WO2004076476A1

WO2004076476A1 - 糖ペプチドおよびそのプロテオグリカンイニシエーターとしての使用

Info

Publication number: WO2004076476A1
Application number: PCT/JP2004/001089
Authority: WO
Inventors: Shinichiro Nishimura; Fumihiro Sato; Kenji Monde
Original assignee: Shionogi Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2004-09-10
Also published as: JPWO2004076476A1

Description

糖ペプチドおよびそのプロテオダリカンイニシエータ一としての使用技術分野

本発明は、糖ペプチドの新規合成方法に関する。本発明はまた、プロテオダリカンのイニシエータ一として使用さ明れ得る新規糖ペプチドおよびその利用法に関する。

書

背景技術

ヒ卜ゲノムの解析が完了し、次なる研究対象、ボストゲノム候補のひとつとして糖鎖が注目されている。糖鎖は遺伝子の直接的な支配を受けない。タンパク質の D N Aにあたるような铸型が糖鎖には存在せず、機能性糖鎖の生体内での存在量も少なく、単一の構造を大量に得るのが困難であるため、その機能解明がそれほど進んでおらず未知の領域がまだまだ多くある。し力し、ウィルスの感染に際しての細胞表面での宿主認識分子としての働きなどの糖鎖の役割のほんの一部だけに注目しても生体内において非常に重要な役割を担っていることがわかる。また、糖鎖は糖タンパク質、糖脂質などのように複合糖質として存在することが多い。これら複合糖質のうち本研究ではプロテオグリカンと呼ばれる糖夕ンパク質の一群に注目した。

プロテオダリカンは側鎖としてダリコサミノグリカン鎖 ( G A G鎖) と呼ばれる長い糖鎖を持つタンパク質の総称である。グリコサミノダリカンは古くはムコ多糖と呼ばれていた酸性多糖と同じもので、ゥロン酸（もしくはガラクトース）とァミノ糖の 2糖を繰り返し単位とする構造を持ち、その糖の種類や立体構造によって 4つに大別することができる（表 1 ) 。これらのうちヒアルロン酸は生体内ではプロテオダリカンとしてではなく遊離の G A G鎖として存在している。ヒアル口ン酸以外の G A G鎖は水酸基ゃァミノ基の硫酸化、ゥ口ン酸残基の 5位のェピ化などの修飾を受け多彩な微細構造の変化がある。このため GA G鎖は抗血液凝固活性など様々な機能を持つことができる。またコンドロイチン硫酸とタンパク質の結合領域の 4糖にもリン酸化や硫酸化などの修飾が起こる。これらの G A G鎖の修飾は、生物種や組織の違い、加齢や病理的変化によってその有無や程度が異なり、全く乱雑ではないものの複雑で、たとえコアタンパク質遺伝子のクローニングをしたとしてもそれだけでは G A G鎖の微細構造をそろえることはできない。酵素処理産物の解析により機能性ドメインの構造が明らかになっても還元末端から非還元末端までの配列はまだほとんど明らかになっていない。

(表 1 ： GA G鎖の基本糖鎖骨格構造）

一方コアとなるタンパク質は様々な種類があり、すべてのプロテオダリカンのコアタンパク質に対する共通点がある訳ではない。よってプロテオダリカンを分類する場合は GA G鎖の種類によってコンドロイチン硫酸プロテオダリカン、へパラン硫酸プロテオダリ力ンなどのように呼ばれることが多いが、 2種以上の G A G鎖を持つプロテオグリカンも多く存在する。

生体内に見られるプロテオグリカンの例を挙げる。軟骨中にはその主要構成成分のひとつとしてァグリカンと呼ばれるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが存在している。このァグリカンは多数の高度に硫酸化された GAG鎖を持ち、リンクタンパク質など他の軟骨構成成分と大きな会合体を形成することで軟骨特有の物性を担っていることが知られている。細胞膜貫通型プロテオダリカンフアミリ一であるシンデカンは、膜貫通型タンパク質であるインテグリンファミリ一や基底膜の主要な成分である I型コラーゲン繊維ゃフィブロネクチンと複雑に相互作用しレセプ夕一のように働くことによりインテグリンが担っている細胞接着を調節および制御している可能性があるといわれている。デコリンと呼ばれる小型のプロテオダリカンは TGF— )3 (卜ランスフォーミング成長因子—) 3) を貯留しその機能を調節しているといわれ、 TGF— j8が過剰になることによって起こる疾患（糸球体ネフローゼ、慢性リウマチ関節炎など）の治療薬開発の標的になろうとしている。また、脳内にもプロテオダリ力ンの存在が確認されており、ァルツハイマー病およびパーキンソン病で確認されているある種のタンパク質の凝集にプロテオグリカンもしくは GA G鎖が何らかの役割を担っている可能性がある (J e f f r e y A. Coh l b e r g, J i e L i, V l ad imi r N. U v e r s k y , and An t h o n y L. F i n k (2002) B i o c h em i s t r y 41, 1502— 1511 ) 。他にも基底膜や角膜などの成分としてもその存在が報告されている。

このようにプロテオダリカンは細胞外マトリックスゃ膜成分として体内に広く分布し、生体組織を構成したり生理現象の制御に関与したり重要な機能を担っていることから、その詳細な機能解明と応用を目指して盛んに研究が進められている。

プロテオダリカンを特徴づけている GAG鎖とコアタンパク質との結合部分にはいくつかの共通点が見られる。ケラタン硫酸型の一部を除くほとんどの GAG 鎖はコアタンパク質のセリン（S e r) またはスレオニン（Th r) 残基の側鎖水酸基と結合していることが知られている。これら O結合型の GAG鎖のうちコンドロイチン硫酸/デルマ夕ン硫酸型、へパラン硫酸/へパリン型の両グループは GAG鎖の還元末端側に特有の 4糖からなる共通結合領域を介してコアタンパク質と結合している（図 1) 。またこれらの 4糖共通結合領域を持つプロテオグリカンには GAG鎖結合のための共通したアミノ酸配列があることがわかっている。いくつかのプロテオダリカンで GAG鎖が結合していると思われるセリン残基周辺のアミノ酸配列について相同性を調べた報告がある（Ma r i o A. B o u r d o n, Tom Kru s i u s, S t eve n Campbe l l, N a n c y B . S c hwa r t z, a nd E r k k i Rou s 1 a h t i ( 1987) P r o c. Na t l . Ac ad. S c i. USA 84, 3194 -3 198) これによるとセリンのすぐ C末端側にグリシン (G 1 y) があり、さらに C末端側に任意のァミノ酸一残基隔ててもう 1つダリシンがあることがわかった。また、 N末端側に数残基隔てて 2つまたは 3つの連続した酸性アミノ酸も存在していた。さらにこれらの条件のいくつかまたはすべてを満たすぺプチドを合成しキシロース転移酵素のァクセプ夕一活性を調べることで、セリン残基のすぐ隣のダリシンが非常に重要であることが判明しており .. ついでもう 1つのグリシンが重要であり（S e r— G l y— Xa a— G l y) 、酸性アミノ酸の存在もァクセプ夕一活性を高めることがわかっている。ただし条件を満たすような配列から必ず GAG鎖が伸長するとは限らず S e r— G l yの 25回の繰り返しのうち 60 %程度の S e rに G A G鎖が結合しているという報告もある (Ma r i o A. Bou r d on, Ak e O l dbe r g, M i c h a e l P i e s c h b a c he r, and E r k k i R o u s 1 a h t i (1985) P r o c . a t l . Ac ad. S c i. USA 82， 1321— 1325) 。逆に全く異なつた配列から G A G鎖が伸長している場合もある。

上記以外のケラタン硫酸型の GAG鎖は O結合型、 N結合型の両方があり同様に GAG鎖とコアタンパク質の間に結合領域があるが、どちらも一般の糖タンパク質によく見られる配列に GAG鎖は結合している。 (図 2) プロテオダリカンの生合成は遺伝子をもとにコアタンパク質が作られ、コア夕ンパク質が GAG鎖伸長のイニシエータ一となり、小胞体、ゴルジ体と進んでいくに従って還元末端側から順番に GAG鎖が糖転移酵素によって合成され、さらに硫酸化などの修飾を受けていく。そして細胞外マ卜リックスや細胞膜など機能するべき場所へと届けられる（J e r emi ah E. S i l be r t, Ge e t h a Suguma r an (1995; B i o c h imi c a e t B i o p h y s i c a Ac t a 1241, 371— 384) (図 3) 。天然のコアタンパク質以外にも GAG鎖伸長の酵素の基質となり、イニシエータ一としてはたらく化合物について複数の興味深い研究報告がある。

前述のようなペプチドや天然のコア夕ンパク質ではなく全く異なつた物質とも言える P—ニトロフエ二ルー i3— D—キシロシドがー番目のガラクトース転移酵素のよい基質となりコンドロイチン硫酸鎖伸長のィ二シェ一夕一となるという報告かめる (M. Ok a y a m a , . K i m a t , and S . Su z u k i ( 1973) J. B i o c h em. 74, 1069— 1073) 。この化合物は還元末端のァグリコン部分が蛍光物質 (Y. Fukun aga, M. S o u e , N. Su z uk i, H. K u s h i d a , S . S uz uk i, S . Su z uk i (1975) B i o c h imi c a e t B i o phy s i c a Ac t a 381, 443 -447) や、様々なアルキル鎖（M. S o b u e, H. Ha b u c h i , K. I t o， H. Yon e ku r a, K. O g u r i , K. S a k υ r a i, S. Kamoh a r a, Y. Ueno, R. Noyo r i and S . Su z uk i (1987) B i o c hem. J . 241, 591— 601) であつてもイニシエータ一活性があることがわかっている。また、プロテオダリカンを生産しうる細胞の培養系へこれら ]3— D—キシロシドを導入することで GAG 鎖の伸長が起こるが、同一のァグリコンを持つ )3— D—キシロシドであっても培養する細胞によって伸長する GAG鎖の種類が違うことが知られている。このことは G A G鎖の分化の選択性はィニシェ一ターの性質というよりも生合成が行われる細胞やゴルジ内の環境によるところが大きいと示唆している。また、同じ 4 糖結合領域をもつへパラン硫酸/へパリン型の GAG鎖を持つプロテオダリカンを生産する細胞を用いた場合には特定のァグリコンを持つ場合に限ってのみィニシェーク一活性が認められている。これは GAG鎖の種類によって、生合成が行われるゴルジのコンパートメントが異なり、このコンパートメントヘイ二シェ一夕一である i8— D—キシロシドが浸透するためには、ァグリコンに特別な構造が必要なことを示唆している。もしくは、へパラン硫酸/へパリン型の GAG鎖骨格を生合成する糖転移酵素はコアタンパク質の構造に敏感なのかもしれない。これらの研究成果をふまえ、本研究では新たな G A G鎖伸長のィ二シェ一夕一となりうる化合物として、ただ GAG鎖伸長のイニシエータ一となるのではなくプロテオダリカンの構造を模倣した GAG鎖伸長というよりもむしろプロテオグリ力ン生合成のィニシエー夕一ともいえる糖ぺプチドを合成することとした。ところで、これまでに当研究室では北海道で多く生産されている牛乳から大量に安価で入手できるラクト一スの新たな活用法として、資源として有機合成の出発物質として有効利用し、これを全く別の有用な価値の高い糖、例えば、糖鎖合成の鍵中間体へ変換し応用する研究を行ってきた（S h i n— I c h i r o N i s h i m u r a , K o j i Ma t s uo k a, Te t s uy a F u r u i k e , No r i o N i s h i , S e i i c h i To ku r a, Ke n N a g arn i , S a d a o Mu r ay ama, a n d K e i s u k e K u r i t a (1 994) Ma c r omo l e c u l e s 27 1 57 - 163 ； T e t s u r o T s ud a, T e t s y a F r u i k e , and Sh i n— I c h i r o N i s h imu r a (1 996) Bu i 1. C h em. S o c. J p n. 69， 4 1 1— 4 1 6) 。ラクトースは 2糖でありガラクトース（G a 1) とグルコース（G 1 c) が β 1→4結合を介している（Ga 1 1→4G 1 c) 。オリゴ糖を合成する場合、単糖をそれぞれ対応するグリコシルドナー ·グリコシルァクセプタ一に調製し、立体化学を制御したうえでグリコシデ一ションを行う逐次合成をする必要がある。しかしこの JS 1→4結合をそのまま持つような糖を合成する場合、ラク卜一スを出発物とすることでグリコシデーシヨンや、煩雑な保護基の導入 ·架け替え ·脱保護をする回数を減らすことができ非常に効率的になる。図 1にある 4糖共通結合領域のうち還元末端側の 2糖であるガラクトースとキシロースに注目すると、 31→4結合を含み、ガラクトースとダルコ —スからなるラクト一スとは 6位のヒドロキシメチル基の有無以外、立体配置が同じであることがわかる。

そこで目的となる糖ペプチドの糖ユニットとしてプロテオダリカンに見られる GAG鎖の 4糖共通結合領域の還元末端側の 2糖を採用し、これまでに当研究室で培ってきたラクト一スを変換するという技術と方法論を応用 ·発展させ、逐次合成ではなくラクト一スを出発物質とした新規合成法により 2糖ュニッ卜を調製することとした。一方、目的となる糖ペプチドのうちペプチドユニットは先に述ベたような比較的重要だと考えられる S e r-G l y-Xa a-G l yを満たすもっとも簡単な配列として S e r-G 1 yの繰り返し配列とした。この繰り返しは天然のプロテオダリカンの中にも確認されている（糖鎖工学、 pp. 254- 281、 III. プロテオグリカンの糖鎖工学、鈴木旺； Ma r i o A. Bou r d o n, A k e O l d be r g, M i c h a e l P i e s c h b a c h e r , and E r k k i Rou s 1 a h t i ( 1985) P r o c. Na t 1. Ac ad. S c i . USA 82， 1321- 1325 ； H. C l em Ro b i n s o n, A l an A. Ho r n e r, Magnu s Hook, So r e n Og r e n, and U 1 f L i n d a h 1 ( 1978) J. B i o l . C em. 253, 19， 6687-6693 ; R am an a V. T a n t r a v a h i , R i c h a r d L. S t eve n s, K. F r ank Au s t e n， and J ohn H. We i s (1986) P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA 83, 9207-9210 ;および S h a 1 om Av r a h am, R i c h r d L. S t eve n s, Ch r i s t ophe r F . N i c o d emu s , Mi c he l C. Ga r t ne r, K. F r ank Au s t en, nd J ohn H. We i s (1989) P r o c. N a t 1. Ac ad. S c i . USA 86， 3763— 3767) 。さらに生体高分子であるプロテオダリカンのコア構造により近づけるため複数の糖鎖を持つポリ糖べプチドの形を最終的な合成目的構造とした。このべプチド配列には後述の合成戦略に関連して、繰り返し単位の C末端側に G 1 yがくることによりラセミ化を防ぐことができるメリットもある。

このポリ糖べプチドは生体内において G A G鎖が伸長することでプロテオグリカンそのものの代用になることが考えられる。たとえば、 4糖共通結合領域を持つプロテオダリカンを含む軟骨組織中にこの化合物を投与すると、プロテオグリカンを生合成している軟骨細胞において、この化合物をィ二シェ一夕一として疑似プロテオダリカンの生合成が起こり、これにより軟骨組織そのものの生合成が活性化されることが考えられる。つまり-. 目的となるポリ糖ペプチドは GAG鎖伸長のイニシエータ一活性が認められた場合、リゥマチ関節炎や変形性関節炎など軟骨の破壌を伴う疾患に対する治療として、軟骨の再生を促進する働きが期待 ≥ 4飞る。

以上のような状況にかんがみ、プロテオダリカンの構造を模倣した GAG鎖伸長のィ二シェ一夕一となりうるポリ糖べプチドを提供すること、糖べプチドの効率的な合成法を提供すること、 GAG鎖伸長のイニシエータ一（イニシエータ一）としての活性のある物質を提供することが当該分野において熱望されている。発明の開示

上述のように、本発明は、プロテオダリカンのイニシエータ一として使用することができる新規物質を探索すること、およびそのようなイニシエータ一として使用できる物質を効率よく合成する方法を提供することを課題とした。

本発明の上記課題は、ラクトースの改変体を糖ペプチドの合成に用いることによって、効率よく糖べプチドを合成することを見出したことによつて一部解決された。本発明はまた、ポリ糖ペプチドがプロテオグリカンのイニシエータ一として使用することができることを見出したことによつて一部解決された。

したがって、本発明は以下を提供する。

1. 以下の式：

O— X

一

y ―

(式中、 Glyはダリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変 ·体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で示される構造を有する、糖ペプチドまたはその改変体。

2. 前記 Xは、 - (1) 一 β - Ό一 Xy 1 p、一 (1) - β -D-Xy 1 p-

(1, 4) -β -D-G a 1 p、一 (1) - i3 - D - X y 1 - (1， 4) — β

-D-G a 1 p— (1， 3) - β-D-G a 1 p、 ― (1) 一 i3— D— Xy 1 p ― ( 1, 4) -i3 -D-G 1 p - ( 1 , 3) -β -Ό-G a 1 p- (1, 3)

-β -Ό-G 1 c pA, 一 (1) _i3 - D— Xy l p - （1， 4) -β-Ό-G a l p - ( 1 , 3) - jS—D— G a 1 p— ( 1， 3) -；8 - D— G 1 c p A -

(1, 4) — jS - D— Ga 1 pNAcおよび一（1) — ;8_D— Xy l p - （1，

4) 一) 3 - D - G a l p_ (1, 3) _/3— D— G a l p_ (1, 3) 一 j3 - D — G l c pA— (1, 4) - α-Ό-G 1 c pNAc (式中、 Xy 1 pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース、 G l c pAは、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）からなる群より選択される構造で示される糖鎖またはその改変体を含む、項目 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

3. 前記 Xは、一（1) 一 )3— D— Xy l p— （1, 4) — 一 D— Ga l p (式中、 Xy l pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む、項目 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

4. 前記 Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、項目 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

5. 前記 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、項目 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。 6. 以下の式：

Ser—— Gly

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは 0— Hまたは 0— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマ一ュニット (i) 、および Zまたは以下の式：

Thr—— Gly (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは〇—Hまたは O— X、ここで 0は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i i) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが〇—Xである、糖ペプチドまたはその改変体。

7. 前記モノマ一ユニット ( i) と前記モノマ一ユニット ( i i) との総和に対する該モノマーユニット（i) の割合が、 0. 1〜0. 9である、項目 6に記載の糖べプチドまたはその改変体。

8. 以下の式

一 (Y— G l y _π—

(式中、 Glyは、グリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体。

9. 前記糖ペプチドのペプチド部分は 4以上のアミノ酸を含む、項目 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。 10. 前記糖ペプチドのペプチド部分は 8以上のアミノ酸を含む、項目 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

11. 前記糖ペプチドのペプチド部分は環状ペプチドを形成する、項目 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

12. 前記糖ペプチドのペプチド部分は、ァセチル化されたものである、項目 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

13. 前記ァセチル化は、前記ペプチド部分の N末端に存在する、項目 12に記載の糖べプチドまたはその改変体。

14. 以下の式

一 (Y ^T-G I y— Y²— G I y) _n~

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹ および Y²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 0 は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体。

15. 糖ペプチドまたはその改変体を含む、プロテオダリカンイニシエータ一として使用するための組成物,

1 6 . 以下の式：

o - x

一 Y— G I y -

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、〇は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly——

(式中、 (； 1 yはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは 0 _ Hまたは 0— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i ) および Zまたは以下の式： Thr—— Gly——

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは 0— Hまたは O— X、ここで 0は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i i ) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが O— XT ある、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式：

(式中、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレォニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；

および

以下の式： O— X

一（Y¹— G i y— Y²— G I y) _n—

(式中、 G l yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹ および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 O は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数) で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含む、項目 1 5に記載の組成物。 1 7. 前記 Xは、一（1) 一 j8— D— Xy l p、一 (1) 一一 D— Xy l p 一 (1， 4) -jS -D-G a 1 p, 一 (1) 一 3— D— X y 1 - (1, 4) 一 β -Ό-Ga 1 p - (1， 3) 一 /3— D— Ga l p、一 (1) -β-D-Xy 1 P - （1 , 4) - iS -D-G a 1 p - ( 1 , 3) - /3 - D - G a 1 p— ( 1， 3) 一 ]3 - D— G l c pA、一 (1) 一 j3 - D_Xy l p— (1, 4) 一 )3 - D - G a 1 - (1, 3) - β -Ό-G a 1 p— (1， 3) - β -D-G I c p A ― ( 1 , 4) 一 /3 - D - G a 1 p N A cおよび一 ( 1) — β— D - Xy 1 p - (1 , 4) -i3 -D-G a 1 p- (1, 3) -β-D-G a 1 p- (1， 3) 一 iS -D-G 1 c p A- (1, 4) - α-D-G 1 c pNAc (式中、 Xy l pは、キシ口,ビラノース、 G a l pは、ガラクトピラノース、 G 1 c p Aは、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）からなる群より選択される構造で示される糖鎖またはその改変体を含む、項目 1 5に記載の組成物。 18. 前記 Xは、 ― （1) 一 ) 3— D— Xy l p— (1, 4) 一 ;3— D— Ga l p (式中、 Xy l pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む、項目 15に記載の組成物。

19. 前記 Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、項目 15に記載の組成物。

20. 前記 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、項目 15に記載の組成物。

21. 糖べプチドまたはその改変体を含む、プロテオダリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患の予防、処置または予後のための医薬組成物。

22. 以下の式：

O— X

一 Y— G I y— (式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、〇は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly——

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは 0— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマ一ユニット ( i ) および Zまたは、以下の式：

Thr—— Gly——

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 T rはスレオニンまたはその改変体、 Aは〇—Hまたは O— X、ここで〇は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマーユニット ( i i ) で構成され、総ァミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが 0— Xである、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式： O— X

― ( Y - G I y ) _n -

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；

および

以下の式：

― ( Y ¹— G I y— Y ²— G I y ) _n—

(式中、 G I yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y ¹ および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 O は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される、少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含む、項目 21に記載の組成物。

23. 前記プロテオダリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨破壌、骨粗鬆症、糸球体ネフローゼ、皮膚の脆弱化、扁平角膜、コラーゲン繊維の構造異常，皮膚の脆弱化、角膜不透明化、 X連鎖性先天性定常夜盲症、軟骨基質欠損、屈指一関節症一内反股 -心膜炎症候群、卵丘 ·卵母細胞複合体のマトリックス欠損、不妊、 Dy s s e gme n t a 1 Dy s p l a s i a、骨格異常、神経筋シナプス形成の異常、 S c hw a r t z— J amp e l症， S i l ve rman— Handmak e r型、 W i n g 1 e s s様表現型、 S imp s on-Go 1 a b i— Be hme 1症および骨格異常からなる群より選択される状態、障害または疾患を包含する、項目 21 に記載の医薬組成物。

24. 以下の工程：

(a) 被検体の状態、障害または疾患を同定する工程；

(b) 同定された該被検体の状態、障害または疾患から、必要とされるプロテォグリカンを決定する工程；

(c) 該プロテオダリカンを生体内で増加させるためのイニシエータ一として使用される糖ペプチドまたはその改変体を提供する工程；

(d) 該糖ペプチドまたはその改変体を該被検体に投与する工程、

を包含する、プロテオダリカンを必要とする状態、障害または疾患の治療のための方法。

25. 以下の工程：

(a) グルコース残基を含む糖鎖またはその改変体を提供し、該グルコース残基を残基内 1, 6脱水縮合させて、 1, 6無水糖鎖を生成する工程； (b) セリンおよび/またはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体を提供する工程；および

(c) 該 1， 6無水糖鎖と該ペプチドまたはその改変体とを脱炭素化および力ップリング反応させて、キシロース残基が該セリンおよびノまたはスレオニンに結合された糖ペプチドまたはその改変体を生成する工程、

を包含する、キシロース残基がペプチドに結合した糖ペプチドまたはその改変体の製造方法。 .

