WO2004070024A1 - チロシルtRNA合成酵素の変異体及びその作製方法 - Google Patents

チロシルtRNA合成酵素の変異体及びその作製方法 Download PDF

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WO2004070024A1
WO2004070024A1 PCT/JP2004/001441 JP2004001441W WO2004070024A1 WO 2004070024 A1 WO2004070024 A1 WO 2004070024A1 JP 2004001441 W JP2004001441 W JP 2004001441W WO 2004070024 A1 WO2004070024 A1 WO 2004070024A1
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WO
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thigh
tyrrs
tyrosine
amino acid
trna
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PCT/JP2004/001441
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Shigeyuki Yokoyama
Kensaku Sakamoto
Osamu Nureki
Takatsugu Kobayashi
Masahiro Takahashi
Original Assignee
Riken
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Definitions

  • the present invention relates to a tyrosyl-tRNA synthetase (hereinafter, referred to as TyrRS) and a Z-tyrosine tRNA (hereinafter, referred to as TyrRS) of Methanococcus jannasi; hereinafter, referred to as M. zo ⁇ ? /? A force 77.
  • TyrRS tyrosyl-tRNA synthetase
  • TyrRS Z-tyrosine tRNA
  • the modified aaRS (aaRS *) must first have the property of covalently binding unnatural amino acids to the modified tRNA (tRNA *).
  • tRNA * must not pair with 61 types of sense codons, but must have the property of pairing with other codons, such as amber codon [Wang et al., Chemical Co. unicat ions, 2002 1-11 (Reference 9)].
  • aaRS * does not amylate other than tRNA * and that tRNA * is not aminoacylated other than aaRS *.
  • a method of introducing pairs of other species into the host system has been adopted. The first attempt was to introduce the phenylalanyl-tRNA synthetase and tRNA Phe pair of budding yeast into Escherichia coli, and to introduce 7 "fluorophenylalanine specifically to ambercodon [Furter, Protein Science Vol. 7, 1998. Pp.
  • the archaebacterium j Fiber aschi i ⁇ ⁇ tRNA Tyi "pair is an Escherichia coli system
  • the E. coli Tyr RS and 3 c / / / 5 / ea 0 thermoph ilus tRNA Tyr are mammalian cell systems. Were used to extend their artificial genetic code [Ref 15 and Wang et al., Lournal of the American Chemical Society, Vol. 122, 2000, p. 50 10-50 11 (Ref. 19)].
  • TyrRS identifies tRNAs by a partial nucleotide sequence called an identity determinant possessed by the corresponding tRNA [Giege et al., Nucleic Acids Research, 26, 1998, p. 5017-5035 (Reference 20) )].
  • Archaeal and eukaryotic tRNAs have characteristic C1: G72 base pairs [Marck et al., RNA, Vol. 8, 2002, p. 1 189-1232 (ref. 21)], anticodons, and A73 identities It has a determinant (Refs.
  • eubacteria have the same anticodon, A73, but the opposite G1: C72 base pair and a characteristic long variable arm (Reference 21) as identity determinants [Himeno et al., Nucleic Acids Research. Vol. 18, 1990, p. 68 15 -68 19 (Reference 22)] (Fig. 1). Reversing the 1:72 base pair of eubacterial and eukaryotic tRNA Tyf to C1: G72 and G1: C72, respectively, reverses species-specific recognition by TyrRS, regardless of the length of the variable arm [ Wakasugi et al., The EMBO Journal Vol. 17, 1998, p. 297-305 (Reference 23)]. Therefore, both the eubacteria type and the bacterium / eukaryote type TyrRS need to recognize 1:72 base pairs of tRNA. It has been suggested that
  • TyrRS from archaebacteria and eukaryotes are similar to each other, but their TyrRS and TyrRS of eubacteria are low in similarity (Fig. 2).
  • Fig. 2 For example, when sequence homology is analyzed using the PSI-BLAST program (ht tp: // www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov / blast /), M.zo3 ?? 59% similarity was found between / and human TyrRS, whereas the e-value was high at 0.22 between M. jannaschii and B. Wear No gender is found.
  • the present invention relates to a crystal of a triple complex of TyrRSZtRNA ⁇ / L-tyrosine of M.a / ?? 7 '/, TyrRS having a tyrosine binding pocket, and 3-aodotyrosine as a substrate rather than aaRS activity using tyrosine as a substrate.
  • the present invention provides the following crystals.
  • the present invention provides a TyrRS having the following tyrosine binding pocket.
  • the present invention provides the following mutant TyrRS and a method for producing the same based on the information on the tyrosine binding pocket structure of (3) above.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a sequence in which one or more amino acid residues of ⁇ Tyr32, His70, Aspi58 '' are replaced with another amino acid residue, or It consists of a sequence in which at least one amino acid residue of “Tyr 32, Aspl 58, Hisl 77” has been replaced with another amino acid residue, and has a 3-terminal activity lower than the aaRS activity using tyrosine as a substrate. Mutant TyrRS characterized by enhanced aaRS activity using eodotyrosine as a substrate.
  • mutant TyrRS of (4) the sequence in which ⁇ Tyr32, His70, Aspl58 '' is replaced with ⁇ Tyr32, Ala70, Thrl58 '', or ⁇ Tyr32
  • a mutant TyrRS comprising a sequence in which “His 70, As pl 58” is replaced with “Thr 32, Thr 70, G lul 58”.
  • (C) A method comprising selecting, from a mutant TyrRS library, one having enhanced aaRS activity using a target tyrosine derivative as a substrate over aaRS activity using tyrosine as a substrate.
  • the amino acid residue selected in the step (A) is a combination of Tyr32, His70, and Asp158, or a combination of Tyr32, Aspl58, and Is177.
  • a method for producing a mutant TyrRS comprising:
  • the present invention provides a TyrRS having the following anticodon G34 binding pocket.
  • the present invention provides the following mutant TyrRS and a method for producing the same based on information obtained from the anticodon G34 binding pocket structure of (11).
  • the present invention provides the following mutant TyrRS and a method for producing the same.
  • the aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate is higher than the aaRS activity using tyrosine as a substrate, and the aminoacylation of amber repressor tRNA is higher than that of TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Mutant TyrRS characterized by increased reaction rate.
  • the amino acid sequence of the mutated TyrRS of (17) comprises one or more amino acids deleted, substituted, or added,
  • the aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate is higher than the aaRS activity using tyrosine as a substrate, and the rate of aminoacylation of ambassador-NA is higher than that of TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides the following kit for producing a polypeptide incorporating a tyrosine derivative and a method for producing a polypeptide.
  • a kit for producing a polypeptide incorporating a tyrosine derivative comprising:
  • a method for producing a polypeptide characterized in that:
  • Figure 1 shows a comparison of the sequences of tRNA Tyr and TyrRS, showing the secondary structure of the tRNA Tyr species.
  • FIG. The M. zoa /? ⁇ / 'And yeast tRNA sequences are shown as transcripts.
  • the letter and the boxed area indicated by the arrow indicate the same identity element for each tRNA T.
  • FIG. 2 shows a sequence alignment of TyrRS.
  • the sequence is jannaschii, Archaeoglobus fulgidus, human, yeast (Itotsuki moon capsule) and zozo stearotlwr hi 1 lus, Thermus thermophi lus ⁇ M. JannascJii itT. Each is shown above and below the alignment.
  • the coil is a "helix” and the arrow is] 3 strands. Letters indicate conserved residues. Alignment was performed with CLUSTALX (Thompson et al., Nucleic Acids Research, Vol. 25, pp. 4876-4882, 1997) and corrected for each other based on the secondary structure of M. jannaschii and T./force //.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of plasmid pMYR-Lac (Am).
  • M J YR 1 DNA fragment containing M. zo a / was / '/ suppressor NA gene.
  • PEYR Fragment containing expression promoter overnight.
  • LacZ (amb) DNA fragment containing a-lac (Am).
  • FIG. 4 shows the tyrosine binding pocket of yavM ⁇ 7 TyrRS. Black represents ⁇ , and diagonal lines represent N.
  • FIG. 5 shows the G34 binding pocket of the tRNA Tyr anticodon of zoa / M / 'TyrRS. Black represents ⁇ , and diagonal lines represent N.
  • FIG. 6 is a lipon model stereogram showing the structure of the ./??7 TyrRS / tRNA Tyr / L-tyrosine complex.
  • Two tyrosine molecules are represented by the CPK model.
  • Residues 203-209 and the 3 'terminal CCA chain of the tRNA T molecule are not shown because they are disordered.
  • FIG. 7 is a stereogram of the molecular structure of one TyrRS subunit. Only C position is shown. Each 20th residue is indicated by a bullet.
  • Figure 8 is a stereo view of the I FO-F c I simulated annealing omit electron density map (3.0 ⁇ ) around the tyrosine binding pocket at 1.95 ⁇ (1.95 ⁇ 1 ( ⁇ 1 ⁇ ) resolution). .
  • Figures 9 ⁇ and 9 9 compare the overall structure of TyrRS ⁇ tRNA.
  • Fig. 9A shows a stereogram in which M. yaw? 'Is superimposed on humans
  • Fig. 9B shows M. jannaschiit. It is a stereo view in which T.//7'/hi 5 is superimposed.
  • FIG. 10 is a diagram showing the] 3-310-iS motif inserted into the C-terminal domain of I.zoa / H? / TyrRS.
  • FIG. 11 is a diagram showing the superposition of what is equivalent to FIG. 9B viewed from the double axis.
  • FIG. 12 is a diagram showing the recognition of the exceptor stem of TyrRS, and is a stereogram of the exceptor-stem binding site of M. jannaschii TyrRS.
  • Figure 13 is a schematic ( stereogram ) around the first base pair of the tRNA Tyf of the M.zo a / w? C force / complex. Since the tRNA was generated by a lipozyme self-cleavage reaction, there is no phosphate at the 5 'end of the tRNA. Nucleotides 1, 72, and 73 of each tRNA are shown in the stick model. Hydrogen bonds and other interactions are indicated by dashed lines. The Ripon model shows the N-terminal region T, the Rosmanfold domain, and the CP1 domain.
  • FIG. 14 is the corresponding diagram in T. 77zw. Nucleotides 1, 72, 73 of each tRNA Tyr are shown in the stick model. Hydrogen bonds and other interactions are indicated by dashed lines.
  • the Ripon model shows the N-terminal region T, Rosmanfold domain, and CP1 domain.
  • FIG. 15 shows the anticodon recognition of TyrRS, and is a stereogram showing anticodon recognition by .ya / w? D // TyrRS. Hydrogen bonds are indicated by dashed lines. Anti-codon triplets are represented by a stick model. The C-terminal domain is shown in a Ripon model.
  • Figure 16 is a correspondence diagram (stereo diagram) of the T./ ⁇ / complex. Hydrogen bonds are indicated by dashed lines. Anticodon triplets are represented by a stick model. The C-terminal domain is shown in the Ripon model.
  • FIG. 17 is a graph showing a comparison of the initial speed of aminoacylation between the wild type and several mutants.
  • FIGS. 18A and 18B show the amino acid residues of TyrRS that recognize the side chain of L-tyrosine (stereo diagram).
  • FIG. // Shows the amino acid binding site of the triple complex
  • FIG. 18B is .st ea r 01 he rnwph i 1 us, i.
  • Two residues of M. jannaschii, Glul07 and Leul62, are each ew of B. stearothe rmoph i 1 us Corresponding to
  • Figure 19 is a photograph of a crystal of a native (left) and selenomethionine-labeled (right) TyrRS-tRNA Tyr -tyrosine complex.
  • FIG. 20 is a diffraction image of a native crystal.
  • the arrow corresponds to 1.95 ⁇ (1.95 ⁇ 10-1 ⁇ 2 ⁇ ) resolution.
  • FIG. 21 shows an XAFS spectrum of Se atom of the selenomethionine-labeled complex crystal. The measurement of the diffraction data was performed at the peak wavelength indicated by the arrow.
  • Figure 22 is the Fourier diagram of the extraordinary dispersion difference (4 cut-off) of the selenomethionine-labeled complex.
  • the selenomethionine side chain is shown by a stick model, and the main chain of TyrRS is shown by a ribbon model.
  • FIG. 23 shows the crystal packing (stereo diagram) of the TyrRS ′ tRNA Tyt> complex. In the center, you can see a dimerized molecule with crystallographic symmetry.
  • FIG. 24 shows non-natural amino acids specifically recognized by the TyrRS mutant of j'azwasdz / i, and shows only the side chains.
  • FIG. 25 shows the amino acid sequence of janmschii. * Indicates the end of translation.
  • FIG. 26 is a photograph of an SDS-PAGE gel in which the expression of GFPuv (ajnber) was examined.
  • FIG. 27 is a photograph of a gel of SDS-PAGE in which the expression of TT1865 was examined.
  • a tyrosine derivative refers to one in which an arbitrary substituent is introduced into any of atoms constituting tyrosine, and there is no limitation on the position where the substituent is introduced. Specifically, for example, a thioxacin derivative having a side chain shown in FIG. 24 can be mentioned.
  • the TyrRS mutant of the present invention has a mutation at a specific position in the amino acid sequence, and as long as the desired activity is maintained, one or several amino acids are deleted at amino acid residues at other positions, Substitutions or additions are also included.
  • the TyrRS mutant of the present invention has a mutation at a specific position in the amino acid sequence, and as long as the desired activity is maintained, 70% or more of amino acid residues at other positions Those having homology, preferably 80% or more homology, more preferably 90% or more homology are included.
  • the present invention provides the atomic structure coordinates of a ternary complex as determined by high resolution three-dimensional structure and X-ray crystallography. Specific methods for crystallization of the triple complex and X-ray analysis of its structural coordinates are as described in Examples.
  • the crystal of the triple complex of TyrRS of jannaschii and tRNA T of ya / w? / '/' And L-tyrosine (hereinafter referred to as triple complex of TyrRSZtRNA ⁇ ZL-tyrosine) of the present invention has a space group of 1 Yes, the unit cell is (15.6 nm).
  • the unit cell refers to the smallest simple volume element of the crystal, and the space group refers to the symmetry of the unit cell.
  • Table 3 shows the atomic structure coordinates of the triple complex of TyrRSZtRNA ⁇ ZL _ tyrosine of the present invention obtained at a resolution of 1.95 A ( ⁇ ⁇ ⁇ -' ⁇ ).
  • atomic numbers 1 to 2415 correspond to TyrRS
  • 2416 to 2428 correspond to L-tyrosine
  • 2429 to 4006 correspond to tRNA
  • 4007 to 4374 correspond to trapped water.
  • the atomic structure coordinates of the triple complex of TyrRSZtRNA T "ZL-tyrosine mean those which match or substantially match the coordinates shown in Table 3, and more specifically, those shown in Table 3.
  • the coordinates shown when they are superimposed using backbone atoms (N, Co !, C and O), they are less than about 1.5 A (0.15 nm), preferably about 1.0 A (0.1 nm).
  • the atomic coordinates shown in Table 3 reflect the tertiary structure of TyrRS of. Jannaschii bound to tRNA Tyf and L-tyrosine and provide much useful information. In particular, it can be used to specify the position of amino acid substitution for TyrRS modification of archaebacteria. In addition, as described above, the similarity of TyrRS between archaea and eukaryotic cells suggests that it can be used to identify the position of amino acid substitutions for eukaryotic TyrRS modification shown in Table 3. Conceivable.
  • the tyrosine-binding pocket structure of TyrRS revealed in the present invention has a structure defined by atomic numbers 1 to 24 15 in atomic coordinates shown in Table 3.
  • Amino acid residues Ty r 32 (atomic numbers 259 to 270), I 1 e 33 (atomic numbers 27 1 to 278), Gly 34 (atomic numbers 279 to 282), Ph e 35 (atomic numbers 283 to 293), G lu 36 (atomic numbers 294-302), Le eu 65 (atomic numbers 525-532), A1a67 (atomic numbers 541-545), His 70 (atomic numbers 562-571), Tyr 1 51 ( Atomic numbers 1230 to 1241), G1n155 (atomic numbers 1265 to 1273), Asp158 (atomic numbers 1289 to 1296), G1n173 (atomic numbers 1398 to 1406), and His 177 (Atomic numbers 1435 to 1444).
  • FIG. 4 shows an enlarged view of this tyrosine binding pocket. In Fig. 4, the dotted line indicates a hydrogen bond.
  • the L-tyrosine amino and haponyl groups of the substrate form a hydrogen bonding network at G1n173, Tyr151, and G1n155. That is, the amino group of L-tyrosine of the substrate forms a hydrogen bond with the carbonyl group of Glnl 73, the hydroxyl group of Tyr151 and the carbonyl group of G1n155, respectively, and The tyrosine radical group forms a hydrogen bond with the amino group at G1n173, and further forms a hydrogen bond with the carbonyl group at G1n173 and the amino group at G1n155.
  • the aromatic ring of tyrosine is recognized by the side chains of Leu 65, His 70, and G1n155, and also by the main chains of Ile33, Gly34, and Phe35. (Behind tyrosine, not shown in Figure 4).
  • the hydroxyl group on the aromatic ring of tyrosine is recognized by hydrogen bonding at Tyr32 and Aspl58 inside the pocket. It is.
  • the water molecule is trapped in hydrogen bonds by His177 and Tyr32 and is also proximal to the tyrosine side chain.
  • This tyrosine binding pocket is thought to determine the substrate specificity of wild-type TyrRS for tyrosine. Therefore, in order to modify the substrate specificity of TyrRS for tyrosine, it is considered effective to mutate the amino acid residues constituting the tyrosine binding pocket.
  • the present invention provides a mutant TyrRS in which aaRS activity using a desired tyrosine derivative as a substrate is higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate, based on the information on the tyrosine binding pocket structure (hereinafter simply referred to as the substrate specificity of the present invention). (Also referred to as mutant TyrRS). That is,
  • (C) a method comprising selecting, from a mutant TyrRS library, one in which aaRS activity using a target tyrosine derivative as a substrate is higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate.
  • a mutant TyrRS in which aaRS activity using a target tyrosine derivative as a substrate is higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate is a mutant TyrRS in which the substrate affinity for a desired tyrosine derivative is higher than that for tyrosine.
  • Tyrosin also has an increased substrate affinity for the desired tyrosine derivative, which means that the activity value (the reaction rate cat divided by the Michaelis constant K m ) for the target tyrosine derivative is greater than the activity value for tyrosine.
  • the activity value can be measured by an in vitro assay, or the relative magnitude of the activity value can be determined from genetic data.
  • the atom into which the substituent is introduced may be any of the carbons constituting the aromatic ring of tyrosine.
  • the carbon atom at the 2- or 3-position of the tyrosine aromatic ring If you want to introduce a substituent into the tyrosine, there are two places due to the line symmetry of tyrosine.
  • a tyrosine derivative in which the hydroxyl group at position 4 of the tyrosine aromatic ring is replaced with another substituent may be used.
  • mutants having substrate specificity for various tyrosine derivatives as shown in FIG. 24 have already been obtained, various substrate specificities can be obtained from the mutation of M.zo aim 7 '. It has been demonstrated that it can have.
  • the site of mutation can be specified more rationally, so that it is possible to obtain a mutant with higher substrate specificity for a tyrosine derivative that is already known to be a substrate.
  • the possibility of obtaining mutants having substrate specificity for thioxacin derivatives having new positions and types of substituents has been opened.
  • step (B) a mutant TyrRS library in which the selected amino acid residue has been replaced with another amino acid residue is prepared.
  • random substitution of amino acid residues can be performed by a known gene manipulation technique using PCR or the like.
  • the 3-substituted two kinds if you select three amino acid residues, the combination of amino acid substitutions should be viewed attempt is by two ways 0 3, 1 6 0 0 0 ways to suit.
  • a library of mutant genes in which the nucleotide residues corresponding to these three positions on the gene (9 residues each in total) have been changed to a random sequence can be created using PCR.
  • the expression of the tyrosine (+) tyrosine derivative (-) in the medium of the tyrosine (+) tyrosine derivative (-) does not occur, but the tyrosine (+) tyrosine derivative ( +) In the medium May be selected to cause an amber sub-resolution.
  • a strain in which a member mutation has been introduced into Lac is transformed with a library of mutant genes in which a random sequence has been changed in combination with an amber suppressor tRNA, and a tyrosine (+) tyrosine derivative (- In the medium of (1), amber-subversion (Lac-) does not occur.
  • an amber-subversion (Lac +) can be selected.
  • the target one can be easily selected from many transgenic cells.
  • an example of a method for modifying the amino acid specificity of jan schii TyrRS using the method for producing a mutant TyrRS of the present invention will be specifically described.
  • the first and third underlines indicate the site and the dl II site.
  • the second underline indicates the structural gene region of the M. jannas chii suppressor 1-tRNA.
  • DNA fragment containing ⁇ -lac (Am) (SEQ ID NO: 7)
  • the tyrosine ring in the three-dimensional structure of the L-tyrosine binding site of TyrRS (Fig. 4) Select the next 3 residues located near the 3rd position (2 left and right places).
  • N A gene substituted with any of A, G, C, T, ⁇ : 6 or 1 is prepared by the following two-step PCR and expressed in E. coli by the method described in [2].
  • Step 1 of PCR Including the following four rounds of PCR using primers 1-18.
  • PCR.1 Use primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 3 (SEQ ID NO: 8).
  • PCR.2 Use Primer 4 (SEQ ID NO: 9) and Primer 5 (SEQ ID NO: 10).
  • PCR.3 Primer 1 (SEQ ID NO: 11) and Primer 1 (SEQ ID NO: 12) are used.
  • PCR.4 Use primer 8 (SEQ ID NO: 13) and primer 2 (SEQ ID NO: 4).
  • the reaction conditions may be as follows.
  • Step 2 of PCR Mix 10 nanograms of each PCR product obtained in PCR.1 to 4 and use primers 1 and 2 as type III.
  • PCR.1 Use primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 1 (SEQ ID NO: 8).
  • PCR.2 Use primer 4 (SEQ ID NO: 9) and primer 6 (SEQ ID NO: 11).
  • PCR.3 Use primer 8 (SEQ ID NO: 13) and primer 1 (SEQ ID NO: 14).
  • PCR.4 Use primer 10 (SEQ ID NO: 15) and Primer 1 (SEQ ID NO: 4).
  • the mutant TyrRS expression plasmid prepared in [5] or [6] is introduced into the MV1184 * strain by the transformation method, respectively, and plated on an LB * plate. Collect the colonies (8000 or more) that have formed after the incubation at 37 ° C for 18 hours or more, inoculate them again on LB «(IY) plates, observe the colonies again after keeping the incubation for 24 hours or more.
