCP-1 gene or a gene functionally equivalent to the MCP-1 gene when the test compound is administered or contacted is 5% or more compared to when the test compound is not administered or contacted.
  • the increase is preferably at least 10%, more preferably at least 20%
  • the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing leanness.
  • test compound is administered to or contacted with a test animal or test cell, and the test compound is functionally equivalent to the MCP-1 protein or the protein in the test animal or test cell.
  • the method for confirming the presence or absence of regulation of the expression level of the protein is not particularly limited, and a change in the expression level of the protein may be determined, for example, by using the above-mentioned administration or contact as a control.
  • the detection can be performed by a method using a chip (for example, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN), an immunological method (for example, ELISA, EIA, Western blotting), or the like.
  • the presence or absence of regulation of the protein expression level was determined by measuring the blood concentration of MCP-1 protein. It is preferable to carry out.
  • the term “protein functionally equivalent to the MCP-1 protein” means that although the amino acid sequence is different from the MCP-1 protein, it shows relatively high homology and is the same as the MCP-1 protein. Or a protein having similar activity.
  • the homology is not particularly limited as long as it is functionally equivalent, but the homology of the amino acid sequence is preferably 50 to 100%, and more preferably 60 to 100%. Is more preferable, and particularly preferably 70 to 100%. When the homology is lower than the lower limit, there is a high possibility that the protein does not show the same or similar function as the MCP-1 protein.
  • the amino acid sequence of the domain having a function specific to the MCP-1 protein and the amino acid sequence corresponding to the domain of the protein When the homology is high, the protein may have the same or similar function as the MCP-1 protein. Such a protein can be suitably used even if the homology of the amino acid sequence is out of the above range.
  • the protein having relatively high homology may be a protein in which one or more amino acid residues in MCP-1 protein have been naturally or artificially substituted, deleted, added, or inserted.
  • the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing obesity.
  • the expression level of the protein functionally equivalent to the MCP-1 protein or MCP-1 protein when the test compound is administered or contacted is 5% or more compared to when the test compound is not administered or contacted.
  • the increase is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing leanness.
  • test compound is evaluated according to the following procedure.
  • a test compound is brought into contact with the MCP-1 protein.
  • the method for bringing the test compound into contact with the protein is not particularly limited, and specifically, for example, mixing and contacting in a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like). There is a method to make it.
  • a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like).
  • test compound affects the activity of the protein.
  • Conditions for measuring the activity of the protein may be appropriately set depending on the properties of the protein to be used. As such conditions, specifically, for example, in the case of the MCP-1 protein, monocyte chemotaxis can be used as an indicator. For example, J. Clin. Invest. 90, 772-779 ( 1992); Kidney Int. 44, 1036-1047 (1993) (Non-Patent Document 4).
  • the activity of the MCP-1 protein when the test compound is brought into contact with the MCP-1 protein is 5% or more, preferably 1%, as compared with the case where the test compound is not brought into contact with the MCP-1 protein.
  • the decrease is 0% or more, more preferably 20% or more
  • the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing obesity.
  • the activity of the MCP-1 protein when the test compound is brought into contact with the MCP-1 protein is 5% or more, preferably 10% or less.
  • the increase is 20% or more, more preferably, the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing leanness.
  • a model mouse exhibiting obesity by administering the NPYY5 agonist was prepared in the following manner.
  • mice 9-: 12-week-old male mice (C57BL / 6J: Claire) were bred one per plastic gauge under the conditions of room temperature 23 ⁇ 2 ° C. and humidity 55 ⁇ 15%. . The light cycle during rearing was 12 hours, and the lights were turned on at 7 am and turned off at 7 pm. Mice were allowed to feed (CE-2 (protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight): Clair) and water freely.
  • CE-2 protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight
  • mice were anesthetized with 80 mg / kg sodium pentoparbital (manufactured by Dynabot), and a sterile 28-gauge brain injection neuron (manufactured by Alzet) was stereotactically injected into the right side of the brain. Transplanted. The force neuron was fixed 0.4 sq. Posterior to Bredama, 0.8 sq. Laterally, and 2 mm deep, perpendicular to the skull. The forcenula was fixed to the skull with dental cement. The force nucleus was connected to an osmotic pump (Model No. 2002: Arze) filled with lOmM phosphate buffer containing 0.05% ⁇ serum albumin (BSA) via a polyvinyl chloride tube. lOmM PBS (0.05%
  • a solution of D-Try 34 NPY (prepared at 5 mic / g / g) in BSA) After filling the pump, the mouse was implanted subcutaneously on the back of the mouse, and an antibiotic (50 mg / kg cefamedine: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) was injected subcutaneously.
  • mice were divided into three groups (vehicle group injected with vehicle only) and D-Try 34 NPY (NPY Y5 agonist) injected with the average body weight (ad lib fed group) and D_Try. 34 NPY was injected into a pair-feed group (pair-fed group).
  • mice C57BL / 6J: Claire
  • mice were bred one at a time in a plastic gauge under the conditions of room temperature 23 ⁇ 2 ° C and humidity 55 ⁇ 15%.
  • High caloric is one meal MHF in this mouse (protein: 1 8.2 wt 0/0, Carbohydrate: 55.6 wt%, the lipid: 1 5.5 wt%) given over a six month period, obesity
  • DI0 mouse obesity
  • "established MFD” refers to mice bred with MHF until the body weight no longer increases.
  • HFD protein: 20.8% by weight, carbohydrate: 38.59% by weight, lipid: 32.88% by weight
  • DI0 mice HFD
  • mice C57BL / 6N, 17 weeks old were individually raised in one cage.
  • the food was given a normal diet (CA-1, CLEA).
  • the eating restriction was performed according to the following schedule. In other words, food (CA-1) was given only for 3 hours (10:00 to 13:00) per day, and water was freely available. The weight of the food was measured before and after the feeding time, and the difference was taken as the food consumption. During the period of food restriction, body weight and appearance were monitored. In addition, mice that seem to have failed in conditioning (such as extreme weight loss in a short period of time (eg, A mouse with a reduction of about 20%) was not used in the experiment. After breeding the mice under these conditions for 7 days, white adipocytes were excised.
  • mMCPl-69F 5'-TCA GCC AGA TGC AGT TAA CGC-3, (SEQ ID NO: 2)
  • raMCPl-163R 5 '_ TGA TCC TCT TGT AGC TCT CCA GC-3, (SEQ ID NO: 3)
  • TaqMan Probe for mouse ⁇ -actin 5 '-CCT GAG GCT CTT TTC CAG CCT TCC TTC T -3'
  • mMCPl-F 5'-TAT TGG C CGA GCG GTT C -3 '(SEQ ID NO: 5)
  • mMCPl-R 5'-ATG CCA CAG GAT TCC ATA CCC -3 '(SEQ ID NO: 6)
  • mMCPl 26F 5 '-CCT GCT GTT CAC AGT TGC C -3' (SEQ ID NO: 7)
  • mMCPl-440R 5,-CAC TGT CAC ACT GGT CAC TCC -3 '(SEQ ID NO: 8).
  • the blood concentration of MCP-1 in DI0 mice was measured to examine the relationship between obesity and MCP-1 concentration.
  • the measurement of the blood concentration of MCP-1 in each mouse was performed as follows.
  • FIG. 4 shows changes in body weight of the model mice before and after dietary restriction.
  • the vertical axis indicates the weight after diet restriction in% with respect to the weight before diet restriction.
  • FIG. 5 shows the expression levels of MCP-1 before and after dietary restriction in model mice. As is evident from FIG. 5, dietary restriction significantly reduced the expression level of MCP-1.
