KR20220124646A

KR20220124646A - 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 변이주의 중화항체 검출용 조성물 및 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20220124646A
Application number: KR1020220026713A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 윤선우; 이규선; 송대섭
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2022-09-14

Abstract

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 및 이의 변이주의 중화항체 검출용 조성물, 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트, 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공 방법 관련 기술에 관한 것이다.
본 발명에 따른 중화항체 검출용 조성물은 안정한 형태의 단백질 구조를 이용하며 SARS-CoV-2에 감염된 환자와 백신 접종 환자의 혈청에서 중화항체를 우수한 민감도로 검출하는 점에서 효과적이며 바이러스 감염에 대한 위험도를 포함하여 중화 효능을 평가하는데 효과가 있다

Description

제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 변이주의 중화항체 검출용 조성물 및 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트 {COMPOSITION FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODY AGAINST SARS-COV2 VARIANTS, DECTECTION METHOD AND KIT COMPRISING THEREOF}

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 및 이의 변이주(예를 들어, 알파(B.1.1.7), 베타(B1.351), 감마(P1), 델타(B.1.617.2), 오미크론(B.1.1.529))의 중화항체 검출용 조성물, 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트, 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술이다.

SARS-CoV-2는 새로 발견된 단일 가닥 RNA의 신종 베타코로나 바이러스로 2020년 1월 국제바이러스 분류 위원회에서 SARS-CoV-2라 명명하였다. 이러한 SARS-CoV-2의 감염경로는 아직 명확하게 규명되지 않았으나, 일부 연구에 따르면 박쥐로부터 사람에게 감염되는 것으로 보고되고 있다.

SARS-CoV-2의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30kb로 10개의 단백질을 암호화(encoding)하고 있다. 10개의 단백질은 한 개의 복제 다단백질(open reading frames 1ab), 4개의 구조 단백질 (spike, envelope, membrane and nucleocapsid), 5개의 비구조단백질(open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10)로 구성되어 있다.

SARS-CoV-2의 감염에 의해 발병하는 COVID-19로 인해 세계적으로 많은 감염자와 사망자가 속출하고 있으며, 현재 백신과 치료제의 개발을 통해 COVID-19를 억제하기 위한 노력이 이뤄지고 있다. 세계 보건기구(WHO)는 전 세계적으로 임상 평가를 받고 있는 여러 개의 COVID-19 백신 후보를 나열했으며, 글로벌 관점에서 전임상 개발 단계에는 훨씬 더 많은 COVID-19 백신 후보가 있을 것으로 보인다.

백신 접종에 의한 면역 반응은 혈액 (세포 면역 반응)과 혈청 (체액 면역 반응)에서 일반적으로 측정된다. 세포 매개 면역 반응은 림프구 집단의 하위 집합의 수를 정량화 (예: CD4 및 CD8 수준의 유세포 분석) 및 기능 분석 (예: 인터페론-감마 방출 분석)으로 측정된다. 체액성 면역 반응은 면역 분석 (예: ELISA를 사용하여 IgM 및 IgG 항체 수준 또는 역가 정량화) 및 기능 분석 (예: 중화항체 생물학적 분석)으로 측정된다.

SARS-CoV-2의 면역 진단을 위해 혈장 또는 혈청을 사용하는 IgA, IgM 및 IgG 항체 ELISA 분석은 최근 또는 이전 감염을 나타내는 SARS-CoV-2에 대한 적응 면역 반응을 가진 개인을 식별하는데 도움이 된다. 감염 초기 단계에서 증상 발생 후 약 5~7일 동안 IgM 항체가 일반적으로 검출된다. IgG 항체는 감염의 활성 및 후기 단계 중에 또는 재발된 감염 중에 검출된다. 적은 비율의 항체는 숙주 단백질과 상호 작용하는 바이러스의 부위에 결합하여 이를 막아서 해당 바이러스가 숙주로 들어가는 것을 억제한다. 이들은 중화항체로 알려져 있다. 중화항체의 코로나 바이러스에서의 주요 표적은 바이러스 막에 고정화된 삼중합체 당단백질인 스파이크(S) 단백질이다. 강력한 중화항체는 종종 S1(N말단도메인과 리셉터 결합도메인 부위)의 수용체 상호 작용 부위를 표적으로 삼아 숙주 수용체 상호 작용을 억제하고 바이러스가 세포로 들어가는 것을 막는다.

최근 전 세계적으로 영국과 남아프리카공화국의 변이 바이러스가 빨리 전파되는 이유와 이들을 기존 백신으로 무력화할 수 있는지 여부에 대하여 관심을 가지고 있다. 이에 SARS-CoV-2의 세포 및 동물모델을 이용하여 바이러스의 변이주와 변이요소(constituent mutation)를 탐지한 다음, 백신과 자연감염에 의해 촉발된 항체에 대한 반응을 테스트하는 가운데, 최초의 분석결과들이 조금씩 나오고 있다.

전 세계적으로 가장 우려되는 변이 바이러스는 영국에서 최초 발견된 'B.1.1.7'과 남아공에서 처음 보고된 'B.1.351', 또한 우리나라를 포함해 브라질 등에서 발견된 'P.1'로 정리된다.

영국인 전체를 대상으로 실시된 COVID-19 유전체학 연구에서, 영국의 남동부와 런던에서 급증하고 있는 감염사례의 주범은 B.1.1.7이라는 변이주인 것으로 확인되었으며, 그 변이주는 현재 영국의 다른 지역으로 확산되었고 다른 나라에서도 탐지되었다. 영국에서 B.1.1.7의 확산을 연구하는 역학자들의 추정에 따르면, B.1.1.7은 기존에 유행하는 바이러스보다 전파력(transmissibility)이 약 50% 높다고 한다.

한편, 많은 연구자들은 'B.1.1.7' 및 'B.1.351' 두 가지 변이주가 공유하는 '스파이크 단백질의 변화'에 초점을 맞추고 있는데, 이는 N501Y이며, 이러한 변이는 수용체결합영역(RBD: receptor binding domain)을 변형시키는데, RBD는 인간의 단백질에 달라붙어 감염을 허용하는 역할을 한다.

N501Y의 주요 변이로는 알파, 베타, 감마, 델타, 오미크론이 있으며, 이들 모두는 스파이크 단백질(Spike protein, S 단백질) 내 숙주세포와 결합하는 부위(Receptor binding domian, RBD)의 아미노산 치환에 의한 전파력, 병원성, 면역회피 등의 바이러스 특성 변화가 있는 것으로 확인되었다. 이 중 델타 변이는 인도에서 처음 발생된 이후 전 세계적으로 유행하고 있다. 이러한 델타 변이의 높은 전파력으로는 감염자의 감염 초기 바이러스 양이 기존 코로나19 바이러스 감염자보다 높기 때문이라는 분석결과들이 발표되고 있으며, 특히 이러한 델타 변이 특성에 따른 무증상 감염자로부터의 바이러스 전파가 확산의 원인으로 보고되고 있다.

최근 유행하고 있는 오미크론 변이 바이러스는 2021년 11월 24일 남아프리카 공화국에서 WHO에 처음 보고하였다. 2021년 11월 26일 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 바이러스진화 기술자문그룹(Technical Advisory Group on Virus Evolution, TAG-VE)의 긴급회의를 통해 B.1.1.529 계통의 코로나19 변이 바이러스의 특성을 평가하고, 「오미크론」이라 명명하며 주요 변이 바이러스(Variants of Concern, VOC)로 분류하였다. 남아프리카공화국은 11월 1, 2주 평균 약 270명이었던 확진자가 11월 24일 1,275명, 25일 2,465명 발생하는 등 몇 주간 급격히 증가하며 오미크론이 확인되었는데, 11월 9일 남아공에서 수집된 표본에서 최초 확인되었다. 11월 30일까지 코로나19 바이러스 유전자정보 공유 데이터베이스인 GISAID(Global Initiative on Sharing All Influenza Data)에 등록된 유전자정보를 기반으로 분석한 남아공의 오미크론 변이 바이러스의 점유율은 1주간 50.1% 증가하였으나, 델타는 7주간 48.6% 증가하는 양상을 보여, 델타 변이 바이러스보다 전파속도가 더 빠를 것으로 추정되었다. 오미크론은 11월 30일까지 남아프리카 공화국, 보츠와나, 네덜란드, 홍콩, 포르투갈, 영국, 호주 등 18개국 203건의 발생사례가 확인되며 전 세계로 확산되는 양상을 보이고 있다.

