CN110551698B - 一种阳离子接枝聚合物的生物酶及其制备方法和固定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种接枝阳离子聚合物的生物酶，通过叠氮基团与炔基的点击化学反应连接生物酶和聚合物。本发明一种阳离子接枝聚合物的生物酶，解决了现有技术中存在生物酶活性降低以及稳定性差的问题。本发明还公开了上述生物酶的制备方法，首先合成含有‑NH2的阳离子聚合物，然后对生物酶进行改性合成含有丙炔基的生物酶以及对含有‑NH2的阳离子聚合物进行改性合成含有叠氮基的阳离子聚合物，含有丙炔基的生物酶与含有叠氮基的阳离子聚合物反应，即得到接枝阳离子聚合物的生物酶；本发明还公开了上述生物酶的固定方法，反应过程温和简单，容易操作。
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，涉及一种阳离子接枝聚合物的生物酶，本发明还涉及上述生物酶的制备方法以及上述生物酶的固定方法。
背景技术
酶是一种重要的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点，在食品、酿造、医药等领域具有广泛应用。由于酶的特殊性质，其高级结构对环境十分敏感，如对温度、pH、有机溶剂、重金属离子等因素，且反应后不能够回收，使酶在工业应用中受到限制。
酶的固定化方法主要有：吸附法、包埋法、交联法和共价法。吸附法是指活性酶在载体表面上的吸附，包括物理吸附和离子吸附，固化过程不需化学试剂，对酶的活性影响小，具有操作简单、步骤少、物理吸附具有很少发生酶降解等优点，但固定后的酶易从载体上脱落，存在稳定性和重现性差，且生物酶存活时间短等问题，因此不能被广泛应用。包埋法是将酶包埋在高分子聚合物三维空间网状结构中的固定方法。该方法可采用温和的实验条件，但这种固定化技术也存在局限性，如聚合物形成过程中产生的自由基对酶的活性基团有影响，而使酶的活性降低。交联法是指通过双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶、聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定的方法，最常用的交联剂是戊二醛，这种方法缺点是膜的形成条件不易确定，须仔细地控制pH、离子强度、温度及反应时间等条件。共价结合法是指酶分子通过共价键与载体表面结合而固定的方法，虽然使酶的结合力增强了，但是存在酶的活性基团因参与共价反应而导致酶活性明显降低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种阳离子接枝聚合物的生物酶，解决了现有技术中存在生物酶活性降低以及稳定性差的问题。
本发明第二个目的是提供上述生物酶的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述生物酶的固定方法。
本发明所采用的技术方案是，一种接枝阳离子聚合物的生物酶，通过叠氮基团与炔基的点击化学反应连接生物酶和聚合物。
本发明第一种技术方案的特征还在于，
阳离子聚合物表面具有易与载体进行化学共价交联和物理吸附的官能团。
本发明所采用的第二种技术方案是，一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，聚合物的合成
称取二苯醚、引发剂、单体和五甲基二乙基三胺PMDETA并混合后，依次通过冷冻、抽真空、解冻、充填氩气的方法进行除氧，然后转移至装有CuCl和磁子的可封口容器中混合均匀，将容器置于30-50℃油浴中搅拌反应1-3h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开容器封口，加入二氯甲烷稀释，然后将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤中性氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物；
将胺类改性剂溶于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到胺类改性剂溶液；
将聚合物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF，得到聚合物溶液；
聚合物溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中，滴加完并经过反应完毕后，混合液经过透析，分子截留量3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物；
步骤2，改性生物酶和改性阳离子聚合物的合成
改性生物酶为：采用丙炔醇修饰生物酶，得到含有丙炔基的生物酶；
改性阳离子聚合物为：采用叠氮钠与步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物反应，得到含有叠氮基的阳离子聚合物；
步骤3，接枝阳离子聚合物生物酶的合成
将步骤2含有丙炔基的生物酶与含有叠氮基的阳离子聚合物反应，即得到接枝阳离子聚合物的生物酶。
本发明第二种技术方案的特征还在于，
步骤1中的引发剂为溴代异丁酸单甲醚乙酯MEG-Br，单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA与丙烯酰胺AM、甲基丙烯酸MA、丙烯酸AA、甲基丙烯酸丁酯TA、甲基丙烯酸羟乙酯HEMA中的一种或几种混合物。