  • Each colony contains one mutant TyrRS gene clone. If the mutant TyrRS has the activity to bind L-tyrosine (or IY or L-tyrosine if IY is added) in the plate to Mjsup-tRNA, then the mutant in the G-lac (Am) gene Substitution of the mutation results in a blue colored colony. Therefore, the blue-stained colonies on the LB «(IY) plate may contain the mutant TyrRS gene that has the activity to bind IY or L-tyrosine to M] 'sup-tRNM. Understand. Therefore, transfer one blue-stained colony to each plate and LB (IY) plate, incubate at 37 ° C for 24 hours or more, and observe coloring again.
  • the colony which is blue on the LB ⁇ ( ⁇ ) plate and white on the LB plate, contains a mutant TyrRS gene that has the activity to bind only ⁇ to Mjsup-tRNA. Therefore, the mutant TyrRS gene is recovered from each colony.
  • composition of each plate can be as follows.
  • LB * plate LB plate containing 100 milligrams of ampicillin and 25 milligrams of chloramphenicol per liter.
  • LB plate 1 mM (final concentration) of isopropyl-tothio-D-galactopyranoside per liter, 40 mg of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl;; 40 mg of 3-D-galactopyranoside, IY LB plate containing 0.1 g.
  • LB (IY) plate 1 mM (final concentration) of isopropyl-1-thio-D-galactovyranoside per 1 liter, 40 mg of 5-promo-4-octanol-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside, ⁇ LB plate containing 0.1 g.
  • the mutant thus obtained is a mutant TyrRS having a higher affinity for a desired tyrosine derivative than tyrosine. That is,
  • a mutant TyrRS produced by a method comprising selecting a substance having an enhanced aaRS activity using a target tyrosine derivative as a substrate rather than an aaRS activity using tyrosine as a substrate, for example,
  • a target tyrosine derivative as a substrate
  • tyrosine as a substrate
  • the desired amber-modified gene By expressing the desired amber-modified gene at a desired position in combination with an amber repressor tRNA derived from an archaebacteria or a eukaryote by the method described below, the desired tyrosine can be placed at a desired position. It is preferably used for production of a polypeptide into which is incorporated.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of wild-type TyrRS of .zo //; 70, a sequence in which one or more amino acid residues of Asp 158 are replaced with another amino acid residue, or one or more amino acid residues of Tyr32, Aspl 58, and His 177
  • a mutant TyrRS comprising a sequence substituted with an amino acid residue, characterized in that aaRS activity using a 3-substituted tyrosine as a substrate is higher than aaRS activity using a tyrosine as a substrate, can be obtained by, for example, a method described below.
  • a desired gene having an amber mutation at a desired position is expressed, thereby incorporating the target 3-substituted tyrosine at a desired position.
  • a desired gene having an amber mutation at a desired position is expressed, thereby incorporating the target 3-substituted tyrosine at a desired position.
  • mutant TyrRS of the present invention in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more amino acid residues of Tyr32, His70, and As158 are replaced with another amino acid residue. Or a sequence in which one or more amino acid residues of Tyr32, Aspl58, and His177 have been substituted with another amino acid residue, and based on aaRS activity using tyrosine as a substrate. Is also a mutant Ty rRS characterized by enhanced aaRS activity using a 3-substituted tyrosine as a substrate.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a sequence in which one or more amino acid residues of Tyr32, His70, and Asp158 have been substituted with another amino acid residue, or Tyr32, It consists of a sequence in which one or more amino acid residues of Asp 158 and His 177 are replaced with another amino acid residue, and has aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate
  • the mutation TyrRS which is characterized in that it has been performed, is combined with an archebacterial or eukaryotic member-subtractor tRNA, for example, by the method described below, and is supposed to have an amber mutation at a desired position.
  • the gene By expressing the gene, it is preferably used for the production of a polypeptide incorporating a 3-substituted tyrosine, preferably a 3-halogenated tyrosine, particularly 3-ododotyrosine at a desired position.
  • a mutant TyrRS of the present invention in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more amino acid residues of Tyr32, His70, and As158 are replaced with another amino acid residue. Or a sequence in which at least one amino acid residue of Tyr32, Aspl58, and His177 has been substituted with another amino acid residue, and based on the aaRS activity using tyrosine as a substrate.
  • T yr RS characterized by enhanced aaRS activity using 3-hydroxytyrosine as a substrate.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a sequence in which His 70 is substituted with A 1 a and Asp 158 is substituted with Thr (Ty r 32—A la 70—Th r 158), or Mutation consisting of a sequence in which Tyr32 is replaced by Thr, His70 is replaced by Thr, and Asp158 is replaced by G1u (Thr32—Thr70—G1u158) Provide TyrRS.
  • this mutant has high specificity for 3-odotyrosine is that in the selection method described above, amber suppression (Lac-) does not occur in the medium of tyrosine (+) 3 -odotyrosine (-). However, tyrosine (+) has been demonstrated by the occurrence of amber-substitution (Lac +) in the medium of 3-hydroxytyrosine (+).
  • mutant TyrRS of the present invention in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a sequence in which His 70 is replaced by A1a and Asp 158 is replaced by Thr (Ty r 32-A la 70-Th rl 58), or a sequence in which Ty r 32 is replaced with Thr, His 70 is replaced with T hr, and Asp 158 is replaced with G 1 u (T hr 32- It is a mutant TyrRS containing Th r 70 -G 1 u 158).
  • 3-Halogenated tyrosine such as 3-hydroxytyrosine and 3-bromotyrosine
  • the mutated TyrRS of the present invention having enhanced substrate specificity for 3-halogenated tyrosine can be used for the production of an aroprotein incorporating a 3-monohalogenated tyrosine, and such an aroprotein may be a protein.
  • Function ⁇ It is useful as a material for structural analysis and may also be a target for drug discovery.
  • the anticodon G34 binding pocket structure of the present invention thus identified has the structure defined by atomic numbers 1 to 2415 in atomic coordinates shown in Table 3.
  • the amino acid residue P It is an anticodon G 34 binding pocket structure formed by he 261, His 283, Pro 284, Met 285, and Asp 286.
  • This anticodon G34 binding pocket is shown in FIG.
  • the base portion of G34 stacks between the rings of Phe261 and His283, and the nitrogen atom at position 1 and the amino group at position 2 are both recognized by hydrogen bonding with Asp286. I have.
  • the present inventors have developed an aminoacylate tRNA, a G34C variant of tRNA ⁇ (a tyrosine anticodon GUA in which the first letter G of the GUA has been replaced with a C and the anticodone has become a CUA). To increase the efficiency of the conversion, a mutation was introduced at residue 286, and its effectiveness was confirmed.
  • one embodiment of the present invention relates to an aminoacylation reaction for Amber Sublesser-tRNA having a sequence in which Asp 286 is replaced with another amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • This is a mutant TyrRS derived from zo '3 / ?; 7.
  • any of known methods may be used.
  • a primer in which the nucleotide sequence encoding the position of the target amino acid has been replaced with a nucleotide sequence encoding the amino acid to be modified Amplifying the DNA substituted with the nucleotide sequence encoding the amino acid to be modified, joining the amplified DNA fragments to obtain DNA encoding the full-length a aRS mutant, It can be easily produced by expressing it using a host cell such as Escherichia coli.
  • the primer used in this method has 20 to 70 bases, preferably about 20 to 50 bases. This primer has 1 to 3 base mistakes with the original base sequence before modification. It is preferable to use a relatively long one, for example, one having 20 bases or more, because it will result in a match.
  • the present inventors have found that, in this Asp286 substitution, when cytosine comes to the 34th base of NA in wild-type TyrRS, even if it comes to the position where the base is inverted like G34, Asp286 and base Asp286 was replaced with larger side chains, Glu, Phe, Ile, Leu, Gin, Arg, and Tyr, taking into account the possibility that satisfactory interaction might not be obtained due to the distance of A mutant was prepared.
  • the present invention provides a mutant TyrRS characterized by having an increased aminoacylation reaction rate for a member-subpressor tRNA as compared to a TyrRS comprising an amino acid sequence.
  • Asp 286 is substituted with Gln, Arg, or Tyr.
  • “high reaction rate” means that the initial rate is high when the substrate concentration and the enzyme concentration are kept constant.
  • either the Michaelis constant K m for that substrate may be lower, or the reaction rate constant Keal may be higher. That is, a mutant TyrRS having an increased aminoacylation reaction rate to amber suppressor tRNA as compared with TyrRS (wild type) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained by using an amber suppressor tRNA as a substrate.
  • Michaelis constant K m of the mutant or lower than wild type when, or reaction rate constant K eat mutants means higher than the wild type.
  • This mutant TyrRS is preferably used for polypeptide production by expressing a nucleic acid having an amber mutation introduced at an arbitrary position in combination with an amber suppressor tRNA derived from an archaebacteria or a eukaryote.
  • mutant TyrRS of the present invention the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a mutant TyrRS containing a sequence in which Asp286 is substituted with another amino acid residue has a higher aminoacylation rate for the amber suppressor tRNA than a TyrRS containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Mutant TyrRS characterized by enhanced levels.
  • the present invention further relates to a mutant TyrRS in which aaRS activity based on a tyrosine derivative is higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate, wherein an amino acid residue corresponding to Asp 286 in SEQ ID NO: 1 is G 1 n
  • a mutant TyrRS having an increased aminoacylation reaction rate with respect to Amber Sublesser-tRNA, wherein the method comprises substitution with Tyr, Arg, or Tyr.
  • a mutant TyrRS in which aaRS activity using a tyrosine derivative as a substrate is higher than aaRS activity using tyrosine as a substrate is one or more of the above-mentioned ⁇ Tyr32, His70, Asp158 '' It consists of a sequence in which an amino acid residue is replaced with another amino acid residue, or a sequence in which one or more amino acid residues of “Tyr32, Aspl58, Hisl77” are replaced with another amino acid residue
  • mutant TyrRS having improved substrate specificity for tyrosine derivatives described in the above-mentioned references 4, 11, 12 and the like can be mentioned.
  • the method of the present invention is based on these substrate-specific variants by further substituting Asp286 or an amino acid residue corresponding thereto with another amino acid residue.
  • Asp286 or an amino acid residue corresponding thereto can be easily determined by determining the amino acid sequence of each mutant by a well-known method and comparing it with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • This mutant TyrRS has a higher aminoacylation rate for the amber-subpressor tRNA than the TyrRS before the substitution of Asp286, so it can be combined with an amber-subpressor tRNA derived from archaebacteria or eukaryotes.
  • a nucleic acid having an amber mutation introduced at an arbitrary position it is preferably used for producing a polypeptide having a tyrosine derivative incorporated at an arbitrary position.
  • the aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate is higher than the aaRS activity using tyrosine as a substrate, and it is more effective against Amber Sublessa-NA than TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention further relates to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, in which His 70 is replaced with A 1 a and Asp 158 is replaced with Thr (Ty r 32 -A 1 a 70 -Th r 158) and a sequence in which A sp 286 is substituted with G 1 n, Ar g, or Tyr, or Ty r 32 is substituted with Thr, His 70 is substituted with Thr, and A sp 158 is G 1 consists of a sequence substituted with u (Thr32—Thr70—Glul58) and Asp286 substituted with Gln, Arg, or Tyr, rather than aaRS activity using tyrosine as a substrate.
  • aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate is enhanced, and the aminoacylation rate for amba-sublesser-tRNA is increased as compared to TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Mutant TyrRS is also provided.
  • This mutant TyrRS is also used in combination with an archaebacterial or eukaryotic amber-subtractor tRNA to express a nucleic acid having an amber mutation introduced at an arbitrary position, whereby a 3-position-substituted cytosine synthase can be obtained at an arbitrary position. Particularly, it is preferably used for production of a polypeptide incorporating 3-odotyrosine.
  • mutant TyrRS of the present invention in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, His 70 is replaced with A1a, Asp 158 is replaced with Thr (Ty r32- A1a70-Thr158) and a sequence in which Asp286 is substituted with G1n, Arg, or Tyr, or Tyr32 is substituted with Thr, and His70 is substituted with Thr.
  • a sequence in which Asp158 is substituted with G1u (Thr32—Thr70—G1u158) and Asp286 is substituted with G1n, Arg, or Tyr, and tyrosine is included.
  • the aaRS activity using 3-odotyrosine as a substrate is higher than the aaRS activity using as a substrate, and the aminoacylation rate for amber repressor tRNA is higher than that of TyrRS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is a mutant TyrRS characterized by an enhancement. (8) Polypeptide production and purification
  • the mutant TyrRS thus obtained can be used in combination with an archaeal or eukaryotic sub-tRNA to produce a polypeptide incorporating the tyrosine derivative in vivo or in vivo.
  • a desired polypeptide is synthesized by a polypeptide synthesis system using the mutant TyrRS and an archaebacteria- or eukaryotic-derived tRNA capable of binding to a tyrosine derivative in the presence of the mutant TyrRS. It is intended to provide a method for producing a polypeptide incorporating a cytosine derivative, which comprises expressing a polypeptide containing an unnatural amino acid using a desired gene having a nonsense mutation at a position.
  • any synthesis system can be used as long as it is an expression system that can be expressed using the above-mentioned mutant TyrRS, a bindable sublesser tRNA, and a desired gene.
  • the “cell-free polypeptide synthesis system” means a system for synthesizing polypeptide in vitro using a cell extract, and reads the mRNA information of mRNA and reads it on the liposome.
  • a cell-free translation system for synthesizing polypeptides and a system containing both a cell-free transcription system and a cell-free translation system for synthesizing RNA using DNA as type II.
  • the requirements for cell-free polypeptide synthesis systems include:
  • Desired cell extract preferably prokaryotic bacterial extract
  • the cell extract of (1) contains ribosomes, tHNA, enzymes necessary for polypeptide synthesis, etc., and is a concentrated cell extract of Escherichia coli having high polypeptide synthesis activity, particularly Escherichia coli A concentrated S30 cell extract can be used.
  • the concentrated cell extract can be obtained by concentrating the above crude cell extract by a concentration method such as dialysis, ultrafiltration, or polyethylene glycol (PEG) precipitation.
  • the concentration of E. coli S30 cell extract can be concentrated by a known method (Zubay et al. (1973) Ann. Re. Genet. 7: E. coli A19 (rna, met)) in a closed system with shaking or stirring.
  • E. coli S30 extract (also available from Promega) obtained from E. coli is used as the inner dialysis solution, and dialyzed against the outer dialysis solution through a dialysis membrane with a molecular weight limit of 1 000 to 14000.
  • the dialysis external solution is composed of a buffer solution containing potassium acetate, magnesium acetate, and dithiothreitol, and a polyethylene glycol or sucrose Zepichlorhydrin water-soluble synthetic copolymer (eg, SI GMA Ficoi l).
  • the cell extract derived from Escherichia coli is preferably concentrated, but may not be concentrated.
  • the term “enriched cell extract” refers to a crude extract of eukaryotic and prokaryotic cells containing components required for polypeptide synthesis such as ribosomes and tRNA, dialysis, ultrafiltration, and precipitation (3). Nakano et al., Journal of Biotechnology, 46 (1996) 275-282), etc., or those enriched by a newly discovered enrichment method, wherein the extract is involved in the in vivo synthesis of polypeptides. And translation / translation / translation system components. “Enrichment” means an increase in the concentration of the total protein in the extract as an index.
  • the cell extract contains polyribosomes, tRNA, etc. Contains components required for peptide synthesis.
  • the method described in Pratt, JM et al., Transcription and translation-a practical approach, (1984), pp. 179-209, Henes, BD and Higgins, SJ, IRL Press, Oxford) is used. it can. Specifically, crushing by French press (Pratt et al., Supra) and crushing using glass beads (Kim et al., Supra) Can be done by
  • a preferred cell extract is E. coli S30 cell extract.
  • the S30 cell extract can be prepared from Escherichia coli A19 (rna, met) according to known methods, for example, the method of Pratt et al. (Supra), or can be prepared from Promega or Novagen. A commercially available product may be used.
  • the cell extract needs to be concentrated so as to increase its total protein concentration.
  • Concentration can be performed by any means such as ultrafiltration (including ultrafiltration centrifugation), dialysis, and PEG. It can be performed by precipitation or the like.
  • the degree of concentration is usually 1.5 times or more, preferably 2 times or more.
  • a cell extract derived from Escherichia coli it can be concentrated to 1.5 to 7 times or more by ultrafiltration centrifugation and 1.5 to 5 times or more by PEG precipitation, but if it exceeds 4 times, handling becomes difficult.
  • PEG precipitation Nakano, H. et al., Supra.
  • a polypeptide and a nucleic acid are precipitated and mixed by mixing an aqueous PEG solution with a cell extract, and a concentrated cell extract can be obtained by dissolving this in a small amount of buffer.
  • Concentration by dialysis is performed, for example, by using a cell extract as a dialysis solution in a closed system that can be shaken or stirred, and dialyzing the dialysis solution through a dialysis membrane (for example, with a molecular weight limit of 1000 to 1400). Obtainable.
  • the outer dialysis solution is a buffer solution containing potassium acetate, magnesium acetate, and dithiothreitol, a PEG (eg, # 8000), a sucrose Z-epiclorhydrin water-soluble synthetic copolymer (eg, SI GMA And a polymer absorbent such as Fico 11 1).
  • Polymer absorbents are essential for absorbing moisture.
  • Cell-free polypeptide synthesis systems include concentrated cell extracts such as Escherichia coli S30, ATP (adenosine 5, monotriphosphate), GTP (guanosine 5, 1 Triphosphate), CTP (cytidine 5, monotriphosphate), UTP (peridine 5, monotriphosphate), buffers, salts, amino acids, RNase inhibitors, antimicrobial agents, RNA polymerase if necessary (When DNA is used as type I) and tRNA.
  • concentration of the additive component can be arbitrarily selected.
  • a buffer such as Hepes-K ⁇ H or Tris-OAc can be used.
  • salts are acetate (eg, ammonium salt, magnesium salt, etc.), glutamate, etc.
  • antibacterial agents are sodium azide, ampicillin, etc.
  • Amino acids are the 20 amino acids that make up the polypeptide.
  • RNA polymerase is added to the reaction system.
  • a commercially available enzyme such as T7 RNA polymerase can be used.
  • any of the mutant TyrRSs of the present invention can be used.
  • the use of a mutant TyrRS having an enhanced aaRS activity using a tyrosine derivative as a substrate is advantageous for the production of a polypeptide incorporating a tyrosine derivative, and further has a mutant TyrRS having an increased aminoacylation reaction rate to an amber suppressor tRNA.
  • the use of is advantageous because the production efficiency can be increased.
  • the sublesser tRNA of (3) is a tRNA T mutant derived from archaebacteria or eukaryotes, and is preferably an amber suppressor tRNA (the first letter G of the tyrosine anticodon GUA is replaced with C, and the anticodon Has become CUA).
  • M. 'a / w? // Derived tyrosine sublesser tRNA can be prepared by the method described above. Eukaryotic tRNAs that can be used are described, for example, in M. Sprintl et al., Nucleic Acids Research, Vol. 17, pp. 117, 1989. Things.
  • polypeptide into which the tyrosine derivative is incorporated is not limited, and may be any expressible polypeptide or a heterologous recombinant polypeptide.
  • a nonsense codon an amber codon when the suppressor RNA is an amber suppressor
  • this nonsense codon is introduced.
  • Part Can specifically incorporate an unnatural amino acid.
  • a well-known method can be used to introduce a mutation into a polypeptide in a site-specific manner, and is not particularly limited.
  • the polypeptide is intended to have any number of residues ranging from a small peptide to a large peptide as defined above, and includes known or novel polypeptides.
  • DNA or RNA encoding the polypeptide of interest can be obtained from eukaryotic or prokaryotic cells or tissues as genomic DNA or mRNA by well-known methods (phenol Z-cloth form treatment, ethanol precipitation, cesium chloride density gradient centrifugation, etc.) Or synthesized or isolated by cDNA cloning.
  • the amino acid sequence of the polypeptide or the nucleotide sequence encoding it is known, it can be chemically synthesized using a DNA synthesizer.
  • reaction conditions such as temperature and stirring speed can be used depending on the type of polypeptide.
  • the temperature is usually about 25 to about 50 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the shaking speed or the stirring speed can be low, for example, 100 to 200 rpm.
  • the reaction time can be appropriately selected while monitoring the production of the desired polypeptide.
  • Any cell extract preferably prokaryotic bacteria extract,
  • kits for producing a polypeptide incorporating a tyrosine derivative comprising: Further, the kit for producing a polypeptide incorporating a tyrosine derivative is described in 1 to 3. in addition,
  • Liponucleotides such as ATP, GTP, CTP, UTP
  • kits As each component of these kits, the same components as described in the cell-free polypeptide synthesis system can be used.
  • kits can easily express DNA or mRNA encoding the desired polypeptide in which an ampa mutation has been introduced at a desired position, and can thus be expressed at any desired position. It can be used for the production of a desired polypeptide incorporating a tyrosine derivative.
  • the invention also provides a method for producing a polypeptide, which is characterized by the following.
  • Escherichia spp. for example, Escherichia coli 12 strain MM294 (ATCC 31446); Escherichia coli X1776 (ATCC 31537); Escherichia coli W3110 strain (ATCC 27325); and K 5 7 7 2 (ATCC 53635); enterobacteria, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, enterobacteria such as Salmonella typhimurium, Serratia, and Shigella, B. subtilis, B. Includes, but is not limited to, Bacillus such as licheniformis, Pseudomonas such as Pseudomonas aeruginosa, and Streptomyces.
  • the method can be performed according to a method in which suppressor tRNA is expressed.
  • eubacteria having This eubacteria can be used in the method for producing a polypeptide described above.
  • the tyrosine derivative-incorporated polypeptide produced in Escherichia coli using the TyrRS of the present invention can be recovered from a culture medium or a host cell lysate by a conventional method. If attached to a membrane, it can be released from the membrane using a suitable detergent (eg, Triton-XI00) or by enzymatic cleavage. Cells can be disrupted by various physical-chemical means such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cell lysing agents.
  • the protein denaturing agent when solubilizing the insoluble substance with a protein denaturing agent, the protein denaturing agent is not contained or the concentration of the protein denaturing agent is so low that the protein is not denatured. It can be diluted or dialyzed to form a protein tertiary structure.
  • Isolation and purification of polypeptides include solvent extraction, fractional precipitation with organic solvents, salt precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, and ion exchange chromatography, based on the specific properties of the produced polypeptide. Separation operations such as gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, crystallization, and electrophoresis can be performed alone or in combination.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • PCR was performed under the following conditions.