26. 前記工程（a) は、前記 1， 6無水糖鎖を保護することを包含する、項目 25に記載の方法。

27. 前記工程（c) は、脱保護することを包含する、項目 26に記載の方法。

28. 前記脱保護は、水素添加による脱保護である、項目 27に記載の方法。

29. さらに、

(d) 前記糖ペプチドまたはその改変体を重合して糖ペプチド重合体を生成する工程、

を包含する、項目 25に記載の方法。

30. さらに、

(e) 前記糖ペプチド重合体を分離する工程、

を包含する、項目 29に記載の方法。 31. さらに、

(f) 前記糖ペプチドまたはその改変体を環化する工程、を包含する、項目 25に記載の方法。本発明者らは、ラクト一スを糖鎖有機合成の出発物質として活用し、糖鎖合成の鍵中間体など価値の高い有用な糖への変換や応用の研究を続けてきた。ラクト一スと図 1の 4糖結合領域の還元末端側の 2糖の立体構造が非常に似ていることをふまえて、本研究では新たな GAG鎖伸長のイニシエータ一となりうる化合物として、プロテオグリカンの構造を模倣し、 GAG鎖伸長のイニシエータ一となりうるポリ糖ペプチドを、ラクト一スを出発物質として新規合成法により効率的に有機合成し、この化合物の GAG鎖伸長のイニシエータ一としての活性を調べることによって本発明は完成した。

このポリ糖ペプチドは生体内において G A G鎖が伸長することでプロテオグリカンそのものの代用になることが考えられる。たとえば、 4糖共通結合領域を持つプロテオグリカンを含むような軟骨組織中にこの化合物を投与すると、軟骨細胞はプロテオグリカンを生合成しているので、この化合物をイニシエータ一として疑似プロテオダリカンの生合成が起こりひいては軟骨組織そのものの生合成が活性化されることが考えられる。このことから目的となるボリ糖べプチドは G A G鎖伸長のイニシエータ一活性が認められた場合、リゥマチ関節炎や変形性関節炎など軟骨の破壊を伴う疾患に対する治療として、軟骨の再生を促進するという働きが期待される。図面の簡単な説明

図 1は、 GAG鎖とコアタンパク質との間に見られる 4糖結合領域の構造を示す図である。本図では、 GAG s→4G l οΑβ 1→3 Ga 1 β l→4Ga 1 β l→4Xy 1 jS 1→0—セリンが示される。

図 2は、ケラタン硫酸に見られる結合領域の例を示す図である。

図 3は、プロテオダリカン生合成の経路を例示する図である。リボソームで翻訳されてできたコアタンパク質は、本図に示されるような経路で細胞マトリックス、あるいは細胞膜へと配送され、この過程でそれぞれに特異的な GAG鎖をつける。また本図において、エンドサイト一シスによるリサイクル経路も存在することもまた示される。

図 4は、本発明の合成戦略を示す図である。本図では、ラクトースを出発物質として糖ユニットとペプチドユニットとを別々に調製した後、グリコシデーション、水素添加による脱保護、そして DPPAによる連続縮重合を行うという合成経路を用いて目的とするポリ糖ペプチドを生成する戦略が示される。

図 5は、 1 , 6無水ラクトース (Ac保護) の¹ H NMRスペクトルの例を示す図である。

図 6は、 2糖ユニット 13の¹ H NMRスペクトルの例を示す図である。本図では、特徴的な 4位の d d dが確認できる。

図 7は、 2糖テトラペプチドモノマーの DP P Aによる反応後の MALD I一 T OF— MSの例示である図である。本図においては、ポリマーの大半が二量体で環化したこと（図中、環状糖ペプチド 20) が示される。

図 8は、ァセチル化したモノマ一を用いた重合反応の M A L D I -TOF-M Sの例示である図である。

図 9は、本発明の例示的重合後の¹ H NMRスペクトルの比較の例を示す図である。各スペクトルは、上から順に、遊離なモノマ一、環状糖ペプチド、直鎖状ポリマ一のスぺクトルを示す。矢印は、それぞれァセチル化したモノマー由来、 S e r α-Η (糖あり）、 S e r a—H (糖なし）のピークの位置を示す。本図において、二糖ュニット由来のモノマーのスぺクトルの保存性が高いことが示されている。

図 10は、本発明の合成スキーム 1を例示する図である。スキーム 1は、工程 a〜eの 5つの工程において進行された。これら工程 a〜eは、以下の条件である： a. Ac₂0中 30%HB rZAcOH ; b. アセトン中 PCPONa ； c. i . KOH、 i i . ピリジン中 Ac ₂0 ; d. i . MeOH中NaOMe、 i i、 DMF中 NaH、 i i i . B n B r ； e . CH₂C 1₂中 PhSTMS、 TMS OT f。本図のスキーム 1に従えば、ァノマー位の立体は、ほぼひ結合に偏った (ひ： j3>20 : 1) 。

図 11は、本発明の合成スキーム 2を例示する図である。スキーム 2は、工程 a〜dの 4つの工程において進行された。これら工程 a〜dは、以下の条件である： a. i. Ts C l/ピリジン i i . 2—ブ夕ノン中 N a I (還流) ； b. DAST、 CH₂C 1₂中 NBS ； c. DMF中 DBU (還流）； d. 0₃、 Me OH中 Me ₂S ： THF。

図 12は、本発明の合成スキーム 3を例示する図である。スキーム 3は、工程 a〜 eの 5つの工程において進行された。これら工程 a〜eは、以下の条件である： a. i . ピリジン中 T s C 1 i i. 2—ブ夕ノン中 N a I (還流) ； b. DMF中 DBU (還流）； c. MeOH中 0₃、 Me ₂ S ： THF； d . i . C H₂C 1₂中 D I BAL_H、 i i . ォキサリルクロリド、 CH₂C 1₂中 DM F； e. THF中 Na.BH₃CN (還流）。

図 13は、本発明の合成スキーム 4を例示する図である。スキーム 4は、工程 a〜bの 2つの工程において進行された。これら工程 a〜bは、以下の条件である： a. T s OH · H₂0、ベンゼン中 Bn OH (還流) ； b. DMF中 DPP A、 TEA。

図 14は、本発明の合成スキーム 5を例示する図である。スキーム 5は、工程 a〜bの 2つの工程において進行された。これら工程 a〜bは、以下の条件である： a. N I S、 CH₃CN中 Tf OH : CH₂C l ₂ ; b. Pd— C、 DMF中 H₂、 H₂0、 Ac OH (圧力下）。工程 aの後、生成される化合物 14は、ひ体と) 3体とに分けられた（ひ： 0 = 1 ： 10) 。

図 15は、本発明の合成スキーム 6を例示する図である。スキーム 6は、図中に示される 3工程において進行された。これら工程は、以下の条件である： a. i . DMF中DPPA、 TEA、 i i . 2N HC 1—ジォキサン； b. DMF 中 DPPA、 TEA。

図 16は、本発明の合成スキーム 7を例示する図である。スキーム 7は、工程 a〜bの 2つの工程において進行された。これら工程 a〜bは、以下の条件である： a. CH₃CN中 N I S、 T f OH： CH₂C 1₂； b. i . DMF中 Pd— C, H₂、 H₂0、 Ac OH (圧力下） i i . NH₃a q. 。

図 1 7は、本発明の合成スキーム 8を例示する図である。スキーム 8は、工程 a〜 bの 2つの工程において進行された。これら工程 a〜bは、以下の条件である： a. DMF中 Ac₂〇； b. DMF中 DPP A、 TEA。

図 18は、 2糖テトラペプチド 1 7を用いた場合の、 NHAC— Kn細胞の培義培地から抽出した F I T Cラベル多糖の T S K GEL G— 3000からの. 溶出プロフィールを示す図である。矢印は、 48時間後の培養培地を示し、そして破線は、細胞がない場合のイニシエータ一と培養培地との混合物を示す。この矢印は、ポイドポリュ一ムを示している。

図 1 9は、ボリ糖べプチド 1 9を用いた場合の.， HAC-Kn細胞の培養培地から抽出した F I T Cラベル多糖の T S GEL G - 3000からの溶出プロフィールを示す図である。矢印は、 48時間後の培養培地を示し、そして破線は、細胞がない場合のィ二シェ一夕一と培養培地との混合物を示す。この矢印は、ボイドボリュームを示している。 . 発明を実施するための最良の形態

(詳細な説明）

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。 (用語）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および Zまたはその誘導体）が 1つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が有する水酸基およびアミノ酸は、後述の「保護基」で保護されていてもよい。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクト一ス、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N 一ァセチルガラクトサミン、シァル酸ならびにそれらの複合体および改変体など）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、

「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」および「糖」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合，本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。単位糖同士の結合は、その位置によって、 1， 2―、 a 1, 3—、 1， 4一、 a 1， 6―、 β 1, 2― などがあり、それらの表示は結合する単位糖における炭素の位置を併記すること、および通常その結合に関するァノマー（(¾、 jS) を記載する。糖鎖の結合に関する情報は複雑であり、ポリペプチド、ポリヌクレオチドのように簡素化することが困難であるが、例えば、 T r e nd s i n G l yc o s c i en c e a n d G l y c o t e c hn o l o gy 14， 127 - 137 (2002) では、リニアコードで糖鎖を表すことを提唱している。本明細書では、通常、 D型または L型の別、ァノマ一型（例えば、ひまたは β型）、結合（例えば、 1， 4 など）、糖の種類（例えば、グルコース、本明細書ではしばしば 3文字表記する）およびビラノース型、フラノ一ス型などを利用して糖鎖を表記するが、当該分野において慣用される他の表現様式もまた使用され得る。本発明の通常の表記様式に従えば、例えば、一（1) 一; S— D— Xy l p— (1, 4) —) 3—D— G a 1 pは、 1つ目の Xy 1 (キシロース）がピラノ一ス型であり、 jS型をしており、 D型のものであって、キシロースが他の分子と 1位で結合していることを示し、 2つ目の Ga l (ガラクト一ス）がピラノース型であり、 /3型をしており、 D型のものであって、ガラクト一スがキシロースと 1， 4結合していることを示す。

糖鎖としては、好ましくは、一（1) _i3— D_Xy 1 p、 — （1) ~β~Ό -Xy 1 - ( 1， 4) 一 j6 _D— G a l p、 - (1) 一 ;3 - D - Xy l p - ( 1， 4) 一 j8— D— G a l p— (1, 3) - β -D-G a 1 p, 一 (1) — β

- D - X y 1 p- (1， 4) - β-D-G a 1 - (1, 3) 一一 D— Ga l p - ( 1， 3) 一 |3 - D - G l c pA、 - ( 1) 一 β— D— X y 1 p - (1 , 4) -β -D-G a 1 p - (1， 3) -β -D-Ga 1 p - (1, 3) 一 β— Ό 一 G l c pA— (1， 4) — jS— D— G a 1 pNAcまたは一（1) 一 i3— D— X y 1 p - ( 1 , 4) 一 3— D— G a l p— （ 1， 3) - β -D-G a 1 p- ( 1， 3) - β -D-G 1 c p A- (1， 4) 一 α— D— G 1 c pNAc (式中、 Xy 1 pは、キシロビラノース、 G a 1 pは、ガラク卜ビラノース、 G l c pA は、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）の構造で示される糖鎖が挙げられる。さらに好ましくは、 ― (1) 一 β— D— Xy 1 p— (1， 4) 一) 3— D— G a 1 p (式中、 Xy 1 pは、キシロビラノース、 Ga 1 pは、ガラクトピラノース）が举げられる。

本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式 C_nH_{2 n}O_nで表される化合物をいう。ここで、 n = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 1 0であるものを、それぞれジォ一ス、トリオース、テトロース、ペントース、へキソース、ヘプトース、ォクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルド一ス，後者をケト一スという。

本明細書において単糖または糖鎖の「改変体」とは、単糖または糖鎖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、力ルポキシル基を有する糖（例えば、 C一 1位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、 D—ダルコ —スが酸化された D—ダルコン酸）、末端の C原子がカルボン酸となったゥロン酸（D—グルコースが酸化された D—グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体 (例えば、ァセチル化されたアミノ基) を有する糖 (例えば、 N—ァセチルー D—ダルコサミン、 N—ァセチルー D—ガラクトサミンなど) 、アミノ基および力ルポキシル基を両方とも有する糖 (例えば、 N—ァセチルノイラミン酸 (シアル酸) 、 N—ァセチルムラミン酸など) 、デォキシ化された糖 (例えば、 2—デォキシ—D—リポース) 、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、へミアセタール構造を形成した単糖または糖鎖において、アルコールと反応してァセタール構造のグリコシドもまた、単糖または糖鎖の誘導体の範囲内にある。

本明細書において「複合糖鎖」または「糖鎖含有物質」は、互換可能に使用され、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「残基」は、当該分野において通常の意味で用いられ、重合体における単位物質の分子の根幹部をいう。従って、糖鎖または糖ペプチドにおいて、キシ口一ス残基という場合、キシロースから糖またはペプチドとの結合に必要な部分（例えば、水素原子）を除いた部分をいう。ただし、特に区別を必要としない場合は、糖残基またはアミノ酸残基は、通常の糖またはアミノ酸と互換可能に使用され得る。

本明細書において「無水糖鎖」とは、水素基および水酸基とを脱水させることによって得られる糖鎖をいう。そのような無水糖鎖としては、たとえば、 1 , 6 無水ラクトースなどが挙げられるがそれに限定されない。

本明細書において「残基内脱水縮合」とは、糖鎖において用いられる場合、その糖鎖のある糖残基内の水素基および水酸基を脱水させて縮合させることをいう。本明細書において「脱炭素化」とは、有機化合物において、炭素原子を脱離させるような反応をいう。そのような脱炭素化としては、例えば、糖鎖上のヒドロキシルメチルの除去などが挙げられるがそれに限定されない。

本明細書において「カップリング」とは、 2以上の分子を結合させる反応をいう。例えば、ペプチドおよび糖鎖が提供される場合、そのペプチドおよび糖鎖は力ップリングされて、糖べプチドが提供される。

本明細書では、「保護基」とは、ある化学反応からの影響を抑制するような置換基をいい、反応性の高い位置を反応させないために導入される。そのような保護基は、所望の反応において保護される置換基がその反応によって改変されないようなものであれば、どのようなものを用いてもよい。そのような保護基としては、例えば、ァニリンのニトロ化を行なう際に，そのまま硝酸と処理するとアミノ基が酸化されることから、予めァセチル化しておきニトロ化を行なった後，ァセチル基を加水分解で外すと目的の二トロア二リンが得られる。この場合、ァセチル基はァミノ基の保護基という。反応の条件および/または目的に応じて種々の保護基を使い分けることができる。例えば、ヒドロキシ基の保護基にはァセチル基、ベンゾィル基、ベンジル基、シリル基などが使用され得、ァミノ基にはァセチル基のほかべンジルォキシカルボニル基、 t一ブトキシカルボニル基などが使用され得る。

本明細書において「脱保護」とは、保護基を脱離させる反応をいう。そのような脱保護の反応としては、例えば、水素添加、加水分解、酸化還元反応などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「重合」とは、ある構成単位（例えば、本発明の糖ペプチドまたはその改変体）を 2つ以上縮合などの反応によって連結する反応をいう。重合は通常、同じ構成単位を連結することによって達成されるが、異なる構成単位を連結することによつても得られる。そのような重合は、本明細書において特に共重合ともいう。本発明の糖ペプチドが重合される場合、通常、ペプチド部分がペプチド結合を介して重合する。本明細書において「重合体」とは、そのような重合反応によって得られた化合物をいう。本明細書において「重合」は、ホモ重合またはへテロ重合の両方を指す。「ホモ重合」とは、同一の単量体による重合をいい、「ヘテロ重合」とは、異なる単量体を用いた重合をいう。本明細書では、糖べプチドが重合したものを特にポリ糖ペプチドという。

本明細書において「環化」とは、ある分子が環状に連結される反応をいい、特に、非環式化合物の分子内または分子間で結合ができて環構造をつくる反応をいう。本発明の糖ペプチドの環化は、通常、分子間で結合ができて環構造を作る。本明細書において、目的の物質の「分離」とは、その物質が、分離前に試料中に存在する状態から実質的に引き離すまたは精製することをいう。従って、試料から分離された物質は、分離される前に含んでいた目的の物質以外の物質の含量が少なくとも低減している。

本明細書において、物質（例えば、糖鎖、糖ペプチド、核酸またはタンパク質などの生物学的因子）の「単離」とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の物質（例えば、糖鎖または糖鎖含有物質である場合、糖鎖または糖鎖含有物質以外の因子、あるいは、目的とする糖鎖または糖鎖含有物質以外の糖鎖または糖鎖含有物質；核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」、糖鎖または糖鎖含有物質には、本発明の精製方法によつて精製された糖鎖または糖鎖含有物質が含まれる。したがって、単離された糖ペプチドまたはその改変体は、化学的に合成した糖ペプチドまたはその改変体を包含する。

本明細書において、物質（例えば、糖鎖、核酸またはタンパク質などの生物学的因子）の「精製」とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部を除去することをいう。したがって、精製および分離は、その形態が一部重複する。したがって、通常、精製された物質 (例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子）におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）が、天然に随伴する因子が低減されている限り、濃縮されていない状態も「精製」の概念に包含される。

本明細書において物質（例えば、糖ペプチドまたはその改変体）の「濃縮」とは、その物質が濃縮前に試料に含まれている含有量よりも高い濃度に上昇させる行為をいう。従って、濃縮もまた、精製および分離と、その概念が一部重複する。したがって、通常、濃縮された物質（例えば、糖ペプチドまたはその改変体）は、その物質が通常存在する状態における不純物の含有量は低減されているが、目的とする物質の含有量が増加している限り、ある特定の不純物が増加していてもよく、「精製」されていない状態も「濃縮」の概念に包含される。

本明細書において「糖ペプチド」とは、糖が結合したペプチドをいい、本明細書において糖タンパク質と互換可能に用いられる。本明細書において「糖タンパク質」としては、例えば、酵素、ホルモン、サイト力イン、抗体、ワクチン、レセプ夕一、血清タンパク質およびそれらのフラグメント、ならびにそれらの模倣物などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「糖ペプチドの改変体」は、糖ペプチドの一部が置換基などによって改変された化合物をいう。従って、糖ペプチドの改変体は、そのべプチド部分が改変されていてもよく、糖部分が改変されていてもよい。

本明細書において「生物学的適合性」とは、生物に投与しても有害な影響を与えない性質をいう。そのような性質は、実際に生物自体に投与しても判定することができるが、細胞に投与し、その増殖の阻害を観察することによってもまた判定することができる。あるアミノ酸の生物学的適合性を有する（改変体は、例えば、そのアミノ酸が、アルキル基などが付加されることによって改変されていてもよく、そのような生物学的適合性は、実際のそのアミノ酸またはそれを含む化合物を生物または細胞に投与することおよび改変されていないアミノ酸またはそれを含む化合物を等量投与すること、ならびにそれらの成長 ·増殖に関するパラメータを比較することによって判定することができる。

本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のボリマ一をいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものも包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変 (例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むボリペプチド (例えば、非天然のアミノ酸などを含む) 、ペプチド様化合物 (例えば、ぺプトイド) および当該分野において公知の他の改変が包含される。従って、本発明のスクリーニング方法が目的とする酵素がポリペプチドである場合、このような改変体を使用してもよい。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。本明細書において「ヌクレオチド」は、アミノ酸をコードすることができる限り、天然のものでも非天然のものでもよい。本明細書において核酸配列、アミノ酸配列などの「相同性」とは、 2以上の核酸配列、アミノ酸配列などの、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの核酸配列、アミノ酸配列などの相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の核酸配列、アミノ酸配列などが相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の塲合ストリンジェン卜な条件下でのハィブリダイゼーシヨン法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で D N A配列が、代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、好ましくは少なくとも 7 0 %同一である場合、より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 %、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 %、 9 8 %または 9 9 %同一である塲合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など) の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ (同一) とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。

