WO2004083250A9 - フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体の認識領域からなる構成物 - Google Patents
フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体の認識領域からなる構成物Info
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Definitions
- the present invention relates to the field of prescription pharmaceuticals. Specifically, an antibody against a specific cleavage enzyme (hereinafter sometimes referred to as ADAMTS-13) of a von Willebrand Factor (hereinafter sometimes referred to as vWF) involved in blood coagulation.
- ADAMTS-13 a specific cleavage enzyme
- vWF von Willebrand Factor
- the present antibody may be referred to as an anti-ADAMTS-13 antibody.
- the present invention relates to an polypeptide that includes the peptide and the epitope, and an antibody that recognizes the polypeptide.
- the polypeptide or peptide fragment containing the epitope region recognized by the antibody against ADAMTS-13 provided by the present invention can be used to diagnose autoantibodies to ADAMTS-13, or to absorb autoantibodies or autoantibodies to ADAMTS-13.
- the potential of ADAMTS-13 replacement therapy in patients with the disease is opened up. Background art
- vWF is produced by vascular endothelial cells and bone marrow megakaryocytes, and is a multimeric structure (molecular weight of 500 to 500 kDa) in which a single subunit consisting of 2050 amino acid residues (monomer about 250 kDa) is connected by an SS bond. It is a hemostatic factor that exists with 20,000 kDa a).
- the blood concentration is about 10 ng / m1, and the higher the molecular weight, the higher the specific activity.
- VWF functions as two major hemostatic factors, one as a carrier protein that binds to and stabilizes blood coagulation factor VIII, and the other as a subendothelial cell on the injured vessel wall. It is a function to form platelet thrombus by adhering and agglutinating platelets to tissues.
- TTP Thrombotic thrombocytopenic purpura
- thrombotic thrombosis in systemic arterioles and capillaries of the whole body. Associated mortality rates have increased about 3-fold over the years 1971-1199.
- the presence of a large amount of vWF in the platelet thrombus produced by immunohistology is considered to be a major factor in this pathogenesis.
- TTP is broadly divided into familial (congenital), which is thought to have a genetic predisposition, and acquired (idiopathic), which develops especially in adults.
- the multimeric structure of VWF in TTP patients is normal or has a high molecular weight. : L vW
- vWF vWF-cleaving protease
- TTP is deduced because the enzyme activity in plasma decreases for some reason, UL vWFM or L vWFM increases, platelet aggregation increases, and platelet thrombus is formed in blood vessels. Have been.
- the vWF-cleaving enzyme which is the active substance having the enzyme activity
- the domain composition of ADAMTS-13 is the presence of the Propeptide following the Signal peptide, followed by the RQRR sequence of the Furin cleavage motif, followed by the Metalloprotease domain containing the Reprolysin-type zinc chelating region consisting of the consensus sequence of HEXXHXXGXXHD. (Up to amino acid residue number 284 (P285X)). Then, through a Disintegrin-like domain (up to amino acid residue number 386 (W387X)) as found in the snake venom meta-mouth protease, it is considered to be generally important for molecular recognition.
- Tspl-l Tspl motif
- RGDS sequence one of the cell adhesion motifs region (up to amino acid residue number 580 (T581X)). It then consists of about 130 amino acid residues without any cysteine residues
- Spacer domain up to amino acid residue number 6887 (W688X)
- Tspl-2 to 8 Tspl-2 to 8
- a first object of the present invention is to identify neutralizing epitopes present on ADAMTS-13 and to provide a neutralized / absorbing material mainly for autoantibodies proposed by the method. It is an invention.
- a second object of the present invention is to provide a method for producing such a neutralizing / absorbing material.
- a third object of the present invention is to provide a use of such a neutralizing / absorbing material.
- a fourth object of the present invention is to provide a method for producing a full-length or partially modified molecule of a VWF-specific cleavage enzyme obtained by modifying such an epitope.
- a fifth object of the present invention is to provide a use of a full-length or partially modified molecule of a VWF-specific cleavage enzyme obtained by modifying such an epitope.
- v Plasma exchange therapy has been used as a treatment for patients with congenital deficiency of the WF-specific cleavage enzyme and patients with an antibody positive for the acquired enzyme. It is hoped that replacement therapy with products will be established.
- the administered enzyme loses its enzymatic activity by being neutralized by antibodies to the enzyme present in the patient's blood, that is, by autoantibodies. Typically the concentration is reduced.
- the method for determining the epitope of an antibody against ADAMTS-13 in the earlier application Japanese Patent Application No. 2002-279799
- the use of the neutralizing region identified in the present invention and By preparing a molecule having a partially modified neutralizing epitope region that can be newly identified by performing the Western blotting of the competitive inhibition method used in the present invention, administration to an antibody-positive patient against the enzyme is possible.
