« Extrait lipidique de pulpe de fruits pauvres en lipides»
La présente invention a pour objet un extrait lipidique de pulpe de fruits pauvres en lipides, son utilisation comme médicament ou comme agent cosmétique, notamment pour restaurer la fonction barrière épidermique, les compositions le contenant, ainsi que son procédé de préparation.
Les fruits qui sont naturellement riches en lipides sont exploités en cosmétologie ou en pharmacologie. L'huile de Serenoa repens est utilisée dans des produits anti-séborrhéiques ou contre les alopécies pour ses activités inhibitrices de la 5 alpha réductase. FR2764804 décrit la préparation d'un extrait lipidique du fruit du Safoutier qui peut être utilisé pour les soins de la peau, des muqueuses et/ou des phanères.
Les noyaux de certains fruits ont également été valorisés en cosmétologie ou en pharmacologie en tant que source de lipides. FR2780277 décrit un procédé de préparation d'un extrait lipidique obtenu à partir de noyaux de fruits du mirabellier et son utilisation pour les soins de la peau, des lèvres, des muqueuses et/ou des phanères. FR 2553788 décrit un procédé de préparation d'un extrait lipidique obtenu à partir des amandes du fruit d'arganier et son utilisation pour restaurer l'élasticité et la souplesse des peaux sèches. En revanche, les fruits dont la pulpe est pauvre en lipides n'ont jusqu'à présent jamais suscité d'intérêt particulier en tant que source de lipides. En conséquence, ils n'ont jamais été exploités pour les lipides qu'ils contiennent.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par fruit pauvre en lipides, un fruit dont la pulpe contient moins de 10 % en poids de lipides. La teneur en lipides d'un fruit peut être déterminée en entraînant les lipides du fruit frais découpé en morceaux par extraction à l'hexane, puis en les pesant après évaporation du solvant.
Or, les inventeurs ont remarqué de façon très surprenante qu'à partir de la pulpe de fruits pauvres en lipides, on peut obtenir un extrait qui présente des propriétés très intéressantes, le rendant utilisable dans des compositions cosmétiques et/ ou pharmaceutiques.
La caractéristique de cet extrait de pulpe de fruit pauvre en lipides est
qu'il comprend moins de 10% en poids de triglycérides et de 5 à 50% en poids de lipides polaires. Cet extrait présente donc l'avantage de contenir peu de triglycérides et d'être en revanche très riche en lipides polaires. On définit les lipides polaires comme étant les lipides qui précipitent à l'acétone. Les extraits préparés à partir de fruits riches en lipides (tels que l'avocat, l'olive, la noix de coco, la noix du palmier Eloeis guineensis, le fruit du Serenoa repens ou du Safoutier) contiennent au contraire beaucoup de triglycérides et ne permettent pas d'extraire facilement les lipides polaires qui s'y trouvent en très faible proportion. De façon très surprenante, les inventeurs ont en outre découvert que cet extrait obtenu à partir de pulpe de fruit pauvre en lipides a pour propriété de restaurer la fonction barrière de la peau et peut ainsi être utilisé dans des compositions en tant qu'agent anti-inflammatoire ou en tant qu'agent pour protéger la peau des agressions physiques ou chimiques. Les lipides polaires présents dans l'extrait pourraient être responsables de cette activité particulière.
La présente invention a pour objet un extrait lipidique de pulpe de fruits, ladite pulpe contenant moins de 10% en poids de lipides et ledit extrait comprenant moins de 10% en poids de triglycérides et de 5 à 50% en poids de lipides polaires, de préférence 10 à 50% en poids de lipides polaires, les pourcentages étant exprimés par rapport à la matière sèche totale de l'extrait.
Avantageusement, les fruits pauvres en lipides à partir desquels est préparé l'extrait objet de la présente invention sont choisis parmi l'abricot, l'acérola (ou cerise des Antilles), l'airelle, l'ananas, l'aronia, la banane, le cassis, la cerise, le citron, la canneberge, l'églantine, la figue, la fraise, la framboise, la griotte, la groseille, le hibiscus, le kiwi, la mandarine, la mûre, la myrtille, l'orange, le pamplemousse, le fruit de la Passion, la papaye, la pêche, la poire, la pomme, la prune, la prunelle, le raisin, le fruit du sorbier ou du sureau, ainsi que leurs mélanges.