步骤1中的胺类改性剂为乙二胺EDA，二乙烯三胺DETA，三乙烯四胺TETA或聚醚酰亚胺PEI400中的任意一种。
步骤1中胺类改性剂溶液中无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10：1-5，得到的胺类改性剂溶液的摩尔浓度为1mmol/1.2-1.5ml；
聚合物溶液中聚合物与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1-5：15；
含有-NH2的阳离子聚合物中胺类改性剂与聚合物的摩尔比为5-7:10。
步骤2中改性生物酶的具体合成过程为：将生物酶溶解于磷酸缓冲溶液中，将丙炔醇溶液缓慢滴入到生物酶的磷酸缓冲溶液中常温下反应2-3h，超滤Mcutoff＝100kDa，即得改性生物酶；其中，丙炔醇溶液与生物酶的磷酸缓冲溶液体积比1:35-40，磷酸盐缓冲溶液PB1由磷酸氢钠溶液和NaCl溶液混合而成，其中，NaCl和磷酸氢钠的摩尔比为1:1.5，磷酸盐缓冲溶液的PH＝7.2，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5；
改性聚合物的具体合成过程为：将步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3溶于DMF中得到含有-NH2的聚合物的DMF溶液，将NaN3溶于H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的聚合物的DMF溶液中，再加入2MHCl，在40℃-60℃下搅拌反应10-12h；反应结束后减压浓缩除去DMF至之前体积的30％-35％，离心除去生成的白色固体，再浓缩至之前体积的35％-40％，离心得到透明清液并沉淀至二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到含有叠氮基的阳离子聚合物，其中，含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3、DMF的体积比为：1-5:1-3:12，NaN3和H2O的体积比1-2:5，叠氮钠水溶液和含有-NH2的聚合物的DMF溶液的体积比3-5:10，含有-NH2的聚合物的DMF溶液和叠氮钠溶液的总体积与2MHCl的体积比为：500-600:1。
步骤3反应过程中叠氮基团和炔基比例为1:1。
本发明所采用的第三种技术方案为：
一种接枝阳离子聚合物的生物酶的固定方法是，基材表面的固定方法为：将置于离心管中的清洁的载体表面用MOPS缓冲液润湿，然后用吸管去掉MOPS缓冲液，将加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液加入离心管中，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲液洗涤盖玻片，加入MOPS缓冲液使玻璃盖玻片完全浸没，冷藏保存，即完成接枝聚合物的生物酶的固定。
基材内部的生物酶固定方法为：玻璃管经乙醇超声清洗干燥，用MOPS缓冲溶液润湿其内表面，填充加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲溶液冲洗玻璃管，再填充MOPS缓冲溶液，玻璃管两端连接橡胶管并用皮筋封口，保存于冰箱中。
本发明的有益效果是：本发明通过叠氮基与炔基的点击化学反应，连接生物酶和聚合物；同时载体上的功能基团(羟基等阴离子基团)通过对聚合物(氨基等阳离子基团)的物理吸附亲和作用，能够显著促进酶的物理吸附；并且聚合物上环氧基团、氨基与基材表面的功能基团进行化学交联，促进了酶在载体上化学键合；此外本发明选择的单体，合成聚合物后含环氧基团，与生物酶蛋白质大分子链上的多种基团(氨基、巯基、酚羟基等)均很容易发生反应，使酶的固定更加稳定，本发明一种接枝阳离子聚合物的生物酶的固定方法反应过程温和简单，容易操作。
附图说明
图1是本发明实施1制备的接枝阳离子聚合物的生物酶在常规表面固定HRP酶活性测量图；
图2是本发明实施1制备的接枝阳离子聚合物的生物酶在玻璃管内固定HRP酶活性测量图；
图3是本发明实施1制备的接枝阳离子聚合物的生物酶稳定性测量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种接枝阳离子聚合物的生物酶，通过叠氮基团与炔基的点击化学反应连接生物酶和聚合物，其中，阳离子聚合物表面具有易与载体进行化学共价交联和物理吸附的官能团。
本发明一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，聚合物的合成
称取二苯醚、引发剂、单体和五甲基二乙基三胺PMDETA并混合后，依次通过冷冻、抽真空、解冻、充填氩气的方法进行除氧，然后转移至装有CuCl和磁子的可封口容器中混合均匀，将容器置于30-50℃油浴中搅拌反应1-3h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开容器封口，加入二氯甲烷稀释，然后将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤中性氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物；
将胺类改性剂溶于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到胺类改性剂溶液；
