WO2004061100A1 - 核酸の変異解析方法および遺伝子の発現解析方法 - Google Patents

核酸の変異解析方法および遺伝子の発現解析方法 Download PDF

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Takeo Takahashi
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the so-called DNA microarray is a device in which many different DNA probes are fixed at high density on a solid substrate such as glass.
  • Devices in which a probe nucleic acid is immobilized on such a substrate are roughly classified into two types depending on the method of manufacturing.
  • One is a type of device that synthesizes DNA on a glass surface by a photolithographic method, that is, a device generally called a DNA chip (Proc Natl Acad Sci USA ( 1994) 91: 5022-5026).
  • the other is a type of device in which pre-prepared DNA is mechanically arranged on a slide glass, and the DNA is then attached to the glass, which is generally called a DNA microarray.
  • Device Science (1994) 270: 467-470).
  • a DNA microarray that attaches DNA to slide glass does not require a large-scale semiconductor manufacturing machine.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing an example of a mutation analysis method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing one example of a mutation analysis method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram schematically illustrating a gene expression analysis method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 (c) is a cross section taken along line 1B-1B of FIG. 1 (a).
  • a heater 6 and a temperature sensor 7 may be arranged below the reaction section 2 as shown in the cross section in FIG. 1 (c).
  • a heater 6 may be arranged below the polyimide thin film 5 on which the probe nucleic acid 3 is immobilized, and a temperature sensor 7 may be arranged below the heater 6.
  • Such a device can be manufactured by any method known per se. Further, the positions and arrangement patterns of the heaters and sensors included in such an apparatus may be changed as desired. Also, heaters and sensors need not necessarily be provided integral with the substrate.
  • This immobilization utilized a biotin-avidin reaction.
  • the first substrate and the second substrate are joined to form the four grooves.
  • four capillaries were formed, namely, Capillary 1, Capillary 2, Capillary 3, and Capillary 4.
  • the RV probe nucleic acid was provided in the obtained four capillaries.
  • the following experiment was performed using the reaction vessel thus formed.
  • reaction A the events that occur in reaction A will be described.
  • RV comp target (.tgcacat gg tcatagctg 111 cc; Rooster S row number 2) as a target nucleic acid was added to the above-mentioned cavities at a concentration of 100 nM (in 1 XSSC solution). did. These were subjected to hybridization for 1 hour at 37 ° C. After hybridization, 1 XSSC solution (having the following composition; 0.15 MNaCl, 0.015 M sodium tenoate, pH 7.0) is sufficient. After washing, unreacted target nucleic acid was removed from the cavity.
  • the fluorescence intensity was measured.
  • the fluorescence intensity is measured using an Argon laser that emits strong laser light at 488 nm and 514 nm as the excitation light, and emits fluorescent light at a wavelength corresponding to each fluorescent substance used as the labeling substance.
  • the strength was measured.
  • the wavelengths of the fluorescent materials used were 6-FAM at 513 nm, HEX at 560 nm, TAMRA at 580 nm and ROX at 610 nm.
  • fluorescence intensity degree from the single-stranded nucleic acid double-stranded nucleic acid in the present embodiment, disclosed fluorescence intensity herein similarly good c measured remains double-stranded
  • the fluorescence intensity may be measured after the single-stranded nucleic acid is used.
  • nucleic acid may be analyzed by a nuclease protection assay using the single-stranded labeled probe nucleic acid obtained by the method described in the sixth example.
  • double-stranded labeled probe obtained by the method described in the second to fifth examples is single-stranded by the means described in the sixth example to obtain a single-stranded probe.
  • a strand-labeled probe nucleic acid may be used.
  • the probe nucleic acid 96a and the target nucleic acid 91b are hybridized without adding the fluorescently labeled substrate nucleic acid 93b and the unlabeled substrate nucleic acid.
  • an extension reaction may be performed by adding both substrate nucleic acids and a polymerase.
  • the embodiment of the present invention it is possible to selectively label only a probe nucleic acid hybridized with a target nucleic acid containing a target site to be detected in a reaction vessel. Therefore, efficient gene mutation analysis can be performed, and at the same time, probe nucleic acid can be efficiently labeled, and the production cost of the reaction vessel can be reduced.
  • a target nucleic acid 102 having a target sequence to be detected is set.
  • a probe nucleic acid 101 having a sequence complementary to the target sequence and having a label attached to a part of the bases of the sequence is prepared (8A).
  • the probe nucleic acid 101 is immobilized on the bottom surface 104 of the reaction part 105.
  • the test nucleic acid is added to the reaction section 105 on which the probe nucleic acid 101 has been immobilized (8B), and they are reacted under conditions that allow appropriate hybridization (8C).
  • a hybridization is generated and a double-stranded nucleic acid is generated.
  • the single-strand-specific nuclease used in such a reaction is a nuclease, which is an enzyme that selectively degrades a single-stranded nucleic acid.
  • S1 nuclease is decomposed into acid-soluble 5,1P nucleotides together with DNA and RNA, and finally, more than 90% of the total is 5'- It is an enzyme that decomposes to P nucleotides (Fig. 4). It also acts on and degrades the single-stranded portion of the double-stranded chain. This enzyme is often used for removing single-stranded portions in DNA-DNA and DNA-RNA hybrids.
  • the single-strand-specific nuclease used in the method of the present invention may be any enzyme capable of degrading single-stranded nucleic acid.
  • any enzyme known per se may be used.
  • S1 nuclease and exonuclease I can be used.
  • a type I nucleic acid comprising a complementary sequence complementary to a seed probe nucleic acid, a sequence to be labeled on the 5 'side of the complementary sequence, and an extended sequence on the 5' side of the sequence to be labeled Reacting the seed probe nucleic acid under suitable hybridizable conditions;
  • the obtained second extended and labeled probe nucleic acid 146b may be further denatured to a single strand, and the above method may be further repeated.
  • the second type II nucleic acid was hybridized under conditions enabling hybridisation, and the extension reaction solution was added with ⁇ 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5), 7 mM MgCl2, 0.1 mM DDT, K1 enow Fragment (DNA polymerase I, Large Fragment; TOYOBO) was replaced with 0.4 unit 10% Cy5-dATP, D ⁇ d dCTP, 10 / zM dGTP, and 10 ⁇ dTTP ⁇ , except that the method described in the first embodiment is used. Perform elongation reaction
  • the amount or relative amount of the first type II nucleic acid and the second type II nucleic acid used is measured. It is also possible to do so.
  • all the processes relating to a plurality of hybridizations and labeling can be performed collectively in a small container, that is, by a series of operations. is there. Therefore, the desired gene expression frequency can be easily analyzed in a short time with a small number of samples. Further, the degree of elongation of the probe nucleic acid can be controlled, and a desired site in the course of elongation of the desired probe nucleic acid can be easily labeled.
  • the type III nucleic acid 1553 contains a sequence complementary to the entire length of the seed probe nucleic acid 151, and further extra sequences are added to the sequence. It may be contained on the 5 ′ side of the type nucleic acid.
  • the labeled probe nucleic acid obtained by any of the above-described eleventh to fifteenth embodiments is used in the ninth and tenth embodiments described above. It may be used in the same manner.
  • the single-stranded labeled probe nucleic acid obtained by the eleventh to fifteenth embodiments may be used in a nuclease protection assay while being immobilized on a substrate. Or may be used after being recovered from the substrate and recovered. No. It may be used after being recovered and further purified.
  • the probe nucleic acid can be labeled in advance with a fluorescent label, it is possible to know the solid phase amount of the probe nucleic acid before the hybridization. That is, it is possible to grasp the amount of the immobilized probe nucleic acid and the state of the spotted spot before the reaction. This makes it possible to control the quality of the solid phase of the probe nucleic acid.
  • mRNA is used as a sample, unlike the conventional method, it can be directly subjected to a hybridization reaction.Therefore, cDNA is prepared using reverse transcriptase. It is possible to avoid loss of efficiency caused by labeling and other operations.
  • the unlabeled probe nucleic acid precursor lacking the nucleic acid and the unlabeled probe nucleic acid precursor immobilized on the support at the 5 ′ end of the unlabeled probe nucleic acid precursor are hybridized under conditions that allow them to hybridize. Reacting,
  • each labeled probe nucleic acid prepared on the support has a labeled nucleotide introduced on its 3 ′ side.
  • the base sequence of the labeled probe nucleic acid to be prepared on the support is designed according to the target analysis.
  • the length of the labeled probe nucleic acid can be 15 to 50 bases.
  • the label is desirable to incorporate the label into the nucleotide at the 3 ′ end of the prepared labeled probe nucleic acid from the viewpoint of the stability of the label. Absent.
  • step (3) all the complementary bonds between the “labeled probe nucleic acid” created by the extension reaction in step (2) and the “type I nucleic acid” are dissociated (see FIG. 14 ( c))).
  • This dissociation is performed by replacing the elongation reaction solution on the support with a 0.1 N NaOH solution and reacting in the solution at room temperature for 5 to 10 minutes as described in Examples below.
  • the heat treatment may be performed by maintaining at 90 to 98 ° C. for 5 to 10 minutes and performing a heat treatment.
  • step (4) “ ⁇ -type nucleic acid” and the like dissociated in step (3) are removed from the support to prepare a support on which the labeled probe nucleic acid is immobilized.
  • the removal can be performed by washing with a buffer solution, autoclave water, or the like.
  • the method according to the second embodiment is the same as the method according to the first embodiment except for the above-described features. Please refer to each process description. An outline of the second embodiment is schematically shown in FIG.
  • the "unlabeled probe nucleic acid precursor” has a partial deletion of the nucleotide in the intermediate portion of the labeled probe nucleic acid to be prepared, It is composed of two “unlabeled probe nucleic acid precursors 203 & 200 3)” separated by a defective portion.
  • the two "unlabeled probe nucleic acid precursors 203a and 203b" are shown in Figure 16 as “unlabeled probe nucleic acid precursor A" and "unlabeled probe nucleic acid precursor B", respectively. Name. "Unlabeled probe nucleic acid precursor A” and "unlabeled probe nucleic acid precursor B" are each used alone.