On entend par mélange, le mélange d'au moins deux fruits. Les agrumes (nom collectif des aurantiacées cultivées) tels que le citron, la mandarine, l'orange et le pamplemousse, ou les baies telles que l'airelle, l'aronia, le cassis, la canneberge, l'églantine, la framboise, la groseille, la mûre,
la myrtille, le raisin, le fruit du sorbier ou du sureau, sont les fruits préférés à partir desquels l'extrait objet de la présent invention est préparé.
De façon encore plus préférée, les fruits extraits sont choisis parmi le citron, l'églantine, la framboise, la griotte, la groseille, la mandarine, la myrtille, l'orange, ainsi que leurs mélanges.
La partie constituée de lipides polaires comprend des phospholipides, des stérols, des glycostérols, des ceramides, des cérébrosides et des glycolipides.
Avantageusement, les phospholipides représentent 0,5 à 30 % en poids par rapport la matière sèche totale de l'extrait, de préférence 10 à 30% en poids.
Avantageusement, les phospholipides comprennent des phosphoéthanolamines, des phosphatidylinositol, des lysophosphatidyléthanolamines, des acides phosphatidiques, des phosphatidylcholine et des lysophosphatidylcholines.
Avantageusement, les ceramides représentent 0,1 à 10 % en poids par rapport la matière sèche totale de l'extrait, de préférence 1 à 10% en poids.
La détermination de la teneur en lipides polaires est réalisée par la méthode Folch. Les dosages en ceramides peuvent être réalisés par Chromatographie Liquide Haute Performance. Les dosages en phospholipides peuvent être dosés par l'intermédiaire du dosage du phosphore par absorption atomique (référence IUPAC 2.423). Les triglycérides peuvent être évalués à partir de la détermination de l'insaponifiable (méthode Pharmacopée Européenne 4ème Edition, 2-5-7). La présente invention a également pour objet le procédé de préparation de l'extrait comprenant les étapes consistant à:
- séparer la pulpe de fruit de ses graines ou de son noyau,
- sécher la pulpe de fruit ainsi obtenue de façon à obtenir une teneur en eau inférieure à environ 10 % en poids, - effectuer l'extraction de la pulpe séchée au moyen d'un solvant de polarité intermédiaire, avec un rapport massique solvant/pulpe séchée compris entre environ 4/1 et environ 20/1 , et à une température comprise
entre la température ambiante et la température d'ébullition,
- effectuer une séparation liquide/solide de façon à recueillir une solution d'extraction,
- évaporer le solvant de ladite solution d'extraction pour obtenir ledit extrait.
Ainsi, selon la procédé objet de la présente invention, les fruits sont d'abord débarrassés de leur noyau ou de leur graine, puis la pulpe ainsi obtenue est séchée.
La pulpe de fruit est séchée de façon à obtenir une teneur en eau inférieure à environ 10 % en poids, de préférence inférieure à 5 % en poids. Plus la teneur en eau est faible, meilleur est le rendement d'extraction des lipides polaires.
Avantageusement, le séchage de la pulpe est effectué par lyophilisation, atomisation ou sur rouleaux de façon à obtenir une poudre ou des flocons de fruits. Le séchage peut également être effectué sur des supports tel que le lactose ou la maltodextrine.
Une fois séchée, la pulpe de fruit est extraite avec des solvants de polarité intermédiaire avec un rapport massique solvant/pulpe compris entre environ 4/1 et 20/1 et à une température comprise entre la température ambiante et la température d'ébullition.
Dans l'échelle de polarité, les solvants de polarité intermédiaire se situent entre le méthanol et l'acétate d'éthyle. Avantageusement, le solvant de polarité intermédiaire est choisi parmi un alcool comprenant 1 à 4 atomes de carbone, une cétone, un mélange eau/alcool comprenant 1 à 4 atomes de carbone et un mélange eau/cétone. De préférence, le solvant choisi est un alcool tel que l'éthanol ou l'isopropanol.