  • the temperature control of the reaction was as follows.
  • y y is 30 or more, and the length of the DNA fragment generated by PCR is divided by 500 and multiplied by 60.
  • pET-YRS Escherichia coli BL21 star
  • E3 Escherichia coli minor codon complement plasmid pRARE
  • the above E. coli transformed with PET-YRS was cultured in LB medium 2/100 g / m / ampicillin. 0.0. 6. .
  • IPTG isopropyl-1-thio-D-galactopyranoside
  • the obtained supernatant was crystallized by two-step column chromatography using an anion exchange column Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) and an affinity column HiTrap Hepar in HP (Amersham Biosciences). Purified to a purity suitable for About 30 mg of a purified sample was obtained per 1 / culture liquid.
  • the amount of transcript of tRNA T of bacterium is small as it is because the 5 'end is a cytidine residue.
  • tRNA transcribed in T7RNA polymerase as a first hammer one Heddoripozaimu fusion (transzyme), it was decided to create a tRNA Ty r by subsequent self-cleavage.
  • Ddoripozaimu to hammer 5 'end of the NA Tyr coding region creating a DNA having a sequence 27 that transcription promoting sequence was added in the bonding of synthetic primer, to introduce it into pUC119.
  • plasmids were prepared in large quantities.
  • the obtained plasmid was used as a type II, and a T7 RNA polymerase transcription reaction was performed to synthesize transzyme RNA.
  • the self-cleavage reaction of the hammerhead lipozyme was promoted by performing 12 to 14 cycles of transzyme at 85 ° C for 30 seconds and 60 ° C for 9 minutes.
  • tRNA T is purified and deurea purified by 8 M urea-15% polyacrylamide gel electrophoresis and column chromatography using an anion exchange column Resource Q (Amersham Biosciences) to obtain a sample suitable for crystallization. Obtained.
  • the purified tRNA Tyf was dissolved in 20 mM Tris -Cl ( H7.5 ) and 20 mM magnesium chloride solution, denatured at 80 ° C, and cooled slowly to form a higher-order structure.
  • the purified TyrRS solution was purified by ultrafiltration using Vivaspin 2 (Vivascience) in 20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 20 mM magnesium chloride, 2 mM L-tyrosine, 10 mM 2 -The solution was replaced with a mercaptoethanol solution and concentrated.
  • the obtained solution was used as a sample for crystallization. Crystallization of the complex
  • crystallization buffer [30% (v / v) 1,6-hexanediol, 50 mM sodium acetate (pH 4.0), 200 mM ammonium chloride] , 10 mM sodium chloride and I mM zinc acetate]
  • crystallization buffer As the reservoir solution, a crystallization buffer in which the 1,6-hexanediol concentration was changed to 35% (v / v) was used. After equilibrating at 30 ° C for 1 week, hexagonal bipyramidal crystals appeared and grew to 0.15X0.15X0.45 mm after about 3 weeks (Fig. 19).
  • Diffraction data was collected at beamline BL41XU at SPring_8, a high-intensity synchrotron radiation facility.
  • the crystals were immersed in a crystallization buffer containing 30% (v / v) ethylene glycol as a cryoprotectant and then instantaneously cooled to 100K. While keeping the temperature at 100 K, diffraction data were collected for native and SeMet conjugates at an oscillation angle of 1 ° and an exposure time of 2 seconds (Fig. 20).
  • the X-ray absorption fine structure (XAFS) spectrum was measured to enhance the anomalous dispersion effect of Se atoms, which is essential for phase determination, and the absorption edge wavelength (0.9793A (0.09793nm)) was measured. The diffraction data was measured. The measured XAFS spectrum is shown in Figure 21.
  • the initial phase of the SeMet-labeled complex was analyzed using the single-wavelength anomalous dispersion (SAD) method.
  • the initial coordinates of Se atoms were determined by the direct method using the SnB program based on the scaling data of the SeMet-labeled complex.
  • MLPHARE of the Collaborative Co. utational Project No.4 (CCP4) program suite
  • CCP4 Collaborative Co. utational Project No.4
  • RESOLVE program to extend the phase to 2.1 A (0.21 nm) and improve the electron density by solvent smoothing and histogram matching, a clearly interpretable electron density was obtained.
  • Figure 22 shows the difference Fourier diagram for the abnormal variance.
  • the model was constructed using program 0.
  • the model of the constructed complex was refined by using program CNS to refine the temperature factor of each atom and repeating simulated annealing. Of the total data, 10% selected at random is excluded from refinement for cross-validation.
  • the aminoacylation reaction was performed at 37 ° C.
  • the composition of the reaction solution was 100 mM HEPES-KOH (H7.5), 15 mM magnesium chloride, 0.05 mg / m spore serum albumin, 1 mM dithiothreitol, 10 mM ATP, and 12 L_ [ 14 C] -tyrosine solution.
  • the enzyme concentration in the reaction solution was set to 10 nM or 100 nM, and the initial reaction rate when the tRNA concentration was changed from 0.25 to 64 M was determined from the time change of the radioactivity of the acetic acid-precipitated trichloride fraction. The kinetic constants were determined by plotting.
  • the asymmetric unit contained one TyrRS subunit, a tRNA Tyr , and a tyrosine molecule.
  • TyrRS forms a homodimer as suggested by the gel filtration method, and the two units in the homodimer are related to each other with a twofold symmetry axis (Fig. 23).
  • Fig. 6 shows the overall structure of the triple complex
  • Fig. 8 shows the electron density near the tyrosine binding site.
  • a part of the KMSKS loop (residues 203 to 209) is disordered because ATP, one of the substrates of TyrRS, is not in a bound state.
  • the nucleotide residues of the tRNA Tyr of the complex have a stable structure except for the 3 'end.
  • the two tRNA Tyr molecules span the two subunits of the homodimer, the receptor stem of the tRNA is in one subunit, and the anticodon loop interacts with the other subunit.
  • T./TyrRS has an additional C-terminal domain after the anticodon binding domain, which recognizes a long variable arm characteristic of eubacteria (Fig. 9 (d)).
  • ⁇ The tRNA bound to / ⁇ / / TyrRS is approximately 18 compared to that of M. / 3/7 /? ( ⁇ //. (Fig. 11) tRNA receptor recognition
  • the CI: G72 base pair of the Axepyu stem is the most important factor for the orthogonality of the TyrRS.tRNA T pair.
  • the except stem is recognized by the Rossmann old domain and the CP1 domain (Fig. 12).
  • G72 base The minutes are parallel to the other base planes of the acceptor stem, whereas the bases of C1 are twisted about 20 ° and tilted further 20 ° ( Figure 13).
  • the C1 base in this twisted position is strictly recognized by the enzyme.
  • the carbonyl group at position 2 and the nitrogen atom at position 3 of the C1 base are hydrogen-bonded to the guanidino group of Argl74, and the amino group at position 4 is hydrogen-bonded to the water molecule captured by Argl32. It also has hydrophobic interaction with the side chain of Metl78 ( Figure 13). G72 is mainly recognized by the amino group on the side chain of Lysl75. Argl32, Argl74, and Lysl75 are highly conserved among germs and eukaryotic TyrRS ( Figure 2). Rigorous recognition of C1 is thought to be the basis for C1: G72 specificity in TyrRS. In fact, M.
  • a / w // TyrRS is, Ul: the A72 base was converted pairs into the yeast M Ty r mutants, only recognize an efficiency of 1/200 as compared with the wild-type tRNA TYF (Reference 1 8) .
  • A73 is also a strong identity determinant of tRNA, and if it is replaced with guanine or peracil, it will not be recognized by zo aw // TyrRS (Reference 18).
  • the amino group at position 6 and the nitrogen atom at position 1 are recognized by the carbonyl and amino groups in the main chain of Vall95, respectively (Fig. 13).
  • Argl32 recognizes G71
  • Thrl26 and Glul82 recognize the tRNA phosphate backbone (Fig. 12).
  • Gl C72 is recognized in a different manner in T. thermophilus 1 ? & (Fig. 14). Not much is known about G1, only C72 is recognized by one hydrogen bond with Glul54. M. a / w? TyrRS does not have a proton axel in the corresponding part (Fig. 13). Furthermore, it was clarified that the A73 base that had been thrown from the helix axis in the. Complex was located on the extension of the helix in ⁇ . TlwrnwpIiUus (Figs. 13 and 14).
  • TyrRS of archaebacteria and eubacteria recognize axepstein stems with completely different residues, despite similar backbone structures.
  • G1 In the case of a tRNA with C72 base pairs. In jannaschii TyrRS, the functional group of Gl is far away from the side chain of Argl 74, and there is no proton receptor that can form a hydrogen bond with the amino group at the 4-position of C72. Is not considered. In fact, biochemical analysis supports this (Reference 18). On the other hand, T./force-force// does not recognize C1: G72 base pairs.
  • anticodons are recognized by the C-terminal domain ( Figure 6).
  • G34 the first letter of the anticodon, is derived and strictly recognized ( Figure 15).
  • the base part of G34 is stacked between the rings of Phe261 and His283, and the nitrogen atom at position 1 and the amino group at position 2 are both recognized by hydrogen bonding with Asp286.
  • the aminoacylation rate of the D286A substitution product is 1/10 or less of that of the wild type.
  • the other bases of the anticodon do not interact with the protein in a very specific manner.
  • the nitrogen atom at position 3 of U35 is a carbonyl group in the main chain of Cys231, and the report of A36 is the main chain of Lys288 and Lys228. It is only interacting with the chain (Fig. 15).
  • the phosphate group of C28 is hydrogen bonded to the side chain of Lys228. This is considered to be the reason why the first letter of anticodon is distinguished much more strongly in zoam / TyrRS than in other bases (Reference 18).
  • Asp286 is highly conserved in archaeal and eukaryotic TyrRS, and corresponds to the aromatic residue corresponding to Phe261 on the / 3-31 () -3 motif (Fig. 10) and to His283. Histidine residues are also well conserved ( Figure 2). For example, in human TyrRS, T ⁇ 283, Asp308, and His305 correspond to Phe261, Asp286, and His283 of ⁇ awz7 TyrRS on the primary sequence, respectively (FIG. 2). Furthermore, the orientations of Trp286 and Asp308 side chains on the three-dimensional structure of human TyrRS are almost the same as those of Phe261 and Asp286 of M. zoa /? // TyrRS.
  • T. thermophilus ⁇ recognizes anticodons by a completely different mechanism than M. zoaz / zc force // TyrRS.
  • G34 is screened at A36, and the modified base, pseudouridine residue 35, is inverted ( Figure 16). And G34 is jannaschii x ⁇ on the primary structure The carbonyl group is recognized by Asp259, which does not correspond to Asp286 (Fig. 2, 16).
  • Pseudouridine residue 35 is primarily recognized by Asp423, but the residue belongs to the C-terminal domain unique to eubacteria TyrRS, and no corresponding residue exists in archaeal / eukaryotic TyrRS ( Figures 2 and 16). Modification of anticodon recognition based on conformation
  • Asp286 of ⁇ azoa; ?? 7 '/ TyrRS is a key residue for specifically recognizing G34, which is the first letter of the anticodon. Therefore, in order to increase the efficiency of aminoacylation of the tRNA T G34C mutant, ambassador sub-resor tRM, a mutation was introduced at residue 286. In the case of cytosine at the 34th base of tRNA in wild-type TyrRS, even if the base is inverted as in G34, the distance between Asp286 and the base is too large to obtain satisfactory interaction. it is conceivable that.
  • mutants in which Asp286 was substituted with Glu, Phe, Ile, Leu, Gin, Arg, and Tyr, which are larger side chains, were prepared, and the activity of aminoacyl sulfide on amba-sublesser-tRNA was measured.
  • the initial reaction rate was determined at a relatively high concentration of amber suppressor tRNA, a significant increase in activity was observed for the Gln, Arg, and Tyr substitutions.
  • the D286R showed an initial velocity eight times that of the wild type (Fig. 17).
  • TyrRS wild type TyrRS (D 2 8 6 R)
  • Table 2 shows the Michaelis constant and the kinetic constant for TyrRS of the wild type and the mutant.
  • Aminoacylation activity against wild-type TyrRS in amber sable suspended one tRNA was about 1/300 as compared with the wild-type tRNA Ty r.
  • the D286R mutant was found to aminoacylate amber suppressor tRNA to the same extent as the wild-type tRNA Tyr .
  • the D286R mutant was found to recognize tRNA 65 times better than the wild-type enzyme.
  • the / i m for Anba one Saburetsusa tRNA is a mutant has been mainly reduced, ⁇ did not change much.
  • the D286R, D286Q, and 3286Y mutants obtained in the present invention are expected to improve suppression efficiency in a w> o or / or in vitro system. By combining these mutations with mutations in the amino acid binding site for specifically recognizing non-natural amino acids, it is thought that large quantities of aloprotein can be produced.
  • thermophilus and M./'/TyrRS the CCA terminus of tRNA is disordered in the three-dimensional structure, so it has not been possible to verify which is the true target.
  • the KMSKS loop that binds ATP and the CCA terminus were both out of order, so we believe that there is some relationship between the two.
  • Tyrosine is housed in a deep tyrosine binding pocket in the enzyme ( Figure 4). Near the entrance of the tyrosine binding pocket, the amino and carbonyl groups of tyrosine form a hydrogen bonding network at Glnl73, Tyr151, and G1n155 ( Figure 4). The phenyl ring of tyrosine is recognized by the side chains of Leu 65, His 70, and G1n155, and further by the main chains of I1e33, G1y34, Phe35. Recognized (behind tyrosine, not shown).
  • hydroxyl group on the side chain of tyrosine is recognized by hydrogen bonding at Tyr32 and Asp158 inside the pocket ( Figure 4).
  • Water molecules are hydrogen-bonded by His 1 7 7 and Ty r 3 2 And is also proximal to the tyrosine side chain ( Figure 4).
  • Tyrosine-free human mini-TyrRS also has this type of amino acid binding pocket.
  • archaeal and eukaryotic TyrRS have conserved tyrosine binding sites.
  • Residues in the tyrosine binding pocket are also well conserved in bacteria.
  • the arrangement of the residues that form the deep pocket is similar to the B. stearothernwphilus and S. aureus TyrRS structures. jannaschim yr32, Aspl58, Glnl55, G1n173, and Tyrl515 in B. stearothennophi lus! corresponds to yr34, Aspl76, Gln173, Gln95, and Tyr169.
  • T. ihermophuIus y ⁇ RS has an exceptional Lys in place of Tyr to recognize the tyrosine hydroxyl group, but other residues in hydrogen bonding to tyrosine are conserved .
  • the details of the tyrosine binding site of TyrRS differ between archaeal eukaryotes and bacteria.
  • ⁇ is 70 and H s 177 of M. iannas chiii TyrRS are absent in A force // TyrRS.
  • the configuration of residues that do not directly interact with tyrosine is ⁇ : in M. jannaschii and B. stearothermophi lus.
  • the side chain of As n 123 is about 4 A (0.4 nm) from the tyrosine hydroxyl group of B./ea/o/force e3 ⁇ 4o 7i «TyrRS, but the corresponding residue of TyrRS of M.zo 3? /?
  • the group G 1 u 107 is 13 A (1.3 nm) away from tyrosine.
  • the Y32Q and D158A mutations are required to form a p-methyl-L-tyrosine binding pocket.
  • the E107T and L162P mutations appear to be either naturally or indirectly affected mutations because they are not close to binding tyrosine.
  • Stearo1 ⁇ 2er 3 ⁇ 4? Computer with Ja / jas / TyrRS structure based on 7i / sTyrRS structure — Gluul 07 and Leul 62 are located away from the tyrosine bond ⁇ , and indirectly L— It has also been shown to contribute to the elimination of tyrosine.
  • FIG. 4 it is possible to obtain new information on the details of the amino acid binding site for more effectively creating the unnatural amino acid specificity.
  • a D286R mutant that efficiently recognizes amber suppressor-tRNA (C34G mutant of tRNA T5T ) was obtained. Since this mutant has a low ⁇ to suppressor-tRNA, it may be possible to co-crystallize with the tRNA.
  • variants that specifically recognize various unnatural amino acids have been obtained (References 4, 5, 11, 13 and 24). In the structure of the complex determined this time, it was revealed that the recognition mechanism of the tyrosine side chain at the tyrosine binding site was similar to that of the previously determined structure of stearothermophilus TyrRS.
  • the determination of the structure of the M.; masc complex allows modification based on the structural information of the substrate binding site and the tRNA binding site.
  • the structure of stearothermophilus TyrRS was used to infer the structure of the substrate binding site, but the arrangement of the fine residues was different.
  • Glul07 of M. J'a / 3 / zasdz TyrRS has the primary sequence B. It corresponds to Asnl23 of TyrRS, but B.