오미크론은 많은 아미노산 변이를 지니고 있어, 오미크론 변이 여부를 확인하기 위해서는 전장유전체 분석 또는 S 단백질을 타겟으로 하는 타겟유전체 분석을 실시해야 하고, 시퀀싱을 위해서는 검체 내에 충분한 양의 바이러스가 존재해야만 분석이 가능하다.

현재 WHO가 오미크론을 긴급하게 주요 변이로 지정한 만큼, 세계 각국에서도 오미크론의 위험도가 델타 등 다른 변이 바이러스보다 낮지 않을 것으로 평가하고 있다. 또한, 오미크론이 전 세계로 급속히 확산되고 있기 때문에 아프리카 외 다른 국가에서도 국내로 유입될 가능성이 높은 상황이다.

오미크론 변이 바이러스는 GR형, B.1.1.529 계통으로 기존 변이 바이러스보다 많은 변이가 확인되는데, 특히 스파이크(S) 단백질에서 약 32개의 아미노산 변이가 확인되고 있다. 특히 S 단백질 중 수용체 결합부위(Receptor binding domain, RBD)에 15개의 아미노산 변이가 존재하여, 알파 1개, 베타 3개, 감마 3개, 델타 2개보다 훨씬 많은 변이를 지니고 있다. 이는 기존 변이 바이러스 보다 S 단백질의 변이가 단백질 구조와 항원성에 변화를 줄 가능성이 크다는 것을 의미하며 알파, 베타, 감마, 델타에서 확인되는 주요 아미노산 변이 부위와 동일한 위치의 K417N, T478K, E484A, N501Y, D614G 변이가 존재하여 전파력 증가 및 면역 회피 가능성이 있을 것으로 추정되고 있다.

본 연구자들은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스의 변이주 바이러스의 스파이크(Spike) 영역의 Receptor binding domain(RBD)에서의 변이 서열들을 이용하여 신규의 RBD 서열을 제조하고 이를 이용하여 기존의 중화항체 분석법(PRNT 법, CPE법)을 대체하는 신규의 중화항체 평가를 위한 조성물을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (ⅰ) 표지물질과 접합(Conjugation)된, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (ⅰ) 표지물질과 접합(Conjugation)된, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 시료 분석을 위하여, (ⅰ) 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질과 (ⅱ)의 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 스파이크 단백질 특이적 결합 단편간의 상호작용 수준을 결정하는 단계;를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) 시료를 표지물질과 접합(Conjugation)된 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 인큐베이션하는 단계;

b) 단계 a)의 혼합물을 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편과 혼합하는 단계; 및

c) 표지물질의 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출용 조성물, 키트 또는 검출 방법을 이용하여 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

하기에서는 중복되는 내용의 혼잡을 방지하기 위하여, 중복되는 내용의 기재를 생략하고자 한다. 즉, 하기의 내용만으로 발명의 내용이 한정되는 것은 아니고, 전체적인 발명의 내용에 따라 발명의 내용이 해석되어야 할 것이다.

본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 및 이의 변이주(예를 들어, 알파(B.1.1.7), 베타(B1.351), 감마(P1), 델타(B.1.617.2), 오미크론(B.1.1.529) 등)의 감염에 대한 중화항체 및 중화능을 검출하기 위한 검출용 조성물, 이를 포함하는 중화항체 검출 방법 및 키트, 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, (ⅰ) 표지물질과 접합(Conjugation)된, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 ACE2 단백질, 인간 ACE2 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 '중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)'는 단일 가닥 RNA 코로나바이러스로서, 인간에게 점염성이 있고, 코로나바이러스감염증-19의 원인 바이러스이다. 이 바이러스는 막 바깥표면에 돌기형태의 단백질(스파이크 단백질)이 촘촘히 달려있는데, 이 스파이크 단백질은 숙주세포의 ACE2 수용체에 결합하여 바이러스가 숙주세포로 빠르게 침투하도록 지지해준다. 이 스파이크단백질이 숙주의 특이성, 선택성, 감염성을 결정한다.

본 발명의 용어 'RBD(Receptor-Binding Domain)'는 바이러스가 숙주 세포의 수용체와 결합하는 영역으로, 스파이크 단백질의 S1 서브유닛에 존재한다. 본 발명에서 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain)는 안지오텐신 전환효소 2 수용체와 결합하는 부분으로 이용되었다. RBD는 차례로 ACE2와 접촉하는 RBD 영역인 수용체 결합 모티프(RBM)를 포함한다.

본 발명의 용어 '안지오텐신 전환효소 2(ACE2)'는 메탈로카복시펩티다제 (metallo-carboxypeptidase)의 하나로, 안지오텐신 전환효소와 상동하는 1형 막관통 단백질이며, 진핵생물과 세균에서 발견할 수 있다. 안지오텐신 전환효소 2는 체내 수분과 혈압을 조절하는 레닌-안지오텐신-알도스테론계 (RAAS)에서 중요한 역할을 담당하며, 사람의 혀, 호흡기, 장내 상피세포막에 다량 존재한다. ACE2는 스파이크 단백질, 특히 본 발명에서 선택되는 RBD 영역과의 상호작용을 통해 SARS-CoV-2에 대한 세포로의 진입점을 제공한다. 즉, ACE2는 SARS-CoV-2의 핵심 세포 진입 수용체로 볼 수 있다.

본 발명에 있어서 "특이적 결합"은 관련 분자에 대해 선택적이고, 비특이적 결합과 구별될 수 있는 상호작용을 지칭한다. 주어진 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 바람직하게는 폴리펩타이드가 특이적으로 결합하지 않는 다른 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로 및/또는 더 긴 지속시간으로 분자에 결합한다.

본 발명에 따른 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체;를 포함한다.

본 발명에서는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 구조 예측에 기반을 둔 단백질 구조 분석을 통해 RBD 단백질의 구조를 분석하였다. 이를 통해 스파이크 단백질 전장 서열의 아미노산 서열 323 내지 532을 선택하였다. 이러한 선택된 RBD의 아미노산 서열은 다른 영역과 대비하여 구조적 안정성이 매우 우수할 뿐만 아니라 중화항체 검출에 적합한 효능을 나타낼 수 있는 서열 부위로 확인되었다.

이에, 본 발명에서는, pcDNA3.4 벡터를 변형시켜 제작한 modified pcDNA3.4 벡터를 BamHI과 XhoI 제한효소를 이용하여 자른 후, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10 또는 12로 표시되는 염기서열을 PCR로 증폭한 절편을 삽입하여 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 발현 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터를 제작하였다. 위 재조합 벡터를 통해 제조된 각각의 아미노산 서열은 각각 서열번호 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타내었다.

또한, 본 발명에서는, pcDNA3.4 벡터를 변형시켜 제작한 modified pcDNA3.4 벡터를 NheI과 XhoI 제한효소를 이용하여 자른 후, 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 PCR로 증폭한 절편을 삽입하여 hACE2 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터를 제작하였다. 위 재조합 벡터를 통해 제조된 아미노산 서열은 서열번호 16에 나타내었다.

본 개시내용의 폴리펩티드는 추가로 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 발현, 폴딩, 트래피킹, 프로세싱 또는 정제를 용이하게 하는 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 임의로 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 His, (예를 들어, 6xHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E, 또는 비오틴 태그를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용의 폴리펩티드는 신호 펩티드(리더 서열 또는 신호 서열로도 알려짐)를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 일반적으로 단일 알파 나선을 형성하는 5-30개의 소수성 아미노산 서열로 구성된다. 세포 표면에서 발현되는 분비 단백질 및 단백질은 종종 신호 펩티드를 포함한다.

시그널 펩타이드는 폴리펩타이드의 N-말단에 존재할 수 있으며, 새로 합성된 폴리펩타이드에 존재할 수 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드의 효율적인 트래피킹 및 분비를 제공한다. 신호 펩티드는 종종 절단에 의해 제거되고, 따라서 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 분비되는 성숙한 폴리펩티드에 포함되지 않는다.

신호 펩타이드는 많은 단백질에 대해 알려져 있으며 GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, Protein Information Resource, Protein Data Bank, Ensembl 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되어 있으며, 예를 들어 아미노산을 사용하여 식별/예측할 수 있다.

이에 본 발명의 실시예들에서 서열들은 위 신호서열 및 His-tag 등의 서열을 추가로 포함할 수 있다.

특히, 인간 ACE2 단백질, 인간 ACE2 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편에 대해서는 C-term에 His-tag를 포함하여 플레이트 쪽으로 고정화되어 N-term이 up되는 orientation을 가질 수 있다. 이러할 경우 RBD와 결합능을 증진시킬 수 있다는 점에서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 폴리펩티드의 생산 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 잔기의 명명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전장 서열을 기초로 하여 언급되는 것을 기초로 한다. 이러한 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질의 전장 서열을 서열번호 1에 나타내었다.

