WO2004086036A1

WO2004086036A1 - Ａｂｃタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2004086036A1
Application number: PCT/JP2004/004093
Authority: WO
Inventors: Hikaru Yabuuchi; Toshihisa Ishikawa
Original assignee: The Circle For The Promotion Of Science And Engineering
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2004-03-24
Publication date: 2004-10-07
Also published as: EP1615033A4; US20060141496A1; EP1615033A1; JP2005024245A

Abstract

　少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性の測定方法や、かかる測定方法を利用したＡＢＣタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法や、それら方法に有利に用いることができるＡＢＣタンパク質のトランスポーター活性測定用キットを提供するものである。バナジン酸と［3Ｈ］ＡＴＰとを含む反応緩衝液にヒトＰ糖タンパク質が発現した昆虫細胞膜を添加してプレインキュベーションを行い、次いで、被験化合物を添加して反応させ、反応終了後の反応液を９６ウェルタイプのグラスフィルターに添加し、吸引洗浄法を用いて１ステップによるＰ糖タンパク質発現メンブレンへの［3Ｈ］ＡＤＰ吸着量を測定する。

Description

AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法技術分野

本発明は、 AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質（AB C トランスポ一ター）と相互作用する物質のスクリーニング方法や、 AB C夕ンパク質のトランスポーター活明性の測定方法や、これらスクリーニング方法や測定方法に有利に用いること細ができる A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キットに関する。背景技術

細胞は形質膜や小胞体，ミトコンドリアなどの細胞内小器官膜を介してイオンや栄養素の輸送ならびに老廃物や毒素の排出を行うことにより細胞機能を維持している。これらの物質輸送は、チャネル，トランスポ —ターと呼ばれる膜輸送タンパク質により選択的に行われている。ィォンゃ栄養素等の物質が細胞膜を透過するための機構としていくつか知られているが、その一つとして A B C夕ンパク質が知られている（例えば、 C. F. Higgins, Ann. Rev. Cell Biol. , 8, 67 (1992)参照) 。 AB C夕ンパク質は、卜ランスボー夕一, チャネル，受容体（レギユレ一夕一）という多様な機能に分化し、それぞれの生物で重要な生理機能を果たしており、いずれも類似の 2次構造をもち、膜貫通ドメインを含む AT P 結合ドメインを共通に有する膜夕ンパク質ファミリ一であり、細胞内 A T P、 AD Ρによって駆動あるいは制御されている。 AB Cタンパク質は、細菌から酵母、植物、哺乳類に至る広い生物種に分布する最も大きい遺伝子ファミリ一の一つである。ヒトでは現在約 5 0以上の A B C夕ンパク質遺伝子が同定されてこれらのタンパク質の大部分は、膜間の分子の能動輸送に関連していることから、 AB Cタンパク質は AB C トランスポ一ターとも呼ばれている。

AB C夕ンパク質は、 AT P加水分解のエネルギーをタンパク質分子の構造変化に変換し、それとカップリングすることによって薬剤を細胞の中から外へ輸送することから、薬物の体内動態プロファイル（吸収、分布、代謝、排泄、ターゲット部位での薬剤実効濃度）を規定し、ひいては薬物の全体的な薬理効果をも左右するといわれており、例えば、小腸上皮細胞や脳血管内皮細胞に発現した AB C 卜ランスポーターは、経口投与した薬物のバイオアべイラビリティーや中枢神経系への薬物移行に大きく影響を与える。また、 AB Cタンパク質遺伝子の異常が病気と関連しているといわれており、特にヒトにおいては、 AB Cタンパク質の異常がさまざまな疾病を引き起こすことが明らかになり、 AB Cタンパク質の生体防御機構としての重要性が理解されつつある。例えば、 A B Cタンパク質ファミリーに属する P—糖タンパク質（MD R 1 ) や M R P 1が過剰発現すると、多くの制癌剤を細胞外へ排出することによつて癌細胞が耐性になることが、癌の化学療法の分野では良く知られている

そして、 A B Cタンパク質がトランスポーターとして細胞膜を介して薬物を輸送する機構は次のように考えられている。

( 1 ) AB Cタンパク質は細胞膜の両面（細胞の内側及び外側）にわたつて膜中に存在する。

(2 ) この AB Cタンパク質に、細胞の内側から、エネルギ一源としての 1分子の AT P及び輸送されるべき 1分子の薬物が結合し、 AT Pは AB Cタンパク質の AT Pァーゼ活性により AD Pとリン酸とに加水分解され、この際に放出されるエネルギーによる AB Cタンパク質の変形により薬物は細胞の内側から外側に輸送される。

( 3) 前記薬物は細胞の内側に放出されると共に、（ 2) において生成したリン酸も A B Cタンパク質から開放される。

(4) AB Cタンパク質に、細胞の内側から、新たな AT P分子が結合し、この AT Pが AD Pとリン酸とに分解し、エネルギーが開放され、このエネルギーにより前記（ 2) において変形した AB Cタンパク質の形状が復旧する。