  • V 6A 00 " ⁇ 86 • on HI ⁇ 8 • ⁇ f 6 V 3W 03 ⁇ V
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Abstract

配列番号1で表されるアミノ酸配列において、「Tyr32、His70、Asp158」のうちの1以上、又は「Tyr32、Asp158、His177」のうちの1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、かつチロシンを基質とするアミノアシルtRNA合成酵素活性よりも3-ヨードチロシンを基質とするアミノアシルtRNA合成酵素活性が高められた変異TyrRS、又はAsp286が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異TyrRSであって、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるTyrRSに比べて、アンバーサプレッサーtRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異TyrRSである。

Description

明細書
チロシル t RNA合成酵素の変異体及びその作製方法 技術分野
本発明は、 メタノコッカス .ジャナシィ Okthanococcus j annas chii；以下、 M. ゾ^?/? a 力 77と記載する） のチロシル t RNA合成酵素 （以下、 TyrRSと記載す る） Zチロシン tRNA (以下、 tRNAT"と記載する） ZL—チロシンの三重複合体の結 晶、 チロシン結合ポケットを有する TyrRS、 チロシンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性 （以下、 aaRS活性と記載する） よりも 3—ョードチロシンを基 質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSとその作製方法、アンチコドン G 34結 合ポケットを有する TyrRS、 野生型の TyrRSに比べて、 アンバーサプレッサー tRNA に対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRS、アン バーサプレッサ一 tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異 TyrRS とその作製方法、 チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基 質とする aaRS活性が高められ、 かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、アンバーサブレッサ一 tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高 められた変異 TyrRS、チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット、ポリべ プチドの製造方法に関する。
本出願は、 2003年 2月 10日に出願された日本国特許出願第 2003 -3 2932号に対し優先権を主張し、 その内容をここに援用する。 背景技術
現在、 今までにない有用な性質をもつタンパク質をデザインし、 生産するうえ で、 人為的に非天然型アミノ酸をタンパク質に導入する方法が注目されている。 例えば、 非天然型アミノ酸を含むタンパク質 [Koideら、 Proceedings of the National Academy of Sciences, 第 85卷、 1988年、 p.6237-6241 (文献 1) ] は、 分子内標識 [Nowakら、 Science, 第 268巻、 1995年、 .439-442 (文献 2)及び Short ら、 Biochemistry, 第 39巻、 2000年、 p.8768-8781 (文献 3) ] 、 タンパク質同士 のクロスリンク [Chinら、 Journal of the American Chemical Society, 第 124 巻、 2002年、 . 9026-9027 (文献 4 ) 及び Chinら、 Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of Amer ica, 第 99巻、 2002年、 p. 11020-11024 (文献 5 ) ] 、 X線や NMRによる構造解析 [Hendricksonら、 The EMBO Journal 第 9巻、 1990年、 p. 1665- 1672 (文献 6 ) 及び Yabukiら、 Journal of Biomol ecular NMR, 第 11巻、 1998年、 . 295-306 (文献 7 ) ] 、 さらにシグナル伝 達系の解析 [文献 2及び Luら、 Molecular Cel K 第 8巻、 2001年、 . 759-769 (文 献 8 ) ] に用いられている。 部位特異的に非天然型アミノ酸が導入されたァロプ 口ティンを効率よく生産するためには、アミノアシル合成酵素（以下、 aaRSと記載 する） の tRNAやアミノ酸に対する特異性を改変することで、 遺伝暗号系を拡張す ることが不可欠である。
そのためにはまず、 改変された aaRS (aaRS*)は、 非天然型アミノ酸を改変され た tRNA (tRNA*) と共有結合させる特性を有しなければならない。 一方、 tRNA*は 61種類のセンスコドンとは対合してはならず、 他のコドン、 例えばアンバーコド ンなどと対合する性質をもたなければならない [ Wangら、 Chemical Co腿 unicat ions、 2002年、 . 1-11 (文献 9 ) ] 。 さらには、 その aaRS* · tRNA*ぺ ァは、宿主翻訳系の他のどの aaRS · tRNAのペアとも相互作用しない、 「直交した」 関係であることが必須である （文献 9 ) 。 すなわち、 aaRS*は tRNA*以外をァミノ ァシル化せず、 tRNA*は aaRS *以外にアミノアシル化されないことが必要である。 そのような直交した aaRS* · tRNA*ペアを実現するために、 他生物種のペアを宿 主の系に導入する方法が取られてきた。 出芽酵母のフエニルァラニル tRNA合成酵 素 · tRNAPheペアを大腸菌に導入し、 7"フルオロフェニルァラニンをアンバーコド ン特異的に導入したのが最初の試みであった [Furter、 Protein Science 第 7巻、 1998年、 p. 419-426 (文献 1 0 ) ] 。 現在のところ、 遺伝暗号の拡張は、 真正細菌 である大腸菌 [文献 4、 5、 及ぴ ½ngら、 Science, 第 292巻、 2001年、 ρ· 498- 500 (文献 1 1 ) 、 Wangら、 Journal of American Chemical Soc ietyヽ 第 124卷、 2002 年、 p. 1836-1837 (文献 1 2 ) 、 Santoroら、 ature Biotechnology, 第 20卷、 2002 年、 p. 1044- 1048 (文献 1 3 ) ] と、 真核生物 [小麦胚芽抽出液について、 Kiga ら Proceedings of the Nat ional Academy of Sc iences of the Uni ted States of America, 第 99巻、 2002年、 . 9715-9723 (文献 1 4 ) ；及び哺乳動物細胞につい て、 Sakamotoら、 Nucleic Acids Research, 第 30巻、 2002年、 .4692-4699 (文献 1 5) ] で成功している。 いずれの例も、 TyrRS変異体とアンバーサブレッサ一化 された ΝΑΤ のペアの導入で遺伝暗号を拡張している。 それらの系では、 真正細 菌型 TyrRS · tRMTyfと古細菌/真核生物型 TyrRS · tRNAT は、 それぞれのグループ内 ではアミノアシル化するが、 互いのグループ同士ではアミノアシル化できない直 交の関係にある [Chowら， Jounal of Biological Chemistry, 第 268巻、 1993年、 p.12855-12863 (文献 1 6 ) 、 Quinnら、 Biochemistry, 第 3 4巻、 1995年、 p.12489-12495 (文献 17) 、 Fechterら、 European Journal of Biochemistry. , 第 268巻、 2001年、 p.76卜 767 (文献 18) ] ことが鍵となっている。
例えば、 古細菌 j纖 aschi i^ · tRNATyi"ペアは大腸菌の系で、 逆に大腸 菌 Ty r RSと 3 c / / / 5 / ea 0 thermoph ilus t RNATyrのペアは哺乳動物細胞の系で直交 したペアとなるために、 それらの人工遺伝暗号の拡張に使われた [文献 1 5及び Wangら、 lournal of the American Chemical Society, 第 122巻、 2000年、 p. 50 10 - 50 1 1 (文献 1 9) ] 。
TyrRS - tRNATyrペアの直交性は、 古細菌/真核生物と真正細菌の間での TyrRSの tRNA認識機構の違いに由来する。 TyrRSは、対応する tRNAが持っているアイデンテ ィティ決定因子という一部のヌクレオチド配列で tRNAを識別する [Giegeら、 Nucleic Acids Research、 第 26巻、 1 998年、 p. 5017-5035 (文 献 20) ] 。 古細菌および真核生物の tRNA は、 特徴的な C1:G72塩基対 [Marck ら、 RNA、 第 8巻、 2002年、 p. 1 189- 1232 (文献 21) ] 、 ァ ンチコドン、そして A73をアイデンティティ決定因子として持つ（文献 18及び 2 0) 。 一方、 真正細菌では、 アンチコドン、 A73は同じであるが、 全く逆の G1:C72 塩基対と特徴的な長いバリアブルア一ム （文献 21) をアイデンティティ決定因 子として持つ [Himenoら、 Nucleic Acids Research 第 18卷、 1990年、 p. 68 1 5 -68 19 (文献 22) ] (図 1)。 真正細菌と真核生物の tRNATyfの 1 :72 塩基対をそれぞれ C1:G72、 G1:C72に逆転させると、 バリアブルアームの長さに関 わらず、 TyrRSによる種特異的な認識が逆転する [Wakasugiら、 The EMBO Journal 第 17巻、 1998年、 p. 297 - 305 (文献 23) ] 。 そのことから、 真 正細菌型、 せ細菌/真核生物型 TyrRS共に tRNAの 1 :72塩基対が認識の要となってい ることが示唆されている。
TyrRSの一次構造においても、 古細菌、 真核生物由来の TyrRSは互いに似ている のに対し、 それらの TyrRSと真正細菌の TyrRSとは類似性が低い (図 2)。 例えば、 PSI -BLASTプログラム (ht tp : //www. ncbi . nlm. nih. gov/b l as t/) で配列相同性を 解析すると、 M.ゾ3 ?？ /とヒトの TyrRSの間には 59%の類似性が見出されるのに 対し、 M. jannaschiiと B. Wearひ/力 の TyrRSの間では e- valueが 0. 22と 高く、 全体的な類似性は見出されない。
M. ya/M/ //の TyrRSのアミノ酸特異性の改変は、 すでにインビポスクリ一二 ングシステムで成功している [文献 4、 5、 1 1— 1 3、及びブリックら、 Journal of Mol ecul ar Bi ol ogy, 第 208巻、 1989年、 ρ· 83- 89 (文献 2 4 ) ] 。 そしてこれ までに、 . ゾ' d?7' の TyrRSから、 図 2 4に示す側鎖を有するチロシン誘導体 を基質として認識する変異 TyrRSが取得されている。 ところが、 これらの改変すベ ての置換の標的残基は、 B. 5 /earo/ /^ カ//^の TyrRS結晶構造に基づいて選択 されたものである。 上述の如く、 TyrRSの一次構造においても、古細菌、 真核生物 由来の TyrRSと真正細菌の TyrRSとは類似性が低いことを考慮すると、 B. /earo er /^/ iwの TyrRS結晶構造に基づいて古細菌や真核生物の TyrRSの改変 のための変異箇所を選択することは、 その有効性が必ずしも保証されたものでは ない。 発明の開示
本発明は、 M. a/? ? 7' /の TyrRSZtRNA^/L—チロシンの三重複合体の結晶、 チロシン結合ポケットを有する TyrRS、チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3— ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSとその作製方法、ァ ンチコドン G 3 4結合ポケットを有する TyrRS、 野生型の TyrRSに比べて、 アンバ 一サブレツサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴と する変異 TyrRS、アンバーサブレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高 められた変異 TyrRSとその作製方法、チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョ 一ドチロシンを基質とする aaRS活性が高められ、 かつ配列番号 1で表されるアミ ノ酸配列からなる TyrRSに比べて、ァンバ一サプレッサー tRNAに対するァミノァシ ル化反応速度が高められた変異 TyrRS、チロシン誘導体組み込みポリぺプチド製造 用キット、 ポリペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、 以下の結晶を提供する。
( 1 ) 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 4006で規定される構造を 有する、 M. //'の TyrRS/ NATyr/L—チロシンの三重複合体の結晶。
( 2 ) 空間群が 3 1であり、単位格子が、 a=b=86.8A (8.68nm)、 c=156A (15.6nm) の寸法を有する、 TyrRS/ tRNATyFZL—チロシンの Ξ重複合体の結晶。
本発明は、 以下のチロシン結合ポケットを有する TyrRSを提供する。
(3) 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 2415で規定される構造に おいて、 アミノ酸残基 Ty r 32、 I l e 33、 G l y 34、 Phe 35、 G 1 u 36、 Leu65、 A 1 a 67, H i s 70、 Ty r l 51、 G l n l 55、 As p 158、 G 1 n 173, 及び H i s 177によって規定されるチロシン結 合ポケッ卜を有する TyrRS。
本発明は、前記（ 3)のチロシン結合ポケット構造の情報から、下記の変異 TyrRS とその作製方法を提供する。
(4) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 「Ty r 32、 H i s 7 0、 As p i 58」 のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換し た配列、 又は 「Ty r 32、 As p l 58、 H i s l 77」 のうちの 1以上のァ ミノ酸残基を別のァミノ酸残基で置換した配列からなり、 かつチロシンを基質と する aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高められたこと を特徴とする変異 TyrRS。
(5) (4) の変異 TyrRSにおいて、 「Ty r 32、 H i s 70、 As p l 58」 が 「Ty r 32、 A l a 70、 Th r l 58」 に置換された配列、 又は 「Ty r 32、 H i s 70、 As p l 58」 が「Th r 32、 Th r 70、 G l u l 58」 に置換された配列からなることを特徴とする変異 TyrRS。
(6) (4) 又は （5) の変異体のアミノ酸配列において、 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつチロシ ンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高め られたことを特徴とする変異 Ty rRS。 (7) チロシンを基質とする aaRS活性よりも所望のチロシン誘導体を基質とす る aaRS活性が高められた変異 Ty r RSを作製する方法であって、
(A) 表 3に示される原子座標に基づいて、 前記チロシン結合ポケット構造を 構成するァミノ酸残基から少なくとも 1つ選択し、
(B)選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異 TyrRS ライブラリ一を作製し、
(C)変異 TyrRSライブラリーから、チロシンを基質とする aaRS活性よりも目的 のチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められたものを選択することを含む ことを特徴とする方法。
(8) 前記工程 （A) において、 表 3に示される原子座標に基づいて、 チロシ ン結合ポケットを構成するアミノ酸残基から 3個選択することを特徴とする、 変 異 TyrRSを作製する方法。
(9) 前記チロシン誘導体が 3位置換チロシンであることを特徴とする、 変異 TyrRSを作製する方法。
(10) 前記工程（A)で選択したアミノ酸残基が、 Ty r 32、 H i s 70、 及び A s p 158の組み合わせ、 又は、 Ty r 32、 As p l 58、 及び H i s 177の組み合わせであることを特徴とする、 変異 TyrRSを作製する方法。
さらに、本発明は下記のアンチコドン G 34結合ポケットを有する TyrRSを提供 する。
(1 1) 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 2415で規定される構造 において、 アミノ酸残基 Ph e 261、 H i s 283、 P r o 284、 Me t 2 85、 及び As p 286によって規定されるアンチコドン G 34結合ポケットを 有する TyrRS。
さらに本発明は、 前記 （11) のアンチコドン G 34結合ポケット構造から得 られる情報に基づいて、 下記の変異 TyrRSとその作製方法を提供する。
(12) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において As p 286が別のアミ ノ酸残基で置換された配列を有する変異 TyrRSであって、配列番号 1で表されるァ ミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、ァンバーサプレッサー tRNMこ対するァミノア シル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRS。 (13) 前記 As p 286が、 G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置換されたもの であることを特徴とする、 変異 TyrRS。
(14) (12) 又は （13) の変異 TyrRSのアミノ酸配列において、 1若しく は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、ァンバーサプレッ サー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRSo
(1 5) チロシンを基質とする aaRS活性よりもチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSにおいて、配列番号 1における A s p 286に相 当するアミノ酸残基を G 1 n、Ar g、又は Ty rで置換することを特徴とする、 アンバーサブレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異 TyrRSの作製方法。
(16) (15) の方法により作製され得る変異 TyrRS。
さらに、 本発明は、 下記の変異 TyrRSとその作製方法を提供する。
(17) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 H i s 70が A 1 aで 置換され、 As p 158が Th rで置換され、 かつ A s p 286が G 1 n、 Ar g、 又は T y rで置換された配列、
又は T y r 32が T h rで置換され、 H i s 70が T h rで置換され、 A s p 1 58が01 \1で置換され、 かつ A s p 286が G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置 換された配列
からなり、 チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とす る aaRS活性が高められ、 かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRS に比べて、 アンバーサブレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高めら れたことを特徵とする変異 TyrRS。
(18) (17) の変異 TyrRSのアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活 性が高められ、 かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、 ァンバーサプレッサ一 NAに対するァミノアシル化反応速度が高められたことを 特徴とする変異 TyrRS。
さらに、 本発明は、 下記のチロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット 及びポリペプチドの製造方法を提供する。
( 1 9 ) ①細胞抽出液、
②前記のいずれかの変異 Ty rRS、
③前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物 由来のサプレッサー tRNA
とを具備した、 チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット。
( 2 0 ) 前記いずれかの変異 TyrRSと、 前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導 体と結合可能な、 古細菌又は真核生物由来のサブレッサー t RNAとを用いたポリべ プチド合成系によって、 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子を用 いて、 非天然型アミノ酸を含んだポリぺプチドを発現させることを特徴とする、 ポリペプチド合成方法。
( 2 1 ) (A)前記いずれかの変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現ベクターと、
( B )前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサブレッサー tRNAを、 前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
( C) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌を、 その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を 添加した培地で、 適当な条件でインキュベートすることにより、 真正細菌内で、 チロシン誘導体組み込みポリぺプチドを発現させることを特徵とする、 ポリぺプ チドの製造方法。
( 2 2 ) (A)前記いずれかの変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現ベクターと、
(B )前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサブレッサー tRNAを、 前記細菌内で発現させる発現べクタ一と、
( C ) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌。 図面の簡単な説明
図 1は、 tRNATyrと TyrRSの配列の比較を示すもので、 tRNATyr種の二次構造を示す 図である。 M. ゾ a/? ^/' とイーストの tRNA 配列は、 転写体として示される。 矢 印で示す文字と枠で囲んだ領域は、 各 tRNAT の同じアイデンティティエレメント を示す。
図 2は、 TyrRSの配列ァラインメントを示す図である。配列は順に jannaschii, Archaeoglobus fulgidus,ヒ卜、酵母（糸田月包質）及び ゾゾ stearotlwr卿 hi 1 lus、 Thermus thermophi lus ^ M. JannascJii i tT. ther卿 hi lusT yて RSの二 次構造エレメントを、 各々、 アラインメントの上と下に示した。 コイルは《ヘリ ックスであり、矢印は ]3ストランドである。文字は、保存されている残基を示す。 アラインメントは、 CLUSTALX (トンプソンら、 Nucleic Acids Research, 第 25巻、 4876-4882頁、 1997年）で行ない、 M. jannaschi iと T. /力 // の二次構造に 基づき互いに修正した。
図 3は、 プラスミド pMYR- Lac(Am)の構造を示す図である。 M J YR 1 ： M. ゾ a/was /'/サプレッサー NA遺伝子を含む DNA断片。 PEYR：発現用プロモ 一夕を含む断片。 LacZ(amb)： a- lac (Am)を含む DN A断片。
図 4は、 yavM ^7 TyrRSのチロシン結合ポケットを示す図である。黒は〇、 斜線は Nを表す。
図 5は、 ゾ a/M /' TyrRSの、 tRNATyrアンチコドンの G 34結合ポケットを 示す図である。 黒は〇、 斜線は Nを表す。
図 6は、 . /?? 7 TyrRS/tRNATyr/L-チロシン複合体の構造を示す、 リポ ンモデルのステレオ図である。 2つのチロシン分子は、 CPKモデルにより示さ れる。 tRNAT 分子の残基 2 03— 2 0 9と 3 '末端 C C A鎖は、 ディスオーダー されているので示されていない。
図 7は、 1つの TyrRSサブユニットの分子構造のステレオ図である。 Cひ位だけ が示される。 各 2 0番目の残基が、 黒丸で示される。
図 8は、 1. 9 5 Α(1.95Χ1(Γ1ΜΙ)解像度でのチロシン結合ポケットの周囲の I FO-F c Iシュミレーテッドアニーリングオミット電子密度図 （3. 0 σ) のステレオ図である。
図 9 Α及び図 9 Βは、 TyrRS · tRNA の全体構造を比較するもので、 図 9 Aは、 M. yaw? ' とヒトとを重ね合わせたステレオ図、 図 9 Bは、 M. jannaschiit T. / / 7'/ひ 5を重ね合わせたステレオ図である。
図 1 0は、 Μ. ゾ a/H? / TyrRSの C末端ドメイン中に挿入された ]3— 310— iSモチーフを示す図である。
図 1 1は、図 9 Bに相当するものを二回軸からみた重ね合わせを示す図である。 図 1 2は、 TyrRSのァクセプ夕ーステム認識を示す図であって、 M. jannaschii TyrRSのァクセプタ—ステム結合部位のステレオ図である。
図 1 3は、 M.ゾ a/w? c力/複合体の tRNATyfの最初の塩基対の周囲の概略図 （ステ レオ図） である。 tRNAをリポザィムの自己切断反応によって生成させたため、 tRNA の 5 '末端のリン酸がない。 各 tRNA のヌクレオチド 1、 7 2、 7 3がス ティックモデルで示される。 水素結合と他の相互作用は、 破線で示す。 リポンモ デルでは、 N末端領域 T、 ロスマンフォ一ルドドメイン、 CP 1ドメインが示さ れる。