  • the vertical axis indicates the expression level of MCP-1 when the expression level of MCP-1 before dietary restriction is set to 1.
  • CDllb which is a surface antigen of macrophages, that is, how blood monocytes fluctuate due to administration of MCP-1.
  • MCP-1 was injected subcutaneously into mice at a rate of lOng / 0.5 microliter / hour using an osmotic pump for 2 weeks.
  • blood was collected from the tail vein of each of control mice (C57BL / 6), DI0 mice and MCP-1 treated mice using heparin-treated capillaries.
  • Blood cells were collected by centrifugation at 300 ⁇ g for 5 minutes, and then incubated at room temperature for 15 minutes with a FITC-labeled anti-mouse CDllb antibody (manufactured by BD Biosciences). In addition, non-specific results As a control, the samples were also incubated with the IgG2b isotype.
  • the red blood cells were lysed with lysis buffer at room temperature for 5 minutes. After washing the cells with PBS, the cells were suspended in PBS containing 0.5% formaldehyde.
  • flow cytometry was performed using an EPICS Elite Flow Cytometer (manufactured by Beckman Coulter). Here, analysis by flow cytometry was performed by determining the aggregation of monocytes / macrophages in whole blood cells. Flow cytometry used fluorescence and scattered light as indices to analyze 40,000 cells for each sample.
  • FIG. 10 (a) shows the results of blood cells derived from control mice
  • FIG. 10 (b) shows the results of blood cells derived from DI0 mice
  • FIG. 10 (c) shows the number of CDllb-positive monocytes in control mice and DI0 mice.
  • FIG. 10 (d) shows the results of blood cells from control mice to which saline was administered
  • FIG. 10 (e) shows the results of blood cells from mice to which MCP-1 was administered.
  • FIG. 10 (f) shows the number of CDllb-positive blood cells in control mice administered with saline and mice administered with MCP-1.
  • Fig. 10 (a) shows the results of blood cells derived from control mice
  • FIG. 10 (b) shows the results of blood cells derived from DI0 mice
  • FIG. 10 (c) shows the number of CDllb-positive monocytes in control mice and DI0 mice.
  • FIG. 10 (d) shows the results of blood cells from control mice to which saline was administered
  • FIG. 10 (e) shows the results
  • the detection method of the present invention obesity or leanness can be tested and predicted at the molecular level, and more accurate diagnosis can be performed as compared with conventional diagnosis methods. Further, according to the method for evaluating a compound of the present invention, various evaluations such as screening for a therapeutic drug for obesity or leanness or a diagnostic drug can be performed.

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Description

5¾糸田 »
肥満又は痩せの検査方法
技術分野
【0 0 0 1】 本発明は、 MCP-1 (Monocyte chemoatractant protein - 1：単球走 化性因子） 遺伝子又はタンパク質を用いた肥満又は痩せの検査方法、 及び、 当該 遺伝子又はタンパク質を含む検査薬等に関する。 また、 本発明は、 当該遺伝子又 はタンパク質を用いた、 肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法 に関する。
背景技術
【0 0 0 2】 肥満は、 高血圧症、 糖尿病、 高脂血症、 虚血性心疾患等に代表さ れる種々の成人病の危険因子である。 また、 これらの多くは慢性疾患であること から、 将来的には医療費の高騰の原因になると考えられ、 社会的にも大きな問題 となっている。
【0 0 0 3】 このような肥満状態を適切に検査し、 認定することは、 その後の 適切な治療にとって必要不可欠であるため、 簡便で精度の高い肥満マーカーの出 現が常に望まれている。 また、 近年、 投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多 型等の遺伝子型に影響を受けることが見出されつつあり、 薬剤の開発段階におけ る臨床試験やいわゆるオーダーメイド医療において、 分子レベルでの検査や診断 のマーカーが待望されている。
【0 0 0 4】 このような状況にあって、 肥満においては、 主に BMI (Body mass index :体重 (kg) 身長 (m) /身長 (m) ) がそのマーカーとして使用されており、遺 伝子ゃタンパク質のような分子レベルで診断可能なマーカーはほとんど知られて いないのが現状であった。
【0 0 0 5】 一方、 MCP - 1は、 オープンリーディングフレームがアミノ酸 9 9 個 （ヒ トの場合） からなり、 CCケモカインサブファミリーに属するタンパク質で ある （ァクセッションナンバー ： ヒ ト 匪 002982 (配列番号 9及ぴ 1 0 ) 、 マウ ス 匪 011333 (配列番号 1 1及ぴ 1 2 ) ) 。 MCP- 1は、 1 9 8 9年にクローニン グされ (Yoshimura T et al. , FEBS Letters, 244, 487 - 493 (1989)； Furutani Y et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 159, 249-255 (1989)等） 、 その後、 動脈硬化、慢性関節リゥマチ、腎炎との関連が示唆されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5134-5138 (1990)； J. Clin. Invest. 90， 772-779 (1992)； Kidney
Int. 44, 1036-1047 (1993) ) 。
【0 0 0 6】 ところで、 ケモカインは、 白血球に対して遊走活性を有する一群 のタンパク質であり、 炎症の急性期及び慢性期においてその病態の発症、 進展、 憎悪に関与していることが明らかになつている。 中でも、 MCP - 1は、 単球に対し て強力な走化性及ぴ活性化作用を有することが知られており、 免疫活性化作用や 抗腫瘍作用等の用途に使用できるものと考えられている。
【0 0 0 7】 このように、 MCP-1についての知見は数多く報告されており、 生 体内の多種多様な生命現象に関与していることが知られている。 しかしながら、 MCP-1と肥満との関係については、 特定の細胞に飽食因子として知られるレプチ ンを投与したところ、 MCP-1の発現レベルが上昇したという報告 （FASEB J.， 13,