- the antibody can be absorbed by the polypeptide or the like containing the neutralizing region provided by the present invention. Disclosure of the invention
- JP-A-2003-284570 JP-A-2003-284570
- the purification and isolation of the desired vWF-cleaving enzyme was successful, and the amino acid sequence of the mature protein and the gene encoding the amino acid sequence were identified.
- Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-284570 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-284570
- the autoantibody recognition region has the above activity.
- the region considered to be essential for expression it was clarified that the region exists from the Cys-rich region (about 499) to the Spacer region (about 687). Therefore, the resistance provided by the present invention
- the main requirements for the major neutralizing epitope region for the ADAMTS-13 antibody are the Cys-rich region (approximately 499-position) and the Spacer region (6
- the present invention includes a neutral epitope region of an von Willebrand factor-specific cleavage enzyme (hereinafter sometimes referred to as vWFCP or ADAMTS-13) recognized by the antibody.
- vWFCP von Willebrand factor-specific cleavage enzyme
- the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence from position 449 to position 687 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a peptide fragment derived from the polypeptide, which is represented by SEQ ID NO: 1.
- the amino acid sequence from position 449 to position 687 of the amino acid sequence A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and which is recognized by an antibody against a von Willebrand factor-specific cleavage enzyme or a peptide fragment derived from the polypeptide It is.
- one or several means one to five, preferably one to three, more preferably one or two.
- antibody preparation technology using phage display technology (Phage Display ⁇ Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al. (1996), Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. 1996) or ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl AK BORREBAECK (1995)) enables the production of antibodies that bind to the protein (ADAMTS-13).
- ADAMTS-13 ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl AK BORREBAECK (1995)
- the use of these antibodies makes it possible to apply the present invention to the diagnosis and treatment of diseases involving fluctuations in the amount of the enzyme, for example, diseases such as TTP.
- the present invention also includes these antibodies.
- the present invention relates to a method for diagnosing a patient at risk for a TTP-like disease or vWF-dependent thrombosis, comprising the following steps:
- Diagnostic assays for diseases involving fluctuations in this enzyme level are performed using biological samples from patients. These samples can be used directly or, in some cases, require treatment before performing the procedure, for example, removing potentially interfering substances in the sample. Can be. Examples of suitable biological samples are blood, urine, sweat, tissue or serum. The method comprises the steps of: Including detecting autoantibodies to the vWF-cleaving enzyme in the sample.
- the above-mentioned diagnosis can be performed by a known Imnoassay method, and a solid support such as a peas or a plate made of a resin such as polystyrene can be used.
- a solid support such as a peas or a plate made of a resin such as polystyrene
- the developing agent a radioisotope, peroxidase, Enzymes such as alkaline phosphatase, fluorescent substances and the like can be used.
- the polypeptide of the present invention is also useful as a neutralizing agent for autoantibodies by administration to an anti-ADAMTS-13 antibody-positive patient or as an autoantibody removing agent.
- neutralization of the autoantibodies means that the autoantibodies
- the polypeptide is optionally immobilized using methods known in the art, such as a suitable support.
- autoantibodies are removed from the patient sample by contacting the sample containing the anti-AD cliff TS-13 antibody to be removed, for example, the patient's blood with the immobilized polypeptide.
- the blood or plasma of the patient is brought into contact with the blood or plasma of the patient by contacting the carrier to which the ligand specific to the anti-ADATS-13 antibody is bound and the anti-ADATS-13 antibody in the blood or plasma.
- the antibody may be removed from the blood, and then the blood or plasma from which the antibody has been removed may be re-infused into the patient.
- the ligand specific to the anti-ADATS-13 antibody the above-mentioned polypeptide or a polypeptide fragment derived from the polypeptide can be used.
- the contact may be made, for example, by passing the patient's blood or plasma through a carrier to which the ligand is bound.
- the present invention relates to the step of contacting the blood or plasma of an anti-ADAMTS-13 antibody-positive patient with a carrier to which the above-described polypeptide or a peptide fragment derived from the polypeptide is bound, and then detecting the anti-ADATS-13 in the blood or plasma.
- An antibody is bound to the ligand and the antibody is removed from blood or plasma by
- Neutralizing agents for autoantibodies administered to patients with anti-ADAMTS-13 antibody positive An anti-dose containing a peptide or a peptide fragment derived from the polypeptide as an active ingredient
- ADAMTS-13 is a pharmaceutical composition for treating an antibody-positive patient. Further, a polypeptide or a peptide derived from the polypeptide in which the polypeptide or a peptide fragment derived from the polypeptide has lost reactivity with the anti-ADAMTS-13 antibody due to modification such as molecular substitution, deletion, or insertion. It is a pharmaceutical composition for treating a patient with anti-ADAMTS-13 antibody positive, which contains a fragment as an active ingredient.