図 14は、 T. 77zwでの対応する図である。各 tRNATyrのヌクレオチド 1、 7 2、 7 3がスティックモデルで示される。 水素結合と他の相互作用は、 破線で 示す。 リポンモデルでは、 N末端領域 T、 ロスマンフォールドドメイン、 CP 1 ドメインが示される。
図 1 5は、 TyrRSのアンチコドン認識を示すもので、 . ya/w? d// TyrRSによる アンチコドン認識を示すステレオ図である。 水素結合は破線で示される。 アンチ コドントリプレットは、 スティックモデルで示される。 C末端ドメインはリポン モデルで示される。
図 1 6は、 T. /^ / 複合体の対応図 （ステレオ図） である。 水素結合は 破線で示される。 アンチコドントリプレットは、 スティックモデルで示される。 C末端ドメインはリポンモデルで示される。
図 1 7は、 野生型と、 いくつかの変異体によるアミノアシレ一シヨンの初期速 度の比較を示すグラフである。
図 1 8A及び図 1 8 Bは、 Lーチロシンの側鎖を認識する TyrRSのアミノ酸残基 を示す （ステレオ図） もので、 図 1 8八は .ゾ3/？ // //三重複合体のアミノ酸結 合部位を示し、 図 1 8 Bは、 . s t ea r 01 h e rnwph i 1 u s 、 iである。 M. jannaschii の 2つの残基、 Glul07、 Leul62は、各々、 B. s t e a r o t h e rmoph i 1 usの ew に対応する。
図 1 9は、 ネイティブ（左）及びセレノメチォニン標識（右） TyrRS · tRNATyr · チロシン複合体の結晶の写真である
図 2 0は、 ネイティブ結晶の回折像である。 矢印は 1 . 9 5 Α( 1.95 χ 10-½η) 分解能に相当する。
図 2 1は、 セレノメチォニン標識複合体結晶の S e原子の XA F Sスペクトル を示す。 回折データの測定は矢印で示すピーク波長で行なった。
図 2 2は、 セレノメチォニン標識複合体の異常分散差フーリエ図 （4びカット オフ）である。セレノメチォニン側鎖をスティックモデル、 TyrRSの主鎖はリボン モデルで示す。
図 2 3は、 TyrRS ' tRNATyt>複合体のクリスタルパッキング（ステレオ図） を示す 図である。 中央に、 結晶学的対称でダイマ一化した分子が見える。
図 2 4は、 j'azwasdz/iの TyrRS変異体によつて特異的に認識される非天然型 のアミノ酸を示すもので、 側鎖のみを示した図である。
図 2 5は、 janmschiiの のァミノ酸配列を示す。 *は翻訳終止を示す。 図 2 6は、 GFPuv(ajnber)の発現を調べた SDS-PAGEのゲルの写真である。
図 2 7は、 TT1865の発現を調べた SDS- PAGEのゲルの写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 チロシン誘導体とは、 チロシンを構成する原子のいずれかに 任意の置換基が導入されたものをさし、 置換基の導入される位置に制限はない。 具体的には、例えば、図 2 4に挙げる側鎖を有するチ口シン誘導体が挙げられる。 本発明の TyrRS変異体は、アミノ酸配列の中に特定の位置に変異を有し、所望の 活性を維持する限り、 その他の位置のアミノ酸残基については、 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたものも包含するものとする。
同様に、本発明の TyrRS変異体は、ァミノ酸配列の中に特定の位置に変異を有し、 所望の活性を維持する限り、 その他の位置のアミノ酸残基については、 7 0 %以 上の相同性、 好ましくは 8 0 %以上の相同性、 より好ましくは 9 0 %以上の相同 性を有するものも包含するものとする。 (1) 三重複合体の結晶構造
本発明は、 高分解能三次元構造及び X線結晶学により決定した、 三重複合体の 原子構造座標を提供する。 三重複合体の結晶化、 及びその構造座標の X線解析の ための具体的な方法は、 実施例に記載した通りである。
本発明の jannaschii の TyrRSと · ya/w? /'/'の tRNAT と Lーチロシンと の三重複合体（以下、 TyrRSZtRNA^ZL—チロシンの三重複合体という） の結晶 は、空間群が 1であり、単位格子が、
Figure imgf000013_0001
(15.6nm) の寸法を有するものである。 ここで、 単位格子とは、 結晶の最も小さく単純な体 積要素をさし、 空間群とは単位格子の対称性をさす。
1. 95 A (Ι^δΧΙΟ-'ηηι) の分解能で得られた本発明の TyrRSZtRNA^ZL _ チロシンの三重複合体の原子構造座標を表 3に示す。 表 3に示した原子座標にお いて、 原子番号 1から 241 5は Ty r RS、 2416から 2428は Lーチロ シン、 2429から 4006は t RNA、 4007から 4374は捕捉された水 に相当する。
本発明において、 TyrRSZtRNAT"ZL—チロシンの三重複合体の原子構造座標と は、 表 3に示された座標と一致又は実質的に一致するものをさし、 より具体的に は、 表 3に示した座標に関し、 バックボーン原子 （N、 Co!、 C及び O) を用い てそれを重ね合わせたときに、 約 1. 5 A (0.15nm) 以下、 好ましくは約 1. 0 A (0. lnm) 以下、 より好ましくは 0. 5 A (0.05nm) 以下の二乗平均偏差をもつ ものを意味する。
表 3に示される原子座標は、 tRNATyfと Lーチロシンに結合した . jannaschii の TyrRSの立体構造を反映するものであり、多くの有用な情報を提供する。中でも、 古細菌の TyrRS改変を行なうためのアミノ酸置換の位置の特定に用いることがで きる。 また、 上述のごとく、 古細菌と真核細胞における TyrRSの類似性から、 表 3 に示される真核生物の TyrRS改変を行なうためのアミノ酸置換の位置の特定のた めにも用いることができると考えられる。
より具体的には、 以下に詳述するように、 表 3の原子座標データを解析した結 果、 TyrRSに存在するチロシン結合ポケット構造と、アンチコドン G 34結合ボケ ット構造とが明らかになった。 また、 実施例の欄で詳述するように、 tRNAのァク セプ夕一ステム認識に関与する部位についても、 表 3の原子座標データより新た な情報を得た。 '
(2) チロシン結合ポケット
本発明において明らかにされた、 TyrRSのチロシン結合ポケット構造とは、表 3 に示される原子座標の原子番号 1から 24 1 5で規定される構造を有する . ゾ /; c力ゾ の TyrRSにおいて、アミノ酸残基 Ty r 32 (原子番号 259〜270)、 I 1 e 33 (原子番号 27 1〜278)、 G l y 34 (原子番号 279〜 282 )、 Ph e 35 (原子番号 283〜293)、 G l u 36 (原子番号 294〜 302 )、 L e u 65 (原子番号 525〜532)、A 1 a 67 (原子番号 541〜 545 )、 H i s 70 (原子番号 562〜 57 1) 、 Ty r 1 51 (原子番号 1230〜 1 241) 、 G 1 n 1 55 (原子番号 1265〜 1273) 、 A s p 1 58 (原子 番号 1289〜 1296) 、 G 1 n 173 (原子番号 1398〜 1406) 、 及 び H i s 177 (原子番号 1435〜1444)によって規定されるものである。 このチロシン結合ポケットを拡大した図を図 4に示す。 図 4において、 点線は 水素結合を意味する。 このチロシン結合ポケット構造において、 Lーチロシンが 認識されるメカニズムは以下の通りであると考えられる。
ポケッ卜の入り口の近くでは、 基質の L—チロシンのァミノ基と力ルポニル基 が、 G 1 n 173、 Ty r 1 5 1及び G 1 n 1 55で水素結合ネットワークを形 成する。 すなわち、 基質の Lーチロシンのアミノ基は、 G l n l 73の力ルポ二 ル基、 Ty r 1 51のヒドロキシル基及び G 1 n 1 55のカルポニル基と、 各々 水素結合を形成し、 基質の L—チロシンの力ルポニル基は、 G 1 n 1 73のアミ ノ基と水素結合を形成し、 さらに G 1 n 173のカルポニル基と G 1 n 1 55の ァミノ基で水素結合を形成する。
チロシンの芳香環は、 L e u 65、 H i s 70、 及び G 1 n 1 55の側鎖によ り認識され、 さらに、 I l e 33、 G l y 34、 P h e 35の主鎖によっても認 識される （チロシンの後ろ側、 図 4には示さず） 。 チロシンの芳香環のヒドロキ シル基は、 ポケットの内部の Ty r 32と As p l 58で水素結合により認識さ れる。 水分子は、 H i s 1 7 7と T y r 3 2により水素結合で捕捉され、 チロシ ンの側鎖にも近位である。
このチロシン結合ポケッ卜が、野生型の Ty rRSのチロシンに対する基質特異性を 決定するものと考えられる。そこで、 TyrRSのチロシンに対する基質特異性を改変 するには、 このチロシン結合ポケットを構成するアミノ酸残基を変異させること が有効であると考えられる。
( 3 ) TyrRSの基質特異性変異体の作製方法
本発明は、 前記チロシン結合ポケット構造の情報に基づき、 チロシンを基質と する aaRS活性よりも所望のチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められた変 異 TyrRS (以下、 単に本発明の基質特異性変異 TyrRSともいう） を作製する方法を 提供する。 すなわち、
(A) 表 3に示される原子座標に基づいて、 前記チロシン結合ポケット構造を 構成するァミノ酸残基から少なくとも 1つ選択し、
( B )選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異 TyrRS ライブラリ一を作製し、
( C )変異 TyrRSライブラリーから、チロシンを基質とする aaRS活性よりも目的 のチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められたものを選択することを含む ことを特徴とする方法である。
本発明において、 チロシンを基質とする aaRS活性よりも目的のチロシン誘導体 を基質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSとは、チロシンよりも所望のチロシ ン誘導体に対する基質親和性が高められた変異 TyrRSということもできる。チロシ ンょりも所望のチロシン誘導体に対する基質親和性が高められたとは、 目的のチ 口シン誘導体に対する活性値 （反応速度 c a tをミカエリス定数 Kmで割つた値） が、 チロシンに対する活性値よりも大きいものをいう。 活性値はインビトロのァ ッセィによって測定できるが、 遺伝学的なデータから活性値の相対的な大きさを 判定することもできる。
工程 （A) において、 置換基を導入する原子は、 チロシンの芳香環を構成する 炭素のいずれでもよい。 特にチロシン芳香環を構成する 2位又は 3位の炭素原子 に置換基を導入したい場合は、 チロシンの線対称性により、 2箇所ずっとなる。 チロシン芳香環の 4位のヒドロキシル基を別の置換基に変えたチロシン誘導体で もよい。 上述したように、 すでに、 図 2 4に示すような種々のチロシン誘導体に 基質特異性を有する変異体が取得されていることから、 M.ゾ aim 7'の変異より、 多様な基質特異性を有し得ることは実証されている。 本発明の方法においては、 より合理的に変異の箇所が特定できるので、 すでに基質となり得ることが知られ ているチロシン誘導体につい 、 より基質特異性が高められた変異体の取得が可 能となるだけでなく、 新たな位置や種類の置換基を有するチ口シン誘導体に対し て基質特異性を有する変異体が取得できる可能性が開かれた。
工程 （B ) において、 選択したアミノ酸残基について、 別のアミノ酸残基で置 換した変異 TyrRSライブラリーを作製する。
アミノ酸残基を複数選択した場合は、 P C R等を用いた公知の遺伝子操作技術 によるァミノ酸残基のランダム置換を行なうことができる。
例えば、 2通りの 3位置換について、 アミノ酸残基を 3個選択した場合は、 試 みるべきアミノ酸置換の組み合わせは 2 0 3通りずつ、 合わせて 1 6 0 0 0通り である。 遺伝子上のこれらの 3つの位置に対応するヌクレオチド残基 （それぞれ 合わせて 9残基） をランダムな配列に変えた変異遺伝子のライブラリ一を P C R を利用して作製することができる。
従来の報告 （文献 4、 1 1、 1 2及び 2 4 ) では、 チロシン誘導体特異的^ ゾ d / TyrRSを得るために、 フエノ一ル環上の置換基の位置に関わらず、 B. s tearo thermophi lus TyrRSの立体構造に基づいてチロシン認識に関与するァミノ 酸残基を 5か所推定して、 これらをランダムに置換している。 この方法では、 1 種類の改変体 TyrRSを得るために 2 0 5通りのアミノ酸置換の組み合わせを調べ る必要があった。 本発明を用いると、 置換の位置をより限定することができるの で、これより少ない置換基を選択してより効率的に目的の TyrRS改変体を得ること が可能である。
工程 （C ) における選択は、 アンバーサブレッサー NAと組み合わせて、 大腸 菌などで発現させ、 チロシン （+ ) チロシン誘導体 （―） の培地では、 アンバー サブレッシヨンが起こらないが、 チロシン （+) チロシン誘導体 （+) の培地で はアンバーサブレヅシヨンが起こるものを選択すればよい。 例えば、 Lacにァ ンバ—変異を導入した株を、 アンバーサブレヅサ一 tRNAと組み合わせて、 ランダ ムな配列に変えた変異遺伝子のライブラリーで形質転換し、 チロシン （+ ) チロ シン誘導体 (-) の培地では、 アンバーサブレヅシヨン （Lac—) が起こらな いが、 チロシン （+ ) チロシン誘導体（+ ) の培地ではアンバーサブレヅシヨン (Lac+) が起こるものを選択すればよい。
このようなポジティブセレクションを用いれば、 多くの形質転衡朱から目的の ものを簡便に選択することができる。 以下、 本発明の変異 TyrRSの作製方法を用いて、 jan schii TyrRSのァミノ 酸特異性の改変手法の一例について具体的に説明する。
[11 M. jannaschii TyrRS遺伝子の入手
M. Jannaschii TyrRS遺伝子の既知の塩基配列 (GenBank ID: 1591094) (配列 番号 2) をもとに PCRプライマー 1, 2 (各々、 配列番号 3、 4) を設計し、 これ らのプライマ一を用いて、 遺伝子の全長を、 jannaschiiゲノム (ATCC bioproducts社から購入）を铸型とした PCI こよつて遺伝子の全長を含む DNA断片を 得ることができる。
(ATCC bioproducts , htt ： / /雨 · at c c · org/Produc ts/Pur if iedDNA. cfm/)
[2] J'a/Masc TyrRSの大腸菌内での発現用プラスミド pMYSの作成
[1] で得た DNA断片は両末端に制限酵素 Λ¾Ι部位と 部位をそれぞれ持つ ので、 これら 2つの制限酵素で処理した後、同様に処理した発現用ベクター pCBSl
(FEBS Letter Vol. 462, pp. 302-306， 1999) とリガ一ゼによって結合させてプ ラスミド pMYSを作成する。 このプラスミドを大腸菌に導入することにより、 jannaschii TyrRSの大腸菌内で大量に発現させることができる。
[3] jannaschii由来チロシン ·サブレヅサ一 tRNA (以下， Mj sup-tRNA) と アンバー変異を含む c¾伝子の フラグメント （以下， ひ- lac(Am))を両方とも W
17 大腸菌内で発現するためのプラスミド pMYR- Lac (Am)の作製
M. / ;? //サブレッサー tRNA遺伝子 （文献 1 1) を含む DNA断片 （配列番号 5) とその発現用プロモータを含む断片 （配列番号 6) を、 ベクター PACYC184 (Journal of Bacteriology Q\. 134, pp. 1141-1156, 1978) の Ba - ff lU 部位， 部位にそれぞれクローニングしてプラスミド pMYRを作製する。 さらに、 pMYRを制限酵素 Iで処理した後、 -lac (Am)を含む DNA断片 （配列番 号 7) とリガーゼによって結合させて、 プラスミド pMYR- Lac (Am)を作製する （図 3) 。
M. ゾ /？ /''サプレッサー tRNA遺伝子を含む DNA断片の塩基配列 （配列番号 5)
CGGCCCGCCGGACCATCAAGCTT
( 1番目と 3番目の下線は、 部位と dl II部位を示す。 2番目の下線は、 M. j annas chii サプレッサ一- tRNAの構造遺伝子領域を示す。 ） 発現用プロモータを含む DNA断片の塩基配列 （配列番号 6 )
AGCAGGCCA6TAAAAAGGATCC
(下線は、 各々^ /1部位と 1部位を示す。 ） α-lac (Am)を含む DNA断片 （配列番号 7 )
CAGACAAGCTGTGACCGGCCG
(下線は、 各々、 ひ- lac遺伝子の開始コドンとアンバーコドンを示す。 ）
[4] M. /awa 力 / TyrRS中のアミノ酸残基でアミノ酸特異性の改変の為に置換 する残基の選択
例えば、 改変によって 3-ョード -L-チロシン （以下， IY) を特異的に認識する変 異 TyrRSを得たい場合は、 TyrRSの L-チロシン結合部位の立体構造 （図 4) におい て、 チロシン環 3位 （左右 2力所） の近傍に位置する次の 3残基を選択する。 右側： N末端から 32番目のチロシン残基 （Tyr32) , His70, Aspl58
左側： Tyr32, Aspl58, Hi si 77
[5] Tyr32, His70, Aspl58の 3残基を同時にそれぞれ 20種類のアミノ酸のいず れかにランダムに置換した変異 TyrRS発現プラスミドの作製
M. jannaschii TyrRS遺伝子中の該当 3アミノ酸残基に対応する塩基配列を NNK
(N： A, G, C, Tのいずれか、 { : 6または1 に置換した遺伝子を次の 2段階の PCR によって作製して、 [2] に記述した方法で大腸菌内で発現させる。
[PCR第 1段階] プライマ一 1一 8を用いた次の 4回の PCRを含む。
PCR.1 プライマ一 1 (配列番号 3) とプライマー 3 (配列番号 8) を用いる。 PCR.2 プライマ一 4 (配列番号 9) とプライマー 5 (配列番号 1 0) を用いる。 PCR.3プライマ一 6 (配列番号 1 1) とプライマ一 7 (配列番号 1 2) を用いる。 PCR.4 プライマー 8 (配列番号 1 3) とプライマー 2 (配列番号 4) を用いる。 反応条件はいずれも次の通りとすればよい。
Pyrobest DNA polymerase (Takara社から購入）、 酵素に添付の反応用緩衝液を 使用し、 反応液の容量は 50マイクロリットルとする。 プライマーは 25ピコモルず つ使用し、 鍀型としてプラスミド pMYSを 1ナノグラム使用する。 反応の温度制御 は次の通りとすればよい。
98度 5分— （98度 10秒— 50度 15秒→72度 X秒） X25回以上→72度 5分 ここで、 Xは 30以上で、 PCRで生成する DNA断片の長さを 500で割って 60を掛けた 値とする。
[PCR第 2段階] PCR.1〜4で得られた PCR産物 10ナノグラムずつを混合して铸型と してプライマ一 1， 2を用いて行う。反応条件、温度制御は X =90とする前記 PCR 第 1段階と同じである。
[6] Tyr32, Aspl58, Hisl77の 3残基を同時にそれぞれ 20種類のアミノ酸のいず れかにランダムに置換した変異 TyrRS発現プラスミドの作製
前記 [5]の手順において PCR第 1段階で用いるプライマーが以下の組み合わせ になる以外は同様に実施する。 プライマー 9、 10 (各々、 配列番号 14、 1 5) に する以外は全て同じである。
[PCR第 1段階]
PCR.1 プライマー 1 (配列番号 3) とプライマ一 3 (配列番号 8) を用いる。
PCR.2 プライマー 4 (配列番号 9) とプライマー 6 (配列番号 1 1) を用いる。
PCR.3プライマー 8 (配列番号 1 3) とプライマ一 9 (配列番号 14) を用いる。
PCR.4プライマー 10 (配列番号 1 5) とプライマ一 2 (配列番号 4) を用いる。
[7] 変異体の選択の方法
大腸菌 MV1184株をプラスミド pMYR-Lac (Am)で形質転換する MV1184*株を作成す る。
MV1184*株に [5] または [6] で作成した変異 TyrRS発現プラスミドをそれぞ れ形質転換法によって導入し、 LB*プレートに播く。 18時間以上 37度で保温した のちに生じたコロニー （8000個以上） を集めて LB«(IY)プレートに再び播き、 24 時間以上保温して再度生じたコ口二一の着色を観察する。
各コロニーは、 それぞれ 1つずつの変異 TyrRS遺伝子のクローンを含んでいる。 変異 TyrRSがプレート中の L-チロシン（または， IYの添加ある場合には， IYまたは L -チロシン） を Mj sup- tRNAに結合させる活性を持つならば、 ひ -lac (Am)遺伝子中 のァンバー変異をサブレツシヨンして青く着色したコロニーを生じる。 よって、 L B « (IY)プレート上の青く染まったコロニーは、 IYまたは L-チロシ ンを M]' sup-tRNMこ結合させる活性を持つ変異 TyrRS遺伝子のク口一ンを含んでい ることがわかる。 そこで、 青く染まったコロニーを 1つずつ プレートと LB (IY)プレート上にそれぞれ移植して、 24時間以上 37度で保温して再度着色を観 察する。 LB η (Π)プレート上では青、 LB プレート上では白になるコロニ一は、 ΙΥのみを Mj sup- tRNAに結合させる活性を持つ変異 TyrRS遺伝子のク口一ンを含ん でいる。 よって， それぞれのコロニーから変異 TyrRS遺伝子を回収する。
各プレートの組成は以下の通りとすることができる。
LB *プレート： 1リットルあたりアンピシリン 100ミリグラム、 クロラムフエニコ ール 25ミリグラムを含んだ L Bプレート。
LB プレート： 1リツトルあたりイソプロピル-卜チォ- D-ガラクトピラノシド 1 mM (最終濃度）、 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル- ;3 - D-ガラクトピラノシド 40 ミリグラム、 IY 0. 1グラムを含んだ LBプレート。
LB （IY)プレート： 1リツトルあたりイソプロピル- 1-チォ- D-ガラクトビラノシ ド 1 mM (最終濃度）、 5 -プロモ- 4-ク口口 -3-ィンドリル- β - D -ガラクトピラノシ ド 40ミリグラム、 ΙΥ 0. 1グラムを含んだ LBプレート。
( 4 ) 基質特異性変異 TyrRS
こうして得られた変異体は、 チロシンよりも所望のチロシン誘導体に対する基 質親和性が高められた変異 TyrRSである。 すなわち、
(A) 表 3に示される原子座標に基づいて、 前記チロシン結合ポケット構造を 構成するァミノ酸残基から少なくとも 1つ選択し、
( B )選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異 TyrRS ライブラリーを作製し、
( C )変異 TyrRSライブラリーから、チロシンを基質とする aaRS活性よりも目的 のチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められたものを選択することを含む 方法により作製された変異 TyrRSは、例えば、後述の方法により、古細菌又は真核 生物由来のアンバーサブレッサー t RNAと組み合わせて、所望の位置にアンバー変 異を受けた所望の遺伝子を発現させることにより、 所望の位置に目的のチロシン を組み込んだポリペプチド生産に好ましく用いられる。 また、 本発明の一態様において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列 （ . ゾ //の野生型の TyrRSのアミノ酸配列； 1文字標記で図 25に示す）におい て、 Ty r 32、 H i s 70、 As p 158のうちの 1以上のアミノ酸残基を別 のアミノ酸残基で置換した配列、 又は Ty r 32、 As p l 58、 H i s 177 のうちの 1以上のァミノ酸残基を別のァミノ酸残基で置換した配列からなり、 か っチロシンを基質とする aaRS活性よりも 3位置換チロシンを基質とする aaRS活性 が高められたことを特徴とする変異 TyrRSは、例えば、後述の方法により、古細菌 又は真核生物由来のアンバーサブレッサー t RNAと組み合わせて、所望の位置にァ ンバー変異を受けた所望の遺伝子を発現させることにより、 所望の位置に目的の 3位置換チロシンを組み込んだポリぺプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異 Ty rRSの一態様によれば、 配列番号 1で表されるアミノ酸配 列において、 Ty r 32、 H i s 70、 A s 158のうちの 1以上のアミノ酸 残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、 又は Ty r 32、 As p l 58、 H i s 177のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列を含 み、 かつチロシンを基質とする aaRS活性よりも 3位置換チロシンを基質とする aaRS活性が高められたことを特徴とする変異 Ty rRSである。 さらに、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 Ty r 32、 H i s 7 0、 As p 158のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した 配列、 又は Ty r 32、 As p 158, H i s 177のうちの 1以上のアミノ酸 残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、 かつチロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高められたことを特 徵とする変異 TyrRSは、例えば、後述の方法により、古細菌又は真核生物由来のァ ンバ一サブレッサー t RNAと組み合わせて、所望の位置にアンバー変異を受けた所 望の遺伝子を発現させることにより、 所望の位置に 3位置換チロシン、 好ましく は 3—ハロゲン化チロシン、 特に 3—ョードチロシンを組み込んだポリペプチド 生産に好ましく用いられる。 本発明の変異 TyrRSの一態様によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にお いて、 Ty r 32、 H i s 70、 As 158のうちの 1以上のアミノ酸残基を 別のアミノ酸残基で置換した配列、 又は Ty r 32、 As p l 58、 H i s 17 7のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列を含み、 か っチロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョ一ドチロシンを基質とする aaRS活 性が高められたことを特徴とする変異 T y r R Sである。 さらに、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 H i s 70が A 1 aで 置換され、 As p 158が Th rで置換された配列 （Ty r 32— A l a 70— Th r 158) 、 又は T y r 32が T h rで置換され、 H i s 70が T h rで置 換され、 As p 158が G 1 uで置換された配列 （Th r 32—Th r 70—G 1 u 158)からなる変異 TyrRSを提供する。 この変異体が実際に 3—ョードチロ シンに対する特異性が高いことは、 前記の選択方法において、 チロシン （+ ) 3 ーョードチロシン （―） の培地では、 アンバーサプレツシヨン （Lac—） が起 こらないが、 チロシン （+ ) 3—ョ一ドチロシン （+) の培地ではアンバーサブ レツシヨン （L a c+) が起こることにより実証されている。