본 발명에 따른 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 있어서 상기 서열은 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 리셉터 결합 도메인 단백질의 단편은 323 내지 532번째 아미노산 서열을 가지며, 이러한 서열을 서열번호 18에 나타내었다.

상기 변이체는 앞서 언급된 위 서열 범주 내에서의 추가적인 변이를 포함하는 것이다.

특히, 알파(B.1.1.7), 베타(B1.351), 감마(P1), 델타(B.1.617.2), 오미크론(B.1.1.529) 등에서 나타나는 특징적인 아미노산 변이를 포함하는 것일 수 있다.

뿐만 아니라 이의 아미노산이 보존적 치환에 의하여 치환된 폴리펩타이드, 이와 80 내지 99%, 85 내지 99%, 바람직하게는 90 내지 99%의 서열 상동성을 갖는, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다. 또한 상응하는 폴리뉴클레오타이드에 대해서도 동일하게 적용된다.

"퍼센트(%) 서열 상동성"은 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의한다. 퍼센트 아미노산 상동성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 참고문헌[Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 외, eds., 1987)]에 기재된 방법, 및 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN) 또는 메갈라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

이에, 본 발명의 'SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체'는, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 것일 수 있다. 즉, 위 N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 RBD 알파 변이체의 특징인 N501Y를 포함하는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RBD 알파 변이체 또는 이의 단편은 적어도 서열번호 20과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

이에, 본 발명의 'SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체'는, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 417번 위치의 리신을 아스파라진으로, 484번 위치의 글루탐산을 리신으로, 그리고 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 것일 수 있다. 즉, 위 K417N/E484K/N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, K417N/E484K/N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 RBD 베타 변이체의 특징인 K417N/E484K/N501Y를 포함하는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RBD 베타 변이체 또는 이의 단편은 적어도 서열번호 22와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

이에, 본 발명의 'SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체'는, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 417번 위치의 리신을 트레오닌으로, 484번 위치의 글루탐산을 리신으로, 그리고 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 것일 수 있다. 즉, 위 K417T/E484K/N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, K417T/E484K/N501Y 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 RBD 감마 변이체의 특징인 K417T/E484K/N501Y를 포함하는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RBD 감마 변이체 또는 이의 단편은 적어도 서열번호 24와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

이에, 본 발명의 'SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체'는, 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 452번 위치의 루신을 아르기닌으로, 478번 위치의 트레오닌을 리신으로 치환한 것일 수 있다. 즉, 위 L452R/T478K 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, L452R/T478K 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 RBD 델타 변이체의 특징인 L452R/T478K를 포함하는 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RBD 델타 변이체 또는 이의 단편은 적어도 서열번호 26과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

이에, 본 발명의 'SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체'는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 339번 위치의 글라이신을 아스파르탐산으로, 371번 위치의 세린을 류신으로, 373번 위치의 세린을 프롤린으로, 375번 위치의 세린을 페닐알라닌으로, 417번 위치의 리신을 아스파라진으로, 440번 위치의 아스파라진을 리신으로, 446번 위치의 글라이신을 세린으로, 477번 위치의 세린을 아스파라진으로, 478번 위치의 트레오닌을 리신으로, 484번 위치의 글루탐산을 알라닌으로, 493번 위치의 글루타민을 리신으로, 496번 위치의 글라이신을 세린으로, 498번 위치의 글루타민을 아르기닌으로, 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로, 그리고 505번 위치의 타이로신을 히스티딘으로 치환한 것일 수 있다.

즉, 위 G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493K, G496S, Q498R, N501Y 및 Y505H로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, G339D/S371L/S373P/S375F/K417N/N440K/G446S/S477N/T478K/E484A/Q493K/G496S/Q498R/N501Y/Y505H 변이를 필수적으로 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 280 내지 570, 보다 바람직하게 290 내지 560, 보다 더 바람직하게 300 내지 550, 보다 더 바람직하게 310 내지 540번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2 RBD 오미크론 변이체의 특징인 G339D/S371L/S373P/S375F/K417N/N440K/G446S/S477N/T478K/E484A/Q493K/G496S/Q498R/N501Y/Y505H를 포함하는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RBD 오미크론 변이체 또는 이의 단편은 적어도 서열번호 28과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체로써 상기 언급된 서열번호 18, 20, 22, 24, 26 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

이러한 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체를 코딩하는 서열은 서열번호 17, 19, 21, 23, 25 및 27에 각각 나타내었다.

상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 N501Y, K417N/E484K/N501Y, K417N/E484K/N501Y, L452R/T478K, 및G339D/S371L/S373P/S375F/K417N/N440K/G446S/S477N/T478K/E484A/Q493K/G496S/Q498R/N501Y/Y505H로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 야생형 SARS-CoV-2, 알파 변이체 B.1.1.7; 베타 변이체 B1.351; 감마 변이체 P1; 델타 변이체 B.1.617.2; 및 오미크론 변이체 B.1.1.529로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 중화항체 검출을 위한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 인간 ACE2 단백질, 인간 ACE2 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함한다.

인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질의 전장 서열은 서열번호 14에 나타내었다. 본 발명에 따른 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질은 서열번호 14 서열 중 16 내지 740번째 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 14의 아미노산 서열의 1 내지 800, 보다 바람직하게 10 내지 780, 보다 더 바람직하게 15 내지 770번째 아미노산일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질의 단편은 16 내지 740번째 아미노산 서열을 가지며, 이러한 서열을 서열번호 30에 나타내었다. 이러한 상기 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질을 코딩하는 서열은 서열번호 29에 나타내었다.

일부 실시양태에서, hACE2 단백질 또는 단편은 적어도 서열번호 30과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

상기 서열번호 30에 대하여 C-말단에 His-tag를 더 포함하는 것일 수 있다.

RBD 영역은 또한 ACE2의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 바, 본 발명에 따른 조성물은 인간 ACE2 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편을 포함할 수도 있다.

제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체;는 표지 물질에 결합(conjugated)될 수 있다.

본 발명의 표지물질은, 면역형광, 방사성 표지, 면역 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 유동 세포 분석법, 면역침전, 면역조직화학, 바이오필름 시험, 핀화도 환 시험, 항체 어레이 광학 밀도 시험 및 화학발광으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 검출 방법에 이용하기 위한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 sVNT(surrogate virus neutralization test), 보다 바람직하게는 ELISA법에 이용하기 위한 것일 수 있다.

sVNT는 바이러스 스파이크 단백질의 RBD 부위와 인간세포 수용체인 ACE2 단백질을 환자 혈청과 혼합한 후, 혈청 내 중화항체로 인한 이들의 결합을 방해하는 정도로 중화항체를 정량화하는 방식이다. 기존 방법은 세포실험이 필요하여 시간이 길게(3일) 소요되거나 생물안전 등급이 높은 시설에서 측정해야 했으나, sVNT는 비교적 짧은(3시간 이내) 시간에 간편하고, 신속하게 측정 가능하다는 점에 우수한 장점을 가진다.

본 발명에 따른 ELISA 검출법에 있어서, 바람직한 표지물질은 비오틴, 디곡시게닌, 압타머 (aptamer), 펩타이드(peptide), 형광 화합물 (fluorescent compound), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리사카라이드 (polysaccharides)으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지물질을 인지할 수 있는 물질은 예를 들어, 아비딘 또는 아비딘 유사체, 항체 (예를 들어, 항-비오틴 항체, 항-디곡시게닌 항체), 수용체, 렉틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

위 표지 물질과 이의 쌍을 기반으로 하여 검출가능한 시그날을 생산하는 효소 및 이의 기질을 통해 발색 등이 이루어질 수 있다.

예를 들어, 상기 효소는 호스래디쉬 과산화수소 (horseradish peroxidase), 알칼린 포스파타제 또는 β-갈락토시다제이다.

상기 효소에 대한 기질은 예를 들어, 호스래디쉬 과산화수소 (horseradish peroxidase)에 대하여 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), 2,2' -azino-di-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid] (ABTS), o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD), 3,3'-diaminobenzidine (DAB), Luminol 등이 사용될 수 있으며, 알칼린 포스파타제에 대하여 p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt (PNPP) 등이 사용될 수 있으며, β-갈락토시다제에 대하여 Chlorophenol red-B-D galactopyrano (CPRG), O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG), 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside (X-Gal) 등이 사용될 수 있다.