( 5) 前記（4) において生成した AD P及びリン酸が AB Cタンパク質から開放され、輸送系は前記（ 1 ) の状態に戻る。

現在、 AB Cトランスポ一ターの中で最も注目を浴びている P—糖夕ンパク質のアツセィにおいて、 P—糖タンパク質が発現している膜に基質を添加した際の AT Pァ一ゼ活性を測定する方法が多くの製薬会社等で採用されている。具体的には、上記のサイクルにおいて、上記（ 2) の段階において輸送されるべき薬物の存在により AT Pが A B Cタンパク質に結合し、 AD Pに分解されることから、 AB Cタンパク質に結合した状態の AD Pを測定すれば、 AB Cタンパク質により認識される薬物を検出することができる。従って、 AT Pに標識を付しておき、標識が結合した A B Cタンパク質（すなわち標識された A D Pが結合している AB Cタンパク質）を測定すれば、 A B Cタンパク質によって輸送される薬物又は阻害剤を検出することができる。この手法の長所としては、試薬代が非常に安価であること、大量の検体を処理することが可能であること等の長所を有する。しかしながら、上記輸送系は酵素回転しており動的状態にあるので、標識された A B C夕ンパク質を測定することは事実上困難である。また、膜自体の持つ内因性 ATPァ一ゼ活性により若干バックグラウンドが高くなる場合があることや、リン酸濃度の分解量を測定することから、感度が比較的低いといった弱点があった。そこで、上述の AT Pァ一ゼ活性を測定する手法に変わる方法として、バナデート法を応用したアツセィが考案された。バナデート法は、 1 9 9 5年以降に論文に報告されるようになった方法であり、 AB C トランスポーターが AT Pを分解する際、リン酸イオンがバナデ一トに置換されることによって、 AD Pがトランスポ一夕一に結合するという現象を利用するものである。すなわち、 AT Pとして予めラジオアイソトープ等で標識した AT Pを用い、上記輸送系にバナジン酸を存在させれば、上記（ 2) の段階で、バナジン酸がリン酸と置き換わり、上記輸送系の回転が停止し、標識された A D Pが A B Cタンパク質に結合した状態に留まり、 AB C夕ンパク質に結合した A D Pの量を定量することができ、間接的に AB Cタンパク質のトランスポ一夕一活性を測定することが可能となる。

この測定において、従来は、細胞膜から膜タンパク質及び A B Cタンパク質を遊離せしめ、遊離した A B C夕ンパク質を電気泳動により他のタンパク質から分離し、 AB Cタンパク質に結合している標識 (すなわち標識された AD P) を測定していた。この方法によれば被験薬物が A B C夕ンパク質の基質又は阻害剤であるか否かを決定することが可能であるが、多量の被験物質を短時間に試験することは不可能であった。そこで、本発明者らは、 AB C—結合カセット（AB C) 蛋白質に対する基質のスクリーニング方法において、 A B C蛋白質が発現している細胞膜画分、標識された AT P及びバナジン酸、並びに被験試料を混合してインキュベートし、この混合物を、 AB C蛋白質に対する抗体が固定化された支持体に添加する、又はその支持体上で標識試薬及び被験試料等を混合してインキュベートし、そして固定化された標識又は固定化されなかった標識を測定する A B C蛋白質の基質のスクリーニング方法を提案した（国際公開第 0 2 / 0 5 2 2 6 2号パンフレット参照）。かかるスクリ一ニング方法によれば、 A B C トランスポーターが発現した細胞膜画分を、抗体を介して支持体（例えば 9 6ウェルマイク口プレート）に結合させ、 A B C トランスポ一夕一に結合した [ ³² P ] A T P ( A D P ) の結合量を測定することにより A B C トランスポーターに対する基質又は阻害剤を極めて効率よくスクリーニング可能であり、ハイスル —プットスクリーニングへの応用が可能となる。しかしながら、上記の方法及びキットでは、抗体を介して支持体に固定化した後の A B Cトランスポ一ターが発現している細胞膜画分は生理活性が不安定であること， 1ゥエルあたりに吸着可能な細胞膜画分の量に制限があり、実験データの再現性に問題がある等の不都合があり、安定したデータ解析の可能なより実用的な実験系の構築に迫られていた。

本発明の課題は、少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができる A B C夕ンパク質のトランスポー夕一活性の測定方法や、かかる測定方法を利用した A B C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法や、それら方法に有利に用いることができる A B Cタンパク質の卜ランスポーター活性測定用キットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、本発明者らによる既存のバナデ一ト法 (国際公開第 0 2 / 0 5 2 2 6 2号パンフレツト参照）の改良に着手し、バナジン酸と [ ³H ] A T Pとを含む反応緩衝液にヒト P糖夕ンパク質が発現した昆虫細胞膜を添加してプレインキュベ一シヨンを行い、次いで、被験化合物を添加して反応させ、反応終了後の反応液を 9 6ウェルタイブのグラスフィルターに添加し、吸引洗浄法を用いて 1ステップによる P糖夕ンパク質発現メンブレンへの [ ³H ] A D P吸着量を測定したところ、少量のサンプルを用いても、データ変動が小さく再現性も良好で、多くのサンプルを同時にかつ簡便に測定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、 AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルタ一により濾過して分離する工程と、フィルタ一上の標識及びノ又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とする A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項 1 ) や、フィル夕一により濾過して分離する工程が、フィルターにより吸引濾過及び/又は遠心濾過して分離する工程であることを特徴とする請求項 1記載の AB C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリー二ング方法（請求項 2) や、ヌクレオシドニリン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一二ング方法 (請求項 3 ) や、ヌクレオシド三リン酸が、 AT Pであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法（請求項 4) や、標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項 5 ) や、放射性標識が、 ³²P, ³³P, ³⁵ S , "C又は ³ Ηであることを特徴とする請求項 5記載の A Β C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項 6 ) や、 A B Cタンパク質が発現している膜画分が、 AB Cタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項 1〜 6 のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項 7) や、 AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB C夕ンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法 (請求項 8) や、 AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法（請求項 9 ) や、 A B C夕ンパク質が、 AB CAサブファミリ一, AB C Bサブファミリ一， AB C Cサブファミリー， AB CDサブファミリ一， AB C Eサブファミリー， AB C Fサブフアミリー又は AB C Gサブフアミリーに属するヒト AB C夕ンパク質であることを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一二ング方法（請求項 1 0 ) に関する。