本発明の変異 TyrRSの一態様によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にお いて、 H i s 70が A 1 aで置換され、 A s p 158が Th rで置換された配列 (Ty r 32-A l a 70-Th r l 58) 、 又は Ty r 32が Th rで置換さ れ、 H i s 70が T h rで置換され、 A s p 158が G 1 uで置換された配列（T h r 32 -Th r 70 -G 1 u 158) を含む変異 TyrRSである。
3—ョ一ドチロシン、 3—ブロモチロシンなどの、 3—ハロゲン化チロシンは、 それ自体で生理活性を有する非天然型アミノ酸であり、 ポリぺプチドの部位特異 的ラベルの標的部位ともなる。 したがって 3—ハロゲン化チロシンに対する基質 特異性が高められた本発明の変異 TyrRSは、 3一ハロゲン化チロシンを組み込んだ ァロタンパク質の生産に用いることができ、 このようなァロタンパク質は、 タン パク質機能 ·構造解析の材料として有用であり、 また創薬のターゲットともなる 可能性がある。 W
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(5) アンチコドン G 34結合ポケット構造
M. _/a/w? / TyrRSにおいて、 アンチコドンは C末端ドメインによって認識さ れる （図 6及び図 1 5)。そして、アンチコドンの 1文字目の G34が引き出されて厳 密に認識される （図 1 5)ことがわかった。
こうして明らかとなった本発明のアンチコドン G 34結合ポケット構造は、 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 241 5で規定される構造を有する . ゾ /md? の TyrRSにおいて、 アミノ酸残基 P h e 261、 H i s 283、 P r o 284、 Me t 285、 A s p 286によって形成される、 アンチコドン G 34 結合ポケット構造である。 このアンチコドン G 34結合ポケットを図 5に示す。 このアンチコドン G34結合ポケットにおいては、 G34の塩基部分は Phe261と His283の環の間にスタツキングし、 さらに 1位の窒素原子と 2位のアミノ基は、 共 に Asp286と水素結合によつて認識されている。
この知見に基づき、 本発明者らは、 tRNA^の G34C変異体であるアンバーサブレ ッサー tRNA (チロシンアンチコドン GUAの 1文字目 Gが Cに置換されて、 アン チコドンが C U Aとなったもの）に対するァミノアシル化の効率を上げるために、 286番の残基に変異を導入し、 その有効性を確認した。
こうして、 本発明の一態様は、 配列番号 1に示されたアミノ酸配列のうち、 A s p 286を別のアミノ酸残基で置換した配列を有し、 かつアンバーサブレッサ 一 t RN Aに対するアミノアシル化反応が向上した . ゾ '3/?；7 由来の変異 TyrRSである。
このような変異体を取得する方法としては、 公知の方法のいずれを用いても良 く、 例えば、 目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸 をコードする塩基配列に置換したプライマ一を用いて、 改変すべきアミノ酸をコ ードする塩基配列に置換した DNAを増幅させて、 増幅させた DNA断片を結合 させて、 全長の a aRSの変異体をコードする DNAを得て、 これを大腸菌など の宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。 この方 法において使用するプライマーとしては 20〜70塩基、 好ましくは 20〜 50 塩基程度である。 このプライマーは改変前の元の塩基配列とは 1〜 3塩基がミス マッチとなるので、 比較的長いもの、 例えば 2 0塩基以上のものを使用するのが 好ましい。
本発明者らは、 この A s p 2 8 6置換において、野生型 TyrRSにおいて NAの 34 塩基目にシトシンがくる場合、 G34と同じように塩基が反転した位置に来たとして も、 Asp286と塩基との距離が離れすぎて満足な相互作用は得られない可能性があ ることを考慮して、 Asp286をより大きな側鎖である、 Glu、 Phe、 I le、 Leu, Gin, Arg、 Tyrに置換した変異体を作製した。
これらの変異体について、 アンバーサプレッサー t R N Aに対するアミノアシ ル t R N A合成の初速度を測定した。 その結果を図 1 7に示す。 図 1 7に示した 結果より、 その結果、 Gln、 Arg、 Tyr置換体について顕著な活性の向上がみられる ことがわかる。特に、 A r g置換体 (D286R)では野生型の 8倍の初速度を示した。 こうして、 本発明によれば、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において A s P 2 8 6が別のアミノ酸残基で置換された配列を有する変異 TyrRSであって、配列 番号 1で表されるァミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、 ァンバ一サブレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 T y r R Sが提供される。 特に、 A s p 2 8 6が、 G l n、 A r g、 又は T y rで置換 されたものであることが好ましい。
本発明において、 「反応速度が高い」 とは、 基質濃度と酵素濃度を一定にした ときにその初速度が高いものをいう。 したがって、 その基質に対するミカエリス 定数 Kmが低くなるか、あるいは反応速度定数 Kealが高くなるかのいずれでもよい。 すなわち、配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRS (野生型） に比べ て、 ァンバーサプレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められた変 異 TyrRSとは、ァンバ一サブレッサー tRNAを基質としたときの変異体のミカエリス 定数 Kmが野生型より低いか、又は変異体の反応速度定数 Ke a tが野生型より高い ことを意味する。
この変異 TyrRSは、 古細菌又は真核生物由来のアンバーサブレッサー t RNAと組 み合わせて、 任意の位置にアンバー変異を導入した核酸を発現させることによる ポリペプチド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異 TyrRSの一態様によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にお いて As p 286が別のアミノ酸残基で置換された配列を含む変異 TyrRSであつ て、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含む TyrRSに比べて、アンバーサプレツ サー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRSである。
( 6 ) アンバーサブレッサ一 tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められた 変異 TyrRSの作製方法
本発明は、 さらに、 チロシンを基質とする aaRS活性よりもチロシン誘導体を基 質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSにおいて、配列番号 1における A s p 2 86に相当するアミノ酸残基を G 1 n、 Ar g、 又は T y rで置換することを特 徵とする、 アンバーサブレッサ一 t RN Aに対するアミノアシル化反応速度が高 められた変異 TyrRSの作製方法を提供する。
ここで、 チロシンを基質とする aaRS活性よりもチロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSとは、 上述の 「Ty r 32、 H i s 70、 As p 158」 のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列、 又 は 「Ty r 32、 As p l 58、 H i s l 77」 のうちの 1以上のアミノ酸残基 を別のアミノ酸残基で置換した配列からなる変異 TyrRSの他、 前記文献 4、 11、 及び 12などに記載されたチロシン誘導体に対する基質特異性が高められた変異 TyrRSが挙げられる。本発明の方法は、 これらの基質特異性変異体に対して、 さら に As p 286又はこれに相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換する ことによるものである。 As p 286又はこれに相当するアミノ酸残基は、 周知 の方法で各変異体のアミノ酸配列を決定し、 配列番号 1のアミノ酸配列と比較す ることにより、 容易に決定することができる。
この変異 TyrRSは、 As p 286を置換する前の TyrRSに比べて、 アンバーサブ レッサ一 tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められているので、 古細菌又 は真核生物由来のアンバーサブレッサー tRNAと組み合わせて、 任意の位置にアン バ一変異を導入した核酸を発現させることにより、 任意の位置にチロシン誘導体 を組み込んだポリぺプチド生産に好ましく用いられる。 (7) チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高められ、かつ配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなる TyrRSに比 ベて、 アンバーサブレッサ一 NAに対するアミノアシル化反応速度が高められた ことを特徴とする変異 TyrRS
本発明は、 さらに、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 H i s 70 が A 1 aで置換され、 A s p 158が Th rで置換され （Ty r 32 -A 1 a 7 0 -Th r 158) かつ A s p 286が G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置換され た配列、 又は Ty r 32が Th rで置換され、 H i s 70が Th rで置換され、 A s p 158が G 1 uで置換され （Th r 32— Th r 70— G l u l 58) か つ As p 286が G l n、 Ar g、 又は T y rで置換された配列からなり、 チロ シンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とする aaRS活性が高 められ、かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、アンバ 一サブレッサ一 tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴と する変異 TyrRSも提供する。
この変異 TyrRSも、古細菌又は真核生物由来のアンバ一サブレッサー tRNAと組み 合わせて、 任意の位置にアンバー変異を導入した核酸を発現させることにより、 任意の位置に 3位置換チ口シン、 特に 3—ョードチロシンを組み込んだポリぺプ チド生産に好ましく用いられる。
本発明の変異 TyrRSの一態様によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸配列にお いて、 H i s 70が A 1 aで置換され、 As p 158が Th rで置換され （Ty r 32 -A 1 a 70 -Th r 158) かつ As p 286が G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置換された配列、 又は Ty r 32が Th rで置換され、 H i s 70が T h rで置換され、 As p 158が G 1 uで置換され （Th r 32— Th r 70— G 1 u 158) かつ As p 286が G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置換された配 列を含み、 チロシンを基質とする aaRS活性よりも 3—ョードチロシンを基質とす る aaRS活性が高められ、 かつ配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなる TyrRS に比べて、 アンバーサブレッサー tRNAに対するアミノアシル化反応速度が高めら れたことを特徴とする変異 TyrRSである。 ( 8 ) ポリペプチド生産、 精製
こうして、得られた変異 TyrRSは、古細菌又は真核生物のサブレヅサ一 tRNAと組 み合わせて、 インビト口又はィンビボでのチロシン誘導体組み込みポリぺプチド の生産に用いることができる。
本発明によれば、 前記変異 TyrRSと、 前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体 と結合可能な、 古細菌又は真核生物由来のサブレヅサ一 tRNAとを用いたポリぺプ チド合成系によって、 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子を用い て、 非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを特徴とする、 チ 口シン誘導体組み込みポリべプチドの製造方法を提供する。
ここで、 ポリペプチド合成系は、 上記の変異 TyrRS、 結合可能なサブレッサー tRNA, 所望の遺伝子を用いて発現ができる発現系であれば、 任意の合成系を用い ることができる。
その具体例としては、 例えば、 無細胞ポリペプチド合成系、 真正細菌内でポリ ぺプチドを合成する系などが挙げられる。 本発明において、 「無細胞ポリペプチド合成系」 は、 細胞抽出液を用いて、 ィ ンビトロでポリぺプチドを合成する系を意味するものであり、 mR NAの倩報を 読み取ってリポソ一ム上でポリぺプチドを合成する無細胞翻訳系、 D N Aを錶型 として R N Aを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含むものを包含す る。
無細胞ポリぺプチド合成系に必要なものとしては、
意の細胞抽出液、 好ましくは原核細菌抽出液、
②本発明の変異 TyrRS、
③前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物 由来のアンバーサプレッサー tRNA
④所望の位置にアンバー変異が導入された目的のポリペプチドをコードする D NA又は mR NA
が挙げられる。 前記無細胞系において、 ①の細胞抽出液は、 リボゾーム、 tHNA、 ポリペプチド 合成に必要な酵素などを含むものであって、 高いポリぺプチド合成活性の状態の 大腸菌の濃縮細胞抽出液、 特に大腸菌 S30細胞抽出液を濃縮したものを用いる ことができる。 濃縮細胞抽出液は、 前記の粗細胞抽出液を透析、 限外濾過、 ポリ エチレングリコール （PEG) 沈殿などの濃縮法によって濃縮して得ることがで きる。 例えば、 大腸菌 S30細胞抽出液の濃縮は、 振とうまたは攪拌可能な閉鎖 系で、 大腸菌 A19株 （rna， met) から既知の方法 （Z ub ayら （19 73) Ann. Re . Genet. 7 : 267-287) で得られた大腸菌 S 30抽出液 （Pr omega社からも入手可能） を透析内液とし、 分子量限界 1 000〜14000の透析膜を介して透析外液に対して透析を行うことによって 得ることができる。 ここで、 透析外液は、 酢酸カリウム、 酢酸マグネシウム、 ジ チオトレイトールを含有する緩衝液と、 ポリェチエレングリコール、 もしくはシ ョ糖 Zェピクロルヒドリン水溶性合成共重合体 （例えば S I GMA社製の F i c oi l) とを含むことができる。
大腸菌由来の細胞抽出液は濃縮されていることが好ましいが、 未濃縮であって もよい。 本明細書でいう 「濃縮細胞抽出液」 は、 リボソーム、 tRNAなどのポ リぺプチド合成に必要な成分を含む真核および原核生物細胞の粗抽出液を透析、 限外濾過、 0沈殿（3. Nakanoら， Journal of Biotechnology, 46 (1996) 275- 282)などの既知の濃縮法または新規に見出される濃縮法によつて濃縮された ものを意味し、 該抽出液はポリべプチドインビボ合成に関与する翻訳系または転 写系/翻訳系の成分を含む。 「濃縮」 は、 抽出液中の総タンパク質濃度を指標と して、 その濃度の増加を意味する。
(Clemens, M. J. , Transcription and translation - a practical approach, (1984)， pp.231-270, Henes, B.D.と Higgins, S.J.編， IRL Press, Oxford )0 前記細胞抽出液はリボソーム、 t RNAなどのポリぺプチド合成に必要な成分 を含む。粗抽出液の調製は例えば Pratt, J.M.ら， Transcription and translation- a practical approach, (1984), pp.179- 209，Henes,B.D.と Higgins, S.J.編， IRL Press, Oxford)に記載の方法を使用できる。 具体的には、 フレンチプレツスによ る破砕 （Prattら， 上掲） やグラスビーズを用いた破砕 （Kimら， 上掲） によって行うことができる。
好ましい細胞抽出液は大腸菌 S 30細胞抽出液である。 S 30細胞抽出液は、 大腸菌 A19株（r n a, me t) から既知の方法、 例えば P r a t tら （上掲) の方法に従って調製できるし、 あるいは P r ome g a社や No v ag e n社か ら市販されるものを使用してもよい。
本発明では、 前記細胞抽出液はその総夕ンパク質濃度が増加するように濃縮す る必要があるが、 濃縮は任意の手段例えば限外濾過 （限外濾過遠心を含む） 、 透 析、 PEG沈殿などによって行うことができる。 濃縮の度合いは、 通常 1. 5倍 以上、 好ましくは 2倍以上である。 大腸菌由来の細胞抽出液の場合、 限外濾過遠 心で 1. 5〜7倍以上、 PEG沈殿で 1. 5〜 5倍以上まで濃縮可能であるが、 4 倍を超えるとハンドリングが難しくなる。 また、 小麦胚芽抽出液の場合、 PEG 沈殿で 10倍の濃縮が可能である （Nak ano, H. ら， 上掲） 。 PEG沈殿に よる方法では、 細胞抽出液に PEG水溶液を混ぜることによりポリペプチド、 核 酸を沈殿させて回収し、 これを少量の緩衝液に溶かすことにより濃縮細胞抽出液 を得ることができる。 透析による濃縮は、 例えば、 振とうまたは攪拌可能な閉鎖 系で細胞抽出液を透析内液とし、 透析膜 （例えば分子量限界 1000〜1400 0) を介して透析外液に対して透析を行うことによって得ることができる。 ここ で、 透析外液は、 酢酸カリウム、 酢酸マグネシウム、 ジチオトレイトールを含有 する緩衝液と、 PEG (例えば # 8000) 、 ショ糖 Zェピクロルヒドリン水溶 性合成共重合体 （例えば S I GMA社製の F i c o 1 1) 等の高分子吸収剤とを 含むことができる。 高分子吸収剤は水分を吸い出すために必須である。
無細胞ポリペプチド合成系 （すなわち、 ポリペプチド合成反応液） には、 大腸 菌 S 30等の濃縮細胞抽出液の他に、 ATP (アデノシン 5，一三リン酸） 、 GT P (グアノシン 5，一三リン酸） 、 CTP (シチジン 5，一三リン酸） 、 UTP (ゥ リジン 5，一三リン酸） 、 緩衝液、 塩類、 アミノ酸、 RNァ一ゼ阻害剤、 抗菌剤、 必要により RNAポリメラ一ゼ （DNAを铸型として用いる場合） および t RN A、 などを含むことができる。 その他、 AT P再生系としてホスホェノールピル ペートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフエ一トとクレア チンキナーゼの組合わせ、 ポリエチレングリコール （例えば # 8000) 、 3，， 5，一 c AM P、 葉酸類、 還元剤 （例えばジチオトレイトール） 、 などを含むこと ができる。 添加成分の濃度は任意に選択することができる。
緩衝液としては、 例えば H e p e s— K〇H、 T r i s— O A cのような緩衝 剤を使用できる。 塩類の例は、 酢酸塩 （例えばアンモニゥム塩、 マグネシウム塩 など） 、 グルタミン酸塩などであり、 抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、 アンピシ リンなどである。 アミノ酸はポリペプチドを構成する 2 0種のアミノ酸である。 また、 D N Aを鍀型として用いる場合には R N Aポリメラーゼを反応系に添加す るが、 例えば T 7 R N Aポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
②の変異 TyrRSとしては、本発明の変異 TyrRSのいずれかを用いることができる。 特に、チロシン誘導体を基質とする aaRS活性が高められた変異 TyrRSを用いること は、 チロシン誘導体組み込みポリペプチド生産のために有利であり、 さらにアン バーサプレツサー t R N Aに対するアミノアシル化反応速度が高められた変異 TyrRSを用いることは生産効率を高めることができるので、 有利である。
③のサブレッサ一 t R NAとは、 古細菌又は真核生物由来の tRNAT 変異体であ つて、 好ましくは、 アンバーサプレッサ一 tRNA (チロシンアンチコドン GUAの 1文字目 Gが Cに置換されて、 アンチコドンが C UAとなったもの） を用いる。 M. 'a/w? //由来チロシン ·サブレッサー tRNAは、 上述した方法により作製する ことができる。 用いることができる真核生物由来の tRNA は、 例えば、 M.スプリ ンツルら、 Nuc l ei c Ac ids Research、 第 1 7卷、 1一 1 7 2頁、 1 9 8 9年に記 載されたものが挙げられる。
④所望の位置にアンバー変異が導入された目的のポリペプチドをコードする D NA又は mR N A
チロシン誘導体を組み込ませるポリペプチドの種類は、 限定されるものではな く、 発現可能ないかなるポリペプチドでもよく、 異種の組換えポリペプチドでも よい。
本発明において非天然型アミノ酸を組み込ませる位置にナンセンスコドン （サ プレッサ一 t R NAがアンバーサブレッサーのときはアンバーコドン） を導入す ることが必要であり、 これによりこのナンセンスコドン （アンバーコドン） 部位 に特異的に非天然型アミノ酸を組み込むことができる。
ポリぺプチドに部位特異的に変異を導入する方法としては、 周知の方法を用い ることができ、特に限定されないが、 Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995) Zoller, Methods Enzymol.100,468-500(1983) 、 Kramer, Nucleic Acids Res.12,9441-9456(1984) 、 Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985)、 「細胞工学別冊「新細胞工学実験プロトコール」 、 秀潤社、 24 1一 248頁 （1 993) 」 に記載の方法、 または「Quick Change Si te- Directed Mutagenesis Kitj (ストラタジ一ン社製） を利用する方法などに準じて、 適宜実 施することができる。
本発明では、 ポリペプチドは、 前記定義のとおり小ペプチドから大ペプチドに 至る任意の残基数のものを対象とし、 公知のものまたは新規のものを含む。 目的 のポリペプチドをコードする DN Aまたは RN Aは、 真核または原核生物の細胞 もしくは組織からゲノム DNA、 mRNAとして周知の方法 （フエノール Zクロ 口ホルム処理、 エタノール沈殿、 塩化セシウム密度勾配遠心など） で得るか、 あ るいは、 c DNAクロ一ニングで合成'単離することができる。 あるいは、 ポリ ぺプチドのアミノ酸配列またはそれをコ一ドするヌクレオチド配列が判明してい る場合には、 DN A合成機を用いて化学的に合成することもできる。
温度および攪拌速度などの反応条件は、 ポリべプチドの種類に応じて任意の条 件を使用できる。 ポリペプチドの合成の場合、 温度は通常約 25〜約 50°C、 好 ましくは約 37°Cである。 また、 振とう速度もしくは攪拌速度は低速、 例えば 1 00〜200 r pmを使用できる。 目的のポリペプチドの生成を監視しながら、 反応時間を適当に選択することができる。
さらに、 本発明は、
①任意の細胞抽出液、 好ましくは原核細菌抽出液、
②本発明の変異 TyrRS、
③前記変異 Ty r RSの存在下でチ口シン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物 由来のサプレッサ一 t RNA、
とを具備した、 チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キットを提供する。 さらに、 前記チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キットは、 ①〜③に 加えて、
•天然型アミノ酸と、 所望のチロシン誘導体とのアミノ酸混合物
• AT P、 G T P、 C T P、 UT Pなどのリポヌクレオチド
とを具備するように構成することもできる。
これらのキットの各成分については、 前記無細胞ポリペプチド合成系で説明し たものと同様のものを用いることができる。
これらのキットは、 所望の位置にアンパ一変異が導入された目的のポリべプチ ドをコードする D NA又は mR NAの発現を、 容易に行なうことができ、 こうし て任意の所望の位置にチロシン誘導体を組み込んだ所望のポリペプチドの生産に 用いることができる。
さらに、
(A) 前記変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現ベクターと、
( B )前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサプレッサー t R NAを、 前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
(C) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌を、 その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を 添加した培地で、 適当な条件でインキュベートすることにより、 真正細菌内で、 チロシン誘導体組み込みポリペプチドを発現させることを特徴とする、 ポリぺプ チドの製造方法も提供する。
ここで用いられる真正細菌としては、 組換えタンパク質発現系が構築されてい るものであれば、 いかなるものでもよい。具体的には、 例えば、 ェシエリキア属、 例えば、 大腸菌 1 2株 M M 2 9 4 (ATCC 31446) ；大腸菌 X 1 7 7 6 (ATCC 31537) ；大腸菌 W 3 1 1 0株 (ATCC 27325) ；及び K 5 7 7 2 (ATCC 53635) ；ェン テロパクター属、 エルウイ二ァ属、 クレブシエラ属、 プロテウス属、 サルモネラ 属、 例えばネズミチフス菌、 セラティア属、 及びシゲラ属のような腸内細菌、 B . スブチリス、 B . リケニホルミスのようなバチルス属、 緑膿菌のようなシユード モナス属、 及びストレブ卜マイセス属を含むが、 これらに制限されるものではな い。
例えば、 大腸菌内で、 このポリペプチドを発現させるためには、 前記の大腸菌 内で、 M.
