WO2004070046A1

WO2004070046A1 - 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法

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Publication number: WO2004070046A1
Application number: PCT/JP2004/001048
Authority: WO
Inventors: Kazuhiro Fukae
Original assignee: Otsuka Chemical Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2004-08-19
Also published as: PT1591532T; TR201820053T4; TWI344819B; CN1777679A; EP1591532B1; JPWO2004070046A1; EP2626429A1; WO2004070046A8; EP1591532A1; ES2701175T3; CN100378225C; US7955819B2; US20060205039A1; DK1591532T3; KR20050095609A; CA2514337A1; EP1591532A4; TW200420231A; JP4237752B2; AU2004209371A1

Abstract

脱脂卵黄から糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法であって、(a)脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、(b)糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、(c)糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖類アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、(d)糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。

Description

明細書糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法技術分野

本発明は糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法に関する。背景技術

近年、核酸（D NA)、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約 6 0兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、 A B O式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。

糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。

例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌ゃインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。

糖鎖は単糖の配列、結合様式 ·部位、鎖の長さ ·分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸や夕ンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。

一方、脱脂卵黄より糖鎖ァスパラギンが得られることは知られている（例えば特許文献 1参照)。特許文献 1によると、脱脂卵黄にアーモンドまたは杏種子を添加することにより従来よりも大量に糖鎖ァスパラギンを得ている。しかし、この方法で得られる糖鎖ァスパラギンは純度が 95%や 92%であり、純粋な糖鎖ァスパラギンを単離しているとはいえない。また、収量も脱脂卵黄 100 k gからダイシァリルオリゴ糖（1 1糖ジシァリルオリゴ糖）を 29. 5 gあるいは 2 7. 2 gとなっている。

また、鶏卵の可溶画分より抽出される糖ペプチド（SGP ：シァリルグリコべプチド）より糖鎖ァスパラギンが得られることも知られている。この SGPは、 1 1個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端に、アミノ酸 6残基からなるぺプチド鎖のァスパラギン残基が結合した化合物である。しかし、 SGPは、たとえば、瀬古ら〔ビオケミカビオフイジ力ァクタ（B i o c h em. B i o ph y s . Ac t a) 第 1335巻、第 23頁（1997)〕の方法によれば、鶏卵黄 1個から約 8 mgしか得られないことが示されている。

〔特許文献 1〕国際公開 W096/02255号公報（請求項 8及び請求項 1 0)

本発明の目的は、医薬品開発等の分野において有用な種々の単離された糖鎖ァスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法を提供することにある。 ' 発明の開示

本発明は、以下の発明に係る。

1. 脱脂卵黄から糖鎖ァスパラギン誘導体を製造する方法であって、（a) 脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖べプチド混合物を製造する工程、 (b) 糖鎖べプチド混合物をべプチド分解酵素により糖鎖ァスパラギン混合物を製造する工程、（c) 糖鎖ァスパラギン混合物中の糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖ァスパラギン誘導体混合物を製造する工程、（d) 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。 2. 脱脂卵黄が鳥類の卵の卵黄を有機溶媒で脱脂処理することにより得られたものである上記の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

3. 糖鎖ァスパラギン誘導体が 1 1〜 5糖鎖ァスパラギン誘導体である上記の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

4. 脂溶性の保護基がカーボネート含有基、ァシル基、ァリル基、 Fmo c基あるいは B o c基である上記の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

5. (b) で得られる糖鎖ァスパラギン混合物に含まれる糖鎖ァスパラギンを予め加水分解して一部糖残基を切断しておく上記の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

6. (c) で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を予め加水分解して一部糖残基を切断しておく上記の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

本発明の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法は、卵黄、たとえば、鳥類卵黄から得られる脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖べプチド混合物を得、次にペプチド分解酵素により糖鎖ァスパラギンの混合物を得、次いでこの混合物に含まれる当該糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖ァスパラギン誘導体に分離することを大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖ァスパラギン」とはァスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「ァスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のァスパラギン（A s n) の酸ァミノ基に、還元末端に存在する N一ァセチルダルコサミンが Nーグリコシド結合した糖鎖群であって、 Ma n (/3 1 -4) G l c Na c ( 1 ~4) G 1 c N a cを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖ァスパラギン誘導体」とはァスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖ァスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「Ac HN」はァセトアミド基を示す。

