WO2004089412A1

WO2004089412A1 - 特異的ｎａｄ(ｐ)ｈオキシダーゼ抑制剤

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Publication number: WO2004089412A1
Application number: PCT/JP2004/005065
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Yamamoto; Kumi Yamada
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2004-10-21
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Abstract

　白血球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織のＮＡＤ(Ｐ)Ｈオキシダーゼ作用を阻害する化合物を含有するＮＡＤ(Ｐ)Ｈオキシダーゼの過剰作用の抑制剤及びそれを含む医薬組成物。

Description

明細書

特異的 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ抑制剤技術分野

本発明は、 N A D ( P ) Hォキシダーゼ（ Nicotinamide adenine dinucleot ide (phosphate) oxidase の過剰発 ί¾又は活性化の抑制剤に関するものである。より詳細には、白血球の N A D P Hォキシダーゼには作用せず、かつ白血球以外の組織において過剰発現又は活性化した N A D ( P ) Hォキシダーゼに対する抑制作用を示す化合物を有効成分とする N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰作用の抑制剤に関するものである。背景技術

高脂血症、高血圧、糖尿病、肥満、加齢、喫煙等のリスクファクタ一により、虚血性心疾患（心筋梗塞又は狭心症等）、脳卒中（脳梗塞、脳出血又はくも膜下出血等）、動脈硬化や末梢循環障害（末梢動脈閉塞症等）等が発症したり、症状が増悪したりすることが知られており、これらの発症や症状増悪に関して、近年、スーパーォキシドア二オン（ · O ₂ - ) 等の活性酸素により生ずる酸化ストレスの重要性がクローズァップされている。また、酸化ストレスが、ガン増殖（Gene. 2001 269 ( 1 -2) , 131 )、アルツハイマー病の増悪（ Biochem. Biop ys. Res. Commun.2000, 273 ( 1 ) , 5 ) 、抗ガン剤による副作用 (Toxicology. 1999 May 3； 134(1)： 51-62) , さらに狭心症患者の硝酸製剤治療による薬剤耐性（ J . Cl inical Investigat ion, 1994, 187- 194) に関与することも報告されている。

従来、スーパ一ォキシドア二オン等の活性酸素の産生源は、 ' 白血球が主体であると考えられてきた。しかし、近年、血管細胞系や心筋細胞等の様々な細胞種においてもスーパ一ォキシドア二オンの産生が確認され、これらのスーパーォキシドァニオン産生酵素である N A D (P ) Hォキシダーゼが注目されている（ Ci rc- Res.2000.86， 494- 501 )。ところで、白血球に存在する N A D P Hォキシダーゼと血管細胞系や心筋細胞等の組織に存在する N A D ( P ) Hォキシダーゼとは、酵素活性や活性調節機構に差異があるため、それぞれの N A D ( P ) H ォキシダーゼは同一ではないと考えられている ( Cardiovascular Research, 1998， 38, 256 - 262)。

N A D ( P ) Hォキシダーゼ活性を阻害する化合物として、これまで ίこ Diphenyleneiodonium (以下「 D P I 」と記す。

Bi ochem. Bi ophys. Res . Commun.1998, 253, 295 参照）、 apocynin (国際公開第 0 1 Z 8 9 5 1 7 号パンフレット）、及ぴ S 1 7 8 3 4 ( Arterioscler-Thromb -Vase -Biol. , 2001 , 21 : 1577) 等が報告されている。しかしながら、これらの化合物は白血球に存在する N A D Ρ Ηォキシダーゼのみならず、白血球以外の組織に存在する N A D ( P ) Hォキシダーゼにも作用するものであり、組織特異性を示さない。

白血球の N A D P Hォキシダ一ゼの遺伝的欠損症である慢性肉芽種症 ( Chronic granulmatous disease) の患者では、白血球のスーパーォキシドア二オン産生能が低下しており、免疫力の低下を起こすことが知られている (J. Leuko Biol.2001， 69, 191)。したがって、上述した非特異的 N A D (P ) Hォキシダ一ゼの阻害剤を医薬として用いる際には、免疫機能の低下等に基づく副作用が生じることがある。発明の開示

本発明は、 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用がリスクファクターである疾患を予防し、又は症状を軽減する医薬を提供することを課題とする。

本発明者らは鋭意研究した結果、白血球の N A D P Hォキシダ一ゼには抑制作用を示さず、白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダーゼに特異的に作用する N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰作用の抑制剤により、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は、白血球の N A D P Hォキシダーゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダーゼ作用を抑制する化合物を含有する N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰作用の抑制剤、及びそれを有効成分とする N A D (P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用に起因する疾病用の医薬組成物に存する。図面の簡単な説明

第 1 図は、 A c h による内皮依存性弛緩反応に対する化合物の効果を示した図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書において、白血球以外の組織としては、例えば、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜及びミクログリア等、並びに腫瘍細胞などが挙げられる。

血管細胞系としては、例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞及び泡沫化マクロファージ等が挙げられる。

N A D (P ) Hォキシダ一ゼは、 N A D H ( Nicotinamide adenine dinucleotide) や N A D P H (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) を基質としてスーパーォキシドア二オンを産生する全ての酵素を意味する。 N A D (P ) Hォキシダーゼの過剰作用とは、 N A D (P ) H ォキシダ一ゼの過剰発現又は活性化に基づく作用を意味し > 例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、喫煙、心不全、心肥大、虚血性心疾患、血管再開通療法、臓器移植術の虚血再灌流、ガン、痴呆症、又は化学物質（例えば、抗ガン剤、硝酸製剤等）の摂取などのリスクファクタ一により惹起される作用が挙げられる。