  • unlabeled probe nucleic acid precursor A and “unlabeled probe nucleic acid precursor B” each have a length of at least 6 nucleotides or more, and preferably 10 to 1 nucleotides. It has a length of 5 nucleotides.
  • the “intermediate portion” necessarily includes a central portion of the labeled nucleic acid probe to be created. become.
  • the nucleotide at the intermediate portion of the probe nucleic acid precursor on the support is deleted to thereby label the intermediate portion of the probe nucleic acid. It is possible to grant.
  • the third embodiment since a label is added to the intermediate part of the probe nucleic acid, various arbitrary positions in the intermediate part can be selected as the defective part.
  • the third embodiment is easier to control the number of labeled nucleotides to be introduced than the first embodiment, in which the defective portion is limited to the 3 ′ end of the probe nucleic acid. Excellent in point.
  • the fact that the labeled nucleotide is contained in the intermediate portion of the probe nucleic acid is also excellent in that the labeling is stable.
  • the “unlabeled probe nucleic acid precursor” on the substrate extends its 3 ′ end in the order of dATP ⁇ Cy5-dUTP ⁇ dCTP ⁇ dATP ⁇ dATP to create a ⁇ labeled probe nucleic acid '' .
  • Table 6 shows the fluorescence intensity of the “labeled probe nucleic acid” immobilized by the above method as 100, and the same process without “ ⁇ type nucleic acid” (negative control). The intensity is indicated by its relative value.
  • Example 17 “Labeled probe nucleic acid” was prepared.
  • the extension reaction was stopped using 0 ⁇ M dCTP or 10 M ddCTP instead of ⁇ dCTP during the extension reaction to introduce the label d- UTP. This is different from the sixteenth embodiment in that it is performed.

Abstract

本発明は、ターゲット核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって、ターゲット核酸の標的部位に隣接する３'側の塩基配列に相補的な選択用配列を含み且つその５'末端を介して基体に固相化されているプローブ核酸と核酸試料とを反応させる工程；検出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の１種類の塩基を含む標識化デオキシヌクレオシド三リン酸とポリメラーゼとの存在下で前記反応で得られた反応産物を伸長する工程；前記伸長工程で使用されなかった標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を当該反応系から除去する工程；当該反応系に存在する前記標識物質由来の信号を検出する工程；検出された信号の有無と前記標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の塩基の種類から標的部位の塩基を決定する工程を具備する方法を提供する。

Description

明 細 書
核酸の変異解析方法および遺伝子の発現解析方法
技術分野
本発明は、 固相されたプローブ核酸を用いて核酸の変異を 解析する方法に関する。 また本発明は、 固相された標識プロ ーブ核酸を用いて遺伝子発現を解析する方法に関する。 更に 本発明は、 核酸を用いた種々の解析、 例えば遺伝子の発現解 析等に有用である、 標識プローブ核酸の調製方法に関する。 背景技術
所謂 D N Aマイ ク ロア レイ は、 多数の異なったプローブ D N Aをガラスなどの固相基板上に高密度に固定した装置であ る。 こ のよ う な基板にプローブ核酸を固定した装置は、 その 製造方法から 2種類に大別される。 1 つは、 光 リ ソグラフ方 式によ り D N Aをガラス表面上で合成していく タイ プの装置 即ち、 一般的には D' N Aチップと称される装置である （ Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91 : 5022 - 5026) 。 も う 1 つは 予め調製した D N Aをスライ ドガラス上に機械的に並べ、 そ れによって D N Aを張り 付けてレヽ く タイ プの装置、 即ち、 一 般的には D N Aマイ ク ロア レイ と称される装置である （Scie nce (1994) 270： 467-470) 。
上記 2種類の D N Aマイ ク ロア レイ の基本的な測定原理は 固定されたプローブ核酸に対して標識された核酸試料をハイ ブリ ダィズさせ、 核酸試料の標識を基に、 核酸試料の中に、 プローブ核酸にハイプリ ダイズする核酸が存在するか否かを 検出する ものである。 このよ う な原理によって、 遺伝子の大 量解析が可能になる。 また、 検出感度の向上、 装置のマイ ク 口化によるサンプルの節約、 データの取得の自動化およびデ ータ処理の簡便化なども達成される と期待されている。
D N Aをガラス表面上で合成していく タイ プの D N Aマイ ク ロア レイ は、 半導体に使われる光リ ソグラフィー技術と 固 相法 D N A合成技術を融合させる こ とで作製する。 まず光反 応で取り 除く こ と ができる保護基を持った合成リ ンカーをガ ラス基板上に結合させ、 マスク と呼ばれる遮蔽物質を通して 光を照射する こ と によ り 、 特定の領域の保護基を脱離させる 次にこのガラス基板を水酸基が保護されたヌ ク レオチ ドと反 応させる。 これによ り保護基が脱離している部分のみで、 重 合反応が起こる。 更に、 別のマスク を用いて基板上の異なる 領域に光を照射し、 ヌ ク レオチ ドの重合を繰り返し、 ア レイ を作製する。
スライ ドガラスに D N Aを張り 付けていく タイプの D N A マイ ク ロアレイは大がかり な半導体製造機を必要と しない。
D N Aア レイ機と検出器があれば目的の D N Aマイ ク ロ ア レ ィ を製造する こ と が可能である。 また、 この方法は、 張り付 ける D N Aを任意に選択でき る こ とが利点であるが、 その一 方で、 D N Aのコ レク ショ ンを調製する必要があ り 、 繁雑な 作業が必要である。 また、 こ の方法では、 ピン先で物理的に スポッ ト していく 。 従って、 D N Aの高密度化は光リ ソダラ フ方式よ り は劣る。 しかしなが ら、 例えば、 直径 1 0 0 μ m のスポッ ト を 1 0 0 m間隔でスポッ トする と計算上 1 c m 2 に 2 5 0 0スポッ 卜する こ とが可能である。 通常のスライ ドガラス 1 枚 （有効面積は約 4 c m 2である） について、 約 1 万の D N Aを载せる こ とが可能である。
D N Aア レイ機は、 基本的に高性能サーボモータを組み合 わせて、 コ ン ピュータ制御下でピン先、 或いは、 ス ラ イ ドホ ルダーを X Y Z軸方向に作動して、 マイ ク ロタイ タープ レー トからスライ ドガラス表面上に D N Aサンプルを運ぶもので ある。 ピン先の形状には、 多く の工夫がなされてお り 、 こ の 技術の命と も言える。 最も一般的なピン先形状は、 カラス 口 のよ う に割れたペン先形状である。 そこに D N Aプローブ溶 液を溜め、 複数のス ラ イ ドにス ポ ッ トする方式である。 洗浄 および乾燥のサイ クルを挟んで次の D N Aサンプルを載せる とレヽ ぅ 工程を繰り返す。 理想的なア レイ機に求め られる機能 は、 スポッ トのサイズや形状が均一で、 しかも高速で再現性 がよいとい う こ とである。 ペン先のロ ッ トの違いなどによ り 均一性ゃス ピー ドに限界があるので、 よ り 高性能なものを求 めてイ ンク ジヱ ッ ト方式やキヤ ビラ リ 一方式など、 新しい技 術の開発も進め られている。
D N A固定法に関しては、 ガラスはメ ンブレンと比較して 有効固定面積が小さ く 電荷のチャージも少ないので、 種々の コーティ ングが試みられている。 実用的にはポリ L リ ジンや シラン化などが用いられている。 D N A末端をア ミ ノ化して シラン化ガラスにク ロス リ ンクする方法もある。
D N Aマイ ク ロ ア レイ上でハイブリ ダィズした蛍光標識 D N Aの蛍光シグナルの検出は蛍光検出器で行う。 通常、 スキ ャナ一は蛍光顕微鏡と可動ステージを組み合わせたものであ る。 従来型のゲル用の蛍光イ メージアナライザーでも、 それ 程高密度ではない D N Aマイ ク ロア レイ の読み取り なら可能 である。 最近、 D N Aマイ ク ロア レイ専用の高解像度スキヤ ナ一が売り 出された。 読み取り 方式の違いによ り 共焦点型と 落射型がある。
D N Aマイ ク ロア レイから出てく るデータは膨大なものに なるので、 データ解析ソフ トが重要と なってく る。 データの 表示方法やデータの後処理、 他のデータベース との リ ンクな ど実験者にと って使い勝ってのよいソフ ト ウエアの開発が望 まれている。 マイ ク ロ ア レイ によ る遺伝子発現モニタ リ ング のデータベースィ匕の試みや、 ア レイデータ ベース のイ ンタ ー ネッ トでの公開も始まっている。
このよ う な技術の D N Aマイ ク ロア レイ を用いて、 突然変 異を検出する こ とが試みられている。 まず、 サンプルの特定 領域中の 1 塩基に対して、 その塩基のみが異なる 4種類のォ リ ゴヌク レオチ ドプローブをデザィ ンし、 D N Aプロ一プチ ップに載せる。 一方、 塩基配列を調べるサンプルは P C Rで 増幅し、 蛍光色素を用いて末端標識しておく 。 こ のサンプル を前記の D N Aチップとハイ ブリ ダイゼーショ ンさせる と、 サンプル配列と相補的な塩基を持つプローブが最も強いハイ ブリ ダィゼーシヨ ンシグナルを示す。 同様に、 1 塩基置換の 突然変異を持ったサンプルの場合は、 変異塩基に相補的な塩 基を持つプローブが最も強いハイブリ ダイゼーシ ョ ンシダナ ルを示す。 こ の方法では、 電気泳動に基づいた D N Aシーケ ンシングと異なる、 未知の塩基配列を決定する こ とはできな いが、 特定の遺伝子の決まった領域について、 突然変異の存 在を高密度で検出でき る。
サンプル調製では、 例えば、 Hu SNP Mapping Assay ( Af f ymetrix 社） は、 S N Pマーカーの増幅に 1 本の反応チュー ブで約 1 0 0種類の P C R産物を增幅させるマルチプル P C Rを採用 している。 2段階目 にはラベリ ング P C Rを行い、 各 S N Pマーカーを含む P C R産物を更に増幅させる と共に . ビォチン標識を行う が、 この と きには、 全ての P C R産物に 共通なプライマーペアを用レ、る こ とができ る。 このサンプル 調整の効率化によ り 、 約 1 2 0 n g のゲノ ム D N Aから出発 し、 1 日 半で S N P遺伝子型を決定する こ とができ る よ う に なった。 実験操作は、 G e n e C h i p システムによ り極限 まで自動化されており 、 1 台のス キャナを用いた場合には 2 4時間で 1 8 0 サンプルの解析が可能である。
このよ う な D N A変異解析は、 4種類のオリ ゴヌ ク レオチ ドプローブをガラスなどの固相基板上に固定し、 その上に、
P C Rで増幅した蛍光標識 D N Aをハイ プ リ ダイ ズさせ、 各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、 その データ をコ ンピュータで解析する。 このよ う な解析は、 以下 の よ う な問題点がある。 即ち、 1 ) 測定したい試料を各試料 毎に蛍光標識ヌ ク レオチ ドゃ蛍光標識プライマ ーを用いて標 識しなければな らず、 標識の効率が低く 、 且つ製造コス トが 高い、 2 ) ハイ プリ ダイゼーシヨ ンまでの前処理が煩雑で自 動化しずらい、 3 ) 1 つの試料を測定するのに 4種類のプロ ープを用意しなければな らず費用がかかる、 4 ) 測定が乾燥 状態で行われるために蛍光シグナルの検出効率が低い。
—方、 上述の D N Aマイ ク ロ ア レイ を用いて、 遺伝子発現 を解析する こ と も現在行われている。 その主流は、 二蛍光標 識法を用いたディ フ ァ レンシャルな遺伝子発現をみる系であ る。 その原理は、 2つの異なった m R N Aサンプル中での遺 伝子発現の差を検出する ものである。 そのために、 各 m R N Aサンプルから各標識 c D N Aを調製する際に、 それぞれを 異なる蛍光物質で標識し、 各標識 c D N Aをア レイ上のプロ ーブに競合的にハイプリ ダイ ズさせ、 両方の蛍光を測定し比 較する ものである。
このよ う な従来の方法は、 以下のよ う な問題点がある。 即 ち、 1 ) 従来の方法では、 測定したい試料を標識するため、 例えば R N Aなどの試料のデグラデーショ ンが生じる。 2 ) 従来の方法では、 ハイブリ ダイゼーショ ンまでの前処理が煩 雑で自動化しずらい。 3 ) 従来の方法は、 ディ フ ァ レンシャ ルな遺伝子発現を検出する ものである。 従って、 相対的変化 でしか発現量を見られない。 4 ) 従来の方法では、 プローブ の固相量や、 点着スポッ トの状態を反応前に知るこ とができ ない。 従って、 プローブ固相の精度管理を行う こ とが不可能 である。 5 ) 従来の方法では、 測定は乾燥状態で行われてい る ので、 蛍光シグナルの検出効率が低い。
発明の開示
上記の状況に鑑み、 本発明の目的は、 効率がよ く 、 且つ経 済的な遺伝子変異解析方法を提供する こ とである。
鋭意研究の結果、 本発明者らは、 上記の課題を解決するた めの手段を見出 した。 即ち、
ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であって 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) 前記ターゲッ ト核酸の標的部位に隣接する 3 ' 側の 塩基配列に相補的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を 介して基体に固相化されているプローブ核酸と、 核酸試料と を、 適切なハイブリ ダイゼーショ ンを得るための条件にある 反応系において反応させる工程と 、
( 2 ) 適切な伸長反応を得るための条件において、 検出可 能な信号を生ずる標識物質を付された特定の 1 種類の塩基を 含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポ リ メ ラーゼ との存在下で、 前記 （ 1 ) の工程で得られた反応産物を伸長 する工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の伸長する工程において、 当該伸長反応 に使用されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を 当該反応系から除去する工程と、
( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 当該反応系に存在する前 記標識物質由来の信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程における当該信号の検出の有無と 前記標識化デォキシヌク レオシ ド三リ ン酸に含まれる塩基の 種類から、 標的部位の塩基を決定する工程
を具備する方法である。
また、 上記背景技術に記載された状況に鑑み、 本発明の 目 的は、 効率のよい遺伝子発現解析方法を提供する こ とである , 本発明の更なる 目的は、 複数のプレー ト間での比較が可能な 遺伝子発現解析方法を提供する こ とである。 また本発明の更 なる 目的は、 検出精度のよい遺伝子発現解析方法を提供する こ とである。
鋭意研究の結果、 本発明者らは、 上記の課題を解決するた めの手段を見出 した。 即ち、
被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であって、
( 1 ) そこにおいて反応を行 う こ とが可能な流路に固相化 され、 標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、 適切な ハイプリ ダイゼーショ ン可能な条件下で被検核酸を反応させ る工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程の後に、 1 本鎖特異的ヌ ク レア一 ゼを前記流路に添加して、 適切な酵素反応を得られる条件下 で反応を行う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程の後に、 前記流路から酵素反応の 分解産物を除去する工程と、
( 4 ) 前記流路内の 2本鎖核酸に含まれる標識物質からの 信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号を基に、 被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程と
を具備する方法 ； および、
対象における標的配列の発現頻度を判定する方法であって、 ( 1 ) そこにおいて反応を行 う こ と が可能な流路に固相化 され、 且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、 適 切なハイ プリ ダイゼーシヨ ン可能な条件下で、 対象から得た 被検核酸を含む試料を反応させる工程と、 ( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程の後に、 1 本鎖特異的ヌ ク レア一 ゼを前記流路に添加して、 適切な酵素反応を得られる条件下 で反応を行う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程の後に、 前記流路から酵素反応の 分解産物を除去する工程と、
( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後に、 前記流路内の 2本鎖核酸 に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号を基に、 対象における標的配列の発現頻度を判定する工程
を具備する方法である。
また、 このよ う な遺伝子発現解析方法を実施するにあた り 、 この方法が、 流路等の支持体上のプローブをすベて標識しな ければならないという 点において、 多大な費用 と時間と労力 を要する とい う 問題を有している こ と を見出した。
従って本発明は、 ア レイ上のプローブをすベて一括して標 識する こ とが可能な、 簡便なプローブ標識方法を提供する こ と を 目 的とする。 すなわち、 本発明は、 標識プローブ核酸を 固相化した支持体を簡便に作成する方法を提供する こ と を 目 的とする。
上記課題を解決するため、 本発明は、 以下の手段を提供す る。 即ち、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、 ( 1 ) 作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な 鏡型核酸と、 前記錶型核酸の塩基の総数よ り少なく 、 作成し たい標識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標 識プローブ核酸前駆体であって、 その 5 ' 端で支持体に固相 化されている未標識プローブ核酸前駆体と を、 これらがハイ ブリ ダィズ可能な条件下で、 反応させる工程と、
( 2 ) 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、 特定 塩基の標識ヌ ク レオチ ドと、 前記特定塩基以外の他の塩基の 非標識ヌ ク レオチ ドと を基質と して用いて、 前記未標識プロ ープ核酸前駆体の欠損部分を、 前記鎵型核酸を铸型と して、 5 ' から 3 ， 方向に向かって伸長させ、 標識プローブ核酸を 合成する工程と、
( 3 ) 前記工程によ り 得られた標識プローブ核酸と、 前記 铸型核酸との間の相補的結合をすベて解離させる工程と、
( 4 ) 解離された前記铸型核酸を支持体上から除去するェ 程と を含む方法である。
図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の 1 態様に従って使用 される反応容器の例 を示す図であ り 、 （ a ) は、 本発明の 1 態様に従って使用 さ れる反応容器の例を示す平面図であ り 、 図 1 ( b ) お よび ( c ) は、 図 1 ( a ) の I B— I B線の断面図である。
図 2 は、 本発明の 1 態様に従う変異解析方法の例を模式的 に示す図である。
図 3 は、 本発明の 1 態様に従う変異解析方法の例を模式的 に示す図である。
図 4 は、 S 1 ヌ ク レアーゼによ る核酸分解の例を模式的に 示す図である。
図 5 は、 ヌ ク レアーゼプロテク シ ョ ンア ツセィ の原理を模 式的に示す図である。
図 6 は、 本発明の 1 態様に従 う 変異解析方法の 1 例を模式 的に示す図である。
図 7 は、 本発明の 1 態様に従 う変異解析方法の 1 例を模式 的に示す図である。
図 8 は、 本発明の 1 態様に従 う遺伝子発現解析方法を模式 的に示す図である。
図 9 は、 本発明の 1 態様に従 う プローブ核酸の標識方法の 例を示す図である。
図 1 0 は、 本発明の 1 態様に従 う標的配列の検出方法を模 式的に示す図である。
図 1 1 は、 本発明の 1 態様に従 う プローブ核酸の標識方法 の例を示す図である。
図 1 2 は、 本発明の 1 態様に従 う プローブ核酸の標識方法 の例を示す図である。
図 1 3 は、 本発明の 1 態様に従 う プローブ核酸の標識方法 の例を示す図である。
図 1 4 は、 本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体 の作成方法の第一の実施の形態を説明する図である。
図 1 5 は、 本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体 の作成方法の第二の実施の形態を説明する図である。
図 1 6 は、 本発明の標識プローブ核酸を固相化した支持体 の作成方法の第三の実施の形態を説明する図である。
図 1 7 は、 第 1 6 の実施例の結果を示す顕微鏡写真である c 図で用いられた符号は、 以下のとお り である ： 1 …反応容器、 2 ···反応部、 3 …プローブ核酸、 4 a 、 4 b …開口部、 5 …ポリ イ ミ ド薄膜、 6 … ヒーター 7 …温度センサー ；
2 1 a 、 2 1 b …ターゲッ ト核酸、 2 2 a 、 2 2 b …プ ローブ核酸、 2 3 a 、 2 3 b …標識化基質核酸 ；
3 1 a 、 3 1 b 、 3 1 c …ターゲッ ト核酸、 3 2 a 、 3 2 b 、 3 2 c …プローブ核酸、 3 3 …標識化基質核酸、 3 4 …反応部の底面、 3 5 …反応部、 3 6 a 、 3 6 b 、 3 6 c …伸長され標識されたプローブ核酸 ；
8 1 a 、 8 1 b 、 8 1 c …ターゲッ ト核酸、 8 2 a 、 8
2 b 、 8 3 c …プローブ核酸、 8 3 …標識化基質核酸、
8 4 …反応部の底部、 8 5 …反応部、 8 6 a 、 8 6 b 、
8 6 c …伸長され標識されたプローブ核酸、 8 7 a 、 8 7 b …ターゲッ ト核酸 ；
9 1 a …ターゲッ ト核酸、 9 2 …プロープ核酸、 9 3 a …標識化基質核酸、 9 4 …反応部の底部、 9 5 …反応 部、 9 6 a …伸長され標識されたプローブ核酸、 9 1 b
…ターゲッ ト核酸、 9 3 b …標識化基質核酸、 9 6 b … 伸長され標識されたプローブ核酸 ；
1 0 1 …プローブ核酸、 1 0 2 …ターゲッ ト核酸、 1 0 4 …反応部の底面、 1 0 5 …反応部 ；
1 2 1 …铸型核酸、 1 2 2 …種プローブ核酸、 1 2 3
