WO2004074471A1 - Inmovilización de bio-macromoléculas sobre soportes activados con grupos epóxido. - Google Patents

Inmovilización de bio-macromoléculas sobre soportes activados con grupos epóxido. Download PDF

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José Manuel GUISAN SEIJAS
Roberto Fernandez-Lafuente
Cesar Mateo Gonzalez
Rodrigo Torres Saez
Gloria FERNÁNDEZ LORENTE
Claudia Ortiz
Manuel FUENTES GARCÍA
Aurelio Hidalgo Huertas
José Miguel PALOMO CARMONA
Fernando LÓPEZ GALLEGO
Lorena Betancor Dutrenit
Chitunda Pessela Benevides Costa
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Resindión Srl
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    • C12N11/087—Acrylic polymers

Definitions

  • the present invention relates to the area of immobilization of industrial enzymes and other biomachromolecules for use as catalysts or biosensors in areas such as analytical chemistry, fine chemistry, food technology, pharmaceutical chemistry, etc.
  • it refers to the use of new epoxy supports in which each of them has an ionic spacer arm to perform said immobilizations, as an advantageous alternative with respect to the conventionally used monofunctional epoxide groups and to any other immobilization method .
  • the supports activated with epoxide groups have a series of characteristics that make them one of the best options for the industrial immobilization of enzymes. Among them, we can highlight:
  • the epoxy supports are activated during the solid preparation process, so that they reach the customer ready to use without any previous treatment.
  • the epoxide groups are very stable at neutral pH even in the presence of water, so they can be produced in a company far away from the one that will finally use them, they can be stored easily, etc.
  • the immobilization is carried out in two stages, a first "rapid” physical adsorption of the protein followed by the "intramolecular” covalent bond between the enzyme and the support epoxy groups.
  • the support must have a hydrophobic nature, and it has been described that this may have unstabilizing or inactivating effects of the enzymes.
  • the enzyme will be oriented on the support by the area where it has more hydrophobic pockets, which may or may not be adequate to achieve the highest values of activity, stability, etc.
  • the present invention seeks to find solutions to the limitations of the methods currently available in the market or in the scientific literature for the use of supports activated with epoxy groups, fundamentally in terms of limiting experimental conditions (now it must be carried out at high ionic strength) and the nature of the support (now it must be hydrophobic in nature).
  • this type of groups avoids the restriction as to the nature of the support, which can be totally inert.
  • the supports activated with this type of groups will have a much more hydrophilic surface due to their own ionic nature.
  • the orientation of the protein with respect to the support may be different from that achieved with conventional hydrophobic supports, so that the immobilization of an enzyme on both supports may cause enzymatic derivatives with different activity and / or stability. This opens up new possibilities of immobilizing industrial enzymes to epoxy supports (one of the most suitable for this purpose as discussed above). DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIGURE 4 Immobilization kinetics of beta-galactosidase from A.oryzae on epoxy-agarose (A) and amino-epoxy-agarose (B) supports at different ionic forces, (rhombuses) supernatant from the 1M sodium phosphate immobilization suspension (circles) supernatant of the 5 mM sodium phosphate immobilization suspension. Immobilizations were carried out at pH 7 and 20 ° C.
  • FIGURE 5 Immobilization courses of A. niger Beta-galactosides on EC-EP-Sepabeads (A) and EC-HFA-Sepabeads (B) supports at different ionic forces: 50 mM (circles) 5 mM (squares) (triangles) ) 100 mM (diamonds) 1000 mM sodium phosphate. The enzyme was immobilized at pH 7.0 and 20 ° C.
  • FIGURE 6 Thermal stability of Thermus sp. Beta-galactosidase. (triangles) soluble enzyme (squares) EC-EP3-Sepabeads (circles) Sepabeads EC-HFA. Courses of inactivation of soluble and immobilized enzymes were carried out in Buffer novo at pH 6.5 and 70 ° C.