また本発明は、 AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過 ·分離しうるフィル夕一とを有することを特徴とする AB Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項 1 1 ) や、濾過 ·分離しうるフィルターが、吸引濾過及び Z又は遠心濾過手段を備えていることを有することを特徴とする請求項 1 1記載の A B Cタンパク質のトランスポ一ター活性測定用キット（請求項 1 2 ) や、ヌクレオシドニリン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項 1 1又は 1 2記載の AB Cタンパク質のトランスポー夕一活性測定用キット（請求項 1 3) や、ヌクレオシド三リン酸が、 AT Pであることを特徴とする請求項 1 1〜 1 3のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポー夕一活性測定用キット（請求項 1 4) や、標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 4のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項 1 5)や、放射性標識が、 ³²P， ³³P, ³⁵ S , ¹⁴C又は ³ Ηであることを特徴とする請求項 1 5記載の AB C夕ンパク質のトランスポーター活性測定用キット (請求項 1 6) や、 AB Cタンパク質が発現している膜画分が、 AB C 夕ンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 6のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット（請求項 1 7) や、 AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポ —ター活性測定用キット（請求項 1 8) や、 AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB C夕ンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポ一タ一活性測定用キット（請求項 1 9) や、 AB Cタンパク質が、 AB CAサブファミリー， A B C Bサブファミリー， AB C Cサブファミリー， A B CDサブファミリ一， AB C Eサブファミリー， AB C Fサブフアミリー又は AB C Gサブフアミリーに属するヒ卜 AB Cタンパク質であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 9のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポ一夕一活性測定用キット（請求項 2 0) に関する。

さらに本発明は、 AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、 AB Cタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜夕ンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィル夕一により濾過して分離する工程と、フィル夕一上の標識及び/又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とする AB Cタンパク質のトランスポーター活性の測定方法 (請求項 2 1 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、 P糖夕ンパク質発現メンブレンにベラパミルを添加したとき（嚳： P _ g pZV e r . ( + ) ) 、 P糖タンパク質発現メンブレンにべラパミルを添加しなかったとき (〇： P - g p / V e r . (一） ) 、 S f 9コントロールメンブレンにベラパミルを添加したとき (國： C o n t r o 1 /V e r . ( + ) ) 、並びに S f 9コントロールメンブレンにベラパミルを添加しなかったとき（□： C o n t r o 1 Z V e r . ( + )) における [³H] AT P結合活性の経時変化を示す図である。

第 2図は、 P糖夕ンパク質発現メンブレンの使用量を検討した図であり、 5 it g、 2. 5 g又は 1 gの P糖タンパク質発現メンブレンにベラパミルを添加したとき ( V e r a p a m i 1 (+ ) ) 又は添加しなかったとき（V e r a p am i 1 (一） ) における [³H] AT P結合活性の変化を示す図である。

第 3図は、ベラパミルの P糖夕ンパク質に対する濃度依存性を示す図である。

第 4図は、 P糖夕ンパク質に対する各種被験物質の結合活性を示す図である。

第 5図は、洗浄条件の検討結果を示す図であり、反応緩衝液 Aによる洗浄と P V Pによるブロッキング法との組合せ（B u f . A + P VP) 、反応緩衝液 Aによる洗浄（B u f . A) 、 P B Sによる洗浄と P V Pによるブロッキング法との組合せ（P B S + P V P) 、及び P B Sによる洗浄（P B S) について検討結果を示す図である。

第 6図は、 A ; j6—ェストラジオ一ル— 1 7— ( β - Ό一ダルクロニド）及び Β ；スルフォブロモフタレイン添加時におけるバナデ一ト法でのヒト MR Ρ 2発現 S f 9メンブレンへの [³H] AD P結合量の測定結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法としては、 AB Cタンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し, ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシド二リン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルターにより濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び Z又は濾液中の標識を測定する工程とを有するスクリ一二ング方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の AB Cタンパク質のトランスポーター活性の測定方法としては、 AB Cタンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、 AB Cタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜夕ンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルタ一により濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び Z 又は濾液中の標識を測定する工程とを有する測定方法であれば特に制限されるものではなく、そしてまた、本発明の AB Cタンパク質のトランスポ一夕一活性測定用キットとしては、 AB C夕ンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過 ·分離しうるフィルターとを有する測定用キットであれば特に制限されるものではない。

AB Cタンパク質は、 AT Pの加水分解によって得られるエネルギーを駆動力として物質を輸送したり、チャンネルを制御する。 AB C夕ンパク質は、特徴的な AT P—結合部位を持ち、その 1次構造は A B C夕ンパク質の種類を超えて、また生物種を超え、進化を通してよく保持されている。特に、 AB Cタンパク質の AT P結合部位は、膜貫通部等の部分の 1次構造と比較してアミノ酸残基配列が保存されている。 Walker Aと Walker Bモチーフ（Walker, J. E. , Saraste, Μ·， Runswick, M. J. , Gay, N. J. (1982) EMBO J 1, 945- 941)及び A B C s ignatureモチーフ (Higgins, C. F. (1992) Annu. Rev. Cell Biol .8, 67- 113)が、その AT P結合部位に共通のアミノ酸残基配列としてほぼ例外なく存在する。本発明において AB Cタンパク質とは、 WalkerAモチーフ（Gly- X-X - Gly-X-Gly~Lys-Ser-[Ser, Thr， Gin] (配列番号 1 ) と WalkerBモチ一フ（[Leu, He, Phe]-[Ile, Leu, Val] -X-Asp- [Glu, Asp, Ser]) (配列番号 2 ) であり、且つ以下の AB C signatureモチーフ（[Leu, He, Val, Met, Phe, Tyr, Cys] - [Ser， Ala] - [Ser, Ala, Pro, Gly, Leu, Val, Phe, Tyr, Lys, Gin, Hi s] -Gly- [Asp, Glu, Asn, Gin, Met, Trp]-[Lys, Arg, Gin, Ala, Ser, Pro, Cys, Leu, lie, Met, Phe, Trp]-[Lys, Arg, Asn, Gin, Ser, Thr, Ala, Val, Met]-[Leu, lie, Val, Met, Phe, Tyr, Pro, Ala, Asn]- [Pro, His, Tyr]-[Leu, lie, Val, Met, Phe, Trp]- [Ser, Ala, Gly, Cys, Leu, lie, Val, Phe]-[Phe, Tyr, Trp, His, Pro]- [Lys， Arg, His, Pro]-[Leu, lie, Val, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Ala] (ただし Xは不特定のアミノ酸を意味する。）（配列番号 3) を有するタンパク質及びそれに類似するタンパク質をいい、その由来は細菌、酵母、植物及び動物など、特に制限されない。