…標識化基質核酸、 1 2 4 …反応部の底面、 1 2 5 …反 応部、 1 2 6 …伸長され標識されたプローブ核酸、 1 2 7 , 1 2 8 …非標識化基質核酸 ； 1 3 1 a 、 1 3 1 b 、 1 3 1 c …铸型核酸、 1 3 2 a 、 1 3 2 b , 1 3 2 c …種プローブ核酸、 1 3 3 …標識化基 質核酸、 1 3 4 …反応部の底面、 1 3 5 …反応部、 1 3 6 a 、 1 3 6 b , 1 3 6 c …伸長され標識されたプローブ 核酸 ；
1 4 1 a …铸型核酸、 1 4 2 …種プローブ核酸、 1 4 3 a 、 1 4 3 b …標識化基質核酸、 1 4 4 …反応部の底面、
1 4 5 …反応部、 1 4 6 a 、 1 4 6 b …伸長され標識さ れたプローブ核酸 ；
1 5 1 …種プローブ核酸、 1 5 2 …反応部の底面、 1 5 3 …錶型核酸、 1 5 4 …第 1 の標識化基質核酸、 1 5 5 …第 2 の標識化基質核酸 ；
1 6 1 a 、 1 6 1 b 、 1 6 1 c …铸型核酸、 1 6 2 a 、 1 6 2 b 、 1 6 2 c …種プローブ核酸、 1 6 3 …標識化基 質核酸、 1 6 4 …反応部の底面、 1 6 5 …反応部、 1 6 6 a 、 1 6 6 b 、 1 6 6 c …プローブ核酸、 1 6 7 a 、 1 6 7 b …ターゲッ ト核酸 ；
2 0 1 …支持体、 2 0 2 …铸型核酸、 2 0 3 …未標識 プローブ核酸前駆体、 2 0 4 …標識ヌ ク レオチ ド、 2 0 5 …非標識ヌ ク レオチ ド、 2 0 6 …標識プローブ核酸 ；
2 0 7 …ジデォキシヌ ク レオチ ド ；
2 0 3 a …未標識プローブ核酸前駆体 A、 2 0 3 b …未 標識プローブ核酸前駆体 B。
発明を実施するための最良の形態
丄. 核 変異解析方法 1 . 1 核酸の変異解析方法の概要
本発明の態様に従う と、 ターゲッ ト核酸の特定部位の塩基 を決定するための方法が提供される。 本方法において、 ター ゲッ ト核酸を選択的に捕獲するための配列を含み、 かつその
5 ' 末端で基体に固相化されているプローブ核酸を用いる。 こ こで使用 される 「核酸」 の語は、 天然に存在する種々 の D N Aおよび R N A、 並びにペプチ ド核酸、 モルホ リ ノ核酸、 メ チルフォス フォネー ト核酸おょぴ S -オ リ ゴ核酸などの人 ェ的に合成された核酸類似体などを示す。
こ こで使用 される 「ターゲッ ト核酸」 と は、 前記核酸の何 れかの核酸であって、 ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンに適切な塩基 長を有する核酸をい う。 ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンに適切な塩 基長と は、 1 0塩基長から 1 0 0 0塩基長であればよ く 、 好 ま しく は 1 5塩基長から 2 0 0塩基長であ り 、 よ り 好ま しく は 1 5塩基長から 5 0塩基長である。
例えば、 本発明に従って好ま しく 対象と されるターゲッ ト 核酸は、 D N A断片、 R N A断片、 ポ リ ヌ ク レオチ ドおよび オリ ゴヌ ク レオチ ド等、 何れの核酸断片であっても よい。 ま た、 当該ターゲッ ト核酸は、 人工的に合成された核酸断片で あっても、 対象から抽出された何れの核酸断片であっても、 それを元に合成された c D N Aおよび R N A断片であっても、 P C Rなどによ り 増幅されて得られた核酸断片であっても よ い。 また、 それ自身公知の何れかの細胞工学的技術によって 操作して得られた核酸の断片であっても よい。
こ こで使用 される 「対象」 の語は、 ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ブ タ、 ヒ ッジ、 ャギ、 ィ ヌ 、 ネコ、 ゥサギ、 ラ ッ トおよびマウ ス を含む任意の哺乳動物、 爬虫類、 魚類おょぴ昆虫などの個 体、 並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、 並びに個 体から採取した細胞おょぴ組織等であっても よい。
上記のよ う な対象からターゲッ ト核酸を含む核酸試料を対 象から得る工程はそれ自身公知の手段によ り 行 う こ とが可能 である。 例えば、 核酸試料がゲノ ム D N Aである場合には、 市販のキッ ト を使用 しても、 他の公知の方法を使用 しても よ い。 また例えば、 核酸試料が R N Aである場合には、 例えば、 市販のキッ ト を使用 しても、 オリ ゴ d Tカ ラムを使用 しても よいが、 これに限定されるのもではない。
本発明の方法で使用 される 「プローブ核酸」 は、 特定の配 列を有する 「ターゲッ ト核酸」 をハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンを 利用 して選択的に捕獲するための核酸である。 従って、 解析 の対象と なる ターゲッ ト核酸の既に分かっている配列の連続 する一部分に相補的な配列を選択用配列と して有する。 プロ ーブ核酸の長さは、 1 0塩基から 1 0 0塩基、 好ま しく は 1 5塩基から 2 5塩基であればよい。 また、 選択用配列の長さ は、 1 0塩基から 5 0塩基、 好ま しく は 1 5塩基から 3 0塩 基であればよい。 プローブ核酸は、 5 ， 末端を介して基体に 固相化されている。
本発明の方法で使用 される 「ターゲッ ト核酸」 は、 本発明 の方法において解析の対象となる配列であ り 、 その塩基を決 定しょ う とする標的部位以外の配列は既に分かっている配列 である こ と が好ま しい。 ターゲッ ト核酸に含まれる標的部位 の 3 ' 側に上記 「選択用配列」 に相捕的な配列が存在する。 また、 標的部位の長さは 1 塩基であっても、 2塩基以上であ つても よいが、 1 塩基である こ とが好ま しい。 また、 ターゲ ッ ト核酸における標的部位の位置は、 プローブ核酸が 5 ' 端 を介して基体に固相化されている場合であれば、 3 ' 端側に 選択用配列に相補的な配列が位置するので、 選択用配列の相 補配列に隣接し、 且つその相捕配列よ り も 5 ' 端側でに位置 すればよ く 、 5 ' 末端であっても、 末端でな く 末端までに幾 つかの塩基を有していても よい。
本発明の態様に従 う方法は、 例えば、 次のよ う に行う こ と が可能である。 先ず最初に、 選択用配列を有するプローブ核 酸を反応容器に固相化する。 次に、 核酸試料をその反応容器 に添加し、 適切なハイプリ ダイゼーシ ョ ンが得られる条件、 例えば、 厳格な （ス ト リ ンジエ ンシーな） 条件、 で反応を行 う。 選択用配列に相補的な配列を有するターゲッ ト核酸が前 記核酸試料に存在すれば、 プローブ核酸にはターゲッ ト核酸 がハイ ブリ ダィ ズする。 これによ り 、 特定の配列を有するタ 一ゲッ ト核酸を核酸試料から捕獲される。 続いて、 そこに検 出可能な信号を生ずる標識物質を付された特定の 1 種類の塩 基を含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポリ メ ラ 一ゼと を反応容器に添加し、 適切な伸長反応が得られる条件 下で伸長反応を行う。 その後、 伸長反応に使用 されなかった 標識化基質を除去し、 標識物質に由来する信号を検出する。 その結果、 当該信号が観察されれば伸長が生じていれる こ と が分かる。 従って、 標的部位の塩基が、 使用 した標識化デォ キシヌク レオシ ド三リ ン酸に含まれるに塩基に相捕的な塩基 であるこ と が分かる。 1 つの核酸試料について、 このよ う な 工程を 4種類の塩基全てについて行っても よい。 また、 標的 部位が遺伝子多型の存在する部位であれば、 その多型の遺伝 子型と な り 得る塩基の種類についてのみ上記の工程を行つて も よい。
本発明の態様においてプローブ核酸は、 その 5 ， 末端を介 して基体に固相化されている。 プローブ核酸の固相化は、 従 来公知の何れかの基体に対して所望のプローブ核酸を固定す る こ とによって行う こ とが可能である。
本発明の態様に従って使用 され得る 「基体」 .は、 そこにお いてハイプリ ダイゼーショ ン反応を行う こ と が可能な形態で あればよい。 例えば、 一般的に使用 される反応容器、 例えば、 キヤ ビラ リ 一形状またはゥエル形状のそこにおいて反応を行 う ための反応部を有した反応容器であっても、 その面におい て反応を行 う よ う な板状および球状の基体であっても よい。 あるいは、 「基体」 が、 針、 糸 （ス ト ラン ド） 、 繊維 （ファ ィパ） 、 円錐 （ディ スク） 、 多孔質フィルタであっても よい c 処理の容易 さから、 キヤ ビラ リ ー形状の反応部を有した反応 容器が好ま しい。
基体が球状である場合、 当該球状の基体を用いて以下に記 載の とお り 、 本発明を実施する こ とができ る。 すなわち、 基 体と して、 検出すべきターゲッ ト に対応する複数のプローブ を固相化した微粒子を調製し、 当該微粒子をキヤ ピラ リ ーま たはゥエル等の反応容器に供給して、 本発明に記載の反応を 実行するこ と ができ る。 当該微粒子は、 反応後に反応容器か ら回収して、 フ ロ ーサイ トメ ーター （ F C M ) やレーザース キヤユングメ ーター （ L S M ) によ る既知の測定に適用 して も よい。 基体と して微粒子を用いた場合、 好ま しく は、 反応 容器であるキヤ ビラ リ 一と連.続する流路の別の場所において 流動させなが ら、 あるいは静止させた状態で測定を行う こ と ができ る。 また、 1 本の流路内の異なる場所に微粒子を順次 移動させて、 それぞれの位置で固相化工程、 反応工程おょぴ 測定工程とい う 一連の工程を同時または連続的に行う こ と も 可能である。 微粒子をキヤ ビラ リ ー内の液体と独立して移動 または停止させるために、 個々 の微粒子が、 既知の磁気的分 離技術を使用可能なよ う に磁性体を含んでいるのが好ま しい このよ う に、 キヤ ピラ リ ー内を流通させる こ と によって、 タ ーゲッ トの種類毎に順番に移動と停止を行 う こ と ができ る。 すなわち、 ある種類のプローブを固相 した微粒子をキヤ ビラ リ 内に流通させ、 その後別の種類のプローブを固相 した微粒 子を流通させる こ と によって、 流路内の上流と下流とで異な る反応を行 う こ と もできる し、 各種ターゲッ トを含む各試料 を流路内に順次流通させる こ と によって、 流路内の上流と下 流と で異なる反応を行う こ と もでき る。
また、 本発明において、 伸長反応時に使用 される基質を標 識するための 「標識物質」 の語は、 検出可能な信号を生じる こ と が可能な物質をいい、 例えば、 蛍光物質、 放射性物質お よび化学発光物質などであってよい。 また、 酵素反応などで 発色する基質を用いても よい。 複数のプローブ核酸を 1 つの 基体において同時に用いる場合など、 所望に応じて識別可能 な複数の標識物質を同時に使用 しても よい。
1 . 2 実施例
以下、 本発明に従う態様例を用いて本発明について更に説 明する。
第 1 の実施例 ： 反応容器
本発明の態様において使用 され得る反応容器の例を図 1 に 示す。 図 1 ( a ) は、 当該反応容器の平面図であ り 、 図 1
( b ) は、 図 1 ( a ) の線 1 B — 1 B に沿った断面図である。 本例における反応容器 1 は、 そこにおいて反応を行う ための 反応部 2 を具備する （図 1 ( b ) ) 。 こ こ で、 反応部 2 は、 図 1 ( b ) に示す通 り の容器内部の形状がキヤ ビラ リ 一形状 である。
また、 図 1 ( a ) および （ b ) に示すよ う に反応容器 1 は、 反応部 2 に試薬などを揷入および/または反応部 2から試薬 などを排出するための開口部 4 a および 4 b を有している。 また、 反応部 2 の底部には、 特定の配列を含むターゲッ ト配 列を捕獲するための選択用配列を含むプローブ核酸 3 が所望 の領域に固相化されている （図 1 ( b ) ) 。 この よ う な反応 容器 1 の製造は次のよ う に行った。
即ち、 キヤ ピラ リ ーを形成可能な溝およびその溝の両端に 孔を有する第 1 の基板 （キヤ ビラ リ 一力パー） と、 その表面 にプローブ核酸が固相化された第 2 の基板と を接合して製造 した。 この と き、 前記プローブ核酸は、 第 1 の基板の溝と第 2 の基板の表面によ り形成される空間內に含まれる。 よ り 具 体的には次の通 り である。 図 1 には、 1 キヤ ピラ リ ーを具備 する反応容器を示したが、 本発明の態様に置いて使用される 反応容器は、 2 以上のキヤ ピラ リ ーを具備する反応容器であ つても よい。
また、 上記の例ではその内部形状がキヤ ビラ リ ー形状の例 を示したが、 キヤ ビラ リ 一形状に限定する ものではなく 、 そ こにおいて所望の反応を行う こ と が可能であればどのよ う な 形状であっても よい。
また、 本発明に従って使用 されるキヤ ビラ リ ーア レイ は、 例えば、 以下の様に変更する こ と も可能である。 図 1 ( c ) は、 図 1 ( a ) の線 1 B — 1 B に沿っ た断面である。 図 1 ( c ) にその断面を示すよ う に、 反応部 2 の下方にヒーター 6 および温度センサー 7 を配置しても よい。 その場合、 例え ば、 プローブ核酸 3 が固相化されるポリ イ ミ ド薄膜 5 の下方 にヒーター 6 を配置し、 ヒーター 6 の下方に温度センサー 7 を配置すればよい。 こ のよ う な装置は、 それ自身公知の何れ かの手法によ り 製造する こ と が可能である。 また、 このよ う な装置に含まれる ヒーターおよびセンサーの配置の位置およ ぴ配置パターンは所望に応じて変更しても よい。 また、 必ず しも、 ヒーターおよびセンサーが当該基板と一体化されて提 供される必要はない。
本実施例に記載のキヤ ビラ リ ーア レイ については、 米国特 許公開 20020013457 ( Akira Suyama) を参照、する こ とカ でき る。 また、 他のキヤ ビラ リ ーア レイ については、 米国特許 6， 143, 152 (Simpson et al. ) を参照する こ とができる。 キヤ ビラ リ ーア レイ は、 米国特許公開 20020013457 ( Akir a Suyama) に記載される よ う に全長に亘つて一定の断面積 を有する よ う に構成される。 これによ り 、 液体の流路内にお ける液量は何処も均等であるから反応条件が等しい。 同 じ理 由によ り 、 キヤ ビラ リ ーア レイ における液体の出入 り は、 特 別な制御手段を用いる こ と なく 定量的に調節されており 、 且 つ脈流のない円滑な液体ハン ドリ ングを可能にする。
第 2 の実施例
( 1 ) 反応容器
以下に示すよ う に、 4つのキヤ ビラ リ一、 即ち、 キヤ ビラ リ ー 1 、 キヤ ピラ リ ー 2 、 キヤ ピラ リ ー 3 およびキヤ ビラ リ 一 4 を具備する こ と以外は第 1 の実施例に記載の反応容器と 同様な反応容器を用いてターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を 決定する方法の例を示す。
第 1 の基板であるガラス板に長さ 3〜 4 c m、 幅 l m m、 高さ 0 . 1〜 0 . 2 mmの溝を 4本开 成し、 これらの夫々 の 溝の両端に貫通孔を形成した。 第 2 の基板には、 ス ト レプ ト アビジンコー トス ライ ド （株式会社グライナ一 ' ジャパン） を用いた。 このス ト レプ トアビジンコー トス ライ ドに対して、 5 ， 末端をピオチン標識した R Vプローブ （ ggaaacagctatga ccatg ; 配列番号 1 ) を点着装置を用いて固相化した。 固相 化は、 第 1 および第 2 の基板を接合した時に、 前記 4本の溝 に相当する夫々の位置に、 R Vプローブが配置されるよ う に した。 この固相化は、 ピオチン一アビジン反応を利用 した。 このよ う な第 1 の基板と第 2 の基板を接合し、 前記 4つの溝 によって 4本のキヤ ビラ リ一、 即ち、 キヤ ピラ リ ー 1 、 キヤ ピラ リ ー 2、 キヤ ピラ リ ー 3 およびキヤ ピラ リ ー 4 を形成し た。 これによ り 、 得られた 4本のキヤ ピラ リ ー内に前記 R V プローブ核酸が具備された。 このよ う にして形成した反応容 器を用いて次の実験を行った。
( 2 ) 遺伝子の変異解析
以下、 遺伝子の変異を解析する方法の 1 例である。 こ こで ίま、 第 4番目 の塩基 「NJ カ 不明である試料 tgcNcatggtcata gctgtttcc ターゲッ ト核酸について、 その 「N」 がアデニン であるのか、 グァニンであるのかを決定する。
前記のキヤ ピラ リ ー 1 と キヤ ピラ リ ー 2 には、 第 1 のター ケッ ト核酸と し の R V comp target ^tgcacatggtcatagctgt ttcc ； 配列番号 2 )を 1 0 0 n M ( 1 X S S C溶液中） の濃 度で添加した。 また、 同様に、 前記のキヤ ピラ リ ー 3 と キヤ ピラ リ ー 4 には、 第 2 のターゲッ ト核酸と しての R V comp target (tgcgcatggtcatagctgtttcc ； 目 ή歹' J番号 3 ) ¾r 1 0 0 n M ( 1 X S S C溶液中） の濃度で添加 した。 これらについて . 3 7 °Cで 1 時間のハイブリ ダィゼーシヨ ンを行った。 ハイ ブ リ ダィゼーシヨ ン後、 1 X S S C溶液 （以下の組成である ； 0 . 1 5 M N a C l 、 0 . 0 1 5 M クェン酸ナ ト リ ウム , p H 7 . 0 ) で十分に洗浄して、 未反応のターゲッ ト核酸を キヤ ビラ リ一内力、ら取り 除いた。 次に 0 . 0 2 m Lの伸長反 応溶液 A [ 1 0 mMの T r i s — H C 1 ( pH7.5) 、 7 m Mの M g C l 2、 0 . 1 mMの D T T、 K l e n o w F r a g m e n t ( DNA ポ リ メ ラーゼ I , Large Fragment； T0Y0B ) ]を 0 . 4 ユニ ッ ト / μ L、 Ι Ο μ Μの C y 3 — d U T P をキヤ ピラ リ ー 1 と 3 に加え （図 2 反応 A ) 、 伸長反応溶液 。 [ 1 0 1111^の丁 1： 1 3 — 11 〇 1 ( pH7.5) 、 7 m Mの M g 〇 1 „、 0 . 1 11^の ]3 丁 丁、 1： 1 6 11 0 F r a g m e n t ( DNA ポ リ メ ラーゼ I ， Large Fragment； T0Y0B0) ] を O . 4 ユニ ッ ト / ju L、 1 0 μ Μの C y 3 — d C T P をキヤ ピラ リ ー 2 と 4 に加え （図 2 反応 B ) 、 これら を 3 7 °Cで 1 2 時間反応 した。
反応後、 0 . 1 X S S Cで十分に洗浄し、 未反応物質を取 り 除き蛍光強度を測定した。 その結果を表 1 に示す。 表 1 は 一番強い蛍光強度を 1 と した場合の相対値で示している。
蛍光強度 (相対値) タ一ゲット核酸 N dNTP キヤピラリー 1 1.000 a UTP キヤピラリー 2 0.012 a CTP キヤピラリー 3 0.017 9 UTP キヤピラリー 4 0.952 9 CTP 表 1 の結果に示される よ う に、 キヤ ピラ リ ー 1 と キヤ ビラ リ ー 4 の蛍光強度が大きい。 こ の結果から、 キヤ ピラ リ ー 1 と キヤ ピラ リ ー 4 に伸長が生 じ、 これに対してキヤ ビラ リ 一 2 と キヤ ビラ リ ー 3 では伸長は生じていないこ と が分かる。 従って、 キヤ ピラ リ ー 1 に添加 したターゲッ ト核酸の標的部 位の塩基は、 アデニンであ り 、 キヤ ピラ リ ー 4 に添加 したタ 一ゲッ ト核酸の標的部位の塩基は、 グァニンである こ と が判 定される。 このよ う に、 加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類 と、 伸長の有無から試料ターゲッ トの 「N」 の塩基が決定され た。
上記の例では、 本発明の態様に従 う方法を説明するために 、 便宜上、 その配列を予め分かっているターゲッ ト核酸、 即 、 R V comp 七31^61; (七§0§03七 §；03七3§0七 1:1:1：00 ; @己歹[|番^" 3 と R V comp target (tgcacatggtcatagctgtttcc ； 酉 d歹 (J番^" 2 ) を用いた。 同様に、 標的部位の塩基の不明な配列についても 、 その塩基を決定する こ とが可能である。 このよ う な態様に よ り 、 遺伝子の変異を検出した ら、 多型の遺伝子型を決定す るこ とが可能である。
このよ う な反応によ り 生じる現象を、 図 2 に模式的に示し た。 本反応では、 （ A 1 ) および （ B 1 ) に示すよ う に、 選 択用配列に相補的な配列を含む核酸試料と してターゲッ ト核 酸 2 1 a および b を、 選択用配列を含むプローブ核酸と して プローブ核酸 2 2 a および b を使用 した。 また、 ターゲッ ト 核酸の標的部位 「 N」 に該当する塩基は Aである。 反応 Aは . キヤ ピラ リ ー 1 で生じる反応を示し、 反応 Bは、 キヤ ビラ リ 一 2 で生じる反応を示す。 反応 Aでは、 標識化基質核酸と し て蛍光標識した塩基 U 2 3 a (即ち、 C y 3 — d U T P ) を 用いた （A 3 ) 。 反応 Bでは、 標識化基質核酸と して蛍光標 織した塩基 C 2 3 b (即ち、 C y 3 — d C T P ) を用いた ( B 3 ) 。 本明細書において、 各略語はそれぞれ、 「A」 は アデニン、 「 U」 はゥラシル、 「 T」 はチミ ン、 「 G」 はグ ァニ ン、 「 C」 はシ トシ ンである。 また、 本明細書において 例と して挙げる塩基は、 記載の便宜上、 例と して挙げている に過ぎないので、 それらの塩基に限定する ものではない。
まず、 反応 Aにおいて生じる事象について説明する。
( A 1 ) プローブ核酸鎖 2 2 a を固相化したキヤ ビラ リ一 にターゲッ ト核酸 2 1 a を含む試料を添加する。
( A 2 ) 当該キヤ ビラ リ ー内の条件をハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンが生じるのに適切な条件とする。 これによ り 、 ターゲッ ト核酸 2 1 a とプローブ核酸 2 2 a がハイブリ ダィズする。
( A 3 ) 次に、 C y 3 で標識した d U T P 2 3 a を基質と して添加し、 キヤ ビラ リ ー内を伸長反応が生じるのに適切な 条件とする。 その結果、 d U T P 2 3 a は、 プローブ核酸 2 2 a に取り込まれ、 プローブ核酸 2 2 a の伸長が起こる。
次に、 反応 Bにおける事象を説明する。
( B 1 ) プローブ 2 2 b を固相化したキヤ ビラ リ 一にター ゲッ ト核酸 2 1 b を含む試料を添加する。
( B 2 ) 当該キヤ ピラ リ ー内の条件をハイ プリ ダイゼーシ ョ ンが生じるのに適切な条件とする。 これによ り ターゲッ ト 核酸 2 1 b とプローブ核酸 2 2 b がハイプリ ダイズする。
( B 3 ) 次に、 C y 3 で標識した 4 C T P 2 3 b を基質と して添加し、 キヤ ピラ リ ー内を伸長反応が生じるのに適切な 条件とする。 その結果、 d C T P 2 3 b は、 ターゲッ ト核酸 2 1 の 「 N」 の位置の塩基に相補性がないために、 ハイ ブ リ ダイズは生じず、 プローブ核酸 2 2 b の伸長は起こ らない c こ こでは、 ターゲッ ト核酸 2 1 a および b は選択用配列に 相捕的な配列を含み、 且つその相捕的配列の 5 ' 側に選択用 配列および相補鎖と は異なる配列を含む。 一方、 プローブ配 列 2 2 a および b は選択用配列を有する。 続く 、 プローブ核 酸 2 2 a および b の 3 ' 端の伸長は、 そこにハイプリ ダイズ しているターゲッ ト核酸の選択用配列に相補的な配列よ り も 5 ' 側の配列を鎊型と して達成される。
上記のよ う なキヤ ビラ リ ー形状の反応容器を使用する と、 使用する試料おょぴ試薬も微量で済むと い う利点がある。 し かしなが ら、 本発明において使用 される反応容器は、 キヤ ピ ラ リ ー形状に限られる ものではない。 また、 上記の例では 1 つの反応容器に 1 本のキヤビラ リ 一が具備される装置の例を 示したが、 これに限定される ものではなく 、 1 つの反応容器 に複数のキヤ ビラ リ 一形状などの内部形状を有する反応部を 有する反応容器を用いてもよい。
上記の模式図では、 便宜上、 1 つのプローブ核酸について 示したがこれに限定する ものではない。 また、 プローブ核酸 の配列は上記の配列に限定する も のではなく 、 所望に応じて 任意に選択し得る。 また、 複数の異なる配列をそれぞれに有 するプローブ核酸を 1 つの基体において用いても よ く 、 同 じ 種類のプローブ核酸を複数使用 しても よい。
以上のよ う な本発明の態様に従 う と、 ターゲッ ト核酸に含 まれる標的部位の塩基の決定に加えて、 同時に、 プローブ核 酸へのラベル付与を容易に行う こ と も可能である。
第 3 の実施例
第 2 の実施例に記載した反応容器を用いて、 同様に第 3 の 実施例を実施した。 また、 第 2 の実施例において使用 した伸長反応液 A と して [ 1 0 111：^の丁 ]： 1 3 — 11 〇 1 ( pH7. 5) 、 7 m Mの M g C
0 I m Mの D T T、 K 1 e n o F r a g m e n t ( DNA ポ リ メ ラーゼ I ， Large Fragment； T0Y0B0) を 0 . 4 ユニ ッ ト / し、 1 0 μ Μの C y 3 — d d U T P ] を用レヽ 伸長反応液 C と して [ l O m Mの T r i s — H C 1 ( pH7.