- the modification such as molecular substitution, deletion, or insertion refers to, for example, deletion, substitution, or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide or the peptide fragment derived from the polypeptide. To be done.
- Such modifications may alter the structure of, for example, polypeptide or peptide fragments, resulting in an epi! Loss of activity results in loss of reactivity with anti-ADAMTS-13 antibody.
- a polypeptide that recognizes the anti-ADAMTS-13 antibody of the present invention is used as a neutralizing agent of the autoantibody by administration to an anti-AD cliff TS-13 antibody-positive patient, use a saline solution, a buffer solution, or the like. It can be diluted and formulated to give a pharmaceutical composition.
- the pH of the preparation is preferably weakly acidic to neutral pH close to the pH of the body fluid, and the lower limit is
- the preparation of the present invention may contain pharmacologically acceptable additives (eg, carriers, excipients, diluents, etc.), stabilizing agents, or components required for pharmacy, which are usually used for pharmaceuticals. .
- the stabilizer examples include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as saccharose and maltose, sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, neutral salts such as sodium chloride, amino acids such as glycine, polyethylene glycol, and polyoxyethylene-poly.
- Non-ionic surfactants such as oxypropylene copolymer (pluronic) and polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (tween), human albumin, etc. are exemplified, and about 1 to 10 wZv% may be added. preferable.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in an effective amount by intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, etc., and is administered once or in several divided doses.
- the dosage varies depending on symptoms, age, weight, etc., but is preferably 0.001 mg to 100 mg per dose. Good.
- FIG. 1 is a diagram showing a method for producing a C-terminal deletion mutant for determining an epitope of an antibody.
- FIG. 2 is a photograph in which the expression of the prepared C-terminal deletion mutant was confirmed by Western plot under non-reducing conditions using an anti-FLAG antibody.
- FIG. 3 is a photograph in which a recognition region was confirmed by non-reducing Western blotting with purified IgG derived from an acquired TTP patient 003.
- FIG. 4 is a photograph in which the recognition region was confirmed by non-reducing Western plot with purified IgG derived from acquired TTP patient 2004.
- FIG. 5 is a photograph in which the recognition region was confirmed by non-reducing Western plot with purified IgG derived from an acquired TTP patient 009.
- FIG. 6 is a photograph showing confirmation of a more detailed recognition region of purified IgG derived from an acquired TTP patient.
- IgG fraction was prepared from the acquired patient plasma using a protein A column (antibody concentration of about 2-5 mg / m2). 1), it was diluted 200-fold and subjected to Western blotting. Filichiru was visualized by staining with a BCIPZNBT substrate using an anti-human IgG alkaline phosphatase-labeled antibody as a secondary antibody (FIGS. 3 to 5). The antibody recognition region determined in these manners reacted up to W688X and did not react with Q449X in any of the three antibody fractions, confirming that it was present on the C-terminal side of Q449X.
- the supernatant of the full-length wild type was electrophoresed and transferred to a PVDF membrane, and the above-mentioned patient antibody was concentrated in advance with a large excess of Q449X, W688X, or a concentrate of the full-length wild type expression supernatant.
- the W688X eliminated the full-length wild type positive band in all samples by the competitive inhibition system (Fig. 6).
- the results shown in Examples 1 and 2 indicate that the three autoantibodies used were mainly from the Cys-rich region to the Spacer region on the N-terminal side, ie, between Q449X and W688X, on the N-terminal side of W688X at the Q449X terminal side. It was confirmed that it was a sum area.
- the polypeptide of the present invention specifically shows immunoreactivity with an anti-ADAMTS-13 antibody. Therefore, rapid detection of the amount of the anti-ADAMTS-13 antibody, diagnosis of a disease associated with the fluctuation of the present enzyme, or neutralization of the binding or inhibitory activity of the anti-ADAMTS-13 antibody can be performed.
- the polypeptides provided by the present invention also provide a wide variety of uses including detection of anti-ADAMTS-13 antibodies.
- the present invention exerts such remarkable functions and effects, and it can be said that the present invention is a very significant invention that contributes to the art.