1231-1238 (1999) ; J. Biol. Chem. , 276, 25096-25100 (2001) ) や、 ケモカイン による刺激が間接的に脂肪の蓄積に関与していることを示唆する報告 (Molecular and Cellular Endocrin. , 175, 81 - 92 (2001) ) があるに過ぎず、 MCP - 1と肥満と の直接的な関係や、 MCP- 1の発現レベルと肥満又は体重変化との相関関係につい ては全く知られていなかった。
発明の開示
【0 0 0 8】 本発明は、 上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであ り、 分子レベルで判断可能な肥満又は痩せの検査方法及ぴ当該分子を用いた肥満 及び痩せの検査薬を提供することを目的とする。 また、 肥満又は痩せの治療薬の スクリ一二ング等、 化合物の評価方法、 及び当該評価方法により肥満又は痩せの 治療薬として有効であると評価された化合物を提供することを目的とする。 【0 0 0 9】 本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 体 重変化と MCP- 1の発現量又は血中濃度に一定の相関関係があることを見出し、 本 発明を完成した。
【0 0 1 0】 すなわち、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 MCP- 1遺伝子の 被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。 すなわ ち、 MCP-1遺伝子発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。 ここで、 前記 発現レベルの測定を DNAマイクロアレイにより行うことが好ましい。
【0 0 1 1】 また、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 MCP-1タンパク質の 被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定することを特徴とする。 すなわ ち、 MCP-1タンパク質の発現レベルに基いて肥満度の検査が可能になる。
【0 0 1 2】 さらに、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 MCP-1遺伝子の被 検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。 す なわち、 MCP-1遺伝子の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの測定値 とを比較する （例えば、 初期値と測定値の差又は比） 、 肥満度の検査又は予測方 法が提供される。 ここで、 前記発現レベルの測定を DNAマイクロアレイにより行 うことが好ましい。
【0 0 1 3】 また、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 MCP- 1タンパク質の 被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出することを特徴とする。 すなわち、 MCP- 1タンパク質の発現レベルの初期値と所定期間後の発現レベルの 測定値とを比較する （例えば、 初期値と測定値の差又は比） 、 肥満度の検査又は 予測方法が提供される。
【0 0 1 4】 また、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 被検組織又は被検細 胞における MCP - 1遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする。すなわち、 MCP-1遺伝子多型に基づいて肥満度の検査又は予測をすることが可能となる。 【0 0 1 5】 さらに、 本発明の肥満又は痩せの検査方法は、 MCP- 1タンパク質 と相互作用することにより MCP - 1遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発 現量又は活性を検出することを特徴とする。 すなわち、 MCP - 1遺伝子の発現量に 影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性に基づいて肥満度の検査又は予測をす ることが可能となる。
【0 0 1 6】 また、 本発明の肥満又は痩せの検査薬は、 MCP-1タンパク質に対 する抗体を有効成分として含むことを特徴とする。
【0 0 1 7】 さらに、 本発明の肥満又は痩せの検查.キットは、 MCP - 1タンパク 質に対する抗体を含むことを特徴とする。 前記キットは、 好ましくは、 前記抗体
( 1次抗体） を検出するための蛍光物質又はラジオァイソトープで標識された 2 次抗体、 抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝液を含む。
【0 0 1 8】 また、 本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評 価方法は、被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、 被検化合物が、 被検動物又は被検細胞中で MCP-1遺伝子あるいは当該遺伝子と機 能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程と、 を含むこ とを特徴とする。
【0 0 1 9】 さらに、 本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の 評価方法は、 被検化合物を、 被検動物又は被検細胞に、 投与又は接触させる工程 と、 被検化合物が、 被検動物又は被検細胞中で MCP-1タンパク質あるいは当該タ ンパク質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する 工程、 を含むことを特徴とする。
【0 0 2 0】 さらに、 本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の 評価方法は、 被検化合物を、 MCP-1タンパク質に接触させる工程と、 被検化合物 力 前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、 を含むこと を特徴とする。
【0 0 2 1】 また、 本発明の化合物は、 本発明の化合物の評価方法により、 月巴 満又は痩せの治療又は予防に有効であると評価されたことを特徴とする。
図面の簡単な説明 【0 0 2 2】 図 1は、 DI0マウスと対照群との MCP - 1の血中濃度を比較したグ ラフである。
【0 0 2 3】 図 2は、 DI0マウスと対照群との体重を比較したグラフである。 【0 0 2 4】 図 3は、 DI0マウスにおける体重と MCP - 1の血中濃度との関係を 示すグラフである。
【0 0 2 5】 図 4は、 食事制限の前後におけるモデルマウスの体重を比較した グラフである。
【0 0 2 6】 図 5は、 食事制限の前後におけるモデルマウスの白色脂肪細胞中 の MCP- 1の発現量を比較したグラフである。
【0 0 2 7】 図 6は、 食事制限の前後におけるモデルマウスの MCP-1の血中濃 度を比較したグラフである。
【0 0 2 8】 図 7は、 DI0マウスにおける肥満抑制化合物の投与と MCP- 1の発 現量との関係を示すグラフである。
【0 0 2 9】 図 8は、 DI0マウスにおける肥満抑制化合物の投与と MCP- 1の血 中濃度との関係を示すグラフである。
【0 0 3 0】 図 9は、 食事制限の前後における肥満抑制化合物の投与と MCP- 1 の血中濃度との関係を示すグラフである。
【0 0 3 1】 図 1 0 (A) ( B ) (D ) 及び （E ) は、 いずれも各種細胞にお ける CDllbの蛍光強度と細胞数との関係を示すグラフである。 また、 （C ) 及び ( F ) は、 各種細胞における CDllb陽性細胞数を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
【0 0 3 2】 以下、 本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【0 0 3 3】 本発明における 「発現レベル」 とは、 MCP- 1遺伝子の転写産物の 絶対量又は相対量をいう。 この場合、 当該遺伝子は、 DNA又は mRNAのいずれをも 含む。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」 とは、 MCP - 1 遺伝子の翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。 【0 0 3 4】 本発明における 「MCP - 1タンパク質」 は、 シグナルペプチドを有 する前駆体タンパク質及ぴシダナルぺプチドを有さな 、成熟タンパク質の V、ずれ も含むが、 好適には成熟タンパク質をさす。 例えば、 ヒ ト MCP - 1タンパク質は、 2 3アミノ酸 （配列番号 1 0の 1〜2 3番目のアミノ酸） からなるシグナルぺプ チドを有する 9 9アミノ酸 （配列番号 1 0 ) 力 らなる前駆体タンパク質及び当該 シグナルぺプチドを有さない 7 6アミノ酸 （配列番号 1 0の 2 4〜9 9番目のァ ミノ酸） からなる成熟タンパク質のいずれであってもよレ、。 また、 マウス MCP- 1 タンパク質は、 2 3アミノ酸 （配列番号 1 2の 1〜2 3番目のアミノ酸） からな るシグナルぺプチドを有する 1 4 8アミノ酸 （配列番号 1 2 ) からなる前駆体タ ンパク質及び当該シグナルペプチドを有さない 1 2 5アミノ酸 （配列番号 1 2の 2 4〜1 4 8番目のアミノ酸）からなる成熟タンパク質のいずれであってもよレ、。 【0 0 3 5】 また、 本発明における 「被検組織」 とは、 肥満又は痩せの検査を 行う際に生体から抽出可能な組織であれば、 その種類は特に限定されないが、 肥 満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、 筋肉組織、 血液組織であることが好ましい。 また、 組織の単離が容易であるとの 観点から、 前記組織の中でも血液組織であることが好ましい。 ここで、 これらの 組織の由来となる動物種については特に制限されないが、 本発明の主たる用途が ヒ トの臨床的使用であることから、 ヒ トであることが好ましい。