  • FIGURE 7 Thermal stability of yeast invert (triangles) Soluble enzyme (squares) EC-EP3 Sepabeads (circles) EC-HFA2-Sepabeads. Courses of inactivation of soluble and immobilized enzymes were carried out in 50 mM acetate buffer, pH 5.5 and 55 ° C.
  • FIGURE 8 Thermal stability of Thermus sp. Beta-galactosidase. (triangles) soluble enzyme (squares) EC-EP3-Sepabeads (circles) Sepabeads EC-H
  • FIGURE 9 A-niger Glucoamylase immobilization courses on EC-EP-Sepabeads (A) and EC-HFA-Sepabeads (B) supports. (squares) Enzymatic activity in the suspension (circles) Enzymatic activity in the supernatant.
  • EXAMPLE 1 Immobilization of Aspergillus or zae Beta-galactosidase on different agarose-epoxide supports: 6% agarose amino epoxide supports (6 BCL) were prepared by incubation of aminated agarose (with 40 micromoles of ethylenediamine) with epichlorohydrin or with 1 -4- butanedioldiglycidyl ether. These amino-epoxide supports were compared in the immobilization of Aspergillus oryzae beta-galactosidase with commercial agarose epoxide supports ( Figure 4).
  • EXAMPLE 2 Immobilization of Aspergillus oryzae Beta-galactosidase on different epoxyacrylic supports activated with monofunctional epoxy groups of the EC-EP-Sepabeads type or commercial epoxy amino groups of the EC-HFA-Sepabeads type.
  • Figure 5 shows how the enzyme is immobilized on monofunctional epoxy supports only at high ionic strength and relatively slowly. In addition, the enzyme is almost completely inactivated upon immobilization. However, in the supports activated with amino epoxide groups, the enzyme is immobilized at low ionic strength. In fact, the enzyme is immobilized very quickly (in just a few minutes), and keeps its activity intact. These derivatives could hydrolyze more than 99% of 5% lactose solutions at pH 4.5 and 30 ° C.
  • EXAMPLE 3 Immobilization of the Beta-galactosidase of Thermus sp T2 on different epoxyacrylic supports activated with monofunctional epoxy groups of the EC-EP-Sepabeads type or commercial epoxy amino groups of the EC-HFA type- Sepabeads at pH 7. Again the enzyme so only monofunctional supports could be immobilized at high ionic strength, even at 1 M sodium phosphate only 60% of the enzyme was immobilized. Supports activated with the new amino-epoxide group immobilized 100% in just a few minutes at 5 mM sodium phosphate. The enzyme immobilized on both preparations maintained 100% activity.
  • EXAMPLE 4 Immobilization of the yeast invertase on different epoxyacrylic support activated with monofunctional epoxy groups of the EC-EP-Sepabeads type or commercial epoxy amino groups of the EC-HFA-Sepabeads type. Again, the enzyme was only immobilized only on monofunctional epoxy supports at high ionic strength (1 M sodium phosphate), reaching an immobilization yield of 62% of the enzyme offered to the support. Supports activated with the new amino-epoxide group immobilized 100% of the invertase at short times (less than 1 hour) and at a concentration of 5 mM sodium phosphate.
  • EXAMPLE 5 Immobilization of Candida lipase rugosa in different epoxyacrylic supports activated with monofunctional epoxide groups of the EC-EP-Sepabeads or commercial epoxy amino groups of the EC-HFA-Sepabeads type
  • the enzyme was immobilized on monofunctional epoxy supports at high ionic strength (1 M sodium phosphate), reaching an immobilization yield of 85% of the enzyme offered to the support at 24 hours.
  • the activity recovery was around 80% of the activity immobilized on the supports.