ここで、 N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰発現とは、生体の恒常性（ホメォス夕シス）にとつて必要な量を超えた発現であり、同一起源の正常組織にとって必要な量を超えた発現を意味する。 N A D (P ) Hォキシダ一ゼの発現部位としては、例えば、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜、ミクログリア及び腫瘍細胞等の組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。すなわち、過剰発現した N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの阻害作用とは、過剰発現している N A D ( P ) Hォキシダ —ゼに対し、その酵素機能を発揮することができないようにする作用をいう。

また、 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの活性化とは、 N A D (P ) Hォキシダーゼを構成する各サブユニットのうち、 p 4 7 ^p ^h。 X、 p 4 0 ^{p h}。 x又は p 6 7 ^{p h}。 ^x等が細胞膜上にトランスロケーションされ、スーパーォキシドア二オン産生機能を発揮しうる状態にある N A D (P ) Hォキシダーゼを意味する。すなわち、活性化した N A D ( P ) Hォキシダーゼの抑制作用とは、酵素機能を発生し得る状態の N A D (P ) Hォキシダーゼに対し、その酵素機能を抑制する作用を意味し、 N A D ( P ) Hォキシダーゼを構成する各サブュニットのトランスロケ一ション又は Z及び各構成サブュニット間の相互作用を抑制することをいう。

N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剩作用に起因する疾病としては、例えば、虚血性心疾患、心不全、糖尿病性合併症、動脈硬化症、血管再開通療法後の再狭窄若しくは再閉塞、臓器移植後の障害、脳卒中、硝酸製剤耐性、抗ガン剤の副作用、痴呆症、又はガンの進展等が挙げられる。

白血球の N A D P Hォキシダーゼ作用を実質的に抑制せずかつ白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ作用を阻害する化合物としては、例えば、下記一般式 ( I ) 〜 ( V I I I ) で表される二環式ピリダジン化合物が挙げられる。

一般式（ I )

{式中、 Aは C ₃ - Cし ₆ « アルキル、 C , 〜 C ₇ シクロアルキル又はそれぞれが C ！〜 C アルキル、 C C アルコキシ若しくはハロゲンから選ばれる 1 以上の置換基を有していてもよいフエニル、チェニル、フリル、チアゾリル、フエノキシ、 c ₇ 〜 c ₉ フエニルアルキル、フエ二ルチオ、含窒素飽和環基、ピリジル若しくはイミダゾリルを表す。

Bは、 — N H— D

〔 Dは

(式中、 R ¹ は水素又は C , 〜 C ₄ アルキルを表す。 Xはハロゲン、 C ！〜 C ₄ アルキル又は C ！〜 C ₄ アルコキシを表す。 k は 0 〜 3 の整数を表し、 kが 2 以上の整数のとき、複数の Xはそれぞれ異なっていてもよい。） TJP2004/005065

6

(式中 R ² は水素又は C C , アルキルを表す Yは C

C アルキル又は C ！ ~ C ₄ アルコキシを表す mは 0

〜 6 の整数を表す。 mが 2 以上のとき、複数の Yはそれぞれ異なっていてもよく、任意の 2 つの Yが連結して分岐していアルキレンを形成してもよい。）

(式中、環 Hは C ₅ 〜 C ₇ シクロアルキルを表す。 Y及び m は前記と同義である。）

- C H R ³ R ⁴

(式中、 R ³ は〜 C ₅ アルキルを表す R は C C ₈ シクロアルキル又はチェニルを表す。）

又は C c _R アルキルを表す。〕

又は

(式中、 Z は C 〜 C ₄ アルキル又はフエニルを表す。 nは 0〜 2 の整数を表し、 nが 2 のときこれらの Z は異なっていてもよい。）

を表し、

Qはベンゼン環、フラン環又はじェ〜 C ₄ アルキルで置換されていてもよいチォフェン環を表す。 }

一般式 ( I ) で表される化合物は、例えば、特許第 2 7 3 0 4 2 1 号明細書に記載された方法に準じて製造することができる。一般式（ II)

[式中、 R ⁵ 及ぴ R ⁶ は、それぞれ独立して水素、 C ！ C

₆ アルキル、 C ！〜 C ₆ アルコキシ、ハロゲン、シァノ、二トロ、アミノ、トリフルォロメチル又はカルボキシルを表す。

X ' は _ C 〇〇 R ⁷ ( R ⁷ は水素又は置換されていてもよい C ！〜 C ₆ アルキルを表す。）、一 C 〇 N H ₂、 - C N、一 C 〇 R ⁸ ( R ⁸ は置換されていてもよい〜 C ₆ アルキル又は置換されていてもよいァリールを表す。）、一 N H ₂、一 N〇 ₂ 又は一 O R ⁷ ( R ⁷ は前記と同義である。）を表す。] 一般式（ II) で表される化合物は、例えば、 J. Ch em. S 0 c . Chem. Commun. , 1974, 752 ； Synthesis 1983, 52 ；欧州特許公開第 1 9 7 2 2 6 号明細書；米国特許第 4 7 2 9 7 8 2号明細書；国際公開第 9 3 / 0 9 0 9 8 号、°ンフレツ卜等に記載された方法に準じて製造することができる。一般式（ III)

(式中、 R ⁹ 、 R ^{1 Q}はそれぞれ独立して水素、 C _x 〜 C ₆ ァルキル、 C ェ〜 C ₆ アルコキシ、ノ、ロゲン、シァノ、ニトロ、ァミノ、トリフルォロメチル又は力ルポキシルを表す。）、一般式（ III) で表される化合物は、例えば、 Tetrahedr on Lett. , 37, 1996 , 24, 4145 等に記載された方法に準じて製造することができる。一般式 ( IV) 及び ( V )