【0 0 3 6】 また、 本発明における 「被検細胞」 についても、 肥満又は痩せの 検査を行う際に生体から抽出可能な細胞であれば、 その種類は特に限定されない 力 肥満又は痩せの影響が反映されやすいとの観点から、 例えば、 肝細胞、 脂肪 細胞 （白色脂肪細胞、 褐色脂肪細胞等） 、 筋肉細胞 （筋芽細胞、 骨格筋細胞平滑 筋細胞等） 、 膝細胞 （膝島細胞等） 、 血球細胞であることが好ましい。 ここで、 かかる組織の由来となる動物種については特に限定されないが、 本発明の主たる 用途がヒ トの臨床的使用であることから、 ヒ トであることが好ましい。
【0 0 3 7】 さらに、 本発明における 「肥満」 とは、 脂肪組織が過剰に蓄積し た状態と定義される一般的な肥満に加え、 これに糖尿病や高血圧等の合併症又は 内臓脂肪が伴う、 いわゆる 「肥満症」 も含む。 また、本発明における 「肥満」 は、 薬物投与等による体重のコントロールを受けた場合に、 もとの体重と比較して相 対的に体重が増加した状態をも意味する。
【0 0 3 8】 一方、 本発明における 「痩せ」 とは、 前記の肥満とは対立する概 念を意味するとともに、 薬物投与又はダイエツト等による体重のコントロールを 受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が減少した状態をも意味する。 【0 0 3 9】 また、 本発明における 「検査」 とは、 肥満又は痩せであることを 単に判断するのみならず、 将来的な肥満又は痩せを 「予測」 する場合をも含む。 【0 0 4 0】 （ 1 ) 本発明の肥満又は痩せの検査方法
【0 0 4 1】 （A) MCP-1遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満又は 痩せの検査方法
【0 0 4 2】 前述した被検組織又は被検細胞における MCP- 1遺伝子の発現レべ ルの変化を検出することにより、 又は、 発現レベルを測定することにより、 当該 被検組織又は被検細胞を抽出した生体 (例えばヒ ト） が肥満であるか又は痩せで あるかを検查 '診断することが可能である。 また、 単に検査時の肥満又は痩せの 状態を検査するのみならず、 将来的に肥満又は痩せになるか否かを予測すること も可能である。
【0 0 4 3】 以下に、 このような検査の具体的な方法について説明する。
【0 0 4 4】 先ず、検査対象となる生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。 このような抽出の方法としては特に制限はなく、 公知の方法により抽出すること ができる。
【0 0 4 5】 次に、 抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の 対象となる遺伝子を調製する。
【0 0 4 6】 MCP- 1遺伝子の発現レベルを測定するには、 先ず、 被検組織又は 被検細胞から MCP- 1の RNA (total RNA又は mRNA) を調製する必要がある。 この ような RNAの調製は、公知の方法によって行うことができる力 S、例えば、 Molecular cloning A LABORATORY MANUAL 2nd EDITION (1989) (T. Maniatis著： Cold Spring Harbor Laboratory Press) 7. 3-7. 36を参照して行うことができる。 こうして調 製した RNAを用いて、 例えば、 RT- PCRのような遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレ ィ （例えば、 Af f ymetrix社製 DNAチップ） を用いる方法、 ノ一ザンハイブリダイ ゼーシヨン法により、 その発現量を測定することができる。 また、 被検組織又は 被検細胞を用いたイン サイチュ ハイプリダイゼーシヨン （in situ hybridization) 等により、 その発現量を測定することもできる。
【0 0 4 7】 また、 MCP-1遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、 前記の 発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後 （例えば、 肥満治 療薬の投与の前後） について行い、 発現量の差を測定すればよい。
【0 0 4 8】 具体的には、 被検組織又は被検細胞において、 前述した MCP- 1遺 伝子の発現量が変化すると予測される期間の前後で、 その発現レベルが有意に上 昇した場合に、 体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断で きる。 一方、 当該発現レベルが有意に減少した場合に、 体重の減少があった又は 将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【0 0 4 9】 （B ) MCP-1タンパク質の発現レベルを測定することによる肥満 又は痩せの検查方法
【0 0 5 0】 被検組織又は被検細胞における MCP- 1タンパク質の発現レベルの 変化を検出することにより、 又は、 発現レベルを測定することにより、 当該被検 組織又は被検細胞を抽出した生体 （例えばヒト） が肥満であるか又は痩せである かを検査 ·診断することが可能である。 また、 単に検査時の肥満又は痩せの状態 を検査するのみならず、 将来的に肥満又は痩せになりうるかを予測することも可 能である。
【0 0 5 1】 以下、 このような検査の具体的な方法について説明する。
【0 0 5 2】 タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、 生体から単離 したタンパク質を定量する方法ゃタンパク質の血中濃度を測定する方法があり、 具体的な方法としては特に限定されない。
【0 0 5 3】 生体から単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、 以下のとおりである。 先ず、 被検組織又は被検細胞から MCP-1タンパク質を調製 する。このようなタンパク質の調製は、公知の方法によって行うことができるが、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 1850 - 1854 (1989)に記載の方法によ り、 行うことができる。 こうして調製したタンパク質から、 例えば、 プロテイン チップ （例えば、 CIPHERGEN社製プロテインチップシステム） を用いる方法、 免 疫学的方法 （例えば、 ELISA、 EIA法、 ウェスタンブロッテイング法） により、 そ の発現量を測定することができる。 また、 被検組織又は被検細胞を用いた免疫染 色等によって、 その発現量を測定することもでできる。 一方、 タンパク質の血中 濃度を測定する方法の具体例としては、 生体から採取した血液を用いて、 上記免 疫学的方法等により、 MCP-1タンパク質を定量する方法が挙げられる。
【0 0 5 4】 以上のようにして、 MCP-1の遺伝子又はタンパク質の発現レベル を測定した後、 その結果を解析することにより、 被検体の肥満又は痩せを検査で きる。 すなわち、 本発明より、 MCP-1タンパク質の発現レベルと体重は一定の相 関関係を有することが明らかになつたため、 上記検査結果と対照群 （健常人等） における MCP-1タンパク質の発現量とを比較することにより、 肥満又は痩せの程 度を判断することが可能となる。 また、 本発明の検査方法によれば、 単に検查時 の肥満又は痩せの状態を検査するのみならず、 将来的な肥満又は痩せの可能性の 予測も可能となる。 これは、 MCP-1タンパク質の血中濃度が体重の増減に先だつ て増減する傾向が見られることによるものであり、 特に MCP - 1タンパク質の血中 濃度の減少と体重の減少との関係において、 この傾向が強いことが本発明者らに よって見出されている。
【0 0 5 5】 また、 MCP-1タンパク質の発現レベルの変化を検出するには、 前 記の発現量の測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後 （例えば、 肥 満治療薬の投与の前後） について行い、 発現量の差を測定すればよい。
【0 0 5 6】 具体的には、 被検組織又は被検細胞において、 前述した MCP-1タ ンパク質の発現量が変化すると予測される期間の前後で、 その発現レベルが有意 に上昇した場合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断 できる。 一方、 当該発現レベルが有意に減少した場合に体重の減少があった又は 将来的に減少する可能性があると診断することができる。
【0 0 5 7】 （C ) MCP-1遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満又は痩せの検査 方法