Figure imgf000034_0001
と、 サプレッサー t R NAを発現させた方法に準じ て行なうことができる。
さらに、 本発明は、
(A) 前記変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現ベクターと、
( B )前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサブレッサー t R N Aを、 前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
( C ) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌も提供する。 この真正細菌は、 前記のポリペプチドの製造方 法に用いることができる。
本発明の TyrRSを用いて、前記の大腸菌内で生産したチロシン誘導体組み込みポ リペプチドは、 培地又は宿主細胞溶解物などから常法に基づき回収し得る。 もし 膜に結合しているならば、それは適当な界面活性剤（例えば Tr i t on- XI 00)を用いて 又は酵素的な切断によってその膜から離すことができる。細胞は、凍結-融解サイ クル、 音波処理、 機械的粉碎、 又は細胞溶解剤のような各種の物理的化学的手段 によつて破砕することができる。
さらに、 細胞内に不溶体を形成した場合には、 不溶体をタンパク質変性剤で可 溶化後、 タンパク質変性剤を含まない、 またはタンパク質変性剤の濃度がタンパ ク質が変性しない程度希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 タンパク質の立体構 造を形成させることができる。
ポリぺプチドの単離 ·精製としては、 生産したポリぺプチド特有の性質に基づ き、 溶媒抽出、 有機溶媒による分別沈澱、 塩析、 透析、 遠心分離、 限外ろ過、 ィ オン交換クロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグ ラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 結晶 化.、 電気泳動などの分離操作を単独あるいは組み合わせて行なうことができる。 以下、 本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施 例によってなんら限定されるものではない。 実施例
実験方法 [全般]
•一般遺伝子操作については， 特に指定がなければ 「Molecular Cloning 3rd Ed. Vol. 1-3, written by J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001」 に準拠して行った。
• PCRは， 特に指定がなければ， 次の条件で行った。
Pyrobest DNA polymerase (Takara社から購入）， 酵素に添付の反応用緩衝液を 使用し， 反応液の容量は 50マイクロリットルとする. プライマ一は 25ピコモルず つ使用し， 铸型 DNA を Xナノグラム使用する。 反応の温度制御は次の通りとした。
98度 5分→ (98度 10秒→50度 15秒→72度 y秒） X z回→72度 5分
X： x=lで DNAの増幅が認められないときは， Xを 10, および 100として PCRを行う。 y： yは 30以上で， PCRで生成する DNA断片の長さを 500で割って 60を掛けた値とす る。
z ： z=25で DNAの増幅が認められないときは， 30， および 35として PCRを行う。
M. jannaschii TyrRS遺伝子のクローニングと大量発現系の構築
すでに同定されている jannaschii TyrRS遺伝子配列 (GenBank ID: 1591094) をもとに、 PCRプライマーを設計し、 遺伝子全長を . j an s cJn']'ゲノム] MAを铸型 にして PCR法で増幅した。 増幅した断片を発現べクタ一 pET-3a (Novagen) に組み 込んだ。得られたプラスミド （pET- YRSと名づける） を、 大腸菌マイナーコドン相 補プラスミド pRARE (Novagen)を導入した大腸菌 BL21 star(DE3) (Invitrogen) に 導入し、 大量発現系を構築した。
M. jannasch i TyrRSの精製
PET-YRSを形質転換した前記の大腸菌を 100 g/m/アンピシリンを含む LB培地 2 /中で培養した。 0.0.6。。が0.4〜0.6になった時点で、 終濃度 I mMとなるようにイソ プロピル- 1_チォ- D-ガラクトピラノシド （IPTG)を添加し、 TyrRSの発現を誘導し た。 発現誘導から 3〜4時間後、 集菌した。 得られた菌体に対して超音波破砕を行い、 上清画分を分離した。 それを 80°Cで 15分間熱処理することで大腸菌由来のタンパク質を変性、 沈殿させ、 上清画分を 遠心によって分離した。 得られた上清を、 陰イオン交換カラム Q Sepharose Fas t Flow (Amersham Bi osc i ences) およびァフィ二ティーカラム HiTrap Hepar in HP (Amersham Bi osc i ences)の二段階のカラムクロマトグラフィーにより、 結晶化に 適した純度まで精製した。 培養液 1 /当たり約 30 mgの精製標品を得た。
M. jannaschii tRNATyrの調製
T7RNAポリメラーゼ転写反応で tRNATyfを試験管内合成する場合、せ細菌の tRNAT は 5 '末端がシチジン残基であるために、 そのままでは転写量が少ない。 そのた め、 tRNAをまずハンマ一ヘッドリポザィム融合体 （transzyme) として T7RNAポリ メラーゼで転写し、 その後自己切断によって tRNATyrをつくることとした。 NATyr コード領域の 5 '末端にハンマーへッドリポザィムと、 転写促進配列が付加した 配列27をもつ DNAを合成プライマーの貼り合わせでつくり、 それを PUC119に導入し た。 大腸菌を形質転換後、 プラスミドを大量に調製した。 得られたプラスミドを 铸型にして T7RNAポリメラーゼ転写反応を行い、 t ranszyme RNAを合成した。 t ranszymeに対し、 85°C 30秒と 60°C 9分の温度サイクルを 12〜14サイクル行うこ とで、八ンマーへッドリポザィムの自己切断反応を促進した。その後、 8 M尿素- 15% ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、 陰イオン交換カラム Resource Q (Amersham Bi osc i ences) によるカラムクロマトグラフィーで tRNAT を精製、 脱尿素し、 結晶 化に適した標品を得た。
TyrRS · tRNATyr · L-チロシン複合体の調製
精製された tRNATyfは 20 mM Tr i s-Cl ( H 7. 5)、 20 mM塩化マグネシウム溶液に 溶解し、 80°Cで変性後、徐冷して高次構造を形成させた。精製された TyrRS溶液は、 Vivaspin 2 (Vivasc i ence) を用いて限外ろ過法で 20 mM Tr i s-Cl (pH 7. 9)、 20 mM 塩化マグネシウム、 2 mM L-チロシン、 10 mM 2-メルカプトエタノール溶液に溶液 置換し、 濃縮した。 得られた TyrRS溶液と tRNA溶液を 6〜8 mg/m/ TyrRS、 TyrRS : tRNATyr (モル比) =1： 1. 2になるように混合した。 それを 50°Cで 10分間反応 させることで複合体を形成させた。 得られた溶液を結晶化用標品とした。 複合体の結晶化
前記で得られた複合体溶液 1 に対して、等量の結晶化バッファ一 [30% (v/v) 1， 6-へキサンジオール、 50 mM酢酸ナトリウム （pH 4.0)、 200 mM塩化アンモニ ゥム、 10 mM塩ィ匕マグネシウム、 I mM酢酸亜鉛] と混合し、 ハンギングドロップ 蒸気拡散法を用いて結晶化を行った。レザーバー溶液は、結晶化バッファーの 1, 6 - へキサンジオール濃度を 35% (v/v) に変更したものを用いた。 30°Cで 1週間平衡化 させることにより、六角両錘状の結晶が現れ、約 3週間後には 0.15X0.15X0.45 mm まで成長した （図 1 9)。 セレノメチォニン （SeMet) 標識 TyrRS · tRNATy チロシン複合体の結晶化 プラスミド pET- YRSをメチォニン要求性大腸菌株 Β834ΦΕ3) (Novagen) の codon plusプラスミド （Stratagene) 保有株に導入した。 得られた大腸菌を、 セレノメ チォニンを含む LeMaster培地 （文献 6) で培養し、 native TyrRSと同様に調製す ることで、 結晶化に適した純度の SeMet標識 TyrRSが得られた。 結晶化は nativeの 複合体における方法に準じるが、結晶化バッファーの pHが 4.6の条件が最適であつ た。 得られた結晶は図 1 9に示す。
X線回折データの収集とスケーリング
回折データの収集は、 高輝度放射光施設 SPring_8のビームライン BL41XUで行つ た。 結晶は、 抗凍結剤として 30% (v/v) エチレングリコールを含む結晶化バッフ ァ一に浸した後、 100 Kまで瞬間冷却した。 100 Kに保ったまま、 native, SeMet 標識体とも振動角 1°、露光時間 2秒で回折データを収集した （図 2 0)。 SeMet標識 複合体については、 位相決定に必須な Se原子の異常分散効果を強めるために、 X 線吸収微細構造 （XAFS) スペクトルを測定して、 その吸収端波長 （0.9793A (0.09793nm) )で回折データの測定を行った。測定された XAFSスぺクトルは図 2 1に示す。
全ての回折データは DENZ0、 SCALEMCKを用いて指数付け、 スケーリングを行つ た。 native、 SeMet標識複合体ともに、 結晶は空間群 3^1に属していた。 格子長 は、 nativeは 3= =86.8A (8.68nm) 、 c=156A (15.6nm) 、 SeMet標識体は a= =87.2 A (8.72nm) 、 c=157A (15.7nm) であった。 全デ一夕セットについての統計値は 表 1に示した。 表 1
X線データ収集、 位相、 精密化
ネイティブ SeMetピーク
データコレクション
波長 (A) 0. 9132 0. 9793
分解能 （A) 50- 1. 95 50-2. 10
測定された反射 419, 200 224, 588
ユニークな反射 49， 557 40， 428
完全性 （％) 1 98. 7 (93, 99. 0 (93. 8)
\/σ (1) 1 30. 9 (2. 23. 5 (2. 0)
Rsym ( ) 1, 2 7. 1 (28. 8. 6 (27. 8) 位相統計値
サイ卜数 1
RCullis3 0 76
フィガ ·ォブ ·メリット
密度修正前 0 26
密度修正後 0 47 精密化
分解能 （A) 50- 1. 95
タンパク質原子 2, 415
t RNA原子 1, 577
チロシン分子 1
水の酸素 382 マグネシウムイオン 4
Rワーク （％) 18. 8
Rフリ一 （％) 23. 9
R.m. s.偏差
結合長さ （A) 0. 026
結合角 （° ) 2. 20
1 かっこ内の数は、 最後のシェルについてのものである。 位相計算とモデルの構築
SeMet標識複合体の初期位相は単波長異常分散 （SAD) 法を用いて解析した。 SeMet標識複合体のスケーリングデータをもとに、 プログラム SnBを用いて、 直接 法により Se原子の初期座標を決定した。 Collaborative Co即 utational Project No.4 (CCP4) program suiteの MLPHAREを用いて、 2.5A. (0.25nra) 分解能までの Se原子の座標の精密化と初期位相の計算を行った。 プログラム RESOLVEを用いて 2.1 A (0.21nm)までの位相の拡張と、溶媒平滑化およびヒストグラムマッチングに よる電子密度の改良を行ったところ、 明確に解釈可能な電子密度が得られた。 異 常分散に対する差フーリエ図を図 22に示す。
モデルの構築はプログラム 0を用いて行った。構築した複合体のモデルはプログ ラム CNSを用いて、 個々の原子の温度因子を精密化し、 simulated annealingを繰 り返すことで精密化した。全デ一夕のうち無作為に選んだ 10%をクロスバリデーシ ョンのために精密化の対象から外している。
改善されたモデルは、 na t i ve複合体の 1.95 A ( 1.95 X 10—1 rnn)分解能までのデー 夕に対して精密化し、さらに水分子を CNSで自動的に拾い、数ラウンドの精密化を 行った。最後にマニュアルで水分子を拾い、 最終的に分解能 50A (5nm) から 1.95 A (1.95X1 (^皿）までの 因子が 18.8% free=23.9¾) になるまで精密化を行った。 位相決定およびモデル精密化の際の統計値を表 1に示した。決定した複合体の座 標デ一夕および構造因子は Protein Data Bank (PDB) に登録されている （PDB ID: 1J1U)。 Asp286置換体および tRNA G34C変異体の調製とアミノアシル化アツセィ
TyrRS変異体および tRNATyf変異体の作成については、 PCR法により変異導入を行 い、 遺伝子構築した。 それぞれの調製については、 野生型と同様に行った。
アミノアシル化反応は 37°Cで行つた。 反応溶液の組成は、 100 mM HEPES-KOH ( H 7.5), 15 mM塩化マグネシウム、 0.05 mg/mゾゥシ血清アルブミン、 1 mMジチオト レイトール、 10 mMATP、 12 L_[14C]-チロシン溶液を用いた。 反応溶液中の酵 素濃度は 10 nMもしくは 100 nMとし、 tRNA濃度を 0.25〜64 Mに変化させたときの 反応初速度をトリクロ口酢酸沈殿画分の放射活性の時間変化から求め、 Lineweaver- Burkプロットにより、 反応速度論定数を求めた。
TyrRS · tRNATyr · L-チロシン複合体の全体構造
M. jannaschii TyrRS · tRNATyr · L-チロシン複合体の結晶構造は SAD法を用いて 解析し、 最終的に 1.95A (1.95 XlO—inm)分解能で、 因子が 18.8% (i?frec=23.9%) に なるまで精密化した。非対称単位には一つの TyrRSサブユニットと tRNATyr、チロシ ン分子が含まれていた。 TyrRSはゲルろ過法で示唆されていた通り、ホモダイマー を形成しており、 ホモダイマー中の二つのサブュニットは互いに二回対称軸で関 連付けられている （図 23)。三重複合体の全体構造を図 6に、チロシン結合部位 付近の電子密度を図 8に示す。 tRNATyfとの複合体中の , // TyrRSの立体 構造は、 一次配列上の類似性から予想されたとおり、 ヒト mini- TyrRS単体の構造 とよく重なり合い、 主鎖の原子同士の平均二乗変位 （r.m.s.d.) は 2.38A (0.238M1)であった （図 9A)。 それに対して、 //' TyrRSと真正細菌で ある B. stearothermophilus, S. aureus, および . ther卿 h i I us 架の と は、 一次構造と同様に類似性はより低く、 それぞれに対する r.m.s.d.は 5.08A (0.508nm)、 5.20A(0.52nm), 4.13A (0· 413nm)であった （図 9B)。
M. ya/M //TyrRSのサブユニット（図 7)は 5つの領域に分けられる （図 6)。 短レ^末端ドメインに続いて Rossmannフォールドドメインがある （図 6)。 全ての TyrRSは、 Rossmannフォールドを触媒ドメインとして持つクラス I aaRSに属する。 決定された立体構造では、チロシン 1分子が Ros smarmフォールドドメインに結合し ている （図 6及び図 8)。一般にクラス I aaRSの Rossmannフォールドに挿入されて いる CP1 (connective- peptide 1) ドメインは、 二量体形成に働いている。 クラス Iの保存配列である KMSKSループは Rossmannフォ一ルドドメィンと C末端ドメイン をつないでいる。 KMSKSループの一部 （残基 203〜209) については、 TyrRSの基質 のひとつである ATPが結合した状態でないためか、 デイスオーダーしている。 複合体の tRNATyrのヌクレオチド残基は 3 '末端以外は安定な構造をとつている。 二つの tRNATyr分子はホモダイマーの二つのサブュニットにまたがつていて、 tRNA のァクセプターステムは片方のサブュニットで、 アンチコドンループはもう一方 のサブユニットと相互作用している。 M. /3/?/？ // TyrRSは tRNAァクセプタース テムを主溝側から認識している （図 6)。 真正細菌である Γ. tlwrnwphilus 来の TyrRSでも同様の認識が見られる。しかし、それらはクラス II aaRSに特徵的な tRNA 認識であり、 他の構造決定されているクラス I aaRSは副溝側からァクセプ夕一ス テムを認識する。
M. ゾ ? //複合体において、 C末端ドメインは tRNAのアンチコドンと相互作 用している （図 6)。 M. jannaschiiと Τ· /力 e/^op力 77 の TyrRSはいずれも同じ 5 ' -GUA-3 'のアンチコドンを認識するにもかかわらず、 C末端ドメインの構造は 異なっている。両者の TyrRSと tRNAの複合体の立体構造を重ね合わせてみると、 M. ゾ cカ ゾでは、 特徴的な/3-310-/3構造が 11と0；12 (7. thernwphi lusで οί 13と α14に対応） の間に挿入されている （図 9 Β, 図 1 0)。 ヒトの TyrRSにもこ のモチーフが存在する（図 9 A)。 一方、 T. / · TyrRSはアンチコドン結 合ドメインの後に、さらなる C末端ドメインをもっており、それが真正細菌に特徴 的な長いバリアブルア一ムを認識している（図 9 Β)。 Τ. /^/ / TyrRSに結 合している tRNAは、 M. /3/7/? (^//のものと比較して、 約 18。だけ二回軸まわりに 回転して結合している （図 1 1)。 tRNAァクセプ夕ーステム認識
M. ゾ a/wa / tRNATyrにおいて、 ァクセプ夕一ステムの CI :G72塩基対は TyrRS · tRNAT ペアの直交性に最も重要な要素である。 ァクセプ夕一ステムは Rossmannフ オールドドメインと CP1ドメインによって認識されている （図 1 2)。G72の塩基部 分はァクセプターステムの他の塩基平面と平行であるのに対し、 C1の塩基はそれ に対して約 20°ねじれ、 さらに 20°傾いている （図 1 3)。 このねじれた位置にある C1塩基は、 厳密に酵素によって認識されている。 C1塩基の 2位のカルボニル基と 3 位の窒素原子は Argl74のグァニジノ基と水素結合し、 4位のアミノ基は Argl32によ つて捕捉された水分子と水素結合している。 また、 Metl78の側鎖とも疎水的な相 互作用をしている （図 1 3)。 G72は主に Lysl75の側鎖のアミノ基によって認識さ れている。 Argl32、 Argl74、 および Lysl75はせ細菌および真核生物由来 TyrRSの間 で高度に保存されている （図 2)。 C1の厳密な認識が、 TyrRSにおける C1:G72特異性 の基盤と考えられる。 事実、 M. a/w // TyrRSは、 Ul :A72塩基対に変換した酵 母 MTyr変異体を、 野生型 tRNATyfと比べて 1/200の効率でしか認識しない （文献 1 8) 。 A73も tRNA の強力なアイデンティティ決定因子であり、 それをグァニンや ゥラシルに置換すると . ゾ aw // TyrRSには認識されなくなる （文献 1 8) 。 実際、 その 6位のアミノ基と 1位の窒素原子はそれぞれ Vall95の主鎖のカルポニル 基とアミノ基により認識されている （図 1 3)。 そのほかには、 Argl32が G71を、 Thrl26と Glul82が tRNAのリン酸骨格を認識している （図 1 2)。
それとは対照的に、 T. thermophilus て1? &では、 Gl :C72が異なった様式で認識 されている（図 14)。 G1についてはあまり認識されておらず、 C72が Glul54との 1 本の水素結合で認識されているのみである。 M. a/w? TyrRSには対応する部 分にプロトンァクセプ夕一はない （図 1 3)。 さらに、 . 複合体では ヘリックスの軸から投げ出されていた A73塩基部分が、 Γ. tlwrnwpIiUusではへ Ό ックスの延長上にあるという違いが明らかとなった （図 1 3及び 14)。
このように、古細菌と真正細菌の TyrRSは、主鎖構造が似ているにもかかわらず、 ァクセプ夕ーステムを全く異なる残基で認識している。 G1:C72塩基対をもつ tRNA の場合、 . jannaschii TyrRSでは Glの官能基が Argl 74側鎖から遠く離れ、 しかも C72の 4位のアミノ基と水素結合できるようなプロトンァクセプタ一がないために、 認識されないと考えられる。 実際、 生化学的な解析もそれを支持している （文献 1 8) 。 一方、 T. /力 ?力// は C1:G72塩基対を認識しない。 G72の 7位の窒素原 子の近傍にはプロトンドナ一がないために、 水素結合ができず、 M. jannaschii TyrRSで Argl 74に対応する残基である Argl 98は、 A73と C1を同時に認識することが W
42 できないためである （図 1 4 )。以上の認識'識別のメカニズムの違いが、真正細 菌 TyrRS · tRNATyrペアと古細菌/真核生物 TyrRS · tRNATyfペア間の直交性の源になつ ていると考えられる。 tRNAアンチコドン認識
M. j annas cli i i yfKSにおいて、 アンチコドンは C末端ドメインによって認識さ れる （図 6 )。アンチコドンの 1文字目の G34が引き出されて厳密に認識されている (図 1 5 )。 G34の塩基部分は Phe261と Hi s283の環の間にスタツキングし、 さらに 1 位の窒素原子と 2位のアミノ基は、共に Asp286と水素結合によって認識されている。 実際に、 D286A置換体ではアミノアシル化の速度が野生型の 1/10以下になることが 知られている。 アンチコドンのほかの塩基はタンパク質とあまり塩基特異的な相 互作用はせず、 U35の 3位の窒素原子が Cys231の主鎖のカルポニル基と、そして A36 のリポースが Lys288の側鎖および Lys228の主鎖と相互作用している程度である (図 1 5 )。そのほかには、 C28のリン酸基が Lys228の側鎖と水素結合している。 こ れらのことが、 ゾ a m / TyrRSにおいて、 アンチコドンの 1文字目が他の塩 基に比べてはるかに強く識別されている （文献 1 8 ) 理由であると考えられる。
Asp286は古細菌と真核生物の TyrRSにおいて高度に保存されており、 /3 -31()- 3 モチーフ （図 1 0 ) 上にある Phe261に対応する芳香族残基と、 Hi s283に対応する ヒスチジン残基もまたよく保存されている （図 2)。例えば、ヒト TyrRSでは T卬 283、 Asp308、 Hi s305がそれぞれ ·ゾ a wz 7 TyrRSの Phe261、 Asp286、 Hi s283に一次 配列の上で対応している （図 2)。さらにヒト TyrRSの立体構造上の Trp286と Asp308 側鎖の向きは、 M.ゾ a/?// TyrRSの Phe261と Asp286とほぼ同じである。 酵母に おいても、 tRNAの G34に変異を導入すると TyrRSによるアミノアシル化が低下する ことから、 アンチコドンの一文字目を厳密に認識する機構は、 古細菌と真核生物 の間で保存されていると考えられる。
それに対して、 T. thermophilus ΐ は M. ゾ a z/z c力// TyrRSとは全く異なつ た機構でアンチコドンを認識している。 まず、 T. thermophilus TyrRS - tRNATyr 複合体では、 G34は A36にス夕ッキングしており、 修飾塩基であるシュ一ドウリジ ン残基 35が反転している（図 1 6 )。そして、 G34は一次構造上 jannaschii x^ の Asp286とは対応しない Asp259によってカルポニル基が認識されている （図 2、 1 6 )。シュ一ドウリジン残基 35は主に Asp423によって認識されているが、その残 基は真正細菌 TyrRS特有の C末端ドメインに属しており、 古細菌/真核生物の TyrRS では対応する残基は存在しない （図 2及び 1 6 )。 立体構造に基づいたアンチコドン認識の改変
前記のように、 Μ· ゾ a;? ? 7' / TyrRSの Asp286は、 アンチコドンの 1文字目であ る G34を特異的に認識するための鍵となる残基である。そこで、 tRNAT の G34C変異 体であるァンバ一サブレッサー t RMに対するアミノアシル化の効率を上げるため に、 286番の残基に変異を導入することとした。 野生型 TyrRSにおいて tRNAの 34塩 基目にシトシンがくる場合、 G34と同じように塩基が反転した位置に来たとしても、 Asp286と塩基との距離が離れすぎて満足な相互作用は得られないと考えられる。 そこで、 Asp286をより大きな側鎖である、 Glu、 Phe、 I l e、 Leu, Gin, Arg、 Tyr に置換した変異体を作成し、 アンバ一サブレッサ一 tRNAに対するアミノアシルイ匕 の活性を測定した。 比較的高いアンバーサブレッサー tRNA濃度で反応初速度を求 めたところ、 Gln、 Arg、 Tyr置換体について顕著な活性の向上がみられた。 特に、 D286Rでは野生型の 8倍の初速度を示した （図 1 7 )。
D286R変異体について、 反応速度論定数を求めた。
表 2
TyrRSのチロシル化反応速度
TyrRS (野生型） TyrRS (D 2 8 6 R)
Figure imgf000045_0001
(s- ') (μΜ) (相対値） (s-1) (μΜ) (相対値） 基質
tRNATyr 0. 19 0. 35 1 0. 12 1. 4 0. 16
(野生型） tRNATyr 0. 070 39 0. 0033 0. 079 0. 68 0. 22
(G34C)
表 2において、野生型と変異体の TyrRSについて、 ミカエリス定数と、反応速度 定数を示す。野生型 TyrRSではアンバーサブレツサ一 tRNAに対するアミノアシル化 活性は野生型 tRNATyrと比べて約 1/300であった。 しかし、 D286R変異体は、 野生型 tRNATyrと同程度ァンバーサプレッサー tRNAをアミノアシル化することが明らかと なった。さらに、 D286R変異体は野生型酵素よりも 65倍もよく tRNAを認識すること がわかつた。 その変異体ではァンバ一サブレツサー tRNAに対する /imが主に低下し ており、 ^はあまり変化していなかった。
以上のように、 わずか 1アミノ酸残基の置換によって、 . _/a M ^ /7' TyrRSが アンバーサブレッサー tRNAをはるかに効率よくアミノアシル化するように改変す ることに成功した。 部位特異的に非天然型アミノ酸をタンパク質に導入するため には、 アンバーコドンに非天然型アミノ酸をコードさせることが現在のところ最 も有効な手段である （文献 2— 5、 7、 1 0 - 1 5 ) 。 これまでの野生型 TyrRS によるァンバーサプレッサー tRNAのアミノアシル化は効率的ではなく、 ァンバー コドンの抑圧効率はァ口プロティンの大量調製を目指すうえでは不十分であつた。 本発明で得られた D286R、 D286Q、 および] 3286Y変異体は w>oあるいは//? vitro の系で抑圧効率を向上させることが期待される。 それらの変異を、 非天然型アミ ノ酸を特異的に認識するためのアミノ酸結合部位の変異と組み合わせることによ つて、 大量のァロプロテインが生産できると考えられる。
TyrRSのアミノアシル化反応機構の解析
今回決定した . a/M? '/ TyrRSと、 すでに構造決定されていた Γ. therinophilus TyrRSはいずれも他のクラス I aaRSとは逆の tRNAァクセプターステ ム認識様式をとつていた。アミノ酸が t RNAの CCA末端のリポースにあるヒドロキシ ル基とエステル結合をつくる際に、 一般的にクラス I aaRSはリポースの 2 ' -0H基 を、 クラス II aaRSは 3 ' -0H基をアミノアシル化するとされている。 生化学的な 解析では、 酵母の tRNAT は、 3 ' -0H基と 2 ' -0H基の両方がアミノアシル化される が、 主に 3 ' - 0H基よりも 2 '-0H基がアミノアシル化されるという報告がある。 し かし、 T. thermophilus, M. /'/ TyrRSともに、 立体構造中では tRNAの CCA 末端がデイスオーダーしているため、 どちらが本当の標的であるかの検証はでき ていない。今回得られた複合体の構造では、 ATPを結合する KMSKSループと CCA末端 がともにディスオーダーしていたことから、 両者に何らかの関連があるのではな いかと考えている。
Lーチロシン認識
M. /a/w? /'/TyrRSによる Lーチロシン認識の構造についても有用な知見を得 た。 チロシンは、 酵素にある深いチロシン結合ポケット （図 4) に収容される。 チロシン結合ポケットの入り口の近くに、チロシンのァミノ基とカルボニル基が、 G l n l 7 3、 Ty r 1 5 1及ぴ G 1 n 1 5 5で水素結合ネットワークを形成し ている （図 4) 。 チロシンのフエニル環は、 L e u 6 5、 H i s 70、 及び G 1 n 1 5 5の側鎖により認識され、 さらに、 I 1 e 3 3、 G 1 y 34、 Ph e 3 5 の主鎖により認識される （チロシンの後ろ側、 図には示さず） 。 チロシンの側鎖 のヒドロキシル基は、 ポケッ卜の内部の Ty r 3 2と A s p 1 5 8で水素結合に より認識される （図 4) 。 水分子は、 H i s 1 7 7と Ty r 3 2により水素結合 で捕捉され、チロシンの側鎖にも近位である（図 4)。チロシンフリーのヒト mini- TyrRSも、 このタイプのアミノ酸結合ポケットを有している。 したがって、古細菌 と真核生物の TyrRSは保存されたチロシン結合部位を有している。
チロシン結合ポケットの残基も、 細菌で良く保存されている。 深いポケットを 形成する残基の配置は、 B. stearothernwphilusと S. aureus TyrRS構造と類似し ている。 . jannaschim y r 32、 As p l 58、 G l n l 55、 G 1 n 17 3、 及び Ty r 1 51は、 B. stearothennophi lusで！ y r 34、 As p l 76、 G l n l 73、 G l n l 95、 及び Ty r 169に対応する。 これらの残基は、 よく保存されて、 2つの TyrRSで、チロシン結合においてほぼ同じ役割を果たして いる。 T. ihermophuIus y^ RSは、チロシンのヒドロキシル基を認識するために、 Ty rの代わりに例外的に Ly sを有しているが、 チロシンとの水素結合の他の 残基は保存されている。
しかしながら、 TyrRSのチロシン結合部位の詳細は、古細菌 真核生物と細菌で 異なっている。 例えば、 M. i annas chi ii TyrRSの Η i s 70と H i s 177は、 A 力// TyrRSには存在しない。 さらに、 チロシンと直接相互作用 しない残基の配置は、 M. jannaschiiと B. stearothermophi lusで^:なる。 As n 123の側鎖は、 B. /ea/o/力 e¾o 7i«TyrRSのチロシンのヒドロキシル基から 約 4 A (0.4nm) であるが、 M.ゾ 3?/? の TyrRSの対応する残基である G 1 u 1 07はチロシンから 1 3A (1.3nm) 離れている。
M. ゾ /? 7'/の TyrRSのアミノ酸特異性の改変は、 すでにインビポスクリ一二 ングシステムで成功している （文献 4、 5、 1 1一 13、 及び 24) 。 以前の実 験で、 置換の標的残基は、 B. s/earo e/7ffo /J の TyrRS結晶構造に基づいて選 択された。 しかしながら、 上述したように、 M. ゾ a/w? /の TyrRSの実際のチロ シン結合部位は、 いくらか異なっている。 例えば、 O—メチルー L—チロシンを 特異的に認識する TyrRS変異体は、 4置換（Y32Q、 E 107T、 D 1 58A及 び L 162 P) で作製された （文献 1 1) 。 1つの構造によれば、 Y32Qと D 1 58 A変異は、 〇ーメチルー L—チロシン結合ポケットを形成するのに必要と されている。 これに対して、 E 107 Tと L 162 P変異は、 結合チロシンに近 くないため、 自然又は間接的に影響のある変異のいずれかのようである。 stearo½er ¾? 7i/sTyrRS構造に基づく Ja/jas / TyrRS構造のコンピュータ —シユミレーシヨンは、 G l u l 0 7と L e u l 6 2がチロシン結^ ¾位から離 れて位置していて、間接的に L—チロシンの排除に寄与することも示されている。 こうして、 図 4に示した構造によれば、 非天然型アミノ酸特異性をより有効に創 出するためのアミノ酸結合部位の詳細についての新規な情報を得ることができる。
M. jannaschii TyrRS変異体の構造解析
本発明でアンバーサプレッサ一 tRNA (tRNAT5Tの C34G変異体） を効率よく認識す る D286R変異体が得られた。 この変異体は、 サプレッサ一 tRNAに対する^が低いの で、その tRNAとの共結晶化が可能であると考えられる。また、 jannaschii TyrRS については、 様々な非天然型アミノ酸に対して、 それそれを特異的に認識する変 異体が得られている （文献 4、 5、 1 1— 1 3、 及び 2 4 ) 。 今回決定された複 合体の構造では、 チロシン結合部位におけるチロシン側鎖の認識機構は、 これま でに構造決定されていた . stearothermophilus TyrRSと似ていることが明らかと なった。 しかし、非天然型アミノ酸特異的な TyrRS変異体が、 なぜ本来の基質であ るチロシンを認識せず、 非天然型アミノ酸を特異的に認識するのかは、 その構造 だけでは完全には説明できない。 これらの tRNAやアミノ酸認識に対する改変体と それぞれの基質の立 造を決定することにより、 人工遺伝暗号の拡張に向けた TyrRSの基質特異性の改変戦略についての新たな知見が得られると考えられる。 立体構造を利用した TyrRSの基質特異性の改変
M. ; masc 複合体の立 ί«造が決定されたことで、基質結合部位と tRNA結合 部位の構造情報に基づいた改変が可能となる。 特に、 これまでは基質結合部位の 構造を類推するために stearothermophilus TyrRSの立{«造を用いていたが、 細かい残基の配置が異なっていた。例えば、 M. J'a/3/zasdz TyrRSの Glul07は一次 配列上、 B.