本明細書では塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ッ —ルである B L A S Tを用いてデフオルトパラメ—夕を用いて算出される。本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。特に区別する場合、それぞれ天然ァミノ酸および非天然ァミノ酸という。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のァミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L一異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、？—カルポキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体であるが、 D体のァミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ一ニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラ一フルオロフェニルァラニン、 3—ァミノ一 2—ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体および D—フエ二ルァラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および Zまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、力ナパニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、ァミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。

アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— I UB B i o c h emi c a l Nomen c l a t u r e Co mm i s s i o nにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレォチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コ一ドにより言及され得る。

本明細書において、「対応する」ヌクレオチド、単糖またはアミノ酸とは、あるポリヌクレオチド分子、糖鎖分子またはポリぺプチド分子において、比較の基準となるポリヌクレオチド、糖鎖分子またはポリぺプチドにおける所定のヌクレォチド、単糖またはアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチド、単糖またはアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸または糖鎖もしくは単糖をいう。あるいは、酵素分子のコンフオメ—シヨン変化に寄与する場合、そのような変化に寄与するアミノ酸または糖鎖もしくは単糖をいう。

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n) に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリぺプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0 およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 1 1など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0、 7 5、 1 0 0およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ (例えば、 1 1など) もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリぺプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下 1 0 %) のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がイニシエータ一である場合、生物学的活性は、そのイニシエータ一が目的とする分子の成長が開始または増強される性質をいう。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。

本明細書において、ペプチドを生産する方法は、合成技術を用いてもよいし、遺伝子工学を用いてもよい。そのような遺伝子工学的手法としては、例えば、そのポリぺプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子工学的手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換えポリぺプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポ ύペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞に由来するポリぺプチドは、天然型のポリぺプチドと実質的に同一の作用を有する限り、ァミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が置換、付加および/または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および Ζまたは欠失していてもよい。好ましくは、糖鎖はないほうが有利である。所望の糖鎖を本発明によって結合することができるからである。

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って.. 特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持する夕ンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたべプチドまたはこのペプチドをコードする対応する D Ν Αにおいて行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。夕ンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Kyt e. Jおよび Do o l i t t i e, R. F. J . Mo 1. B i o l. 157 (1) ： 105 - 132, 19 82) 。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプ夕一、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（+

4. 5) ；バリン（+4. 2) ；ロイシン（+3. 8) ；フエ二ルァラニン（+ 2. 8) ；システィン Zシスチン（+2. 5) ；メチォニン（+ 1. 9) ；ァラニン（+ 1. 8) ；グリシン（一 0. 4) ；スレオニン（— 0. 7) ；セリン (一 0. 8) ；トリプトファン（一 0. 9) ；チロシン（一 1. 3) ；プロリン

(一 1. 6) ；ヒスチジン (-3. 2) ；グルタミン酸 (-3. 5) ；グルタミン（一 3. 5) ；ァスパラギン酸 (—3. 5) ；ァスパラギン（一 3. 5) ；リジン（一 3. 9) ；およびアルギニン (一 4. 5) ) である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有する夕ンパク質 (例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が士 2以内であることが好ましく、土 1以内であることがより好ましく、および土 0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第 4 554、 1 0 1号に言己載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+ 3. 0) ；リジン（+ 3. 0) ；ァスパラギン酸（+ 3. 0 ± 1 ) ；グルタミン酸 (+ 3. 0士 1) ；セリン（+0. 3) ；ァスパラギン（+0. 2) ；グルタミン（+0. 2) ；グリシン (0) ；スレオニン (- 0. 4) ；プロリン (一 0. 5 ± 1) ；ァラニン（一 0. 5) ；ヒスチジン（一 0. 5) ；システィン（一 1. 0) ；メチ才ニン (一 1. 3) ；バリン（― 1. 5) ；ロイシン（一 1. 8) ；イソロイシン（一 1. 8) ；チロシン（—2. 3) ；フエ二ルァラニン（一 2. 5) ；およびトリブトファン（—3. 4) 。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ±2以内であることが好ましく、 ± 1以内であることがより好ましく、および ± 0. 5以内であることがさらにより好ましい。

本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または //および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、 ± 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ± 0 . 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、〇型の糖鎖結合について言及する場合、「保存的置換」は、セリンおよびスレオニンならびにそれらの生物学的適合性を有する改変体のうち酸素原子を保持するものからなる群の中での置換をいう。

本明細書において、ペプチドの「改変体」とは、もとのペプチドなどの物質に対して, 一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（t r u n c a t e d ) 改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。置換は、上述の保存的置換でもよく、そうでなくてもよい。置換されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸であってもよい。あるいは、置換されるアミノ酸は、アミノ酸アナログでもよい。

本明細書において「イニシエータ一」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいい、本明細書において「プライマー」ともいう。本明細書において、「プロテオダリカンイニシエータ一」とは、生体または細胞内において、投与された後に糖鎖および Zまたはペプチド鎖が伸長する能力を有する物質をいう。そのようなプロテオグリカンィニシェ一夕一は、投与されるべき生物に応じて適切なものが変動することは当業者には明らかである。

本明細書において「プロテオダリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患」とは、生体内または細胞内のプロテオダリカンの通常のレベルとは異なるレベルに起因するかまたはそのようなレベルを伴う状態、障害または疾患をいう。そのような疾患、障害または状態としては、例えば、循環器系疾患（貧血 (例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、癌性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、癌または腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫）など）；神経系疾患（痴呆症、脳卒中およびその後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷など）；免疫系疾患（T細胞欠損症、白血病など）；運動器 ·骨格系疾患（骨折、骨粗鬆症、関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨形成不全症、骨軟骨異形成症など）；皮膚系疾患（無毛症、黒色腫、皮膚悪性リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疮症、膿疱症、皮膚炎、湿疹など）；内分泌系疾患（視床下部 ·下垂体疾患、甲状腺疾患、副甲状腺（上皮小体）疾患、副腎皮質 *髄質疾患、糖代謝異常、脂質代謝異常、タンパク質代謝異常.. 核酸代謝異常、先天性代謝異常（フェニールケトン尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メ一プルシロップ尿症）、無アルブミン血症、ァスコルビン酸合成能欠如、高ピリルビン血症、高ピリルビン尿症、力リクレイン欠損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレツシン分泌異常、侏儒症、ウォルマン病（酸リパーゼ (A c i d l i p a s e ) 欠損症）、ムコ多糖症 V I型など) ；呼吸器系疾患（肺疾患（例えば、肺炎、肺癌など）、気管支疾患、肺癌、気管支癌など）；消化器系疾患（食道疾患（たとえば、食道癌）、胃 ·十二指腸疾患（たとえば、胃癌、十二指腸癌）、小腸疾患 ·大腸疾患（たとえば、大腸ポリープ、結腸癌、直腸癌など）、胆道疾患、肝臓疾患（たとえば、肝硬変、肝炎（A型、 B型、 C 型、 D型、 E型など）、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝癌、アルコール性肝障害、薬物性肝障害）、塍臓疾患（急性塍炎、慢性塍炎、塍臓癌、嚢胞性滕疾患）、腹膜 ·腹壁 '横隔膜疾患（ヘルニアなど）、ヒルシュスプラング病など）；泌尿器系疾患（腎疾患（腎不全、原発性糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎障害、腎癌など）、膀胱疾患（膀胱炎、膀胱癌など）など）；生殖器系疾患（男性生殖器疾患（男性不妊、前立腺肥大症、前立腺癌、精巣癌など）、女性生殖器疾患（女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮癌、子宮内膜症、卵巣癌、絨毛性疾患など) など）；循環器系疾患（心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋 ·心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤）、リンパ管疾患（たとえば、リンパ浮腫）など）などが挙げられるがそれらに限定されない。

そのようなプロテオダリ力ンの異常に関連するかまたはプロテオダリ力ンを必要とする状態、障害または疾患としては、好ましくは、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨破壌、骨粗鬆症、糸球体ネフローゼ、皮膚の脆弱化、扁平角膜、コラーゲン繊維の構造異常，皮膚の脆弱化、角膜不透明化、 X連鎖性先天性定常夜盲症軟骨基質欠損、屈指一関節症 -内反股—心膜炎症候群、卵丘卵母細胞複合体のマトリックス欠損、不妊、 Dy s s e gme n t a l Dy s p l a s i a、骨格異常、神経筋シナプス形成の異常、 S c hwa r t z— J amp e l 症， S i l ve rman— Handmak e r型、 Wi ng l e s s様表現型、 S imp s on— Go 1 a b i一 Behme 1症、骨格異常などが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、そのような状態、障害または疾患は、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節炎）を含む。

本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウィルスなどを含むがそれらに限定されない。そのような生体は、プロテオグリカンが生存に関係する生物であれば、どのようなものでもよく、動物、植物、細菌、ウィルスを問わない。生体は、好ましくは動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）が挙げられる。より好ましくは、生体は、好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）であり得る。より好ましくは霊長類であり、もっとも好ましくはヒトである。

本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジエニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、プロテオダリカンの伸長をすることが知られる細胞が用いられ得る。好ましくは本明細書では、細胞は軟骨細胞であり得る。

(本明細書において用いられる一般技術）

本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、有機化学、生化学、医学、薬学、遗伝子工学、分子生物学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Man i a t i s， T. e t a 1. (1989) . Mo l e c u l a r C l o n i n g ： A L a bo r a t o ry Manu a l , Co l d Sp r i ng Ha r b o rおよびその 3 r d Ed• (2001) ； Au s u b e 1， F. M. ， e t a 1. e d s , C u r r e n t P r o t o c 0 1 s i n Mo 1 e c u 1 a r B i o 1 o g y, J o h n Wi l ey & S o n s I nc. ,

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1 1 ， S h a b a r o v a, Z • e t a 1. (1 9 9 4) . Advan c e d

0 r g a n i c Ch e m i s t r y o f N u c 1 e i c Ac i d s,

We i n h e i m ； B 1 a c k b u r n , G. M. e t a 1. (1996) .

Nu c 1 e i c Ac i d s i n C h e m i s t r y and B i o 1 o g y Ox f o r d U n i v e r s i t y P r e s s ； He rman s on_:

G. T . (1 99 6) . B i o c 0 n j u g a t e T e c h n i q u e s , A c a d e m i c P r e s s ； Me t h o d i n E n z ymo l ogy 2

30 、 242 、 2 47、 A c a d e m i c P r e s s 、 1 994 ;畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイェンティフイク、 1997 ;糖鎖分子の設計と生理機能日本化学会編、学会出版センター、 2001などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

薬学の分野では、例えば、日本薬局方第 14版またはその最新版、 Remi n g t o n ' s Ph a rma c eu t i c a l S c i e n c e s, 18 t h Ed i t i on, A. R. Genn a r o, e d . ， Ma c k P u b 1 i s h i n g Comp any, 1990などが本明細書において参考として援用される。

医学の分野においても、種々の技術常識を示す文献を用いて、当業者は本発明を実施することができる。そのような文献は当業者には周知である。

(有機化学）

本発明の化合物は、（A) — (B) という模式図で表すことができる。（A) は糖鎖またはその改変体であり、（B) はペプチドまたはその改変体であり得る。本発明の化合物はまた、このような構造の重合体であり得る。

(A) および (B) は、以下のような官能基で置換することができる。そのような置換基を以下に説明する。

本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水素 (アルカン) から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_{2n + 1}—で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルの Hが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、 C 1〜C2アルキル、 C 1〜C 3アルキル、 C 1〜C4アルキル、 C 1〜C 5アルキル、 C 1〜C 6アルキル、 C 1〜C 7アルキル、 C 1〜C8ァルキル、 C 1〜C 9アルキル、 C 1〜C 10アルキル、 C 1〜C 1 1アルキルまたは C 1〜C 12アルキル、 C 1〜C 2置換されたアルキル、 C 1~C3置換されたアルキル、 C 1〜C4置換されたアルキル、 C 1〜C 5置換されたアルギル、 C 1〜C 6置換されたアルキル、 C 1〜C 7置換されたアルキル、 C 1〜C8置換されたアルキル、 C 1〜C 9置換されたアルキル、 C 1〜C 10置換されたァルキル、 C 1〜(： 1 1置換されたアルキルまたは C 1〜C 12置換されたアルキルであり得る。ここで、例えば C1〜C 10アルキルとは、炭素原子を 1〜 10 個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（CH₃—）、ェチル (C₂H₅_) 、 n—プロピル（CH₃CH₂CH₂—）、イソプロピル ( (CH ₃) ₂CH—）、 n一ブチル (CH₃CH₂CH₂CH₂—）、 n—ペンチル (CH ₃CH₂CH₂CH₂CH₂— ) 、 n—へキシル (CH₃ CH₂ CH₂ CH₂ CH₂ CH ₂— ) 、 n—ヘプチル（CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂—）、 n—ォクチル ( C H 3 C H 2 C H 2 C H 2 C H ₂ C H ₂ C H 2 C H 2 - ) 、 n—ノニル（CH₃ C H ₂ C H ₂ C H ₂ C H 2 C H ₂ C H ₂ C H 2 C H 2 - ) 、 n—デシル (CH₃CH₂C H 2 C H 2し H C H 2 C H し H'2 C H ₂ C H ₂― ) 、 — し ( C H ₃ ) ₂ C H ₂ C H ₂ CH (CH₃) — CH₂CH (CH₃) ₂などが例示される。また. 例えば. C 1〜C 10置換されたアルキルとは、 C 1~C 10アルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。

本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルの Hが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、 C 3〜C4シク口アルキル、 C 3〜C 5シクロアルキル、 C 3〜C 6シクロアルキル、 C3〜C 7シクロアルキル、 C 3〜C 8シクロアルキル、 C 3〜C 9シクロアルキル、 C 3〜C 10シクロアルキル、 C 3〜C 1 1シクロアルキル、 C 3〜C 12シクロアルキル、 C 3〜C 4置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 5置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 6置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 7置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 8置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 9置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 10置換されたシクロアルキル、 C3〜C 11置換されたシクロアルキルまたは C 3〜C 12置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロへキシルなどが例示される。本明細書において「ァルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1 価の基をいい、一般に C_nH_2n— i—で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたァルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルの Hが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、 C 2〜C 3ァルケニル、 C 2〜C4アルケニル、 C 2〜C 5アルケニル、 C 2〜C 6アルケニル、 C 2〜C 7アルケニル、 C 2〜C 8アルケニル、 C 2〜C 9アルケニル、 C2〜 C 10アルケニル、 C 2〜C 1 1アルケニルまたは C 2〜C 12アルケニル、 C 2 ~C 3置換されたァルケニル、 C 2〜C 4置換されたァルケニル、 C2〜C 5 置換されたァルケニル、 C 2〜C 6置換されたァルケニル、 C2〜C7置換されたァルケニル、 C 2〜C 8置換されたァルケニル、 C 2〜C 9置換されたァルケニル、 C 2〜C 10置換されたァルケニル、 C 2〜C 1 1置換されたアルケニルまたは C 2〜C 12.置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えば C2〜C 10アルキルとは、炭素原子を 2〜10個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル (CH₂ = CH-) 、ァリル (CH₂ = CHCH₂ -) 、 CH₃C H = C H—などが例示される。また、例えば、 C 2〜C 10置換されたァルケ二ルとは、 C 2〜C 10アルケニルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。

本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルの Hが置換されたシクロアルケニルをいう。具体例としては、 C 3〜C 4シクロアルケニル、 C 3〜C 5シクロアルケニル、 C3〜C6シクロアルケニル、 C 3〜C 7シクロアルケニル、 C 3〜C 8シクロアルケニル、 C 3〜 C 9シクロアルケニル、 C3〜(： 10シクロアルケニル、 C 3〜C 11シクロアルケニル、 C 3〜C 12シクロアルケニル、 C 3〜C4置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 5置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 6置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 7置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 8置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 9置換されたシクロアルケニル、 C3〜C 10置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 1 1置換されたシクロアルケニルまたは C 3〜C 12置換されたシクロアルケニルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケ二ルとしては、 1—シクロペンテニル、 2—シクロへキセニルなどが例示される。本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_2n— ₃_で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルの H が置換されたアルキニルをいう。具体例としては、 C2〜C3アルキニル、 C 2 〜C 4アルキニル、 C2〜C 5アルキニル、 C2〜C6アルキニル、 C 2〜C 7 アルキニル C2〜C8アルキニル、 C2〜C9アルキニル C2〜C 10アルキニル、 C2〜C 1 1アルキニル、 C 2〜C 12アルキニル、 C 2〜C 3置換されたアルキニル、 C 2〜C 4置換されたアルキニル、 C 2〜C 5置換されたアルキニル、 C 2〜C 6置換されたアルキニル、 C 2〜C 7置換されたアルキニル、 C 2〜C 8置換されたアルキニル、 C 2〜 C 9置換されたアルキニル、 C2〜C 10置換されたアルキニル、 C2〜C 1 1置換されたアルキニルまたは C 2〜C 12置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、 C 2〜C 10アルキニルとは、例えば炭素原子を 2〜10個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、ェチニル（CH=C—）、 1一プロピニル（CH₃C = C—）などが例示される。また、例えば、 C 2~C 10置換されたアルキニルとは、 C 2〜C 10アルキニルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_2n+10—で表される（ここで、 nは 1以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシの Hが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、 C 1〜C 2アルコキシ、 C 1〜C3アルコキシ、 C 1〜C4アルコキシ、 C 1〜 C 5アルコキシ、 C 1〜C6アルコキシ、 C 1〜C 7アルコキシ、 C 1〜C8ァルコキシ、 C 1〜C9アルコキシ、 C 1〜C 10アルコキシ、 C 1〜C 11アルコキシ、 C 1〜( 12アルコキシ、 C 1〜C 2置換されたアルコキシ、 C 1〜C 3置換されたアルコキシ、 C 1〜C4置換されたアルコキシ、 C 1〜C5置換されたアルコキシ、 C：！〜 C 6置換されたアルコキシ、 C 1〜C7置換されたアルコキシ、 C 1〜C 8置換されたアルコキシ、 C 1〜C 9置換されたアルコキシ、 C 1〜C 10置換されたアルコキシ、 C 1〜C 1 1置換されたアルコキシまたは C 1〜C 12置換されたアルコキシであり得る。ここで、例えば、 C 1~C 10 アルコキシとは、炭素原子を 1〜10個含む直鎖または分枝状のアルコキシを意味し.. メ卜キシ (CH₃0―) 、エトキシ（C₂H₅0—）、 n—プロボキシ (C H₃CH₂CH₂〇一) などが例示される。

本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であつて、前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基の Hが置換された炭素環基をいう。具体例としては、 C3〜C4炭素環基、 C3〜C5炭素環基、 C3〜C6炭素環基、 C3〜C 7炭素環基、 C3〜C8炭素環基、 C3〜C9炭素環基、 C3〜C 10炭素環基、 C3〜C 11炭素環基、 C3〜C12炭素環基、 C 3〜C 4置換された炭素環基、 C 3〜C 5置換された炭素環基、 C3〜C6置換された炭素環基、 C 3〜C 7置換された炭素環基、 C3〜C8置換された炭素環基、 C 3〜C 9置換された炭素環基、 C 3〜C 1 0置換された炭素環基、 C 3 〜C 1 1置換された炭素環基または C 3〜C 1 2置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、 C 4〜 C 7炭素環基または C 4〜 C 7置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フエニル基から水素原子が 1個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。

本明細書において、「芳香族（官能）基」または「芳香環（官能）基」とは、芳香族の特性を有する環系化合物またはその部分をいい、一般に冗電子が 4 n + 2個ある環状共役系を含む安定な構造を有する。このような芳香族官能基は、他の芳香族官能基とも相互作用することができる。芳香族官能基の例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン、アントラセン、フラン、ピリジン、ァズレン、

ォンなどが挙げられるがそれらに限定されな。芳香族官能基は、炭素環であってもよくへテロ環であってもよい。

本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の 1または 2以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、 R O Hとも表記される。ここで、 Rは、アルキル基である。好ましくは、 Rは、 C 1〜C 6アルキルであり得る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、 1一プロパノール、 2 -プロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「ヘテロ環基」とは、炭素およびへテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで，ヘテロ原子は、〇、 Sおよび Nからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、 1つ含まれていても 2以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換されたへテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってヘテロ環基の Hが置換されたへテロ環基をいう。具体例としては、 C 3〜C 4炭素環基、 C 3〜C 5炭素環基、 C 3〜C 6炭素環基、 C 3〜C 7炭素環基、 C3〜C 8炭素環基、 C3〜C9炭素環基、 C3〜C 10炭素環基、 C 3〜C 1 1炭素環基、 C3〜C 12炭素環基、 C 3〜C 4置換された炭素環基、 C 3〜C 5置換された炭素環基、 C 3〜C 6置換された炭素環基、 C3〜C 7置換された炭素環基、 C 3〜C 8置換された炭素環基、 C3〜C 9置換された炭素環基、 C3〜C 1 0置換された炭素環基、 C3〜C 1 1置換された炭素環基または C 3〜C 12置換された炭素環基の 1つ以上の炭素原子をへテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基はまた、 C4〜C 7炭素環基または C4〜C 7置換された炭素環基の炭素原子を 1つ以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、チェニル基、ピロリル基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。

本明細書において、炭素環基またはへテロ環基は、下記に定義されるように 1 価の置換基で置換され得ることに加えて、 2価の置換基で置換され得る。そのような二価の置換は、ォキソ置換（ = 0) またはチォキソ置換（=S) であり得る。本明細書において「ハロゲン」とは、周期表 7 B族に属するフッ素（F) 、塩素（C 1 ) 、臭素（B r) 、ヨウ素 ( I) などの元素の 1価の基をいう。

本明細書において「ヒドロキシ」とは、一 OHで表される基をいう。「置換されたヒドロキシ」とは、ヒドロキシの Hが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。