5) 7 m Mの M g C 1 0 m Mの D T T、 K l e n o w F r a g m e n t ( DNA ポ リ メ フーゼ I , Large Fr a gment ;T0Y0B0) を 0 . 4 ユニ ッ ト Z^u L Ι Ο μ Μの C y 3 - d d C T P ] を用いたこ と 以外の条件は第 2 の実施例の記 載と 同様に して反応を行った。
この反応の結果を表 2 に示す。 表 2 は、 一番強い蛍光強度 を 1 と した場合の相対値で示 している。
表 2 蛍光強度 (相対値) ターゲット核酸 N dNTP キヤピラリー 1 0.991 a UTP キヤピラリー 2 0.022 a CTP キヤピラリー 3 0.011 9 UTP キヤピラリー 4 1.000 g GTP 表 2 の結果に示される よ う に、 キヤ ピラ リ ー 1 と キヤ ビラ リ ー 4 の蛍光強度が大きい。 こ の結果から、 キヤ ピラ リ ー 1 と キヤ ビラ リ ー 4 に伸長が生 じ、 これに対してキヤ ビラ リ ー 2 と キヤ ビラ リ ー 3 では伸長は生じていないこ と が分かる。 従って、 キヤ ピラ リ ー 1 に添加 したターゲッ ト核酸の標的部 位の塩基は、 アデニンであ り 、 キヤ ピラ リ ー 4 に添加 したタ 一ゲッ ト核酸の標的部位の塩基は、 グァニンである こ と が判 定される。
この よ う に、 加えた伸長反応溶液中に含まれる基質の種類 と、 伸長の有無から試料ターゲッ トの 「N」 の塩基が決定され た。
上記の例では、 本発明の態様に従う方法を説明するために 、 便宜上、 その配列を予め分かっている ターゲッ ト核酸、 即 、 R V comp target(tgcgcatggtcatagctgtttcc ; 配歹 [J番 ·¾" 3 )と R V comp target (tgcacatggtcatagctgtttcc ； 酉己歹 (J番号 2 ) を用いた。 同様に、 標的部位の塩基の不明な配列についても 、 その塩基を決定する こ とが可能である。 このよ う な態様に よ り 、 遺伝子の変異を検出 した ら、 多型の遺伝子型を決定す るこ とが可能である。
第 4 の実施例
遺伝子の変異を解析する方法のも う 1 つの例を示す。 こ こ では、 第 4番目 の塩基 「N」 が不明である試料 tgcNcatggtca tagctgtttcc ターゲッ ト核酸について、 その 「N」 がアデ二 ン、 グァニン、 シ ト シンまたはチミ ンであるのかを決定する。
第 1 の実施例に記載した形態の反応容器を用いて、 第 4 の 実施例を実施した。 使用 した反応容器は以下のよ う に製造し た。
即ち、 第 1 の基板には、 ガラス板に長さ 3〜 4 c m、 幅 1 m m、 高さ ◦ . 1〜 0 . 2 m mの溝を 1 本形成し、 この溝の 両端に貫通孔を形成した。 第 2 の基板には、 ス ト レプ トアビ ジンコー トス ライ ド （株式会社グライナ一 ' ジャパン） を用 いた。 こ のス ト レプ ト ア ビジンコー ト ス ライ ドに対して、 5 ' 末端をビォチン標識した R Vプローブ （ ggaaacagctatga ccatg ； 配歹 U番号 1 ) を点着装置を用いて固相化した。 固相 化は、 第 1 および第 2 の基板を接合した時に、 前記 4本の溝 に相当する夫々 の位置に、 R Vプロープが配置される よ う に した。
この よ う な第 1 の基板と第 2 の基板を接合し、 前記溝によ つて 1 本のキヤ ビラ リ ーを形成した。
前記のキヤ ビラ リ ーに、 ターゲッ ト核酸と しての R V comp t ar g e t (. t g c a c a t gg t c a t a g c t g 111 c c ； 酉 S列番号 2 )を 1 0 0 n M ( 1 X S S C溶液中） の濃度で添加した。 これらについ て、 3 7 °Cで 1 時間のハイプリ ダイゼーシヨ ンを行った。 ハ イブリ ダィゼーシ ヨ ン後、 1 X S S C溶液 （以下の組成であ る ； 0 . 1 5 M N a C l 、 0 . 0 1 5 M タエン酸ナ ト リ ゥム、 p H 7 . 0 ) で十分に洗浄して、 未反応のターゲッ ト 核酸をキヤビラ リ ー内から取り 除いた。
次に 0 . 0 2 m L の伸長反応溶液 A [ 1 0 mMの T r i s - H C 1 ( pH7.5) 、 7 mMの M g C l 2、 0 . l mMの D T T、 K 1 e n o w F r a g m e n t ( DNA ポ リ メ ラー ゼ I , Large Fragment； T0Y0B0) ]を 0 . 4 ユニ ッ ト Z /i L 、 並びに 1 Ο μ Μの 6 — F AM— d U T P、 1 0 Mの H E X 一 d A T P 、 l O ^u Mの T A M R A— d C T Pおよび 1 0 μ Μの R O X— d G T P を前記キヤ ピラ リ ーに力 Βえ、 これら を 3 7 °Cで 1 、 2 時間反応した。
反応後、 0 . 1 X S S Cで十分に洗浄し、 未反応物質を取 り 除き蛍光強度を測定した。 蛍光強度の測定は、 励起光と し て 4 8 8 n mと 5 1 4 n mに強いレーザー光を発するァルゴ ン レーザを使用 し、 標識物質と して用いた夫々 の蛍光物質に 応じた波長で蛍光強度を測定した。 使用 した蛍光物質の波長 は、 6 — F A Mは 5 1 3 n m、 H E Xは 5 6 0 n m、 T A M R Aは 5 8 0 n mおよび R O Xは 6 1 0 n mである。
このよ う に 4種類の蛍光物質を標識物質と して使用する こ と によって、 1 キヤ ビラ リ ー内で効率的に標的部位の塩基を 決定する こ とが可能である。
第 5 の実施例
第 4 の実施例に記載した反応容器を用いて、 同様に第 5 の 実施例を実施した。 第 4 の実施例に記載した方法と 同様に、 ターゲッ ト核酸をハイ プリ ダイズした。 次に、 第 4 の実施例 において使用 した伸長反応液に変えて、 次の伸長反応液 [ 1 O mMの T r i s — H C 1 (pH7.5) 、 7 mMの M g C l 2 0 . I mMの D D T、 K 1 e n o w F r a g m e n t ( DN A ポ リ メ ラーゼ I , Large Fragment； T0Y0B0) を 0 . 4 ュニ ッ ト / i L、 1 0 Mの d A T P、 Ι Ο ^ Μの d C T P 、 0 μ Μの d G T Pまたは 1 Ο μ Μの d d G T P、 および 1 0 μ Μの C y 3 — d U T P を含む] を用い、 他の条件は第 4 の実 施例の記載と 同様にして伸長反応を行った。
この反応の結果、 Ο μ Μの d G T P を用いた場合には、 R Vターゲッ ト はその 3 ' 端から C y 3 — Uまで伸.長された。 即ち、 その後の G、 Cおよび Aは伸長されない。 また、 1 0 μ Μの d d G T P を用いた場合には、 R Vターゲッ トはその 3 ' 端から Gまで伸長された。 即ち、 その後の C、 Aは伸長 されない。
このよ う にして、 変異の有無を検出する こ とができ る。
第 6 の実施例
第 6 の実施例を模式図である図 3 を用いて説明する。 本例 では、 それぞれに異なる選択用配列を有する第 1 、 第 2 およ び第 3 のプローブ核酸 3 a 、 3 b および 3 c を固相化した以 外は第 5 の実施例と 同様に作成レた反応容器 3 0 を使用する。 3 Aに示す通 り 、 それぞれのターゲッ ト核酸 3 1 a 〜 3 1 c に含まれる標的部位の塩基を便宜上 「 A」 と して示した。
第 5 の実施例において記載した方法に従って、 先ず、 3 B に示すよ う にターゲッ ト核酸 3 1 a 〜 3 1 c をプローブ核酸 3 2 a 〜 3 2 c に対してハイ ブリ ダィ ズし、 次に、 3 Cに示 すよ う に伸長反応を行う。 続いて、 3 Cにおいて、 反応部 3 5 を例えば、 約 9 5 °Cに温度を上昇させ、 伸長したプローブ 核酸 3 6 からターゲッ ト核酸 3 1 を解離させ、 反応部 3 5 を 具備するキヤ ピラ リ ー内に 0 . 1 X S S C溶液などの緩衝液 を注入し、 排出する こ と によ り 内容液をフローする。 それに よ り 、 解離したターゲッ ト核酸を除去して、 3 Dに示すよ う に、 伸長され標識されたプローブ核酸 3 6 a 、 3 6 b および 3 6 c をそれぞれ 1 本鎖と して得る こ とが可能である。
上記の態様では、 2本鎖核酸の解離手段と して熱処理を行 つているが、 本発明の態様に従って使用可能な 2本鎖核酸の 解離手段は、 これに限定する も のではない。 即ち、 それ自体 公知の一般的に 2本鎖核酸を 1 本鎖に解離する場合に使用さ れる手段であれば何れの手段であってよい。 例えば、 アル力 リ溶液、 尿素またはホルムア ミ ド等を用いても よい。
また、 ターゲッ ト核酸が R N Aであ り 、 プローブ核酸が D N Aである場合、 1 本鎖への解離は、 前記 R N Aを分解する よ う な酵素、 例えば、 R N A a s e Hなどを用いて行っても よい。
上記では 3種類のプローブ核酸と ターゲッ ト核酸の例を示 したが、 これ以上または以下の種類のプローブ核酸および/ またはターゲッ ト核酸を用いても よ く 、 また、 各種類の核酸 を 1 以上で用いても よい。
また、 本例では 2本鎖核酸を 1 本鎖核酸と してから蛍光強 度を測定したが、 二本鎖のままで蛍光強度を測定しても よい c 同様に本明細書に開示した他の例についても 1 本鎖核酸と し てから蛍光強度を測定してもよい。
本発明の態様に従 う と、 上述した第 1 の実施例から第 6 の 実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせて 実行しても、 また、 所望に応じて一部を変更して実施しても よい。
本発明の更なる側面に従う と 、 上述のよ う な第 6 の実施例 に示すよ う な本発明の態様によ り 得られた 1 本鎖標識化プロ ーブ核酸も本発明の更なる態様と して提供される。
例えば、 本発明の態様に従って得た伸長され標識されたプ ローブ核酸を、 1 本鎖にした後に、 更なる標識化プローブ核 酸と して、 後述する第 7 の実施例と して記載する よ う なヌ ク レアーゼプロテク ショ ンアツセィ に利用する こ と も可能であ る。
従来の方法では、 プローブ核酸の中間部位を標識化する場 合には、 高度な技術が必要と されている。 また、 中間部位が 標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合に は、 莫大な時間と費用が必要と されている。 しかしなが ら、 本発明の態様に従う と、 ヌ ク レオチ ドの伸長反応を制御でき るので、 最終的に得られる更なるプローブ核酸の所望の中間 位置を容易に標識化する こ とが可能である。 従って、 ヌ ク レ ァーゼプロテク ショ ンアツセィ に利用するためのプローブ核 酸も短時間に効率よ く 作製する こ とが可能である。
第 7 の実施例
ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィへの利用
核酸分解酵素 （nuclease) である S I ヌ ク レアーゼは、 1 本鎖特異的ェン ドヌ ク レアーゼであ り 、 DNA およぴ RNA と も に酸可溶性の 5 ， 一 Pのヌク レオチ ドに分解し最終的には、 全体の 9 0 %以上を 5 ' — Pのヌ ク レオチ ドに分解する。 ま た 2本鎖中の 1 本鎖部分にも作用 し、 これを分解する酵素で ある。 また、 この酵素は D N A— D N Aおよび D N A— R N Aハイ プリ ッ ド中の 1 本鎖部分の除去などによ く 用い られる c また、 ェキ ソヌ ク レアーゼ I も、 1 本鎖特異的ェク ソヌ ク レ ァーゼであ り 、 1 本鎖 D N Aの 3 ' 端から順番に加水分解し て 5 ' — P のヌ ク レオチ ドにする。 これらの酵素は、 P C R 後のプライマーの除去などに用いられている （図 4 ) 。
ヌ ク レアーゼプロ テク シ ョ ンア ツセィ (Nuclease Protect ion Assay)は、 固相化 したプローブ核酸をあ ら力、じめラベ ルを しておき、 ハイブリ ダィゼーシヨ ン後に 1 本鎖特異的ヌ ク レアーゼを反応させる解析方法である。 例えば、 ターゲッ ト核酸とハイプリ ダイゼーシ ョ ンした 2本鎖 D N Aは、 こ の ヌ ク レアーゼからプロテク シ ョ ンされるので標識が保護され るのに対し、 未反応のプローブ核酸 （例えば、 1 本鎖 D N A など） は分解されるので標識が遊離して しま う。 従って、 そ のプロテク ショ ンされたプローブ核酸の標識量を、 プローブ 核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する こ と によって 測定し、 それによつて遺伝子の発現頻度を測定する方法であ る （図 5 ) 。
このよ う なヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ を本発明 の一部と して変異解析のために利用する こ と も可能である。 例えば、 第 6 の実施例に記載する方法によ り 得た 1 本鎖標識 化プローブ核酸を用いてヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセ ィ によ り核酸を解析しても よい。 また、 第 2 から第 5 の実施 例に記載する方法によ り 得た 2本鎖標識化プローブを第 6 の 実施例に記載する よ う な手段によ り 1 本鎖して得られた 1 本 鎖標識化プローブ核酸を用いても よい。 また、 そのよ う に し て得られた 1 本鎖標識化プローブ核酸は、 本発明の態様に従 つて得られたままで、 即ち、 基体に固相化されたままでヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ に利用 しても よ く 、 或いは 基体から遊離させ回収して利用 しても よい。 更に、 回収した 後に生成した後に使用 してもよい。
本発明の更なる態様を、 図 6 の模式図を用いて説明する。 まず、 第 6 の実施の態様に記載した方法と 同様に、 蛍光強度 の検出以前の段階まで、 即ち、 図 6 の 6 Aから 6 Dまでを行 う。 これによ り 、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ のた めの 1 本鎖標識化プローブ核酸が得られる （ 6 D )。
次に、 核酸配列の解析を行う べき試料を添加し、 ハイ プリ ダイゼーシ ョ ン可能な条件下で反応する。 6 Eに示すよ う に、 試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合それらはハイ ブ リ ダィズする。 即ち、 前記標的核酸を含むターゲッ ト核酸 8 7 a および 8 7 b と標識化プローブ核酸 8 6 a および 8 6 b がそれぞれハイ ブリ ダィズする。 その後、 6 F に示すよ う に、 1 本鎖特異的ェン ドヌ ク レアーゼを添加し、 適切な条件下で 反応する。 その結果、 ハイプリ ダイゼーシヨ ンの生じなかつ た標識化ターゲッ ト核酸 8 6 Cは分解される （ 6 G ) 。 続レ、 て、 反応部 8 5 内の容器をフローさせ、 分解された核酸を除 去し （ 6 G ) 、 蛍光強度を検出する （ 6 H ) 。
本態様によ り使用 されるヌ ク レオチ ドプロテク ショ ンア ツ セィ の詳細な条件は、 実施者によって、 適宜決定されればよ い
こ こに示した態様では、 プローブ核酸の伸長および標識化 から、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ までを連続して 行う例を示したが、 これに限る ものではなく 、 上述したプロ ーブ核酸の伸長および標識化によ り 得られた更なる伸長され 標識されたプローブ核酸を、 ヌ ク レアーゼプロテク シ ョ ンァ ッセィ のための 1 本鎖標識化プローブ核酸と して予め作成し， 所望に応じてヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ に使用 し ても よい。 キヤ ビラ リ 一形状の反応容器を用いる場合の利点の 1 は、 各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定まで の処理を自動化でき る可能性が大きいこ とである。 また、 キ ャ ピラ リ ー形状の反応容器の場合、 そこに含まれる溶液を容 易に置換する こ とが可能であるこ と も更なる利点である。
上述したよ う な本発明の態様によって得られた標識化プロ ーブ核酸を用いれば、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ は次のよ う な利点を得る こ と が可能である。 即ち、 プローブ 核酸を予め蛍光ラベルしておけるのでハイブリ ダィゼーショ ン前のプローブ核酸の固相量を予め知るこ と が可能である。 即ち、 プローブ核酸の固相の量や点着スポッ トの状態を反応 前に知る こ とが可能である。 従って、 プローブ核酸の固相の 精度管理が可能である。 また、 試料と して m R N Aを用いる 場合には、 従来の方法と は異な り 、 これを直接にハイブリ ダ ィゼーショ ン反応させる こ と が可能であるので、 逆転写酵素 で c D N Aを作製した り標識化するな どの作業によ り 生じる 効率のロスを避る こ とが出来る。
第 8 の実施例
本発明の更なる側面に従 う と 、 1 プローブ核酸に対して、 複数回、 ターゲッ ト核酸を含む被検試料を繰り 返し処理する こ と も可能である。
第 1 の実施例に記載した反応容器と 同じ構成を有する反応 容器 1 を使用 し、 本発明の態様に従い 2回繰り 返して処理す る場合の例について、 各工程における各分子の状態を模式的 に示した図 7 を用いて説明する。 まず、 プローブ核酸 9 2 を反応部 9 5 の底面 9 4 に固相化 する。 次に、 反応部 9 5 に対して、 第 1 のターゲッ ト核酸 9 1 a と第 1 の蛍光標識化基質核酸 9 3 a (こ こでは例と して 標識化 d U T P を記載 している） および非標識化基質核酸 (図には示してないが、 例えば、 d C T P、 d G T Pおよび d A T P ) をハイ プリ ダイズ可能な条件の下で加えハイブリ ダイゼーショ ンを行う ( 7 B ) 。 続いて、 ポ リ メ ラーゼを添 加し、 第 1 の標的部位 （図 7 では 「 A」 で示す） の次の塩基 まで伸長反応を行う （ 7 C ) 。
或いは、 上記のハイプリ ダイゼーシ ヨ ンの際に、 蛍光標識 化基質核酸 9 3 a および非標識化基質核酸は添加せずに、 最 初に、 プローブ核酸 9 2 と第 1 のターゲッ ト核酸 9 1 a と を ハイプリ ダイ ズし、 その後、 両基質核酸と ポリ メ ラーゼを添 加して伸長反応を行ってもよい。
こ こで、 所望の箇所、 即ち、 第 1 の標的部位の次の塩基で 伸長反応を停止するためには、 例えば、 第 1 の標的部位の次 の次の塩基に相捕的な塩基からなる d N T P を添加しないと い う 手段を用いればよい。
続いて、 7 Cに示すよ う に、 反応部 9 5 に、 例えば、 0 . 1 X S S C溶液を満た した状態で 9 5 °Cに温度を上昇させ、 伸長されたプローブ核酸 9 6 a からターゲッ ト核酸 9 1 a を 解離させる。 反応部 9 5 を具備するキヤ ビラ リ一内に、 例え ば、 0 . 1 X S S C溶液などを注入し排出する こ と によって 内容液をフ ロー して解離核酸を除去する。 その結果、 7 Dに 示すよ う に、 伸長され標識されたターゲッ ト核酸 9 6 a 力 1 本鎖と して得られる。
続いて、 7 Eに示すよ う な第 2 のターゲッ ト核酸 9 1 b と 第 2 の蛍光標識化基質核酸 9 3 b (こ こでは例と して標識化 d A T P を記載している） およぴ非標識化基質核酸 （図には 示してないが、 例えば、 d C T P 、 d G T P および d U T P ) をハイブリ ダィズ可能な条件の下で、 伸長され標識され たターゲッ ト核酸 9 6 a に対してカ卩ぇノヽイ ブリ ダイゼーショ ンを行う （ 7 G ) 。 続いて、 ポリ メ ラーゼを添加 し、 第 2 の 標的部位 （図 7 では 「 T」 で示す） の次の塩基まで伸長反応 を行う （ 7 H ) 。 続いて、 更に伸長され標識された第 2 のプ ローブ核酸 9 6 b について、 第 1 の蛍光物質およぴ第 2 の蛍 光物質の蛍光強度を測定する （ 7 H ) 。
或いは、 上記のハイブリ ダィゼーシヨ ンの際に、 蛍光標識 化基質核酸 9 3 b および非標識化基質核酸は添加せずに、 最 初に、 プローブ核酸 9 6 a と ターゲッ ト核酸 9 1 b と をハイ ブリ ダィズし、 その後、 両基質核酸と ポリ メ ラーゼを添加し て伸長反応を行ってもよい。
この態様においては、 第 2 の標的部位の次の塩基まで伸長 反応を行った例を示したが、 それ以上伸長しても、 第 2 の標 的部位まで伸長する こ と も可能である。
また、 上記の例では、 プローブ核酸の伸長において、 第 1 の標的部位と第 2 の標的部位の間に 1 の塩基が配置される例 を示したが、 これに限定する ものではなく 、 当該間に塩基が 配置されなく と も、 また 2以上の塩基が配置されても よい。
7 Hに示すよ う に、 得られた伸長され標識されたプローブ 核酸 9 6 b に含まれる第 1 の蛍光物質 （図 7 では星印でしめ す） と第 2 の蛍光物質 （図 7 では X印で示す） は、 識別可能 である こ とが望ま しく 、 互いに異なる波長の蛍光を生じる物 質である こ とが望ま しい。 また、 検出される蛍光強度の違い によって、 判定する場合や、 使用する検出手段の選択によつ ては、 必ずしも互いに異なる波長である必要はない。