将聚合物溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF，得到聚合物溶液；
聚合物溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中，滴加完并经过反应完毕后，混合液经过透析，分子截留量3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物；
其中，引发剂为溴代异丁酸单甲醚乙酯MEG-Br，单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA与丙烯酰胺AM、甲基丙烯酸MA、丙烯酸AA、甲基丙烯酸丁酯TA、甲基丙烯酸羟乙酯HEMA中的一种或几种混合物；
胺类改性剂为乙二胺EDA，二乙烯三胺DETA，三乙烯四胺TETA或聚醚酰亚胺PEI400中的任意一种；
胺类改性剂溶液中无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10：1-5，得到的胺类改性剂溶液的摩尔浓度为1mmol/1.2-1.5ml；
聚合物溶液中聚合物与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1-5：15；
含有-NH2的阳离子聚合物中胺类改性剂与聚合物的摩尔比为5-7:10；
步骤2，改性生物酶和改性阳离子聚合物的合成
改性生物酶为：采用丙炔醇修饰生物酶，得到含有丙炔基的生物酶；
步骤2中改性生物酶的具体合成过程为：将生物酶溶解于磷酸缓冲溶液中，将丙炔醇溶液缓慢滴入到生物酶的磷酸缓冲溶液中常温下反应2-3h，超滤Mcutoff＝100kDa，即得改性生物酶；其中，丙炔醇溶液与生物酶的磷酸缓冲溶液体积比1:35-40，磷酸盐缓冲溶液PB1由磷酸氢钠溶液和NaCl溶液混合而成，其中，NaCl和磷酸氢钠的摩尔比为1:1.5，磷酸盐缓冲溶液的PH＝7.2，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5；
改性阳离子聚合物为：采用叠氮钠与步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物反应，得到含有叠氮基的阳离子聚合物；
改性聚合物的具体合成过程为：将步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3溶于DMF中得到含有-NH2的聚合物的DMF溶液，将NaN3溶于H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的聚合物的DMF溶液中，再加入2MHCl，在40℃-60℃下搅拌反应10-12h；反应结束后减压浓缩除去DMF至之前体积的30％-35％，离心除去生成的白色固体，再浓缩至之前体积的35％-40％，离心得到透明清液并沉淀至二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到含有叠氮基的阳离子聚合物，其中，含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3、DMF的体积比为：1-5:1-3:12，NaN3和H2O的体积比1-2:5，叠氮钠水溶液和含有-NH2的聚合物的DMF溶液的体积比3-5:10，含有-NH2的聚合物的DMF溶液和叠氮钠溶液的总体积与2MHCl的体积比为：500-600:1。
步骤3，接枝阳离子聚合物生物酶的合成
将步骤2含有丙炔基的生物酶与含有叠氮基的阳离子聚合物反应，即得到接枝阳离子聚合物的生物酶，其中，叠氮基团和炔基比例为1:1。
本发明一种接枝阳离子聚合物的生物酶的固定方法，基材表面的固定方法为：将置于离心管中的清洁的载体表面用MOPS缓冲液润湿，然后用吸管去掉MOPS缓冲液，将加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液加入离心管中，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲液洗涤盖玻片，加入MOPS缓冲液使玻璃盖玻片完全浸没，冷藏保存，即完成接枝聚合物的生物酶的固定。
基材内部的生物酶固定方法为：玻璃管经乙醇超声清洗干燥，用MOPS缓冲溶液润湿其内表面，填充加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲溶液冲洗玻璃管，再填充MOPS缓冲溶液，玻璃管两端连接橡胶管并用皮筋封口，保存于冰箱中。
实施例1
一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
在50mL的圆底烧瓶中加入CuCl(15.7mg，0.158mmol)和磁子，另用一个50mL的圆底烧瓶装入18mL二苯醚、引发剂MEG-Br(35.6mg，0.158mmol)、GMA(18.0g，126.4mmol)和PMDETA(27.5mg，0.158mmol)，依次通过冷冻-抽真空-解冻-充填氩气，反复三次进行除氧，然后将其全部转移到装有CuCl的瓶中，混匀后将其于30℃油浴中搅拌反应2h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开瓶塞，加入60mL二氯甲烷稀释，将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤中性氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物PGMA。