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Abstract
フォンビルブラント因子(von Willebrand Factor：以下、ｖＷＦと称することがある)の特異的切断酵素（以下、ADAMTS-13と称することがある）に対する抗体（以下、本抗体を抗ADAMTS-13抗体と称することがある）が認識するエピトープ及び当該エピトープ領域を含むポリペプチドを提供する。 抗ADAMTS-13抗体が認識するADAMTS-13を構成するアミノ酸配列の４４９位から６８７位領域に存在するポリペプチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片。
Description
明 細 書 フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体の認識領域からなる構成物 技術分野
本願発明は、 医療用医薬品の分野に関する。 詳細には、 血液凝固に関与するフ オンビルブラン卜因子（von Willebrand Factor：以下、 vWFと称することがあ る）の特異的切断酵素 （以下、 ADAMTS-13と称することがある） に対する抗体 （以 下、 本抗体を抗 ADAMTS - 13抗体と称することがある） が認識するェピ] ^一プ及び 当該ェピトープ領域を含むポリぺプチドならびに当該ポリべプチドを認識する抗 体に関する。
本願発明で提供される ADAMTS- 13に対する抗体の認識するェピト一プ領域を含 むポリペプチドあるいはペプチド断片により、 ADAMTS-13 に対する自己抗体の有 無の診断あるいは自己抗体の吸収剤あるいは自己抗体陽性にともなう疾病患者へ の ADAMTS- 13の補充療法の可能性が拓かれる。 背景技術
vWFは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、 2050アミノ酸残基（モノ マー約 250 kD a)からなる単一サブュニッ卜が S— S結合にて結ばれたマル チマ一構造（分子量 500〜20， 000 kD a)を持って存在している止血因子 である。血中濃度は約 10 n g/m 1で、一般に高分子量のものほど比活性が高レ 。
V WFには 2つの大きな止血因子としての機能があり、 1つは血液凝固第 VIII 因子と結合し、 これを安定化させるキャリアー蛋白質としての働き、 もう 1つは 傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着 ·凝集させ、 血小板血栓を形成 する機能である。
血栓性血小板減少性紫斑病 （以下、 TTPと称することがある） は、 全身の体 組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、 今日の医療技術の進歩 にもかかわらず、 当該疾患での関連死亡率は 1 97 1〜199 1年にかけて約 3 倍に増加している。 病理学的に、 TTPは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集
によって惹き起こされると考えられており、 免疫組織学的には生じた血小板血栓 中に多量の vWFの存在が認められ、 vWFがこの成因に大きな役割を果たして いると考えられている。 TTPには遺伝的素因を有すると考えられる家族性 （先 天性） のものと特に成人において発症する後天性 （特発性） のものなどに大別さ れる。 T T P患者の V W Fのマルチマー構造は正常もしくは高分子量が優位とな つており、 特に通常では見られない超高分子量の vWF (unusually large vWF multimer : UL vWFM)や高分子量 vWF重合体 （large vWF mul timer : L vW
FM)が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果た していることが推察される。 一方で、 vWFは健常人の循環血液中で高ずり応力 下、 vWF切断酵素（vWF - cleaving protease)の作用により 842Ty r— 8
43Me tの位置で分解を受けることが知られていた。 したがって、 TTPは血 漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、 UL vWFMないし L vWFM が増加して血小板凝集が亢進し、 血管内に血小板血栓が形成されるためといぅシ ナリオが描かれている。
2 0 0 1年、 前記酵素活性を有する活性本体である vWF切断酵素、 別名
ADAMTS-13 をコードする遺伝子が本願発明者等によりクローニングされた （特開
2003- 284570号公報）。 以下に、 ADAMTS-13の分子構造に関する知見を整理する。 括弧内におおよその目安となる開始コドン（ATG)のメチォニンからの残基番号の 位置を示す （配列番号 1参照）。
ADAMTS-13のドメイン構成は Signal peptideに続いて Propeptideが存在し、 次いで、 Furinの切断モチーフの RQRR配列が存在し、 HEXXHXXGXXHDのコンセンサ ス配列からなる Reprolysin タイプの亜鉛キレート領域を含む Metal loprotease domain が続く（アミノ酸残基番号 284位 （P285X) まで）。 そして、 蛇毒メタ口 プロテアーゼで見出されるような Disintegrin-like domainを経て（アミノ酸残基 番号 386位 （W387X) まで）、 一般的に分子認識に重要と考えられているおよそ
50〜60残基からなる最初の Tspl motif (Tspl-l) (アミノ酸残基番号 448 位 （Q449X) まで）へとつながり、 さらに、 細胞接着モチーフの 1つである RGDS 配列が含まれる Cys- rich region (アミノ酸残基番号 580位 （T581X) まで）へと 続く。 次いで、 システィン残基を全く含まない約 1 30アミノ酸残基からなる