本明細書において「チォ一ル」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基 (メルカプ卜基) であり、一 SHで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプトの Hが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。本明細書において「シァノ」とは、 —CNで表される基をいう。「ニトロ」とは、 —N0₂で表される基をいう。「ァミノ」とは、 _NH₂で表される基をいう。「置換されたァミノ」とは、ァミノの Hが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。本明細書において「カルボキシ」とは、 — C〇〇Hで表される基をいう。「置換された力ルポキシ」とは、カルボキシの Hが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。

本明細書において「チォカルボキシ」とは、カルボキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基をいい、 — C (=S) OH、 -C ( = 0) SHまたは一 CSSH で表され得る。「置換されたチォカルポキシ」とは、チォカルボキシの Hが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。

本明細書において「ァシル」とは、カルボン酸から OHを除いてできる 1価の基をいう。ァシル基の代表例としては、ァセチル（CH₃CO—）、ベンゾィル (C₆H₅CO— ) などが挙げられる。「置換されたァシル」とは、ァシルの水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。

本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基 (ァシル基) で置換した基であり、好ましくは、一 CONH₂で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換されたものをいう。

本明細書において「カルボニル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である— (C = 0) 一を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル J は、下記において選択される置換基で置換されている力ルポ二ル基を意味する。本明細書において「チォカルボニル」とは、カルボニルにおける酸素原子を硫黄原子に置換した基であり、特性基— （C = S) —を含む。チォカルボニルには、チオケ卜ンおよびチォアルデヒドが含まれる。「置換されたチォカルボニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたチォカルポニルを意味する。本明細書において「スルホニル」とは、特性基である一 S〇₂—を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたスルホニルを意味する。

本明細書において「スルフィニル」とは、特性基である一 SO_を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルフィニル」とは、下記において選択される置換基で置換されているスルフィニルを意味する。

本明細書において「ァリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が 1個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

本発明の物質が置換 Rによって置換されている場合、そのような Rは、単数または複数存在し、複数存在する場合は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ置換されたァミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルボキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィニルからなる群より選択される。好ましくは、 Rは、複数存在する場合それぞれ独立して、水素、アルキルおよび置換されたァルキルからなる群より選択され得る。より好ましくは、独立して、 Rは、複数存在する場合それぞれ独立して、水素、水酸基、アミノ基、力ルポキシル基および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。 Rは、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも 1つの水素、水酸基、アミノ基または力ルポキシル基、より好ましくは、 2〜n (ここで nは Rの個数）の水素、水酸基、アミノ基または力ルポキシル基を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、水酸基、アミノ基または力ルポキシル基、 C 1〜C 6アルキル、 C 1 〜C 5アルキル、 C 1〜C 4アルキル、 C 1〜C 3アルキル、 C 1〜C 2アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。さらにより好ましくは Rは、ペプチド鎖の末端を除きすべてが水素であり得る。ペプチド末端は、水素であってもよいが、水素、水酸基、アミノ基またはカルボキシル基を有し得る。本明細書において、 C l、 C 2、、、 C nは、炭素数を表す。従って、 C 1は炭素数 1個の置換基を表すために使用される。

本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあって、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。

本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

置換基としては、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、力ルポキシ、力ルバモイル、置換された力ルポキシ、ァシル、ァシルァミノ、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルポキシ、アミド、置換されたアミド、置換された力ルポニル、置換されたチォカルポニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。上記の置換基が置換された基である場合は、そのさらなる置換のための置換基についても上記と同様に選択され得る。

本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物（未反応減量、副生成物、溶媒など）を、当該分野で慣用される方法（例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法（例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど）を組み合わせて処理して単離し得る。 (医薬 ·化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）

別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧用組成物に関する。この医薬および化粧用組成物は、薬学的に受容可能なキヤリァなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および Zまたは薬学的ァジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピェントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、ひ—トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 E D TA) ；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール) ；塩形成対イオン (例えば、ナトリウム）；ならびに Z あるいは非ィォン性表面活性化剤（例えば、 T w e e n、プル口ニック（ p 1 u r o n i c ) またはポリエチレングリコール ( P E G) ) 。

例示の適切なキヤリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルプミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 p H 7 . 0 - 8 . 5の T r i s緩衝剤または p H 4. 0 - 5 . 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらにソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 p H、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第 14版またはその最新版、 Rem i ng t on's P a rma c eu t i c a l S c i enc e .s, 18 t Ed i t i on, A. R. Genn a r o, e d. , Mac k Pub l i s h i ng Comp any, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。

本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に 1 回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間—：！ケ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。

本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。 (農薬）

本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。

本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤（ビラゾレートなど）、殺虫 ·殺ダニ剤（ダイアジノンなど）、殺菌剤（プロべナゾールなど）、植物成長調整剤（例、パク口ブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、べノミルなど）、共力剤（例、ピぺロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色 1号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。

(保健，食品）

本発明はまた、保健 ·食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品 '健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。

本発明は上記のように、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで、生体分子の検査が必要なものに全て適応可能である。本発明においては特に、食料の安全目的のための (たとえば、 B S E検查）使用も企図される。

(好ましい実施形態の説明）

1つの局面において、本発明は、新規糖ペプチドまたはその改変体を提供する。そのような糖ペプチドまたはその改変体は、以下の式：一 Λ

！

一 — I y —

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で示される構造を有する。ここで、 Yの左端は R ¹ G 1 y の右端は R ²という置換基で修飾することができる。あるいは、 Yの左端はぺプチドの N末端、 G l yの右端はペプチドの C末端であり得る。

ある実施形態において、 R ¹は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、力ルポキシ、置換された力ルポキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ¹は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ¹は水素、ァセチル基および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ¹は、水素である。

ある実施形態において、 R ²は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルポキシ、アミド、置換されたアミド、置換された力ルポニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ²は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R²は、水素および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R²は、水素である。

ここで、 Xとしては、例えば、一（1) 一 i3— D_Xy 1 p、一 (1) - β— D-Xy 1 p- (1, 4) 一 jS _D - Ga l p、 - (1) 一) 3 - D— Xy l p— (1, 4) - β-Ό-Ga 1 p- (1， 3) 一 jS— D - Ga l p、一 (1) 一 β -D-Xy 1 ρ- (1, 4) -i8-D-Ga 1 ρ- (1, 3) -β-Ό-G a 1 ρ - （1 , 3) - β -Ό- G 1 c ρ Α, ― (1) _ β— D - Xy 1 - ( 1， 4) -^ -D-Ga 1 - (1， 3) _/3— D - G a l p— (1， 3) -β -D — G l c pA— (1, 4) — j3_D - Ga 1 pNAc、一 (1) - )3 -D-Xy 1 p - (1， 4) - β -D-G a 1 p - (1， 3) -β -D-G a 1 - (1， 3) -β-D-G 1 c p A- (1, 4) - α-D-G 1 c pNAc (式中、 Xy 1 pは、キシロビラノース、 Ga 1 pは、ガラク卜ビラノース、 G l c pAは、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）などで示される糖鎖またはその改変体を含むが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、. Xは、一 (1) 一 β— D— Xy 1 P- (1， 4) -[3 -D -G il 1 (式中、 X y 1 pは、キシロビラノース、 G a l pは、ガラクトピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む。 Xy 1 p (キシロビラノース) を末端に有することが好ましい。プロテオグリカンにおいて通常ペプチドに直接結合する糖鎖として見出されるからである。そのような糖鎖を合成する方法は、当該分野において周知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は適宜本発明に関係する糖鎖を合成することができる。

好ましい実施形態において、 Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である。より好ましくは、 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である。さらに好ましくは、 Yは、セリンまたはスレオニンであり、もっとも好ましくは、セリンである。プロテオダリカンにおいて通常見出されるのは、 L体のセリンまたはスレオニンであるからである。そのようなペプチド鎖を合成する方法は、当該分野において周知であり、本明細書の記載に基づいて当業者は適宜、有機合成、生化学的合成、自動合成、遺伝子工学などの手法を用いて本発明に関係するペプチド鎖を調製することができる。このような糖ぺプチドは、プロテオダリ力ンの生体内でのィニシエーターとして使用することができる。

より好ましくは、本発明の糖ペプチドのペプチド部分は 4以上のアミノ酸を含み、さらに好ましくは、前記糖ペプチドのペプチド部分は 8以上のアミノ酸を含む。 4以上のアミノ酸を含むことにより、重合がスムーズに進むからであり、 8 以上のアミノ酸を含むことにより、環化が生じ得るからである。あるいは、 8以上のアミノ酸を含むことが好ましいのは、 4アミノ酸を含む糖ペプチドをモノマ一としたときに、重合体として最低限含まれるァミノ酸数であるからである。このような糖ぺプチドまたはその改変体は、プロテオダリカンのィ二シェ一夕一として使用することができることから、その有用性は、医療などにおいて重要である。 '

1つの好ましい実施形態において本発明の糖べプチドのぺプチド部分は環状べプチドを形成したものであり得る。ただし、環状ペプチドは、プロテオダリカンのィ二シェ一夕一としては適切でない場合があることから、別の好ましい実施形態では、環状べプチドは除去されることが有利であり得る。

別の好ましい実施形態において、本発明の糖べプチドのぺプチド部分は、ァセチル化されたものである。ァセチル化されることによつて重合がスムーズに行くことから、そのようなァセチル化は有利であるといえる。ァセチル化の方法は、当業者に周知であり、種々の方法を用いて実施することができる；

好ましくは、そのようなァセチル化は、ペプチド部分の N末端に存在することが有利である。ァセチル化が N末端にあることによつて重合が促進されるからである。

別の好ましい実施形態において、本発明は、以下の式：

Ser—— Gly—— (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは

0— Hまたは O— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ユニット（i) および Zまたは以下の式：

T^hr一 Gly一

(式中、 (； 1 yはグリシンまたはその改変体、 Th rはスレオニンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは O— X、ここで Oは該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（ i i) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上である、糖ペプチドまたはその改変体を提供する。ここで、上記糖ペプチドまたはその改変体を構成する少なくとも 1つのモノマーュニッ卜中の Aは、 0— Xである。本明細書中においては、「少なくとも 1つの Aが O— Xである」と記載している。好ましくは、総アミノ酸残基の数は、 4〜60、より好ましくは、 4〜40、さらに好ましくは、 4〜32、よりさらに好ましくは、 4〜12、なおさらにより好ましくは、 8〜12である。好ましい実施形態では、上記モノマーユニット（i) とモノマーユニット（ i i) との総和に対するモノマ一ユニット（ i) の割合は、 0. 1〜0. 9であり得る。好ましくは、上記モノマ一ユニット（i) とモノマーユニット（i i) との総和に対するモノマーユニット（i) の割合は、 0. 3〜0. 7、より好ましくは、 0. 4〜0 . 6、なおさらに好ましくは、 0 . 5付近のランダム共重合した糖べプチドまたはその改変体である。このような糖ペプチドまたはその改変体を提供する方法は、当該分野において公知であるか本発明において記載される新規方法を用いて実施することができる。このような糖ペプチドまたはその改変体は、プロテォグリカンの生体内でのイニシエータ一として使用することができる。ここで、上記糖べプチドまたはその改変体中の N末端に位置する S e rまたは T h rの左端は R C末端に位置する G 1 yの右端は R ²という置換基で修飾することができる。あるいは、上記糖ペプチドまたはその改変体の N末端に位置する S e r または T h rの左端はペプチドの N末端、上記糖ペプチドまたはその改変体中の N末端に位置する G 1 yの右端はペプチドの C末端であり得る。

ある実施形態において、 R ¹は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されだアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チ才力ルポキシ、置換されたチォカルポキシ、アミド、置換されたアミド、置換された力ルポニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィエルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ¹は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ¹は、水素、ァセチル基および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ¹は、水素である。

ある実施形態において、 R ²は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チォ一ル、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、置換された力ルポキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルポキシ、アミド、置換されたアミド、置換された力ルポニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ²は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ²は、水素および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ²は、水素である。

別の好ましい実施形態において、本発明は、

以下の式：

置

— ί γ — 一

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する、糖ペプチドまたはその改変体を提供する。ここで、 nは、好ましくは、 1〜 1 5、より好ましくは、 1〜1 0、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜3、さらになおより好ましくは、 2〜3である。このような糖ペプチドまたはその改変体を提供する方法は、当該分野において公知であるか本発明において記載される新規方法を用いて実施することができる。このような糖べプチドまたはその改変体は、プロテオグリ力ンの生体内でのイニシエータ一として使用することができる。ここで、 Yの左端は R ¹ G 1 yの右端は R ²という置換基で修飾することができる。あるいは、 Yの左端はペプチドの N末端、 G l yの右端はペプチドの C末端であり得る。

ある実施形態において、 R ¹は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ¹は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ¹は. 水素、ァセチル基および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ¹は、水素である。

ある実施形態において、 R ²は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、力ルポキシ、置換された力ルポキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルポキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルポエル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ²は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ²は、水素および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ²は、水素である。

好ましい実施形態において、本発明の糖ペプチドまたはその改変体は、以下の式によって表される：

上記式中、 mは 1以上である。 mは、好ましくは、 1〜 1 5、より好ましくは、 1 - 1 0 , さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましぐは、 1〜3、なおさらにより好ましくは、 2〜 3である。

本発明はまた、別の実施形態において、本発明の糖ペプチドまたはその改変体の重合体を提供する。そのような重合体を製造する方法は、当該分野において周知であるか本発明において記載される新規方法を用いて実施することができる。例えば、そのような重合の方法としては、脱水縮合などが挙げられるがそれらに限定されない。別の局面において、本発明は、

以下の式： o - x

¹一 G I y — Y ²— G I y )

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y ¹および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体を提供する。ここで、 nは、好ましくは、 1〜： 1 5、より好ましくは、 1〜： L 0、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜3、なおさらにより好ましくは、 2〜3である。このような糖ペプチドまたはその改変体を製造する方法は、当業者に周知であるか本発明において記載される新規方法を用いて実施することができる。このような糖ぺプチドまたはその改変体は、プロテオダリカンのイニシエータ一として有用である。ここで、 Y ¹の左端は R G 1 yの右端は R ²という置換基で修飾することができる。あるいは、 Yの左端はペプチドの N末端、 G l yの右端はペプチドの C末端であり得る。

ある実施形態において、 R ¹は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チォ一ル、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、'置換されたァミノ、力ルポキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。好ましくは、 R ¹は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ¹は、水素、ァセチル基および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ¹は、水素である。

ある実施形態において、 R ²は、水素、アルキル、置換されたアルキル、シク口アルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、置換されたカルボキシ、ァシル、置換されたァシル、チォカルポキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニル、置換されたスルフィニルおよび上述の「保護基」からなる群より選択される。 R ²は、水素、アルキルおよび上述の「保護基」からなる群より選択され得る。より好ましくは、 R ²は、水素および C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。さらに好ましくは、 R ²は、水素である。

別の局面において、本発明は、プロテオダリカンイニシエータ一として使用するための組成物であって、糖ペプチドまたはその改変体を含む、組成物を提供する。このような組成物を調製する方法は、当該分野において公知であり、本発明の糖ペプチドまたはその改変体を、適切な溶媒に溶解し、必要に応じて添加物を加えることによって達成される。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、

以下の式：

o - x

一 Y— G I y -

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは 0— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ユニット（i ) および Zまたは以下の式：

Thr—— Gly (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは〇— Hまたは 0— X、ここで Oは該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i i ) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが O— Xである、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式：

(式中 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数（nは、好ましくは、 1〜： 1 5、より好ましくは、 1〜： 1 0、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜 3、さらになおより好ましくは、 2〜3である) ) で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体；および

以下の式： O— X

― ( Υ ¹一 G I y— Y²— G I y ) _n―

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数（nは、好ましくは、 1〜1 5、より好ましくは、 1〜1 0、さらにより好ましくは、 1〜 8、なおより好ましくは、 1〜3、なおさらにより好ましくは、 2〜 3である） ) で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含む。上記糖ペプチドまたはその改変体は、本明細書において別の場所においてより詳細に記載されており、上述の発明においてそのような記載および好ましい実施形態が適用され得る。

好ましくは、本発明の組成物において、 Xは、一（1) _i3— D— Xy l p、一 ( 1) - β-Ό-Xy 1 p - (1， 4) 一) 8 - D - G a l p、一 (1) — β— D-Xy 1 p - (1， 4) - β -Ό-G a 1 p - (1， 3) - β -D-G a 1 p, 一（1) 一 i3 _D - Xy l p— (1, 4) — /3 - D - G a l p— (1, 3) 一 β — D - G a l p - (1, 3) _3 - D - G l c pA、 — （1) -β-D-Xy 1 p - ( 1 , 4) - β -D-G a 1 p - ( 1, 3) 一) 3—D - G a l p - （1， 3) - β -Ό- G I c p A- ( 1 , 4) _ jS— D— G a 1 p N A cおよび一 ( 1) -β-Ό-Xy 1 p- (1， 4) 一 jS - D— G a l p - (1, 3) 一 β— D-Ga 1 p- (1, 3) - β-Ό-G 1 c p A- (1, 4) - α-D-G 1 c pNAc (式中、 Xy l pは、キシロピラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース、 G l c pAは、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）からなる群より選択される構造で示される糖鎖またはその改変体を含む。このような配列を有することによって、プロテオダリカンのイニシエータ一としての作用が強くなり、生体適合性も増す。

より好ましくは、本発明の組成物において、 Xは、一（1) 一 jS_D— Xy l p— （1， 4) -β-Ό-Ga 1 p (式中、 Xy l pは、キシロピラノ一ス、 G a 1 pは、ガラクトピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む。このような配列を有することによって、プロテオダリカンィニシェ一夕一を簡便なコ 7として提供することができ、プロテオダリカンのイニシエータ一としての作用が強くなり、生体適合性も増す。

好ましい実施形態において、本発明の組成物における Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である。このような配列を有することによって、プロテオダリカンのイニシエータ一としての作用が強くなり、生体適合性も増す。

より好ましくは、 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である。さらに好ましくは、 Yは、セリンまたはスレオニンであり、もっとも好ましくは、 Yは、セリンである。このような配列を有することにより、プロテオダリ力ンのイニシエータ一としての作用が強くなり、生体適合性も増す。

別の局面において、本発明は、糖ペプチドまたはその改変体を含む、プロテオグリ力ンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患の予防、処置または予後のための医薬組成物を提供する。

好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の式： o - x

一 Y— G I y -

(式中、 Glyはダリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子) で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは

O— Hまたは 0 _ X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマ一ユニット ( i ) および/または以下の式：

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは 0— Hまたは〇_ X、ここで 0は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ユニット（i i ) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、伹し少なくとも 1つの Aが O— である、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式： o-x

― (Y— G I y) _rt—

(式中、 G はグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数（nは、好ましくは、 1〜15、より好ましくは、 1〜10、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜

3、なおさらにより好ましくは、 2〜3である））で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体；

および

以下の式：

O— X

― (Y¹— G I y— Y²— G I y ) _n— (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 0は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数（nは、好ましくは、 1〜15、より好ましくは、 1〜： L 0、さらにより好ましくは、 1〜 8、なおより好ましくは、 1〜3、なおさらにより好ましくは、 2〜3である））で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される、少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含有する。上記糖ペプチドもしくはその改変体は、本明細書において別の場所においてより詳細に記載されており、上述の発明においてそのような記載および好ましい実施形態が適用され得る。

好ましい実施形態において、プロテオダリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨破壊、骨粗鬆症、糸球体ネフローゼ、皮膚の脆弱化、扁平角膜、コラーゲン繊維の構造異常，皮膚の脆弱化、角膜不透明化、 X連鎖性先天性定常夜盲症、軟骨基質欠損、屈指一関節症一内反股一心膜炎症候群、卵丘，卵母細胞複合体のマトリックス欠損不妊、 Dy s s e gme n t a 1 Dy s p l a s i a, 骨格異常、神経筋シナプス形成の異常、 S c hwa r t z— J amp e 1症， S i 1 v e r ma n— Hand ma k e r型、 Wi n g l e s s様表現型、 S imp s on— Go 1 a b 卜 B e hme 1症および骨格異常からなる群より選択される状態、障害または疾患を包含する。より好ましくは、そのような状態、障害または疾患は、関節疾患（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節炎) であり得る。

本発明の医薬組成物はまた、さらに他の薬剤を含む。そのような薬剤としては、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミンなどが含まれるがそれらに限定されない。別の局面において、本発明は、プロテオダリカンを必要とする状態、障害または疾患の治療のための方法を提供する。このような方法は、（a) 被検体の状態、障害または疾患を同定する工程；（b) 同定された該被検体の状態、障害または疾患から、必要とされるプロテオダリカンを決定する工程；（C ) 該プロテオグリカンを生体内で増加させるためのイニシエータ一として使用される糖ペプチドまたはその改変体を提供する工程；（d ) 該糖ペプチドまたはその改変体を該被検体に投与する工程、を包含する。上記方法は、ティラーメイド治療であり得る。プロテオグリカンのイニシエータ一として適切なものの選択は、当該分野において公知の情報を適用することによって行うことができる。本発明は、そのような情報に基づいて、簡便に効率よくプロテオダリカンのイニシエータ一を合成することから、有用性を有する。

好ましい実施形態において、上記糖べプチドまたはその改変体は、

以下の式：

！

一 Y— G I V —

(式中、 Gl yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

S^er Gly (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは 0— X、ここで 0は該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ユニット（i ) および Zまたは以下の式：

T r—— Gly——

(式中、 Glyはダリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは 0— Hまたは 0— X、ここで〇は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ュニッ卜 ( i i ) で構成され、総ァミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが O— Xである、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式：

0— X

― ( Y— G I y ) _rt—

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数（nは、好ましくは、 1〜： L 5、より好ましくは、 1〜1 0、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜 3、なおさらにより好ましくは、 2〜3である））で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体；