【0 0 5 8】 MCP-1遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、 その多型の有無や種 類により MCP-1遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、 当該タンパク 質の活性に異常が生じる場合がある。 従って、 このような遺伝的多型を検出する ことにより MCP - 1の発現や活性に関する知見を得、 さらに、 被検組織ゃ被検細胞 の由来となった被検体の肥満又は痩せの検査を行うことができる。 このような遺 伝的多型としては、具体的には、例えば、 ミニサテライト、マイクロサテライト、 SNP (single nucleotide polymorphism：—塩基多型) 力 S挙げられる。
【0 0 5 9】 MCP - 1遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことが できる。 すなわち、 MCP-1遺伝子において、 その発現量を制御する領域を検查対 象となる肥満又は痩せの被検体を対象として塩基配列を決定し、 多型部位を検出 する。 検出された多型部位の対立遺伝子頻度を算出し、 被検体集団において有意 に増加又は減少している対立遺伝子を見出すことにより肥満又は痩せと相関する 多型を同定する。 このようにして検出された遺伝的多型は、 例えば、 被検体由来 のゲノム DNAについて、 多型部位の塩基配列の解析、 多型部位に存在する塩基の 種類に依存して変化する DNAの物理化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用 する方法、 当該多型部位の検出に適当な検出用プローブを利用する方法及び質量 分析法を利用した方法等によって臨床的に検出可能である。
【0 0 6 0】 （D) MCP - 1タンパク質と相互作用することにより MCP-1遺伝子 の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満 又は痩せの検査方法
【0 0 6 1】 生体内において、 多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用 することにより、 所定の生理機能を発揮する。 例えば、 MCP-1タンパク質は、 血 管内皮細胞や平滑筋細胞等で産生され、その受容体である CCR2を介して単球、 リ ンパ球、 好塩基球等の走化を促すことが知られている。 従って、 MCP - 1タンパク 質と、 当該 MCP - 1タンパク質と相互作用することにより MCP-1遺伝子の発現量に 影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは一定の相関関係を有し、 いずれ か一方の挙動を検出することにより、 他方の挙動を推測できる関係にある。
【0 0 6 2】 ここで、 「相互作用」 とは、 MCP - 1タンパク質と別のタンパク質 が直接的又は間接的に作用することをいい、 例えば、 MCP- 1タンパク質が別のタ ンパク質と物理的に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、 第 3のタンパク質を介して相互作用し、 間接的に MCP-1タンパク質の発現に影響 を及ぼすような作用が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、 MCP- 1 タンパク質を介するシグナル伝達において、 MCP-1タンパク質の上流又は下流で 生理的機能を発揮するタンパク質が挙げられ、 より具体的には、 例えば、 MCP-1 タンパク質の受容体である CCR2や、 CCR2の下流に位置するシグナル伝達分子が 挙げられる。 また、 MCP-1タンパク質の上流又は下流に位置するタンパク質の発 現量又は活性を検出する方法としては、 対象となるタンパク質の種類に応じて好 適な手段を適宜選択すればよく、 具体的な手段としては特に限定されない。
【0 0 6 3】 以上の （A) 〜 （D ) で説明したような本発明の肥満又は痩せの 検査方法によって、 分子レベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかり力、 将 来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることとなり、 従来の診断 方法と比較して、 より的確な診断が可能となる。
【0 0 6 4】 （2 ) 肥満又は痩せの検査薬、 検査キット
【0 0 6 5】 MCP-1タンパク質の発現量は、 肥満又は痩せに基づく体重変化と 相関関係を有する。 従って、 当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞や 被検組織中のタンパク質量を検出、 測定することにより、 肥満又は痩せの検査を 簡便に行うことができる。 ここで、 「抗体」 とは、 抗原である MCP - 1遺伝子産物 に結合しうる抗体分子全体又はその断片をいう。 このような抗体は、 公知の方法 によって製造することができ、 モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のい ずれであってもよい。 また、 当該抗体を用いた免疫学的測定法としては、 公知の 方法を使用すればよく、 具体的には、 例えば、 蛍光抗体法、 酵素抗体法が挙げら れる。
【0 0 6 6】 また、 このような抗体を含んだキットを製造し、 本発明を実施す ることも可能である。 キットの構成としては、 当該抗体に加え、 例えば、 抗体を 検出するために蛍光標識やラジオアイソトープで標識された 2次抗体や抗原抗体 反応を行う際に使用する緩衝液を備えていてもよい。
【0 0 6 7】 このような肥満又は痩せの検查薬を使用することにより、 分子レ ベルで肥満又は痩せの診断が可能となるばかり力 将来的に肥満又は痩せになる 可能性についても予測できることとなり、 従来の診断方法と比較して、 より的確 な診断が可能となる。 また、 本発明の肥満又は痩せの検査キットを使用すること により、 前述したような的確な診断を非常に簡便に実施することが可能となる。
【0 0 6 8】 （3 ) 本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評 価方法
【0 0 6 9】 被検化合物を被検動物ゃ被検細胞に投与、 接触させることにより 変動する MCP-1遺伝子又は MCP- 1タンパク質の発現量を測定したり、 被検化合物 を MCP-1タンパク質に接触させて当該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討する ことにより、 当該被検化合物の評価を行うことが可能となる。
【0 0 7 0】 すなわち、 このような被検化合物の中には、 細胞や組織に作用す ることにより、 MCP-1遺伝子又は MCP - 1タンパク質の発現レベルや MCP - 1タンパ ク質の活性を正常化あるいはコントロールし、 脂肪の蓄積や食欲のコントロール 等、 肥満や痩せの原因となるメカェズムの正常化を図ることができるものがある と考えられる。 従って、 以下に説明するような評価方法により、 肥満又は痩せの 治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。 ここで、 「評価」 とは、化合物のスクリーニングのみならず、バリデーションをも含む概念を指す。 【0 0 7 1】 また、 本発明者らは、 MCP-1を投与してその血中濃度を高めるこ とにより単球の活性化、すなわち CDllb positive単球の増加が促進されることを 見出している。 従来は、 血管の炎症部分等から MCP-1が血管内に分泌され、 その 結果、 単球の活性化が促進されていると考えられていた。 しかし、 これに加え、 血管外部からの MCP - 1によっても単球の活性化が認められる。 単球の走化は単球 の活性化によって促進され、 また、 単球の走化に続くマクロファージの産生によ り動脈硬化が生じることから、肥満に,よる MCP - 1の増加が動脈硬化の一因となる。 【0 0 7 2】 本発明の化合物の評価方法により、 MCP- 1遺伝子又は MCP- 1タン パク質の発現レベル又は MCP- 1タンパク質の活性を指標として肥満又は痩せの治 療又は予防に有効な化合物を評価することが可能になるとともに、 肥満を介した 動脈硬化についても、 その治療又は予防に有効な化合物の評価を行うことが可能 となる。
【0 0 7 3】 （A) MCP-1遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法 【0 0 7 4】 被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、 当該被 検化合物が被検動物又は被検細胞中で MCP - 1遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的 に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認することにより、 肥満又は 痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【0 0 7 5】 具体的には、 以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【0 0 7 6】 先ず、被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる。 ここで、 被検化合物としては、 肥満又は痩せの治療又は予防薬の候補化合物であ れば、 その構造や性質は問わず、 化合物種も限定されない。 また、 被検動物とし ては、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 サルが挙げられる。 【0 0 7 7】 被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなく、 具体的には、 例えば、 経口投与、 非経口投与 （例えば、 経皮投与、 筋肉内注射、 静脈内注射、 皮下注射） が挙げられる。 また、 被検化合物を被検細胞に接触させ る方法としても特に制限はなく、具体的には、例えば、緩衝液（リン酸緩衝液等） 等の溶液中で混合し接触する方法が挙げられる。