かかる AB Cタンパク質としては、 AB CA 1 (別名 AB C 1， TG D, HD L DT 1 ) , A B C A 2 (別名 AB C 2) ， AB CA 3 (別名 AB C 3， AB C— C, E S T 1 1 1 6 5 3) , AB CA4 (別名 S T GD I , R P 1 9 , F F M, S T GD) , AB CA 5 (別名 E S T 9 0 6 2 5 ) , A B C A 6 (別名 E S T 1 5 5 0 5 1 ) ， AB CA 7 , A B CA 8， AB CA 9 , AB CA 1 0 (別名 E S T 6 9 8 7 3 9) , A B C A 1 1 (別名 E S T 1 1 3 3 5 3 0) , A B C A 1 2 (DKF Z P 4 34 G 2 3 2 ) 等の A B C Aサブファミリー (別名 A B C 1サブファミリー）に属するヒト AB Cタンパク質や、 AB C B 1 (別名 MD R 1 , P— g p, P GY 1 ) ； TAP 1 (別名 P S F 1 , I N G 4 , D 6 S 1 1 4 E) , TAP 2 (別名 P S F 2， R I N G 1 1 , D 6 S 2 1 7 E) AB C B 4 (別名 MD R 2 Z 3 , P F I C— 3 , P GY 3 ) , AB C B 5 (別名 E S T 4 2 2 5 6 2 ) , AB C B 6 (別名 E S T 4 5 5 9 7 , urn a t , H s . 1 0 7 9 1 1 ) ， AB C B 7 (別名 E S T 1 4 0 5 3 5 , A t m 1 , A B C 7 ) , AB C B 8 (別名 E S T 3 2 8 1 2 8 , M— AB C l ) , AB C B 9 (別名 E S T 1 2 2 2 3 4) , A B C B 1 0 (別名 E S T 2 0 2 3 7) ， AB C B 1 0 P (別名 M— AB C 2 , M AB C 2) , AB C B 1 1 (別名 S P GP, P F I C— 2 , B S E P， P GY 4.) 等の AB C Bサブファミリ一（別名 MDRZTAPサブファミリ一）に属するヒト AB Cタンパク質や、 AB C C 1 (別名 MR P 1 , MR P , G S—X) ， AB C C 2 (別名 MR P 2 , c MOAT, c MR P ) , AB C C 3 (別名 MR P 3 , c MO AT 2 , E S T 9 0 7 5 7 , ML P 2 , MO AT - D) , A B C C 4 (別名 MR P 4， E S T 1 7 0

2 0 5 , MO AT - B ) ， AB C C 5 (別名 MR P 5， SMR P, E S T 2 7 7 1 4 5 , MOAT— C) ， AB C C 6 (別名 M R P 6， E S T

3 4 9 0 5 6 , ML P 1 , A R A) , C F TR (別名 C F , MR P 7 , AB C C 7 ) , AB C C 8 (別名 S UR 1 , MR P 8 , P HH I , H I , HR I N S) , AB C C 9 (別名 S UR 2 ) ， A B C C 1 0 (別名 E S T 1 8 2 7 6 3 ) , A B C C 1 1 , AB C C 1 2 (別名 MR P 9) ， A B C C 1 3 (別名 P R E D 6 , C 2 1 o r f 7 3 ) 等の AB C Cサブファミリ一 (別名 C F T R / M R Pサブフアミリー) に属するヒト A B C タンパク質や、 AB CD 1 (別名 ALD P, AL D， AMN) ， AB C D 1 P 1 , AB CD 1 P 2 , AB CD 1 P 3 , AB CD 1 P 4, AB C D 2 (別名 ALD R, ALD R P, A L D L 1 ) , AB CD 3 (別名 P M P 7 0 , P XMP 1 ) ， AB C D 4 (別名 P 7 0 R， E S T 3 5 2 1 8 8 , P XMP 1 L, PMP 6 9 ) 等の AB CDサブファミリ一（別名 A L Dサブファミリー）に属する AB Cタンパク質や、 AB C E 1 (別名 RN S 4 I , R L 1 , OAB P, RNA S E L I ) 等の AB C Eサブファミリ一（別名 OA B Pサブファミリ一）に属する AB Cタンパク質や、 AB C F 1 (別名 E S T 1 2 3 1 4 7 , AB C 5 0 ) ， AB C F 2 (別名 E S T 1 3 3 0 9 0 , H s . 1 5 3 6 1 2 ) , A B C F 3 (別名 E S T 2 0 1 8 6 4) 等の AB C Fサブファミリ一（別名 GC N 2 0サブファミリ一）に属するヒト AB Cタンパク質や、 AB C G 1 (別名 W H I T E, AB C 8 ) , AB C G 2 (別名 E S T 1 5 7 4 8 1 , MX R, B C R P， AB C P) , A Β C G 3 (別名 A b c p 2 , M x r 2 ) , A B C G 4 (別名 WH I T E 2 ) ， AB C G 5 , AB C G 8等の AB C G サブファミリ一（別名 WH I T Eサブファミリ一）に属するヒト AB C タンパク質などを挙げることができるが、これらの中でも、 P糖タンパク質（P— g p) , MR P 1 , M R P 2 , C F T R, S UR l , AB C 1， TAP 1等を好適に例示することができる。