将12.0g胺类改性剂聚醚酰亚胺PEI400溶于25ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF(无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10:1)，得到胺类改性剂溶液，将聚合物PGMA溶于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中(聚合物PGMA与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为5：15)，得到聚合物PGMA溶液，聚合物PGMA溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中反应，得到混合液，60℃反应10h结束后，混合液经过透析，其中分子截留量为3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物PGMA-NH2；
从82.3μM HRP(206nmol，1eq)原液中量取2.5mL溶解于磷酸缓冲溶液(PB1，0.2MNaCl，PH＝7.2)，与72μL 20mM的丙炔醇溶液混合，室温反应3h后经多次超滤得到丙炔基修饰的HRP，HRP为辣根过氧化物酶，即就是改性生物酶。
将聚合好的PGMA-NH2(1.0g，7.03mmol)、AlCl3(18.8mg，0.14mmol)溶于120mLDMF中，得到含有-NH2的聚合物的DMF溶液，将NaN3(2.28g，35mmol)溶于5.5mL H2O中，得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的聚合物的DMF溶液中，再加入0.2mL 2M HCl，在50℃下搅拌反应12h，反应结束后减压浓缩除去大部分DMF至40mL左右，离心除去生成的白色固体，再浓缩至15mL左右，离心得到透明清液并沉淀至300mL二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到P(GMA-N3)。
从MesB1(0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7)的缓冲溶液中量取250μL经炔基修饰的HRP与36μL的PGMA-N3采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物。
表面酶活性测量：
解吸附的生物酶活性测定：用吸管吸出离心管中的缓冲液(该离心管中有吸附生物酶接枝聚合物玻璃盖玻片)，加入到比色皿中，加入底物ABTS/H2O2，以15s的间隔记录该测定混合物的UV/vis光谱2min，制备每个样品并测量三次，通过测量所得数据经线性回归后除以时间得到产物ABTS-产生的初始速率。
吸附生物酶的活性测定：去掉离心管中的缓冲液，加入底物ABTS/H2O2与缓冲液，每分钟轻轻倒置离心管，15min后，从反应管中取出底物溶液，用UV/vis光谱记录产物对ABTS-的吸光度，用缓冲液洗涤离心管，并在4℃直至进一步使用。如图1所示，在常规表面固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.9左右浮动。
玻璃管内酶活性测量：催化底物以一定速度流动，流过吸附生物酶的玻璃微管两端连接橡胶管，底物ABTS/H2O2附生物酶接枝聚合物的玻璃微管被催化反应，反应的产物ABTS-在比色皿中经实时UV/vis光谱得以记录。如图2所示，在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.9左右浮动。
生物酶接枝聚合物在吸附材料上的活性稳定性研究：将负载有生物酶接枝聚合物的吸附材料储存不同的时间，采用与生物酶活性测定相同的方法来，研究其生物活性随储存时间的稳定性。如图3所示，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达1.0。
实施例2
一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
在50mL的圆底烧瓶中加入CuCl(15.7mg，0.158mmol)和磁子，另用一个50mL的圆底烧瓶装入18mL二苯醚、引发剂MEG-Br(35.6mg，0.158mmol)、GMA(18.0g，126.4mmol)和PMDETA(27.5mg，0.158mmol)，通过“冷冻-抽真空-解冻-充填氩气”的方法(反复三次)进行除氧，然后将其全部转移到装有CuCl的瓶中，混匀后将其于30℃油浴中搅拌反应2h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开瓶塞，加入60mL二氯甲烷稀释，将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物PGMA。
将2.3g胺类改性剂乙二胺EDA溶于25ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF(无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10:5)，得到胺类改性剂溶液，将PGMA溶于5ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中(PGMA与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1：15)，得到聚合物PGMA溶液，聚合物PGMA溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中反应，得到混合液，60℃反应10h结束后，混合液经过透析，其中分子截留量为3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物。
