JP4728140B2

JP4728140B2 - タンパク質の固定化方法

Info

Publication number: JP4728140B2
Application number: JP2006043874A
Authority: JP
Inventors: 典穂神谷; 雅宏後藤; 智土居; 浩一郎中村; 規之川太; 浩示藤田; 興規棚村
Original assignee: Kyushu University NUC; Nippon Sheet Glass Co Ltd
Current assignee: Kyushu University NUC; Nippon Sheet Glass Co Ltd
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2006-02-21
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2026-02-21
Also published as: JP2006258805A

Description

本発明は、基板、特に、タンパク質固定用の基板、及びタンパク質の固定化方法に関する。

今日、様々な機能性タンパク質がプロテインアレイなどのバイオテクノロジー関連分野で利用されている。プロテインアレイの分野における近年の成長は、表面化学、タンパク質の固定化、タンパク質のラベル化やその検出方法などの発達に起因するところが大きい。中でも特に、タンパク質の固定化は、DNAアレイとは違い、固定化するタンパク質の種類によって大きく異なるため、非常に重要である。タンパク質はその活性を失うことなく、また、できるだけ水環境で保持されて固定化されなければならない。タンパク質アレイ技術の発展のためには、タンパク質の固定化技術の確立が不可欠である。

タンパク質アレイではタンパク質はほとんどの場合、担体に固定化されて利用される。一般に固定化担体としてはガラススライド、多孔質ゲル、マイクロタイタープレートなどが用いられている。また、固定化担体がガラススライドである場合に、表面にアミノ基を導入したスライドガラスが知られている。また、担体上のアミノ基とタンパク質の固定化方法については、グルタルアルデヒドでアミノ基を活性化して、タンパク質の末端アミノ基等と結合させる方法などが知られている。

特許文献1には、スライドガラス表面に、末端がアミノ基である活性分子を導入したDNA反応検出チップが開示されている。特許文献２には、プラスチック基材表面に、アミノアルキルシランによりアミノ基を導入したマイクロチップ用基板が開示されている。
特開２００４−０９３３３０号特開２００３−１６１７３１号

しかしながら、上記に開示されている方法は、以下のような問題点があった。すなわち、表面にアミノプロピル基を導入したスライドガラスの場合、タンパク質の固定化力が弱く、繰り返し使用した場合に、固定化したタンパク質の量が減少するという問題があった。

そこで、本発明はこのような課題を解決するためになされたものであって、タンパク質を強く固定化するとともに、繰り返し使用しても、タンパク質の活性が維持されたアミノ化タンパク質固定化基板を提供することを目的とする。

本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、本発明の基板及びタンパク質の固定化方法を完成するに至った。

本発明の基板は、下記の一般式、
（RO）_３Si-(CH₂)_k-(C₆H₄)_l-(CH₂)_ｍ−（NHCH₂CH₂）_ｎ−NH₂
(但し、式中、Rはアルキル基であり、ｋ＝1,2,3・・・、ｌ＝0,1,2,3・・・、ｍ＝0,1,2,3・・・、ｎ＝1,2,3・・・である。)で示されるアミノ基含有ケイ素化合物で担体を処理して、該担体の表面にアミノ基を導入してなる基板に関する。

本発明は前記ｎが、３〜２０である基板に関する。

本発明は前記アミノ基含有ケイ素化合物が、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンである基板に関する。

特に、本発明は、基板へタンパク質を固定化する方法であって、基板が下記の一般式
（ＲＯ）_３Ｓｉ−（ＣＨ_２）_ｋ−（Ｃ_６Ｈ_４）_ｌ−（ＣＨ_２）_ｍ−（ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ_２
（但し、式中、Ｒはアルキル基であり、ｋ＝１，２，３・・・、ｌ＝１，２，３・・・、ｍ＝０，１，２，３・・・、ｎ＝１，２，３・・・である。）
で示されるアミノ基含有ケイ素化合物によって担体を処理して、担体の表面にアミノ基を導入されてなり、該基板をタンパク質含有緩衝液に浸して、該タンパク質を該アミノ基に静電相互作用によって固定化することを特徴とする基板へタンパク質を固定化する方法に係るものである。

本発明は、前記緩衝液が、タンパク質、生体高分子、生物試料(細胞、微生物、組織、器官など)を含有するものに関する。

本発明のタンパク質の固定化方法の好ましい実施態様において、ｌ≧１の場合(フェニル基を有する場合)、フェニル基の疎水性相互作用によって、タンパク質を固定化することを特徴とする。