Spacer domain (アミノ酸残基番号 6 8 7位（W688X) まで）を経て、再び Tsp l mot i f の繰り返し （Tspl- 2〜8) の後、 補体成分 Cl rあるいは Clsの中に最初に見つかつ たとされる CUB domain- 1， 2が続く。
ところで、 ADAMTS- 13 に対する主要な中和ェピトープ領域に関しての知見はこ れまでのところ全く得られていない。 また、 当該酵素に対する自己抗体陽性患者 の簡便な診断法も確立されていない。
斯かる状況に鑑み、 本願発明の第一の課題は、 ADAMTS- 13 上に存在する中和ェ ピトープの同定とそれにより発案される自己抗体を主たる対象とする抗体の中 和 ·吸収材に係る発明である。
本願発明の第二の課題は、 斯かる中和 ·吸収材の製造方法を提供することにあ る。
本願発明の第三の課題は、 斯かる中和 ·吸収材の用途を提供することにある。 本願発明の第四の課題は、 斯かるェピトープを改変することにより得られる V W F特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の製造方法を提供することにある。 本願発明の第五の課題は、 斯かるェピトープを改変することにより得られる V W F特異的切断酵素全長もしくは部分改変分子の用途を提供することにある。 v W F特異的切断酵素の先天的欠損患者及び後天性の当該酵素に対する抗体陽 性患者の治療法として、 現在までプラズマ交換療法が施されており、 当該酵素の 精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。 家族性 T T P患者は、 先天的に v W F特異的切断酵素が欠損しており、 非家族性では後天 的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。 したがって、 家 族性 T T P患者には、 当該酵素の補充療法が望ましく （現実には血漿投与が行わ れている）、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と当該酵素の補充が必 要である。
しかし、 自己抗体陽性患者への ADAMTS- 13の補充投与においては患者血液中に 存在する当該酵素に対する抗体、 すなわち自己抗体によって中和されることによ り、 投与された酵素は酵素活性を失い実質的には濃度が減ぜられる。 しかし、 先 の出願 （特願 2 0 0 2 - 2 7 9 9 2 4 ) の ADAMTS- 13に対する抗体のェピトープ の決定方法、 あるいは本願発明において同定された中和領域の利用ならびに本願
発明において用いられた競合阻害法のウエスタンプロッティングを行うことによ り新たに同定されうる中和ェピトープ領域を部分改変した分子を調製することで、 当該酵素に対する抗体陽性患者への投与が可能になる。 あるいは本願発明によつ て提供される中和領域を含むポリペプチド等による抗体の吸収が可能になる。 発明の開示
上述の状況の下、 本願発明者等は先の出願 （特開 2003- 284570号公報） におい て v W F切断酵素の単離同定を達成するべく、 鋭意研究を重ねた結果、 従来報告 のなかった所望の v W F切断酵素の精製単離に成功し、 その成熟型蛋白質のアミ ノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った。
そして、 先の出願 （特開 2003- 284570号公報） 記載の遺伝子組換え技術を利用 して得られた知見に基づき、 活性発現に必須と考えられる領域を特定した （特願
2 0 0 2 - 2 7 9 9 2 4 )。この知見に基づいて調製された変異体分子を利用した 本願発明の後天性 T T P患者の抗 ADAMTS- 13に対する自己抗体の認識する主要中 和領域解析の結果、 該自己抗体の認識領域は前記の活性発現に必須と考えられる 領域と一致して、 Cys- rich領域 （4 9 9位程度） から Spacer領域 （ 6 8 7位程 度） に存在することが明らかとなった。 よって、 本願発明で提供される抗
ADAMTS- 13 抗体に関する主要な中和ェピトープ領域の主たる要件は、 ADAMTS - 13 を構成するポリペプチド中の Cys- r ich領域（4 9 9位程度）から Spacer領域（6
8 7位程度） の領域または同等のアミノ酸配列を有するペプチド断片である。 す なわち、 本発明はフォンビルブランド因子特異的切断酵素 （以下、 v W F C Pも しくは ADAMTS- 13と称することがある） に対する抗体が認識する、 当該酵素の中 和ェピト一プ領域を包含するポリペプチドまたは当該ポリぺプチドに由来するべ プチド断片であり、 前記中和ェピトープ領域が、 配列番号 1に示されるアミノ酸 配列の 4 4 9位から 6 8 7位領域に存在するものである請求項 1記載のポリぺプ チドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。さらに、本発明は、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 4 4 9位から 6 8 7位のアミノ酸配列から なるポリべプチドまたは当該ポリべプチドに由来するペプチド断片であり、 配列 番号 1に示されるアミノ酸配列の 4 4 9位から 6 8 7位のアミノ酸配列において
1個または数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列からな り、 かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認識するポリべ プチドまたは当該ポリペプチドに由来するペプチド断片である。 ここで、 1個ま たは数個とは 1個から 5個、 好ましくは 1個から 3個さらに好ましくは 1個もし くは 2個をいう。