上記の AB Cタンパク質が発現している膜画分としては、 AB Cタンパク質遺伝子が導入され、 AB C夕ンパク質が発現している生体膜の画分であればどのようなものでもよく、かかる生体膜としては細胞膜や小胞体，ミトコンドリアなどの細胞内小器官膜を挙げることができる。これら生体膜の由来としては特に制限されるものではないが、大腸菌、ストレプトミセス枯草菌、ストレプトコッカス、ス夕フイロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、ァスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラ S 2、スポドプテラ S f 9等の昆虫細胞や、 L細胞、 CHO細胞、 C 0 S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 B AL BZ c 3 T 3細胞、 B HK 2 1細胞、 H E K 2 9 3細胞、 V E R O細胞、 C V— 1細胞、 MD CK細胞、 B o w e sメラノ一マ細胞、アフリカッメガエル等の卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、ドロソフイラ S 2、スポドプテラ S f 9等の昆虫細胞が好ましい。 ·

AB Cタンパク質が発現している膜画分の調製方法としては、 AB C タンパク質を発現している細胞の調製し、 AB Cタンパク質を発現して

4 いる細胞からの膜画分の調製する方法を挙げることができる。上記 A B Cタンパク質を発現している細胞の調製方法としては、例えば、 A B C タンパク質をコードする c D N Aを選択マ一カーを有する発現べクタ一に組み込み、哺乳類細胞，昆虫細胞，酵母，細菌等の培養細胞にトランスフエクシヨンする方法を挙げることができる。選択マ一力一を有する発現べクタ一として、例えば、ネオマイシン，ピューロマイシン，ハイグロマイシン等の特定の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を持つベクターを使用し、トランスフエクションした細胞を抗生物質の存在下で培養することによって、 A B C夕ンパク質の発現べクタ一を持つ細胞のみを選択する。 A B Cタンパク質の発現を R T— P C R又は特異的抗体によって確認することが好ましい。かくして得られた A B Cタンパク質発現細胞を大量に培養する。また、 A B Cタンパク質を発現している細胞からの膜画分の調製方法としては、例えば、上記 A B Cタンパク質発現細胞の培養物を遠心分離し、 A B Cタンパク質を発現する細胞を集め、細胞を超音波、浸透圧処理等によって破砕して、遠心によって膜画分を採取し、採取した膜画分を緩衝液中に懸濁して、ショ糖濃度勾配遠心によって細胞膜画分を単離精製する方法を挙げることができる。調製後の細胞膜画分は、そのタンパク質濃度を測定した後、液体窒素温度で瞬時凍結して摂氏一 8 0 °Cで保存することが好ましい。

標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体における標識としては、検出可能なものであれば特に限定されないが、 ³² P， ³³ P , ³⁵ S , ¹⁴ C , ³Η等の放射性同位体を用いる放射性標識や、フルォレスセインイソチオシァネート，フィコピリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド，テトラメチルローダミンイソチオシァネート等を用いる蛍光標識や、アジド基，ベンゾフエノン等を用いる光親和基標識や、ペルォキシダ—ゼ，アルカリフォスファタ一ゼ等を用いる酵素標識などを挙げることができ、中でも放射性標識を特に好適に例示することができる。標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体におけるヌクレオシド三リン酸としては、 AT P， GT P, I TP, UT P， C T P等を例示することができるが、中でも AT Pを特に好適に例示することができる。また、ヌクレオシド三リン酸の誘導体、例えば、 ATPの誘導体としては、〔³⁵ S〕 AT P r S , ひ、 i3—メチレン AT P, 8—アジド A T P等を挙げることができる。

本発明におけるヌクレオシドニリン酸不動化物質としては、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜タンパク質との結合を維持する化学物質であれば特に制限されるものではなく、バナジン酸やその塩等を挙げることができる。バナジン酸塩としては、バナジン酸ナトリウム（オルトバナジン酸ナトリウム N a₃V〇₄, ピロパナジン酸ナトリウム N a ₄V ₂0₇，メ夕バナジン酸ナトリウム N a V0₃) , バナジン酸カリウム（オルトバナジン酸カリウム K₃V0₄，ピロバナジン酸力リゥム κ₄ν₂〇₇，メタバナジン酸カリウム κ vo₃) , バナジン酸カルシゥム (オルトバナジン酸カルシゥム C a 3 ( V〇,,) ₂, ピロバナジン酸カルシウム C a ₂V ₂0₇, メタバナジン酸カルシウム C a ( V 0₃) ₂) 等を例示することができる。

本発明において用いられるフィル夕一としては、未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過 ·分離しうるフィルタ一であれば特に制限されるものではないが、吸引濾過手段，遠心濾過手段，限外濾過手段等を備えているものが濾過 ·分離効率の点で好ましく、中でも底部にフィルタ一が内蔵されたプレートとフィルター下方に吸引濾過手段を備えたものが好ましく、例えば、底部にフィルタ一が内蔵されたマイクロプレート「ュニフィルタ」（N o .7 7 0 0 - 3 3 0 3、 Whatman

6 社製）、マルチスクリーンプレート（Multiscreen Plate； MILLIPORE社製）、サイレントスクリーンプレート（Silent Screen Plate； Nalge Nunc 社製）などを具体的に挙げることができる。

本発明の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法における被験物質としては、抗腫瘍剤等の薬剤の候補物質を好適に例示することができ、また、本発明の AB Cタンパク質のトランスポーター活性の測定方法における A B Cタンパク質の基質としては、 AB Cタンパク質が P糖タンパク質の場合、ベラパミル（ヮソラン），キニジン，ローダミン 1 2 3 , ドキソルビシン，ジゴキシン，ビンクリスチン，ビンブラスチン，ダウノルビシン, フォレート，コルチゾール，アルドステロン等の一部のステロイド等を挙げることができ、 AB Cタンパク質が MR P 2の場合、 ]3—エストラジオール一 1 7— ( β — Ό -ダルク口二ド），スルフォブロモフタレイン等を挙げることができる。