바람직하게, 아비딘 또는 아비딘 유사체를 처리하여 표지물질을 인지할 수 있는 물질을 제공하고, 이에 검출 가능한 시그날을 생산하는 효소 및 기질을 처리하는 것일 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 아비딘 유사체에 반응 가능한 호스래디쉬 과산화수소가 처리되고 이에 적용 가능한 기질, 예를 들어 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘 (TMB), 2,2' -아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산] (ABTS), o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (OPD), 3,3'-디아미노벤즈이딘 (DAB), 루미놀 등이 사용될 수 있으며, 알칼린 포스파타제에 대하여 p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt (PNPP) 등을 처리하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 표지 물질로써 비오틴이 사용될 수 있으며, 이에 아비딘 또는 아비딘 유사체의 호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트를 처리하고, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 통해 발색 정보 및/또는 형광 발색 변화 정보를 제공할 수 있다. 여기서 아비딘 유사체는 예를 들어 아비딘 유사체는 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 또는 캡타비딘(captavidin)일 수 있다.

즉, 보다 구체적으로 표지물질로 비오틴에 대하여 스트렙타비딘(streptavidin)-호스래디쉬 과산화수소 컨쥬게이트를 처리하고 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)를 통해 발색 정보 및/또는 형광 발색 변화 정보를 확인한다.

상기 조성물을 통하여 본 발명에서는 중화항체의 유무, SARS-CoV의 감염 진행 정도, 이전의 감염 유무 등에 대한 구체적 정보를 제공할 수 있다. 특히, 다양한 변이에 대한 중화항체 여부를 개별적으로 확인하도록 정보를 제공할 수 있는바, 유행성을 나타내는 다양한 변이들에 대한 항체 보유 유무, 바이러스 감염 위험도 등에 대한 구체적 정보를 제공할 수 있다.

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, (ⅰ) 표지물질과 접합(Conjugation)된, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 키트를 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는, 담체, 세정버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 및 사용법을 교시하는 설명서 중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 필요에 따라 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다.

고체 지지체는 폴리펩티드가 쉽게 고정될 수 있고(예를 들어 흡착 또는 접합에 의해) 항체 함유 샘플, 예를 들어 본 개시내용에 따른 혈청 샘플과 같은 혈액 유래 샘플의 분석에 적합한 임의의 고체 지지체일 수 있다. 이러한 키트 및 조성물에 사용하기에 적합한 고체 지지체는 당업자에게 잘 알려져 있다.

일부 실시양태에서, 고체 지지체는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 시클로-올레핀, 유리 또는 석영을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 미세역가(또는 "멀티웰") 플레이트 또는 마이크로어레이 플레이트일 수 있다. 일부 실시예에서, 고체 지지체는 비드, 예를 들어 자기 비드일 수 있다.

본 개시내용에 따른 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 본 개시내용에 따른 고체 지지체 상에 고정화(또는 '코팅')될 수 있다. 폴리펩티드는 고체 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정될 수 있다.

예를 들어, 폴리펩티드가 고체 지지체의 표면에 흡착되도록 하기에 적합한 조건 및 충분한 시간 동안 완충 용액 중의 폴리펩티드 용액을 적용함으로써 폴리펩티드를 고체 지지체 상에 고정화할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 예를 들어 공유 결합을 통해 고체 지지체에 접합될 수 있다.

바람직하게는, 대상은 포유동물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간일 수 있다.

또한 Sars-Cov2에 감염된 것으로 의심되거나 Sars-Cov2감염으로 인한 질병이 있는 것으로 의심되는 인간 일 수 있다. 또한, 이전에 Sars-Cov2에 감염된 적이 있는 것으로 의심되거나 이전에 Sars-Cov2 의한 감염으로 인한 질병이 있었던 것으로 의심되는 인간 일 수 있다.

본 발명의 시료는, 혈액, 림프, 타액 또는 활액일 수 있다.

본 발명의 이해를 위하여, 본 발명에 따른 중화항체 반응의 모식도를 도 1에 나타냈다.

예를 들어, 고체 지지체 상에 고정된 hACE2에 대하여 표지물질이 접합된 RBD를 처리하는 경우, 중화항체 유무에 따라 시그날의 발생 여부가 달라지게 된다. 중화항체가 존재하는 경우, 중화항체에 의하여 hACE2와 RBD 간의 결합이 저해되어 시그날 생산이 이루어지지 않게 된다. 반면, 중화항체가 존재하지 않는 경우에 hACE2와 RBD 간의 결합이 이루어지고 이에 따라 시그널 발생이 증가하게 된다.

샘플에서 중화항체의 감지는 바이러스에 대한 진행 중이거나 이전의 감염을 나타낼 수 있다. 샘플에서 중화항체의 존재 검출은 진행 중이거나 이전의 면역 반응, 특히 체액성 면역 반응을 나타낼 수 있다. 따라서, 대상체가 감염되었거나 감염되었는지 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 또한 대상체가 면역 반응(예: 체액성 면역 반응)을 탑재하거나 또는 탑재했는지 여부를 결정하도록 정보를 제공할 수 있다. 또한, COVID-19에 의한 감염에 의해 유발된 질병의 진단을 위해 사용될 수도 있다.

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 시료 분석을 위하여, (ⅰ) 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질과 (ⅱ)의 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 스파이크 단백질 특이적 결합 단편간의 상호작용 수준을 결정하는 단계;를 포함하되,

상기 (ⅰ)의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체는 표지물질에 접합되고, 상기 (ⅱ)의 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 스파이크 단백질 특이적 결합 단편은 고체 지지체 상에 고정되는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법을 제공한다.

즉, 구체적으로 본 발명은 숙주세포를 모방하는 시스템을 채택하였으며, 유리한 RBD 결합을 유도하기 위하여 RBD보다 3배가량 사이즈가 큰 hACE2를 플레이트에 고정하는 방식을 채택하였다.

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 a) 시료를 표지물질과 접합(Conjugation)된 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 인큐베이션하는 단계;

c) 표지물질의 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 중화항체 검출을 위한 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 또는 이의 변이체이며, 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 변이체는, 알파 변이체 B.1.1.7; 베타 변이체 B1.351; 감마 변이체 P1; 델타 변이체 B.1.617.2; 및 오미크론 변이체 B.1.1.529로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

위와 같이, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, a) 시료를 표지물질과 접합(Conjugation)된 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 인큐베이션하는 단계;

b) 단계 a)의 혼합물을 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편과 혼합하는 단계;

c) 표지물질의 신호를 검출하는 단계; 및

d) 신호의 존재는 시료 속에 중화항체가 존재하는 것으로 판정하고, 신호의 부재는 시료 속에 중화항체가 존재하지 않는 것으로 판정하는 단계;를 포함함으로써, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예를 통해, 본 발명의 기술이 표준중화항체(Nb20과 4G6)를 이용하여 분석값을 보정할 수 있는 장점이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 키트를 통해 변이 바이러스는 물론 백신 종류별 중화항체의 검출에도 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편은 안정한 형태의 단백질 구조를 가지며, SARS-CoV-2에 감염된 환자와 백신 접종 환자의 혈청에서 중화항체를 우수한 민감도로 검출하는 효과가 있다.

또한, 백터에 삽입되는 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 서열을 최적화함으로써 절감된 생산 단가의 중화항체의 검출용 키트를 효율적으로 생산할 수 있다.

본 발명에서는 많은 시간을 요구하며, 대량 검사에 어려운 기존의 중화 분석을 간편하게 진행할 수 있으며, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 및 변이주의 극도의 감염성을 고려할 때 이러한 분석은 고도로 훈련된 시험자와 함께 BSL-3 시설에서 수행되어야 하나, 기존 바이러스 중화 생물학적 분석의 단점을 극복하기 위해 본 발명을 이용한 중화항체 검출 키트 시험법은 대량 검사가 가능하고, 자동화가 가능하며 BSL-2 안전 수준 환경을 사용하는 일반 실험실 시험자가 수행하기에 용이하며, 최근 유행하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 변이주(알파(B.1.1.7), 베타(B1.351), 감마(P1), 델타(B.1.617.2), 오미크론(B.1.1.529))의 감염환자 및 백신접종 후 변이주 바이러스에 대한 중화 효능을 평가하고, 중화항체 보유 진단을 위한 정보제공을 하는데 효과가 있다.

본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 상기 언급된 단백질 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 핵산을 포함할 수 있는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 포함할 수 있는 세포를 제공한다.