【0 0 7 8】 次に、 被検化合物が被検動物又は被検細胞中で MCP-1遺伝子ある いは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認す る。
【0 0 7 9】 前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、 特に制 限はなく、 前述の投与又は接触の前を対照とし、 当該遺伝子の発現量の変化を
RT - PCRのような遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハ イブリダイゼーション法等によって検出することにより実施することができる。 また、 前記遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に 導入した動物又は細胞を用いてもよい。 この場合、 レポーター遺伝子としては、 具体的には、 例えば、 /3—ガラクトシダーゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子又は グリーンフルォレツセンスプロティン遺伝子が挙げられる。 一
【0 0 8 0】 ここで、 「MCP-1遺伝子と機能的に等価な遺伝子」 とは、 MCP-1 遺伝子と塩基配列は異なるものの、 比較的高い相同性を示し、 MCP - 1と同じ又は 類似の活性を有する遺伝子を示す。 ここで、 前記相同性は、 機能的に等価であれ ば特に制限はなレ、が、塩基配列の相同性が 7 0〜 1 0 0 %であることが好ましく、 8 0〜1 0 0 %であることがより好ましく、 9 0〜1 0 0 %であることが特に好 ましい。 相同性が前記下限より低い場合には、 MCP-1と同じ又は類似の機能を示 さない可能性が高い傾向にある。 しかしながら、 塩基配列の相同性が前記下限未 満であっても、 MCP-1に特有の機能を有するドメインと、 当該ドメインに対応す る塩基配列との相同性が高い場合には MCP - 1遺伝子と同様又は類似の機能を有す る場合がある。 このような遺伝子は、 塩基配列の相同性が前記範囲外であっても 好適に使用可能である。 また、 比較的相同性の高い遺伝子とは、 MCP- 1遺伝子に おける 1又は 2以上の塩基が自然若しくは人工的に置換、 欠失、 付加及びノ又は 挿入した遺伝子であってもよい。
【0 0 8 1】 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、 被検化合物を 投与又は接触させた場合の MCP-1遺伝子又は MCP-1遺伝子と機能的に等価な遺伝 子の発現レベルが 5 %以上、 好ましくは 1 0 %以上、 より好ましくは 2 0 %以上 低下した場合、 当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価でき る。 他方、 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、 被検化合物を投与 又は接触させた場合の MCP- 1遺伝子又は MCP- 1遺伝子と機能的に等価な遺伝子の 発現レベルが 5 %以上、 好ましくは 1 0 %以上、 より好ましくは 2 0 %以上上昇 した場合、 当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
【0 0 8 2】 （B ) MCP-1タンパク質の発現レベル調節能を指標とする評価方 法 '
【0 0 8 3】 被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、 当該被 検化合物が被検動物又は被検細胞中で MCP-1タンパク質あるいは当該タンパク質 と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認することによ り、 肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【0 0 8 4】 被検化合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる方法等 については、 上記の （A) MCP-1遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方 法に記載の方法等と同様である。
【0 0 8 5】 前記タンパク質の発現レベルの調節の有無の確認法としては、 特 に制限はなく、 前述の投与又は接触の前を対照とし、 当該タンパク質の発現量の 変化を、 例えば、 プロテインチップ （例えば、 CIPHERGEN社製プロテインチップ システム） を用いる方法、 免疫学的方法 （例えば、 ELISA、 EIA法、 ウェスタンブ ロッテイング法） 等によって検出することにより実施することができる。 前記タ ンパク質の発現レベル調節の有無の確認は、 MCP- 1タンパク質の血中濃度の測定 により行うことが好ましい。
【0 0 8 6】 ここで、 「MCP- 1タンパク質と機能的に等価なタンパク質」 とは、 MCP - 1タンパク質とアミノ酸配列は異なるものの、 比較的高い相同性を示し、 MCP - 1タンパク質と同じ又は類似の活性を有するタンパク質を示す。 ここで、 前記相 同性は、 機能的に等価であれば特に制限はないが、 アミノ酸配列の相同性が 5 0 〜1 0 0 %であることが好ましく、 6 0〜1 0 0 %であることがより好ましく、 7 0〜1 0 0 %であることが特に好ましい。相同性が前記下限より低い場合には、 MCP - 1タンパク質と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にある。 し かしながら、 タンパク質のアミノ酸配列の相同性が前記下限未満であっても、 MC P-1タンパク質に特有の機能を有するドメインのアミノ酸配列と、 前記タンパク 質の当該ドメィンに対応するアミノ酸配列との相同性が高い場合には、 前記タン パク質は MCP-1タンパク質と同様又は類似の機能を有する場合がある。 このよう なタンパク質は、 ァミノ酸配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能 である。 また、 比較的相同性の高いタンパク質とは、 MCP-1タンパク質における 1又は 2以上のアミノ酸残基が自然若しくは人工的に置換、 欠失、 付加及びノ又 は挿入したタンパク質であつてもよい。
【0 0 8 7】 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、 被検化合物を 投与又は接触させた場合の MCP - 1タンパク質又は MCP-1タンパク質と機能的に等 価なタンパク質の発現レベルが 5 %以上、 好ましくは 1 0 %以上、 より好ましく は 2 0 %以上低下した場合、 当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合 物と評価できる。 他方、 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、 被検 化合物を投与又は接触させた場合の MCP-1タンパク質又は MCP - 1タンパク質と機 能的に等価なタンパク質の発現レベルが 5 %以上、 好ましくは 1 0 %以上、 より 好ましくは 2 0 %以上上昇した場合、 当該被検化合物は痩せの治療又は予防に有 効な化合物と評価できる。
【0 0 8 8】 （C ) MCP-1タンパク質の活性を指標とする評価方法 【0 0 8 9】 被検化合物を MCP- 1タンパク質に接触させ、 被検化合物が当該タ ンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、 肥満又は痩せの治 療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
【0 0 9 0】 具体的には、 以下の手順で被検化合物の評価を行う。
【0 0 9 1】 先ず、 被検化合物を MCP - 1タンパク質に接触させる。
【0 0 9 2】 このようなタンパク質と被検化合物を接触させる方法は、 特に制 限はなく、 具体的には、 例えば、 緩衝液 （リン酸緩衝液等） 等の溶液中で混合し 接触させる方法が挙げられる。
【0 0 9 3】 次に、 被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否か を確認する。 タンパク質の活性測定における条件は、 使用するタンパク質の性質 により適宜設定すればよい。このような条件としては、具体的には、例えば、 MCP-1 タンパク質の場合には、 単球走化性を指標とすることができ、 例えば、 J. Clin. Invest. 90, 772-779 (1992)； Kidney Int. 44， 1036-1047 (1993) (非特許文献 4 ) を参照して行うことができる。
【0 0 9 4】 被検化合物を MCP-1タンパク質に接触させない場合に比べて、 被 検化合物を MCP - 1タンパク質に接触させた場合の MCP - 1タンパク質の活性が 5 % 以上、 好ましくは 1 0 %以上、 より好ましくは 2 0 %以上低下した場合、 当該被 検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。 他方、 被検化合物 を MCP - 1タンパク質に接触させない場合に比べて、 被検化合物を MCP- 1タンパク 質に接触させた場合の MCP- 1タンパク質の活性が 5 %以上、 好ましくは 1 0 %以 上、 より好ましくは 2 0 %以上上昇した場合、 当該被検化合物は痩せの治療又は 予防に有効な化合物と評価できる。