本発明の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法は、具体的には、 ( a ) 脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、ならびに

( b ) 糖鎖べプチド混合物をぺプチド分解酵素により糖鎖ァスパラギン混合物を製造する工程、ならびに

( c ) 糖鎖ァスパラギン混合物中の糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖ァスパラギン誘導体混合物を製造する工程、ならびに

( d ) 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をクロマ小グラフィ一に供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、

を含むものである。 ·

以下、本発明の脱脂卵黄から糖鎖ァスパラギン誘導体を得る製造方法を具体的に説明する。

本発明に使用される脱脂卵黄とは、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類の卵の卵黄（ニヮトリ、ゥズラ、ァヒル、カモ、ハトなどの卵黄が好ましレ^ 特に卵黄内に含まれる人型糖鎖ァスパラギン、特に人型 2分岐糖鎖ァスパラギンの量からニヮトリがよい。）を有機溶媒で脱脂処理したものがよい。このとき、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジェチルエーテル等が好ましい。

( a ) 工程としては、上記脱脂卵黄をタンパク質分解酵素によりタンパク質を切断し、脱脂卵黄に含まれる糖鎖ペプチド（糖鎖ァスパラギンペプチド）の混合物を得る。このとき、使用するタンパク質分解酵素としては、例えば、プロナーゼ (和光純薬社製）、オリエンターゼ（H B I社製）等、一般のものを使用することができる。

また、糖鎖ペプチドの混合物より糖鎖ペプチド以外の成分を公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム'などを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（H P L C) を用いた精製法に従って除去することが好ましい。

( b ) 工程としては、（a ) 工程で得られた糖鎖ペプチドの混合物をペプチド分解酵素によりペプチドを分解し、糖鎖ペプチドに含まれる糖鎖ァスパラギンの混合物を得る。このとき、使用するペプチド分解酵素としては、例えば、ァクチナーゼ等、一般のものを使用することができる。

また、糖鎖ァスパラギンの混合物より糖鎖ァスパラギン以外の成分を公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（H P L C ) を用いた精製法に従って除去することが好ましい。

また、所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖ァスパラギンを加水分解して一部糖残基を予め切断しておくのが好ましい。加水分解する方法としては酸を使用する方法あるいは酵素を使用する方法等がある。

前記酸としては特に限定するものではなく、たとえば、塩酸、硫酸、硝酸、トリフルォロ酢酸などの無機酸および有機酸、陽イオン交換樹脂、不溶性の固体試薬（シリカゲル等）などを使用することができる。また、酵素としては、糖加水分解酵素が好適であり、エンド型、ェキソ型いずれの反応様式の酵素も使用することができる。かかる酵素としては特に限定されるものではなく、当該活性を有するものであれば、市販の酵素、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。

酵素反応は公知の条件に従えば良く、その際、反応の進行を薄層クロマトダラフィ一で追跡し、化合物がもっとも多く得られるところで反応を適宜停止させればよい。

( c ) 工程としては、 ( b ) 工程で得られた糖鎖ァスパラギンを含む混合物を用い、それに含まれる糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基の導入を行う。当該保護基としては特に限定されるものではなく、たとえば、 9一フルォレニルメトキシカルボニル（F m o c ) 基や t—プチルォキシカルポニル（B o c ) 基、ァリルォキシカーボネート（A l 1 o c ) 基等のカーボネート含有基、ァセチル（A c ) 基等のァシル基、 ,ァリル基、ベンジル基等の保護基を使用することができる。合成の効率および次工程の分離精製の効率を考慮すると、好ましくは、 9一フルォレニルメトキシカルポニル（Fm o c ) 基や t —ブチルォキシカルポニル（B o c ) 基、ァリルォキシカーボネート基等のカーボネート含有基、ァセチル基等のァシル基がよい。また、得られた糖鎖ァスパラギン誘導体を直ちに所望の糖べプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、ペプチド合成に広く用いられる F m o c基または B o c基が好ましく、なかでも Fm o c基はシアル酸など比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効であることからより好ましい。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、