본 발명은 샘플에서 상기 언급된 중화항체의 존재를 검출하기 위한 앞서 언급된 키트, 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 중화항체 검출용 조성물은 안정한 형태의 단백질 구조를 이용하며 SARS-CoV-2에 감염된 환자와 백신 접종 환자의 혈청에서 중화항체를 우수한 민감도로 검출하는 점에서 효과적이며 바이러스 감염에 대한 위험도를 포함하여 중화 효능을 평가하는데 효과가 있다. 또한, 최적화된 제조 공정 (즉, 백터에 삽입되는 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 서열의 최적화 등)을 통해 절감된 생산 단가로 중화항체의 검출용 키트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 중화항체 반응의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 인간 ACE2 단백질의 발현을 위한 동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.4-hACE2를 나타낸 도이다.
도 3은 정제된 인간 ACE2 단백질을 확인한 도이다.
도 4의 A는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 변이체 도메인 단백질 수득을 위해 제작한 재조합 플라스미드의 모식도이고, 도 4의 B는 정제된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 야생형 및 변이체(알파, 베타, 감마 및 델타) 도메인 단백질을 확인한 도이다.
도 5의 A는 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 알파 변이체(N501Y) 단백질을 이용하여 변이체의 중화항체 검출을 확인하기 위한 결합농도를 확인한 결과이고, 도 5의 B는 hACE2 리셉터와 농도별 RBD의 결합을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6의 A는 비감염자와 SARS-CoV-2에 감염된 후 완치 1달 후 양성반응을 보인 환자의 혈청 속 항체량을 측정한 결과이고, 도 6의 B는 비감염자와 SARS-CoV-2에 감염된 후 완치 1달 후 양성반응을 보인 환자의 혈청 속 중화항체 역가를 측정한 결과이며, 도 6의 C(혈청 1:100 희석)는 본 발명의 중화항체 검출용 키트를 이용한 중화능 값을, 도 6의 D(혈청 1:10 희석) 및 E(혈청 1:100 희석)는 시제품인 진스크립트를 이용한 중화능 값을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 진단 키트 및 시제품인 진스크립트 진단 키트에 대한 중화능을 평가한 결과이다 (A: 본 발명 고농도 진단 키트, B: 본 발명 중농도 진단 키트, C: 본 발명 저농도 진단 키트, D: 진스크립트 진단 키트).
도 8은 본 발명의 진단 키트의 중화능(A: Nb20 중화항체 이용, B: 4G6 중화항체 이용) 및 항체량(C: Nb20 중화항체 이용, D: 4G6 중화항체 이용)을 측정한 결과이다.
도 9는 백신 접종자 혈청 속 야생형 RBD에 결합하는 일반항체를 확인한 결과이다.
도 10은 백신 접종자 혈청 속 중화항체를 검출한 결과이다

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

핵산 서열이 본 발명에 개시되어 있는 경우, 그의 역 상보체도 명시적으로 고려된다. 또한, 폴리펩타이드-인코딩 핵산 서열이 본 발명에 개시되어 있는 경우, 유전 코드의 축퇴의 결과로서 동등한 폴리펩타이드-인코딩 서열이 또한 명시적으로 고려된다.

단수형은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 범위는 본 발명에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 다른 특정 값으로 표현될 수 있습니다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 실시예는 하나의 특정 값 및/또는 다른 특정 값을 포함한다.

본 문서에 공개된 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 수행되거나 제품이 존재할 수 있다. "시험관 내"라는 용어는 실험실 조건 또는 배양물에서 물질, 생물학적 물질, 세포 및/또는 조직을 사용한 실험을 포함하는 반면, "생체 내"라는 용어는 온전한 다세포 유기체를 사용한 실험 및 절차를 포함하도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 생체내에서 수행되는 방법은 비인간 동물에서 수행될 수 있다. "생체 외"는 유기체 외부, 예를 들어 인간 또는 동물 신체 외부에 존재하거나 일어나는 것을 지칭하며, 이는 조직(예: 전체 기관) 또는 유기체로부터 채취한 세포에 있을 수 있다.

실시예 1. 인간 ACE2 수용체 단백질의 제조

실험에 사용된, 인간 ACE2 단백질의 막관통부위를 제거한 세포 표면의 돌출부위단백질(725개 아미노산)은 hACE2 (angiotensin-converting enzyme 2, human) 염기서열을 이용하여 제조되었다. 구체적으로, ACE2 전장 단백질의 16 내지 740 아미노산 서열(서열번호 16)에 대한 염기서열을 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 ㈜바이오니아를 통해 합성하였다. 단백질 제조를 위해 선택된 인간 ACE2의 돌출단백질의 단편을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 제조된 염기서열을 서열번호 15에 나타냈다.

특히, C-말단에 대해 His-tag를 포함하도록 서열을 디자인하여 향후 고체 지지체에 위 서열이 고정될 수 있도록 디자인하였다.

상기 염기 서열번호 15로 표시되는 인간 ACE2의 단편을 변형된 pcDNA3.4 벡터를 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 변형된 pcDNA3.4 벡터의 NheI과 XhoI 부위에 서브클론(subclone)하여 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이와 같이, 제조된 재조합 플라스미드의 모식도를 도 2에 나타냈다.

재조합 플라스미드는 CHO 세포주에 Expi CHO transfection kit를 이용하여 형질주입하였다. hACE2 단백질은 CHO 세포주에 6.0Ⅹ10⁶ cell/㎖를 접종하여 12일간 배양하였다. 배양 상층액은 반투과성 막을 이용하여 배지 성분을 제거한 후, 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제하였다. 이후 단백질은 2X PBS 완충용액을 사용하여 HiPrep 16/60 Superdex S-200 겔-여과 크로마토그래피로 한 번 더 정제하여, hACE2 단백질을 얻었다. 그 결과를 도 3에 나타냈다.

실시예 2. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 야생형 및 변이체 도메인 단백질의 제조

SARS-CoV-2의 검출을 위한 항원으로 사용될 수 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 단백질(이하, RBD)의 서열을 정립하기 위하여, 구조 예측에 기반을 둔 단백질 구조분석 서버 (XtalPred-RF, RaptorX)를 이용하여 RBD 단백질의 구조를 확인하였다.

위 구조 분석을 통해 안정한 형태의 2차 구조를 갖는 RBD 단백질의 아미노산 서열을 결정하였으며, 이를 기초로 이하의 항원을 제조하였다.

실험에 사용된 (210개 아미노산)은 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 염기서열을 이용하여 제조되었다. 구체적으로, RBD 전장 단백질의 323 내지 532 아미노산 서열(서열번호 1)에 대한 염기서열(서열번호 2)을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 ㈜바이오니아를 통해 합성하였다.

부위 특이적 변이 유도법(site-directed mutagenesis)을 이용하여 상기 서열번호 1의 야생형 RBD 단백질의 특정 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 SARS-CoV-2 RBD 변이체 단백질을, 변형된 pcDNA3.4 벡터의 BamHI과 XhoI 부위에 서브클론(subclone)하여 제조된 재조합 플라스미드를 이용하여 제조하였다. 이러한 재조합 벡터의 예시적인 모식도는 도 4의 A에 나타내었다.

구체적으로 상기 서열번호 1의 야생형 RBD 단백질의 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 서열번호 20으로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 알파 변이체인 N501Y의 단백질 및 이에 대한 염기서열(서열번호 19)을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 제조하였다.

또한, 상기 서열번호 1의 야생형 RBD 단백질의 417번 위치의 리신을 아스파라진으로, 484번 위치의 글루탐산을 리신으로, 그리고 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 서열번호 22로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 베타 변이체인 K417N-E484K-N501Y의 단백질 및 이에 대한 염기서열(서열번호 21)을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 제조하였다.

또한, 상기 서열번호 1의 야생형 RBD 단백질의 417번 위치의 리신을 트레오닌으로, 484번 위치의 글루탐산을 리신으로, 그리고 501번 위치의 아스파라진을 타이로신으로 치환한 서열번호 24로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 감마 변이체인 K417T-E484K-N501Y의 단백질 및 이에 대한 염기서열(서열번호 23)을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 제조하였다.

또한, 상기 서열번호 1의 야생형 RBD 단백질의 452번 위치의 루신을 아르기닌으로, 478번 위치의 트레오닌을 리신으로 치환한 서열번호 26으로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 델타 변이체인 L452R-T478K의 단백질 및 이에 대한 염기서열(서열번호 25)을 CHO 세포주에 맞게 코돈 최적화하여 제조하였다.

마찬가지로 오미크론 변이에 해당하도록 서열번호 28에 대한 아미노산 서열과 서열번호 27에 대한 서열을 제조하였다.