(IV) (V)

[式中、 R ^{1 1}及び R ^{1 2}は、それぞれ独立して水素、〜 C ₆ アルキル、 C 丄〜 C ₆ アルコキシ、ノヽロゲン、シァノ、ニトロ、ァミノ、トリフルォロメチル又はカルボキシルを表す。 X，，は一 O R ^{1 3} ( R ^{1 3}は水素、〜 C ₆ アルキル又はァリ一ルを表す。）又は一 N R ^{1 4} R ^{1 5} ( R ^{1 4}及び R ^{1 5}は、それぞれ独立して、水素、 C ！〜 C ₆ アルキル又はァリールを表す。）]

一般式（ IV) で表される化合物は、例えば、 Heterocycles (1981 ), 16 ( 1 ) , 25-30 等に記載された方法に準じて製造することができる。

一般式 ( V ) で表されるィ匕合物は、 Shenyang Yaoke Daxue Xuebao (2001) , 18 (2) , 106-109 ； Chem. Pharm. Bul l. (1980) , 28 (9) , 2763-9 ； Heterocycles (1981) , 16 (1)， 25- 30等の文献に記載された方法に準じて合成することができる。一般式 (VI), (VII), (VIII)

(VII)

(式中、 R ^{1 6}及び R ^{1 7}は、それぞれ独立して、水素、 C

C アルキル、アルコキシ、ハロゲン、シァノ、ニトロァミノ、トリフルォロメチル又は力ルポキシルを表す。 R ¹ ⁸及び R ^{1 9}は、それぞれ独立して、水素又は C ェ〜 C ₆ アルキルを表す。 Y ' は酸素又は硫黄を表す。）

一般式（ V I ) で表される化合物は、例えば、特開 2 0 0 1 一 3 3 5 4 7 6 号公報等に記載された方法に準じて製造することができる。

一般式（VII) で表される化合物は、例えば、 Tetrahedron Lett. ( 1986), 27 (7) , 869-872 等に記された方法に準じて製造することができる。

一般式（VIII) で表される化合物は、例えば、 Pharmazie, 46, 2, 1991， 105-8等に記載された方法に準じて製造することができる。

これらのうち、一般式（ 1 )、 ( II) 又は（VIII) で表される二環式ピリダジン化合物、特にペリ位に置換基を有していてもよいフエニル基が結合し、かつその p位に窒素原子又は酸素原子が結合した二環式ピリダジン化合物が好ましい。

一般式（ I ) 〜（VIII) で表される化合物の薬理学上許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸.、リン酸等の鉱酸塩；メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等のスルホン酸塩；酢酸、シユウ酸、クェン酸、リンゴ酸、フマル酸塩等のカルボン酸塩などの酸付加塩：ナトリウム、カリウム、マグネシウム等の金属塩；アンモニゥム塩；エタノールァミン、 2 —アミノー 2 ーメチルー 1 一プロパノール等の有機アミン塩などの塩基付加塩を用いることができる。

本発明に係る N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用の抑制剤 (以下「 N A D ( P ) Hォキシダーゼ抑制剤」と記すことがある。）は、白血球の N A D P Hォキシダ一ゼ及ぴ白血球以外の正常な状態の N A D ( P ) Hォキシダ一ゼには作用しないので、 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用に起因する疾患、例えば、虚血性心疾患、動脈硬化性疾患、脳卒中、糖尿病性合併症等の又は症状の軽減、特に免疫機能が低下している前記疾患の予防又は症状の軽減に極めて有効である。

本発明に係る N A D ( P ) Hォキシダーゼ抑制剤を含む医薬組成物は、白血球の N A D P Hォキシダ一ゼ作用を実質的に抑制せず、かつ白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ作用を抑制する化合物と慣用の製剤担体とを、適当な比率で混合した後、常法により処理することにより調製することができる。また、剤形は、投与方法に応じて、適宜、選択すればよく、例えば、経口投与用製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤及びエリキシル剤等が挙げられ、非経口用製剤としては、注射剤、貼付剤及び坐剤等が挙げられる。

また、本発明に係る医薬組成物は、種々のリスクファクタ —により惹起される疾患を予防し、又は症状を軽減するので、脂質低下剤、降圧剤、血糖低下剤、血管拡張剤、抗血小板剤、抗凝固剤、脳保護薬、抗ガン剤、利尿剤、強心薬、鎮痛薬、抗浮腫薬、血栓溶解剤、免疫抑制剤、ステロイド、ビタミン剤又は抗酸化剤と、同時に若しくは別々に、又は逐次的に投与する形態で用いることができる。本発明に係る医薬組成物中に含まれる N A D (P ) Hォキシダ一ゼ抑制剤は、患者の年齢や状態などの条件に応じて、適宜、定めればよい。一般的には、成人に対して 0 . 0 0 1〜 l O O m g Z k g程度を非経口的に投与するか、 0 . 0 0 1

〜 1 0 O m g / k g程度を経口的に投与する量を含むのが好ましい。実施例

以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。

以下の各試験に使用した化合物の構造式を以下に示す。なお、化合物 A及び化合物 Bは一般式（ I ) で表される化合物又はその塩、化合物 C〜化合物 Gは一般式（ II) で表される化合物、化合物 Hは一般式（VIII) で表される化合物である。