また更に、 得られた伸長され標識されたプローブ核酸 9 6 b を 1 本鎖に変性し、 上述した方法の更なる繰り 返しを行つ ても よい。
本発明の態様に従う と、 効率のよい遺伝子変異解析方法が 提供される。
本発明の態様に従う と、 反応容器内で、 検出するべき標的 部位を含むターゲッ ト核酸とハイブリ ダィゼーシ ョ ンしたプ ローブ核酸についてのみ選択的に標識化する こ とが可能であ る。 従って、 効率のよい遺伝子変異解析が可能である と共に、 プローブ核酸の標識化を効率的に行う こ と も可能であ り 、 且 つ反応容器の製造コ ス ト も安価なものと なる。
本発明の態様に従う と、 遺伝子の変異の解析を、 煩雑な操 作を必要とせずに行う こ とが可能である。
本発明の態様に従う と、 標識化から発現頻度解析までの全 ての処理を 1 つの容器内で一括して行う こ とが可能である。
2 . 遺伝子の発現解析方法
2 . 1 遺伝子の発現解析方法の概要
本発明に従 う と 、 被検核酸中の標的配列の存在を検出する 方法が提供される。 そのよ う な被検核酸中の標的配列の存在 を検出する方法の 1 態様を図 8 を用いて説明する。
まず、 検出 したい標的配列を有するターゲッ ト核酸 1 0 2 を設定する。 一方、 前記標的配列に相補的な配列を有し、 且 つその配列の一部の塩基に標識物質を付与されたプローブ核 酸 1 0 1 を準備する （ 8 A ) 。 次に、 プローブ核酸 1 0 1 を 反応部 1 0 5 の底面 1 0 4 に固相化する。 プローブ核酸 1 0 1 を固相化された反応部 1 0 5 に被検核酸を添加 し （ 8 B ) 、 適切なハイ プリ ダイゼーショ ンが可能な条件下で、 それらを 反応させる （ 8 C ) 。 こ こで、 被検核酸中に標的配列を有す るターゲッ ト核酸が存在すれば、 ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンが 生じ、 2本鎖核酸が生じる。
続いて、 1 本鎖特異的ヌ ク レアーゼを添加 し、 適切な酵素 反応が得られる条件下で反応を行 う （ 8 D ) 。 その結果、 1 本鎖のままのプローブ核酸およびターゲッ ト核酸などの当該 反応系に存在する 1 本鎖核酸は当該酵素によって分解される。 この酵素反応の後、 反応系を洗浄し、 そこに残った 2本鎖核 酸に含まれる標識物質からの信号を検出し、 それによつて被 検核酸中に標的配列を有するターゲッ ト核酸が存在する こ と を検出する。
また、 こ の と き、 被検核酸を対象から採取した核酸を含む 試料と し、 上述の通 り に検出を行 う こ と によって、 対象にお ける遺伝子の発現頻度を解析する方法と しても提供される。
本発明で利用 されるヌ ク レオチ ドプロテク ショ ンアツセィ においては、 ヌ ク レアーゼによる分解反応中にヌ ク レアーゼ を含む液体を流動させる工程を加えても よい。 この流動によ つて、 ヌク レア一ゼは固相化された多種類のターゲッ ト に対 応する標識化プローブ核酸に対して均質な分解作用をする。 さ らに、 キヤ ビラ リ ーア レイ のよ う な流路の一方向にヌ ク レ ァーゼを含む溶液を連続的ないし断続的に流動させる よ う に すれば、 分解反応と除去と を継続して実行する こ とができ る し、 静止状態に起こ る よ う な酵素活性の低下も起こ る こ と な く 活性状態を維持する こ と ができ る。 一方、 本発明で利用 さ れるヌク レオチ ドプロテク ショ ンア ツセィ においては、 試料 との反応前および反応後の両方の標識量を測定し、 両方の標 識量を比較する こ と によって真の固相量に基づく 反応量を正 確に産出する工程を付加する こ と もでき る。
このよ う な反応において使用 される 1 本鎖特異的ヌ ク レア ーゼは、 核酸分解酵素 （nuclease) であ り 、 1 本鎖の核酸を 選択的に分解する酵素である。 その 1 つである S 1 ヌ ク レア ーゼは、 D N Aおよび R N A と もに酸可溶性の 5 ， 一 P のヌ ク レオチ ドに分解し最終的には、 全体の 9 0 %以上を 5 ' — P のヌ ク レオチ ドに分解する酵素である （図 4 ) 。 また、 2 本鎖中の 1 本鎖部分にも作用 しこれを分解する。 この酵素は D N A— D N Aおよび D N A— R N Aハイプリ ッ ド中の 1 本 鎖部分の除去などによ く 用いられる。 また、 ェキソヌ ク レア ーゼ I も、 1 本鎖特異的エタ ソヌ ク レアーゼであ り 、 1 本鎖 D N Aの 3 ， 端カゝら順番に加水分解して 5 ' — Pのヌク レオ チ ドにする。 従来、 これらの酵素は、 P C R後のプライマー の除去などに用いられている。
従来のヌ ク レアーゼプロテ ク シ ョ ンア ツセィ （ Nuclease Protection Assay) は、 固相 したプロ ーブ核酸をあ ら力、じ めラベルを しておき、 ハイプリ ダイゼーショ ン後に 1 本鎖特 異的ヌ ク レアーゼを反応させる解析方法である。 例えば、 タ ーゲッ ト核酸とハイプリ ダイゼーシ ョ ンした 2本鎖 D N Aは、 このヌ ク レアーゼからプロテク ショ ンされるので標識が保護 されるのに対し、 未反応のプローブ核酸 （例えば、 1 本鎖 D N Aな ど） は分解されるので標識が遊離して しま う （図 5 ) 。 従って、 そのプロテク ショ ンされたプローブ核酸の標識量を、 プローブ核酸に含まれる標識物質からの信号を検出する こ と によって測定し、 それによつて遺伝子の発現頻度を測定する 方法である。 このよ う な従来のプロテクショ ンアツセィ の例 は、 例えば、 特表 2 0 0 0 — 5 1 2 4 9 9 (米国特許 5， 770, 370 の 日本での公表公報） に記載されている。
前記文献に記載される よ う な従来の方法に比較して、 本発 明は以下のよ う な効果を有する。 本発明の態様に従う と、 上 述したよ う な本方法は、 好ま しく は後述する よ う な温度制御 の可能なキヤ ビラ リ 一形状の反応部を具備する反応容器中で 行われる。 キヤ ビラ リ 一形状の反応部を具備する反応容器を 使用する こ と によ り 、 反応前の操作 （例えば、 固相化や標識 化） を同一のキヤ ビラ リ 一で実行する こ と によって、 効率的 に全ての操作および反応を行う こ と が可能である。 また、 従 来では必要であった煩雑な操作も不要にな り 、 必要な試料の 容量も微量ですむ。 また、 全ての反応について、. 小型の容器 で一括して行 う こ とが可能であるので自動化が可能である。 また、 本発明の態様に従 う と 、 反応前のプローブの固相化の 状態をモニターする こ とが可能である。 更に、 従来の D N A ア レイで行われる よ う な競合反応によ り解析を行う の と異な り 、 本発明の態様では、 他検体同士での比較や、 キヤ ビラ リ 一間での比較、 また、 プレー ト間での比較が可能である。 ま た、 逆転写酵素で c D N Aを作成した り 、 ラベルする作用で 生じる効率の低下などを回避する こ とが可能である。
上述したよ う に、 本発明に従 う発現解析方法は、 図 1 に示 すよ う なキヤ ビラ リ ー形状の反応部 2 を具備する反応容器 1 内において実施される こ とが好ま しい。
本発明において使用 される 「対象」 の語は、 ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ブタ、 ヒ ッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ラ ッ トお よびマウスを含む任意の哺乳動物、 爬虫類、 魚類および昆虫 などの個体、 並びに遺伝子を発現し得るその他の生物個体、 並びに個体から採取した細胞および組織等であってもよい。
本発明において使用 される 「被検核酸」 の語は、 標的配列 の存在の検出対象となる核酸である。 被検核酸は、 自然界に 存在する如何なる核酸であっても、 人工的に作られた核酸で あっても よい。 例えば、 遺伝子の発現頻度を解析する場合に は、 一般的には対象において発現される m R N Aが被検核酸 であってよい。
対象から被検核酸を得る工程はそれ自身公知の手段によ り 行う こ とが可能であ り 、 例えば、 被検核酸が m R N Aである 場合には、 例えば、 市販のキッ トを使用 しても、 オリ ゴ d T カラムを使用 してもよい。 しかしなが ら、 これらの手段に限 定されるのもではない。 また、 被検核酸は、 対象から抽出さ れた後に、 それ自身公知の方法によって増幅されて本発明の 態様に従う 方法に供されても よい。
また、 標識されたプローブ核酸を得る場合に使用する 「鐯 型核酸」 および 「種プローブ核酸」 も どのよ う な核酸であつ ても よい。 こ こ における 「核酸」 は、 天然に存在する種々 の D N Aおよび R N A、 並びにペプチ ド核酸、 モルホ リ ノ核酸、 メ チルフォ スフォネー ト核酸および S -オ リ ゴ核酸などの人 ェ的に合成された核酸類似体などであっても よ く 、 その塩基 配列および修飾の有無などは任意に選択すればよい。
本発明において使用 される 「標的配列」 の語は、 検出され るべき塩基配列を示す。 こ こ で使用 される 「ターゲッ ト核 酸」 の語は、 検出されるべき塩基配列、 標的配列を含む核酸 を示す。
本発明において使用 される 「プローブ核酸」 の語は、 標的 配列を検出するための核酸を示し、 標的配列に相補的な塩基 配列をその一部に含む核酸である。 また、 こ こ で使用 される 「標識化プローブ核酸」 の語は、 その配列の一部分の塩基に 標識物質が付与されている核酸を示す。 本発明の態様に従 う プローブ核酸は、 その 5 ' 末端を介して基体に固相化されて いる。 プローブ核酸の固相化は、 従来公知の何れかの基体に 対して所望のプローブ核酸を固定する こ と によって行う こ と が可能である。
本発明の態様に従って使用 され得る 「基体」 は、 そこにお いてハイ プリ ダイゼーショ ン反応を行う こ と が可能な形態で あればよい。 例えば、 一般的に使用 される反応容器、 例えば, キヤ ビラ リ 一形状またはゥエル形状のそこにおいて反応を行 う ための反応部を有した反応容器であっても、 その面におい て反応を行う よ う な板状および球状の基体であっても よい。 あるいは、 「基体」 が、 針、 糸 （ス ト ラン ド） 、 繊維 （フ ァ ィパ） 、 円錐 （ディ スク） 、 多孔質フ ィ ルタ であっても よい。 処理の容易さから、 キヤ ビラ リ 一形状の反応部を有した反応 容器が好ま しい。
キ ヤビラ リ 一形状の反応部を有した反応容器の場合、 例え ば、 シ リ コ ン基板またはガラス基板などの基体に、 幅およぴ 厚さ約 1 0 〜約 5 0 μ mで形成された溝によ り キヤ ビラ リ一 形状の反応部が形成されても よい。 また、 1 反応容器に具備 されるキヤ ビラ リ 一形状の反応部は、 例えば、 キヤ ビラ リ一 間隔約 5 0 μ πιで 1 反応容器に約 5 0 〜約 1 0 0本/ c mの 本数で具備されても よい。 また、 各々 のキヤ ビラ リ 一は反応 温度に素早く 到達でき る よ う な構成である こ とが好ま しい。
本発明において使用 される 「標識物質」 の語は、 検出可能 な信号を生じる こ と が可能な物質をいい、 例えば、 蛍光物質、 放射性物質および化学発光物質などであってよい。 また、 酵 素反応な どで発色する基質を用いても よい。 また、 異なる部 位に存在する複数の核酸を標的配列と して検出する場合や、 複数のプローブ核酸を 1 つの基体において同時に用いる場合 など、 所望に応じて識別可能な複数の標識物質を同時に使用 してもよい。
本発明の方法において使用 される 1 本鎖特異的ヌク レアー ゼは、 1 本鎖核酸を分解する こ とが可能な酵素であればよい c そのよ う な酵素は、 それ自身公知の何れの酵素を使用 してよ く 、 例えば、 S 1 ヌク レアーゼおよぴェク ソヌ ク レアーゼ I などを使用するこ とが可能である。
2 . 2 標識化プローブ核酸の調製方法
本発明では、 プローブ核酸の所望の部位に対して標識物質 を付与する際に使用 されるそれ自身公知の何れの手段も、 本 発明において使用される 「標識化プローブ核酸」 を調製する 際に使用 してよい。 また、 以下において説明する標識化プロ ープ核酸の調製方法を、 上述の遺伝子発現解析方法で使用 さ れる 「標識化プローブ核酸」 を調製する際に使用 しても よい 以下、 図 9 を用いて 「標識化プローブ核酸」 を調製する方法 を説明する。
先ず最初に、 錶型捕獲用配列を有する種プローブ核酸 1 2 2 を、 その 5 ， 末端を介して反応部 1 2 5 の底面 1 2 4 に固 相化する。 次に、 錶型核酸 1 2 1 を反応部 1 2 5 に添加し、 適切なハイ ブリ ダィゼーシヨ ンが得られる条件、 例えば、 厳 格な （ス ト リ ンジエ ンシーな） 条件、 で反応を行う。 こ こで . 錶型核酸 1 2 1 は、 その 3 ' 端側に铸型捕獲用配列に相補的 な配列 a を、 配列 a の 5 ' 側の隣り に被標識配列 b を、 更に 被標識配列 b の 5 ' 側の隣り に伸長配列 c を含む （ 9 A ) 。 このよ う な構成によって、 铸型核酸 1 2 1 は、 種プローブ核 酸 1 2 2 に対してハイブリ ダィズする。 図 9 には、 被標識配 列 b 力 S 「 A」 即ちアデニンである場合を示す。
ハイプリ ダイゼーショ ンの後に、 ハイブリ ダイゼーシ ョ ン に使われなかった錶型核酸 1 2 1 を除去する。 続いて、 反応部 1 2 5 に対して、 検出可能な信号を生ずる 標識物質を付された特定の 1 種類の塩基を含む標識化デォキ シヌ ク レオシ ド三リ ン酸 1 2 3 と、 伸長配列 c に相補的な塩 基を含む非標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸 1 2 7 およ ぴ 1 2 8 と、 ポ リ メ ラーゼと を反応部に添加し、 適切な伸長 反応が得られる条件下で伸長反応を行 う （ 9 D ) 。 伸長反応 終了後、 伸長反応に使用 されなかった基質を除去する。 その 後、 得られた 2本鎖を変性し、 铸型核酸 1 2 1 を除去する。 それによ り標識されたプローブ核酸 1 2 6 が得られる。 得ら れた標識されたプローブ核酸 1 2 6 は、 反応部 1 2 5 に固.相 化されたままの状態で使用 しても、 回収してから使用 してい よい。
また、 上述の例では、 ハイブリ ダィゼーシヨ ンおょぴ伸長 反応の後に、 反応に供されなかった物質を除去している。 し かしなが らこれらの除去は必ずしも行 う必要はない。
こ こで、 錄型核酸の長さは、 目 的とする標識されたプロ一 ブ核酸の長さ に応じて変更すればよい。 例えば、 铸型核酸の 長さは 1 0塩基から 1 0 0 0塩基でよ く 、 好ま しく は 1 5塩 基から 2 0 0塩基であればよい。
種プローブ核酸の長さは、 1 0塩基から 5 0塩基でよ く 、 好ま しく は 1 5塩基から 3 0塩基であればよい。 また、 上記 の例では被標識配列がアデニンの例を示したが、 これに限定 する ものではな く 、 シ ト シン、 ゥ ラ シル、 チ ミ ン、 グァユン 何れであっても よい。
伸長配列は、 種プローブ核酸に標識化基質が取り 込まれた 後に、 続いて取 り 込まれる非標識化基質の種類および長さを 決定する配列である。 従って、 実施者が任意に選択する こ と が可能である。 しかしながら必ずしも伸長配列が存在する必 要はなく 、 伸長配列が存在しない場合には、 標識化基質が種 プローブ核酸の末端に存在する。 伸長配列の長さは、 1 塩基 から 5 0塩基であればよ く 、 好ま しく は 1 塩基カゝら 1 0塩基 である。
本発明に従う と、 以下の [ 1 ]〜 [ 6 ]に記載の態様も本発明 と して好ま しく 提供される。
[ 1 ] 以下の工程によ り得られる標識化プローブ核酸 ：
( 1 ) 種プローブ核酸に対して、 適切なハイ ブリ ダィゼー シヨ ン可能な条件下で、 前記種プローブ核酸に相補的な相捕 配列と 、 この相補配列の 5 ' 側に存在する被標識配列と、 こ の被標識配列の 5 ' 側に存在する伸長配列と を含む鎳型核酸 を反応させる工程と、
( 2 ) 前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、 且つ 標識物質を付与された標識化基質核酸と、 前記伸長配列に含 まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、 ポリ メ ラ ーゼの存在する条件下で、 前記種プローブ核酸を伸長するェ 程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程で得られた 2本鎖を解離する こ と によ り 、 1 本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
[ 2 ] 以下の工程によ り得られる標識化プローブ核酸 ：
( 1 ) 第 1 の種プローブ核酸に対して、 適切なハイ ブリ ダ ィゼーショ ン可能な条件下で、 前記第 1 の種プローブ核酸に 相補的な第 1 の相補配列と、 こ の第 1 の相補的配列の 5 ' 側 に存在する第 1 の被標識配列と 、 第 1 の被標識配列の 5 ' 側 に存在する第 1 の伸長配列と を含む铸型核酸を反応させるェ 程と、
( 2 ) 前記第 1 の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、 且つ標識物質を付与された第 1 の標識化基質核酸と、 前記第 1 の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非標 識基質核酸と 、 ポ リ メ ラーゼ と の存在する条件下で、 前記
( 1 ) の工程で得られた 2本鎖に含まれる前記第 1 の種プロ ーブ核酸を伸長する工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程における伸長の後に、 当該 2本鎖 を解離する こ と によ り 、 第 2 の種プローブ核酸を得る工程と 、
( 4 ) 前記 （ 3 ) で得られた第 2 の種プローブ核酸に対し て、 適切なハイプリ ダイゼーシ ヨ ン可能な条件下で、 前記第 2 の種プローブ核酸の 3 ， 側の一部の配列に相補的な第 2 の 相補的配列と、 この第 2 の相補的配列の 5 ， 側に存在する第 2 の被標識配列と、 第 2 の被標識配列の 5 ' 側に存在する第 2 の伸長配列と を含む铸型核酸を反応させる工程と、
( 5 ) 前記第 2 の被標識配列の塩基に相補的な塩基を含ん でお り標識物質を付与された第 2 の標識化基質核酸と、 前記 第 2 の伸長配列に含まれる塩基に相補的な塩基を具備する非 標識基質核酸と、 ポリ メ ラーゼと の存在する条件下で、 前記 ( 4 ) の工程で得られた 2本鎖に含まれる前記第 2 の種プロ ーブ核酸を伸長する工程と、
( 6 ) 前記 （ 5 ) の工程における伸長の後に、 当該 2本鎖 を解離する こ と によって 1本鎖と して標識化プローブ核酸を 得る工程。
[ 3 ] 前記 （ 6 ) の工程で得られた標識化プローブ核酸を 種プローブ核酸と して用いて、 前記 （ 4 ) の工程から （ 6 ) の工程を任意の回数だけ繰り 返すこ と によ り 得られる こ と を 特徴とする上記 [ 2 ]に記載の標識化プローブ核酸。
[4 ] 前記種プローブ核酸がその 5 ' 末端を介して基体に 固相化されている こ と を特徴とする上記 [ 1 ]から [ 3 ]の何れ か 1 に記載の標識化プローブ核酸。
[ 5 ] 上記 [ 1 ]から [ 4 ]の何れか 1 に記載の標識化プロ一 ブ核酸を用いる こ と を特徴と し、 以下の工程を含む、 被検核 酸中の標的配列の存在を検出する方法 ；
( 1 ) そこにおいて反応を行 う こ とが可能な流路に固相化 され、 標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、 適切な ハイ プリ ダイゼーシ ョ ン可能な条件下で被検核酸を反応させ る工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程の後に、 1 本鎖特異的ヌク レア一 ゼを前記流路に添加して、 適切な酵素反応を得られる条件下 で反応を行う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程の後に、 前記流路から酵素反応の 分解産物を除去する工程と、
( 4 ) 前記流路内の 2本鎖核酸に含まれる標識物質からの 信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号を基に、 被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。 [6 ] 上記 [ 5 ]に記載の （ 1 ) の工程において使用 される 標識物質を付加された標識化プローブ核酸が、 以下の工程に よ り製造される こ と を特徴とする、 上記 [ 5 ]に記載の被検核 酸中の標的配列の存在を検出する方法 ：
( i) 種プローブ核酸に相補的な相補配列と 、 こ の相補配 列の 5 ' 側に存在する被標識配列と、 この被標識配列の 5 ' 側に存在する伸長配列と を含む铸型核酸を、 適切なハイプリ ダイゼーショ ン可能な条件下で、 種プローブ核酸に対して反 応させる工程と、
( ii) 前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、 且つ 標識.物質を付与された標識化基質核酸と、 前記伸長配列に含 まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と、 ポリ メ ラ ーゼの存在する条件下で、 前記種プローブ核酸を伸長するェ 程と、