위 서열 합성 및 단백질 합성을 위해 사용된 구체적 서열은 서열번호 2-14에 구체적으로 나타내었다.

이후, 재조합 플라스미드는 CHO 세포주에 Expi CHO transfection kit를 이용하여 형질주입하였다. RBD 단백질은 CHO 세포주 6.0 X 10⁶ cell/㎖에 접종하여 12일간 배양하였다. 배양 상층액은 반투과성 막을 이용하여 배지 성분을 제거한 후, 페닐 세파로오스(Phenyl Sepharose) 6 FF로 일차 정제하였다. 이후, 히드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography)와 HiPrep 16/60 Superdex S-200 겔-여과 크로마토그래피를 연속으로 이용하여, 야생형 및 변이체 RBD 단백질을 얻었으며, 그 결과를 도 4의 B에 나타냈다.

실시예 3. 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 알파 변이체 단백질을 이용한 알파 변이체의 중화항체 검출 확인

상기 실시예 1과 2에서 제조한 인간 ACE2 단백질과 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 알파 변이체(N501Y) RBD 단백질 항원들이 효과적으로 결합을 유도하는지 여부를 확인하였다.

이를 위하여, 시약은 하기 프로토콜에 의해 제조하였다(시약 제조 단계):

구체적으로, 모든 샘플을 사용 직전 볼텍싱(voltexing)하였다. 그리고 나서, 바이오틴-RBD(Biotin-RBD)의 준비를 하였으며, Biotin-RBD는 PBST 버퍼를 이용하여 1:40,000 비율로 희석하였다(Biotin RBD 1 ㎎/㎕ concentration stock 사용 기준). [Biotin-RBD 워싱 솔루션(2.0 ng/100㎕, neutralization reaction 진행 시 샘플과 1:1 혼합하면 최종 농도 1 ng/100㎕)]. 다음으로, 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)을 준비하였으며, Streptavidin-HRP는 PBS 버퍼를 이용하여 1:20,000 비율로 희석하여 사용하였다.

중화 반응을 위하여, 하기 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다(중화 반응 단계):

hACE2 단백질을 250 ng/well이 되도록 PBS 버퍼를 이용하여 100㎕/well로 분주하여 계수(coating)하였다. 이후, 플레이트 내의 용액을 제거한 뒤 1% BSA하에서 25°C에서 30분 동안 반응시켜 블로킹하였다. 그리고 나서, PBST를 이용하여 1 회 세정한 후, PBST를 완전히 제거하였다. 다음으로, 양성 대조군, 음성대조군 및 샘플을 1:50 비율로 희석하였다. 이후, 희석한 대조군 및 샘플을 Biotin-RBD와 1:1 비율로 섞어 25°C에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 상기 혼합물 100㎕를 앞서 제조한 각 웰에 넣어준 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 25°C에서 10분간 반응시켰다. 다음으로, 플레이트 내용물을 제거한 후 200㎕의 PBST로 2번 세척한 후, PBST 완전히 제거하였다. 그리고 나서, Streptavidin-HRP 100㎕를 넣어 준 후 뚜껑을 덮고 25°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 플레이트 내용물을 제거한 후 200㎕의 PBST로 4번 세척한 후, PBST 완전히 제거하였다.

또한, 기질 반응 및 흡광도 측정(저해도 계산)을 위하여, 하기 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다(저해도 측정 단계):

구체적으로, 상기 중화 반응 프로토콜의 결과물에 대하여 100㎕의 TMB 솔루션을 넣어준 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 25°C에서 10분간 반응시켰다. 타이머 시작은 TMB 솔루션을 첫 웰에 넣어준 순간부터 측정하였다. 다음으로, 100㎕의 스톱 솔루션을 넣어 추가 반응을 정지하였다. 그리고 나서, 450㎚에서 흡광도를 즉시 측정한 후, 하기 계산식에 의해 중화반응 정도를 계산하였다.

inhibition(%) = (1- Sample O.D value/negative control O.D value) X100

실험 결과 도 5를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 알파 변이체(N501Y) RBD와 hACE2의 결합은 농도 의존적으로 변화하는 것을 확인하였다. 또한, N501Y 중화항체에 의해 결합이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

구체적으로, 도 5의 A를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, SARS-CoV-2 WT의 RBD 항혈청을 10배 및 100배 희석하여 hACE2와 HRP가 접합된 알파 변이체 RBD(N501Y)의 결합 저해를 확인한 결과, 100배 희석군에서는 hACE2와 HRP가 접합된 알파 변이체 RBD(N501Y)의 결합을 전혀 저해하지 못하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5의 B를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, hACE2와 hDPP4(MERS-CoV의 세포 감염 리셉터)를 각각 플레이트에 고정화한 후, 각각 HRP가 접합된 SARS-CoV-2 WT의 RBD의 농도별 결합반응을 확인한 결과, hACE2에는 SARS-CoV-2 WT의 RBD가 결합하였으나(빨간그래프), hDPP4에는 SARS-CoV-2 WT의 RBD가 결합하지 않았음을 확인할 수 있었다(파란그래프).

실시예 4. SARS-CoV-2 감염 환자 혈청에서 일반항체, 인간 ACE2 단백질 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 야생형 단백질을 이용한 중화항체 검출 확인

실제 SARS-CoV-2에 감염된 후 완치된 환자의 혈청(완치 1달 후, 음성 1명(NC1), 양성 11명(001, 002, 003, 004, 005, 014, 015, 016, 017, 018, 019))에서 스파이크단백질의 수용체결합부위에 결합하는 항체의 형성 여부를 ELISA 방법을 통해 완치 환자와 비감염자(-)의 혈청을 1:2,500 비율로 희석하여 비교 평가하였다. 또한, 국내감염 환자에서 분리된 SARS-CoV-2 (BetaCoV/South Korea/KUMC01/2020) 바이러스를 분양 받아 완치자의 항혈청을 일정 비율(1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1,280)로 희석한 후, 바이러스를 각각 100 TCID50와 혼합하여, Vero E6 세포에 1시간 동안 처리한 후에 제거하고, 새로운 배양액에서 72시간 후에 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)가 나타나기 직전의 희석 배율의 값을 판독하여 중화능으로 평가하였다. 그리고 완치 환자 혈청을 1:100으로 희석하여 실시예 3의 방법으로 중화능을 검출하였으며, 상용화제품(진스크립트)은 1:10, 1:100 두 조건으로 비교 평가를 진행하였다. 그 결과를 도 6에 나타냈다.

실험 결과, 일반항체와 중화항체는 완전히 일치하지 않으며 실제로 평가 조건에 따라서 중화능 기준의 설정이 필요하고(도 6의 A 및 B), 혈청 희석배율에 따른 중화능 값의 비교분석결과 본 발명의 중화항체 검출능(도 6의 C)은 기존 제품(도 6의 D 및 E) 대비 우수한 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5. SARS-CoV-2 중화항체를 이용한 변이체의 중화항체 검출 확인 및 최적화

임상시료가 아닌 기존 연구 결과로 잘 알려진 야생형 SARS-CoV-2의 중화항체인 나노항체 Nb20 (Science. 2020 Dec 18; 370(6523): 1479-1484, Versatile and multivalent nanobodies efficiently neutralize SARS-CoV-2)를 직접 대장균에서 발현시키고, 중화능을 실제 바이러스에서 확인하였다. 또한, SARS-CoV-2의 중화항체로 단클론항체인 진스크립트 회사의 4G6 항체를 구입하여 본 발명의 변이체에 대한 중화능 평가에 이용하였다. 실시예 3의 방법으로 웰 당 Nb20과 4G6 중화항체를 각각 0.39, 0.78, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50ng 처리하였다.

실험 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 각각 고농도는 2.5ng, 중농도는 2ng 저농도는 1ng의 야생형 RBD의 농도로 반응하여 중화항체를 검출할 수 있었으며, 상용화제품은 동일농도의 중화항체를 3ng의 야생형 RBD에 처리하여야 하지만 중화항체를 검출할 수 있었다. 이를 통해 본 기술은 RBD의 양을 조절함으로써 중화항체의 농도별로 진단이 가능한 장점이 있으며, 실제 중화항체의 높은 때와 낮을 때를 구별하여 정교하게 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.

또한, 실시예 3의 방법으로 야생형과 변이체를 웰 당 Nb20과 4G6 중화항체를 각각 0.01, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 10, 200ng 처리해 야생형과 변이체 RBD을 2ng 농도로 반응하여 중화능을 평가하여, 그 결과를 도 8에 나타냈다.