Avantageusement, l'extraction est faite sous agitation ou de façon statique pendant une durée comprise entre 1 et 24 h environ.
Une fois l'extraction réalisée, on effectue une séparation solide/liquide de façon à recueillir une solution d'extraction. Les étapes d'extraction et de séparation peuvent être effectuées plusieurs fois de suite, de préférence 2 fois, et les solutions d'extraction ainsi obtenues sont ensuite réunies.
Les étapes d'extraction et de séparation peuvent être réalisées en une seule étape comme lors d'une lixiviation.
On évapore ensuite le solvant de ladite solution d'extraction ainsi obtenue pour obtenir un extrait lipidique. Avantageusement, le solvant de ladite solution d'extraction est évaporé, complètement ou partiellement, sous pression réduite et à température d'ébullition du solvant sous cette pression.
Dans le cas d'une évaporation complète, on obtient un extrait lipidique sec. Dans le cas d'une évaporation partielle, on obtient un extrait lipidique pâteux ou liquide contenant 0,1 % à 20 % en poids de matière sèche.
La présente invention a également pour objet les compositions comprenant l'extrait. De préférence, ces compositions sont cosmétiques ou pharmaceutiques et à usage topique.
Avantageusement, les compositions selon la présente invention contiennent 0,0001 à 1 % en poids de matière sèche de l'extrait lipidique.
L'extrait sec, pâteux ou liquide peut être solubilisé dans un solvant cosmétiquement et ou pharmaceutiquement acceptable, en particulier une huile, le butylène glycol ou le propylène glycol.
L'extrait peut aussi être présent dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention sous forme de liposomes. De manière avantageuse, ces liposomes se forment spontanément en solution aqueuse lorsqu'on ajoute de l'eau pendant ou avant l'évaporation complète du solvant de la solution d'extraction du procédé objet de la présente invention.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de l'extrait comme médicament ou comme agent cosmétique, notamment pour restaurer la fonction barrière épidermique. En particulier, cet extrait peut être utilisé en tant qu'agent anti-inflammatoire ou comme agent pour protéger la peau d'agressions physiques ou chimiques.
La peau constitue l'organe le plus exposé aux agressions environnementales. La complexité structurale du tissu cutané lui confère diverses fonctions : l'hypoderme joue un rôle d'isolant thermique, le derme contribue à la résistance et l'élasticité, tandis que l'épithélium de revêtement,
pavimenteux stratifié et cornifié, est responsable de l'étanchéité donc de la fonction barrière. Le Stratum cornéum, partie la plus superficielle de l'épiderme, est constitué de cellules non vivantes, remplissant des fonctions de protection, de régulation de la différentiation et multiplication des kératinocytes. En conséquence il joue un rôle primordial dans le contrôle de l'homéostasie cutanée. En effet, la couche cornée empêche les déperditions hydriques et s'oppose aux agressions physiques et chimiques ainsi qu'à la pénétration des micro-organismes.
Lors d'une perturbation aiguë ou subaiguë de la peau par des tensioactifs, des solvants organiques ou une altération mécanique, une phase de récupération de la barrière de plusieurs heures se met en place. La cinétique de réparation, variable d'un sujet à l'autre, est fonction de l'âge du sujet, de l'intensité et de l'étendue de la lésion. Cette récupération est en relation directe avec une série de réponses métaboliques incluant les biosynthèses lipidiques protéiques et nucléiques. Ces diverses réponses métaboliques sont mises en place suite à des signaux biologiques qui accompagnent la rupture de la fonction barrière. Parmi la cascade d'événements moléculaires et cellulaires intervenant lors d'une altération du stratum cornéum, est relevée une augmentation des cytokines keratinocytaires, telles IL1σ et des molécules d'adhésion inter keratinocytaires tel ICAMi (Intra Cellular Adhésion Molecule-1) au niveau des compartiments épidermiques et dermiques du système cutané (Nickoloff BJ, Naidu Y, Perturbation of epidermal barrier function correlates with initiation of cytokine cascade in human skin. J. Am Acad Dermatol. 1994 Apr; 30 (4): 535-546 - Elias PM, Wood LC, Feingold KR. Epidermal pathogenesis of inflammatory dermatoses. AM. Contact Dermat, 1999 Sept ; 10 (3) : 119-126 - Elias PM, Feingold KR,. Coordinate régulation of Epidermal Différentiation and barrier Homeostasis. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 2001 ; 14 (suppl 1 ) : 28- 34).