( iii) 前記 （ i i ) の工程で得られた 2 本鎖を解離する こ と によ り 、 1 本鎖の標識化プローブ核酸を得る工程。
2 . 3 実施例
本発明の遺伝子の発現解析方法は、 上述の第 1 およぴ第 2 の実施例で記載される反応容器に、 検出 したい標的配列に相 捕的な配列を含む標識化プローブ核酸を固相化して行う こ と ができ る。
第 9 の実施例 ： ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ 1 本発明の態様に従 う被検核酸中の標的配列の存在を検出方 法の例を図 1 0 を用いて説明する。
それ自身公知の何れかの手段によ り 、 所望する部分に対し て標識物質を付与されたプローブ核酸を準備する。 この よ う な標識化プローブ核酸を第 1 の実施例に示す反応容器と 同様 の反応容器の底面に固相化する （ 1 0 D ) 。
例えば、 これに限定される ものではないが、 種プローブ核 酸 1 6 2 a カゝら 1 6 2 c を反応容器の反応部 1 6 5 の底面 1 6 4 に固相ィ匕し （ 1 0 A ) 、 铸型核酸 1 6 l a 力 ら 1 6 1 c と、 蛍光標識化基質核酸 1 6 3 (こ こでは例と して標識化 d U T Pを記載している） およぴ非標識化基質核酸 （図には示 してないが、 例えば、 d C T P、 d G T Pおよび d A T P ) をハイブリ ダィ ズ可能な条件の下で加えてハイ ブリ ダィゼー シヨ ンを行い （ 1 0 B ) 、 ポ リ メ ラーゼを添加 して所望の塩 基まで伸長反応を行い、 更に加熱しなが らまたは加熱後にフ ローを行って一本鎖と し （ 1 0 C ) 、 所望する標識化プロ一 ブ核酸 1 6 6 a 力 ら 1 6 6 c を合成しても よい ( 1 0 D ) 。 また、 こ こでは、 ハイブリ ダィゼーシヨ ン時に蛍光標識化お よび非標識化基質核酸を存在させたが、 ハイ ブリ ダィズ終了 後のポリ メ ラーゼ添加と共に蛍光標識化および非標識化基質 核酸を添加してもよい。
次に、 核酸配列の解析を行 う べき試料を添加 し、 ハイ プリ ダイゼーショ ン可能な条件下で反応する。 1 0 Eに示すよ う に、 試料中に検出すべき標的核酸が存在する場合、 ハイ プリ ダイゼーシヨ ンが生じる。 こ こで示す例は、 前記標的配列を 含むターゲッ ト核酸 1 6 7 a および 1 6 7 b と プロープ核酸 1 6 6 a および 1 6 6 b が、 それぞれにハイプリ ダイズして いる （ 1 0 E ) „ その後、 1 本鎖特異的ヌ ク レアーゼを添加し、 適切な条件 下で反応する （ 1 0 F ) 。 その結果、 ハイ プリ ダイゼーショ ンの生じなかった 1 本鎖のプローブ核酸 1 6 6 c は分解され る （ 1 0 G ) 。 次に、 反応部 1 6 5 内の内容物をフローさせ、 分解された核酸を除去する （ 1 0 G ) 。 続いて、 反応部 1 6 5 について蛍光強度を検出する （ 1 0 H ) 。
本態様によ り 使用 されるヌ ク レオチ ドプロテク シ ョ ンア ツ セィ の詳細な条件は、 実施者によって、 適宜決定されてよい。
ここに示した態様では、 種プローブ核酸の伸長および標識 化から、 ヌ ク レアーゼプロ テ ク ショ ンア ツセィ までを連続し て行う例を示したが、 これに限る も のではない。 予め、 上述 した種プローブ核酸の伸長および標識化によ り 得られた、 更 なる伸長され標識されたプローブ核酸を、 ヌ ク レアーゼプロ テクシ ョ ンア ツセィ のための 1 本鎖標識化プローブ核酸と し て作成しておき、 所望の時期にヌ ク レアーゼプロテク シ ョ ン ア ツセィ に使用 しても よい。 また、 他のそれ自身公知の方法 によって所望の位置に標識を付与した 1 本鎖標識化プローブ 核酸を使用 しても よい。
上述したよ う な本発明の態様に従 う標識化プローブ核酸を 用いれば、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ を次のよ う な有利点をもって行 う こ と が可能である。 即ち、 プローブ核 酸を予め蛍光ラベルしておけるので、 ハイプリ ダイゼーショ ン前に、 予めプローブ核酸の固相量を知る こ と が可能である。 即ち、 固相化されたプローブ核酸量や点着ス ポ ッ ト の状態を 反応前に把握する こ とが可能である。 それによつて、 プロ一 ブ核酸の固相について精度管理を行 う こ と が可能になる。 ま た、 試料と して m R N Aを用いる場合には、 従来の方法と は 異な り 、 これを直接にハイ プリ ダイゼーショ ン反応させる こ とが可能であるので、 逆転写酵素で c D N Aを作製した り標 識化するなどの作業によ り 生じる効率のロスを回避する こ と が可能である。
キヤ ビラ リ 一形状の反応容器を用いる場合の利点の 1 は、 各種溶液を置換するだけで分注および洗浄方法から測定まで の処理を行えるため、 装置を 自動化でき る可能性が大きいこ とである。 また、 キヤ ビラ リ 一形状の反応容器の場合、 そこ に含まれる溶液の置換も容易である。
第 1 0 の実施例 ： ヌ ク レアーゼプロテク シ ョ ンア ツセィ 2 まず、 第 1 の実施例と 同様の方法によ り 反応容器を形成し た。 第 1 の基板に、 ガラス板に長さ 3〜 4 c m、 幅 1 m m、 高さ 0 . 1〜 0 . 2 nx mの溝を形成し、 こ の溝の両端にそれ ぞれ貫通孔を形成した。 第 2 の基板は、 ス ト レプ トア ビジン コー トス ライ ド （株式会社グライナ一 ， ジャパン） である。
ス ト レプ ト ア ビジンコー ト ス ライ ド （ （株） グライ ナ一' ジャパン社製） に対 して、 5 ， 端を ピオチン標識 し、 且つ 3 ' 端力 ら 1 0番目 の Tを C y 3標識した P R H— H P R T 1 M . B D { biotin- G G G G G C T A T A A A T T C T T T G C ( T - C y 3 ) G A C C T G C T G (配列番号 4 ) } を 1 0 n Mで点着装置を用いてスポッティ ングした。 これに よ り ピオチン一アビジン反応でプローブ核酸が固相化された。 続いて、 第 1 の基板と第 2 の基板を接合した。 上述のよ う に して作成した反応容器に前記溝によって形成 されたキヤ ビラ リ一内に、 ターゲッ ト核酸と して 1 O n Mの P R H - H R R T 1 R V . 0 ( C A G C A G G T C A G C A A A G A A T T T A T A G C C C C C (配列番号 5 ) ) を添 カロ した。 この と き、 溶媒と しては 1 X S S C溶液 （ 0 . 1 5 Mの N a C l 、 0 . 0 1 5 Mのク ェン酸ナ ト リ ウム） を使用 した。 これを 4 2 °Cで 1 時間ハイ ブリ ダィズした。 ハイブリ ダイゼーショ ン後、 1 X S S C溶液で十分に洗浄し、 未反応 のターゲッ ト核酸を当該キヤ ビラ リ 一から除去した。 次に、 S 1 ヌ ク レアーゼ溶液 （ 3 O mMの酢酸ナ ト リ ウム （ p H 4 . 6 ) 、 2 8 0 の & じ 1 、 I mMの Z n S 0 4の緩衝液 中） をキヤ ピラ リ ー内に添加し、 3 7 °Cで 1 時間反応した。 反応後、 0 . 1 X S S Cで十分に洗浄し、 未反応物質を除去 して蛍光強度を測定した。 表 3 に P R H— H P R T 1 R V . 0 ターゲッ ト核酸を濃度 1 0 n Mで存在させた場合と、 当該 ターゲッ ト核酸を存在させなかった場合に得られる蛍光強度 を相対的に示した。
表 3
PRH-HPRT1RV.0ターゲッ 卜 蛍光強度 (相対値）
10nM 1.000
OnM 0.012
PRH-HPRT1M.BDプローブ 10Π
表 3 中の蛍光強度は、 一番強い蛍光強度を 1 と した場合の 相対値である。 表から分かる よ う に、 本態様に従う方法によ る と 、 定量的にターゲッ ト核酸の検出を行 う こ とが可能であ る。
本発明の態様に従 う と、 反応容器内で、 標的配列を有する ターゲッ ト核酸にハイプリ ダイズしたプローブ核酸について のみ、 その標識物質からの信号が選択的に検出される。 従つ て、 効率のよい遺伝子発現頻度解析が可能である。
本発明の態様に従 う と、 遺伝子の発現頻度の解析を、 煩雑 な操作を必要とせずに行う こ と が可能である。 また、 本発明 の態様に従う と 、 標識化から発現頻度解析までの全ての処理 を 1 つの容器内で一括して行う こ とが可能である。
本発明に従 う遺伝子の発現頻度の解析は、 従来の解析方法 のよ う な競合反応ではないので、 他検体などについて検出を 行った反応容器と の間で比較をするこ とができ る。 即ち、 複 数の反応容器間 （例えば、 キヤ ビラ リ 一間や、 プレー ト 間な ど）での比較が可能である。
また、 プローブ核酸の固相状況を把握する こ とが可能であ るので、 プローブ核酸の固相量や、 点着スポ ッ トの状態を反 応前に把握する こ とが可能である。 従って、 プローブ固相の 精度管理が可能である。
第 1 1 の実施例 ： 標識化プローブの製造 1
上述のよ う な第 1 の実施例に示すよ う な反応容器を用いて、 次の実験を行った。
前記キヤ ビラ リ一内に、 鍀型核酸と して前記 R V核酸の配 歹 にネ目捕的な R V c o m p t a r g e t 、 tgcacatggtcata gctgtttcc ； 配列番号 2 ) を 1 0 0 n M ( 1 X S S C溶液 中） の濃度で添加し、 3 7 °Cで 1 時間、 ハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンを行った。 ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ン後、 1 X S S C溶液 (以下の組成である ； 0 . 1 5 Mの N a C l 、 0 . 0 1 5 M のクェン酸ナ ト リ ウム、 p H 7 . 0 ) で十分に洗浄して、 未 反応の鎳型核酸をキヤ ビラ リ一内から取り 除いた。 次に 0 . 0 2 πl L の伸長反応溶液 [ 1 0 mMの T r i s — H C l ( p H 7 . 5 ) 、 7 mMの M g C l 2、 0 . I mMの D D T、 K 1 e η ο w F r a g m e n t ( D Ν Α ポ リ メ ラーゼ I ， L a r g e F r a g m e n t ; T O Y O B O ) を 0 . 4ュ ニ ッ ト / μ Ι^、 Ι Ο ^ Μの d A T P、 Ι Ο μ Μの d C T P、 1 Ο μ Μの d G T P、 および 1 Ο μ Μの C y 3 _ d U T P を 含む]を前記キヤ ピラ リ ー内に添加 し 3 7 °Cで 1 〜 2 時間反 応させた。 反応後、 0 . 1 X S S Cで十分に洗浄して未反応 物を取り 除き蛍光を測定した （表 4 ) 。
表 4 は、 種プローブ核酸の基体への点着量を 1 0 n Mまた は I n Mと した場合に、 K l e n o w F r a g m e n t を 添加あ り の場合と添加なしと した場合に得られる蛍光強度を 示す表である。 表中の蛍光強度は、 一番強い蛍光強度を 1 と したと きの相対値である。
表 4 ターゲッ 卜点着量 10n 1n
Klenow Fragmentめ 'り -. 1.000 0.321
Klenow Fragmentなし 0.017 0.012 表 4 に示すよ つ に、 伸長反 M、中に K 1 e n o w F r m e n t を存在させなかった場合には、 相対値は非常に低か つた。 従って、 種プローブ核酸への標識核酸の結合が非特異 的なものではなく 、 ポ リ メ ラーゼによ る伸長である こ とが確 認できた。 また、 種プローブ核酸の点着量の増加に依存して、 相対的蛍光強度も増加した。
このよ う な反応によ り 生じる現象を、 図 9 に模式的に示し た。 本反応では、 9 Aに示すよ う に、 铸型核酸 1 2 1 と して 5 ' 末端をピオチン標識した R V核酸 ( ggaaacagctatgaccat g ; 配列番号 1 ) 1 2 1 を、 プローブ核酸 1 2 2 と して R V c o m p t a r g e t ( tgcacatggtcatagctgtttcc ； 酉己歹 (J 番号 2 ) を使用 した。 また、 被標識配列 b はそこに存在する 塩基を Aと し、 それに相補的な塩基を含む標識化基質核酸と しては蛍光標識した塩基 U 2 3 を用いた （ 9 A ) 。 本明細書 において、 各略語はそれぞれ、 「A」 はアデニン、 「 U」 は ゥ ラ シル、 「 T」 はチ ミ ン、 「 G」 はグァニン、 「 C」 はシ ト シンである。 また、 本明細書において例と して挙げる塩基 は、 記載の便宜上、 例と して挙げているに過ぎないので、 そ れらの塩基に限定する ものではない。
また、 錶型核酸 1 2 1 は、 捕獲用配列 a を含み、 且つその 捕獲用配列 a の 5 ' 側に被標識配列 b を含む。 この捕獲用配 列 a によって、 種プローブ核酸 1 2 2 と のハイブリ ダィゼー シ ヨ ンが達成される。 続く 、 種プローブ核酸 1 2 2 の 3 ' 端 の伸長は、 铸型核酸 1 2 1 の捕獲用配列 a よ り も 5 ' 側の配 列を铸型と して達成される。 更に、 その铸型核酸 1 2 1 の捕 獲用配列 a よ り も 5 ' 側に含まれる被標識配列 b の塩基に対 して、 標識化基質 1 2 3 がハイブリ ダィ ズして取り 込まれる こ と によって、 標識化が達成される。
こ こ では 1塩基の被標識配列を用いた例を示 したが、 被標 識配列は 1 塩基のみを含むものに限らず、 連続した複数の塩 基を含んでいても よ く 、 または断続的な複数の塩基であって あ よい。
このよ う なプローブ核酸の標識化は、 上述のよ う にキヤ ピ ラ リ ー形状の反応容器を使用する と 、 必要と される試料およ ぴ試薬の量が微量でよいとい う効果が得られる。
以上のよ う な本発明の態様に従 う と、 プローブ核酸の標識 化を容易に行 う こ とが可能である。 本態様に従 う と、 所望す る特定の配列を有するプローブ核酸の特定の塩基を選択的に 標識する こ とが可能であ り 、 これによつて、 被検試料中に含 まれる被検核酸に標的配列が存在するか否かを判定する こ と が可能である。 それによ り 、 遺伝子の発現頻度を解析する こ とが可能である。 また、 上述のよ う な方法によ り標識化した プローブ核酸も本発明の範囲内である。
第 1 2 の実施例 ： 標識化プローブ核酸の製造方法 2 第 1 の実施例に記載した反応容器を用いて、 伸長反応液を 変更したこ と以外は第 1 1 の実施例に記載の方法と 同様に標 識化プロープ核酸を作成した。
第 1 1 の実施例において使用 した伸長反応液に変えて、 次 の伸長反応液 { l O mMの T r i s — H C l ( pH7.5) 、 7 mMの M g C l 2、 0 . 1 mMの D D T、 K l e n o w F r a g m e n t ( D N A ポ リ メ ラーゼ I , L a r g e F r a g m e n t ； T O Y O B O ) を 0 . 4ユニッ ト / L 、 1 0 /i Mの d A T P、 Ι Ο μ Μの d C T P 、 Ο μ Μの d G T Pまたは Ι Ο μ Μの d d G T P、 および Ι Ο μ Μの C y 3 — d U T P を含む } を用い、 他の条件は第 1 1 の実施例の記載 と 同様にして標識化プローブ核酸を作成した。
その反応の結果、 0 Μの d G T P を用いた場合には、 種 プローブである R V核酸はその 3 ， 端から C y 3 — Uまで伸 長された。 即ち、 その後の G、 Cおよび Aは伸長されなかつ た。 また、 1 0 / Mの d d G T P を用いた場合には、 R V核 酸はその 3 ， 端から Gまで伸長された。 即ち、 その後の C 、 Aは伸長されなかった。
表 5 は、 種プローブ核酸の基体への点着量を 1 O n Mと 1 n Mと し、 且つ K l e n o w F r a g m e n t を添力!]あ り の場合と添加な しの場合について、 一番強い蛍光強度を 1 と したと きの相対値を示す。
表 5 ターゲッ卜点着量 10n 1n
Klenow卜 ragn^'nt...あり 1.000 0,356
Klenow Fragmentなし 0.024 0.014 表 5 に示すよ う に、 伸長反応中に K l e n o w F r a g m e n t を存在させなかった場合には、 相対値は非常に低か つた。 従って、 種プローブ核酸への標識基質核酸の結合が非 特異的なものではなく 、 ポリ メ ラーゼによ る伸長である こ と が確認できた。 また、 種プローブ核酸の点着量の増加に依存 して、 相対的蛍光強度も増加した。
本発明は、 錶型核酸とハイ ブリ ダィ ズした種プローブ核酸 のみを標識化する こ とが可能である。 また、 鍚型捕獲用配列 にハイプリ ダイ ズするべき標識化基質核酸以外の基質核酸を、 それ以降伸長反応できないよ う なヌ ク レオチ ド（例えば、 d dN TP など）にすれば、 或いは反応系に存在させないよ う にすれ ば、 種プローブ核酸の標識量および伸長程度を制御する こ と ができ る。
また、 種プローブ核酸に取り 込まれる標識物質の量は、 铸 型核酸の量に依存する。 従って铸型核酸と して試料中の被検 核酸を使用すれば、 特定の条件において発現された核酸の情 報を反映した標識化プローブ核酸を作成する こ とが可能であ る。 また、 そのよ う な場合には、 铸型核酸の量は、 その核酸 の発現頻度に依存して変化する ので、 標識化プローブ核酸を 作成する と 同時に、 铸型核酸と して用い られた標的核酸につ いての遺伝子発現頻度も同時に測定する こ と も可能である。 このよ う な遺伝子発現頻度解析方法は、 微量な試料で行 う こ とが可能である。 即ち、 全ての処理を小型の容器内で、 一連 の処理と して行う こ とが可能であるので、 核酸基質 （例えば. d N T P など） の量おょぴ必要な試薬の量を低減する こ と が 可能であ り 、 また、 多検体について短時間に解析する こ と も 可能である。
第 1 3 の実施例 ： 標識化プローブ核酸の製造方法 3
第 1 3 の実施例を模式図である図 1 1 を用いて説明する。 本例では、 それぞれに配列の異なる第 1 の種プローブ核酸 1 3 2 a 、 第 2 の種プローブ核酸 1 3 2 b 、 およぴ第 3 の種プ ローブ核酸 1 3 2 c を反応部の底部 1 3 4 に固相化した以外 は第 1 の実施例と 同様に作成した反応容器を使用する。 また、 1 1 Aでは、 それぞれの铸型核酸 1 3 1 a 〜 l 3 1 c に含ま れる被標識配列は便宜上 「 A」 と して示した。
本発明に従 う標識化プローブ核酸の作成は、 以下のよ う に 行う こ と も可能である。 先ず、 1 1 B に示すよ う に铸型核酸 1 3 1 a 〜 l 3 1 c を種プローブ核酸 1 3 2 a 〜 l 3 2 c に 対してハイ ブリ ダィズし、 次に、 1 1 Cに示すよ う に標識化 基質核酸 1 3 3 を基質と して用いて伸長反応する （ 1 1 B 〜 1 1 C ) 。 続いて、 反応部 1 3 5 について、 例えば、 約 9 5 °Cに温度を上昇させ （ 1 1 C ) 、 伸長したプローブ核酸 1 3 6 から鎳型核酸 1 3 1 を解離させ、 反応部 1 3 5 を具備す るキヤ ピラ リ ー内に 0 . 1 X S S C溶液な どの緩衝液を注入 し、 排出する こ と によって内容液をフローさせる。 それによ り 、 解離したターゲッ ト核酸を除去し、 伸長され標識された プローブ核酸 1 3 6 a カゝら 1 3 6 c を 1 本鎖と して得る （ 1 1 D 。
上記の態様では、 2本鎖核酸の解離手段と して熱処理を行 つているが、 本発明の態様に従って使用可能な 2本鎖核酸の 解離手段は、 これに限定する も のではない。 即ち、 それ自体 公知の一般的に 2本鎖核酸を 1 本鎖に解離する場合に使用 さ れる手段であれば何れの手段であってよい。 例えば、 アル力 リ 溶液、 尿素またはホルムア ミ ド等を用いても よい。
また、 铸型核酸が R N Aであ り 、 プローブ核酸が D N Aで ある場合、 1 本鎖への解離は、 前記 R N Aを分解する よ う な 酵素、 例えば、 R N A a s e Hなどを用いて行ってもよい。
上記では 3種類の種プローブ核酸と鎵型核酸の例を示した が、 これ以上またはこれ以下の種類の種プローブ核酸おょぴ /または鎳型核酸を用いても よ く 、 また、 各種類の核酸を 1 以上で用いてもよい。
本発明の態様に従う と、 上述した第 9 の実施例から第 1 3 の実施例に記載した方法の一部分を所望に応じて組み合わせ て実行しても、 また、 所望に応じて一部を変更 して実施して あ よい。
従来の方法では、 プローブ核酸の中間部位を標識化する場 合には、 高度な技術が必要と されている。 また、 中間部位が 標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合に は、 莫大な時間と費用が必要と されている。 それに対して、 本発明の態様に従う と、 ヌ ク レオチ ドの伸長反応を制御でき る。 従って、 最終的に得られる更なる標識されたプローブ核 酸の所望の中間位置を容易に標識化する こ と が可能である。 それによ り 、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ に利用す るためのプローブ核酸も短時間に効率よ く 作製する こ と が可 能である。