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Abstract

El proceso de inmovilización de enzimas y proteínas sobre este tipo de soporte tiene lugar en dos etapas consecutivas: a. una primera adsorción iónica muy rápida de la enzima sobre el soporte ionizado en condiciones experimentales muy suaves y b. la inmovilización covalente multipuntual intensa entre la enzima previamente adsorbida y una muy alta densidad de grupos epóxido presentes en el soporte. Las principales características prácticas de este nuevo método de inmovilización son: la inmovilización muy rápida de grandes cantidades de enzima en condiciones experimentales muy suaves, la posibilidad de conseguir la estabilización de las enzimas inmovilizadas por inmovilización covalente multipuntual al soporte, la no utilización de ningún reactivo inestable ni tóxico durante o después de la inmovilización, etc.

Description

INMOVILIZACIÓN DE BIO-MACROMOLÉCULAS SOBRE SOPORTES ACTIVADOS CON GRUPOS EPÓXIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al área de la inmovilización de enzimas industriales y otras biomacromoléculas para su utilización como catalizadores o biosensores en áreas como la química analítica, química fina, tecnología de alimentos, química farmacéutica, etc. En particular, se refiere a la utilización de nuevos soportes epoxidos en los que cada uno de ellos tiene un brazo espaciador de carácter iónico para realizar dichas inmovilizaciones, como una alternativa ventajosa con respecto a los grupos epoxido monofimcionales convencionalmente utilizados y a cualquier otro método de inmovilización.
ANTECEDENTES DE LAINVENCIÓN
Los soportes activados con grupos epoxido reúnen una serie de características que los convierten en una de las mejores opciones para la inmovilización industrial de enzimas. Entre ellas, podemos destacar:
1.- Los soportes epóxido se activan durante el proceso de preparación del sólido, de forma que llegan al cliente listos para usar sin ningún tratamiento previo.
2.- Los grupos epóxido son muy estables a pH neutro incluso en presencia de agua, por lo que pueden ser producidos en una compañía muy alejada de la que finalmente los va a utilizar, pueden almacenarse de forma sencilla, etc.
3.- Los grupos epóxido pueden reaccionar con grupos amino, grupos tiol o grupos hidroxilo de la superficie de la proteína, originando enlaces covalentes muy robustos (amino secundario, tioeter o éter) sin necesidad de requerir una estabilización posterior, e introduciendo una modificación química mínima en la proteína.
4.- Tras los procesos de inmovilización, es muy sencillo bloquear los grupos epoxido remanentes, evitando reacciones incontroladas entre la proteína y el soporte y alterando las propiedades físicas del soporte de la forma deseada. Por otro lado, los grupos epóxido podrían ser muy útiles para conseguir la estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual ya que:
.- Su estabilidad permite reacciones largas entre la enzima ya inmovilizada y los grupos epoxido del soporte, incluso a pH alcalino. .- Pueden implicarse grupos de la superficie de la proteína muy diferentes
.- No existen grandes impedimentos estéricos para la reacción entre los grupos de la proteína y los grupos epóxido.
.- Están separados por brazos de tamaño moderado del soporte, de forma que son útiles para incrementar la rigidez de las proteínas Sin embargo, los grupos epóxido no son muy reactivos con las proteínas. La inmovilización se efectúa en dos etapas, una primera adsorción física " rápida" de la proteína seguida por la unión covalente "intramolecular" entre la enzima y los grupos epóxido del soporte.
Por ello, los soportes comerciales que se utilizan para inmovilizar enzimas (p.ej. Eupergit, Sepabeads) son de naturaleza moderadamente hidrofóbica y recomiendan la inmovilización de las proteínas a elevada fuerza iónica para forzar la adsorción hidrofóbica de las proteínas sobre el soporte, para a continuación producirse la reacción covalente (ver figura 1). Este tipo de inmovilización ha sido empleado con éxito en muchos casos, pero presenta una serie de limitaciones: .- No todas las proteínas pueden exponerse a elevada fuerza iónica sin que se inactiven o precipiten.