および

以下の式：

O— X

― ( Y ¹— G I y— Y ²—G I y ) _n—

(式中、 G l yはダリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y ¹および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数 (好ましくは、 1〜1 5、より好ましくは、 1〜1 0、さらにより好ましくは、 1〜8、なおより好ましくは、 1〜3、なおさらにより好ましくは、 2〜3 ) ) で表される構造を有する糖ぺプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体、を含む。上記糖べプチドまたはその改変体は、本明細書において別の場所においてより詳細に記載されており、上述の発明においてそのような記載および好ましい実施形態が適用され得る。

好ましい実施形態において、上記の治療では、プロテオダリカンを必要とする状態、障害または疾患は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨破壌、骨粗鬆症、糸球体ネフローゼ、皮膚の脆弱化、扁平角膜、コラーゲン繊維の構造異常，皮膚の脆弱化、角膜不透明化、 X連鎖性先天性定常夜盲症、軟骨基質欠損、屈指一関節症—内反股一心膜炎症候群、卵丘 ·卵母細胞複合体のマ卜リックス欠損、不妊、 Dy s s e gmen t a l Dy s p l a s i a、骨格異常、神経筋シナプス形成の異常、 S c hwa r t z— J amp e l症， S i l ve rman— H andma k e r型、 Wi ng l e s s様表現型、 S imp s on-Go l ab i一 Be hme 1症および骨格異常からなる群より選択される状態、障害または疾患を包含する。好ましくは、そのような疾患は、関節疾患（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節炎）である。

別の局面において、本発明は、キシロース残基がペプチドに結合した糖べプチドまたはその改変体の製造方法を提供する。そのような製造方法は、 (a) ダルコ一ス残基を含む糖鎖またはその改変体を提供し、該グルコース残基を残基内 1 ' 6脱水縮合させて、 1, 6無水糖鎖を生成する工程； (b) セリンおよび Zまたはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体を提供する工程；および (c) 該 1， 6無水糖鎖と該ぺプチドまたはその改変体とを脱炭素化および力ップリング反応させて、キシロース残基が該セリンおよび/またはスレオニンに結合された糖ペプチドまたはその改変体を生成する工程、を包含する。ここで、残基内 1， 6脱水縮合は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、以下に示すような実施例などに基づいて行うことができる。好ましくは、工程 (a) は、前記 1， 6無水糖鎖を保護することを包含する。そのような保護基としては、例えば、 Bo c，ベンジル基、ァセチル基などが举げられるがそれらに限定されない。セリンおよび/またはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体は、生物学的方法または有機合成による方法の ^ずれによっても提供することができる。好ましくは、自動合成を用いることが有利であり得る。脱炭素化およびカツプリングもまた、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、以下に示すような実施例などに基づいて行うことができる。好ましくは、工程（c) は、脱保護することを包含する。脱保護は、水素添加によって行うことができる。

好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、さらに、（d) 前記糖ぺプチドまたはその改変体を重合して糖べプチド重合体を生成する工程、を包含する。重合体を製造する際は、重合することが必要であるからである。重合の方法は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、以下に示すような実施例などに基づいて行うことができる。

好ましい実施形態において、本発明の製造方法では、さらに、（e ) 前記糖べプチド重合体を分離する工程、を包含する。分離は、例えば、クロマトグラフィ一などの分離手法を用いて行うことができる。分離工程は、環化糖ペプチドと直鎖糖べプチドとを分離することが意図される際には行うことが好ましい。

別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法は、さらに、 ( f ) 前記糖ペプチドまたはその改変体を環化する工程、を包含する。環化は、通常の重合条件下でも生じ、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、以下に示すような実施例などに基づいて行うことができる。

好ましい実施形態において、本発明の製造方法において用いられる 1， 6無水糖鎖は、 1， 6無水ラクト一スを含む。ラクト一スは、単糖としてグルコースを含んでおり、このグルコースが脱炭素およびカップリングすることによってキシロースに変換することから、新たな糖べプチドの合成のツールとして使用することができる。

別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法で用いられるセリンおよび /またはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体は、 - Y - G 1 y—という配列を有し、ここで Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体である。セリンおよびスレオニンは、その側鎖に水酸基を有しており、この水酸基を介して糖鎖と結合することができる。

別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法で用いられるセリンおよび /またはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体は、 — S e r— G l y— S e r— G l y—を含む。このような 4量体をとることにより、重合が効率的に行われることから好ましい実施形態といえる。別の好ましい実施形態において、本発明の製造方法の工程（C ) の前に、本発明の製造方法で用いられる一 S e r— G l y— S e r— G l y—のうち、 N末端側のセリンを保護することを包含することが有利であり得る。このことにより、 3つ目のセリンのみを糖鎖結合させることができるからである。

別の実施形態において、本発明の製造方法で用いられるセリンおよび/またはスレオニンを含むぺプチドまたはその改変体は、ァセチル化されることが有利であり得る。ァセチル化により、重合が効率よく行うことができるからである。本発明はまた、別の局面において、 1 , 6無水グルコース残基を含む、糖鎖化合物またはその改変体を提供する。好ましくは、この糖鎖化合物は、 1， 6無水ラクト一スまたはその改変体である。より好ましくは、この糖鎖化合物は、 1， 6無水ラクト一スである。

別の局面において、本発明は、糖鎖合成において糖鎖部分提供のために使用される組成物であって、 1 , 6無水グルコース残基を含む、糖鎖化合物またはその改変体を含む、組成物を提供する。好ましくは、この 1， 6無水グルコース残基は、 1 , 6無水グルコースまたはその改変体を含む。このような糖鎖化合物は、キシロース含有糖べプチドを効率よく合成するための中間体として有用である。このような糖鎖化合物は、当該分野において周知の技術により合成することがでさる。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。

(実施例) 以下に本実施例において行った実験の詳細を記載する。

(一般的方法）

(反応のモニタリング）

反応は MERCKのシリカゲルガラスプレート（60F ₂₅₄) を用いて TLC でモニターした。糖鎖を含む化合物についてはァニスアルデヒドと硫酸のメ夕ノ —ル溶液によって、またペプチドおよびアミノ基を含む化合物については和光純薬のニンヒドリンスプレーによってホッ卜プレートで加熱し発色させた。フラッシュカラムクロマトグラフィーには関東化学のシリカゲル 6 ON (球状、中性、 40 - 50 ^m) を用いた。 NMRの測定は J EOLの J MN— 1 amb d a一 400 FT-NMR s e c t r ome t e r ( ¹ H : 40 OMH z) 、 B RUKERの AVANCE 600 ひ H : 600MHz) 、同じく BRUKE Rの A VANCE 500 ( ¹ H : 500MHz) を使用した。 MALD 1一 T OF— MSは BRUKERの REFLEX I I Iを使用して測定した。また F AB— MSは機器分析セン夕一に依頼し J E〇L JMS— HX 1 10 ma s s s p e c t r ome t e rを使用し NBA (m—二卜口べンジルァリレコール）をマトリックスとして測定した。

(合成実施例）

(O - (2, 3, 4, 6—テトラー 0—ァセチル _|3— D—ガラクトピラノシル） - (1→4) 一 2, 3， 6—トリー O—ァセチル一ひ一 D—ダルコピラノシルブロミド（2) )

—D—ガラクトピラノシルー（1—4) —D—ダルコピラノース 1 (80 g 0. 222mo 1 ) を無水酢酸（480ml ) に溶かし、氷で冷やしながら 3 0 %HB r酢酸溶液（720ml) を 3回に分けてゆっくりと加えた。冷やしたまま遮光した状態で 21時間撹拌した。次に遮光したまま減圧濃縮してトルエンで 4回共沸した後、 E t OH、 CHC 1₃、ジェチルェ一テル中にて結晶化させ濾取し、 2 (90 g, 58%) を得た。

2 ： ^-NMR (500MHz, CDC 1₃, δ) ： 6. 53 (d, 1H, J ₁； ₂ = 4. 0Hz, H一 1) ， 5. 56 ( t , 1 H， J ₃, ₄=9. 7Hz, H — 3) ， 5. 36 (d, 1 H, Η_4') , 5. 1 3 (d d, 1 H, J _{i 2}.= 7. 9Hz, J ₂，， ₃,= 1 0· 4Hz, H-2') , 4. 97 (d d, 1 H, J ₃', ₄'= 3. 5Hz, H - 3') , 4. 77 (d d， 1 H， H- 2) , 4. 5 1 (m, 2 ト I， H— 1 ', H - 6 a) , 4. 23— 4. 14 (m, 3 H， H— 5， H— 6 , H - 6'a) , 4. 09 (d d, 1 H, J ₅,, ₆,_b=7. 3Hz, J ₆,_a, ₆,_b= l l. 1 Hz, H- 6'b) ， 3. 9 1— 3. 85 (m， 2 H， H - 5，， H - 4) ， 2. 1 7, 2. 14, 2. 1 0, 2. 08, 2. 07， 2. 06, 1. 97 ( s x 7, 2 1 H, CH₃ CO ' 7) ； t . 1. c . ： R f = 0. 48 (へキサン： E t OA c = 1 ： 2) (ペンタクロロフェニル 0- (2, 3, 4, 6ーテトラ— O—ァセチルー β 一 D—ガラク卜ピラノシル) 一 (1— 4) -2, 3, 6—トリー Ο—ァセチルー i3— D—ダルコピラノシド (3) )

2 (60 g, 0. 086mo 1 ) をアセトン (400m l ) に溶かしペンタクロロフエノキシドナトリウム（PCPONa ： 1. 2 e q, 33. 1 g) を加えオイルパス中にて 40°Cで撹拌し、その後 60°Cに温度を上げ 18. 5時間撹拌した。減圧濃縮した後、 CH₂C 1₂で抽出し、水で十分に洗浄して、 MgS0₄ で乾燥させた。セライト濾過にて MgS0₄を取り除き、濃縮した後、次の反応に進んだ。

3 ： t. 1. c. ： R f = 0. 55 (トルエン： E t OAc = l ： 2)

(0— (2, 3, 4， 6—テトラー 0—ァセチルー j6— D—ガラクトピラノシル） - (1→4) -2, 3—ジ一 O—ァセチルー 1， 6—アンヒドロー j3— D— ダルコピラノース (4) )

精製していない 3のシロップに 5 N KOH (400ml) を加えオイルバス中で熱をかけ 18時間撹拌した。（45°C : 45分 → 50°C : 15分 → 60°C： 60分 → 80°C： 80分 → 100 °C：終了まで）その後、氷水で冷やしながら 9 N H₂S〇₄で中和し、生成した塩を乾燥させないようにセライト濾過により取り除いた。さらに pHを見ながら NaHC〇₃を加えていき完全に中和した。次に濃縮し、さらに E t〇Hで 2回、トルエンで 3回共沸させた。その後、残留物をピリジン (150ml) に溶かし無水酢酸 (150ml) を加え、 0°Cに冷やしながら 22時間撹拌した。次に水で洗った後濃縮しトルェンで共沸した。氷水を加え分液漏斗に移し CHC 1₃で抽出し、その後氷を加えながら 1N ト I₂ S〇₄、水、飽和 N aHC〇₃水溶液、ブラインで洗った。 Mg S0₄で乾燥させた後、セライト濾過で MgS〇₄を取り除き、濃縮した後結晶化させ、濾取し 4の結晶（14. 4 g) を得た。濾液をフラッシュカラムクロマトグラフィ一により精製し 4のシロップ（c a. 4 g) を得た。 (18. 4 g， 37%, 3工程超）

4 ： ^-NMR (600MHz, CDC ", δ) ： 5. 44 (s， 1 H, H - 1 ) , 5. 37 (d, 1 H, J ₃,, ₄,= 3. 4Hz， H - 4') , 5. 26 (d d, 1 H, J ₂., ₃'= 10. 4Hz, H - 2 ') , 5. 14 (s, 1 H, H— 3 ) ， 5. 02 (d d， 1 H， H— 3，）， 4. 79 (d, 1 H, J ₂·= 8.

1 Hz, H― 1 ') , 4. 5 (d， 1 H， H— 5) ， 4. 54 (s, 1 H， I -2) ， 4. 14 (d d, 1H， H— 6'a) ， 4. 04 (d d, 1 H， H— 6' b) , 3. 97 (m， 2H， H— 5，， H- 6 a) ， 3. 79 ( t , 1 H， H - 6 b) , 3. 54 (s, 1 H, H— 4) , 2. 12， 2. 12， 2. 10, 2. 03， 2. 01, 1. 96 (s x 6, 18H， CH₃CO ' 6) ； t. 1. c. ： R f = 0. 25 (トルエン： E t OAc = l : 2) ， R f = 0. 78 (クロロホルム： E t〇Ac ：メタノール =5 : 4 : 1)

(0— (2, 3, 4, 6—テトラ一 O—ベンジル一 ]3— D—ガラクトピラノシル） - ( 1→4) ー 1， 6—アンヒドロ一 2, 3—ジ一 O—ベンジルー j8—D— ダルコビラノース（5) )

4 (8 g, 13. 88mmo 1 ) を Me OH： THF = 1 ： 1の溶媒（500 ml) に溶かし触媒量の NaOMe (0. 3 e q, 225mg) を加え室温で 1 時間撹拌した。 DOWEX 50Wx8を、 p Hを監視しながらくわえていき中和した。濾過、減圧濃縮の後トルエンで共沸した。残留物を DMF (120m 1 ) に溶かし、氷 ·食塩 · Me OHを使って一 20°Cに冷やした状態で N aH (1. 5 e qx6, 5. 0 g) を加えた。十分に撹拌した後 B n B r (2. 0 e qx6, 19. 8m l) をゆつくりと加え、徐々に室温になるように 17時間撹拌した。その後 M eOHを加え完全に濃縮した後 C H C 1₃で抽出しプライン、水で洗った。 MgS0₄で乾燥させた後、セライト濾過で MgS0₄を取り除き、濃縮しフラッシュカラムクロマトグラフィー (へキサン： E t OA c = 10 ： 0 から 2 ： 1まで徐々に）により精製し 5のシロップ (6. 0 g, 50%, 2工程経由）を得た。

5 ： ¹ H - N M R ( 500 MH z, CDC 1₃ , δ) ： 7. 38 - 7. 2 1 (m， 3 OH, a r oma t i c) , 5. 48 (s, 1 H, H_ 1) , 5. 05 - 4. 96 (m， 2 H, Ph_CH₂_〇） , 4. 80-4. 71 (m, 3 H, P h - CH₂ - O) , 4, 63 -4. 50 (m， 6H， H - 5 , P h - C H ₂ - 0， H_ l，， J _{: 2}.= 7. 6 H z ) , 4. 44-4. 36 (m， 3 H， Ph - CH₂ -〇）， 3. 94 - 3. 87 (m, 4H, H- 6 a, H - 2，， H— 5，， H- 3) , 3. 79 (s， 1H, H - 4) , 3. 67 (t, 1 H, H - 6 b) ， 3. 55 - 3. 45 (m， 4 H, H_ 6'a， H_3，， H - 4'， H— 6'b) ， 3. 34 (s， 1 H, H- 2) ； t. 1. c. ： R f = 0. 66 (トルエン： E OAc-2 ： 1) ， R f = 0. 45 (へキサン： E t〇Ac = 2 ： 1)

(フエニル O— (2, 3， 4， 6—テトラ一 O—べンジルー一 D—ガラクトピラノシル）一（1→4) 一 2， 3—ジー〇—ベンジルー 1—チォ—D—ダルコピラノシド (6) )

5のシロップ（4. 6 g, 5. 32mmo 1 ) を CH₂C 1₂ (45m 1 ) に溶かしフエ二ルチオ (トリメチル) シラン（PhSTMS) (6. O e q. ， 6.

23m l ) を加え 0°Cで撹拌し窒素置換した。次に TMSOT f (卜リメチルシリルトリフレ一卜） (2. O e q. ， 1. 93m l ) を加え窒素下で 45. 5時間撹拌した。 CHC 1₃で抽出し飽和 C a C0₃水溶液、ブライン、水で洗った。 Mg S〇₄で乾燥させた後、セライト瀘過で MgS〇₄を取り除き、濃縮した。ここに Me OH： T H F = 1 ： 1の溶媒 ( 1 50m l ) を加えて溶かし、 K₂C 〇₃を加え室温で 1時間撹拌した。次に E t OAcで希釈しブラインと水で洗い、 Mg S 0₄で乾燥させた後、セライト濾過で Mg S 0₄を取り除き、'濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 3 ： 1から 2 ： 1) により精製し 6のシロップ（3. 2 g, 62 %) を得た。（a : i6>20 : 1)

6 ： ¹ H - N M R ( 5 0 0 MH z , CDC 1 ₃ , δ) : 7. 45 - 7. 1 5 (m, 35 H, a r oma t i c) , 5. 52 (d, 1H， H— 1， J ₂ = 4. 7 Hz) ， 5. 0 1 -4. 97 (m， 2 H, P h— CH₂— 0) ， 4. 89— 4. 5 5 (m， 8 H, Ph-CH₂-0) , 4. 5 1 (d, 1 H, H— 1 ', J ₂, =7. 7Hz) , 4. 34-4. 2 1 (m, 2 H, Ph_CH₂_0) ， 4. 1

3 (d, 1H， H - 5) ， 3. 9 3 (d, 1 H， H_4，， J ₃,, ₄'=2. OH z ) ， 3. 86 - 3. 7 5 (m， 5 H, H - 2，， H- 6 a, H - 4, H- 3, H- 2) ， 3. 63 - 3. 47 (m， 4H, H— 6 b， H— 6'a， H— 3，， H — 5，）， 3. 35 (d d, 1H， H- 6'b) ； t . 1. c. ： R f = 0. 57 (トルエン： E t OAc = 2 ： 1)

(フエニル O— (2, 3， 4, 6—テトラー O—べンジル一j3— D—ガラクトピラノシル）一 (1→4) -2, 3—ジ— O—ベンジルー 1一チォ一 6—〇一 p—トルエンスルホニル—ひ一 D—ダルコビラノシド (7) )

6のシロップ（4. 42 g, 4. 53mmo 1 ) をピリジン（95m 1 ) に溶かし氷 · N a C 1 · Me OHを使って— 20 °Cに冷やした状態で p—トルエンスルホニルクロリド (5 e q. ， 4. 32 g) をゆっくりと加え 21時間撹拌した。真空ポンプを使い完全に減圧濃縮した後 CHC 1₃で抽出し I N HC 1水溶液、飽和 NaHC0₃水溶液、ブライン、水で洗い M g S〇₄で乾燥させた後、セライト濾過で Mg S0₄を取り除き、濃縮し 7のシロップ（5. 08 g) を得た。そのまま次の反応に進んだ。

7 ： ¹ H— N M R ( 5 0 0 MH z , CD C 1 ₃， δ) ： 7. 60— 7. 1 1

(m， 4 OH, a r oma t i c) , 5. 35 (d， 1H， H— 1) ， 4. 97 一 4. 55 (m， 1 OH, Ph_CH₂—〇）， 4. 39 (d d, 1H， H - 6' a) ， 4. 36 -4. 25 (m, 3 H, H— 1 ', P h - CH₂ - O) , 4. 1 5

(m, 1H， H - 5 ) , 3. 96 (d d, 1 H, H - 6 b) ， 3. 93 (d, 1 H， H— 4，）， 3. 77 - 3. 65 (m, 4H， H— 2，, H— 4, H - 3， H - 2) , 3. 54 ( t , 1 H, H - 6 ' a ) , 3. 44 (d d, 1 H, H - 3，）， 3. 40 (d d, 1 H, H_ 5，）， 3. 34 (cl d , 1 H， H - 6， b ) ； t .