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TyrRSの Asnl23に相当するが、 B.
stearothermophilus TyrRSで Asnl23は基質のチロシンから約 4A(0.4nm)と近傍に あるのに対し、 M. afl/jascAi'i TyrRSの Glul07はチロシンから約 13A( 1.3皿）も離 れている。 今回の立 ί«造を利用することで、 従来の非天然型アミノ酸を認識さ せるための改変よりも、 より効率よく、 かつ幅広いアミノ酸に対応した改変がで きると期待される。 表 3
原子 原子 アミノ酸 X y z occ 温度因子 番号 タイプ 残基
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ATOM 2 CG MET A 1 50. 817 34. 547 111. 960 1. 00 92. 79 A
ATOM 3 SD MET A 1 49. 915 36. 022 112. 581 1. 00107. 52 A
ATOM 4 CE MET A 1 51. 244 37. 038 113. 483 1. 00 95. 00 A
ATOM 5 C MET A 1 51. 461 31. 431 111. 392 1. 00 73. 05 A
ATOM 6 0 MET A 1 50. 976 30. 329 111. 330 1. 00 75. 79 A
ATOM 7 N MET A 1 52. 835 32. 783 112. 928 1. 00 84. 35 A
ATOM 8 CA MET A 1 51. 487 32. 183 112. 704 1. 00 77. 94 A
ATOM 9 N ASP A 2 52. 036 32. 036 110. 365 1. 00 67. 16 A
ATOM 10 CA ASP A 2 52. 104 31. 515 109. 001 1. 00 55. 38 A
ATOM 11 CB ASP A 2 52. 074 29. 984 108. 944 1. 00 51. 25 A
ATOM 12 CG ASP A 2 52. 042 29. 469 107. 520 1. 00 58. 96 A
ATOM 13 0D1 ASP A 2 53. 070 29. 498 106. 809 1. 00 60. 67 A
ATOM 14 0D2 ASP A 2 50. 959 29. 045 107. 074 1. 00 69. 91 A
ATOM 15 C ASP A 2 50. 899 32. 140 108. 267 1. 00 54. 37 A
ATOM 16 0 ASP A 2 49. 715 31. 883 108. 579 1. 00 45. 37 A
ATOM 17 N GLU A 3 51. 234 32. 998 107. 319 1. 00 48. 60 A
ATOM 18 CA GLU A 3 50. 269 33. 748 106. 543 1. 00 46. 41 A
ATOM 19 CB GLU A 3 51. 018 34. 652 105. 538 1. 00 41. 78 A
ATOM 20 CG GLU A 3 51. 379 35. 982 106. 215 1. 00 51. 20 A
ATOM 21 CD GLU A 3 52. 216 36. 928 105. 319 1. 00 59. 11 A
ATOM 22 0E1 GLU A 3 52. 629 36. 504 104. 184 1. 00 54. 18 A /i/:2TI>d SOLO/ OoAV
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TyrRSのァミノ酸特異性をョ一ドチロシン特異的に切り換える変異 (H70Aおよび D158T) と、 サブレッサー tRNAの認識を向上させる変異（D286Y) を TyrRS遺伝子に 同時に導入した。このョ一ドチロシン特異的 TyrRS遺伝子は pACYCl 84ベクタ一にク 口一ニングし、 リポプロテイン ·プロモーター（lpp)下で発現する /力 STWCOCCZW ゾ a/w / '由来アンバーサプレッサー t RNATyF遺伝子も同じべクタ一上にクロー二 ングした （サブレッシヨン用プラスミド） 。 一方、 ョ一ドチロシンを導入したい タンパク質は、 pE Tベクタ一 （ノバジェン社） 上にクローニングし （発現用ブラ スミド） 、 これら 2つのベクターを大腸菌株 BL2 DE3)に同時に導入する。 緑色蛍光夕ンパク質へのョードチロシンの導入
緑色蛍光タンパク質 GFPuv (クロンテック社)遺伝子の塩基配列 （配列番号 1 6 ) は次の通りである。
Figure imgf000200_0001
ACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAA 遺伝子内部の v / 部位 （下線部） をサイレント変異によって除去し、 さらに、' 遺伝子内の Tyr66のコドン （二重下線部） をアンバー · コドンに置換した GFPuv (amber)遺伝子を作製して、 この遺伝子を pET41aベクター (ノバジェン社) に組み込んだ。
このプラスミドを発現用プラスミドとして用い、 上記のサブレッシヨン用ブラ スミドとともに大腸菌株 BL2 DE3)に導入した。 この大腸菌を、 0. 1 mg/mlョード チロシンを含む （もしくは含まない） 液体 LB培地で 37°Cで増殖させ、 培養液の濁 度が、 600nmの波長に対する吸光度が 0. 4— 0. 8のときに、 IPTG (イソプロピル j8— チォガラクトシド） を 1 mMになるように培養液に加えた。 そのまま一晩待って、 菌を回収して GFPuv (amber)の発現をしらベた。.
次に， そのときの SDS-PAGEのパターンを図 2 6に示す。 ■
図 2 6に示すように、 GFPuv (amber)がョードチロシン非存在下では発現せず、 存在下で発現していることから、 発現している GFPuv (amber)にはアンバーコドン の位置にョードチロシンを取り込まれていることがわかる。 この GFPuv (amber)の 合成量は、 アンバーコドンを導入していない野生型 GFPuvに比べても遜色はない。 このように、 ョードチロシン含有 GFPuvの大量合成が確認された。 高度好熱菌 HB8由来の夕ンパク質 TT1865へョードチロシンの導入
TT1865のアミノ酸配列は、 次の通りである。
Figure imgf000201_0001
VLKEEWPGVKARLEARLYGASGNP 最初に C末端のプロリン残基を除去しておく。この措置は TT1865の発現に必要で ある。 そこで、 TT1865に含有されるチロシン残基 （Tyr30, Tyr35, Tyrl l lの 3箇 所、下線部）をそれぞれアンバー'コドンに置換した変異遺伝子を作成して、 pET3a ベクタ一にそれぞれクローニングした。 サブレッション用ベクターとともに大腸 菌 BL2 DE3)に導入し、 この大腸菌を 0. 1 mg/mlョ一ドチロシンを含む （もしくは 含まない） 液体 LB培地で 37°Cで増殖させる。 006。。=0. 4〜0. 8のときに1^^を1 mM になるよう加え、そのままー晚待って菌を回収した。回収した菌は、 20 mM Tr i s-HCl ( H 8. 0)、 20 mM EDTA、 200 mM NaClのバッファーで懸濁し超音波破砕を行い、 15, 300 X で 10分間遠心を行った。 このときの上清を 70°Cで 30分間熱処理を行い、 さら に 15300 X で 10分間遠心を行うことで、 熱変性した大腸菌タンパク質を沈殿除去 した。 この上清をさらに 100°Cで 1時間熱処理を行い、 再び遠心操作によって変性 したタンパク質を沈殿させた。 ここで得られた沈殿の中には発現した TT1865が濃 縮されて含まれており、 この沈殿の SDS- PAGEを行うことで ΤΠ 865の発現を調べる ことができた。 その結果を図 2 7に示す。 図 2 7に示すように、 Tyr30アンバーコドン、 Tyr35アンバーコドン、 Tyr l l lァ ンバーコドンのそれぞれの TT1865変異体について、 ョードチロシン非存在下では 発現せず、 存在下で発現していることから、 それぞれの位置にョ一ドチロシンを 取り込まれていることがわかる。
以上、 TT1865遺伝子内の異なる 3箇所にアンバーコドンを導入したとき、 3箇所 についてはョードチロシンが導入されたことが確認された。 産業上の利用可能性
本発明により、 M. /a/?/? 複合体の立体構造が決定され、 この立体構造から 基質認識及び結合部位である、 チロシン結合ポケット及びアンチコドン G 3 4結 合ポケットの構造が解明されたことで、 基質結合部位と tRNA結合部位の構造情報 に基づいた改変が可能となる。 この改変は、 古細菌はもちろん、 古細菌と真核生 物との類似性から、 真核生物由来酵素を改変する際にも、 有用な情報を提供し得 る。
さらに、 これまで基質となり得ることが知られていたチロシン誘導体だけでな く、任意のチロシン誘導体を基質とし得る変異 TyrRSが得られる可能性があり、未 知のァロポリペプチド生産の可能性を開くものである。
本発明により明らかにされた立体構造から /a ? ? の TyrRS改変のための 置換位置を選択することは、 これまで類似性の低い^ s tearothermophilus の立体構造から推定した方法に比べて、 より効果的かつ効率的である。 本発明のチロシン結合ポケットの情報から得られる変異体は、 チロシン誘導体 に対する基質特異性が高められたものである。 また、 G 3 4結合ポケットの情報 から得られる変異体は、 アンバーサブレッサー効率が高められたものである。 そ して、 これら 2つの変異を併せ持つ変異体は、 チロシン誘導体に対する基質特異 性が高められ、 かつ、 アンバーサブレッサー効率が高められるものである。
これらの変異体は、 古細菌又は真核生物由来のアンバーサブレッサー tRNA 、 すなわち、 アンバーコドンに相補するアンチコドンを有する tRNA の変異体と組 み合わせて、 インビポ又はインビトロの系で、 所望の位置にチロシン誘導体を導 入した非天然型アミノ酸組み込みポリぺプチドの生産効率を挙げることができる。

Claims

請求の範囲
1. 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 4006で規定される構造を有 する、 メタノコッカス 'ジャナシィ (lethanococcus ja腿 schii) のチロシレ t RNA合成酵素（TyrRS)/チロシン t RNA/L—チロシンの三重複合体の結晶。
2. 空間群が 3 1であり、単位格子が、 a=b=86.8 A (8.68nm)、 c=156 A (15.6nm) の寸法を有する、 TyrRSZチロシン t RNAZL—チロシンの三重複合体の結晶。
3. 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 2415で規定される構造にお いて、 アミノ酸残基 Ty r 32、 I l e 33、 G l y34、 Ph e 35、 G 1 u 36、 Le u 65、 A l a 67、 H i s 70、 Ty r l 51、 G l n l 55、 A s p l 58、 G l n l 73、 及び H i s 177によって規定されるチロシン結合 ポケットを有する TyrRS。
4. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 「Ty r 32、 H i s 70、 As p 158」 のうちの 1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配 列、 又は 「Ty r 32、 As p l 58、 H i s l 77」 のうちの 1以上のァミノ 酸残基を別のアミノ酸残基で置換した配列からなり、 かつチロシンを基質とする アミノアシル tRNA合成酵素活性よりも 3—ョードチロシンを基質とするアミノア シル tRNA合成酵素活性が高められたことを特徴とする変異 TyrRS。
5. 請求の範囲第 4項に記載の変異 TyrRSにおいて、 「T y r 32、 H i s 70、 As p l 58」が「Ty r 32、 A l a 70、 Th r l 58」 に置換された配列、 又は 「Ty r 32、 H i s 70、 As p l 58」 が 「Th r 32、 Th r 70、 G 1 u 158」 に置換された配列からなることを特徴とする変異 TyrRS。
6. 請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の変異体のアミノ酸配列において、 1 若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からな り、 かつチロシンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性よりも 3—ョード チロシンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性が高められたことを特徴と する変異 TyrRS。
7. チロシンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性よりも所望のチロシ ン誘導体を基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性が高められた変異 TyrRSを 作製する方法であって、
(A) 表 3に示される原子座標に基づいて、 前記チロシン結合ポケット構造を 構成するァミノ酸残基から少なくとも 1つ選択し、
(B)選択したアミノ酸残基について、別のアミノ酸残基で置換した変異 TyrRS ライブラリーを作製し、 .
(C) 変異 TyrRSライブラリ一から、 チロシンを基質とするアミノアシル tRNA 合成酵素活性よりも目的のチロシン誘導体を基質とするアミノアシル tRNA合成酵 素活性が高められたものを選択することを含むことを特徴とする方法。
8. 前記工程 （A) において、 表 3に示される原子座標に基づいて、 チロシン 結合ポケットを構成するアミノ酸残基から 3個選択することを特徴とする、 請求 の範囲第 7項に記載の方法。
9. 前記チロシン誘導体が 3位置換チロシンであることを特徴とする、 請求の 範囲第 7項又は第 8項に記載の方法。
10. 前記工程 （A) で選択したアミノ酸残基が、 Ty r 32、 H i s 70、 及び A s p 158の組み合わせ、 又は、 Ty r 32、 As p l 58、 及び H i s 177の組み合わせであることを特徴とする、 請求の範囲第 9項に記載の方法。
11. 表 3に示される原子座標の原子番号 1から 2415で規定される構造に おいて、 アミノ酸残基 Ph e 261、 H i s 283、 P r o 284、 Me t 28 5、 及び As p 286によって規定されるアンチコドン G 34結合ポケットを有 する TyrRS。
12. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において As p 286が別のアミノ 酸残基で置換された配列を有する変異 TyrRSであって、配列番号 1で表されるアミ ノ酸配列からなる TyrRSに比べて、アンバーサプレッサー t RN Aに対するァミノ ァシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRS。
13. 前記 As p 286が、 G l n、 Ar g、 又は T y rで置換されたもので あることを特徴とする、 請求の範囲第 12項に記載の変異 TyrRS。
14. 請求の範囲第 12項又は第 13項に記載の変異 TyrRSのアミノ酸配列にお いて、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、ァ ンバーサプレッサー t R N Aに対するアミノアシル化反応速度が高められたこと を特徴とする変異 TyrRS。
15. チロシンを基質とするアミノアシル NA合成酵素活性よりもチロシン誘 導体を基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性が高められた変異 TyrRSにおい て、配列番号 1における As p 286に相当するアミノ酸残基を G 1 n、Ar g、 又は Ty rで置換することを特徴とする、 アンバーサブレッサー t RNAに対す るアミノアシル化反応速度が高められた変異 TyrRSの作製方法。
16. 請求の範囲第 15項に記載の方法により作製され得る変異 TyrRS。
17. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において、 H i s 70が A 1 aで置 換され、 As p 158が Th rで置換され、かつ A s p 286が G 1 n、 A r g、 又は T y rで置換された配列、
又は Ty r 32が Th rで置換され、 H i s 70が T h rで置換され、 As p i 58が01 1で置換され、 かつ A s p 286が G 1 n、 Ar g、 又は Ty rで置 換された配列
からなり、 チロシンを基質とするアミノアシル t RNA合成酵素活性よりも 3—ョ一 ドチロシンを基質とするアミノアシル tRM合成酵素活性が高められ、 かつ配列番 号 1で表されるアミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、アンバーサブレッサー t R N Aに対するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRS。
1 8 . 請求の範囲第 1 7項に記載の変異体のアミノ酸配列において、 1若しく は数個のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 チロシンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性よりも 3—ョ一ドチロシ ンを基質とするアミノアシル tRNA合成酵素活性が高められ、 かつ配列番号 1で表 されるァミノ酸配列からなる TyrRSに比べて、ァンバーサプレッサー t R N Aに対 するアミノアシル化反応速度が高められたことを特徴とする変異 TyrRS。
1 9 . ①細胞抽出液、
②請求の範囲第 4項乃至第 6項、 第 1 2項乃至第 1 4項、 第 1 6項乃至第 1 8 項のいずれか一項に記載の変異 TyrRS、
③前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生物 由来のサプレッサー t R NA
とを具備した、 チロシン誘導体組み込みポリペプチド製造用キット。
2 0 . 請求の範囲第 4項乃至第 6項、 第 1 2項乃至第 1 4項、 第 1 6項乃至第 1 8項のいずれか一項に記載された変異 TyrRSと、 前記変異 TyrRSの存在下でチロ シン誘導体と結合可能な、 古細菌又は真核生物由来のサブレッサー t R NAとを 用いたポリペプチド合成系によって、 所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝 子を用いて、 非天然型アミノ酸を含んだポリペプチドを発現させることを特徴と する、 ポリペプチドの製造方法。
2 1 . (A) 請求の範囲第 4項乃至第 6項、 第 1 2項乃至第 1 4項、 第 1 6項 乃至第 1 8項のいずれか一項に記載の変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現べク 207 ターと、
(B)前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサブレッサ一 t RNAを、 前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
(C) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌を、 その細菌の増殖に適した培地に目的のチロシン誘導体を 添加した培地で、 適当な条件でインキュベートすることにより、 真正細菌内で、 チロシン誘導体組み込みポリペプチドを発現させることを特徴とする、 ポリぺプ チドの製造方法。
2 2 . (A) 請求の範囲第 4項乃至第 6項、 第 1 2項乃至第 1 4項、 第 1 6項 乃至第 1 8項のいずれか一項に記載の変異 TyrRSを細菌内で発現させる発現べク ターと、
(B )前記変異 TyrRSの存在下でチロシン誘導体と結合可能な、古細菌又は真核生 物由来のサブレッサー t R NAを、 前記細菌内で発現させる発現ベクターと、
(C) 所望の位置にナンセンス変異を受けた所望の遺伝子
とを有する真正細菌。
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