Protect ing Groups in Organic Chemi s try, John Wi l ey & Sons INC. , New York 1991, ISBN 0— 471— 62301— 6を参照）に従って行えばよい。

たとえば、 F m o c基を用いる場合、糖鎖ァスパラギンを含む混合物に対しァセトン或いは D M Fを適量加えた後、さらに 9 _フルォレニルメチル一N—スクシニミデルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、 2 5 にてァスパラギン残基への F m o c基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖ァスパラギンのァスパラギン残基に F m o c基を導入することができる。

以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物が得られる。

( d ) 工程としては、（c ) 工程で得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物を公知のクロマトグラフィー、特に分取型のクロマトグラフィーに供して各糖鎖ァスパラギン誘導体に分離する。なお、かかる工程においては、得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物を直接使用することができるが、所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解に供し、一部糖残基を予め切断して得られる糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物を使用してもよい。なお、糖残基の切断の程度は前記同様である。また、加水分解は前記と同様にして行うことができる。各糖鎖ァスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のク口マトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。

たとえば、得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をゲル濾過力ラムクロマトグラフィ一で精製後、 H P L Cを用いて精製する。 H P L Cにおいて用い得る力ラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、 O D S、 P h e n y l系、二トリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、フアルマシア社製モノ Qカラム、ィャトロン社製ィアト口ビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖ァスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ることができる。

上記で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体としては、例えば 1 1〜 5糖鎖ァスパラギン誘導体、好ましくは 1 1〜7糖鎖ァスパラギン誘導体、更に好ましくは 1 1〜 9糖鎖ァスパラギン誘導体、特に好ましくは下記式で示される 1 1糖鎖ァスパラギン誘導体を挙げることができる。なお、式中の P r o tは保護基を示す。

さらに、分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖ァスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。

このように、各糖鎖ァスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖ァスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖ァスパラギン誘導体を製造することができる。

また本発明は、種々の単離された糖鎖ァスパラギンを大量に得ることができる糖鎖ァスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法に従う糖鎖ァスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖ァスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。

糖鎖ァスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる (たとえば、 Protect ing Groups in Organic Chemis try, John Wi ley & Sons INC. , New York 1991, ISBN 0— 471— 62301— 6を参照）。たとえば、保護基が F m o c基である場合、 N, N—ジメチルホルムアミド (D M F ) 中、糖鎖ァスパラギン誘導体にモルフオリンを加えて反応を行うことにより F m o c基を除去することができる。また、 B o c基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、 H P L Cによる分離という方法によって精製することにより、糖鎖ァスパラギンを得てもよい。また、保護基がベンジル基である場合、ベンジル基の除去は、公知の方法に従つて行うことが、できる（たとえば、、 Protect ing Groups in Organic Chemis try, John Wi ley & Sons INC. , New York 1991, ISBN. 0—471— 62301— 6を参照）。

さらに、糖鎖ァスパラギンからのァスパラギン残基の除去は、公知の方法に従つて行うことができる。たとえば、糖鎖ァスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、ァセチル化することによりァスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。また、糖鎖ァスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、ァセチル化することによつてもァスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。ァスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、 'イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、 H P L Cによる分離という方法によって精製してもよい。

このように、本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体、糖鎖ァスパラギンおよび糖鎖（以下、 3つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。

かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なヮクチンの合成を行うことも可能である。

また、たとえば、糖タンパク質であるエリスロポエチン（E P O) が、その赤血球増殖能により貧血の治療薬として使われているが、この E P Oは糖鎖が結合していないと活性がでないことが判明している。このように、タンパク質には糖鎖の結合によって生理活性を発現するものがあるので、たとえば、糖鎖を結合させることができない大腸菌発現系により夕ンパク質のみを大量に調製し、次いで所望の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより生理活性の発現を付与したり、また、任意のタンパク質に種々の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより、新たな生理活性を有する新規な糖夕ンパク質を合成することも可能である。