本発明のタンパク質の固定化方法の好ましい実施態様において、前記タンパク質の固定化において、前記タンパク質の等電位点をpIとし、前記アミノ基の酸解離定数をｐKaとした場合に、前記タンパク質を含有する緩衝液のpHが、下記式、
pKa＞前記タンパク質を含有する緩衝液のpH＞pI
を満足することを特徴とする。

本発明によれば、アミノ基による静電相互作用に加え、フェニル基による疎水性相互作用によって、pH依存性の影響を抑えつつ、タンパク質の固定化力を向上させるとともに、繰り返し使用した場合であっても、タンパク質の活性を維持し得るという有利な効果を有する。

本発明の基板は、下記の一般式、
（RO）_３Si-(CH₂)_k-(C₆H₄)_l-(CH₂)_ｍ−（NHCH₂CH₂）_ｎ−NH₂
(但し、式中、Rはアルキル基であり、ｋ＝1,2,3・・・、ｌ＝1,2,3・・・、ｍ＝0,1,2,3・・・、ｎ＝1,2,3・・・である。)で示されるアミノ基含有ケイ素化合物で担体を処理して、該担体の表面にアミノ基を導入してなることができる。ｋ、ｌ、ｍの上限については、特に限定されるものではないが、好ましくは、３〜２０である。かかる一般式で示されるアミノ基含有ケイ素化合物は、側鎖に多数の置換基を有し、これら置換基が、静電相互作用、疎水性相互作用などによりタンパク質を固定化することを可能としている。好ましい実施態様において、前記一般式中のアミノ基へタンパク質が静電相互作用によって固定化される。高分子タンパク質をより安定的に固定化するという観点から、上記一般式中の前記ｎが、３〜２０であることが好ましい。

アミノ基含有ケイ素化合物としては、特に限定されず、上記一般式を満たすようなものであればよい。アミノ基含有ケイ素化合物としては、例えば、（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン、などを挙げることができる。

また、アミノ基が付与される担体としては、特に限定されることはないが、ガラススライド、多孔性ゲル、マイクロウエルプレート、シリコンウエハなどの無機基板、ポリエステルフィルム、ポリエチレンフィルムなどの有機基板などを挙げることができる。担体の形状に制限はなく、例えば、板、フィルムまたはシートのような平板状のものや、立方体、棒状、球状など３次元形状でもよい。

アミノ基の担体への導入は、特に限定されないが、いわゆるシランカップリングによる。例えば、適当な担体を用意し、トルエン、メタノール、エタノール、水などの溶媒中に、アミノ基含有ケイ素化合物を溶解した溶液に担体を浸し、溶液温度５〜１００℃で、限定されないが、１〜１２時間程度保つと、アミノ基含有ケイ素化合物が担体に結合し、担体の表面にアミノ基が導入される。

本発明のタンパク質の固定化方法について説明する。すなわち、本発明の方法は、基板へタンパク質を固定化する方法であって、該基板が下記の一般式、
（RO）_３Si-(CH₂)_k-(C₆H₄)_l-(CH₂)_ｍ−（NHCH₂CH₂）_ｎ−NH₂
(但し、式中、Rはアルキル基であり、ｋ＝1,2,3・・・、ｌ＝1,2,3・・・、ｍ＝0,1,2,3・・・、ｎ＝1,2,3・・・である。)で示されるアミノ基含有ケイ素化合物で担体を処理して、該担体の表面にアミノ基を導入してなり、該基板をタンパク質含有緩衝液に浸して、該タンパク質を該アミノ基に静電相互作用によって固定化することができる。当該アミノ基とタンパク質との静電相互作用を利用すれば、タンパク質への固定をより一層安定化させることができる。安定化を向上させるには、アミノ基の数を増大させることが好ましい。アミノ基含有ケイ素化合物は、特に限定されるものではなく、上記一般式を満たすようなものであればよい。また、同一または異なるケイ素化合物をタンパク質の固定化に用いることができる。

前記タンパク質含有緩衝液は、タンパク質のほかには、生体高分子又は生物試料（細胞、微生物、組織、器官など）を含有することができる。

ｌ≧１の場合(すなわち、アミノ化合物がフェニル基を有する場合)、フェニル基の疎水性相互作用によって、タンパク質を固定化することができる。これはタンパク質の一次構造の安定化においても、多数の疎水性相互作用が重要な役割を演じているのと同様に、当該多数の疎水性相互作用を利用して、さらにタンパク質の固定化力を向上させることができる。