本発明の A B C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法 [ A B Cタンパク質のトランスボーター活性の測定方法] について、 A B C夕ンパク質が P糖夕ンパク質、標識されたヌクレオシド三リン酸が放射性標識 AT P _¾ ヌクレオシドニリン酸不動化物質がバナジン酸の場合について説明する。 P糖夕ンパク質が発現している膜画分と、放射性標識された AT Pと、バナジン酸と、被験物質 [P糖タンパク質の基質] とを T r i s — HC 1，リン酸緩衝液等の反応緩衝液中で反応させる。反応緩衝液の P Hは 6〜 8、特に ρ Η 7〜 7 · 5が好ましい。反応時間は 1 0秒〜 3時間、例えば 1〜 3 0分程度とすることが好ましい。反応は、例えば 0 に冷却した緩衝液を過剰量（例えば、反応液の 2 0〜 1 0 0倍量）反応液に加えて混合することにより停止させる。次いで、反応終了後の反応液を、例えば 9 6ゥエルグラスフィル夕一に添加して吸引洗浄を行う。洗浄液としては、緩衝液をあらかじめ 4 に氷冷したも

7 のを使用し、 1ゥエル当たり 5 0〜 5 0 0 /2 1、例えば 2 0 0 1の洗浄液で複数回吸引洗浄する。この吸引洗浄操作により、反応液中の未反応の ATP，バナジン酸，被験物質 [P糖タンパク質の基質] がフィル夕一により濾過 '分離され除去することができる。次に、膜画分が存する洗浄後のプレート 1ゥエル当たり 3 0〜： L O O 1、例えば 5 0 x l の液体シンチレーションカクテルを添加し、約 1時間プレートを室温で静置した後、液体シンチレーションやべ一夕一カウン夕一を用いて放射性標識を測定する。この測定値と被験物質 [P糖タンパク質の基質] 未添加の場合の測定値とを比較し、 P糖タンパク質のトランスポ一タ一活性が大きい場合は P糖タンパク質に対する基質であると判断し、 P糖夕ンパク質のトランスポーター活性が小さい場合は P糖タンパク質の阻害物質であると判断することができる。

[実施例]

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

(資材と材料）

9 6ウェルタイブのグラスフィル夕一を使用し、吸引洗浄法を用いて 1ステツプによる P糖夕ンパク質発現メンブレンへの [³H] AD P吸着量測定法の構築を試みた。 9 6ウェルタイブのグラスフィルタ一としては、 3 5 0 lュニフィルタ（N o. 7 7 0 0— 3 3 0 3、 Whatman 社製）を用いた。反応緩衝液 Aとしては、 0. 2 mM N a₃V0₄、 3 m M M g S 0₄、 2 mM Ouabain, 0. 1 mM ED TA、 0. 0 5 m M ATP、 40 mM T r i s - H C 1 ( H 7. 4 ) の組成のものを用いた。ラジオアイソトープとしては、 [³H] AT P (N E T - 4 2 0、 PerkinElmer life science社製）を用いた。 S f 9メンブレンとしては、ヒト P糖夕ンパク質（P g p o r MDR 1 ) 発現メンブレン (N o . 4 5 3 2 2 8、第一化学薬品社製）と S f 9コントロールメンプレン（N o. 4 5 3 2 0 0、第一化学薬品社製）を用いた。液体シンチレーシヨンカクテルとしては、 MicroScint (登録商標） 20 (N o . 6 0 1 3 6 2 1、 Packard Bi oSc i ence社製）を用いた。

(測定方法）

5 0 1 の上記反応緩衝液 Aに P糖夕ンパク質発現メンブレン 5 g を添加し、 3 7 °Cで 1分間のプレインキュベーションを行った。次に、被験物質 [P糖タンパク質の基質化合物]を上記反応液に添加し、 3 7でで一定時間（ 1〜 3 0分間）反応させた。反応終了後、上記反応液を 9 6ゥエルグラスフィルターに添加し、吸引洗浄を行った。反応緩衝液 A をあらかじめ 4 °Cに氷冷したものを洗浄液として使用し、 1ゥエル当たり 2 0 0 ." 1 の洗浄液で 5回吸引洗浄を行った。次に、洗浄後のプレート 1ゥエル当たり 5 0 // 1の液体シンチレ一ションカクテルを添加した _t 約 1 時間、プレートを室温で静置した後、パッカ一ド社製、 TOP COUNT(C990201/42637)を用いて R I活性を測定した。すべての実験は、基本的に N= 3で行った。

実施例 2 (経時変化検討)

P糖夕ンパク質発現メンブレン及び S f 9コントロールメンブレンを用いて、バナデート法による [³H] AD P結合量の経時変化を測定した ₍ 使用化合物（陽性対照）として、 P糖タンパク質の代表的基質として知られているベラパミルを使用した。ベラパミルの最終濃度は 5 0 /ζΜとした。結果を図 1に示す。図 1から、コントロールメンブレンにおいては [³H] AD Ρのメンブレンへの結合における経時変化は見られないが、 P糖夕ンパク質発現メンブレンにおいては、ベラパミル添加時において、 [³H] AD P結合量の上昇が経時的に観察されることがわかった。興味

9 深い点として、 P糖夕ンパク質発現メンブレンにベラパミルを未添加状態であっても、ベースラインが高くなるという若干の [³H] AD P結合活性が観察されることが明らかになった。この活性は、 P糖タンパク質の内因性の働きに依存した活性ではないかと考えられる。

実施例 3 (メンプレン使用量）

グラスフィルターを利用した吸引洗浄法では、 1ゥエル当たりの反応メンブレン量を自由に設定できる。そこで、至適反応メンブレン量を探るため、ゥエル当たりのメンブレン量を 3段階（ 5 z g、 2. 5 g > 1 g ) に振り、化合物としてべラバミルを用いて反応を行った。ベラパミルの添加濃度は、最終濃度 2 0 Mとした。結果を図 2に示す。図 2から、メンブレン使用量の増加に従い、検出域が広がることが明らかになった。そこで、今回の条件ではメンブレン使用量 5 ^ gが適当であると判断し、以下の実験に用いる P糖夕ンパク質発現メンプレンの使用量を、 1ゥエル当たり 5 si gに設定した。

実施例 4 (ベラパミルと P糖タンパクの基質親和性)