Ces événements moléculaires mis en place lors d'un stress physique et/ou chimique du stratum cornéum précèdent tout mouvement de cellules inflammatoires de la circulation vers le derme et l'épiderme, induisant ainsi un foyer inflammatoire cutané. La couche cornée de l'épiderme est donc un
biocapteur régulateur de l'homéostasie cutanée, suite à des stress exogènes Des tests qui sont développés plus loin dans la description ont mis en évidence la restauration de la fonction barrière par application topique d'un extrait lipidique de fruits selon la présente invention prévenant ainsi la mise en place des marqueurs inflammatoires ICAM et IL1 , suite à une agression chimique inductrice des perturbations métaboliques cellulaires.
Exemples de procédé de préparation d'un extrait lipidique de fruit pauyre en lipides:
Exemple 1
100 kg de flocons de framboises séchés sont extraits par 700 I d'isopropanol à reflux pendant 2 h et sous agitation. Après retour à température ambiante, on sépare les fruits extraits de la solution d'extraction par filtration. La solution recueillie est concentrée. On détermine la matière sèche. Puis on rajoute une quantité d'eau 50 fois supérieure à la matière sèche. On reconcentre ensuite jusqu'à obtenir une solution aqueuse liposomée dont la matière sèche est de 5 % en poids. L'extrait obtenu est analysé en chromatographie sur couche mince afin d'identifier les molécules présentes. Ainsi, on identifie des phospholipides, ceramides, cérébrosides, stérols, glycolsystérols et glycolipides. On procède également au dosage des phospholipides, des ceramides et des triglycérides. La quantité de lipides polaires totaux est de 45 % en poids par rapport à la matière sèche totale. La teneur totale en phospholipides est de 25 % en poids par rapport à la matière sèche totale. La teneur totale en ceramides de 3,5 % en poids par rapport à la matière sèche totale. La teneur en triglycérides est de 5 % en poids par rapport à la matière sèche totale.
Exemple 2 500 kg d'un mélange de groseilles, framboises et myrtilles séchées (1/3,
1/3, 1/3) est extrait avec 5 tonnes d'éthanol à 50°C pendant 5 heures sous agitation à température ambiante. On sépare par filtration les résidus
d'extraction de la solution. Cette dernière est totalement évaporée, jusqu'à l'obtention d'un extrait pâteux.
L'analyse chromatographique sur couche mince permet d'identifier les molécules suivantes : phospholipides, ceramides, cérébrosides, stérols, glycostérols et glycolipides. La teneur en lipides polaires totaux est de 15 % en poids par rapport à la matière sèche totale. Les phospholipides totaux sont dosés à 11 % en poids par rapport à la matière sèche totale et les ceramides à 2 % en poids par rapport à la matière sèche totale. La teneur en triglycérides est de 10 % en poids par rapport à la matière sèche totale.
Exemple 3
10 kg d'un mélange de citron, mandarine et orange séchés (1/3, 1/3, 1/3) sont extraits par 200 kg d'isopropanol à température ambiante statistiquement par lixiviation. La solution obtenue est concentrée jusqu'à 2 kg. On détermine la teneur en matière sèche du concentrât et on ajoute une quantité de butylène glycol 50 fois supérieure à la matière sèche. Le reste de solvant volatil est évaporé. On obtient donc un extrait de butylène glycol contenant 2 % en poids de matière sèche. Les molécules présentes dans l'extrait sont contrôlées par chromatographie sur couche mince. On identifie des phospholipides, des ceramides, des cérébrosides, des stérols, des glycosylstérols et des glycolipides.
Les lipides polaires sont déterminés à 20 % en poids par rapport au poids de matière sèche totale, les phospholipides à 16 % en poids par rapport à la matière sèche totale et les ceramides à 1 ,5 % en poids par rapport à la matière sèche totale. La teneur en triglycérides est de 10 % en poids par rapport à la matière sèche totale.