また、前記タンパク質を固定化させた場合に、前記タンパク質の等電位点をpIとし、前記アミノ基の酸解離定数をpKaとした場合に、タンパク質含有緩衝液のpHが、下記式、
pKa＞前記タンパク質を含有する緩衝液のpH＞pI
を満足することが好ましい。これは、図１に示すように、pHの値が酸解離定数ｐKaの値以下である場合、基板上のアミノ基がプラスの電荷を有している一方、pHの値が等電位点ｐIの値以上である場合、緩衝液中のタンパク質がマイナスの電荷を有しているので、より一層静電相互作用によって固定の安定化を図ることができるからである。

以下、本発明を参考例、実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。

参考例１〜３
アミノ化プレートの準備
（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミンを用いてガラス製マイクロタイタープレートにアミノ基を導入したアミノ化マイクロタイタープレート(日本板硝子(株)製９６穴タイプ、アミノ基のｐKa=8、以後プレートAという)を準備した。

タンパク質の準備
アルカリホスファターゼ(和光純薬製アルカリホスファターゼ（ALP）、コード番号：０１２−１０６９１、pI＝５)を準備した。

緩衝液の準備
ｐH7.5の緩衝液として、緩衝液A（５０ｍM Tris-HCl buffer）を準備した。ｐH ６及びｐH５の緩衝液として、緩衝液B、緩衝液C（５０ｍM acetate buffer）を準備した。

洗浄液としてPBST（８ｍM NaHPO₄、２ｍM KH₂PO₄、0.145M NaCl、０．０５％ Tween２０）を準備した。

プレートAのウエルに、下記のようにしてALPの固定化を行った。所定のｐHの緩衝液に溶解したALP(100μg/ml)をウエルに５０μl加え、37℃で6時間反応させ、リン酸緩衝液で9回、蒸留水で3回洗浄した。酵素活性は、ALPの基質であるp-ニトロフェニル燐酸（１ｍM、１M tris-HCｌ、ｐH8）を用いて評価した。まず、p-ニトロフェニルリン酸１mlをウエルに加え、10分後の吸光度を分光光度計で測定した。その後、繰り返し使用性を評価するために、洗浄液PBSTで５回洗浄後、１MのNaClで3回、蒸留水で2回洗浄し、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。アミノ化プレートのアミノ基のｐKa、タンパク質のpI、固定化水溶液のｐHの間に、ｐKa＞ｐH＞ｐIの関係が成り立つ場合に、効果が認めれた。

実施例４〜６
アミノ基を有するプレートBを、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン（ｋ＝２、ｌ＝1、ｍ＝１、ｎ＝１）をアミノ基含有化合物として用いた以外は参考例１〜３と同様の手順に従って準備した。当該プレートBを使用して、参考例１と同様に酵素活性を調べた。結果を表2に示す。

表２

いずれも、フェニル基の疎水性効果で、ｐＨに依存しないで活性を維持できることが分かる。
したがって、本発明によれば、タンパク質などを静電相互作用によって強く固定化させるとともに、タンパク質の活性をも維持させることが可能であることが判明した。

プロテインアレイなどのバイオテクノロジー関連分野での利用に貢献し得る。

図１は、アミノ基のｐK aとタンパク質のpIとの関係を示した図である。

Claims

基板へタンパク質を固定化する方法であって、基板が下記の一般式
（ＲＯ） _３Ｓｉ−（ＣＨ _２） _ｋ −（Ｃ _６Ｈ _４） _ｌ −（ＣＨ _２） _ｍ −（ＮＨＣＨ _２ＣＨ _２） _ｎ −ＮＨ _２
（但し、式中、Ｒはアルキル基であり、ｋ＝１，２，３・・・、ｌ＝１，２，３・・・、ｍ＝０，１，２，３・・・、ｎ＝１，２，３・・・である。）
で示されるアミノ基含有ケイ素化合物によって担体を処理して、担体の表面にアミノ基を導入されてなり、該基板をタンパク質含有緩衝液に浸して、該タンパク質を該アミノ基に静電相互作用によって固定化することを特徴とする基板へタンパク質を固定化する方法。
フェニル基の疎水性相互作用によってタンパク質を固定化する、請求項１記載の方法。
前記タンパク質の固定化において、前記タンパク質の等電位点をｐＩとし、前記アミノ基の酸解離定数をｐＫａとした場合に、前記タンパク質を含有する緩衝液のｐＨが、下記式
ｐＫａ＞前記タンパク質を含有する緩衝液のｐＨ＞ｐＩ
を満足する、請求項１記載の方法。