また天然の糖タンパク質に存在する糖鎖を本発明により製造した糖鎖と置換することにより新たな生理活性を付与することも可能である。糖夕ンパク質が有する糖鎖を本発明により得られた糖鎖と置換する技術としては、たとえば、 P. Sears and C. H. Wong, Sc ience, 2001, vol 291, p2344 〜2350に記載の方法をあげることができる。すなわち、糖タンパク質を iS—N—ァセチルダルコサミニダーゼ（E n d o—Η) で処理してタンパク質表面のァスパラギン残基には N—ァセチルダルコサミン残基が 1つだけ結合した状態にする。次いで、本発明により得られた糖鎖ァスパラギン中の所望の糖鎖を iS —N—ァセチルダルコサミニダ一ゼ（E n d o— M) を用いて、前記 N—ァセチルダルコサミン残基に結合させるという方法があげられる。また、 t R NAに N—ァセチルダルコサミンを結合させておいて、大腸菌などの発現系を利用して N—ァセチルダルコサミン残基を有する糖タンパク質を合成後、本発明により得られた糖鎖ァスパラギン中の所望の糖鎖を E n d o— Mを用いて導入することも可能である。

また、現在、糖タンパク質を治療薬として利用する際の問題として、投与された糖夕ンパク質の代謝速度が速いことがあげられる。これは、糖タンパク質の糖鎖末端に存在するシアル酸が生体内で除去されると直ちに当該糖タンパク質が肝臓により代謝されることによる。そのため、ある程度の量の糖タンパク質を投与する必要がある。そこで、本発明により糖鎖の末端に除去されにくいシアル酸を新たに組み込んだ糖鎖を製造し、対象タンパク質に当該糖鎖を E n d o— Mを利用して導入すれば、生体内での糖夕ンパク質の代謝速度を制御することが可能となり、投与する糖タンパク質の量を低くすることも可能である。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1

エタノール（E t〇H) 67m 1を撹拌しているところに、卵黄 1個を割り入れた。約 5時間撹拌した後ろ過を行い、さらに E t OH 30m lで洗浄を行つた。得られた結晶に、再度 E t OH 83mlを加え 1晚撹拌を行った後ろ過を行い E t OH 30mlで洗浄後、結晶を乾燥させると脱脂卵黄（De l i p i d a t e d Egg Y o 1 k) が約 3 g得られた。

(a) このものを、りん酸緩衝液（pH== 7· 0, 30m l) に溶解させた後、 NaN₃ (1 Omg) を加えた。さらに、オリエンターゼ ONS (HB I社製、 1. 0 g) を加え 50°Cで約 24時間静置させた。反応の終了を TL Cにて確認した後、反応液をセライトにて濾過した。濾液を濃縮により減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（S e ph ad e x G- 25 , 2. 5X 100 cm, H ₂0) で精製した。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行った。

(b) 得られた残留物 (約 43 Omg) に、卜リスー塩酸 ·塩化カルシウム緩衝溶液（pH=7. 5, 43m l), NaN₃ (2 lmg) を加え、溶解させた。このものに、ァクチナーゼ E (43mg) を加え 12時間おきに pHをチェックしながら 24時間静置させた。 24時間後、反応液に再度ァクチナーゼ E 21. 5mgを加え、再び pHをチェックしながら約 48時間反応させた。反応の終了を TLCで確認した後、セライトろ過を行い、濾液を濃縮で減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（S e ph ad e x G- 25, 2. 5X 100 cm, H ₂0) で精製した。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行った。

(c) 得られた残留物（約 120mg) を、水 1. 5m lに溶かし、重炭酸ナトリウム 26 mgを加えた。ここに、 Fmo c— Os u 〔N_ (9_

Fluorenylmethyloxycarbonyl) oxysuccinimide] 68 mgを溶力、したジメチ Jレホルムアミド 2. 5m lを加え、室温で 2時間反応させた。原料消失を TLC (ィソプロパノール： 1M酢酸アンモニゥム水溶液 =3 ： 2) で確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣に、水 15mしジェチルエーテル 25m lを加えて 10分間撹拌した後、分液操作を行った。さらに水層を、ジェチルエーテル 15mlで洗浄した後、濃縮、凍結乾燥を行った。このものを、 ODSカラム

(ヮコ一ゲル 100 C 18) を用い、グラディエントをかけ精製した。糖鎖が含まれている画分を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。