Evaluation de la restauration de la fonction barrière épidermique par application topique d'un extrait lipidique de fruit pauyre en lipides. Les tests sont effectués sur explant cutané provenant de plasties mammaires maintenues en survie dans un milieu adéquat.
Les tests sont effectués sur un explant cutané sentant de témoin absolu,
sur un explant délipidé par un mélange éther/acétone puis stressé par un stress chimique induit par application topique d'une solution de lauryl sulfate ou SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) et sur une peau délipidée, traitée par l'extrait de fruits préparé selon l'exemple 1 , à raison de 500 μg/ml et traitée par un agent de stress chimique.
Le protocole de test est décrit par Williams ML, Elias PM, From besket weave to barrier. Arch Dermatol 1993 ; 129 : 626-629.
Des prélèvements d'expiants cutanés ayant subi ces préparations sont réalisés afin d'étudier les divers paramètres proposés : - Contrôle de la viabilité et de l'activité métabolique des cellules à l'aide de test MTT (réf. Mosmann Tim. 1993 - Journal of immunological methods 65: 55-63).
- Détection d'un signal cytosoluble inflammatoire : immunomarquage de la protéine ICAMi.
- Détection d'un signal membranaire inflammatoire : quel que soit le marqueur à révéler, le principe de la technique d'immunomarquage est le même, on utilise un kit spécial immunomarquage.
Sur des cryocoupes fixées à l'acétone, les sites aspécifiques sont saturés à l'aide d'une solution de BSA à 3%.
L'anticorps primaire reconnaissant la protéine à identifier est appliqué sur la coupe, les échantillons sont ensuite rincés à l'aide du tampon phosphate (PBS).
L'anticorps secondaire biomarqué dirigé contre l'espèce ayant produit la protéine d'intérêt, est alors appliqué. Les coupes sont à nouveau rincées au PBS et mises en contact avec la streptavidine peroxydase protéine couplée à un marqueur enzymatique.
Cette enzyme est alors visualisée par un substrat chromogène spécifique la DAB. Les coupes sont ensuite montées au Gel/Mount et observées 24 h après en lumière blanche.
L'observation au microscope optique droit en lumière blanche et au confocal conduit aux résultats suivants.
Evaluation de la viabilité des explants après métabolisation du MTT.
Le témoin absolu entraîne une forte métabolisation du MTT, se traduisant par la présence de cristaux de formazan bleu-poupre au niveau de l'épiderme et dans le derme. L'agression chimique par le SDS, induit sur le témoin délipidé une diminution de la métabolisation du MTT au niveau de l'épiderme.
Pour l'expiant traité avec les lipides de fruits nous observons une métabolisation du MTT plus intense et plus dense que celle relevée au niveau du témoin délipidé stressé qui mettait en évidence une altération de la barrière. Le retour à la normale par le traitement aux lipides de fruit traduit une protection et une reconstitution de la barrière cutanée par ces mêmes lipides de fruit.
Etude de l'expression de l'IL1 or cytokine inflammatoire
Le témoin absolu met en évidence une expression d'ILIσ sur la totalité de l'épiderme avec un marquage plus soutenu au niveau de la couche basale. Comparé au témoin absolu le témoin délipidé stressé présente une surexpression d'IL1 a au niveau des kératinocytes basaux et suprabasaux.
Par le traitement aux lipides de fruits, l'intensité de marquage est très discrète et au niveau de certaines zones de l'assise basale le marquage est moins soutenu que celui relevé chez le témoin absolu.
Etude de l'expression de la protéine ICA i
Le témoin absolu présente un marquage essentiellement localisé au niveau des cellules du derme supérieur proche de la jonction dermo épidermique.
L'agression chimique induit sur le témoin délipidé une surexpression d'ICAMi au niveau des kératinocytes basaux et des cellules dermiques : cellules endothéliales, cellules dendritiques dermiques, macrophages, etc..
En ce qui concerne la peau traitée par les lipides de fruits nous observons une localisation et un marquage identique à ceux relevés chez le témoin absolu.