从82.3μM HRP(206nmol，1eq)原液中量取2.5mL溶解于磷酸缓冲溶液(PB1，0.2MNaCl，PH＝7.2)，与72μL 20mM的丙炔醇溶液混合，室温反应3h后经多次超滤得到炔基修饰的HRP。
将聚合好的含有-NH2的阳离子聚合物(1.0g，7.03mmol)、AlCl3(18.8mg，0.14mmol)溶于120mLDMF中，含有-NH2的聚合物的DMF溶液，NaN3(2.28g，35mmol)溶于5.5mL H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的聚合物的DMF溶液中，再加入0.2mL 2M HCl，在50℃下搅拌反应12h，反应结束后减压浓缩除去大部分DMF至40mL左右，离心除去生成的白色固体，再浓缩至15mL左右，离心得到透明清液并沉淀至300mL二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到PGMA-N3。
从MesB1(0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7)的缓冲溶液中量取250μL经炔基修饰的HRP与36μL的PGMA-N3采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物。
其中反应过程中叠氮基团和炔基比例为1:1。
使用该投料比制备的生物酶接枝聚合物酶催化底物，如图1所示，在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.4左右浮动。如图2所示，在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.8左右浮动。如图3所示，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.95。
实施例3
一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
在50mL的圆底烧瓶中加入CuCl(15.7mg，0.158mmol)和磁子。另用一个50mL的圆底烧瓶装入18mL二苯醚、引发剂MEG-Br(35.6mg，0.158mmol)、GMA(18.0g，126.4mmol)和PMDETA(27.5mg，0.158mmol)，通过“冷冻-抽真空-解冻-充填氩气”的方法(反复三次)进行除氧，然后将其全部转移到装有CuCl的瓶中，混匀后将其于30℃油浴中搅拌反应2h。反应结束后，液氮冷冻，立即打开瓶塞，加入60mL二氯甲烷稀释，将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤柱子两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物PGMA。
将3.0951g胺类改性剂二乙烯三胺DETA溶于25ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF，得到胺类改性剂溶液，将PGMA溶于5ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，并滴加至胺类改性剂溶液中反应，得到混合液，60℃反应10h结束后，混合液经过透析，其中分子截留量为3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物。
从82.3μM HRP(206nmol，1eq)原液中量取2.5mL溶解于磷酸缓冲溶液(PB1，0.2MNaCl，PH＝7.2)，与72μL 20mM的丙炔醇溶液混合，室温反应3h后经多次超滤得到炔基修饰的HRP。
将聚合好的含有-NH2的阳离子聚合物(1.0g，7.03mmol)、AlCl3(18.8mg，0.14mmol)溶于120mLDMF中得到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液，将NaN3(2.28g，35mmol)溶于5.5mL H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液中，再加入0.2mL 2M HCl，在50℃下搅拌反应12h。反应结束后减压浓缩除去大部分DMF至40mL左右，离心除去生成的白色固体，再浓缩至15mL左右，离心得到透明清液并沉淀至300mL二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到PGMA-N3。
从MesB1(0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7)的缓冲溶液中量取250μL经炔基修饰的HRP与36μL的PGMA-N3采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物。