そして、 この知見から得られる AMMTS - 13のアミノ酸配列を基に調製される中 和ェピトープ領域のポリペプチド等を抗原にして、 通常の免疫方法 （Current Protocols in Molecular Biology, Edited by F. M. Ausbel et al. (1987)、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. (1996)、 Antibodies: A Laboratory Mannual, Edited by Harlow David Lane (1988) ある いは ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECK ( 1995 ))によってモノクローナル及びポリクローナル抗体等の作製が可能である。 あるいは、 ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display οί Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al. (1996)、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. (1996)、 あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK (1995)) により当該蛋白質 （ADAMTS-13) と結合する抗体の作出が 可能である。 あるいは、 これらの技術に基づき、 本酵素に対する自己抗体陽性で ある T T P患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離 も可能である。 そして、 これらの抗体を用いることで、 本酵素量の変動を伴う疾 病、 例えば TTPなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。 本発明はこ れらの抗体をも含有する。
—実施態様において、 本発明は、 TTP様の疾患または vWF依存性の血栓症 の恐れのある患者を診断する方法に関し、 該方法は、 以下の工程を含む：
本酵素量の変動を伴う疾病に関する診断的アツセィは、 患者からの生物学的試 料を用いて行われる。 これらの試料は、 直接的に用いられることができ、 または いくつかの事例においては、 アツセィを行う前に処置、 例えば干渉する可能性の ある試料中の物質を除去することなどを必要とすることができる。 適した生物学 的試料の例は、 血液、 尿、 汗、 組織または血清である。 該方法は、 上記生物学的
試料中の vWF切断酵素に対する自己抗体を検出することを含む。
( a ) 患者から得られた生物学的試料を、 ADMITS - 13 もしくはその部分ペプチド 断片を固定化した固型支持物と接触させること ；
( b )固型支持物を、現像剤標識化抗ヒ卜免疫グロプリン抗体と接触させること； 及び、 （c )試料中における抗 ADAMTS-13抗体の濃度に相応する値を得るために、 工程 （b ) において特異的に結合している現像剤の標識を検出すること。
上記診断は、 公知のィムノアッセィ方法により行うことができ、 固形支持物と してはポリスチレン等の樹脂製のピーズ、 プレート等を用いることができ、 現像 剤としては、 放射性同位元素、 ペルォキシダ一ゼ、 アルカリフォスファターゼ等 の酵素、 蛍光物質等を用いることができる。
本願発明の他の実施態様として、 本発明のポリペプチドは、 抗 ADAMTS- 13抗体 陽性患者への投与による自己抗体の中和剤としてまたは、 自己抗体除去剤として も有用である。 この場合、 自己抗体の中和とは、 自己抗体に結合し自己抗体が V
WF切断酵素に結合することを阻害することをいう。 この方法において、 ポリべ プチドは、 場合によっては適した支持物等、 当該分野に公知の方法を用いて固定 化される。 次いで、 除去すべき抗 AD崖 TS- 13抗体を含む試料、 たとえば患者血液 と固定化したポリペプチドを接触させることで患者試料中から自己抗体を除去す る。 この際、抗 ADATS- 13抗体に特異的なリガンドが結合した担体と患者の血液ま たは血漿を接触させ、血液または血漿中の抗 ADATS- 13抗体を前記リガンドに結合 させることにより血液または血漿から該抗体を除去し、 次いで抗体を除去した血 液または血漿を患者に再注入すればよい。 ここで、抗 ADATS-13抗体に特異的なリ ガンドとしては、 前記ポリぺプチドまたはポリぺプチド由来のぺプチド断片を用 いることができる。 また、 接触は例えば患者血液または血漿を上記リガンドが結 合した担体に通過させればよい。 さらに、 本発明は上記のポリペプチドもしくは 当該ポリぺプチドに由来するべプチド断片が結合した担体と抗 ADAMTS- 13抗体陽 性患者の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗 ADATS- 13抗体を前記 リガンドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗
ADAMTS- 13抗体を含まない血液または血漿を製造する方法を包含する。
抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者への投与する自己抗体の中和剤は、 上記のポリぺプ
チドもしくは当該ポリペプチドに由来するべプチド断片を有効成分として含む抗
ADAMTS-13 抗体陽性患者処置用医薬組成物である。 さらに、 ポリペプチドまたは 当該ポリペプチドに由来するペプチド断片が分子置換 ·欠失 ·挿入などの改変に より抗 ADAMTS- 13抗体との反応性が消失したポリベプチドもしくは当該ポリぺプ チドに由来するべプチド断片を有効成分として含む抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者処 置用医薬組成物である。 ここで、 分子置換 ·欠失 ·挿入などの改変とは、 例えば 上記ポリべプチドまたは該ポリペプチド由来のペプチド断片のァミノ酸配列にお いて、 1個または複数のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されることをいう。 このような改変により、例えばポリぺプチドまたはべプチド断片の構造が変化し、 ェピ！ プを喪失することにより、 抗 ADAMTS-13抗体との反応性が消失する。 例 えば、抗 AD崖 TS- 13抗体陽性患者への投与による自己抗体の中和剤として本発明 の抗 ADAMTS- 13抗体の認識するポリべプチドを使用する場合、生理食塩水、 緩衝液等で希釈して製剤化し、 医薬組成物を得ることもできる。 製剤の p Hは体液の p Hに近い弱酸性〜中性域の p Hが望ましく、 その下限は