1. c . ： R f = 0. 70 (へキサン： E t〇Ac = 2 ： 1)

' (フエ二ル〇_ (2, 3， 4, 6—テトラー O—ベンジルー j6—D—ガラクトピラノシル）一（1→4) -2, 3—ジ—0—ベンジルー 6—デォキシ— 6—ョ一ドー 1 _チォー α— D—ダルコビラノシド (8) )

精製していない 7のシロップを 2—ブタノン（39ml) に溶かし Na l (3 e q. , 2. 0 g) を加え窒素中、 8 5°C (還流）で 7時間撹拌した。セライト濾過、減圧濃縮した後 CHC 1 ₃で抽出し 1 0 %N a ₂S₂O₃水溶液と水で洗い、 Mg S0₄で乾燥させた後、セライト濾過で Mg S〇₄を取り除き、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 5 : l〜3 : 1) により精製し 8のシロップ（4. 2 9 g, 8 7 %, 2工程超）を得た。

8 ： ^-NMR ( 5 0 0 MH z , CD C 1 ₃, δ) ： 7. 5 9— 7. 0 9

(m， 3 5H, a r oma t i c) , 5. 3 5 (d, 1 H, H - 1, J ₂= 5. 0 H z) , 4. 9 7 - 4. 5 5 (m, 1 0 H, P h— CH₂— O) ， 4. 4 0

(d d, 1 H, H- 6 a) ， 4. 3 6 -4. 24 (m， 3 H, H— 1，， P h— CH₂-0) ， 4. 1 6 -4. 1 4 (m， 1 H， H— 5) ， 3. 96 (d d, 1 H, H - 6 b ) ， 3. 9 3 (d, 1 H， H一 4 ') , 3. 7 7 - 3. 6 5 (m， 4H, H— 2，， H - 4， H - 3 , H - 2 ) ， 3. 54 ( t , 1 H， H— 6 , a ) , 3. 44 (d d, 1 H, H - 3 ') ， 3. 4 1 (d d, 1 H, H— 5，) , 3. 3 5 ( d d， 1 H， H— 6'b) ； t . 1. c . ： R f = 0. 7 7 (へキサン： E t OA c = 2 ： 1 )

(フエニル O— (2, 3， 4, 6—テトラー〇一べンジルー β— Ό _ガラク卜ピラノシル) - (1— >4) - 2, 3—ジ— Ο—ベンジル— 1—チォ一 α— D— キシ口一へキス一 5—エノビラノシド (9) )

8のシロップ（4. 2 9 g, 3. 9 5 mm o 1 ) を DMF (4 1m l ) に溶かし DBUを ( 1. 5 e q. , 8 6 7 /i 1 ) 加え窒素中、 1 6 0°C (還流) で 1 6 時間撹拌した。真空ポンプで完全に濃縮した後 CHC 1 ₃で抽出し 1 0 %N a₂ S₂〇₃水溶液と水で洗い、 Mg S0₄で乾燥し、セライト濾過で Mg S〇₄を取り除き、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OA c = 8 ： 1から徐々に 2 ： 1まで）により精製し 9のシロップ（2. 0 6 g， 5 4%) を得た。 9 ： ^XH-NMR (400 MH z , CD C 1₃, δ) ： 7. 52— 7. 12 (m, 35 H, a r oma t i c) , 5. 56 (d, 1 H， J _x, ₂ = 4. 9Hz, H- 1) , 5. 15 (s， 1 H, H- 6 a) , 5. 03-4. 68 (m， 9 H, Ph— CH₂— O) , 4. 61-4. 57 (m， 3 H, H_6 b， H_l，， P h 一 CH₂— O) , 4. 44-4. 32 (m， 3 H, Ph— CH₂_0， H— 4) ， 3. 94 (d， 1H， H - 4') ， 3. 92 - 3. 87 (m， 2 H, H - 2，， H ― 2) , 3. 81 (t， 1 H, H - 3) ， 3. 67— 3. 50 (m, 4H， H - 6'a, H - 3，， H- 5 H_6'b) ； t . 1. c . ： R f = 0. 76 (へキサン： E t OAc = 2 ： 1)

(3， 4—ジベンジルォキシー 5—チォフエ二ルー 2一 (2, 3, 4， 6—テトラー O—ベンジル一 ;3— D—ガラク卜ピラノシルォキシ) シクロへキサノン (10) )

9のシロップ（ 188mg， 0. 196mmo 1 ) を Me OH： THF= 1 ： 1の溶媒に溶かし氷で冷やし撹拌ながら 0₃を 20分間パブリングした。次に 0 ₂を 1 5分間バブリングして余分な 0₃を追い出しジメチルスルフイド（1. 3 e q. , 19^ 1) を加え 2晚撹捽した。濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー (へキサン： E t OAc=4 ： 1) により精製し 10のシロップ（17 8mg, 95%) を得た。

10 ： ^-NMR (400MHz, CDC 1₃， δ) ： 7. 56-7. 1 9

(m， 35 H, a r oma t i c) , 5. 68 (d, 1 H，】 ^=1. 8Hz, H— 1) ， 5. 03 -4. 99 (m, 2 H, Ph - CH₂— O) , 4. 91 (d, 1 H, J！., ₂.= 7. 5Hz, H - 1 ') , 4. 83— 4. 55 (m， 9 H, Ph — CH₂—〇， H-4) ， 4. 40 -4. 33 (m， 2 H, P h— CH₂— O) ， 4. 00 (t, 1 H, H - 2) ， 3. 93 (d d, 1 H， J ₂, ₃=2. 7Hz， J _{3; 4}= 5. 2Hz H— 3) ， 3. 88 - 3. 83 (m, 2 H， H_4'， H 一 2，）， 3. 59-3. 51 (m, 4H, H— 3，， H— 5，， H- 6'a, H- 6'b) ； t. 1. c. ： R f = 0. 48 (へキサン： E t〇Ac = 2 ： 1)

(フエニル 0_ (2， 3, 4， 6—テトラー O—ベンジルー) 3_D—ガラクトピラノシル）一 (1→4) 一 2， 3 _ジ— O—ベンジル— 5—ヒドロキシルー 1一チォーひ一D—キシロビラノシド (1 1) )

10のシロップ（132. 4mg, 0. 13 Smmo 1 ) を CH₂ C 1₂ ( 1 3m l) に溶かし窒素気下、 -40 °Cでジィソブチルアルミニウムヒドリド (D I BAL-H) (2. 0 e q. , 275 χ 1 ) を加え— 40 °Cのまま 2時間撹拌した。次に、 10 %酢酸水溶液を加え撹拌し、 C H C 13で抽出し飽和 N a H C 0₃水溶液、水で洗い MgS0₄で乾燥させた後、セライト濾過で MgS0₄を取り除き、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー (トルエン： E t OA c = 10 ： 1〜5 ： 1) により精製し 1 1のシロップを 49. 8mg (36%) 得た（それほどカラム中で安定ではないので通常はここで精製せずに次の反応へ進み 13の段階で精製したほうが好ましい) 。

1 1 H—匪 R (400 MHz, CDC 1₃， δ) ： 7. 46 -7. 16 (m， 35 H, a r oma t i c) , 5. 51 {d, 1 H, H— 1 , J！ ₂ = 4. 7 Hz) , 5. 28 - 5. 25 (m， 1H， H— 5) ， 5. 02 -4. 82 (m， 4H， P h -CH₂-0) , 4. 76 -4. 59 (m, 7H, H - 1 '， Ph-C H₂-0) , 4. 42 -4. 34 (m, 2H， P h— CH₂— 0) ， 3. 96— 3. 76 (m， 5H， H— 4 H - 2，， 5 - OH, H— 2， H— 3) ， 3. 6 9 - 3. 48 (m, 5H， H- 6 ' a, H— 4， H— 3，， H - 5'， H- 6 ' b) ； t. 1. c . ： R f = 0. 29 (へキサン： E t〇Ac = 2 ： 1) (フエニル〇— (2, 3，. 4, 6ーテトラ一 O—ベンジルーガラク

一 ( 1→4) -2, 3—ジ一0—ベンジル _ 5—クロロー 1—チォー α— D—キシロビラノシド（1 2) )

精製した 1 1のシロップ（1 7. 6mg, 0. 0 1 8 3mmo 1 ) を CH₂C 1 2 0. 4m 1に溶かし DMFを一滴加えた。窒素下、室温でォキサリルクロリドを（3 e. q. , 5 1 ) シリンジでゆっくり加え、そのまま 3時間撹拌した。真空ポンプを用い減圧濃縮し黄色のシロップを得た。精製せずに次の反応へ進んだ。

1 2 ： ^XH-NMR ( 5 0 0MHz, CDC 1 ₃， δ) 7. 54— 7. 1 5 (m, 3 5H, a r oma t i c) , 6. 1 1 (d, 8 5/1 0 OH, J ₄' _{5 eq} =4. 2Hz， H- 5 e q u a t r i a l ) , 6. 0 7 (d, 1 5/1 0 OH, J ₄, _{5 ax}= 6. 2Hz, H- 5 a x i a 1 ) , 5. 7 2 (d, 1 5/1 0 OH, J _{1; 2} = 4. 1 Hz, H - 1 (H- 5 a x i a 1 ) ) , 5. 6 5 (d, 8 5/1 0 0 H, J !, 2 = 3. 3 Hz, H- 1 (H- 5 e q u a t r i a l ) ) , 5. 0 0 -4. 54 (m, 1 1 H， P h - CH₂ - O, H— 1，）， 4. 43 -4. 34 (m, 2 H， P h -CH₂-0) ， 4. 0 9 ( t , 1 H, H— 4) , 4. 0 1 ( t , 1 H, H- 3) , 3. 9 1 (d, 1 H, H— 4，）， 3. 8 2 (d d , 1

H, H- 2) ， 3., 7 9 (d d , 1 H, H— 2，） , 3. 64— 3. 4 5 (m, 4H， H - 3，， H— 5，， H- 6'a, H- 6'b)

(フエニル O— (2， 3, 4, 6—テトラ _〇一べンジル _ )3— D—ガラク卜ピラノシル）一（1→4) 一 2， 3—ジ一O—ベンジル一 1—チォ— α— D— キシロビラノシド（1 3) )

精製した 1 1のシロップ（2 5 3mg、 0. 2 64mmo 1 ) を上で述べたように D I BAL_H、ォキサリルクロリドで塩化物 1 2とし、 1 2の粗製のシロップを THF (5m l ) に溶かし、 N a BH₃CN ( 1 0 e. q. 、 1 7 5m g) を加え窒素気化中、 6 0°Cで 1 2時間撹拌した。水を加え CHC 1 ₃で抽出しブラインで洗った。 Mg S〇₄で乾燥させセラィト濾過で Mg S0₄を取り除き減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し 104mg の 13のシロップを得た。（11から 3つの反応を経て 42%の収率だった。） 13 ： — NMR (500MHz, CDC 1₃, δ) ： 7. 45— 7. 16

(m, 35H, a r oma t i c) , 5. 48 (d, 1 H, J ₁； ₂ = 4. 7Hz, H- 1 ) ， 5. 00 -4. 59 (m， 10 H， Ph - CH₂— 0) ， 4. 45

(d, 1 H, J ₂, = 7. 6 Hz, H_ 1，）， 4. 39-4. 31 (m, 2 H, P h-CH₂-0) , 4. 07 (t. 1H， H- 5 a) ， 3. 94 (d, 1 H， J ₃，， ₄,= 2. 7Hz， H-4') , 3. 90 (d d d, 1 H, J _{4> 5a}= 10. 2 H z， J _{3> 4}= 7. 8 H z , J ₄, _5b= 5. 7Hz, H-4) , 3. 82-3. 72 (m, 4H， H— 2'， H— 3， H_ 2, H - 5 b ) ， 3. 64 ( t， 1 H, H- 6 a) ， 3. 52— 3. 44 (m, 3 H, H- 3', H— 5，， H- 6'b)

(N— (p—卜ルエンスルホニル) 一グリシンベンジルエステル (A) ) グリシン（10 g, 0. 133 m o 1 ) 、 p—トルエンスルホン酸 1水和物 ( 1. 2 e q. ， 30. 4 g) 、ベンジルアルコール（10 e q. ， 137. 6 m 1 ) をベンゼン（250ml) に溶かし 120°Cでー晚撹拌した。減圧濃縮しジェチルエーテル中で結晶化させ Aを得た。 (30. 2 g, 67%)

A： t . 1. c. ： R f = 0. 70 (CHC 1₃ : MeOH : H₂0= 65 ： 25 : 4)

(N- (ベンジルォキシカルボニル) 一 Lーセリル一グリシンベンジルエステル (B) )

A (30. 2 g， 89. 5mmo l) と Z_L_セリン（0. 83 e q. , 1 7. 84 g) を DMF (300ml) に溶かし 0 °Cに冷やし撹拌した。全て溶けた後ジフエニルホスホリルアジド（DPPA : 1. 0 e q. , 19. 3ml) の DMF ( 1 30m 1 ) 溶液を加え、間隔をおいてさらに D P P A (2. 3 e q. ， 2 8. 7 3m l ) の DMF (1 3 0m l ) の溶液をゆっくり加え 24時間撹拌した。真空ポンプで完全に濃縮し E t OA cで抽出し 5 %HC 1水溶液、飽和 N aHC0₃水溶液、ブラインで洗い Mg S〇₄で乾燥させた後、セライト濾過で Mg S0₄を取り除き、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー (トルエン： E t OAc = 2 ： 1から 1 ： 2まで）により精製しその後結晶化させ Bを得た。（2 1. 8 g, 7 5 %)

B H - NMR ( 5 0 0 MH z , CD C 1 ₃， δ ) ： 7. 3 8 - 7. 2 6 (m, 1 OH, a r oma t i c) , 7. 1 1 (m， 1 H， G 1 y-NH) ， 5. 9 2 (m， 1 H, S e r— NH) , 5. 2 0 - 5. 0 8 (m， 4H， P h - CH 2— 0) , 4. 3 0 (m， 1 H, S e r -ひ _H) , 4. 0 6 (m， 3H, G 1 y— a— Hx2， S e r - jS— H) ， 3. 6 8 - 3. 6 6 (m， 1 H, S e r - iS -H) , 3. 24 - 3. 2 0 (m, 1 H, S e r一 OH) ； t . 1. c . ： R f = 0. 8 2 (CHC 1 3： Me OH： H₂〇=6 5 : 2 5 : 4) (N— (ベンジルォキシカルボニル) -0- [O - (2, 3， 4, 6—テ卜ラ

—O—べンジルー j8— D—ガラクトビラノシル） ― (1→4) - 2, 3—ジー 0 一ベンジル— D—キシロビラノシル] 一 L—セリル—グリシンベンジルエステル（14) )

精製した 1 3のシロップ（5. 3mg, 5. 6 /i m o 1 ) を C H ₂ C H ₂と C H₃CN (2 ： 1) の混媒 0. 3m lに溶かし Bの結晶粉末 (1. 5 e. q. ， 3. 3mg) と活性化した M S 4 Aを加え窒素気下中で撹拌し 1時間後に N— 3 —ドスクシンイミド（N I S : 1. 2 e. q. , 1. 6mg) を加えた。その間に別の容器に CH₂C 1 ₂ 5 0 0 ^ 1を入れそこへ活性化した MS 4 Aを加えた。しばらくしてからトリフリック酸（T f OH) (5 1 ) をこの容器に加え 1 %溶液を作りこのうち 1 0 1 (1. 2 e. q. ) を反応系にゆっくり加えた。室温で窒素気下中 4. 5時間撹拌した。その後トリェチルァミンを加え撹拌しセライト濾過した後、真空ポンプで減圧濃縮した。クロ口ホルムに溶かし塩水で洗い Mg S0₄で乾燥、セライト濾過後減圧濃縮しフラッシュカラムクロマトダラフィ一により精製し 14 (6 7 %) を得た。（α : ]3 = 1 : 1 0) α体と) 3体はこの段階で分けることができた。

1 4 (/3 -ァノマ一) ： ^I-NMR (5 0 ΟΜΗ ζ , CDC 1 ₃， δ) ： 7. 3 6 - 7. 1 3 (m, 40 H， a r oma t i c) , 6. 9 3 (m， 1 H， G 1 y-NH) , 5. 74- 5. 7 3 (m， 1 H, S e r—題）， 5. 14-4. 5 8 (m， 1 4H, P h - CH₂— O) ， 4. 43 -4. 3 1 (m， 5 H, H— 1，， H - 1 , S e r - ~H, P h— CH₂ - O) ， 4. 1 6 -4. 14 (m, 1 H， S e r— j8— H) , 3. 9 9 - 3. 8 8 (m, 4H， H— 5 a, H_4, H - 4，， G 1 y- -H) ， 3. 7 9 (d d , 1ト I， H - 2 ') ， 3. 6 7— 3. 5 0 (m, 6 H, S e r - β -Η, H— 6，a， G 1 y- a-H, H_ 5'， H— 3 ', H - 3) ， 3. 4 7 (d d, 1 H， H - 6 ' ) ， 3. 3 5 ( t , 1 H, H 一 2) , 3. 2 1 - 3. 1 9 (m， 1 H, H - 5 b)

(O- [O- (i3— D—ガラク卜ピラノシル) 一 (1→4) 一 jS— D—キシロピラノシル] 一 L—セリル—グリシン (1 5) )

1 4の j8体（1 1 5mg) を DMF ( 1 6m l ) に溶かし、水 (2m l ) 、酢酸（0. 5m l ) 、パラジウム—活性炭素 (3 0 Omg) を入れて水素気下 2 7 °Cで圧力をかけて撹拌した。反応をモニターしながら触媒を加え温度を 3 2°C に上げた。 9時間後、セライト濾過で触媒を取り除き真空ポンプで減圧濃縮した。 HP LCにより精製して凍結乾燥し 1 5 (6mg、 14%) を得た。

(N- (ベンジルォキシカルポニル) _〇— (ベンジル) —L—セリルーダリシル— L—セリル—グリシンベンジルエステル (C) )

N— (p—トルエンスルホニル) 一グリシンベンジルエステル（A) (3 g、 8. 89mmo 1 ) および N— （ t—ブトキシカルポニル） _L— s e r i n e (B o c— S e r -OH： 2 g) を DMF (30ml) に溶かし、 0°Cに冷やした状態でジフエ二ルホスホリルアジド（DPPA : 1. 2 e. q. ) とトリェチルァミン（TEA : 2. 2 e. q. ) をこの順番で 10 %DMF溶液としてから加え室温まで放冷しながら一晩撹拌した。反応終了後、真空ポンプを用いて減圧濃縮し E t〇 A cで抽出し、 5 %クェン酸水溶液、飽和 N a H C 0₃水溶液、ブラインで洗い、 MgS0₄で乾燥させセラィト濾過で MgS0₄を取り除き減圧濃縮した。このシロップを 2 N HC 1 -ジォキサンに溶かし室温で 3時間撹拌した後、減圧濃縮し乾固させた。次に同様の手順に従って、このジペプチドと N 一 ( t一ブトキシカルボニル) —グリシンとのをカップリング、および Bo c基の脱保護を行い、さらに N— (ベンジルォキシカルボニル) —0—ベンジル _L ーセリンとカツプリングした。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、 Cを 2. 67 g (32%、 a由来）得た。

C：一 NMR (500MHz, CDC 1₃, <5 ) ：

(N— （ベンジルォキシカルボニル） — O— (ベンジル）一 Lーセリルーグリシル— O— [O— (2, 3， 4， 6—テトラー〇_ベンジル一 S— D—ガラク卜ピラノシル）一 ( 1→4) -2, 3—ジ一 O—ベンジル一 D—キシロビラノシル] _ L—セリル一グリシンベンジルエステル (16) )

フエニル O— (2, 3, 4， 6—テトラ一 O—ベンジル— j3— D—ガラク卜ピラノシル）一 (1→4) -2, 3—ジ— O—ベンジル— 1—チォ一ひ—D—キシロビラノシド（13) のシロップ（380mg、 0. 403mmo 1 ) と C (1. 2 e. q. 、 30 Omg) を 14の調製法と同様の手順でグリコシデーシヨンした。その後、フラッシュカラムクロマトグラフィー (クロ口ホルム： Me OH= 100 ： 1) により精製し、 16のひ体と; 8体の混じったシロップ（31 0mg、 13から 53%) と不純物の混じったシロップ（1 15mg) を得た。 1 6 ： ^XH-NMR (500MHz, CDC 1₃, δ) ： 7. 35— 7. 1 3 (m, 46H, a r oma t i c, G 1 yNH) ， 7. 0 1 -7. 00 (m、 2 H、 G l y— NH、 S e r— NH) 、 5. 82 (m、 1 H、 S e r -NH) 、 5. 1 2 -4. 47 (m, 1 7 H, Ph_CH₂ - Ox8， S e r -ひ）、 4. 43 -4. 3 1 (m， 5H, H— l'， H— 1， S e r—ひ， Ph_CH₂_0) ， 4. 1 1 (dd、 1 H, S e r— jS a) 、 3. 98 - 3. 95 (m, 3H， H—4， H - 4'， H - 5 (e qu a t r i a l ) ) , 3. 88 - 3. 78 (m， 5H, G l y— ひ， S e r— i3 a、 H_ 2，， G 1 y— ひ a) , 3. 65 - 3. 46 (m、 8H、 H— 6'a、 H—3、 H— 5，、 H—3，、 G l y— ab、 S e r - j3 b、 S e r - j3 b、 H - 6， b ) 、 3. 3 5 ( t， 1 H, H— 2) ， 3. 1 9 (m, 1 H, H— 5 (ax i a l) ) 。

(L—セリル—グリシル—O— [O - (/3— D—ガラク卜ピラノシル) - (1 →4) 一 )S— D—キシロピラノシル] _L—セリル—グリシン (1 7) )

精製した 1 6の α体と 3体の混合シロップ（ 1 52 m g .. 0. 1 04mmo

1 ) を DMF (6m l ) に溶かし、水 (0. 5m l ) と酢酸 (0. 5m l ) を加え、パラジウム？活性炭素 (P d 1 0 : 50 Omg) を入れ水素気下、 3 5°Cで圧力をかけ 12時間撹拌した。桐山ろ紙を二重にして濾過して触媒を取り除き、減圧濃縮しゲル濾過 (S e p h a d e x G— 1 5、 H₂0) 、および H PLC (YMC-P a c k ODS、 250x2 Omm, 0. 1 %TFA水溶液 — CH₃CN) により精製したのち凍結乾燥し、 i3体（39. lmg、 TFA塩として 53%) と α体（8. 2mg) を得た。次に得られた j3体のうち 29. 3 mg (TFA塩として 41 τηο 1 ) を水（485 1 ) に溶かしアンモニア水溶液を加え中和した。ゲル濾過により脱塩し、凍結乾燥して 1 7 (22. 9mg、 TFA塩から 70%、 ] ^一タル 37%) を得た。

.1 7 (NH₃処理前）： — NMR (500MHz, D₂0， δ) : 4. 52 ( t , 1 H, S e r - a) ， 4. 2 7 (d， 1 H， H - 1，， J _{1 2}.= 7. 8H z) ， 4. 2 5 (d， 1 H, H - 1， J ₁； ₂=7. 7Hz) ， 4. 0 5 -4. 0 1 (m， 2H, S e r -ひ， S e r - 3 a) ， 3. 9 6 - 3. 7 9 (m, 7 H, G 1 y- a a, b, H- 5 a, S e r -)3 a, b， G 1 y- a a, b) ， 3. 7 6— 3. 7 2 (m， 2H， S e r - j3 b, H— 4，）， 3. 6 7— 3. 54 (m, 3H， H— 4， H- 6'a, b) , 3. 5 1 (d d， 1 H， H - 5，， J ₅'， ₆'_a = 8. 3 H z, J ₅，， ₆._b= 3. 7 H z ) ， 3. 45 (d d, 1 H, H - 3，， J ₃,, ₄,= 3. 4 H z ) , 3. 42 ( t， 1 H， H— 3, J ₃, ₄=9. 1 Hz) ， 3. 3 2 (d d, 1 H， H— 2，, J ₂，, ₃'= 9. 9 Hz) , 3. 2 0 (d d, 1ト I， H- 5 (a x i a l ) ) , 3. 1 5 (d d, 1 H， H— 2， J ₂, ₃= 9. 3 H z)