試験例 1 N A D ( P ) Hォキシダーゼ抑制作用

(方法）

ヒ卜臍帯静脈内皮細胞 (Human Umbi 1 ical Vein Endothel ial Cel Is ： Bio i t taker 社。以下「 H U V E C」と記す。）に 4 4 mMグルコースを添加し、 8 日間培養した。次いで、界面活性剤 Triton - X Nonidet P-40 を含む Lysis buf fer を添カロし、 N A D ( P ) Hォキシダ一'ゼにより産生した eel 1 lysate 中のインターロイキン一 8 (以下「 I L 一 8」と記す。）を固相酵素免疫検定法 ( enzyme- 1 i nked i mmuno solvent assay) で測定した。被験化合物はグルコース添加の 1 日前に添加した。

被験化合物を添加し 4 4 mMグルコース存在下で培養した細胞の I L 一 8 産生を A、被験化合物を添加せず 4 4 m Mグルコース存在下で培養した細胞の I L 一 8産生を B、被験化合物及び 4 4 m Mグルコースをともに添加せずに培養した細胞の I L — 8 産生を C とし、以下の式により抑制率を算出した。

抑制率（％) = 1 0 0 — 〔（ A— C ) / ( B — C )〕 X 1 0 0 I C ₅ 。値は、得られた抑制率をもとに最小二乗法により求めた用量作用直線から算出した。結果を表 1 に示す。

表 1 I L 一 8 産生抑制作用

ND：データ無し

試験例 2 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ抑制作用

Wistar 系雄性ラット（日本 S L C ) の尾静脈から 0 . 0 5

Mクェン酸バッファー（ p H 4 . 5 ) に溶解したストレプトゾトシン 4 O m g Z k g を投与し、糖尿病ラットを作製した。ストレブトゾトシン静注 1 週間〜 8 週間後に、へパリン処理したキヤピラリーを用いて尾静脈から採血し、直ちに氷冷後、 3 0 0 0 r p m , 1 5 分， 4 °Cで遠心分離して血清を得た。グルコース測定用キット" G L Uネオシノテスト " （シノテスト社）により、マイクロプレートリーダー（ SPECTRA MAX 250, Molecular Devices 社）を用いて酵素法で血糖値を測定した。

糖尿病ラットに 3 日間被験化合物（10mg/kg)を 1 日 1 回経口投薬した。試験開始 4 日目に、大動脈のスーパーォキシドァニオン産生を指標とし、 David. G. Harrison らの方法 ( J. Clin. Invest. 91， 2546-2551 , 1993)を改良した以下の方法により、 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ活性を測定した。

すなわち、上記処置を施していない正常ラット又は糖尿病ラットを腹部大動脈から放血させた後、胸部大動脈を摘出した。摘出した胸部大動脈を Krebs- Hepes buf fer 中に浸し、周辺組織を除き、約 5 m mのリング標本を作製した。このリング標本を Krebs- Hepes buf fer 中、 3 7 °Cで 1 0 分間プレインキュベー卜した後、 0 . 2 5 m M luc igenin ( S I G M A社）を含む Krebs— Hepes buf fer 中に移した。 5 0 0 Mの N A D Hを添加し、ルミノメーター（MULTI— BIOLUMAT LB9505 C,ワラック · ベルトールド社）を用い、 3 7 °Cで 1 0 分間化学発光数 (chemiluminescence:単位 R L U： relative light units) を測定した。測定時間（横軸）に対し化学発光数（縦軸）をプロットした曲線の曲線下面積（以下「 A U C」という。）により、総化学発光数を算出した。測定した総化学発光数を、血管リング標本の湿重量で割付け、大動脈単位重量当たりのスーパ一ォキシドア二オン産生量に標準化した。

被験化合物を投与した糖尿病ラットの標準化した化学発光数を A、被験化合物を投与していない糖尿病ラットの標準化した化学発光数を B、被験化合物を投与していない正常ラットの標準化した化学発光数を C とし、下記式により抑制率 ( % ) を算出した。

抑制率（％) = 1 0 0 — 〔（ A— C ) / ( B — C )〕 X 1 0 0 結果を表 2 及び表 3 に示す。表 2 糖尿病ラッ卜の大動脈 N A D (P )Hォキシダ一ゼ活性

平均値 ±標準誤差

3 糖尿病ラット大動脈 N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ抑制作用

ND：デ一夕無し表 1 〜 3 に示したとおり、 4 4 mMグルコース存在下で培養した内皮細胞及び糖尿病ラット大動脈の N A D (P ) Hォキシダーゼ活性は正常よりも高く、化合物 A〜 Hはいずれも N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ阻害作用を示した。試験例 3 正常ラット N A D (P )Hォキシダーゼへの作用正常 Wi s Ur 系雄性ラット（日本 S L C ) に 3 日間被験化合物（10mg/kg)を投与し、試験例 2 と同様の方法で、大動脈のス

—パーォキシドア二オン産生量を測定した。

被験化合物を投与したラットの標準化した化学発光数を A 被験化合物を投与していないラット（対照群）の標準化した化学発光数を B とし、下式により抑制率（％ ) を算出した抑制率 ( % ) = 1 0 0 - ( A Z B ) X 1 0 0 結果を表 4 に示す。表 4 正常ラット大動脈 N A D ( P ) Hォキシダーゼ抑制作用