(d) この残留物を HPLC分取カラムにて精製した（YMC— P a c k R &D ODS, D— ODS— 5— A， 20 X 250 mm, AN/25 mM Ac ONH₄ bu f f e r = 20/80, 7. 5m l /m i n., wave 1 e n g t h ; 274 nm)。約 15分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いで ODSカラムにて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシァ口 F m o c糖鎖誘導体が、約 13. 3 m g得られた。

得られた化合物の ¹ H— NM Rデータは以下のとおりである。

— NMR (400MHz , D₂0， 30°C, HOD = 4. 8 1)

8. 01 (2 H, d, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 80 (2 H, d, J = 7 5Hz， Fmo c), 7. 60 (2 H, d d, 1 = 7. 5 H z , Fmo c ), 7. 5 3 (2 H, d d, J = 7. 5 H z , Fmo c), 5. 23 ( 1 H, s , M a n 4 - H^, 5. 09 (1H， d， J = 9.4Hz , G 1 c NAc 1 -H^, 5. 04 (1 H, s, Ma n 4 ' 一）， 4. 86 (1 H, s, Ma n 3 -Η_χ), 4. 7 0〜4. 66 (m, G 1 c NAc 2 -U₁ G 1 c NAc 5, 5 ' -H^, 4. 5 4 (2H, d, J = 7. 9Hz, G a 1 6, 6 ' 一 H ), 4.44 (1H， d, Fmo c CH), 4. 34 (1 H, b d, M a n 3 -H₂), 4. 29, ( 1 H， b d， Man4， — H₂)， 4. 20 (1 H, b d, Man4— H₂), 2. 77 ( 2 H, d d, Ne uAc 7, 7 ' -H_3eq), 2. 80 ( 1 H, b dd, A s n - /3 CH), 2. 62 (1H， b d d, As n— ]3CH)， 2. 14 ( 1 8 H, s X 6 , -Ac), 1. 80 (2H, d d， Ne uAc 7 , 7 ' — H_3ax) 実施例 2 〔ジシァロ糖鎖一 B o c誘導体（1 1糖)〕

(b) までは、実施例 1と同様に行った。

(c) 得られた残留物（約 12 Omg) を、 0. 1N NaOHa q. lm l に溶解させた。ここに、（B o c) ₂0 (4m 1，東京化成社製）を加え、室温で 2時間反応させた。原料消失を TLC (イソプロパノール： 1M 酢酸アンモニゥム水溶液 =3 ： 2) で確認後、ジクロロメタン 2. 5m lを加えて分液を行つた。水層をさらにジクロロメタン 2. 5m 1で洗浄した後、 40mM HC 1 にて pH=7. 0に調整する。水層を濃縮後、 ODSカラムにて精製を行う（グラジェント H₂〇 1 00% → H₂0/AN= 99/1 → H₂0/AN = 95/ 5 → H₂〇/AN= 90/1 0)。目的のジシァ口糖鎖 B o c誘導体が含まれている画分（HPLCにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行 (d) この残留物を HP L Cにて単離 ·精製を行った。（YMC— P a k OD S -AM, SH- 343 - 5 AM, 2 0 X 2 5 0mm, AN/ 2 5 mM A c ONH₄ b u f f e r = 5/ 9 5, 7. 0m l / i n., wa v e 1 e n g t h ; 2 1 5 nm)。約 1 1分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（S e p h a d e x G- 2 5, H₂0) にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシァ口糖鎖 B o c誘導体が、約 1 0. Omg得られた。

^-NMR (40 OMH z , D₂0, 3 0。C， HOD = 4. 8 1)