1 7 (NH₃処理後）： ^LH-NMR (5 0 OMH z, D₂〇， δ) ： 4. 6 3 ( t， 1 H， S e Y - ) , 4. 3 8 (d， 1 H， H― 1 ', J , ₂·= 7. 8 H z) ， 4. 3 5 (d, 1 H， H— 1， J _{1; 2}=7. 7Hz) ， 4. 1 5 -4. 1 1 (m, 2 H, S e r - a, S e r— j6 a) ， 4. 0 7 - 3. 8 9 (m, 5H, G 1 y— a a , b , H— 5 (e q u a t r i a l ) , S e r— j6 a , b) , 3. 8 6 - 3. 8 3 (m, 2 H, S e r - )3 b, H— 4，）， 3. 7 8 - 3. 64 (H-4, G 1 y 1 a, b, H— 6 , a， b) ， 3. 6 1 (d d, 1 H， H— 5，， J ₅,, ₆,_a=8. 2 H z , J ₅,, ₆'_b= 3· 8 Hz) , 3. 5 6 (d d, 1 H, H_ 3，， J ₃,, ₄,= 3. 1 Hz, J ₃,, ₂,= 9. 9 Hz) , 3. 5 2 ( t， 1 H, H- 3, J ₃, ₄= 9. 1 H z ) ， 3. 4 2 ( t， 1ト I， H— 2，）， 3. 3 1 ( t , 1 H, H- 5 (a x i a l ) ) , 3. 2 5 ( t, 1 H, H - 2， J ₂, ₃ = 8. 5Hz) (N—ァセチルー L—セリルーグリシル— O— [〇_ (]3— D—ガラクトピラノシル） - ( 1—4) 一 i3—D—キシロピラノシル] 一 Lーセリル一グリシン (1 8) )

1 7 (5. 8mg、 9. 6 6 ^mo 1 ) を DMF (3 7 0 1 ) に溶かし、 0°Cで無水酢酸（1. 5 e. q. 、 1 0 %DMF溶液で 14 i 1 ) を加え、徐々に室温まで放冷しながら 2時間撹拌した。真空ポンプを使い減圧濃縮し、ゲル濾過（S e p h a d e x G— 1 5) により精製し凍結乾燥し 1 8 (1. 7mg ，

2 7 %) を得た。

1 8 H - NMR ( 5 0 0MHz, D₂0， δ) ： 4. 5 9 ( t , 1 Η， S e τ - ) ， 4. 3 6 - 4. 3 1 (m， 3H， H— 1 '， S e r - α, H— 1， J 2= 7. 7 H z) , 4. 0 8 (d d， 1 H, S e r _j6 a) ， 3. 9 8 (d d， 1 H, H- 5 (e q u a t r i a l ) , J ₄, ₅= 5. 3 H z , J _gem= 1 1. 9 H z ) , 3. 9 1 (d d， 2 H, G 1 y _ひ a， b) , 3. 8 5 - 3. 6 1 (m, 9 H, S e r - j8 b, G 1 y- a a, b, H— 4，， S e r— jS a, b， H-4, H - 6 ' a , b) ， 3. 5 8 (d d, 1 H， H— 5，， J _G._a=8. 3 Hz, J ₅', ₆'_b= 3. 8 H z) ， 3. 5 3 (d d, 1 H， H - 3，， J ₃', ₄,= 3. 4Hz) ， 3. 48 ( t , 1 H， H - 3, J ₃, ₄ = 9· 1 Hz) ， 3. 3 9 (d d, 1 H， H - 2 ', J ₂,, ₃.= 9. 9 H z ) ， 3. 2 8 (d d， 1 H, H - 5 (a x i a l ) ) ， 3. 2 1 (d d， 1 H, H - 2， J _{2> 3}=9. 2 Hz)

( N—ァセチル— L—セリルーグリシルー O— [〇一（|8 _D—ガラクトピラノシル）一 ( 1→4) 一 i3— D—キシロビラノシル] 一 L—セリル—グリシルーポリ— {Lーセリル—グリシルー 0— [O - (β—Ό—ガラク卜ピラノシル) - (1→4) _)3—D—キシロビラノシル] —L—セリル—グリシン } (1 9) ) 1 8を DM Fに溶かし 0°Cでジフエニルホスホリルアジド (DPPA) を加え

3 0分間撹拌した。次に 1 7と卜リエチルァミン (TEA) を加え放冷しながら 1 2時間撹拌した。 1 2時間後再び 0 °Cに冷やし 1 7と DPP Aおよび TEAを加え 1 2時間撹拌した。この追加の操作をさらにもう一回繰り返したあと、エタノールとジェチルェ一テルで沈殿させ遠心分離（7000 r pm、 10分間）し、上澄みを取り除いた。残ったものをエタノールとジェチルエーテル中に懸濁させて遠心分離し上澄みを取り除いた。この操作をさらに一回繰り返し、残留物に窒素ガスを緩やかに当てて乾燥させた。これを水に溶かし 25mMN a OH水溶液を加え 2時間撹拌し、 0. 1 M酢酸水溶液で中和しゲル濾過（S e phad ex G-25) により精製し凍結乾燥した。その後、陰イオン交換ゲルクロマトグラフィ一（DEAE— S e ph a c e l) により環状のものと直鎖状のものとを分け、直鎖状のものをゲル濾過（S e ph ad ex G— 10) で脱塩、精製しポリマーの各重合度の混合物 19を得た。

以上において、本発明の 1つの合成例を記した。

(実施例 1 ：プロテオダリカンコア構造の効率的合成)

本実施例において、本発明は、プロテオダリカンコア構造の効率的合成を行つた。

この効率的合成を行うにあたり、本発明において目的となるポリ糖ペプチドを合成するにあたって大まかな合成戦略を立てた。まず繰り返し単位となる両末端が遊離の糖べプチドを調製しこれを D P P A (ジフエニルホスホリルアジド) 、 TEA (卜リエチルァミン) により連続縮重合する。繰り返し単位は、グリコシデーションに必要な脱離基および遊離の水酸基以外の官能基を水素添加により外れる保護基で保護した糖ユニット、ペプチドュニットそれぞれを個々に合成しその後立体選択的にグリコシデーションし、さらに全保護基を水素添加により脱保護し調製した（図 4) 。 DPPAは、ペプチドのカップリング試薬として知られ、糖やべプチドの側鎖の水酸基の存在下でもべプチドの C末端を選択的に活性化することができ、その結果、両末端が遊離の糖ペプチドを用いることで連続縮重合が起こった。この合成戦略は当研究室において AFGP s (不凍タンパク質）の合成に用いられ確立された方法である（Te t s u r o T s u d a and Sh i n- I c h i r o N i s h i mu r a ( 1996) C h e m. Com mu n. 2779— 2780) 。

(実施例 2 ： 2糖ユニットの合成）

以下、本発明の実施形態の例示として、 GAG鎖伸長のイニシエータ一となりうる 2糖として G a 1 β l→4Xy 1を合成するためにコンフオメ一ションが同じ G a 1 j81→4 G 1 cである 2糖のラクトースを出発物質として用い、ラクト —スのグルコース残基の 6位のヒドロキシメチル基を取り去るというスキームを採用した。キシロース残基とセリン残基の結合は β結合である必要があるが、後に行うグリコシデ一ションの際に立体を制御するのでこの段階ではァノマー位に脱離基を導入するだけでよい。また、脱炭素化する 6位と脱離基を導入するァノマー位を同時に特異的に保護するような 1， 6無水ラク卜一スを中間体とした。出発物質であるラクト一ス 1を遮光した状態で水酸基をァセチル基で保護し同時にァノマー位に脱離基であるブロモ基を導入する。その後ブロモ基をより強い脱離基（例えば、 PCP基（ペンタクロロフエノ一ル基））に替える。次に強塩基条件下において分子内求核置換反応を誘起し精製するために一旦ァセチル化し中間体となるァセチル保護された 1， 6無水ラクトース 4を調製した。次に、より安定な保護基であり水素添加によって脱保護できるベンジル基に架け替えた。 1， 6無水環を導入することによりグルコース残基のコンフオメ一シヨンが'¹ C iから¹ C₄へ大幅に変化し、それに伴い ¹ H— N M Rにも変化がありグルコース残基の 1から 4位までがすべてシングレットになった (図 5) 。

次に、 1， 6無水結合を開裂し 6位を遊離にすると同時にァノマー位に比較的安定な脱離基であるチォフエ二ル基を導入した（L a i—X i Wang, No buo S a k a i r i , and H i r oyo s h i Ku z uh a r a (1 990) J. C h em. So c. P e r k i n. Tr an s. I, 1677— 1 682) 。この際のァノマ一位の立体はほぼひ結合に偏った（ひ： ]S>20 ： 1) 。これはおそらく 3位にある比較的大きな保護基であるべンジル基と 1， 6 無水結合と 6位のメチレンによる立体障害によると思われる。また、開裂した後の 6は通常の⁴ コンフオメ一シヨンに戻った（図 10、スキ一ム 1) 。

6位を取り去るために 5、 6位間に二重結合を導入しオゾン分解を用いることができるが、オゾンと硫黄原子の親和性が高くチォフエニル基が酸化され反応系が複雑化することが考えられることから、これを避けるために比較的安定な脱離基であるフッ素基を脱離基として用いることができる。

脱離反応のために 6位に脱離基としてヨウ素基を導入し（Ma z h a r— u l -H a q u e ( 1 977) J . C. S. P e r k i n I I， 1509 - 15 1 3 ； C a 1 v i n L. S t eve n s, Pe t e r B 1 umbe r g s, a n d D i e t e r H. O t t e r b a c h ( 1966) J . Or g. Ch e m. 31 (9) , 28 17-2822) 、この段階でァノマ一位を D AST (ジメチルァミノィォゥトリフルオリド）でフッ素化した。 5位と 6位の間に E 2反応により二重結合を導入し（An a Ca l vo-Ma t e o, Ma r i a J o s e Cama r a s a, and F e d e r i c o G. D e l a s H e r a s ( 1 984) J . Ca r bohyd r a t e Ch e m. 3 (3) , 4 61 -473) 、これをオゾン分解しァノマ一位に脱離基としてフッ素をもつシクロへキサノン改変体とした。次に D I BAL— H (ジィソプチルアルミニウム • ヒドリド）および三フッ化ほう素エーテル錯体 (BF₃ ： OE t ₂) による脱酸素化 (Ge o r g e A. K r a u s a nd Ke v i n F r a z i e r ( 1980) J . Or g. Ch em 46， 2419-2423) 、水素化リチゥムアルミニウム（L i A 1 H₄) や L i A 1 H (O— t— Bu) ₃を用いた反応 (Fuq i ang J i n, D e n g j i n Wang, P a t N. Con f a 1 o n e , M i c h a e l E. P i e r c e, Z h e Wang, G u o you X u, An u s u y a Choudhu r y, and D i e u N g uyen (2001) Te t r ah e d r on Le t t e r s 42, 478 7-4789 ； Lak s hm i P. Ko t r a, M. Ga r y Newt on, C ung K. C u (1998) Ca r bohyd r a t e R e s e a r c h 306, 69— 80) チォカルポニル化後に R a n e y— N iによる接触水素化（An t hony G. M. Ba r r e t t and A l e r t C. Le e ( 1992) J. Or g. Ch em. 57， 2818-2824 ; K. C. N i c o 1 a o u, D. G. Mc Ga r r y, P. K. S ome r s , B. H. K i m, W. W. O g i 1 v i e , G. Y i ann i kou r o s, C. V. C. P r a s a d, C. A. V e a 1 e, and R. R. Ha r k (199 0) J . Am. C h em. S o c . 1 12, 6263-6276) など種々の反応により脱酸素化を試みた。しかし、塩基性の条件の場合にはァノマ一位に導入したフッ素基が副反応を起こしていると考えられ、どの系も好ましい結果は得られなかった。従って、好ましくは、酸性条件を用いることができる。

先にべプチドとのグリコシデ一シヨンをした後に脱酸素化を行う経路も試用することができるがシクロへキサノン改変体ではダリコシデ一ションが進まず、またべプチドを導入することにより脱酸素化において強塩基性条件が使えなくなることもあることから、本発明ではそれほど好ましくはない（図 1 1、スキーム 2) 。

そこでフッ素基以外の脱離基を検討する必要があつたが、チォフエニル基が酸化されてしまうという懸念を実際に確かめる意味で、もともとあったチォフエ二ル基のままで同様にオゾン分解までの反応を行ったところ、意外にも今回の条件では懸念されたようなオゾンによるチォフエニル基の酸化は全くおこらなかった。従って、この手法を用いてァノマ一位にチォフエ二ル基を持つシクロへキサノン改変体 10を高収率で得ることができる。

次にシクロへキサノン改変体 10の 5位の力ルポ二ル基を D I BAL— Hにより還元し水酸基を導入し脱酸素化を試みた。しかし BF₃ ：〇E t ₂を用いて水酸基のままで脱酸素化した（F r anc e s c o N i c o t r a, Lu i g i P a n z a, G i ovann i R u s s o, and L u c a Z u c c h e 1 1 i (1992) J. Or g. Ch em. 57， 2154-2158) ことはできなかったのでこの水酸基へ脱離基を導入することにした。チォエステル基を導入しラジカル的に脱酸素化する方法（M o r r i s J. Rob i n s, J o h n S. Wi l s on, and F r i t s Han s s k e ( 1983) J. Am. Ch em. So c. 105， 4059-4065) も試したがチォェステルの導入の効率はよくない。これには、ラジカル反応の際にチォフエニル基が反応する可能性 ( J a n e z P l ave c We imi n T o n g, an d J y o t i Ch a t t o p ad hy ay a ( 1993) J . Am. Ch e m. So c. 1 15, 9734-9746) が考えられることから、反応させる際には留意すべきである。

メシル基（Ms, メタンスルホニル基) 、トシル基 (T s， p—トルエンスルホニル基) 、などのスルフォニル基系の脱離基は反応性が高く導入後不安定であると考えられそれほど好ましくはないが本発明の範囲内にある。そこでハロゲンを脱離基として導入した。一時的にトリフレート基を経由しブロモ基を導入する方法リ a c qu e s L e r o u x and Ar t hu r S . Pe r l i n ( 1978) Ca r boyd r a t e Re s e a r c h 67, 163 - 1 78) や四塩化炭素中でトリフエニルフォスフィンを使用する反応 (C. R. H ay l o c k, L. D. Me 1 t on, K. Ν. S l e s s o r, and A. S . T r a c e y (1971) Ca r bohyd r a t e Re s e a r c h

16, 375 - 382) など数種類の反応系を試した結果、 TLC上で反応が進んでいると思われる反応系もあったが、 DMFを触媒としてォキサリルクロリドで塩素を導入する系（Ke n S. F e 1 dma n, S a r a L. Wi l s on, M i c h a e l D. L a w 1 o r, Ch a r l e s H. Lang, a n d Wi l l i am J. S c he uc he n z ub e r (2002) B i o o r g an i c & Me d i c i n a l Ch emi s t r y 10, 47- 55) が TLC上で最もきれいに短時間で反応が終了し後処理も容易である。つづく水素化の反応は、ヒドリドイオン（H-) ソースとして L i A l H₄ (C. R. Hay l o c k, L. D. Me l t on, K. N. S l e s s o r, and A. S. T r a c e y (1 971) C a r bohyd r a t e R e s e a r c h 16, 375-382 ; Ro b e r t K. Ne s s, Hew i t t G. F l e t c h e r, J r. ， a nd C. S. Hud s on ( 1 950) J. A m. C h em. S o c. 72 (10) 4547-4549 ； Ma s u o Fun a b a s h i and To s h imo r i Ha s e g awa (1 99 1) B u 1 1. C h em. S o c. J p n. 64， 2528-253 1) 、 N a BH₄ (Ha r o l d M. B e l l , C. Wa r r e n Vand e r s 1 i c e, a n d And r e a S p e h a r ( 1 969) J. Or g. Ch e m. 34， 3923 -3926) 、 N a B H ₃ C N (Ro e r t 〇. H u t c h i n s , B r u c e E. Ma r y an o f f, a nd Cyn t h i A. M i l e ws k i (1971) Ch em. Commun. 1097- 1 098) などをいろいろな溶媒中で試した結果， THF (テトラ hy d r o ί u r a n) 中で N a B H ₃ C Nによつて水素化することができた。以上により、目的となる水酸基をベンジル基で保護しァノマー位に脱離基を持った 2糖ュニッ卜 1 3を得た。この脱酸素化、および水素化の反応では中間生成物が不安定であるために精製は行わずにそのまま次の反応に進んだ。シクロへキサノン改変体 1 0からの 3反応を経ての収率は 40%を超え、まずまずの収率で求める 2糖ュニットを調製することができた（図 1 2、スキーム 3) 。出発物であるラクトースからの収率は 1 % (1. 25%) 程度になった。合成した 2糖ユニットの 1H— NMRスペクトルを図 6に示す。 5位がメチレン基になったことで 4位が特徴的に d d dに割れているのが判る。

(実施例 3 ：ジペプチドュニッ卜の合成) 本発明の 1つの実施形態では、ジペプチドユニットをまず合成した。グリシンの C末端をディ一ンス夕一ク管を用いて水を反応系から除きながらベンジルエステル化した。精製したグリシンベンジルエステルと、市販されている N末端を Z 基（c b z基、ベンジルォキシカルポニル基）で保護した側鎖水酸基が遊離のセリンを DP PA、 TEAでカップリングすることができる。これによりセリンの側鎖水酸基のみが遊離であるジペプチドュニット Bが得られた。（図 1 3、スキ —ム 4)

(実施例 4 ：グリコシデーシヨンと重合 (1) )

ここまでで調製した 2糖ユニット 1 3とジペプチドユニット Bを N I S (N— ョードスクシンィミド）、 T f OH (トリフリック酸 ( t r i f 1 i c a c i d) 、トリフルォロメタンスルホン酸) を用いてグリコシデーションする (P e r J . G a r e g g ( 1. 9 9 7 ) Ad v a n c e s i n C a r b o h y d r a t e Ch em i s t r y a n d B i o c h em i s t r y 5 2， 1 7 9— 2 0 5) 。立体を制御するために、経験的に知られているァセトニトリルの溶媒効果を利用して iS結合を優先的に導入する。しかし 2糖ュニッ卜がァセト二卜リルに対して非常に溶解しにくいため、ジクロロメタンとの混媒とする。結果、 a ： β = 1 ： 1 0のように j3結合を優先させた。またフラッシュカラムクロマトグラフィ一によりこの段階で α体と β体を分けることができた。得られた糖ペプチド 1 4のうちの j3体を水素添加により全保護基を脱保護した（図 1 4、スキ一ム 5) 。 HPLCにより精製した後 DPPA、 TEAによる重合を行うと、反応が進行せずモノマー 1 5が残った。原因としては、アミノ酸 2残基ごとに糖ユニットが 1つという割合が、糖ュニットに対してペプチドの長さが短すぎたために反応が進行しないことと、反応に関与する N末端側のセリン残基に比較的大きな糖ュニッ卜が結合していることによる N末端への立体障害が考えられたので、糖ュニット同士の間隔を空けるために N末端側へセリン一グリシンの繰り返しをさらに 1つ伸ばし、 4アミノ酸残基ごとに 1つの糖ユニットとなるように繰り返し単位の構造を変更した。

(実施例 5 ：テトラペプチドユニットの合成）

ジペプチドユニットのときと同様にグリシンをべンジルエステル化し、つづいて市販の N末端を Bo c基（t—ブチルォキシカルポニル基）で保護した側鎖水酸基が遊離のセリンを D P P Aで力ップリングし、そして 2規定の塩化水素ジォキサン溶液で B o c基を脱保護した。以下同様の手順で N末端を B o c基で保護したグリシン、 N末端を Z基で保護し側鎖水酸基をべンジル基で保護したセリン (いずれも市販）とカップリングし、セリンの側鎖水酸基 1つだけが遊離のテ卜ラペプチドユニット Cが得られる（図 15、スキーム 6) 。精製は最後のカップリングが終了したあとのみで行つた。

(実施例 6 ：グリコシデーションと重合 (2) )

2糖ジペプチドモノマ一のときと同様に N 1 S、 T f OHを用いァセ卜二トリルとジクロロメタンの混媒中でグリコシデ一シヨンを行った。 α体と体の混じつた保護されたモノマー 16をそのまま水素添加し全保護基を脱保護し、ゲルろ過（S e ph ad e x G - 15) したあと HP LCにより 17の3体を単離した。このとき HPLCの溶離液に含まれる T F Aとモノマ一が塩をつくるので、単離後アンモニア水溶液で処理し中和した (図 16、スキーム 7) そして、定法に従って DPPA、 TEAを用いての重合を試みたが、 MALD I— TOF— MSによると、モノマ一はすべて反応しているものの生成物のほとんどは 2量体、もしくは 3量体において環化した環状糖ペプチド 20であった（図 7) 。この生成物に対して陰イオン交換ゲル DEAE— S e p h a c e 1を使用したところ、生成物の大半が水を溶離液としたときに溶離してきたことから陰イオンがないことが証明され、環状になっていることが確認できる。この反応結果は濃度を変えても起こることから、セリンとグリシンの繰り返し構造は 2量体、つまり 8アミノ酸残基程度でヘリックスが 1周し、両末端が非常に近づくのでどうしても環化反応が優先してしまうと考えられる。そこで少々強引ではあるが N末端をなんらかの保護基でふさいでしまい、遊離モノマ一との混合状態で DP P Aにより重合を行い、このとき遊離モノマーが N末端を保護したモノマーに比べて少なければ遊離モノマー同士の反応よりも N末端を保護したモノマーとの反応が優先するので、遊離モノマーを分割して加えることで直鎖状のポリマ一が優先して生成すると考えられる。