化合物 A及び B は、いずれも正常ラットのスパーォキシドア二オン産生に影響を与えなかった。試験例 4 大動脈 N A D ( P ) Hォキシダーゼ阻害作用

試験例 2 と同様の方法で摘出した腹部大動脈を Krebs- Hepes buf f er 中に浸し、周辺組織を除き、約 5 mmのリング標本を作成した。このリング標本を、被験化合物（化合物 A、化合物 B又は D P I ( S I G M A社））を添加した Krebs-Hepes buf fer Φ ^ 3 7 °C、 1 0 分間プレインキュベートした後、リング標本を 0 . 2 5 m M lucigenin を含む Krebs-Hepes buf fer 中に移した。 5 0 0 の N A D Hと被験化合物を添加し、化学発光数.を 3 7 °Cで 1 0 分間測定した。測定時間（横軸）に対し、化学発光数（縦軸）をプロットした曲線の A U C により、総化学発光数を算出した。得られた化学発光数値を、血管リング標本の湿重量で割付け、大動脈単位重量当たりのスーパ一ォキシドア二オン産生量に標準ィ匕した。

被験化合物を添加したリング標本の標準化した化学発光数を A、被験化合物を添加しなかったリング標本（対照）の標準化した化学発光数を B とし、下式により阻害率 ( % ) を算出した。

阻害率（％ ) = 1 0 0 — （ A Z B ) X 1 0 0 結果を表 5 に記す。表 5 糖尿病ラット大動脈 N A D (P ) Hォキシダーゼ阻害作用

平均値土標準誤差

化合物 Aは N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ阻害作用を示さなかつたが、非特異的 i nh i b i t 0 r である D P I は N A D ( P ) Hォキシダーゼ阻害作用を示した。試験例 5 白血球 N A D P Hォキシダ一ゼに対する作用

正常 Wis ter 雄性ラット（日本 SLC) の腹部大動脈から採血し、直ちに血液 3 m L に対し 4 2 m L の氷冷 Lysis buf fer と混和した。 5 分後、 4 V 、 1 1 0 0 r p mで 5 分間遠心分離した。沈渣を氷冷 Lysis buf fer に懸濁し、再び 4 °C、 1 1 0 0 r p mで 5 分間遠心分離した。この操作を 3 回繰り返すことにより、白血球を得た。得られた白血球を Krebs-Hepes buffer で懸濁して細胞数を 1 X 1 0 ⁶個/ m 1 に調整した。 0 . 2 5 m M 1 u c i gen i n 及び被験薬を添加し、さらに Phorbol 12-myr i state 13 - acetate (以下「 P M A J と記す。 S I G M A社。）を添加した後、化学発光数を 3 7 でで 1 0分間測定した。

被験化合物を添加した白血球懸濁液の総化学発光数を A、被験化合物を添加しなかった白血球懸濁液（対照）の総化学発光数を B とし P M Aで刺激しなかった白血球懸濁液の総化学発光数を C とし、下式により抑制率（％ ) を算出した。抑制率（％ ) = 1 0 0 — (( A - C ) / ( B — C )〕 X 1 0 0 結果を下記表 6 に示した。表 6 白血球 N A D P Hォキシダーゼに対する作用

平均値土標準誤差

化合物 A、 B は、白血球の N A D P Hォキシダーゼに対する抑制作用を示さなかったが、非特異的 i nh i b i t 0 r である D P I は白血球の N A D P Hォキシダ一ゼに対する抑制作用を示した。試験例 1〜 5 の結果から、一般式（ I) 〜（VIII) で表される二環式ピリダジン化合物は、白血球の N A D P Hォキシダ一ゼには抑制作用を示さず、白血球以外の組織における N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用に対する抑制作用を有することが明らかとなつた。試験例 6 酸化低密度リポタンパク質（ low- density lipoprotein, 以下「 L D L」と記す。）による N A D (P ) H ォキシダーゼ発現抑制に対する作用

H U V E C を 2 4穴コラーゲンコートプレートに播種した < 化合物 Aを添加し、 2 4 時間後に健常人ボランティァ血液より調製した酸化 L D L を 1 0 0 g m L添加した。

酸化 L D L添加 2 4時間後に、 MgExtr actor ( T0Y0B0) を用いて toUl R N Aを抽出し、 D N a s e l 処理（日本 g e n e を行った。

この一部を分取し、吸光度（ O D _{2 6 Q} ) を測定することにより、 total R N Aの濃度を算出した。

得られた total R N A l O O n g を用いて R T ( reverse transcript ion) 反応（ A B I 社）を行い、 c D N Aを合成した。

合成した c D N A 1 0 L を用いて P C R ( polymerase chain react ion) を行い（ A B I 社）、 N A D (P ) Hォキシダーゼ主要構成成分である p 2 2 ^{p h}。 ^x、内在コントロールとして jS - ac t i n の発現量を測定した。

2 2 ^{13 11}。 ⁵^の発現量を /3 -&(^ 111 の発現量で標準化し、正常の（ p 2 2 ^{p h} ° ^x ) I ( β -act in) の発現量を 1 0 0 % として表した。表 7 p 2 2 ^{p h}。 ^x発現に対する作用

# ： pく 0.05 (対照群に対する t 検定）

* ： pく 0.05 (対照群に対する t 検定）

平均値土標準誤差酸化 L D L添加により H U V E Cの p 2 2 ^{p h}。 ^x発現が、約 1 . 6 倍上昇した。一方、化合物 A添加群の p 2 2 ^{p h} ° ^x 発現は、正常群の 1 . 2倍にすぎず、化合物 Aが酸化 L D L 添加による p 2 2 ^{p h}。 ^x発現上昇を抑制したことがわかる。試験例 7 動脈硬化阻害作用

雄性 N Z Wゥサギ (日本 S L C ) に、 1 2 週間 0 . 6 7 % コレステロール含有飼料を 4 0 g Z k g / d a y及び化合物 Aを与えた。耳介静脈からへパリン処理したキヤピラリーを用いて採血し、 3 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心して得られた血漿中のトータルコレステロール（以下「 T C」と記す。）値を、測定キットを用い酵素法で測定した。