ベラパミルの P糖タンパク質に対する基質親和性（濃度依存性）を測定するため、 0〜 1 0 0 0 n Mの濃度のベラパミルを反応緩衝液 Aに添加し、 R I活性を測定した。結果を図 3に示す。図 3からもわかるように、約 3 0 0 nMという Km値が得られた。これは従来法である P糖夕ンパク質の A T P a s e活性測定時におけるベラパミルの Km値 1 7 n Mと比較して、約 2 0分の 1 という非常に低い値である。 AT P a s e 活性測定時では AT Pの P糖タンパク質に対する反応は競合的であるが. バナデート法においては、一旦反応した AT P (正確には AD P) はバナデートにより非競合的に結合してしまうため、見かけの Km値が低く見積もられるのではないかと考えた。この結果より、本発明によるアツセィ方法は、従来法である AT P a s e法と比較して、低濃度でアツセィが可能であると考えられる。

実施例 5 (P糖タンパク質の基質特異性）

ベラパミルの他、 1 3種類の化合物におけるバナデート法での [³H] AD P結合量の測定を行った。反応条件は、反応時間 5分、反応温度 3 7 °C, 基質添加濃度 0. 0 5 mMで行った。測定結果は、コントロールメンブレンのバックグラウンドを差し引いてある。結果を図 4に示す。図 4から、一般的に P糖タンパク質の基質と考えられているベラパミル Verapamil, キニジン Quinidine, ヒンフラスチン Vinbras t ine，ピンクリスチン Vincristine , ジゴキシン Digoxin, ローダミン 1 2 3 Rhodaminel23，ドクソルビシン Doxorubicin，ダウノルビシン Daunorubicin, メソ卜リキセ一卜 Methotrexate, フォレー卜 Folate において [³H] AD P結合活性の有意な上昇が観察された。興味深いことに、ブロモサルファレイン Bromosulfaleinにおいては、基質未添加の P 糖タンパク質発現膜による測定値（Substrate(- ))と比較して有意な [³ H] AD P結合活性の低下が観察されている。この低下分は実施例 2で検出された P糖夕ンパク質の内因性の働きを阻害した結果と考えられ、この測定値はコント口一ルメンブレンにおける測定値（Control) とほぼ同等である。プロモサルファレインは一般に P糖タンパク質の阻害剤と考えられている。よって、このアツセィ系を用いた化合物スクリ一ニングにより P糖タンパク質の基質（ァゴ二スト）になるか阻害剤（アンタゴニスト）となるかを同時に検出することができることが分かった。実施例 6 (洗浄法の検討）

測定のバックグラウンドを下げるための手段として、一般に有効と考えられるプレートの P VP (ポリビニルピロリドン）によるブロッキング法及び P B Sによる洗浄法を検討した。ベラパミルの最終濃度は 2 0 Mとした。 P VPによるブロッキング法は、具体的には洗浄用プレー

2 ト使用直前に、反応緩衝液 Aに P VPを 1 %溶解したブロッキング液を 1ゥエルあたり 2 0 0 2 1添加し、室温で 1時間放置した。その後、反応緩衝液 A 2 0 0 1で 1回洗浄後、使用した。また、 P B Sによる洗浄法は、 1ゥエルあたり 2 0 0 1添加し、 5回吸引洗浄を行った。結果を図 5に示す。この結果、両手法ともに、劇的な効果は得られなかつた。 P B Sによる洗浄に関しては、特異的な [³H] AD Pの結合をむしろ抑制する結果であった。測定のバックグラウンドの原因は、プレ一卜への吸着のみではなく、むしろメンブレンそのものへの内因性の結合の影響が大きいと考えられる。

実施例 7 (ヒト MR P 2発現 S f 9メンブレンの調製)

P C R法を用いて常法によりクロ一ニングを行ったヒト MR P 2をコ ―ドする c DNAを、バキュロウィルスベクター pFASTBac 1 (BAC-T0-BAC^R Bacu 1 ov i rus Express ion Systems (Invi t rogen, 10359-016))に組み込み、 S f 9細胞 (Sf9 Frozen Cel Is B825-0 K Invi t rogen社製）にリポフエクシヨン法によりトランスフエクシヨンした。卜ランスフエクションした細胞からバキュロウィルスを回収し、バキュロウィルスを更に S f 9 細胞に感染させることにより MR P 2夕ンパク質を発現する細胞を得た ₍ また、 MR P 2の発現をウェスタンブロット法によつて確認することにより得られた MR P 2発現 S ί 9細胞を無血清昆虫培地（ S F 9 0 0 I I 一 S FM、 Invitrogen社製）を用い、 2 7 °Cで 3 日間培養した。 MR P 2発現 S f 9細胞を遠心分離 ( 3 0 0 0 r p mで 1 0分) によつて集めた後、超音波処理（ソニケ一ター中で 1 0分間処理）によって破砕して、遠心分離（ 1 0 0 , 0 0 0 r pmで 3 0分）によってヒト MR P 2 発現 S f 9細胞膜画分を採取し、分離した膜画分を P B S緩衝液（p H 7. 4) 中に懸濁して、ショ糖濃度勾配遠心によって細胞膜画分を単離精製した。細胞膜画分のタンパク質濃度を測定した後、液体窒素温度で瞬時凍結して摂氏一 8 0 °Cで保存した。