第 1 4 の実施例 ： 標識化プローブ核酸の製造方法 4 ' 本発明の更なる側面に従 う と 、 1 種プローブ核酸に対して、 複数回繰り 返して異なる種類の錶型核酸をハイ プリ させて伸 長処理する こ と も可能である。
第 1 の実施例に記載する反応容器と 同様な反応容器を使用 し、 本発明の態様に従い標識を 2 回繰り 返して行う場合の例 を図 1 2 を用いて説明する。
まず、 第 1 の铸型核酸 1 4 1 と種プローブ核酸 1 4 2 と蛍 光標識基質核酸 1 4 3 a を用意する （ 1 2 A ) 。 次に、 種プ ロープ核酸 1 4 2 を反応部 1 4 5 の底面 1 4 4 に固相化する ( 1 2 B ) 。 次に、 反応部 1 4 5 に対して、 第 1 の铸型核酸 1 4 l a と第 1 の蛍光標識化基質核酸 1 4 3 a (こ こでは例 と して標識化 d U T P を記載している） およぴ非標識化基質 核酸 （図には示してないが、 例えば、 d C T P 、 d G T Pお ょぴ d A T P ) をハイブリ ダイズ可能な条件の下で加えてハ ィプリ ダイゼーシヨ ンを行う （ 1 2 B ) 。 続いて、 ポリ メ ラ ーゼを添加 し、 第 1 の被標識配列 （図 1 2 では 「 A」 で示 す） の次の塩基まで伸長反応を行う （ 1 2 C ) 。
こ こで、 所望の箇所、 即ち、 第 1 の被標識配列の次の塩基 で伸長反応を停止するためには、 第 1 の被標識配列の次の次 の塩基に相補的な塩基からなる d N T P を添加 しないでおけ ばよい。 或いは第 1 の被標識配列の次の塩基に相補的な塩基 からなる基質を d d N T Pにしても よい。
また、 上記では、 蛍光標識基質核酸' 1 4 3 a と非標識化基 質核酸の添加をハイ プリ ダイゼーショ ンに先駆けて添加して いるが、 蛍光標識基質核酸 1 4 3 a と非標識化基質核酸の添 加はハイプリ ダイゼーショ ンの後に、 ポリ メ ラーゼの添加と 同時またはその前後に行ってよい。
続いて、 1 2 Cに示すよ う に、 反応部 1 4 5 に、 例えば、 0 . 1 X S S C溶液を満た した状態で 9 5 °Cに温度を上昇さ せ、 伸長されたプローブ核酸 1 4 6 a から錶型核酸 1 4 1 a を解離させる。 反応部 1 4 5 を具備するキヤ ビラ リ一内に、 例えば、 0 . 1 X S S C溶液などを注入し排出するこ と によ つて内容液をフ ロー して解離核酸を除去する。 その結果、 1 2 Dに示すよ う に、 伸長され標識されたプローブ核酸 1 4 6 a 力 本鎖と して得られる （図 1 2 ) 。
続いて、 1 2 Eに示すよ う な第 2 の铸型核酸 1 4 2 b と第 2 の蛍光標識化基質核酸 1 4 3 b (こ こでは例と して標識化 d A T P を記載している） および非標識化基質核酸 （図には 示してなレヽが、 例えば、 d C T P、 d G T P お よび d U T P ) をハイ ブリ ダイ ズ可能な条件の下で加えハイプリ ダイゼ ーシヨ ンを行 う （ 1 2 G ) 。 続いて、 ポリ メ ラーゼを添加し、 第 2 の被標識配列 （図 1 2では 「 T」 で示す） の次の塩基ま で伸長反応を行 う （ 1 2 H) 。 更に、 铸型核酸 1 4 2 b を解 離させ、 1 本鎖を得る。
また、 上記では、 ハイブリ ダィズに先駆けて第 2 の蛍光標 識基質核酸 1 4 3 b と非標識化基質核酸を添加しているが、 ハイブリ ダィ ズの後で、 ポリ メ ラーゼの添加と 同時、 または その前後に添加してもよい。
この態様においては、 第 2 の被標識配列の次の塩基まで伸 長反応を行った例を示したが、 それ以上伸長しても、 第 2 の 標的配列までで伸長を止めても よい。
また、 上記の例では、 種プローブ核酸の伸長において、 第 1 の被標識配列と第 2 の被標識配列の間に 1 の塩基が配置さ れる例を示したが、 これに限定する も のではなく 、 当該間に 塩基が配置されな く と も、 また 2以上の塩基が配置されても よい。
1 2 Hに示すよ う に、 得られた第 2 の伸長され標識された プローブ核酸 1 4 6 b に含まれる第 1 の蛍光物質 （図 1 2 で は星印でしめす） と第 2 の蛍光物質 （図 1 2 では X印で示す ) は、 識別可能である こ と が望ま しく 、 互いに異なる波長の 蛍光を生じる物質である こ と が望ま しい。 しかしなが ら、 検 出される蛍光強度の違いによって判定する場合や、 使用する 検出手段の選択の仕方によっては、 必ずしも互いに異なる波 長である必要はない。
また更に、 得られた第 2 の伸長され標識されたプローブ核 酸 1 4 6 b を更に 1 本鎖に変性し、 上述した方法を更に繰り 返しても よい。
以下に、 具体的な 1 例を挙げて更に説明する。
まず、 第 1 の実施例に記載の反応容器と 同様な反応容器を 用いて、 ハイプリ ダイゼーショ ン可能な条件下で第 1 の種プ ローブ核酸と第 1 の铸型核酸とのハイプリ ダイゼーショ ンを 行 う。 続いて伸長反応溶液を { 1 0 mMの T r i s - H C 1
( H 7 . 5 ) 、 7 mMの M g C l 0 m Mの D D T
K 1 e n o w F r a g m e n t ( D N A ポ リ メ ラーゼ I L a r g e F r a g m e n t ; T O Y O B O ) を 0 . 4 ュ ニ ッ ト / L 、 Ι Ο μ Μの d A T P 、 の d C T P 、
Ο μ Μの d G T P、 および Ι Ο μ Μの C y 3 — d U T P を含 む } を用いる こ と を除き、 第 1 1 の実施例に記載の方法と 同 様の方法によ り伸長反応を行う。 このハイブリ ダィゼーショ ンと伸長反応によって、 第 1 の 錶型核酸の存在おょぴその配列情報が第 1 のプローブ核酸の 伸長および標識化に反映される。 即ち、 第 1 の種プローブ核 酸にハイブリ ダィズした第 1 の铸型核酸を鎵型と して、 第 1 の種プローブ核酸が伸長され、 C y 3 — Uが取 り 込まれ、 G の手前まで伸長される。 その結果、 第 1 の鎵型核酸にハイプ リ ダイズした第 1 の伸長され標識されたプローブ核酸が得ら れる。
次に、 温度を約 9 5 °Cに上昇させる こ と によ り 、 第 1 の伸 長され標識されたプローブ核酸から第 1 の铸型核酸を解離す る。 更に、 反応部に含まれる溶液をフローする こ と によ り 、 遊離した第 1 の铸型核酸を除去する。
続いて、 第 2 の錶型核酸をハイ プリ ダイゼーショ ン可能な 条件下においてハイブリ ダィ ズさせ、 伸長反応溶液を { 1 0 mMの T r i s — H C 1 ( p H 7 . 5 ) 、 7 mMの M g C l 2、 0 . I mMの D D T 、 K 1 e n o w F r a g m e n t ( D N A ポ リ メ ラーゼ I , L a r g e F r a g m e n t ； T O Y O B O ) を 0 . 4ユニッ ト 1 0 Μの C y 5 - d A T P , Ο μ Μの d C T P 、 1 0 /z Mの d G T P 、 および 1 0 μ Μの d T T P を含む } を用いる こ と を除いて第 1 1 の実施例に記載の方法と 同様の方法によ り 伸長反応を行 う
上記の反応によ り 、 第 2 の錶型核酸の存在が反映され、 第 2 の鎳型核酸と第 1 の伸長され標識されたプローブ核酸と の ハイ ブリ ダィゼーショ 'ンが生じ、 続いて、 更なる伸長おょぴ 標識化が生じ、 第 2 の伸長され標識されたプローブ核酸が得 られる。 第 2 の伸長され標識されたプローブ核酸は、 C y 5 一 Aで標識化され、 Cの手前まで伸長される。
次に、 得られた 2本鎖を変性して 1 本鎖にする こ と によ り 、 標識されたプローブ核酸を得る こ とが可能である。 この標識 されたプローブ核酸は、 所望によっては基板から回収して使 用 してもよい。
こ こで、 C y 3 と C y 5 の蛍光強度をそれぞれにまたは相 対的に測定する こ と によって、 使用 した第 1 の鎵型核酸と第 2 の鎊型核酸の量または相対量を測定する こ と も可能である。 以上のよ う な本発明の態様に従う と、 複数のハイプリ ダイ ゼーショ ンおよび標識化に関する全ての処理が、 小型の容器 内で、 一括して、 即ち、 一連の操作によって行 う こ とが可能 である。 従って、 少ない試料で、 所望する遺伝子発現頻度解 祈を短時間に、 簡便に行 う こ と が可能である。 また、 プロ一 ブ核酸の伸長の程度を制御でき、 また、 所望のプローブ核酸 を伸長していく 途中の所望の部位に容易に標識を行う こ とが 可能である。
第 1 5 の実施例 ： 標識化プローブ核酸の製造方法 5
本発明の態様に従い使用され得る種プローブ核酸と铸型核 酸とがハイ プリ ダイ ズした場合の状態の例を、 図 1 3 の 1 3 Aから 1 3 Dまでに模式的に示す。
上述した通 り 、 種プローブ核酸 1 5 1 は、 反応部の底部 1 5 2 にその 5 ' 末端を介して固相化されている。
1 3 Aに示すよ う に、 鎳型核酸 1 5 3 の全長は、 種プロ一 プ核酸 1 5 1 の全長よ り も長いこ と が好ま しい。 それによ り 、 铸型核酸 1 5 3 と鎵型核酸 1 5 1 がハイ ブリ ダィズした際に、 その長さの違いから生じる鎵型核酸 1 5 3 の 1 本鎖の部分を 铸型と して、 種プローブ核酸 1 5 1 の 3 ， 末端が伸長される。 また、 この と き被標識配列は鍀型核酸 1 5 3 の 1 本鎖の部分 の最も 3 ' よ り に存在するこ とが好ま しい。
また、 1 3 Aおよび 1 3 C に示すよ う に、 種プローブ核酸 1 5 1 の全長に相補的な配列を、 铸型核酸 1 5 3 が含み、 そ の上で、 更に余分な配列が铸型核酸の 5 ' 側に含まれる よ う にしても よい。
或いは、 1 3 Bおよび 1 3 Dに示すよ う に、 種プローブ核 酸 5 1 の一部に相補的な配列を铸型核酸 1 5 3 の 3 ' 側が含 み、 更に余分な配列を铸型核酸 1 5 3 の 5 ' 側に含むよ う に 設計しても よい。
また、 1 3 Aおよび 1 3 B に示すよ う に、 被標識配列と し て 1 ヌ ク レオチ ドが 1 箇所に設定されても よ く 、 1 3 Cおよ ぴ 1 3 Dに示すよ う に、 被標識配列と して 1 ヌ ク レオチ ドが 2箇所以上で設定されてもよい。
上述のまた、 上述の第 1 1 の実施例から第 1 5 の実施例ま での何れかによ り得られる標識化プローブ核酸を、 上述の第 9 の実施例および第 1 0 の実施例において用いて、 同様にァ ッセィ しても よい。 第 1 1 の実施例から第 1 5 の実施例によ り得られた 1 本鎖標識化プローブ核酸は、 基体に固相化され たままでヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ に利用 されて も よ く 、 或いは基体から遊離させ回収した後に利用 しても よ い。 また、 回収して、 更に精製した後で使用 してもよい。
上述したよ う な本発明の態様によって得られた標識化プロ ープ核酸を用いれば、 ヌ ク レアーゼプロテク ショ ンア ツセィ を次のよ う な有利点をもって行 う こ とが可能である。 即ち、 プローブ核酸を予め蛍光ラベルしておけるので、 ハイブリ ダ ィゼーショ ン前に、 予めプローブ核酸の固相量を知る こ と が 可能である。 即ち、 固相化されたプローブ核酸量や点着スポ ッ トの状態を反応前に把握する こ とが可能である。 それによ つて、 プローブ核酸の固相について精度管理を行う こ と が可 能になる。 また、 試料と して m R N Aを用いる場合には、 従 来の方法と は異な り 、 これを直接にハイプリ ダイゼーショ ン 反応させる こ とが可能であるので、 逆転写酵素で c D N Aを 作製した り標識化するなどの作業によ り 生じる効率のロスを 回避する こ とが可能である。
上述のよ う な本発明によって、 効率のよい遺伝子発現頻度 解析方法が提供された。 また、 上述のよ う な本発明によって、 複数のプレー ト間での比較が可能な遺伝子発現頻度解析方法 が提供された。 更に、 上述のよ う な本発明によって、 検出精 度のよい遺伝子発現頻度解析方法が提供された。
3 . 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法
3 . 1 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法の 概要
上記 2 . 2 の欄で説明した 「標識化プローブ核酸の調製方 法」 は、 別の側面に従えば、 標識プローブ核酸を固相化した 支持体の作成方法とい う こ と もでき る。 以下、 標識プローブ 核酸を固相化した支持体の作成方法について詳説する。 当該 方法によ り 作成される標識プローブ核酸を固相化した支持体 は、 核酸を用いた種々の解析、 例えば遺伝子の発現解析等に 有用である。 と り わけ、 上記 2 . 1 の欄で説明 した 「ヌク レ ァーゼプロテク ショ ンア ツセィ を利用 した遺伝子の発現解析 方法」 に有用である。
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法について、 第一から第三の実施の形態を例に説明する。
第一の実施の形態
本発明の第一の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、
( 1 ) 作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な鎵 型核酸と 、 前記铸型核酸の塩基の総数よ り 少な く 、 作成した い標識プローブ核酸の 3 ， 端の 1 以上のヌ ク レオチ ドが欠損 している未標識プローブ核酸前駆体であって、 その 5 ' 端で 支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体と を、 これらがハイ プリ ダイ ズ可能な条件下で、 反応させる工程と、
( 2 ) 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、 特定塩 基の標識ヌ ク レオチ ドと 、 前記特定塩基以外の他の塩基の非 標識ヌ ク レオチ ドと を基質と して用いて、 前記未標識プロ一 プ核酸前駆体の欠損部分を、 前記錶型核酸を錶型と して、 5 ' から 3 ' 方向に向かって伸長させ、 標識プローブ核酸を 合成する工程と、
( 3 ) 前記工程によ り 得られた標識プローブ核酸と、 前記錶 型核酸と の間の相補的結合をすベて解離させる工程と、 ( 4 ) 解離された前記鐯型核酸を支持体上から除去する工程 と
を含む。
第一の実施の形態では、 支持体上に作成される各標識プロ ーブ核酸は、 その 3 ' 側に標識ヌ ク レオチ ドが導入される。
以下、 各工程について、 図 1 4 を参照しなが ら順に説明す る。
[工程 （ 1 ) ]
工程 （ 1 ) の反応によ り 、 図 1 4 ( a ) に模式的に示す状 態が作成される。
まず、 目的とする解析に応じて、 支持体上に作成する標識 プローブ核酸の塩基配列をデザィ ンする。 一般に標識プロ一 ブ核酸の長さは、 1 5〜 5 0塩基とする こ とができ る。
デザィ ン された標識プローブ核酸の塩基配列に基いて、 「鎵型核酸 2 0 2」 および 「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3」 を調製する。
こ こで、 「铸型核酸 2 0 2」 および 「未標識プローブ核酸 前駆体 2 0 3 」 は、 それぞれ、 D N Aを構成するデォキシリ ボヌク レオチ ド ·（ dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP ) 、 R N Aを構成 する リ ボヌ ク レオチ ド （ ATP、 UTP、 GTP、 CTP ) 、 その他 d UT P等のヌ ク レオチ ドから構成され得る。
「铸型核酸 2 0 2」 は、 作成したい標識プローブ核酸に相 補的な配列を有する よ う に調製される。 一方、 「未標識プロ ープ核酸前駆体 2 0 3 」 は、 「鎵型核酸」 の塩基の総数よ り 少なく 、 作成したい標識プローブ核酸の 3 ' 端の 1 以上のヌ ク レオチ ドが欠損するよ う に調製される。 こ の欠損部分に、 後の工程で標識ヌク レオチ ドが少なく と も一つ導入される。 こ こで、 欠損させるヌ ク レオチ ドの数は、 好ま しく は 2 〜 1 0個とする こ と ができる。 欠損させるヌ ク レオチ ドの数を好 ま しく は 2以上と した理由は、 標識プローブ核酸の 3 ' 端の ヌ ク レオチ ドに標識が取込まれる こ と を、 標識の安定性の観 点から避けるためである。 また、 欠損させるヌ ク レオチ ドの 数を好ま しく は 1 0 以下と した理由は、 取込まれる標識ヌ ク レオチ ドの数を制限するためである。
欠損させるヌ ク レオチ ドの数は、 作成したい標識プローブ 核酸の 3 ' 端側の塩基配列と、 欠損部分に後の工程で導入す る標識ヌ ク レオチ ドの塩基の種類と を考慮して決定する。 例 えば、 作成したい標識プローブ核酸が、 その 3 ' 端から AAC UA CAUUA · · · と い う配列を有し、 欠損部分に導入する標識 ヌ ク レオチ ドが Cy 5 - dUTP である場合、 「未標識プローブ核 酸前駆体」 は、 作成したい標識プローブ核酸の 3 ' 端から 4 〜 7 のヌ ク レオチ ドを欠損させる こ と ができ る。 この場合、 標識ヌ ク レオチ ド C y 5 - dUTP は、 欠損部分に一つだけ導入さ れる こ と になる。 こ の よ う に、 「未標識プローブ核酸前駆 体」 に一つの標識ヌ ク レオチ ドのみが導入される よ う に、 欠 損させるヌ ク レオチ ドの数を制御すれば、 D N Aア レイ上の すべての標識プローブを同じ標識物質の量で均一に標識する こ とが可能である。
「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3 」 は、 その 5 ' 端で支 持体 2 0 1 に固相化されている （図 1 4 ( a ) ) 。 本発明の 方法において 「支持体 2 0 1 」 は、 そこにおいてハイブリ ダ ィゼーショ ン反応を行う こ とが可能な形態であればよい。 例 えば、 一般的に使用 される反応容器、 例えば、 キヤ ビラ リ一 形状またはゥエル形状のそこにおいて反応を行う ための反応 部を有した反応容器であっても、 その面において反応を行う よ う な板状おょぴ球状の支持体であっても よい。 あるいは、 「支持体」 が、 針、 糸 （ス ト ラ ン ド） 、 繊維 （フ ァ イ バ） 、 円錐 （ディ スク） 、 多孔質フィルタであっても よい。 キヤ ピ ラ リ ー形状の反応部を有した反応容器 （以下、 キヤ ビラ リ一 ア レイ と もい う） は、 反応部内の溶液を置換する こ とが容易 であるため好ま しく 使用 される。 キヤ ビラ リ ーア レイ の具体 的な説明については、 上述の第 1 およぴ第 2 の実施例の記载 を参照する こ とができ る。 こ こ で用いた 「支持体」 の用語は、 上記 「基体」 と同 じ意味を有する。
「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3 」 の支持体への固相化 は、 従来公知の方法によ り行う こ とができ る。 例えば、 核酸 の固相化は、 後述の実施例のよ う にアビジンコー ト された支 持体と、 ピオチン標識された 5 ' 端を有する核酸と を用いて ピオチンア ビジン反応によ り 行っても ょレヽ し、 あるいは、 反 応基を導入した支持体と、 該反応基と反応性を有する反応基 を 5 ' 端に有する核酸と を用いて化学結合によ り行っても よ い o
ェ.程 （ 1 ) において、 「铸型核酸 2 0 2」 と、 支持体 2 0
1 上に固相された 「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3」 とが ハイ プ リ ダイ ズされた状態が作成される （図 1 4 ( a ) 参 照） 。 こ こでのハイブリ ダィゼーシ ヨ ンは、 「鎵型核酸」 と 、 支持体上に固相されていない 「未標識プローブ核酸前駆体」 と をハイブリ ダイズさせた後に、 支持体上に固相 しても よい し、 「鎵型核酸」 と、 支持体上に予め固相 した 「未標識プロ ーブ核酸前駆体」 と をハイプリ ダイズさせても よい。
「ハイブリ ダィ ズ可能な条件下で反応させる」 と は、 例え ば適切なハイ ブリ ダィゼーシヨ ン溶液 （ 1 X S S C ) 中で、 2 5 〜 7 0 °Cで （または 9 5 °Cで 5分間ののち徐冷して 2 5 〜 7 0 °Cで） 5 〜 6 0分間静置させる こ と をレヽ う。
[工程 （ 2 ) ]
工程 （ 2 ) において、 「未標識プロ ーブ核酸前駆体 2 0 3 」 の欠損部分 （すなわち 3 ' 側） が、 「铸型核酸 2 0 2 J を錶型と した伸長反応によ り 修復される と と もに、 「未標識 プローブ核酸前駆体 2 0 3」 に標識ヌ ク レオチ ド 2 0 4 が導 入される （図 1 4 ( b ) 参照） 。