結果を表 9 に示す。

1 2週間後、ペントバルビタール麻酔下で頸動脈を剥離 ' 摘出した後、脱血し、大動脈を摘出した。得られた頸動脈を、直ちに Kr e b s 緩衝液に浸し、慎重に周囲の組織を除去し、内皮細胞に損傷を与えないようにして、リング標本を作成した。次いで、リング標本を 9 5 % O ₂ - 5 % C O ₂ 混合ガスの通気下で、 3 7 °Cの Kr e b s 緩衝液を満たしたマグヌス槽中に懸垂し、 2 g の張力負荷により定常状態となった後、実験を行つ 7こ

弛緩反応を測定する際には、ノルェピネフリンであらかじめ標本を収縮させておき、収縮が一定になった時点でァセチルコリンを累積的に添加した。 1 0 μ Mのノルェピネフリンにより引き起こされた収縮を 1 0 0 % として血管の弛緩率を求めた。

トランスジュ一サ一 (日本光電）を用いて、等尺性に張力 P T/JP2004/005065

21 を測定した。対照群に対する二元配置分散分析（ Dunne 11 法）により有意差検定を行った。

摘出した大動脈を弓部 ·胸部，腹部大動脈に分割し、 1 0 % ホルマリン緩衝液で固定後、写真撮影を行い、大動脈に沈着した脂質面積を測定し、大動脈面積に対する脂質沈着部の面積の割合を求めた。

結果を表 8 に示す。

8 ゥサギ動脈硬化モデルにおける脂質沈着に対する効果

## ： p〈0.01 (対照群に対する Dunne ti 法）

** ： pく 0.01 (対照群に対する t 検定）

平均値土標準誤差表 9 コレステロール負荷 12週後の血中脂質に対する作用

## : pく 0.01 (対照群に対する t 検定）

平均値土標準誤差 0 . 6 7 %コレステロール含有飼料投与で対照群の血漿中の T C値は約 2 0 0 O m g / d L に上昇した。血漿中の T C 値は対照群と比較して有意な低下作用を示さなかった。頸動脈の内皮依存性血管弛緩反応について、ァセチルコリン（以下「 A c h」と記す。） 1 0 — ⁸〜 1 0 — ⁵ Mの濃度反応曲線を図 1 に示した。

対照群の A c h による弛緩反応は、正常食群に対して有意に減弱した。一方、化合物 A投与群の A c h による弛緩反応は、対象群と比較して、有意に改善された。化合物 Aは動脈硬化のリスクファクターである高脂血症の改善作用なしに、胸部、腹部大動脈への脂質沈着を有意に阻害した。この結果は、血漿中に高濃度の脂質が存在している状態においても、化合物 Aが組織への脂質沈着を阻害し、血管内皮依存性弛緩反応を改善することを示している。試験例 8 ラット左冠動脈結紮心筋梗塞モデルに対する作用 S D系雄性ラット（日本 S L C ) をエーテル麻酔下で背位固定し、 Selye H. らの方法 ( Angiology, 1960 , 11， 398)に従い、胸骨左線に沿って縦切開を加え開胸し、心臓を露出させた。左冠動脈を起始部から 1 一 2 m mの部位を 4号シルク糸により結紮し、心臓を元に戻し、すばやく脱気した後、閉胸した。心電計（日本光電）により心筋梗塞の状態であることを確認した。結紮 2 4時間後に腹部大動脈から放血致死させ心臓を取り出し、中央部の横断輪状切片を、 0 . 1 Mリン酸緩衝液に溶解した 1 %塩化 2 , 3 , 5 — トリフエニルテトラゾリゥム（以下「 T T C」と記す。）溶液中、遮光下で 2 0 分インキュベー卜した。その後、切片をホルマリン緩衝液で固定し、切片をトレースし、梗塞部（ T T C非染色部）面積、左心室面積を算出した。冠動脈結紮直後、化合物 Aを 1 % C M C溶液に懸濁し、経口投与した。

抑制率は次式で算出した。

化合物投与群の梗塞率

抑制率（％)= 1 0 0 X 1 0 0

化合物非投与群の梗 ^

梗塞率 ( % ) (梗塞部面積 Z左心室面積） X 1 0 0

また、化合物 A ( 1 m g / k g ) を結紮 1 5 分、 1 時間、 3 時間後に経口投与し、梗塞抑制作用を検討した。結果を下表に示す。表 1 0 ラット急性心筋梗塞モデルに対する作用

梗塞率（％ ) 抑制率 ( % ) 非投与 40

化合物 A (0. lmg/kg) 40 0

化合物 A (0.3mg/kg) 17. ネネ 57 " 化合物 A (lmg/kg) 6.3 " 84.3 ネネ

**:p〈0.01 (化合物非投与群に対する Dunne tt 法）表 1 1 結紮後投与時の梗塞率に：対する作用

梗塞率（％ ) 抑制率 ( % ) 非投与 40

1 5 分後 10.5 ネネ 73.8

1 時間後 16.7 ネ 58.3

3 時間後 29.3 * 26.8

*:pく 0.05, pく 0.01 (化合物非投与群に：対する Dunne 11 法 ) 化合物非投与群において、左心室に対する梗塞率は約 4 0 %であったのに対し、化合物 A投与群は、 0 . 3 m g / k g、 1 m g / k g投与群で有意な梗塞率の抑制作用があった。試験例 9 ゥサギ虚血再灌流心筋梗塞モデルに対する作用雄性 N Z Wゥサギ (日本 S L C ) を背位固定後、ペントバルビタール麻酔し開胸した後、左冠動脈基始部に 4号シルク糸をかけ、さらに長さ 1 c mのポリエチレンチューブをあてて糸で左冠動脈を結紮した。結紮 2 時間後にポリエチレンチユーブ上の糸を切断し、血流を再開させた。再灌流 4時間後に、 4号シルク糸で冠動脈基始部を結紮し、 3 %エバンスブルー液を 1 m L k g静脈内投与した。 5分後に過剰量のぺントバルピタールを投与し心臓及び大動脈を摘出した。心臓を幅 3 m mの輪状に切断し、左心室面積、虚血領域（エバンスブルー非染色部）をトレースした。