실험 결과, 본 기술은 표준중화항체(Nb20과 4G6)를 이용하여 분석값을 항상 보정할 수 있는 장점이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 야생형 SARS-CoV-2의 중화항체인 Nb20과 4G6의 경우 야생형, 알파 그리고 델타 변이주에는 중화능이 있으나, 베타와 감마 변이주는 중화능이 아주 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 6. SARS-CoV-2 백신 접종자 혈청에서 변이체의 중화항체 검출 확인

실제 백신 접종자 32명(백신 2차 접종 4주 후 혈청)을 이용하여, 일반항체를 실시예 4의 방법으로 측정하여 야생형 RBD에 결합하는 항체를 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타냈다.

또한, 백신 접종자 혈청을 1:50으로 희석하여 실시예 3의 방법으로 중화항체를 검출하였고, 그 결과를 도 10에 나타냈다.

상기 실험에서 제공된 환자 샘플에 대해서는 3-34, 3-36 내지 3-48, 3-50 내지 3-52, 3-148, 3-150, 3-151, 3-155, 3-157, 3-159 내지 3-165, 3-172 및 3-174로 임의로 라벨링하였다.

실험 결과, 전체적으로 야생형과 델타 변이주 RBD에 높은 중화능을 나타내는 것이 확인되었다. 한편, 알파, 베타, 감마 변이가 20~30% 정도 낮은 중화능을 나타냈다.

또한, 아데노바이러스 (벡터 백신(아스트라제네카 AZ)/AZ), mRNA 백신(모더나(M)/M) 및 교차접종 백신(AZ/화이자(PZ)) 접종자간 중화능의 차이(벡터 백신보다 mRNA 백신 또는 교차접종 백신 접종자의 혈청에서 중화항체가 높게 나타남)를 보였으며, 본 발명의 키트를 이용해 변이 바이러스는 물론 백신 종류별 중화항체를 우수한 민감도로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> COMPOSITION FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODY AGAINST SARS-COV2 VARIANTS, DECTECTION METHOD AND KIT COMPRISING THEREOF <130> P22017-KRIBB-PA <150> KR 1020210027938 <151> 2021-03-03 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> Human coronavirus <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val 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comprising signal peptide <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <400> 13 Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe 20 25 30 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Asp Glu Val Phe Asn Ala Thr 35 40 45 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 50 55 60 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Leu Ala Pro Phe Phe Thr Phe 65 70 75 80 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 85 90 95 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 100 105 110 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 115 120 125 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Lys Leu 130 135 140 Asp Ser Lys Val Ser Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg 145 150 155 160 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 165 170 175 Gln Ala Gly Asn Lys Pro Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr 180 185 190 Phe Pro Leu Lys Ser Tyr Ser 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agataatcca caagaatgct tattacttga accaggtttg 480 aatgaaataa tggcaaacag tttagactac aatgagaggc tctgggcttg ggaaagctgg 540 agatctgagg tcggcaagca gctgaggcca ttatatgaag agtatgtggt cttgaaaaat 600 gagatggcaa gagcaaatca ttatgaggac tatggggatt attggagagg agactatgaa 660 gtaaatgggg tagatggcta tgactacagc cgcggccagt tgattgaaga tgtggaacat 720 acctttgaag agattaaacc attatatgaa catcttcatg cctatgtgag ggcaaagttg 780 atgaatgcct atccttccta tatcagtcca attggatgcc tccctgctca tttgcttggt 840 gatatgtggg gtagattttg gacaaatctg tactctttga cagttccctt tggacagaaa 900 ccaaacatag atgttactga tgcaatggtg gaccaggcct gggatgcaca gagaatattc 960 aaggaggccg agaagttctt tgtatctgtt ggtcttccta atatgactca aggattctgg 1020 gaaaattcca tgctaacgga cccaggaaat gttcagaaag cagtctgcca tcccacagct 1080 tgggacctgg ggaagggcga cttcaggatc cttatgtgca caaaggtgac aatggacgac 1140 ttcctgacag ctcatcatga gatggggcat atccagtatg atatggcata tgctgcacaa 1200 ccttttctgc taagaaatgg agctaatgaa ggattccatg aagctgttgg ggaaatcatg 1260 tcactttctg cagccacacc taagcattta 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of RBD of alpha variant N501Y <400> 20 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 1 5 10 15 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 20 25 30 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile 85 90 95 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 100 105 110 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 115 120 125 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 130 135 140 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly 145 150 155 160 Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 165 170 175 Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 180 185 190 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 205 Thr Asn 210 <210> 21 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RBD of beta variant K417N-E484K-N501Y <400> 21 accgagtcta tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gtcctttcgg cgaggtgttc 60 aacgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 120 gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tccttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg 180 tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 240 agaggcgacg aagtgcggca gatcgctcct ggacagaccg gcaacatcgc cgactacaac 300 tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt gtgatcgctt ggaactccaa caacctggac 360 tccaaagtcg gcggcaacta caattacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 420 cctttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gcagcacccc ttgtaatggc 480 gtgaaaggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacatacggc 540 gtgggctacc agccttacag agtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca tgctcctgct 600 accgtgtgcg gccctaagaa atctaccaac 630 <210> 22 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of RBD of beta variant K417N-E484K-N501Y <400> 22 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 1 5 10 15 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 20 25 30 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile 85 90 95 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 100 105 110 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 115 120 125 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 130 135 140 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly 145 150 155 160 Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 165 170 175 Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 180 185 190 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 205 Thr Asn 210 <210> 23 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RBD of gamma variant K417T-E484K-N501Y <400> 23 accgagtcta tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gtcctttcgg cgaggtgttc 60 aacgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 120 gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tccttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg 180 tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 240 agaggcgacg aagtgcggca gatcgctcct ggacagaccg gcaccatcgc cgactacaac 300 tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt gtgatcgctt ggaactccaa caacctggac 360 tccaaagtcg gcggcaacta caattacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 420 cctttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gcagcacccc ttgtaatggc 480 gtgaaaggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacatacggc 540 gtgggctacc agccttacag agtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca tgctcctgct 600 accgtgtgcg gccctaagaa atctaccaac 630 <210> 24 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of RBD of gamma variant 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Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 1 5 10 15 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 20 25 30 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 35 40 45 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile 85 90 95 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 100 105 110 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 115 120 125 Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 130 135 140 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly 145 150 155 160 Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 165 170 175 Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 180 185 190 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 205 Thr Asn 210 <210> 27 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of RBD of omicron variant G339D-S371L-S373P-S375F-K417N-N440K-G446S-S477N-T478K-E484A-Q493K -G496S-Q498R-N501Y-Y505H <400> 27 accgagtcta tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gtcctttcga cgaggtgttc 60 aacgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 120 gccgactact ccgtgctgta caacctggcc cctttcttca ccttcaagtg ctacggcgtg 180 tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 240 agaggcgacg aagtgcggca gatcgctcct ggacagaccg gcaacatcgc cgactacaac 300 tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt gtgatcgctt ggaactccaa caagctggac 360 tccaaagtct ccggcaacta caattacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 420 cctttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gcaataaacc ttgtaatggc 480 gtggctggct tcaactgcta cttcccactg aagtcctact ccttccggcc tacatacggc 540 gtgggccatc agccttacag agtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca tgctcctgct 600 accgtgtgcg gccctaagaa atctaccaac 630 <210> 28 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of RBD of omicron variant G339D-S371L-S373P-S375F-K417N-N440K-G446S-S477N-T478K-E484A-Q493K -G496S-Q498R-N501Y-Y505H <400> 28 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 1 5 10 15 Asp Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 20 25 30 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 35 40 45 Leu Ala Pro Phe Phe Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 50 55 60 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile 85 90 95 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 100 105 110 Ala Trp Asn Ser Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Ser Gly Asn Tyr Asn 115 120 125 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 130 135 140 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro Cys Asn Gly 145 150 155 160 Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Lys Ser Tyr Ser Phe Arg 165 170 175 Pro Thr Tyr Gly Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 180 185 190 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 195 200 205 Thr Asn 210 <210> 29 <211> 2175 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized DNA sequence of fragment of projecting protein of hACE2 <400> 29 gctgctcagt ccaccattga ggaacaggcc aagacatttt tggacaagtt taaccacgaa 60 gccgaagacc tgttctatca aagttcactt gcttcttgga attataacac caatattact 120 gaagagaatg tccaaaacat gaataatgct ggggacaaat ggtctgcctt tttaaaggaa 180 cagtccacac ttgcccaaat gtatccacta caagaaattc agaatctcac agtcaagctt 240 cagctgcagg ctcttcagca aaatgggtct tcagtgctct cagaagacaa gagcaaacgg 300 ttgaacacaa ttctaaatac aatgagcacc atctacagta ctggaaaagt ttgtaaccca 360 gataatccac aagaatgctt attacttgaa ccaggtttga atgaaataat ggcaaacagt 420 ttagactaca atgagaggct ctgggcttgg gaaagctgga gatctgaggt cggcaagcag 480 ctgaggccat tatatgaaga gtatgtggtc ttgaaaaatg agatggcaag agcaaatcat 540 tatgaggact atggggatta ttggagagga gactatgaag taaatggggt agatggctat 600 gactacagcc gcggccagtt gattgaagat gtggaacata cctttgaaga gattaaacca 660 ttatatgaac atcttcatgc ctatgtgagg gcaaagttga tgaatgccta tccttcctat 720 atcagtccaa ttggatgcct ccctgctcat ttgcttggtg atatgtgggg tagattttgg 780 acaaatctgt actctttgac agttcccttt ggacagaaac caaacataga tgttactgat 840 gcaatggtgg accaggcctg ggatgcacag agaatattca aggaggccga gaagttcttt 900 gtatctgttg gtcttcctaa tatgactcaa ggattctggg aaaattccat gctaacggac 960 ccaggaaatg ttcagaaagc agtctgccat cccacagctt gggacctggg gaagggcgac 1020 ttcaggatcc ttatgtgcac aaaggtgaca atggacgact tcctgacagc tcatcatgag 1080 atggggcata tccagtatga tatggcatat gctgcacaac cttttctgct aagaaatgga 1140 gctaatgaag gattccatga agctgttggg gaaatcatgt cactttctgc agccacacct 1200 aagcatttaa aatccattgg tcttctgtca cccgattttc aagaagacaa tgaaacagaa 1260 ataaacttcc tgctcaaaca agcactcacg attgttggga ctctgccatt tacttacatg 1320 ttagagaagt ggaggtggat ggtctttaaa ggggaaattc ccaaagacca gtggatgaaa 1380 aagtggtggg agatgaagcg agagatagtt ggggtggtgg aacctgtgcc ccatgatgaa 1440 acatactgtg accccgcatc tctgttccat gtttctaatg attactcatt cattcgatat 1500 tacacaagga ccctttacca attccagttt caagaagcac tttgtcaagc agctaaacat 1560 gaaggccctc tgcacaaatg tgacatctca aactctacag aagctggaca gaaactgttc 1620 aatatgctga ggcttggaaa atcagaaccc tggaccctag cattggaaaa tgttgtagga 1680 gcaaagaaca tgaatgtaag gccactgctc aactactttg agcccttatt tacctggctg 1740 aaagaccaga acaagaattc ttttgtggga tggagtaccg actggagtcc atatgcagac 1800 caaagcatca aagtgaggat aagcctaaaa tcagctcttg gagataaagc atatgaatgg 1860 aacgacaatg aaatgtacct gttccgatca tctgttgcat atgctatgag gcagtacttt 1920 ttaaaagtaa aaaatcagat gattcttttt ggggaggagg atgtgcgagt ggctaatttg 1980 aaaccaagaa tctcctttaa tttctttgtc actgcaccta aaaatgtgtc tgatatcatt 2040 cctagaactg aagttgaaaa ggccatcagg atgtcccgga gccgtatcaa tgatgctttc 2100 cgtctgaatg acaacagcct agagtttctg gggatacagc caacacttgg acctcctaac 2160 cagccccctg tttcc 2175 <210> 30 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of projecting protein of hACE2 <400> 30 Ala Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys 1 5 10 15 Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser 20 25 30 Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn 35 40 45 Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu 50 55 60 Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu 65 70 75 80 Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp 85 90 95 Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr 100 105 110 Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu 115 120 125 Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn 130 135 140 Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala 165 170 175 Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr 180 185 190 Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile 195 200 205 Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His 210 215 220 Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr 225 230 235 240 Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp 245 250 255 Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln 260 265 270 Lys Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp 275 280 285 Ala Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly 290 295 300 Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp 305 310 315 320 Pro Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu 325 330 335 Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp 340 345 350 Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met 355 360 365 Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly 370 375 380 Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro 385 390 395 400 Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp 405 410 415 Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val 420 425 430 Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val 435 440 445 Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu 450 455 460 Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu 465 470 475 480 Thr Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser 485 490 495 Phe Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu 500 505 510 Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp 515 520 525 Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg 530 535 540 Leu Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly 545 550 555 560 Ala Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu 565 570 575 Phe Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser 580 585 590 Thr Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser 595 600 605 Leu Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu 610 615 620 Met Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe 625 630 635 640 Leu Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg 645 650 655 Val Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala 660 665 670 Pro Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala 675 680 685 Ile Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp 690 695 700 Asn Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn 705 710 715 720 Gln Pro Pro Val Ser 725