【0 0 9 5】 以上説明したような本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効 な化合物の評価方法により、肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスクリーニングや、 これらの薬剤の有効性又は安全性の評価、 さらには、 オーダーメイド治療におけ る適切な薬剤の選択が可能となる。 【0096】 （4) 本発明の肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物 【0097】 MCP - 1が肥満及ぴ体重変化に関与していることが解明されたので、 上記の評価方法により有効であると評価された化合物は、肥満又は痩せの治療又は 予防剤として極めて有用である。
[実施例]
【0098】 以下、 実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、 本発 明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0099】 （肥満モデル ft物の作製）
【0 100】 製造例 1
(ニューロペプチド Y (Neuropeptide Y： NPY)Y5ァゴニスト i.e. v,投与マウス）
【0101】 NPYY5ァゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウ スを以下の要領で作製した。
【0102】 9〜： 1 2週齢の雄マウス （C57BL/6J：クレア社製） は、 室温 23 ±2°C、湿度 55± 1 5%の条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。 また、 飼育時の明暗のサイクルは 1 2時間とし、 午前 7時に点灯し、 午後 7時に 消灯した。 また、 マウスは、 飼料 （CE- 2 (タンパク質： 25. 4重量％、 炭水化 物： 50. 3重量％、 脂質： 4. 4重量％) :クレア社製） と水は自由に摂取させ た。
【0103】 マウスは、 80mg/kgペントパルビタ一ルナトリウム （ダイナボッ ト社製）で麻酔をかけ、滅菌された 28ゲージの脳注入力ニューレ（アルゼ（Alzet) 社製）を右側脳質へ定位的に移植した。力ニューレはブレダマより後方へ 0.4讓、 側方へ 0.8讓、 深さ 2mmの位置に、 頭蓋骨に対し垂直に固定した。 力ニューレは 歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。 力ニューレは、 0.05%ゥシ血清アルブミン (BSA) を含む lOmMのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ （モデルナンバー 2002：アルゼ社製）にポリビニルク口ライドチューブで接続した.。 lOmM PBS(0.05%
BSA含む）に D- Try34NPY(5マイク口グラム/日になるように調製）を溶解した溶液を ポンプに満たした後、 マウスの背中の皮下に埋め込み、 抗生物質 （50mg/kgのセ ファメジン （Cefamedine) ：藤沢薬品社製） を皮下注射した。
【0104】 これらのマウスを平均体重を一致させた 3つのグループ （溶媒の みを注入したグループ （vehicle group) D- Try34NPY (NPY Y5ァゴニスト）を注入 したグループ （ad lib fed group)、 D_Try34NPYを注入しペアフィードとしたグル ーフ (pair—fed group) ) ίこ分りた。
【0105】 製造例 2
(DI0(Diet induced obesity)マウス）
【0106】 18週齢のマウス （C57BL/6J:クレア社製） は、室温 23±2°C、 湿度 55± 1 5%の条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。 このマ ウスに高カロリ一食である MHF (タンパク質： 1 8. 2重量0 /0、炭水化物： 55. 6重量％、 脂質： 1 5. 5重量％) を 6ヶ月間に渡って与え、 肥満を呈するモデ ルマウス （DI0マウス） を作製した。 なお、 実施例中、 「established MFD」 は、 これ以上体重が増えないようになるまで MHFを与えて飼育したマウスを指す。 【01 07】 また、 前記のマウスに MHFよりさらに高い脂肪を含有する高カロ リー食である HFD (タンパク質： 20. 8重量％、 炭水化物： 38. 59重量％、 脂質： 32. 88重量％) を与えた DI0マウス （HFD) も作製した。
【0108】 製造例 3
(食事制限をしたマウス）
【0109】 マウス （C57BL/6N、 1 7週齢） は 1ケージに 1匹ずつ個別に飼育 した。 また、 エサは普通食（CA-1、 CLEA)を与えた。
【01 10】 摂食制限は、 以下のようなスケジュールで行った。 すなわち、 ェ サ（CA- 1)を 1日につき 3時間 （10 ： 00〜1 3 ： 00) だけ与え、 水は自由に 摂取できるようにした。 摂食時間の前後で餌の重量を測定し、 その差を摂食量と した。 また、 摂食制限をしている期間は、 体重、 外見の観察等をモニターした。 なお、 条件付けに失敗したと思われるマウス （短期間に極度な体重減少 （例えば 2 0 %程度の減少） が見られるマウス） は実験には使用しなかった。 かかる条件 下でマウスを 7日間飼育した後、 白色脂肪細胞を摘出した。
【0 1 1 1】 実施例 1〜 3及び比較例 1
(白色脂肪細胞における MCP- 1の発現）
【0 1 1 2】 MCP-1の発現量の定量的な解析は、マウス白色脂肪細胞から RT-PCR によつて得た cDNAを用い、 TaqMan PCR法により行つた。標準曲線はマゥス MCP - 1 cDNA (ァクセッションナンパ一：匪 011333) 断片を用いて作成し、 j3 - actinの発 現量に基づいて標準化した。 以下に、 使用したプライマーの塩基配列を示す。 マウス MCP- 1用 TaqMan Probe： 5， - CCA CTC ACC TGC TGC TAC TCA TTC ACC A -3' (配列番号 1 )
mMCPl-69F： 5' - TCA GCC AGA TGC AGT TAA CGC -3， （配列番号 2 )
raMCPl- 163R： 5' _ TGA TCC TCT TGT AGC TCT CCA GC -3， （配列番号 3 )
マウス β -actin用 TaqMan Probe： 5' - CCT GAG GCT CTT TTC CAG CCT TCC TTC T -3'
(配列番号 4 )
mMCPl-F： 5' - TAT TGG C CGA GCG GTT C -3' (配列番号 5 )
mMCPl-R： 5' - ATG CCA CAG GAT TCC ATA CCC -3' (配列番号 6 )
マウス MCP- lcDNA断片作製用プライマー
mMCPl 26F: 5' - CCT GCT GTT CAC AGT TGC C -3' (配列番号 7 )
mMCPl- 440R： 5， - CAC TGT CAC ACT GGT CAC TCC -3' (配列番号 8 )。
【0 1 1 3】 非処理の C57BL/6Nの白色脂肪細胞における MCP- 1及ぴレプチンの 発現量を 1とした場合の、 DI0マウス（DI0)、D-Try34NPY投与マウス（Y5 agonist FF)、 D-Try34NPY pair feeding投与群マウス（Y5 agonist PF)及ぴ食事制限をしたマウ ス（Fasting)におけるこれらの遺伝子の発現量を表 1に示す。表 1より明らかなよ うに、 肥満モデルマウスでは MCP-1の発現量が増加し、 食事制限をしたマウスで は、 その発現量が低下していた。 従って、 MCP - 1の発現量と体重とが相関関係を 有していることが明らかとなった。 【0 1 1 4】
(表 1 )
Figure imgf000022_0001
【0 1 1 5】 実施例 4
(肥満モデルマウスにおける MCP - 1の血中濃度）
【0 1 1 6】 DI0マウスにおける MCP- 1の血中濃度の測定を行い、肥満と MCP- 1 濃度との関係を検討した。 各マウスにおける MCP-1の血中濃度の測定は、 以下の ようにして行った。
【0 1 1 7】 8週齢から MHFを与えて飼育した DI0マウス 5 5匹について、 1 5週齢のときに尾静脈より採血を行った。 この血漿成分を用いて、 MCP-1の血中 濃度を測定した。 具体的には、 先ず、 マウス尾静脈よりへパリン採血を行い、 遠 心操作により血漿成分を採取した。 次に、 5 0マイクロリツトルの血漿を抗体固 相化プレート中、 室温で 2時間静置して反応させた。 このプレートを緩衝液で洗 浄後、 酵素標識された抗マウス MCP - 1抗体を加え、 室温でさらに 2時間静置して 反応させた。 再びこのプレートを緩衝液で洗浄した後、 酵素基質溶液を加え、 遮 光下、 室温で 3 0分間静置して反応させた。 この反応を塩酸で停止させた後、 吸 光度を測定した。 標準曲線用の MCP-1溶液の吸光度より標準曲線を作製し、 血漿 中の MCP- 1の濃度を求めた （EIAサンドィツチ法 （R&Dシステム社製））。
【0 1 1 8】 図 1に示すとおり、 DI0マウスでは対照群（C57BL/6N)と比較して MCP-1の血中濃度が著しく上昇していることが分かった。 なお、 ここで使用した DI0マウスと対照群との体重差を図 2に示す。
【0 1 1 9】 また、 DI0マウスにおける体重と MCP - 1の血中濃度との関係を図 3に示す。 図 3から明らかなように、 肥満モデルマウスにおいて、 MCP- 1の血中 濃度と体重とは一定の相関関係を有することが見出された。
【01 20】 実施例 5
(食事制限モデルマウスの白色脂肪細胞における MCP- 1の発現）