使用该投料比制备的生物酶接枝聚合物酶催化底物，如图1所示，在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.3左右浮动。如图2所示，在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.7左右浮动。如图3所示，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.95。
实施例4
参照实施例1，CuCl、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、五甲基二乙基三胺(PMDETA)、引发剂溴代异丁酸单甲醚乙酯(MEG-Br)的摩尔比不变，得到PGMA；其余条件不变，此时胺类改性剂为三乙烯四胺TETA，将4.3869g的TETA溶于25ml的无水DMF，PGMA溶于5mL无水DMF，将聚合物溶液缓慢滴加入DETA溶液中，滴加完毕后，混合液60℃反应10h，反应完毕后，混合液经透析三天，除去未反应的DETA和溶剂，得到含有-NH2的阳离子聚合物。
使用该投料比制备的生物酶接枝聚合物酶催化底物，在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.2左右浮动。在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.6左右浮动。该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.95。
实施例5
在50mL的圆底烧瓶中加入CuCl(15.7mg，0.158mmol)和磁子，另用一个50mL的圆底烧瓶装入18mL二苯醚、引发剂MEG-Br(35.6mg，0.158mmol)、GMA(18.0g，126.4mmol)、丙烯酰胺AM(24.3g，341.3mmol)和PMDETA(27.5mg，0.158mmol)，通过“冷冻-抽真空-解冻-充填氩气”的方法(反复三次)进行除氧，然后将其全部转移到装有CuCl的瓶中，混匀后将其于30℃油浴中搅拌反应2h。反应结束后，液氮冷冻，立即打开瓶塞，加入60mL二氯甲烷稀释，将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤柱子两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物P(GMA-AM)。
将2.3g胺类改性剂乙二胺EDA溶于25ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF(无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10:5)，得到胺类改性剂溶液，将P(GMA-AM)溶于5ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中(PGMA与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1：15)，得到聚合物溶液，将聚合物溶液滴加至胺类改性剂溶液中反应，得到混合液，60℃反应10h结束后，混合液经过透析，其中分子截留量为3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物。
从82.3μM HRP(206nmol，1eq)原液中量取2.5mL溶解于磷酸缓冲溶液(PB1，0.2MNaCl，PH＝7.2)，与72μL 20mM的丙炔醇溶液混合，室温反应3h后经多次超滤得到炔基修饰的HRP。
将聚合好的含有-NH2的阳离子聚合物(1.0g，7.03mmol)、AlCl3(18.8mg，0.14mmol)溶于120mLDMF中得到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液，NaN3(2.28g，35mmol)溶于5.5mLH2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液中，再加入0.2mL 2M HCl，在50℃下搅拌反应12h，反应结束后减压浓缩除去大部分DMF至40mL左右，离心除去生成的白色固体，再浓缩至15mL左右，离心得到透明清液并沉淀至300mL二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到P(GMA-AM)-N3。
从MesB1(0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7)的缓冲溶液中量取250μL经炔基修饰的HRP与36μL的P(GMA-AM)-N3采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物。
其中反应过程中叠氮基团和炔基比例为1:1。
使用该投料比制备的生物酶接枝聚合物酶催化底物，如图1所示，在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.35左右浮动。如图2所示，在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.75左右浮动。如图3所示，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.8。
实施例6
一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，包括以下步骤：