5 . 0〜 6 . 4が望ましく、 その上限は p H 6 . 4〜 7 . 4が望ましい。 ま た、 凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、 こ の場合使用時に水、 生理食塩水、 緩衝液等で所望の濃度になるように溶 解して使用することができる。 本発明の製剤は、 通常医薬品に用いられる薬 理学的に許容される添加剤 （例えば担体、 賦形剤、 希釈剤等）、 安定化剤または製 薬上必要な成分を含有していてもよい。 安定化剤としては、 グルコース等の単糖 類、 サッカロース、 マルトース等の二糖類、 マンニトール、 ソルビトール等の糖 アルコール、 塩化ナトリウム等の中性塩、 グリシン等のアミノ酸、 ポリエチレン グリコール、 ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン共重合体 （プルロニッ ク）、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トウィーン）等の非イオン 系界面活性剤、 ヒトアルブミン等が例示され、 1〜1 0 wZ v %程度が添加され ていることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、 静脈内注射、 筋肉内注射、 皮下注射等により有効量で 投与することができ、 1回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、 年齢、 体重などによって異なるが、 1回あたり、 0 . 0 0 l m g〜 1 0 O m gが好
ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 071979号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗体のェピトープを決定するための C末欠失変異体作製法を示す図で ある。
図 2は、 調製された C末欠失変異体の発現を抗 F L A G抗体を用いて非還元下 ウエスタンプロットにてその存在量を確認した写真である。
図 3は、 後天性 T TP患者 00 3に由来する精製 I gGによる非還元下ウェス タンブロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図 4は、 後天性 TTP患者 0 04に由来する精製 I gGによる非還元下ウェス タンプロットによる認識領域の確認を行った写真である。
図 5は、 後天性 T TP患者 00 9に由来する精製 I gGによる非還元下ウェス タンプロットによる認識領域の確認を行つた写真である。
図 6は、 後天性 TTP患者に由来する精製 I gGのより詳細な認識領域の確認 を行った写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 実施例に従って本願発明を詳説するが、 本願発明はこれら実施例に何 等限定されるものではない。
実施例
調製例 1
(ADAMTS- 13C末欠失変異体の作製）
先の特許出願 （特願 2002 - 2 7 9 9 24) 記載の全長及び C末端より逐次 ドメインを欠失させた変異体 (Fulll427、 T1135L W1016X, W897L W808X、 W746X,
W688X, T581L Q449L W387L P285X, ：それぞれの数字は開始コドン AT Gのコ 一ドする Metから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、 Xは stopコドンを 表す。） 遺伝子発現ベクターを利用して、 Hela 細胞を用いて、 以下の手順でトラ
ンスフェク卜した。 図 1に各変異体の全長配列中における位置を示す。
まず初めに、 トランスフエクシヨンの 2 4時間前に 1一 3 X 105 個/ /35腿 dish で細胞を捲き、 その翌日に上記発現ベクターを I nも当たり 10 1 の Polyamine Transiect ion Reagentである TransIT (TAKARA社製） をとり、 Opt i- MEM等の無血 清培地 200 lに添加して、試薬添付文書に従い、 D NAとのコンプレックスを調 製後、 準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、 6時間インキュベーションし、 そ の 72時間後、培地を回収した。それぞれの変異体を適宜濃縮したものの検出は抗 FLAG-M2 抗体 （コダック社製） を用いたウェスタンプロット法により、 抗マウス I g G-アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った（図 2に発現 の様子を確認した結果を示す。）。
実施例 1
(ウェスタンプロットを利用した後天性 T T P患者抗体のェピトープの解析） 常法により、 プロテイン Aカラムを用いて後天性患者血漿より I g G画分を調 製し（抗体濃度約 2— 5 m g /m 1 )、それを 2 0 0倍希釈してウエスタンブロッ トを行った。 フィル夕一は二次抗体に抗ヒト I g Gアルカリフォスファタ一ゼ標 識抗体を用いて B C I P ZN B T基質により染色し可視化した（図 3〜5 )。 これ らにより決定された抗体の認識領域は 3者の抗体画分いずれにおいても W688Xま で反応し Q449Xで反応しないことから Q449Xよりも C末端側に存在することが確 認された。
実施例 2
(競合阻害の原理に基づくウエスタンプロットを利用した後天性 T T P患者抗体 の詳細なェピトープの解析）
次にさらに詳細な本中和抗体の認識ェピトープを絞り込むために、 及び