Claims

(ⅰ) 표지물질과 접합(Conjugation)된, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 (ⅰ)의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편;을 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체는 서열번호 18, 20, 22, 24, 26 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 N501Y, K417N/E484K/N501Y, K417N/E484K/N501Y, L452R/T478K, 및G339D/S371L/S373P/S375F/K417N/N440K/G446S/S477N/T478K/E484A/Q493K/G496S/Q498R/N501Y/Y505로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 변이를 포함하며 서열번호 1의 아미노산 서열의 323 내지 532번째 아미노산 서열을 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
중화항체 검출용 조성물은 야생형 SARS-CoV-2, 알파 변이체 B.1.1.7; 베타 변이체 B1.351; 감마 변이체 P1; 델타 변이체 B.1.617.2; 및 오미크론 변이체 B.1.1.529로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 대한 중화항체 검출을 위한 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질은, 서열번호 14의 16 내지 740번째 서열을 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제5항에 있어서,
인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질은, 서열번호 30인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표지물질은, 면역형광, 방사성 표지, 면역 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 유동 세포 분석법, 면역침전, 면역조직화학, 바이오필름 시험, 핀화도 환 시험, 항체 어레이 광학 밀도 시험 및 화학발광으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 검출 방법에 이용하기 위한 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표지물질은, 비오틴, 디곡시게닌, 압타머 (aptamer), 펩타이드(peptide), 형광 화합물 (fluorescent compound), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리사카라이드 (polysaccharides)으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제8항에 있어서,
표지물질은 비오틴인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제9항에 있어서,
시그날을 간접적으로 생성할 수 있는 표지물질을 인지할 수 있는 물질은 아비딘 또는 아비딘 유사체인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제10항에 있어서, 아비딘 또는 아비딘 유사체는 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 또는 캡타비딘(captavidin)인 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 조성물을 포함하는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트는 고체 지지체를 추가로 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 키트.
제12항에 있어서,
상기 키트는, 담체, 세정버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 및 사용법을 교시하는 설명서 중 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출용 키트.
시료 분석을 위하여, (ⅰ) 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체; 및 (ⅱ) 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질과 (ⅱ)의 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 스파이크 단백질 특이적 결합 단편 간의 상호작용 수준을 결정하는 단계;를 포함하되,
상기 (ⅰ)의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체는 표지물질에 접합되고, 상기 (ⅱ)의 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 스파이크 단백질 특이적 결합 단편은 고체 지지체 상에 고정되는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제15항에 있어서,
상기 시료는, 혈액, 림프, 타액 또는 활액인 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제15항에 있어서,
상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 변이체는, 알파 변이체 B.1.1.7; 베타 변이체 B1.351; 감마 변이체 P1;델타 변이체 B.1.617.2; 및 오미크론 변이체 B.1.1.529로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제15항에 있어서,
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체는 서열번호 18, 20, 22, 24, 26 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
상기 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질은, 서열번호 14의 16 내지 740번째 서열을 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
a) 시료를 표지물질과 접합(Conjugation)된 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체와 혼합하여 혼합물을 제조하고, 인큐베이션하는 단계;
b) 단계 a)의 혼합물을 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질, 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질 세포 외 도메인 또는 상기 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 단편과 혼합하는 단계; 및
c) 표지물질의 신호를 검출하는 단계;를 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제19항에 있어서,
상기 시료는, 혈액, 림프, 타액 또는 활액인 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제19항에 있어서,
상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 변이체는, 알파 변이체 B.1.1.7; 베타 변이체 B1.351; 감마 변이체 P1;델타 변이체 B.1.617.2; 및 오미크론 변이체 B.1.1.529로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.
제19항에 있어서,
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 변이체는 서열번호 18, 20, 22, 24, 26 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
상기 인간 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 단백질은, 서열번호 14의 16 내지 740번째 서열을 포함하는 것인, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV2)의 중화항체 검출 방법.