在50mL的圆底烧瓶中加入CuCl(15.7mg，0.158mmol)和磁子。另用一个50mL的圆底烧瓶装入18mL二苯醚、引发剂MEG-Br(35.6mg，0.158mmol)、GMA(18.0g，126.4mmol)、丙烯酸AA(24.6g，341.3mmol)和PMDETA(27.5mg，0.158mmol)，通过“冷冻-抽真空-解冻-充填氩气”的方法(反复三次)进行除氧，然后将其全部转移到装有CuCl的瓶中，混匀后将其于30℃油浴中搅拌反应2h。反应结束后，液氮冷冻，立即打开瓶塞，加入60mL二氯甲烷稀释，将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤柱子两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物P(GMA-AA)。
将3.0951g胺类改性剂二乙烯三胺DETA溶于25ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF，得到胺类改性剂溶液，将P(GMA-AA)溶于5ml的无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到聚合物溶液，将聚合物溶液滴加至胺类改性剂溶液中反应，得到混合液，60℃反应10h结束后，混合液经过透析，其中分子截留量为3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物。
从82.3μM HRP(206nmol，1eq)原液中量取2.5mL溶解于磷酸缓冲溶液(PB1，0.2MNaCl，PH＝7.2)，与72μL 20mM的丙炔醇溶液混合，室温反应3h后经多次超滤得到炔基修饰的HRP。
将聚合好的含有-NH2的阳离子聚合物(1.0g，7.03mmol)、AlCl3(18.8mg，0.14mmol)溶于120mLDMF中，得到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液，将NaN3(2.28g，35mmol)溶于5.5mL H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的阳离子聚合物的DMF溶液中，再加入0.2mL 2M HCl，在50℃下搅拌反应12h。反应结束后减压浓缩除去大部分DMF至40mL左右，离心除去生成的白色固体，再浓缩至15mL左右，离心得到透明清液并沉淀至300mL二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到P(GMA-AA)-N3。
从MesB1(0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7)的缓冲溶液中量取250μL经炔基修饰的HRP与36μL的P(GMA-N3)采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物。
使用该投料比制备的生物酶接枝聚合物酶催化底物，如图1所示，在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.2左右浮动。如图2所示，在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.65左右浮动。如图3所示，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.75。
实施例7
参照实施例1，改变辣根过氧化物酶为蛋白酶，其余条件不变，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.95。在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.4左右浮动。在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在0.8左右浮动。
实施例8
参照实施例1，改变辣根过氧化物酶超氧化物歧化酶，其余条件不变，该生物酶接枝聚合物溶液在4℃下储存30天后，该酶仍能保持其活性，相对活性可达0.95。在常规表面上固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.3左右浮动。在玻璃管内固定的酶，其ABTS-在414nm处的吸光度在1.1左右浮动。
Claims (5)
1.一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，聚合物的合成
称取二苯醚、引发剂、单体和五甲基二乙基三胺PMDETA并混合后，依次通过冷冻、抽真空、解冻、充填氩气的方法进行除氧，然后转移至装有CuCl和磁子的可封口容器中混合均匀，将容器置于30-50℃油浴中搅拌反应1-3h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开容器封口，加入二氯甲烷稀释，然后将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤中性氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物；
将胺类改性剂溶于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到胺类改性剂溶液；
将聚合物PGMA溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF，得到聚合物溶液；