さらに 1 % T T C溶液中で 3 0 分インキュベートした後、梗塞巣（ T T C非染色部）をトレ一スした。化合物 A ( 1 m g / k g ) は結紮 1 時間前に投与した。

左心室面積に対する虚血域、梗塞巣の割合を算出した。心臓の一部を液体窒素で凍結し、クラッシャーにより粉砕、リン酸緩衝液でホモジネートした。この懸濁液を 3 0 0 0 r p mで 1 0 分、さらに上清 8 m L を 1 5 0 0 O r p mで 1 5 分遠心分離し、得られた上清を 0- dianisidine dihydrochloride を含むリン酸緩衝液と混合し、 2 5 °C、 3 0 分静置した後、吸光度（ O D _{4 6}。）を測定し、ミエ口パーォキシダ一ゼ ( M P 〇）活性を求めた。 M P 〇活性は正常群の値を 1 0 0 % として表した。結果を表 1 2 に示す。 ¾： 1 ヮ I 千助 ¾泰七ァソレにスす 9 る TP ffl

囬 ^ ¾ / 皿囬 ¾ 、肋 P¾ M r (J ^:古 Ί王止吊群丄 U U

Βδ 1¥ c p

M flu ¾ΐ 0 o ^ t 0 7b 卄卄化合物 Α投与群 1 4 % $ 1 2 8 % :!:

*： pく 0.05 (対照群に対する t検定）

##： pく 0.01 (正常群に対する t検定）対照群では、虚血域に対する梗塞巣の割合は 5 8 %であつた。それに対し化合物 A投与群では、この割合は 1 4 % となり、有意な抑制作用が認められた。また、心筋内への白血球浸潤の指標となる M P〇活性は、対照群（梗塞心臓）で正常群に対して有意に増加したが、化合物 A投与群では対照群に対して有意に抑制された。試験例 1 0 ゥサギ慢性心筋梗塞（心不全）モデルに対する作用

雄性 N Z Wゥサギ（日本 S L C ) を背位固定後、ペントバルビタール麻酔し開胸した後、左冠動脈基始部に 4号シルク糸をかけ、さらに長さ 1 c mのポリエチレンチューブをあてて糸で左冠動脈を結紮した。結紮 2時間後にポリエチレンチュ一ブ上の糸を切断し、血流を再開させた。再開通 2時間後に化合物 A ( 1 m g / k g ) を 1 回投与し、その後、 1 日 1 回 1 2週間にわたり投与した。 1 2週間後に過剰量のベントバルピタールを投与した後、心臓を摘出し、その重量及び左心室中央の壁の厚さを測定した。結果を以下に示す。

致死率と心重量、左 'L、室厚により化合物を評価した。表 1 3 累積死亡率に対する作用結紮 2週間結紮 4週間死亡率非投与群 3 / 2 0 6 / 2 0 3 0 % 化合物 A投与群 0 / 1 2 1 / 1 2 8 ノ。表 1 4 ヽ堇対する作用

* ： pく 0.05 (対照群に対する t 検定）

# ： pく 0.05 (対照群に対する t 検定）ゥサギ虚血再灌流心筋梗塞後、 1 2 週間で被験化合物非投与群は、心重量の増加及び左心室厚の薄弱化が認められ、心筋梗塞後の心不全への移行時にみられる心臓の膨化 · 腫大を示した。化合物 A投与群では、心重量の増加及び左心室厚の薄弱化が抑制された。試験例 1 1 脳梗塞モデルに対する作用（虚血性脳障害モデル）

I C R系雄性マウス（日本 S L C ) をエーテル麻酔し、背位に固定し、両総頸動脈を糸で結紮した。すばやく傷をふさぎ、直ちにマウスをケージ内に解放、 3 0 分毎に 2 4 0 分までの死亡の有無を確認し、各群の累積死亡率を求めた。総頸動脈結紮 1 時間前に化合物 B を経口投与した。表 1 5 累積死亡率に対する作用

化合物 B投与群では、両頸動脈結紮による脳虚血モデルに対して、死亡率の改善効果がみられた。産業上の利用可能性

本発明に係る N A D (P ) Hォキシダーゼを含む医薬組成物は、種々のリスクファクタ一により起こる疾患の予防や症状の軽減に用いることができ、しかも免疫機能に与える影響が小さいので、副作用が少なく、極めて有用なものである。なお、本出願は、日本特許出願特願 2 0 0 3 — 1 0 3 5 7 6 号を優先権主張して出願されたものである。

Claims

請求の範囲

1 . 白血球の N A D P Hォキシダ一ゼ作用を実質的に阻害せず、かつ白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダ一ゼ作用を抑制する化合物を含有する N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰作用の抑制剤。