5 5. 1 9 (s， 1 H, Ma n 4-Hj), 5. 1 2 (d， 1 H, J = 9. 6, G 1 c NAc 1 - Ι-Ι,), 5. 0 0 (s , 1 H, Ma n 4 ' -H_₁), 4. 6 1 - 4. 7 1 (m, 3 H), 4. 4 9 (d， 2 H, J = 7. 6), 4. 3 0 - 4. 40 (b s , 1 H, A s n - a CH), 4. 3 1 (s， 1 H, Ma n 3 _H— ₂)， 4. 2 5 (b s , 1 H, Ma n 4— H_₂)， 4. 1 7 (b s， 1 H, Ma n 4— H— ₂), 2. 8 4 (d d, 1 H, J a= 1 5. 6, J b = 4. 4, A s n— i3 CH)， 2. 7 2 (d d, 2H, J a= 1 2. 4, J b= 2. 8, N e u A c 7— H_3ex)， 2. 6 0 - 2. 7 5 (m， 1 H, A s n-j3 CH), 2. 1 3, 2. 1 2, 2. 1 1 (e a c h s , 18H， Ac x 6), 1. 77 (dd， 2H, J a= 12.0, J b= 12.4, N e uAc 7 -H_3ax), 1.48 (s, 9H, Bo c). 実施例 3 〔ジシアロー糖鎖 Ac誘導体（1 1糖)〕

(b) までは、実施例 1と同様に行った。

(c) 得られた残留物（約 120mg) を、精製水 lm 1に溶解させた。このものに K₂C〇₃ (72mg) を加え、さらに無水酢酸（99m 1 ) を加え約 2 時間撹拌した。室温で 2時間反応させた後、原料消失を TLC (イソプロパノール： 1M 酢酸アンモニゥム水溶液 = 3 ： 2) で確認後、ジクロロメタン 2. 5 m 1を加えて分液を行った。水層をさらにジクロロメタン 2. 5mlで洗浄した後、 s a t. NaHC0₃a q. にて、 p H= 7. 0に調整した。水層を濃縮後、 ODSカラムにて精製を行った（グラジェント H₂〇 100% → H₂0 /AN= 99/1 → Η₂θΖΑΝ= 95Z5)。目的のジシァ口糖鎖 Ac誘導体が含まれている画分（HP LCにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。

(d) この残留物を HP LCにて単離 ·精製を行った。（YMC— P a c k ODS - AM， SH- 343 - 5 AM, 20 X 250 mm, AN/25 mM A c ONH₄ bu f f e r^l/99, 7.0m l / m i n., wav e 1 e n g t h ; 215 nm)。約 1 1分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（S e p h a d e X G— 25， H₂0) にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシァ口糖鎖 Ac誘導体が、約 8. 5mg得られた。

^XH-NMR (400MHz , D₂0, 30°C, HOD = 4. 81)

δ 5. 19 (s, 1 H, Ma n 4 -H^, 5. 11 (d, 1 H, J = 9. 6, G 1 c NAc 1 -H^, 5. 00 (s, 1 H， Ma n 4 ' — H ）， 4. 66 (b s , 3H), 4. 54-4. 57 (d d, 1 H, J a = 8. 1, J b = 4. 5)， 4. 50 (d， 2 H, J = 7. 8), 4. 31 (s , 1 H, M a n 3 -H_₂), 4. 25 (b s, 1 H, Man4-H_₂), 4. 17 (b s , 1 H, Ma n 4-H_₂), 2. 85 (d d, 1 H, J a= 15. 8, J b = 4. 3, A s n - ;3 CH), 2. 65— 2. 75 (m, 3 H, N e u Ac 7 -H_3ex, A s n- j3 CH), 2. 13, 2. 1 2, 2.08， 2. 06 (e a c h s, 21 H， Ac x 7), 1.77 (d d, 2H, J a= 12. 1 , J b=12. 1, N e u A c 7 -H_3ax). 実施例 4 〔ジシァロ糖鎖一 A 1 1 o c誘導体（11糖)〕

(b) までは、実施例 1と同様に行った。

(c) 得られた残留物（約 12 Omg) を、 0. 1 N N aOH a q. 6m lに溶解させた。ここに、（A l 1 y 1 OCO) ₂0 (573ml , 東京化成社製）を加え、室温で 12時間反応させた。原料消失を TLC (イソプロパノール： 1 M 酢酸アンモニゥム水溶液 =3 ： 2) で確認後、ジクロロメタン 12m 1を加えて分液を行った。水層をさらにジクロロメタン 12m 1で洗浄した後、 40m M HC 1にて pH=7. 0に調整した。水層を濃縮後、 ODSカラムにて精製を行った（グラジェン卜 H₂〇 1 00% → H₂〇/AN=99/1 → H₂0/AN= 95/5)。目的のジシァ口糖鎖 A l l o c誘導体が含まれている画分（HP LCにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。