.- El soporte debe de tener una naturaleza hidrofóbica, y se ha descrito que esto puede tener efectos inestabilizantes o inactivantes de las enzimas.
.- La enzima se orientará sobre el soporte por la zona donde tenga mas bolsillos hidrofobicos, pudiendo ser ésta adecuada o no para conseguir los mayores valores de actividad, estabilidad, etc
Una primera solución a este problema surgió con el empleo de soportes epóxido- heterofimcionales, en los que se modificaba una pequeña cantidad de grupos epóxido con distintos grupos capaces de adsorber proteínas (etilendiamina, iminodiacético, m- amino-fenilborónico, quelatos metálicos, etc). Aunque este tipo de soportes permitía inmovilizar enzimas en distintas condiciones, no requería que el soporte fuera hidrofóbico y permitía inmovilizar una enzima mediante diferentes orientaciones, sin embargo, no permitía simultáneamente tener elevada velocidad de adsorción y de unión covalente, ya que los grupos adsorbentes se introducían destruyendo parte de los grupos epóxido. Esto originaba que no se lograran velocidades grandes de inmovilización, y que las posibilidades de la unión covalente multipuntual se vieran disminuidas (figura
2)
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención trata de encontrar soluciones a las limitaciones de los métodos actualmente existentes en el mercado o en la literatura científica para la utilización de soportes activados con grupos epóxido, fundamentalmente en cuanto a la limitación de las condiciones experimentales (ahora debe de realizarse a alta fuerza iónica) y a la naturaleza del soporte (ahora debe de ser de naturaleza hidrofóbica).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En esta patente reivindicamos el uso de un nuevo tipo de grupos amino con un grupo epóxido sobre él como una mejor opción para inmovilizar proteínas. De esta forma, no hay competencia entre grupos adsorbentes y grupos para la unión covalente y se puede maximizar ambas velocidades. (Figura 3). Además, al ester todos los grupos epoxido sobre los grupos amino y a la misma distancia del soporte, no habrá impedimentos para la unión covalente multipuntual de la enzima sobre el soporte. Al ser una interacción iónica, la adsorción se realizará a baja fuerza iónica, siendo la presencia en la proteína de interés de zonas con carga negativa en las condiciones de inmovilización la única restricción a la posibilidad de uso de esta estrategia.
Finalmente, este tipo de grupos evita la restricción en cuanto a la naturaleza del soporte, que puede ser totalmente inerte. En cualquier caso, los soportes activados con este tipo de grupos tendrán una superficie mucho mas hidrofílica por su propia naturaleza iónica. Además, la orientación de la proteína con respecto al soporte podrá ser diferente a la conseguida con los soportes hidrofóbicos convencionales, por lo que la inmovilización de una enzima sobre ambos soportes podrá originar derivados enzimáticos con diferente actividad y/o estabilidad. Esto abre nuevas posibilidades de inmovilizar enzimas industriales a soportes epóxido (uno de los mas adecuados para este fin como discutimos anteriormente). DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 4. Cinética de Inmovilización de beta-galactosidasa de A.oryzae sobre soportes epoxi-agarosa (A) y amino-epoxi-agarosa (B) a diferentes fuerzas iónicas, (rombos) sobrenadante de la suspensión de inmovilización en fosfato de sodio 1M (círculos) sobrenadante de la suspensión de inmovilización en fosfato de sodio 5 mM. Inmovilizaciones fueron llevadas a cabo a pH 7 y 20 °C.
FIGURA 5. Cursos de inmovilización de Beta-galactosidas de A. niger sobre soportes EC-EP- Sepabeads (A) y EC-HFA-Sepabeads (B) a diferentes fuerzas iónicas: (círculos) 5 mM (cuadrados) 50 mM (triángulos) 100 mM (rombos) 1000 mM de fosfato de sodio. La enzima se inmovilizó a pH 7.0 y 20 °C.