聚合物溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中，滴加完并经过反应完毕后，混合液经过透析，分子截留量3500，得到含有-NH2的阳离子聚合物；
步骤1中所述的引发剂为溴代异丁酸单甲醚乙酯MEG-Br，单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA；
步骤1中所述的胺类改性剂为乙二胺EDA，二乙烯三胺DETA，三乙烯四胺TETA或聚醚酰亚胺PEI400中的任意一种；
步骤1中所述胺类改性剂溶液中无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10：1-5，得到的胺类改性剂溶液的摩尔浓度为1mmol/1.2-1.5ml；
聚合物溶液中聚合物与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1-5：15；
含有-NH2的阳离子聚合物中胺类改性剂与聚合物的摩尔比为5-7:10；
步骤2，改性生物酶和改性阳离子聚合物的合成
改性生物酶为：采用丙炔醇修饰生物酶，得到含有丙炔基的生物酶；丙炔基的生物酶为HRP；
改性阳离子聚合物为：采用叠氮钠与步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物反应，得到含有叠氮基的阳离子聚合物；含有-NH2的阳离子聚合物为PGMA-NH2；
所述步骤2中改性生物酶的具体合成过程为：将生物酶溶解于磷酸缓冲溶液中，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5，将丙炔醇溶液缓慢滴入到生物酶的磷酸缓冲溶液中常温下反应2-3h，超滤Mcutoff＝100kDa，即得改性生物酶；其中，丙炔醇溶液与生物酶的磷酸缓冲溶液体积比1:35-40，磷酸盐缓冲溶液PB1由磷酸氢钠溶液和NaCl溶液混合而成，其中，NaCl和磷酸氢钠的摩尔比为1:1.5，磷酸盐缓冲溶液的PH＝7.2，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5；
改性聚合物的具体合成过程为：将步骤1得到的含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3溶于DMF中得到含有-NH2的聚合物的DMF溶液，将NaN3溶于H2O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH2的聚合物的DMF溶液中，再加入2M HCl，在40℃-60℃下搅拌反应10-12h；反应结束后减压浓缩除去DMF至之前体积的30-35％，离心除去生成的白色固体，再浓缩至之前体积的35-40％左右，离心得到透明清液并沉淀至二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到含有叠氮基的阳离子聚合物，其中，含有-NH2的阳离子聚合物、氯化铝AlCl3、DMF的体积比为：1-5:1-3:12，NaN3和H2O的体积比1-2:5，叠氮钠水溶液和含有-NH2的聚合物的DMF溶液的体积比3-5:10，含有-NH2的聚合物的DMF溶液和叠氮钠溶液的总体积与2MHCl的体积比为：500-600:1；
步骤3，接枝阳离子聚合物生物酶的合成；
将步骤2含有丙炔基的生物酶与含有叠氮基的阳离子聚合物反应，即得到接枝阳离子聚合物的生物酶；
步骤3反应过程中叠氮基团和炔基比例为1:1；
步骤3的具体过程为：
量取经炔基修饰的HRP与PGMA-N3加入MesB1缓冲溶液中，采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物，MesB1缓冲溶液为：0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7。
2.根据权利要求1所述的一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法制备的生物酶，其特征在于，通过叠氮基团与炔基的点击化学反应连接生物酶和聚合物。
3.根据权利要求2所述的一种接枝阳离子聚合物的生物酶，其特征在于，所述阳离子聚合物表面具有易与载体进行化学共价交联和物理吸附的官能团。
4.根据权利要求2或3所述的一种接枝阳离子聚合物的生物酶的固定方法，其特征在于，基材表面的固定方法为：将置于离心管中的清洁的载体表面用MOPS缓冲液润湿，然后用吸管去掉MOPS缓冲液，将加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液加入离心管中，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲液洗涤盖玻片，加入MOPS缓冲液使玻璃盖玻片完全浸没，冷藏保存，即完成接枝聚合物的生物酶的固定。
5.根据权利要求2或3所述的一种接枝阳离子聚合物的生物酶的固定方法，其特征在于，基材内部的生物酶固定方法为：玻璃管经乙醇超声清洗干燥，用MOPS缓冲溶液润湿其内表面，填充加入接枝阳离子聚合物的生物酶的磷酸缓冲液，静置1-2h后，除去枝阳离子聚合物的生物酶溶液，并用MOPS缓冲溶液冲洗玻璃管，再填充MOPS缓冲溶液，玻璃管两端连接橡胶管并用皮筋封口，保存于冰箱中。
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