Tableau de résultats des immunomarquages
L'interruption de la fonction barrière par délipidation superficielle de l'expiant cutané à l'aide d'un solvant organique a favorisé l'induction d'événements moléculaires et cellulaires pro inflammatoires suite au stress chimique exogène : en effet, la cytokine epidermique IL1σ pro inflammatoires et la molécule d'adhésion intercellulaire ICAMi sont surexprimées lors d'une fonction barrière détériorée. L'activité métabolique nécessaire à la restauration de la fonction barrière se trouve très diminuée, suite au stress chimique. L'application d'un extrait lipidique de fruits selon la présente invention a contribué à restaurer la fonction barrière inhibant l'effet pro inflammatoire et l'altération métabolique tissulaire induite par un stress chimique ou mécanique : l'homéostasie cutanée est ainsi retrouvée grâce à l'application topique de l'extrait lipidique de fruits selon la présente invention.
Evaluation de l'effet d'un extrait lipidique de fruit pauyre en lipides sur le métabolisme énergétique de la peau
Cette étude a pour objectif d'évaluer l'efficacité dynamisante d'un extrait lipidique de fruit préparé selon l'exemple 1 par spectroscopie de résonance magnétique du phosphore 31 (SRM31P).
L'étude fut réalisée sur un groupe de 15 femmes présentant une peau déshydratée. L'extrait lipidique de fruit a été appliqué deux fois par jour pendant 28 jours, son activité a été comparée à une partie de la peau non traitée. Les résultats obtenus aux différents temps ont été comparés à ceux obtenus à T0 (zone traitée/zone témoin).
Les variations du métabolisme énergétique de la peau ont été déterminées par spectroscopie de résonance magnétique du Phosphore 31 grâce à la mesure des concentrations relatives des principaux métabolites phosphorylés de la peau : Phosphate Inorganique (Pi), Phosphocréatine (Pcr), Adénosine Tri-phosphate (ATP).
Les acquisitions spectroscopiques ont été réalisées avec un spectromètre imageur RMN équipé d'une antenne de surface double accord Proton-Phospore développée pour la spectroscopie de résonance magnétique in vivo de la peau. Aucune augmentation significative n'est observée 4 heures ou 7 heures après l'application, de l'extrait lipidique de fruit.
En revanche, après 28 jours d'application de l'extrait lipidique de fruit, une augmentation des rapports Pcr/Pi de + 8 %, ATP/Pi de + 8,5 % et Pcr/P total de + 3,1 % ainsi que de l'indice de phosphorylation de + 1 ,5 % a été mise en évidence de façon significative.
Les molécules d'ATP procurent l'énergie nécessaire aux cellules et tissus. La phosphocréatine est une molécule qui constitue une réserve d'énergie immédiatement disponible, chargée de reconstituer les réserves d'ATP consommées lors d'une période d'ischémie cellulaire en fournissant un groupement phosphate aux molécules d'ADP.
Les résultats obtenus après traitement par l'extrait lipidique de fruit indiquent que l'augmentation significative du rapport Pcr/Pi (+ 8 %) après 28 jours d'application est principalement due à une augmentation de la phosphocréatine puisque le rapport Pcr/Ptotal augmente également de façon significative (+ 3,1 %).
De plus, pour le rapport Pcr/Pi, on observe une différence significative après 28 jours de traitement entre les bras traités et les bras témoins.
Les résultats indiquent une augmentation du taux d'ATP qui est mise en évidence par l'augmentation significative à T + 28 jours du rapport ATP/Pi (+8,5 %).
De plus, l'augmentation du pool d'ATP est confirmée par l'augmentation significative de l'indice de phosphorylation (+ 1 ,5 %) qui est un reflet de l'état du
métabolisme énergétique.
Cette étude par SRM Λ3°1'IP met donc en évidence une amélioration du statut énergétique de la peau après un traitement par l'extrait lipidique de fruit. Cet effet peut être attribué au produit puisque aucune variation significative n'a été observée, sur l'avant-bras témoin, durant toute la durée de l'étude.
Exemples des compositions contenant un extrait lipidique de fruit pauyre en lipides
Les compositions suivantes ont été réalisées à partir le l'extrait lipidique de fruit obtenu selon l'exemple 1.
Soin osmo-actif (E/S)
Gelée
Soin de nuit
Crème d'hydratation