そこで遊離モノマ一 17を DMF中、無水酢酸を用いて N末端をァセチル基で保護した。もともと遊離のモノマー 17は DMFに対する溶解性はあまり良くなかったが、ァセチル化したモノマー 18は DMFに対する溶解性が改善した。このことから反応系において、遊離モノマーに比べてァセチル保護したモノマーの存在比が高くなり、遊離モノマーを何回にも分けて加えるときの一回の量が少々多くてもこの存在比の差が保たれると考えられる。これをふまえて、このァセチル保護されたモノマ一と遊離のモノマーのモル比が 1 ： 1となるように DPPA による重合を試みた（図 17、スキーム 8) 。結果、やはり環状の糖ペプチドが生成するが、直鎖状のポリマー 19の生成も MALD I— TOF—MSによって確認された（図 8) 。環状糖ペプチドには C末端、つまりカルボキシル基がないので陰イオン交換ゲル (DEAE- s e ph a c e 1 ) により簡単に環状糖ぺプチドと直鎖状ポリ糖べプチドは分けることができ、それぞれのおおよその重量比は、環状：直鎖状 =2 ： 5であった。また、環状糖ペプチド、直鎖状ポリマ一、それぞれを重合度が異なつたものの混合物のまま¹ H— N M Rを測定した。スぺクトルを図 9に示す。全体として、共にモノマーのスぺクトルの保存性 ·対称性が高く重合が確実に進んでいるといえる。

(実施例 7 ：合成物質の活性検定） (関節軟骨細胞培養系への合成物質の添加）

この実験は、北海道大学医学部の岩崎倫政先生らの協力により行われた。日本白色家兎（2. 0 k g) の関節軟骨より、軟骨細胞を単離（約 lxl 0⁷細胞）し 24ゥエルおよび 96ゥエルのプレートに各細胞数 1x10⁵、 lxl 0⁴を播種した。コントロールとして通常の培養を行い、 l ng/ml， 10 n g/m 1 , 100 η g/m 1の濃度で合成したポリ糖ペプチド 19、環状糖ペプチド 20、 2糖テトラペプチドモノマ一 17を加えたグループを設定した。上記の濃度をそれぞれ 50 1ずつ添加した。

1週間後の細胞には合成化合物を添加したことによる大きな変化は見られなかつた。ただし、添加したことによって著しく増殖が阻害されることはなく、この化合物の軟骨細胞に対する毒性はないといえる。 (まとめ）

安価な 2糖であるラクト一スを出発物質として活用し、プロテオダリカンの G AG鎖とコアタンパク質の結合領域に見られる 2糖である G a 1 β l→4Xy 1 の改変体 13に変換する新規合成法を確立した。この改変体はァノマー位に脱離基であるチォフエ二ル基を有しグリコシデーションなど更なる有機合成への応用が可能である。

またこの改変体を用いて、この結合領域を模倣した糖べプチドを、 2糖ジぺプチドのものと 2糖テトラペプチドのもの、 2種類合成した。

さらにこの 2種類の糖ぺプチドのうち 2糖テトラべプチドのモノマーについて、 DP P Aを用いた重合反応により直鎖状のポリマ一を合成した。また重合反応の副生成物として環状の糖べプチドを得た。

日本白色家兎の関節軟骨細胞培養系への合成物質の添加では細胞の増殖に影響は見られず、細胞に対する毒性はほとんどないものと判断した。 (結果および考察）

ラクト一スを出発物質として、炭素を取り去りたい 6位とペプチドとのグリコシデ一ションに備えて脱離基を導入したい 1位を同時に特異的に保護した 1 , 6 無水ラクト一スを中間体として調製し、この間に他の水酸基をべンジル基で保護した。次に、 1， 6無水結合を開裂し 6位を遊離に、 1位にチォフエ二ル基を導入した。 6位の脱炭素化を行うため 5， 6位間に二重結合を導入しオゾン分解した。このとき懸念されていたチオフェニル基の酸化は起こらなかった。得られたシクロへキサノン改変体を D I BAL—Hにより還元し、生じた水酸基をォキサリルクロリド、 DMFにより塩素化し、この塩素基を THF中で N aBH₃CN を用い水素化した。以上、目的となる 2糖ユニットを新規合成法により調製することができた。

一方のペプチドュニッ卜は先に述べた S e r-G l y-Xa a-G l yを満たす最も簡単な配列として S e r— G 1 yの繰り返し配列とした。まず、 N末端を Z基で、 C末端をべンジルエステル基で保護した側鎖水酸基が遊離のジぺプチド Z— S e r (OH) — G 1 y-OB z 1を調製した。これを先に合成した 2糖ュニットとグリコシデ一ションし水素添加により全保護基を脱保護し繰り返し単位となる 2糖ジペプチドのモノマーを調製した。しかし、このモノマ一は重合反応が進行しなかった。これはペプチドュニットが糖の大きさに対して小さすぎたことによる立体障害が原因と考えられる。

これを解決するために両端を保護された Z— S e r (OB z 1 ) 一 G l y— S e r (OH) 一 G 1 y— OB z 1というテ卜ラペプチドを合成し、同様にグリコシデーシヨン、脱保護を行い 2糖テトラペプチドのモノマーを調製した。次に D P P Aによる連続縮重合を試みたが、ほとんどのものは 2量体において環化していた。環化を防ぐためにモノマーの N末端をァセチル基で保護しここへ遊離のモノマーを分割して加える方法で重合を試みた。その結果、やはり環状の糖べプチドが生成するものの直鎖状のポリマ一を得ることに成功した。直鎖状ボリマ一と環状糖べプチドは陰イオン交換ゲルにより容易にわけることができた。

それぞれ分けた環状糖べプチドと直鎖状ポリマ一、および 2糖テトラペプチドのモノマーを日本白色家兎の軟骨細胞を培養しているプレートへ撒いたところ、 1週間経過した後も細胞は増え続け決定的な毒性はないものと判断された。

(まとめ）

ラクトースを出発物質として、目的となるプロテオダリカンコア構造を模倣したポリ糖べプチドを新規合成法により合成することができた。この合成法の中でチォフエ二ル基はオゾン分解では酸化されないことを見いだした。また、副生成物として環状の糖べプチドが得られた。

軟骨細胞培養系へのこれらの化合物の添加の結果、これらの化合物により細胞の培養に特に変化はなく、毒性はほとんどないと判断された。

従って、本発明では、例示として以下のような、合成模式図が意図される。

(実施例 8 ：生体内における実証：本発明の化合物のプロテオダリカンィニシェ一夕一としての能力）

実施例 7に記載されるのと同様の条件で、軟骨細胞を培養し、培養開始後 1日後、 7日後、 1 4日後の各ゥエル内のコンドロイチン硫酸含有量を市販のキット (例えば、株式会社ホクドー（札幌、日本）の簡易型 ·酸性ムコ多糖定量キッ卜）を用いて測定した。

上記実施例において合成したポリ糖ペプチド、環状の糖ペプチドおよびその 2 糖テトラペプチドモノマ一を培養系に添加し、添加しない場合をコントロールとして、コンドロイチン硫酸の含有量が変化するかどうかを調べた。ここで、 I n g/ml, 1 O ng/ml , 100 n g/m 1の濃度で合成したポリ糖ペプチド 19、環状糖ペプチド 20、 2糖テトラペプチドモノマー 17を加えたグループを設定した。上記の濃度をそれぞれ 50 1ずつ添加した。このアツセィは、細胞外マトリクス中のプロテオダリカン中の量を調べることになる。

細胞を培養し、その後、細胞層（Ce l l Laye r) を物理的に剥離し、遠心分離した。沈澱物 (Ce l l L a y e r) を検体調製用酵素で溶解 (6 0°C、 1時間）し、この溶液中の酸性ムコ多糖含量を簡易型 ·酸性ムコ多糖定量キッ卜で定量した。検体に発色液を加えて 650 nmにてすぐに測定した。 ςのアツセィの結果、ポリ糖ペプチド、環状の糖ペプチドおよびその 2糖テトラペプチドモノマ一を加えた細胞において、コンドロイチン硫酸の含有量が有意に増加していることが分かった。他方、コントロール細胞では、コンドロイチン硫酸は有意に増加していなかった。従って、ポリ糖ペプチド、環状の糖ペプチドおよびその 2糖テトラペプチドモノマーはいずれもプロテオダリカンのィニシェ —夕一として使用され得ることが実証された。

次に、日本白色家兎（2. 0 k g) の関節軟骨に直接これら 3種の糖べプチドを注入し動物内で効果があるかどうか確認した。上記実施例において合成したポリ糖べプチド、環状の糖べプチドおよびその 2糖テトラベプチドモノマーを培養系に添加し、添加しない場合をコントロールとして、コンドロイチン硫酸の含有量が変化するかどうかを調べた。ここで、 I ngZml , 1 O n g/ml, 1 00 ng/mlの濃度で合成したポリ糖ペプチド 19、環状糖ペプチド 20、 2 糖テトラペプチドモノマー 17を加えたグループを設定した。上記の濃度をそれぞれ 50 1ずつ添加した。

この兎から軟骨組織 1〜1 Omg取り（組織中の酸性ムコ多糖含量により採取量は異ります）に検体調製用酵素溶液 1 Oml加え 60°Cで 1時間加熱し完全に溶解した。上記で得た検体溶液 100マイクロリツトルおよび各濃度の標準液をマイクロテストチューブに移し反応溶液（用時調製）を 1. 3ml加え攪拌し、 650 n mにてすぐに測定した。

このアツセィの結果、ポリ糖ペプチド、環状の糖ペプチドおよびその 2糖テトラペプチドモノマーを加えた細胞において、コンドロイチン硫酸の含有量が有意に増加していることが分かった。他方、コントロール細胞では、コンドロイチン硫酸は有意に増加していなかった。従って、ポリ糖ペプチド、環状の糖ペプチドおよびその 2糖テ卜ラぺプチドモノマ一はいずれもプロテオグリ力ンのィニシェ一夕一として使用され得ることが実証された。

(実施例 9 ：化学合成イニシエータ一を用いる細胞培養物における軟骨細胞および線維芽細胞からの蛍光発生ムコ多糖の分析）

本実施例は、本発明の糖ペプチドおよび糖ペプチドポリマーが、細胞培養中の軟骨細胞から GAGを形成したことを示す。本実施例で使用した糖べプチドおよび糖べプチドボリマ一はそれぞれ、上記実施例にて作製した 2糖テ卜ラベプチドモノマー 17およびポリ糖ペプチド 19である。本実施例における試薬は、特に示さない限り、 Sigma Co. (MO, USA) または和光純薬工業 (大阪、日本) から入手可能な高級試薬である。

正常ヒト軟骨細胞（NHAC— Kn) (B i o Wh i t t a k e r, I nc. (MD, USA) より購入）を 48ゥエルプレートに 1. 0X 10⁵細胞ノウエルずっ播き、 10% (v/v) 透析ゥシ胎児血清を含有する Du 1 b e c c 0 M i n i mum E a g 1 e培地中で 37 °C、 0. 5%C0₂条件下、ー晚培養した。成熟した細胞を、細胞中の GAGコア蛋白質芯の新たな合成を阻害するために、蛋白質合成阻害剤のピューロマイシンを 200 M添加し、 37°Cで 1 時間インキュベートした。その後、 1. OmM 酢酸ナトリウムとペプチドのァミノ基に F I TCをラベルした化学合成イニシエータ一を F I TC濃度で、 2糖テトラペプチド 17 20 iMZゥエル、ポリ糖ペプチド 19 60μΜΖゥェルになるように添加し、 48時間、 37°C、 0. 5 %C0₂条件下で培養した。多糖へのバックグラウンドの F I TCの取り込みを、細胞なしでインキュベートした細胞から決定した。

F I TCでラベルした多糖の取り込みをゲル濾過クロマトグラフィーによって単離した。 48時間後、培養細胞の培養上清を回収し、 15， O O O r pmで 5分間遠心し、培地と細胞を分けた。フィル夕一濾過後、 TSK ge l G— 30 00 (TOSHO) を用いて 0. 4ml/分、水で溶出した。検出は F I TCにて蛍光検出を行なった。 (λ e x = 495 nm, λ em= 525 n m) 。

実験の結果、モノマ一、ポリマー共に、化合物の分子量と異なる高分子量の産物を得た。 2糖テトラペプチド 17の結果を図 18に示し、ポリ糖ペプチド 19 の結果を図 19に示す。これら図 18および図 19より、 2糖テトラペプチド 1

7では分子量約 50, 000の G A Gが、ポリ糖ぺプチド 19ではカラムの排除限界部分にピークが見られる事から、少なくとも分子量 200, 000以上の G

A Gが出来ていると考えられる。従って、本実施例においても、ポリ糖ペプチドおよびその 2糖テトラぺプチドモノマーのいずれもが、プロテオダリ力ンのィ二シェ—夕—として使用され得ることが実証された。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。産業上の利用可能性

本発明により、新規糖ペプチド合成方法が提供される。本発明はまた、プロテォグリ力ンのィ二シェ一夕一として有用な糖べプチドおよびポリ糖べプチドを提供する。

Claims

請求の範囲

1. 以下の式

O— X

Y— G I y

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子) で示される構造を有する、糖ペプチドまたはその改変体。

2. 前記 Xは、一 (1) - β -Ό-Χ y 1 、一 (1) -/3 -D- X y 1 p -

( 1， 4) -β -D-G a 1 p、一 (1) -β -D-Xy 1 p - ( 1, 4) — β -D-G a 1 p— (1, 3) - β -Ό-G a 1 p、一 ( 1) - 3 - D - X y 1 p - ( 1, 4) -β -Ό-Ga 1 p— ( 1, 3) -β-Ό-Ga I p- (1， 3) — j3— D— G l c pA、一 (1) — β— D— X y 1 - (1, 4) -β -D-G a l p - ( 1， 3) - β -D- G a 1 p - ( 1， 3) — /3— D— G l c p A— ( 1， 4) 一) 3 - D— Ga 1 pNAcおよび— ( 1) — β _D— Xy 1 p— (1, 4) 一 — D— Ga l p - （1, 3) 一 jS— D— Ga l p - （1, 3) 一 j8 - D — G l c pA— (1, 4) 一ひ一 D— G l c pNAc (式中、 Xy 1 pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース、 G l c pAは、グルクロン酸、 Acは、ァセチル）からなる群より選択される構造で示される糖鎖またはその改変体を含む、請求項 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

3. 前記 Xは、 ― （1) — ;3— D— Xy l p— (1， 4) -^-D-Ga 1 p (式中、 Xy l pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む、請求項 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

4. 前記 Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、請求項 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

5. 前記 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、請求項 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

6. 以下の式：

S^er一 Gly

(式中、 (； 1 yはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは O— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマーュニッ卜 (i) 、および Zまたは以下の式：

T r—— Gly

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは O— X、ここで〇は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマ一ユニット（i i ) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが〇—Xである、糖べプチドまたはその改変体。

7 . 前記モノマーユニット（i ) と前記モノマーユニット（i i ) との総和に対する該モノマーユニット ( i ) の割合が、 0 . 1〜0 . 9である、請求項 6に記載の糖べプチドまたはその改変体。

8 . 以下の式

(式中、 Glyは、グリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 0は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体。

9 . 前記糖ペプチドのペプチド部分は 4以上のアミノ酸を含む、請求項 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

1 0 . 前記糖ペプチドのペプチド部分は 8以上のアミノ酸を含む、請求項 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

1 1 . 前記糖ペプチドのペプチド部分は環状ペプチドを形成する、請求項 1に記載の糖べプチドまたはその改変体。

1 2 . 前記糖ペプチドのペプチド部分は、ァセチル化されたものである、請求項 1に記載の糖ペプチドまたはその改変体。

1 3 . 前記ァセチル化は、前記べプチド部分の N末端に存在する、請求項 1 2 に記載の糖べプチドまたはその改変体。

1 4. 以下の式

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y ¹ および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、〇は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数) で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体。

1 5 . 糖ペプチドまたはその改変体を含む、プロテオダリカンイニシエータ一として使用するための組成物。

1 6 . 以下の式：

o - x

一 Y— G I y -

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 0は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは O— X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体) に示される構造を有するモノマーュニッ卜 ( i ) および/または以下の式：

Thr—— Gly—— (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは〇— X、ここで 0は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（ i i) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが O— Xである、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式：

O— X

(式中、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；

および

以下の式： o-x

一（Y¹— G l y— Y²— G l y ) ―

H7 (式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹ および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 O は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数）で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含む、請求項 1 5に記載の組成物。

1 7. 前記 Xは、 ― （1) 一 — D— Xy l p、一 (1) 一 /3—D— Xy l p 一（1, 4) 一 i3 - D - G a l p、一 (1) — |3 - D— Xy l p - （1, 4) - β -Ό-G a 1 P- (1, 3) 一 3 - D— Ga l p、一 (1) — β _D— Xy 1 P― ( 1， 4) ~ β -D-G a 1 p - ( 1 , 3) - β -D-G a 1 p - (1 , 3) -β -D-G 1 c pA、一 (1) — β— D— X y 1 - (1， 4) -/3 -D -G a 1 - (1， 3) 一 j3 - D— G a l p - （1， 3) 一 j8 - D - G l c pA - ( 1， 4) 一 — D - G a 1 pNA cおよび— （1) — )3 - D - Xy l p— ( 1， 4) - β -D-G a 1 p— (1, 3) 一 j6— D - G a l p - （1， 3) 一 iS— D— G l c pA— （1, 4) - α-D-G 1 c pNAc (式中、 X y 1 pは、キシロビラノース、 Ga l pは、ガラクトピラノース、 G l c pAは、ダルク口ン酸、 Acは、ァセチル）からなる群より選択される構造で示される糖鎖またはその改変体を含む、請求項 1 5に記載の組成物。

1 8. 前記 Xは、 ― （1) 一 ]3— D— Xy l p— （1， 4) - j3 -D-G a 1 P (式中、 Xy l pは、キシロピラノ一ス、 G a l pは、ガラク卜ピラノース）で示される糖鎖またはその改変体を含む、請求項 1 5に記載の組成物。

1 9. 前記 Yは、セリンもしくはスレオニンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、請求項 1 5に記載の組成物。

2 0 . 前記 Yは、セリンまたはその生物学的適合性を有する改変体である、請求項 1 5に記載の組成物。

2 1 . 糖ペプチドまたはその改変体を含む、プロテオグリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患の予防、処置または予後のための医薬組成物。

2 2 . 以下の式：

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Yはセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 Oは該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子）で表される構造を有する糖ペプチドまたはその改変体；以下の式：

Ser—— Gly (式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Serはセリンまたはその改変体、 Aは O— Hまたは〇_ X、ここで Oは該セリンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i ) および Zまたは、以下の式：

Thr—— Gly

(式中、 Glyはグリシンまたはその改変体、 Thrはスレオニンまたはその改変体、 Aは 0— Hまたは O— X、ここで 0は該スレオニンに由来する酸素原子、 Xは糖鎖またはその改変体）に示される構造を有するモノマーユニット（i i ) で構成され、総アミノ酸残基の数が 4以上であり、但し少なくとも 1つの Aが O— Xである、糖ペプチドまたはその改変体；

以下の式：

- — G 1 y ) _n—

および以下の式：

O— X

― (Y¹— G ί y— Υ²— G I y ) _n—

(式中、 G 1 yはグリシンまたはその改変体、 Xは糖鎖またはその改変体、 Y¹ および Y ²はそれぞれ独立してセリンもしくはスレオニンまたはその改変体、 O は該セリンまたは該スレオニンに由来する酸素原子、 nは 1以上の整数) で表される構造を有する糖べプチドまたはその改変体、

からなる群から選択される、少なくとも 1つの糖ペプチドまたはその改変体を含む、請求項 21に記載の組成物。

2 3. 前記プロテオダリカンの異常レベルに関連する状態、障害または疾患は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、軟骨破壊、骨粗鬆症、糸球体ネフローゼ、皮膚の脆弱化、扁平角膜、コラーゲン繊維の構造異常，皮膚の脆弱化、角膜不透明化、 X連鎖性先天性定常夜盲症、軟骨基質欠損、屈指 -関節症 -内反股一心膜炎症候群、卵丘 ·卵母細胞複合体のマトリックス欠損、不妊、 Dy s s e gme n t a 1 Dy s p l a s i a, 骨格異常、神経筋シナプス形成の異常、 S c h w a r t z— J amp e 1 -EE, S i l v e rma n— Handma k e r型、 Wi n g 1 e s s様表現型、 S imp s on— Go l a b i - Be hme 1症および骨格異常からなる群より選択される状態、障害または疾患を包含する、請求項 2 1に記載の医薬組成物。

24. 以下の工程：

(a) 被検体の状態、障害または疾患を同定する工程；

(c) 該プロテオグリカンを生体内で増加させるためのイニシエータ一として使用される糖ペプチドまたはその改変体を提供する工程；

( d ) 該糖ペプチドまたはその改変体を該被検体に投与する工程、

25. 以下の工程：

(a) ダルコース残基を含む糖鎖またはその改変体を提供し、該グルコース残基を残基内 1， 6脱水縮合させて、 1, 6無水糖鎖を生成する工程；

(b) セリンおよび Zまたはスレオニンを含むペプチドまたはその改変体を提供する工程；および

(c) 該 1， 6無水糖鎖と該ペプチドまたはその改変体とを脱炭素化および力ップリング反応させて、キシロース残基が該セリンおよび Zまたはスレオニンに結合された糖べプチドまたはその改変体を生成する工程、

を包含する、キシロース残基がペプチドに結合した糖ペプチドまたはその改変体の製造方法。

26. 前記工程（a) は、前記 6無水糖鎖を保護することを包含する、請求項 25に記載の方法。

27. 前記工程（c) は、脱保護することを包含する、請求項 26に記載の方

28. 前記脱保護は、水素添加による脱保護である、請求項 27に記載の方法

29. さらに、

を包含する、請求項 25に記載の方法。

30. さらに、

(e) 前記糖べプチド重合体を分離する工程、

を包含する、請求項 29に記載の方法。

31. さらに、

( f ) 前記糖ペプチドまたはその改変体を環化する工程

を包含する、請求項 25に記載の方法。