FIGURA 6. Estabilidad térmica de Beta-galactosidasa de Thermus sp. (triángulos) enzima soluble (cuadrados) EC-EP3-Sepabeads (círculos) Sepabeads EC-HFA. Cursos de inactivación de las enzimas soluble e inmovilizadas se llevaron a cabo en Buffer novo a pH 6,5 and 70°C. FIGURE 7. Estabilidad térmica de Invertasa de levadura (triángulos) Enzima soluble (cuadrados) EC-EP3 Sepabeads (círculos) EC-HFA2-Sepabeads. Cursos de inactivación de las enzimas soluble e inmovilizada fueron llevados a cabo en buffer acetato 50 mM, pH 5.5 y 55°C. FIGURA 8. Cursos de inmovilización de lipasa de Candida vmg&m sobre soportes EC- EP-Sepabeads (A) y EC-HFA-Sepabeads (B). (cuadrados) Actividad enzimática en la suspensión (círculos) Actividad enzimática en el sobrenadante.
FIGURA 9. Cursos de inmovilización de Glucoamilasa de A-niger sobre soportes EC- EP-Sepabeads (A) y EC-HFA-Sepabeads (B). (cuadrados) Actividad enzimática en la suspensión (círculos) Actividad enzimática en el sobrenadante.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1.- Inmovilización de la Beta-galactosidasa de Aspergillus or zae sobre distintos soportes agarosa-epóxido: Se prepararon soportes amino epoxido agarosa 6% (6 BCL) por incubación de agarosa aminada (con 40 micromoles de etilendiamina) con epiclorhidrina o con 1-4- butanodioldiglicidil-eter . Estos soportes amino-epóxido se compararon en la inmovilización de la beta-galactosidasa de Aspergillus oryzae con soportes epóxido agarosa comerciales (Figura 4). Mientras que los grupos epóxido monofuncionales no inmovilizaban la beta-galactosidasa ni a alta ni a baja fuerza iónica (la agarosa es inerte y no adsorbe la proteína), por el contrario, la agarosa activada con grupos amino- epóxido era capaz de inmovilizar la enzima a pH 7, aumentando la velocidad de inmovilización cuando la fuerza iónica descendía. Después de 24 h, lavados con alta fuerza iónica de derivados de la enzima inmovilizada no liberaban enzima al medio, mostrando que la enzima había sido unida covalentemente al soporte.
EJEMPLO 2.- Inmovilización de la Beta-galactosidasa de Aspergillus oryzae sobre diferentes soportes epoxiacrílicos activados con grupos epóxido monofimcionales del tipo EC-EP-Sepabeads o grupos amino epóxido comerciales del tipo EC-HFA- Sepabeads.
La Figura 5 muestra como la enzima se inmoviliza sobre soportes epóxido monof ncionales solo a elevada fuerza iónica y de forma relativamente lenta. Además, la enzima se inactiva casi totalmente al inmovilizarse. Sin embargo, en los soportes activados con grupos amino epoxido, la enzima se inmoviliza a baja fuerza iónica. De hecho, la enzima resulta inmovilizada de forma muy rápida (en tan solo unos pocos minutos), y mantiene intacta su actividad. Estos derivados podían hidrolizar mas del 99% de soluciones de lactosa al 5% a pH 4.5 y 30°C.
EJEMPLO 3.- Inmovilización de la Beta-galactosidasa de Thermus sp T2 sobre diferentes soporte epoxiacrílicos activados con grupos epóxido monofuncionales del tipo EC-EP-Sepabeads o grupos amino epóxido comerciales del tipo EC-HFA- Sepabeads a pH 7. Nuevamente la enzima tan sólo se podía inmovilizar sobre soportes monofuncionales a elevada fuerza iónica, incluso a 1 M de fosfato sódico se inmovilizaba tan solo el 60% de la enzima. Soportes activados con el nuevo grupo amino-epóxido inmovilizaban el 100% en tan solo unos minutos a 5 mM de fosfato sódico. La enzima inmovilizada sobre ambas preparaciones mantenía el 100% de la actividad. Tras bloquear los grupos epóxido remanentes por incubación a pH 8.5 con 3 M de glicina, se comprobó que el derivado realizado sobre los soportes amino epóxidos eran mucho mas estables que los realizados sobre los soporte epóxido monofuncionales (Figura 6) aunque ambos eran mas estables que la enzima soluble. Asi, en este ejemplo los nuevos grupos permiten mayores rendimientos de inmovilización y estabilidad final del derivado.