(d) この残留物を HPLCにて単離 ·精製を行った。（YMC— P a c k ODS— AM, SH- 343 - 5 AM, 20 X 250 mm, AN/25 mM A c O N H 4 b u f f e r = 2/ 98, 7. 5m l /m i n.， wa v e 1 e n g t h ; 2 1 5 nm)。約 1 8分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（S e p h a d e X G- 25, H₂0) にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシァ口糖鎖 A 1 l o c誘導体が、約 8. 7mg得られた。

】H— NMR (400MHz, D₂0, 30。C, HOD = 4. 8 1 )

δ 6. 01 (ddd， 1 H, J a= 1 7. 2, J b= 1 0.4, J c = 5. 2， -CH₂-CH=CH₂), 5. 37 (d， 1 H, J = 1 7. 2, — CH₂— CH = CH₂), 5. 30 (dd, 1 H, J a= 1 0.4, J b= 1. 6, 一 CH₂— CH = CH₂), 5. 1 9 (s， 1H, Ma n 4-H_x), 5. 1 2 (d, 1 H, J = 9. 6， 1 c NAc 1 -H^, 5. 00 (s, 1 H, M a n 4 ' -H__x), 4. 60 -4. 71 (m), 4. 50 (d, 2 H, J = 7. 6), 4. 35— 4.45 (bm, 1 H, As n - aCH), 4. 3 1 (s , 1 H, Man 3~H_₂), 4. 25 (d, 1H， J = 2. 0, Man4— H一 ₂)， 4. 17 (d, 1 H， J = 2.4， Man 4— H一 ₂), 2. 87 (dd, 1 H, J a= 1 5. 6, J b = 4. 0, As n- β CH), 2. 72 (b dd， 2H， J a = 1 2.4, J b = 2.4, Ne uAc 7 - H_3ex)， 2. 64 (dd, 1 H, J a = 1 5. 6 , J b= 10. 0， A s n - j8 C H), 2. 13, 2. 12, 2. 1 1, 2. 08， 2. 05 (e a c h s , 1 8 H， A c x 6), 1. 77 (d d, 2H， J a= 1 2.4, J b= 1 2. 0, N e uA c 7 — H_3ax)， 1. 48 (s , 9H, B o c) . 産業上の利用可能性

本発明によれば、医薬品開発等の分野において有用な種々の単離された糖鎖ァスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 脱脂卵黄から糖鎖ァスパラギン誘導体を製造する方法であって、（a ) 脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、（b ) 糖鎖ぺプチド混合物をべプチド分解酵素により糖鎖ァスパラギン混合物を製造する工程、（c ) 糖鎖ァスパラギン混合物中の糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖ァスパラギン誘導体混合物を製造する工程、（d ) 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

2 . 脱脂卵黄が鳥類の卵の卵黄を有機溶媒で脱脂処理することにより得られたものである請求の範囲第 1項記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

3 . 糖鎖ァスパラギン誘導体が 1 1〜 5糖鎖ァスパラギン誘導体である請求の範囲第 1項記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

4 . 糖鎖ァスパラギン誘導体が 1 1〜 7糖鎖ァスパラギン誘導体である請求の範囲第 3項記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

5 . 糖鎖ァスパラギン誘導体が 1 1〜9糖鎖ァスパラギン誘導体である請求の範囲第 4項記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

6 . 糖鎖ァスパラギン誘導体が 1 1糖鎖ァスパラギン誘導体である請求の範囲第 5項記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法。

7 . 脂溶性の保護基がカーボネート含有基あるいはァシル基である請求の範囲第 1項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

8 . 脂溶性の保護基がカーボネート含有基である請求の範囲第 7項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。 .

9 . 脂溶性の保護基が F m o c基あるいは B o c基である請求の範囲第 1項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

1 0 . 脂溶性の保護基が F m o c基である請求の範囲第 9項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

11. (b) で得られる糖鎖ァスパラギン混合物に含まれる糖鎖ァスパラギンを予め加水分解して一部糖残基を切断しておく請求の範囲第 1項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。

12. (c) で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を予め加水分解して一部糖残基を切断しておく請求の範囲第 1項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。