【01 21】 製造例 3で作製した食事制限モデルマウスを用い、 MCP- 1の発現 量を測定した。 ここで、 MCP- 1の発現量の測定は、 実施例 1と同様に実施した。 【01 22】 図 4にモデルマウスの食事制限の前後における体重変化を示す。 なお、図 4中、縦軸は、食事制限前の体重に対する食事制限後の体重を％で示す。 【01 23】 また、 図 5にモデルマウスの食事制限の前後における MCP- 1の発 現量を示す。 図 5から明らかなように、 食事制限により MCP-1の発現量が著しく 低下した。 なお、 図 5中、 縦軸は食事制限前の MCP - 1の発現量を 1とした場合の MCP-1の発現量を示す。
【01 24】 以上より、 体重の減少と MCP - 1の発現量との間には密接な相関関 係があることが明らかとなつた。
【01 25】 実施例 6
(食事制限モデルマウスにおける MCP- 1の血中濃度）
【01 26】 製造例 3で作製した食事制限モデルマウスを用レ、、 MCP-1の血中 濃度の測定を行った。また、 MCP- 1の血中濃度は実施例 4と同様にして測定した。 【01 27】 図 6から明らかなように、 食事制限の前後で MCP-1の血中濃度は 著しく減少した。 このことから、 体重の減少と血中の MCP-1濃度との間には密接 な相関関係があることが明らかとなった。
【01 28】 実施例 7〜 9
(肥満抑制作用を有する化合物投与による MCP-1の発現量及び血中濃度の変動） 【01 29】 DI0マウス（HFD)に W001/14376号公報記載の肥満抑制作用を有す る化合物 （化合物 1) を投与した後、 当該マウスの白色脂肪細胞における MCP-1 の発現量を測定した。 図 7に示すとおり、 DIO(HFD)マウスでは MCP- 1の発現は著 しく上昇したが、 肥満抑制作用を有する化合物を投与した場合には、 その発現は 有意に減少した（実施例 7 )。なお、図 7中、 R Dは普通食を与えたマウス（Re ular diet)を示し、 縦軸は mRNAの発現量を β— actinの発現量で補正した値を示す。 【0 1 3 0】 また、 DI0マウスに W001/14376号公報記載の肥満抑制作用を有す る化合物 （化合物 1 ) を投与した後、 MCP-1の血中濃度を測定した。 図 8に示す とおり、 DIO (MHF)マウスでは MCP-1の血中濃度は著しく上昇したが、 肥満抑制作 用を有する化合物を投与した場合には、 その血中濃度は有意に減少した （実施例 8 )。
【0 1 3 1】 さらに、 DI0マウスに前記化合物を投与後、 4日目に採血して MCP - 1 の血中濃度を測定し、 この血中濃度を体重で標準化した。 図 9より明らかなよう に、 4日目では体重は減少していないにもかかわらず、 MCP- 1の血中濃度は低下 した。 これは、 体重が減少するのに先だって MCP-1の血中濃度の低下が生じてい ることを示す （実施例 9 )。 なお、 前記化合物投与 4日目においては、 MCP- 1遺伝 子の発現は減少したが、 レプチン遺伝子の発現には変化はなかった。 このことよ り、 MCP-1は、 レブチンよりも先に体重変化に反応することが明らかとなった。 【0 1 3 2】 実施例 1 0
(フ口一サイトメ トリーによる CDllbの発現解析）
【0 1 3 3】 マクロファージの表面抗原である CDllbの数、 すなわち、 血中単 球が MCP-1の投与によりどのように変動するかを調べるため、 フローサイトメ ト リーによる解析を行った。
【0 1 3 4】 先ず、 MCP- 1をマウスの皮下に lOng/0. 5マイクロリツトル/時間 の割合でォスモティックポンプを用いて 2週間に渡って注入した。 次に、 コント ロールマウス （C57BL/6)、 DI0マウス及び MCP- 1処理したマウスそれぞれの尾静 脈から、へパリン処理したキヤビラリ一を用いて血液を採取した。血球細胞は 300 X gで 5分間遠心分離して採取した後、 室温で 1 5分間、 FITCラベルした抗マゥ ス CDllb抗体 （BD Biosciences社製） とインキュベートした。 また、 非特異的結 合のコントロールとして、 前記の試料は IgG2bアイソタイプともインキュベート した。 これらの細胞を PBSで洗浄した後、 赤血球を、 溶解バッファーを用いて、 室温で 5分間、 溶解した。 細胞を PBSで洗浄した後、 0. 5%ホルムアルデビド入り の PBSに懸濁した。 この懸濁液から単球を同定するため、 EPICS Elite Flow Cytometer (Beckman Coulter社製）を用いてフローサイトメ トリーを行った。 こ こで、 フローサイ トメ トリーによる解析は、全血球細胞中の単球/マクロファージ の集合を決定することにより行った。 また、 フローサイトメ トリーは、 蛍光と散 乱光を指標にし、 各試料につき 40， 000個の細胞を解析した。
【0 1 3 5】 フローサイトメ トリーの結果を図 1 0 (a)〜（f)に示す。 ここで、 図 1 0 (a)はコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、 図 1 0 (b)は DI0 マウス由来の血球細胞の結果を示す。また、図 1 0 (c)はコントロールマウス及び DI0マウスにおける CDllb陽性の単球数を示す。 一方、 図 1 0 (d)は saline投与 したコントロールマウス由来の血球細胞の結果を示し、図 1 0 (e)は MCP- 1投与し たマウス由来の血球細胞の結果を示す。 また、 図 1 0 (f)は saline投与コント口 ールマウス及び MCP- 1投与マウスにおける CDllb陽性の血球数を示す。図 1 0 (a)
〜（f)より、 DI0マウス及ぴ体外から MCP- 1を投与したマウスにおいて CDllb陽性 の血球数すなわちマク口ファージ数の増加が確認できた。ここで、 CDllb positive 単球の増加は、 単球の動脈硬化巣への走化を促進していると考えられる。 すなわ ち、 血管内皮から分泌された MCP - 1のみならず、 体外から投与した MCP-1によつ ても単球の走化が起きることが確認できた。
産業上の利用可能性
【0 1 3 6】 本発明の検查方法によれば、 分子レベルで肥満又は痩せの検査 · 予測が可能となり、 従来の診断方法と比較してより的確な診断が可能となる。 ま た、 本発明の化合物の評価方法によれば、 肥満又は痩せの治療薬や診断薬のスク リーニング等、 各種評価が可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . MCP-1遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定するこ とを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
2 . MCP-1タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルを測定す ることを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
3 . MCP-1遺伝子の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を検出 することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
4 . MCP-1タンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルの変化を 検出することを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
5 . 被検組織又は被検細胞における MCP-1遺 {云子に存在する多型を検出する ことを特徴とする肥満又は痩せの検査方法。
6 . MCP-1タンパク質と相互作用することにより MCP - 1遺伝子の発現量に影 響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することを特徴とする肥満又は痩 せの検查方法。
7 . MCP - 1タンパク質に対する抗体を有効成分として含むことを特徴とする 肥満又は痩せの検査薬。
8 . MCP-1タンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする肥満又は痩せの 検査キット。
9 . 被検化合物を、 被検動物又は被検細胞に、 投与又は接触させる工程と、 被検化合物が、 被検動物又は被検細胞中で MCP- 1遺伝子あるいは該遺伝子と機能 的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、 を含むことを 特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
1 0 . 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、 被検化合物が、 被検動物又は被検細胞中で MCP- 1タンパク質あるいは該タンパク 質と機能的に等価なタンパク質の発現レベルを調節するか否かを確認する工程、 を含むことを特徴とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
1 1 . 被検化合物を、 MCP - 1タンパク質に接触させる工程と、被検化合物が、 前記タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程、 を含むことを特徴 とする肥満又は痩せの治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
1 2 . 請求項 9〜 1 1のいずれか一項に記載の評価方法により、 肥満又は痩 せの治療又は予防に有効であると評価された化合物。
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