実施例 8

MRP 2は、肝臓の胆管側に高発現し、多くの薬物を肝臓から大腸側へ排出するという、肝臓の解毒機構に重要な働きを持った AB C トランスポ一夕一の一種である。そこで、 9 6ウェルタイブのグラスフィルタ一を使用し、吸引洗浄法を用いて 1ステップによるヒト MR P 2発現メンブレンへの [³H] AD P吸着量測定法の構築を試みた。ヒト P糖タンパク質発現メンブレンに代えて実施例 7で調製したヒト MR P 2発現 S f 9メンブレンを用いる他は、実施例 1 と同様に測定した。 MR P 2に輸送されることが良く知られている代表的な化合物である β—エストラジオール— 1 7 - ( /3 _ D—ダルクロニド） β -Estradiol-17-( /3 - D- glucuronide)及びスルフォブロモフタレイン Sul fobromophthal ein添カロ時におけるバナデート法での [³H] AD P結合量の測定を行った。反応条件は、反応時間 5分、反応温度 3 7°C、基質添加濃度 0. I mMで行つた。結果を図 6に示す。図 6中、 Aは 3一エストラジオ一ル— 1 7 - ( β一 D—ダルクロニド）を、 Βはスルフォブロモフタレインを、 Cは基質無添加を表す。その結果、上記 2種類の化合物において、基質未添加の MR Ρ 2発現膜による測定値と比較して、有意な [³H] AD P結合活性の上昇が観察され、 MR P 2においても吸引洗浄法によるスクリ― ニングシステムの有用性が確認された。

産業上の利用可能性

本発明のグラスフィルターを用いた吸引洗浄法による条件検討の結果、バナデ一ト法による P糖タンパク質や MR P 2検出系の確立に成功した _c 得られた測定結果は、データ変動が小さく再現性も良好であるため、バナデート法の応用法である本方法は、 P糖タンパク質や MR P 2等の A B Cタンパク質の基質認識性測定において、非常に大きなメリットを有している。特に、国際公開第 0 2 / 0 5 2 2 6 2号パンフレットに開示される E L I S Aプレートを用いたバナデ一ト法と比較した場合の利点として、以下の 4点を挙げることができる。

1 . 1ゥエル当たりのメンブレン量を自由に増量できる。

2 . E L I S Aプレートへの膜結合ステップを省略できるため、製品の品質をコントロールしゃすく、コストも低下することが可能である。

3 . 従来法の A T P a s e法と比較して、少量の化合物量でアツセィが可能である。

4 . アツセィを行う化合物が、 A B C 卜ランスポーターへのァゴニストであるか、アンタゴニス卜であるかを、一度にアツセィ可能である。

Claims

請求の範囲

1. AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜タンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、被験物質とを接触させる工程と、前記膜タンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィル夕一により濾過して分離する工程と、フィル夕一上の標識及び Z又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とする A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。

2. フィルタ一により濾過して分離する工程が-. フィルタ一により吸引濾過及び Z又は遠心濾過して分離する工程であることを特徴とする請求項 1記載の AB Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法,

3. ヌクレオシドニリン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の AB C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法。

4. ヌクレオシド三リン酸が、 AT Pであることを特徴とする請求項 1 〜 3のいずれか記載の A B C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリ一エング方法。

5. 標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一二ング方法。

6. 放射性標識が、 ³²P, ³³P， ³⁵ S, "C又は ³ Hであることを特徴とする請求項 5記載の A B C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリ一ニング方法。

7. AB Cタンパク質が発現している膜画分が、 AB Cタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記載の A B C夕ンパク質と相互作用する物質のスクリ一二ング方法。

8. AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。

9. AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリ一二ング方法。

1 0. AB Cタンパク質が、 AB C Aサブファミリー， AB C Bサブファミリ一， A B C Cサブフアミリー， A B C Dサブファミリー， AB C Eサブフアミリー， A B C Fサブフアミリー又は A B C Gサブフアミリ —に属するヒト AB Cタンパク質であることを特徴とする請求項 1〜 9 のいずれか記載の A B Cタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法。

1 1. AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド≡リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体を濾過 ·分離しうるフィルターとを有することを特徴とする A B Cタンパク質のトランスポー夕 —活性測定用キット。

1 2. 濾過 ·分離しうるフィルターが、吸引濾過及び Z又は遠心濾過手段を備えていることを有することを特徴とする請求項 1 1記載の AB C タンパク質のトランスポ一夕一活性測定用キット。

1 3. ヌクレオシドニリン酸不動化物質が、バナジン酸であることを特徴とする請求項 1 1又は 1 2記載の AB Cタンパク質のトランスポー夕一活性測定用キット。

1 4. ヌクレオシド三リン酸が、 AT Pであることを特徴とする請求項 1 1〜 1 3のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

1 5. 標識が、放射性標識，蛍光標識又は光親和基標識であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 4のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

1 6. 放射性標識が、 ³²P， ³³P, ³⁵ S , ¹⁴C又は³ Ηである ζとを特徴とする請求項 1 5記載の AB Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

1 7. A B Cタンパク質が発現している膜画分が、 A B Cタンパク質が発現している哺乳類又は昆虫の細胞膜画分であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 6のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

1 8. AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質に対する基質であることを特徴とする請求項 1 1〜1 7のいずれか記載の A

B Cタンパク質のトランスポー夕一活性測定用キット。

1 9. AB Cタンパク質と相互作用する物質が、 AB Cタンパク質の阻害物質であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の A B Cタンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

2 0. AB Cタンパク質が、 AB C Aサブファミリ一， AB C Bサブフアミリー， AB C Cサブファミリー， AB CDサブファミリー， AB C Eサブファミリ一， AB C Fサブファミリ一又は AB C Gサブファミリ一に属するヒト AB Cタンパク質であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 9のいずれか記載の AB C夕ンパク質のトランスポーター活性測定用キット。

2 1. AB C (ATP Binding Cassette) タンパク質が発現している膜画分と、標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体と、ヌクレオシド三リン酸又はその誘導体のリン酸イオンと置換してヌクレオシドニリン酸と複合体を形成し、ヌクレオシドニリン酸と膜夕ンパク質との結合を維持するヌクレオシドニリン酸不動化物質と、 AB Cタンパク質の基質とを接触させる工程と、前記膜夕ンパク質が発現している膜画分を洗浄液で洗浄し、少なくとも未反応の標識されたヌクレオシド三リン酸又はその誘導体をフィルタ一により濾過して分離する工程と、フィルター上の標識及び/又は濾液中の標識を測定する工程とを有することを特徴とする AB Cタンパク質のトランスポーター活性の測定方法。