Ful卜 length wi ld typeの上清を電気泳動し PVDF膜へトランスファーしたものを、 前述の患者抗体を予め大過剰の Q449X、 W688X, あるいは Ful l- length wi ld type の発現上清の濃縮物とプレインキュベーションしたものを一次抗体反応液として 用いることで競合阻害の系により、 W688Xによりいずれの検体も Ful l- length wi ld typeの陽性バンドが消失することを確認した （図 6 )。
このことからこの 3者の抗体はいずれも W688Xよりも N末側を認識しているこ
とが示唆された。
以上、 実施例 1， 2に示す結果により、 用いた 3者の自己抗体は、 Q449X 末側 で W688Xよりも N末側すなわち Q449X と W688Xの間である Cys- rich領域から Spacer領域が主要な中和領域であることが確認された。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本願発明によりもたらされた知見により、 この発明のポリペプチドは、 抗 ADAMTS- 13抗体に対して特異的に免疫反応性を示す。 したがって抗 ADAMTS-13抗 体量の迅速な検出、 本酵素変動に伴う疾病の診断あるいは抗 ADAMTS- 13抗体の結 合あるいは阻害活性の中和が可能となる。 このように、 本願発明で提供されるポ リペプチドは、 抗 ADAMTS-13抗体の検出をはじめとする多種多様の用途を提供す るものでもある。
本願発明は、 斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、 斯界に貢献するこ と誠に多大な意義のある発明であると云える。
Claims
1 . フォンビルブランド因子特異的切断酵素 （以下、 v W F C Pもしくは ADAMTS-13 と称することがある） に対する抗体が認識する、 当該酵素の中和ェピ トープ領域を包含するポリべプチドまたは当該ポリべプチドに由来するべプチド 断片。
2 . 前記中和ェピトープ領域が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 4 4 9位から 6 8 7位領域に存在するものである請求項 1記載のポリペプチドまたは 当該ポリぺプチドに由来するべプチド断片。
3 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 4 4 9位から 6 8 7位のアミノ酸 配列からなるポリべプチドまたは当該ポリべプチドに由来するべプチド断片。
4 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 4 4 9位から 6 8 7位のアミノ酸 配列において 1個または数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつフォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体が認 識するポリべプチドまたは当該ポリべプチドに由来するべプチド断片。
5 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリぺプチドまたは当該ポリぺ プチドに由来するべプチド断片に結合性を有する抗体。
6 . 抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者血液中に存在する請求項 5の抗体。
7 . 非家族性血小板減少性紫斑病 (以下、 当該疾病を T T Pと称することが ある） 患者血液中に存在する請求項 5または 6に記載の抗体。
8 . ADAMTS- 13 を構成するポリペプチドの全配列または請求項 1から 4のい ずれか 1項に記載のポリべプチドまたは当該ポリべプチドに由来するべプチド断 片を含む抗体測定試薬。
9 . T T P患者の自己抗体を検出対象とする請求項 8記載の抗体測定試薬。
1 0 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドもしくは当該ポ リぺプチドに由来するべプチド断片を有効成分として含む抗 ADAMTS-13抗体陽性 患者処置用医薬組成物。
1 1 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリペプチドまたは当該ポリ ペプチドに由来するペプチド断片が分子置換 ·欠失 ·挿入などの改変により抗
ADAMTS- 13 抗体との反応性が消失したポリベプチドもしくは当該ポリぺプチドに 由来するペプチド断片を有効成分として含む請求項 1 0記載の抗 ADAMTS-13抗体 陽性患者処置用医薬組成物。
1 2 . 抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者の処置のための、 患者への投与による抗体の 中和に用いられる請求項 1 0または 1 1に記載の医薬組成物。
1 3 . 抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者を処置するための抗 ADAMTS- 13抗体に特異 的なリガンドを含む組成物であって、 担体に結合させ前記患者の血漿と接触させ 抗 ADAMTS - 13抗体を患者の血漿から除去するための用いられる請求項 1から 4の いずれか 1項に記載のポリべプチドもしくは当該ポリぺプチドに由来するべプチ ド断片を有効成分として含む組成物。
1 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載のポリべプチドもしくは当該ポ リベプチドに由来するべプチド断片が結合した担体と抗 ADAMTS- 13抗体陽性患者 の血液または血漿を接触させ、血液または血漿中の抗 ADiVTS- 13抗体を前記リガン ドに結合させ血液または血漿から該抗体を除去することにより抗 AD崖 TS - 13抗体 を含まない血液または血漿を製造する方法。
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| JP4451518B2 (ja) | ハイブリッド細胞、モノクローナル抗体、製造方法および測定方法 |
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