Estos derivados podían hidrolizar mas del 99% de soluciones de lactosa al 5% a pH 5-7 a temperaturas entre 30 y 80 °C.
EJEMPLO 4.- Inmovilización de la invertasa de levadura sobre diferentes soporte epoxiacrilicos activados con grupos epoxido monofuncionales del tipo EC-EP- Sepabeads o grupos amino epoxido comerciales del tipo EC-HFA-Sepabeads. Nuevamente, la enzima solo se inmovilizó solo sobre soportes epóxido monofuncionales a elevada fuerza iónica (1 M de fosfato sódico), alcanzando un rendimiento de inmovilización del 62% de la enzima ofrecida al soporte. Soportes activados con el nuevo grupo amino-epóxido inmovilizaban el 100% de la invertasa a tiempos cortos (menos de 1 hora) y a una concentración de 5 mM de fosfato sódico. Tras bloquear los grupos epóxido remanentes por incubación a pH 8.5 con 3 M de glicina, se comprobó que el derivado realizado sobre los soportes amino epóxidos eran mucho mas estables que los realizados sobre los soporte epóxido monofuncionales (Figura 7), aunque ambos eran mas estables que la enzima soluble. Asi, en este ejemplo los nuevos grupos permiten mayores rendimientos de inmovilización y estabilidad final del derivado. Estos derivados podían hidrolizar mas del 99% de soluciones de sacarosa al 50% a pH 5-7 a temperatura entre 30 y 65 °C.
EJEMPLO 5.- Inmovilización de la lipasa de Candida rugosa en diferentes soporte epoxiacrilicos activados con grupos epoxido monofuncionales del tipo EC-EP- Sepabeads o grupos amino epoxido comerciales del tipo EC-HFA-Sepabeads
La lipasa de Grugosa se inmovilizó sobre soportes epóxido monofuncionales a elevada fuerza iónica (1 M de fosfato sódico), alcanzando a 3 horas un rendimiento de inmovilización del 90%. Sin embargo, se recuperó solo un 22% de la actividad en la suspensión enzimática. Mientras que con soportes activados con el nuevo grupo amino- epóxido se inmovilizaba el 90% de la lipasa en un tiempo de 15 minutos, con una recuperación del 75% de la actividad remanente en la suspensión enzimática. (Figura 8). EJEMPLO 6.- Inmovilización de la glucoamilasa de Aspegillus niger sobre diferentes soportes epoxiacrílicos activados con grupos epóxido monofuncionales del tipo EC-EP- Sepabeads o grupos amino epóxido comerciales del tipo EC-HFA-Sepabeads. La enzima se inmovilizó sobre soportes epóxido monofuncionales a elevada fuerza iónica (1 M de fosfato sódico), alcanzando un rendimiento de inmovilización del 85% de la enzima ofrecida al soporte a las 24 horas. Soportes activados con el nuevo grupo amino-epóxido inmovilizaban el 100% de la glucoamilasa a tiempos cortos (menos de 1 hora) y a una concentración de 5 mM de fosfato sódico. (Figura 9). Además, en ambos casos la recuperación de actividad fue de alrededor del 80% de la actividad inmovilizada en los soportes.