2 . 白血球以外の組織が、血管細胞系、心臓、腎臓、網膜、ミクログリァ又は腫瘍細胞の組織であることを特徵とする請求項 1 記載の抑制剤。

3 . N A D ( P ) Hォキシダーゼの過剰作用が、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、喫煙、心不全、心肥大、虚血性心疾患、又は血管再開通療法若しくは臓器移植術の虚血再灌流により生じたものであることを特徴とする請求項 1 又は 2記載の抑制剤。

4 . N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用が、ガン又は痴呆症により生じたものであることを特徴とする請求項 1 又は 2 記載の抑制剤。

5 . N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用が、化学物質の摂取により生じたものであることを特徴とする請求項 1 又は 2 記載の抑制剤。

6 .白血球の N A D P Hォキシダ一ゼには実質的に作用せず、かつ白血球以外の組織の N A D ( P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用を抑制する化合物が、下記一般式（ I ) から ( V I I I ) で表される二環式ピリダジン化合物又はその薬理学上許容される塩であることを特徴とする請求項 1 乃至 5 のいずれかに記载の抑制剤。一般式 ( I )

{式中、 Aは C ₃ 〜 C ₆ アルキル、 C ₅ 〜 C ₇ シクロアルキル又はそれぞれが C ！〜 C ₄ アルキル、 C ₁ 〜 C ₄ アルコキシ若しくはハロゲンから選ばれる 1 以上の置換基を有していてもよいフエニル、チェニル、フリル、チアゾリル、フエノキシ、 C C フエニルアルキル、フエ二ルチオ、含窒素飽和環基、ピリジル若しくはイミダゾリルを表す

B は、一 N H _ D

〔 Dは

(式中、 R ¹ は水素又は C 〜 C ₄ アルキルを表す。 Xはハロゲン、 C _x 〜 C ₄ アルキル又は C ₁ 〜 C ₄ アルコキシを表す。 k は 0 〜 3 の整数を表し、 kが 2 以上の整数のとき、複数の Xはそれぞれ異なっていてもよい。）

(式中、 R ² は水素又は C ₁ 〜 C ₄ アルキルを表す。 Yは C ₁ 〜 C ₄ アルキル又は〜 C ₄ アルコキシを表す。 mは 0 〜 6 の整数を表す。 mが 2 以上のとき、複数の Yはそれぞれ異なっていてもよく、任意の 2 つの Yが連結して分岐していてもよいじェ〜 c ₆ アルキレンを形成してもよい。）

(式中、環 Hは C C ₇ シクロアルキルを表す。 Y及び m は前記と同義である。）

- C H R ³ R ⁴ (式中、 R ³ は（ェ C , アルキルを表す。

R ⁴ は C ₅ C ₈ シク口アルキル又はチェニルを表す。）又は C ₃ C ₈ アルキルを表す。〕

又は

(式中、 Z は〜 C ₄ アルキル又はフエニルを表す。 n は 0 2 の整数を表し、 nが 2 のときこれらの Z は異なっていてもよい。）

を表し、

Qはベンゼン環、フラン環又は〜 C ₄ アルキルで置換されていてもよいチォフェン環を表す。 } 一般式（ Π)

[式中、 R ⁵ 及び R ⁶ は、それぞれ独立して水素、 C ェ〜 C

6 アルキル、 C , 〜 C 6 アルコキシ、ハロゲン、シァノ、二トロ、アミノ、トリフルォロメチル又は力ルポキシルを表す。

X ，は— C〇〇 R ⁷ ( R ⁷ は水素又は置換されていてもよい C , 〜 C ₆ アルキルを表す。）、 — C O N Hい一 C N、 — C O R ⁸ ( R ⁸ は置換されていてもよい C i C e アルキル又は置換されていてもよいァリールを表す。）、一 N H " 一 N〇 ₂ 又は一 O R ⁷ ( R ⁷ は前記と同義である。）を表す。] 一般式（ III)

素、〜 C ₆ ァシァノ、ニトロ、

シルを表す。）、一般式（ IV) 及び（ V )

R

(V)

[式中、 R ^{1 1}及び R ^{1 2}は、それぞれ独立して水素、（

C ₆ アルキル、 C i C アルコキシ、ハロゲン、シァノ、ニトロ、ァミノ、トリフルォロメチル又は力ルポキシルを表す。 X ，，は—〇 R ^{1 3} ( R ^{1 3}は水素、 C i 〜 C ₆ アルキル又はァリールを表す。）又は— N R ^{1 4} R ^{1 5} ( R ^{1 4}及び R ^{1 5}は、それぞれ独立して、水素、 C ！〜 C ₆ アルキル又はァリールを表す。）] 一般式（VI)， (VII), (VIII)

(式中、 R ^{1 6}及び R ^{1 7}は、それぞれ独立して、水素、

C アルキル、アルコキシ、ノ、ロゲン、シァノ、ニトロ、ァミノ、卜リフルォロメチル又は力ルポキシルを表す。 R ⁸及び R ^{1 9}は、それぞれ独立して、水素又は C c _fi アルキルを表す。 Y ' は酸素又は硫黄を表す。）

7 . 請求項 1 乃至 6 のいずれかに記載の抑制剤を有効成分とする N A D (P ) Hォキシダ一ゼの過剰作用に起因する疾病用の医薬組成物。

8 . 脂質低下剤、降圧剤、血糖低下剤、血管拡張剤、抗血小板剤、抗凝固剤、脳保護薬、抗ガン剤、利尿剤、強心薬、鎮痛薬、抗浮腫薬、血栓溶解剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ビタミン剤又は抗酸化剤と、同時に若しくは別々に、又は逐次的に投与する形態であることを特徴とする請求項 7 記載の医薬組成物。