Estos derivados podían hidrolizar más del 99% de soluciones de dextrinas o maltosa al 50% a pH 5-7 a temperatura entre 30 y 65 °C.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas sobre soportes activados con grupos epoxido conteniendo grupos ionizados en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. Este proceso de inmovilización esta caracterizado porque ocurre en dos etapas secuénciales: una adsorción física muy rápida de la enzima sobre el soporte ionizado y una posterior inmovilización covalente entre la enzima adsorbida y los grupos epoxido del soporte.
2.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado porque el soporte activado contiene uno o varios grupos con carga positiva en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. Por ejemplo, grupos aminos primarios, grupos amino secundario, grupos amino terciarios, grupos amino cuaternario, grupos guanidino o cualquier otro grupo funcional con características físicas similares.
3.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 2 caracterizado porque el soporte activado se prepara a partir de soportes que contienen cualquier tipo de grupo funcional, cercano a la superficie del soporte, que sea capaz de reaccionar con grupos amino. Estos soportes se modifican inicialmente con una diamina (p.e.etilendiamina) y posteriormente con butanodiol diglicidil éter. Los grupos iniciales presentes en el soporte pueden ser epóxidos, cianatos, imidocarbonatos, aldehidos, esteres de N-hidroxisucinimida o cualquier otro grupo funcional con reactividad química similar.
4.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado porque el soporte activado contiene uno o varios grupos con carga negativa en el brazo espaciador que une cada grupo epoxido a la superficie del soporte. Por ejemplo, grupos carboxilo, grupos fosfato, grupos sulfato o cualquier otro gripo funcional con propiedades físicas similares.
5.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizados porqué los soportes utilizados son resinas epoxi- acrílicas, geles de agarosa, vidrio poroso, sílice porosa, celulosa o cualquier otro tipo de soporte útil para la inmovilización de enzimas.
6.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado porque la inmovilización se realiza a baja fuerza iónica (entre 0 y 500 mM), a pH comprendido entre 3 y 11 (preferentemente a pH 7.0), a temperaturas comprendidas entre 4 y 80 °C (dependiendo de la estabilidad térmica de la enzima a inmovilizar) y durante un prolongado tiempo de inmovilización para fomentar la unión covalente multipuntual entre la enzima adsorbida y los grupos epóxido del soporte (por ejemplo entre 30 minutos a 7 días).
7.- Un método de inmovilización de enzimas y bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado porque el proceso de inmovilización se realiza en presencia de polioles, detergentes, aditivos, inhibidores de las enzimas, etc con objeto de conservar la estabilizad de la enzima soluble durante el proceso de inmovilización y evitar simultáneamente fenómenos de agregación indeseables.
8.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado por un tratamiento final físico o químico del derivado inmovilizado con diferentes compuestos hidrofílicos (etilendiamina, lisina, glicina, ácido aspartico, polietrilendiamina, dextrano sulfato etc) con objeto de modificar la interacción enzima-soporte y de modificar el micro-ambiente que rodea todas y cada una de las moléculas de enzima inmovilizada.
9.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reivindicación 1 caracterizado porque las enzimas inmovilizadas son la beta- galactosidasa de Aspergillus oryzae, la beta-galactosidasa de Thermus sp T2, la invertasa de levadura de panadería, la glucoamilasa de Asperigullus niger, la lipasa de Candida rugosa , la lipasa de Candida antárctica (fracción B) y cualquier otra proteína glicosilada o no glicosilada y que posea cualquier valor de su punto iso-eléctrico.
10.- Un método de inmovilización de enzimas y otras bio-macromoléculas según reinvindicación 1 caraterizado porque los derivados inmovilizados preparados se pueden utilizar en cualquier proceso enzimático de interés industrial.
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CROSS-LINKERS Almost any of the homobifunctional cross-linkers listed in Chapter 4 can be used one way or another to immobilize proteins. Depending on the matrix functional groups, different cross-linkers will have to be used. The following reactions demonstrate the use of these reagents.

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