こ こでの伸長反応には、 その基質と して、 「検出可能な信 号を生ずる標識物質を付された、 特定塩基の標識ヌ ク レオチ ド 4」 と、 「当該特定の塩基以外の他の各塩基の非標識ヌ ク レオチ ド 5 」 とが使用 される。 こ こで 「標識物質」 と は、 検 出可能な信号を生じる こ とが可能な物質をいい、 例えば蛍光 物質、 放射性物質、 化学発光物質等であ り 得る。 「特定塩基 の標識ヌ ク レオチ ド」 と して、 1 種類の塩基の標識ヌ ク レオ チ ドを使用 し、 「当該特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌク レオチ ド」 と して、 他の 3種類の塩基の各ヌ ク レオチ ドを使 用する こ とができ る。 ただし、 これに限定されず、 複数種類 ' の塩基のヌ ク レオチ ドを標識ヌ ク レオチ ドと して使用 しても よい。 あるいは、 後述の第二の実施の形態に記載される とお り 、 ある種類の塩基のヌ ク レオチ ドを基質と して使用 しなく ても よい。 例えば 「標識ヌ ク レオチ ド」 と して、 Cy5- d UTP を用い、 「非標識ヌ ク レオチ ド」 と して、 dATP、 d CTP およ ぴ d GTP を使用するこ とができ る。
伸長反応溶液は、 上述の基質と なるヌ ク レオチ ド、 伸長反 応酵素 ( T4 DNA polymerase) 、 Tris buffer, M g 2+を含 む公知の溶液を使用する こ と ができ る。 伸長反応は、 例えば 2 5 〜 7 0 °Cで 5 〜 1 2 0分間行う。
「標識ヌ ク レオチ ド」 と して、 Cy5- d UTP を用いる場合、
「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠損部分に、 当該伸長反応 によ り 少なく と も 1 つの Cy5- d UTP が導入される よ う に、
「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠損部分のヌ ク レオチ ド数 を設計する こ とが必要である。 すなわち、 伸長反応の際に錶 型と なる 「鎵型核酸」 の部分に、 d ATP が少なく と も 1 っ存 在していなければ、 Cy5- d UTP は導入されないため、 Cy5- d UTP が導入される よ う に 「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠 損部分のヌク レオチ ド数を設計する必要がある。
好ま しく は、 「標識ヌ ク レオチ ド」 と して Cy5- d UTP を用 いる場合、 「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠損部分に、 当 該伸長反応によ り 「 1 つの」 Cy5- d UTP が導入される よ う に、
「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠損部分のヌ ク レオチ ド数 を設計する。 支持体上のすべての 「未標識プローブ核酸前駆 体」 の欠損部分のヌ ク レオチ ド数を、 当該伸長反応によ り 1 つの Cy 5- d UTPが導入される よ う に設計しておく と、 すべて のプローブ核酸 1 分子に対して、 均一に 1 つの Cy 5- d UTP を 導入する こ と ができる。 これによ り 、 支持体上のすべてのプ ローブ核酸を、 1 回の伸長反応によ り 、 均一な標識量で標識 する こ とが可能になる。
ただし、 第一の実施の形態において、 作成された標識プロ ーブ核酸の 3 ' 端のヌ ク レオチ ドに標識が取込まれる よ う に する こ と は、 標識の安定性の面から望ま しく ない。
[工程 （ 3 ) ]
工程 （ 3 ) において、 工程 （ 2 ) の伸長反応によ り 作成さ れた 「標識プローブ核酸」 と 、 「鎵型核酸」 と の間の相補的 結合をすベて解離させる （図 1 4 ( c ) 参照） 。
こ こでの解離は、 後述の実施例のよ う に支持体上の伸長反 応溶液を、 0 . 1 N N a O H溶液に置換し、 当該溶液中で 5 〜 1 0分間室温で反応させる こ と によ り 行っても よいし、 9 0 〜 9 8 °Cで 5 〜 1 0分間維持し、 熱処理を施すこ と によ り 行っても よい。
[工程 （ 4 ) ]
工程 （ 4 ) において、 工程 （ 3 ) で解離された 「鎵型核 酸」 等を支持体上から除去し、 標識プローブ核酸が固相化さ れた支持体を作成する。 こ こでの除去は、 緩衝液、 オー ト ク レーブ水等を用いた洗浄によ り行 う こ とができ る。
以上第一の実施の形態で説明 したとお り 、 支持体上のプロ ーブ核酸前駆体の 3 ' 端のヌ ク レオチ ドを幾つか欠損させて おく こ と によ り 、 プローブ核酸の 3 ' 側に標識を付与する こ とが可能である。 これを支持体上に複数の標識プローブ核酸 を作成する際に適用 して、 支持体上のすべてのプローブ核酸 前駆体の 3 ， 端のヌク レオチ ドを幾つか欠損させておけば、 支持体上のすべてのプローブ核酸を一回の伸長反応で標識す る こ とが可能である。
また、 本発明の方法は、 支持体上のすべてのプローブ核酸 前駆体の欠損部分を、 導入する標識ヌ ク レオチ ドの塩基の種 類に応じて、 1 つの標識ヌ ク レオチ ドのみが導入される よ う に設計しておく こ と によ り 、 支持体上のすべてのプローブ核 酸に対して、 それぞれ均一な標識量の標識を導入する こ とが でき る。
これによ り 、 支持体上のすべてのプローブ核酸を、 1 回の 伸長反応によ り 、 均一に標識する こ とが可能になる。 この よ う に、 1 回の伸長反応で、 支持体上のすべてのプローブ核酸 を標識でき る とい う 点において本発明は簡便であ り 、 加えて、 欠損部分のヌク レオチ ド数を制御する こ と によ り 、 核酸プロ ーブに導入する標識物質の量を制御でき る とい う 点において 優れている。
第二の実施の形態
本発明の第二の実施の形態に係る方法は、 第一の実施の形 態に係る方法と基本的には同 じであるが、 以下の点を特徴と する。 すなわち、 第二の実施の形態に係る方法は、 欠損部分 の伸長反応に使用する ための 「特定塩基の標識ヌ ク レオチ ド」 が、 1 種類の塩基の標識ヌ ク レオチ ドであ り 、 欠損部分 の伸長反応に使用するための 「前記特定塩基以外の他の塩基 の非標識ヌ ク レオチ ド」 の少なく と も 1 種類が、 ジデォキシ ヌ ク レオチ ドであるか、 あるいは存在しないこ と を特徴とす る。
このよ う に第二の実施の形態に係る方法は、 上記特徴以外、 第一の実施の形態に係る方法と 同様であるため、 各工程の詳 細については、 上記第一の実施の形態の工程の各説明を参照 されたい。 第二の実施の形態の概要を、 図 1 5 に模式的に示 す。
第二の実施の形態では、 まず、 「铸型核酸 2 0 2」 と、 支 持体 2 0 1 上に固相された 「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3 」 と がハイ ブ リ ダィ ズされた状態が作成される （図 1 5 ( a ) 参照） 。 次いで、 「未標識プロ ーブ核酸前駆体 2 0 3 」 の欠損部分 （すなわち 3 ' 側） が、 「鎵型核酸 2 0 2」 を铸型と した伸長反応によ り 修復される と と もに、 「未標識 プローブ核酸前駆体 2 0 3」 に標識ヌ ク レオチ ド 2 0 4 が導 入される （図 1 5 ( b ) 参照） 。
ここで、 「非標識ヌ ク レオチ ド」 と して、 ジデォキシヌ ク レオチ ド 7 を用いる こ と によ り 、 ジデォキシヌ ク レオチ ドが 欠損部分に導入された後の伸長反応を停止させる こ とができ る。 「標識ヌ ク レオチ ド 2 0 4 」 と して、 Cy5— dUTP を用い た場合、 「ジデォキシヌ ク レオチ ド 2 0 7 」 と して、 ddATP、 ddCTP、 ddGTP の少な く と も 1 つを用レヽる こ と ができ る。 例 えば、 「未標識プローブ核酸前駆体」 がその 3 ' 端から UUA ACUA と い う配列を欠損 してお り 、 欠損部分に導入する標識 ヌ ク レオチ ドが Cy5- dUTP である場合、 ddCTP を 「非標識ヌ ク レオチ ド」 と して使用 して、 伸長反応を途中で停止させる こ とができ る。 こ こでは、 d dCTP を用いる こ と によ り 、 伸長 反応の際に Cy 5- dUTP が 3分子取込まれないで 1 分子取込ま れるこ と になる。
あるいは、 塩基がシ ト シ ンのヌ ク レオチ ド （ d C T P、 d d C T P ) を伸長反応の際に存在させないこ と によ り 、 伸長反応を 途中で停止させるこ と もでき る。
伸長反応の後、 伸長反応によ り 作成された 「標識プローブ 核酸」 と、 「铸型核酸」 との間の相補的結合をすベて解離さ せる （図 1 5 ( c ) 参照） 。
第二の実施の形態では、 ジデォキシヌ ク レオチ ドを用いた り 、 特定塩基のヌ ク レオチ ドを使用 しないこ と によ り 、 伸長 反応を停止させる。 このよ う に特定塩基のジデォキシヌ ク レ ォチ ドの使用 も しく は特定塩基のヌ ク レオチ ドの除去によ り 、 プローブ核酸への標識物質の導入量を制御する こ とができ る。
第三の実施の形態
本発明の第三の実施の形態に係る方法は、
標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であって、 ( 1 ) 作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な铸 型核酸と 、 前記鎳型核酸の塩基の総数よ り 少なく 、 作成した い標識プローブ核酸の中間部分においてヌ ク レオチ ドがー部 欠損している未標識プローブ核酸前駆体であって、 その 5 ' 端で支持体に固相化されている未標識プローブ核酸前駆体と を、 これらがハイプリ ダイズ可能な条件下で、 反応させるェ 程と、 ( 2 ) 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、 特定塩 基の標識ヌ ク レオチ ドと、 前記特定塩基以外の他の塩基の非 標識ヌ ク レオチ ドと を基質と して用いて、 前記未標識プロ一 ブ核酸前駆体の欠損部分を、 前記铸型核酸を铸型と して、 5 ' から 3 ' 方向に向かって伸長させ、 標識プローブ核酸を 合成する工程と、
( 3 ) 前記工程によ り得られた標識プローブ核酸と、 前記鎳 型核酸と の間の相補的結合をすベて解離させる工程と、
( 4 ) 解離された前記铸型核酸を支持体上から除去する工程 と
を含む。
第三の実施の形態では、 支持体上に作成される各標識プロ ーブ核酸は、 その中間部分 （例えば中央部分） に標識ヌ ク レ ォチ ドが導入される。 こ の点を除いて、 第三の実施の形態は 第一の実施の形態と 同様である。
従って、 以下、 各工程について図 1 6 を参照しなが ら順に 説明するが、 各工程 （ 1 ) 〜 （ 4 ) の詳細については、 第一 の実施の形態の工程 （ 1 ) ( 4 ) の各説明も適宜参照され たい。
[工程 （ 1 ) ]
工程 （ 1 ) の反応によ り 6 ( a ) に模式的に示す状 態が作成される。
第一の実施の形態と 同様 目 的とする解析に応じて、 支持 体上に作成する標識プローブ核酸の塩基配列をデザィ ンする。 「鎵型核酸 2 0 2」 は、 作成したい標識プローブ核酸に相補 的な配列を有する よ う に調製される。 一方、 「未標識プロ一 ブ核酸前駆体 2 0 3 a および 2 0 3 b 」 は、 その総塩基数に おいて、 「铸型核酸」 の塩基数よ り 少なく 、 作成したい標識 プローブ核酸の中間部分においてヌ ク レオチ ドが一部欠損す る よ う に調製される。
本実施の形態では、 「未標識プローブ核酸前駆体」 は、 図 1 6 ( a ) に示すとお り 、 作成したい標識プローブ核酸の中 間部分においてヌ ク レオチ ドを一部欠損しているため、 欠損 部分によ り分断された 2つの 「未標識プローブ核酸前駆体 2 0 3 & ぉょぴ 2 0 3 ) 」 から構成される。 2つの 「未標識プ ローブ核酸前駆体 2 0 3 a および 2 0 3 b 」 を、 図 1 6 では、 それぞれ 「未標識プローブ核酸前駆体 A」 、 「未標識プロ一 ブ核酸前駆体 B」 と称する。 「未標識プロ ーブ核酸前駆体 A」 、 「未標識プローブ核酸前駆体 B」 は、 それぞれ単独で、
「铸型核酸」 にハイプリ ダイ ズする こ とができ る長さである こ と が必要である。 よ っ て、 「未標識プローブ核酸前駆体 A」 および 「未標識プローブ核酸前駆体 B」 は、 それぞれ少 なく と も 6 ヌ ク レオチ ド以上の長さを有し、 好ま しく は 1 0 〜 1 5 ヌク レオチ ドの長さを有する。 このよ う にある程度の 長さ を有する 2つの 「未標識プローブ核酸前駆体」 の間に欠 損部分を作成するため、 「中間部分」 は、 必然的に、 作成し たい標識核酸プローブの中央部分になる。
こ こで、 欠損させるヌ ク レオチ ドの数は、 一般に 1〜 1 5 個、 好ま しく は 5〜 1 0個とする こ と ができ る。 欠損させる ヌク レオチ ドの位置およびその数は、 作成したい標識プロ プ核酸の塩基配列と 、 欠損させた領域に後の工程で導入する 標識ヌ ク レオチ ドの塩基の種類と を考慮して決定する。 例え ば、 欠損させた領域に導入する標識ヌ ク レオチ ドが Cy5 - dUT P である場合、 欠損させるヌ ク レオチ ドの位置は、 dUTPが導 入されるべき位置を含んでいなければならない。 また、 欠損 させるヌ ク レオチ ドの数は、 作成したい標識プローブ核酸の 中央部分においてその塩基配列が Uである部分の前後 1 〜 5 個とする こ とができ る。 こ こ で、 欠損させた領域に標識ヌ ク レオチ ド Cy5- dUTP がーつだけ導入される よ う に欠損部分を 選定すれば、 支持体上のすべてのプローブ核酸に均一な標識 量で標識を導入する こ とができる。
工程 （ 1 ) では、 第一の実施の形態と 同様にして、 「铸型 核酸」 と、 支持体上に固相された 「未標識プローブ核酸前駆 体」 と がハイ ブ リ ダィ ズされた状態が作成 される （図 1 6 ( a ) 参照） 。
[工程 （ 2 ) ]
工程 （ 2 ) において、 「未標識プローブ核酸前駆体」 の欠 損部分 （すなわち中間部分） が、 「铸型核酸」 を铸型と した 伸長反応によ り 修復される と と もに、 「未標識プローブ核酸 前駆体 A」 と 「未標識プローブ核酸 B」 の間に標識ヌ ク レオ チ ド 2 0 4 が導入される （図 1 6 ( b ) 参照） 。 こ こでは第 一の実施の形態と 同様に して、 伸長反応を 5 ' から 3 ' 方向 へと行う。 ただし、 第三の実施の形態では、 伸長された最後 のヌ ク レオチ ドの 3 ' 端と 「未標識プローブ核酸前駆体 B」 (図 1 6 の符号 2 0 3 b ) の 5 ' 端と の間に切れ目 （ - ッ ク） が存在し、 伸長反応だけで標識核酸プローブは完全な 1 本鎖ではない。 よって、 伸長反応の後、 好ま しく はライ ゲー シ ヨ ン反応を行う必要がある。 ライ ゲーシヨ ン反応は、 ライ ゲース酵素を含む緩衝液中で 1 4 〜 3 7 °Cで 3 0 〜 1 2 0分 行う こ とができる。
工程 （ 3 ) および （ 4 ) については、 第一の実施の形態と 同様に して行い、 標識プローブ核酸が固相された支持体を作 成する。
以上第三の実施の形態で説明 したとお り 、 支持体上のプロ ーブ核酸前駆体の中間部分のヌ ク レオチ ドを欠損させておく こ と によ り 、 プローブ核酸の中間部分に標識を付与する こ と が可能である。 第三の実施の形態では、 プローブ核酸の中間 部分に標識を付与するため、 中間部分の種々 の任意の位置を 欠損部分と して選定する こ とができ る。 こ の点において第三 の実施の形態は、 欠損部分がプローブ核酸の 3 ' 端に限定さ れる第一の実施の形態に比べて、 導入する標識ヌ ク レオチ ド の数を制御しやすいとい う 点で優れている。 また、 プローブ 核酸の中間部分に標識ヌ ク レオチ ドが入っている こ と は、 標 識が安定している点でも優れている。
従来の方法では、 プローブ核酸の中間部分を標識化する場 合には、 高度な技術が必要と されていた。 また、 中間部位が 標識されたプローブ核酸の作製を専門業者に依頼した場合に は、 莫大な時間と費用が必要と されていた。 それに対して、 本実施の形態に従う と、 プローブ核酸の所望の中間位置を容 易に標識化するこ とが可能である。 3 . 2 実施例
第 1 6 の実施例
第 1 6 の実施例では、 「未標識プロ ーブ核酸前駆体」 の 3 ' 端を、 標識 d UTP を用いて伸長 し、 「標識プローブ核 酸」 を作成した。
本実施例では、 「未標識プロ ーブ核酸前駆体」 と して、 5 ' - biotin- TATAAATTCTTTGCTGACCTGCTGGATTAC- 3 ' (配 列番号 6 ) を用い、 「铸型核酸」 と して、 5 ' - TTGATGTAAT CCAGCAGGTCAGCAAAGAATTTATA- 3 ' (酉 B歹 IJ番号 7 ) を用いた。
基板であるス ト レプ トア ビジンコー トスライ ド （（株）ダラ イナ一 . ジャパン） において、 5 ， 端にピオチンを結合した
20η M 「未標識プローブ核酸前駆体」 と、 20 η Μ 「鎳型核酸」 と を、 等量 I O Lずつ 1 X S S C溶液 （ 3 0 /i L ) 中で混 合し、 3 7 °Cで 1 時間反応させた。 反応によ り ハイブリ ダィ ズした 「未標識プローブ核酸前駆体」 と 「鎵型核酸」 を、 点 着装置を用いて、 ピオチンと アビジンと の反応によ り 基板上 に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄によ り 除去した後、 キヤ ビラ リ一 を形成可能な溝を有するキヤ ビラ リ 一力パーを基板上にかぶ せ、 核酸分子が固相化されたキヤ ビラ リ ーア レイ を作成した。 こ こで、 キヤ ビラ リ 一力パーは、 両端に溶液を出 し入れでき る穴を有し、 長さ 3〜 4 c m。 幅 l m m、 深さ 0. 1〜0.2m mのキヤ ビラ リ ーを形成可能なものを使用 した。
次いで、 以下の成分からなる伸長反応溶液をキヤ ビラ リ一 内に入れ、 3 7 °Cで ：！ 〜 2 時間反応させた ： lOmM Tris- HC1 (pH7.5)、 7mM MgCl2、 0. ImM DTT、 0.4units/ μ L lenow Fr a g m e t (DNA polymerase I Large Fragment； T0Y0B0)、 10 μ M dATP, 10 μ M dCTP、 10 μ M dGTP、 10 M Cy5 - dUTP。 伸 長反応によ り 、 基板上の 「未標識プローブ核酸前駆体」 は、 その 3 ' 端を、 dATP→ Cy5-dUTP→ dCTP→ dATP→ dATP と伸長 し、 「標識プローブ核酸」 が作成される。
反応後、 0. 1 X S S Cでキヤ ピラ リ ー内の未反応物を十分 洗浄する こ と によ り 除去した。 次いで、 0. 1 N NaOH のアル 力 リ溶液をキヤ ビラ リ ー内に導入し、 室温で 5 分間反応させ
「鍚型核酸」 を 「標識プローブ核酸」 から解離した。 解離さ れた 「錶型核酸」 を洗浄によ り キヤ ビラ リ一内から除去し、
「標識プローブ核酸」 が固相 されたキヤ ビラ リ ーア レイ を作 成した。
表 6 は、 以上の方法で固相 された 「標識プローブ核酸」 の 蛍光強度を 100 と し、 「铸型核酸」 な しで同様の工程を経た 場合 （ネガティ ブコ ン ト ロ ール） の蛍光強度をその相対値に よ り示す。
表 6 鎢型核酸なしで 錶型核酸を用いて
作成された 作成された
標識プローブ核酸 標識プローブ核酸
蛍光強度 0. 55 100
また、 図 1 7 は、 以上の方法で固相された 「標識プローブ 核酸」 と 「ネガティ ブコ ン ト ロ ール」 の蛍光顕微鏡写真を示 す。 図 1 7 において、 「 （ 1 ) ネガティ ブコ ン ト ロ ール」 は 蛍光が観察されず、 固相 された 「 （ 2 ) 標識プローブ核酸」 は、 蛍光が観察されている。
表 6 およぴ図 1 7 の結果は、 本発明の方法によ り 、 標識さ れたプロープ核酸が基板上に作成可能である こ と を示す。
第 1 7 の実施例
第 1 7 の実施例では、 第 1 6 の実施例と 同様、 「未標識プ ローブ核酸前駆体」 の 3 ' 端を、 標識 d- UTP を用いて伸長し、
「標識プローブ核酸」 を作成した。 第 1 7 の実施例では、 標 識 d- UTP を導入する伸長反応の際に、 ΙΟ μ Μ dCTP の代わ り に 0 μ M dCTP も しく は 10 M ddCTP を用いて伸長反応を途 中で停止させた点において第 1 6 の実施例と異なる。
第 1 6 の実施例で使用 した伸長反応溶液を、 以下の成分に 変えた以外、 第 1 6 の実施例と 同様にして、 「標識プローブ 核酸」 が固相されたキ ヤ ビラ リ ーア レイ を作成した。 すなわ ち、 第 1 7 の実施例では、 以下の成分の伸長反応溶液を使用 した ： 10mM Tris-HCl (pH7. 5) , 7mM MgCl2、 0. ImM DTT、 0. 4 units/ μ L K 1 e now Fragment (DNA polymerase I Large Fr a gment； T0Y0B0)、 10 μ U dATP、 0 μ dCTP また ^; 10 ,u M ddC TP、 10 μ M dGTP、 10 μ M Cy5— dUTP。
伸長反応のための基質ヌク レオチ ドと して、 dCTP を 用いた場合、 伸長反応によ り 、 基板上の 「未標識プローブ核 酸前駆体」 は、 その 3 ' 端を、 dATP→ Cy5- dUTP と伸長し、 反応は停止する。 一方、 伸長反応のための基質ヌ ク レオチ ド と して、 10 μ U ddCTP を用いた場合、 dATP→ Cy5-dUTP→ ddCT P と伸長し、 反応は停止する。 この結果、 「標識プローブ核 酸」 が作成される。 表 7 は、 以上の方法で固相された 「標識プローブ核酸」 の 蛍光強度を 100 と し、 「铸型核酸」 な しで同様の工程を経た 場合 （ネガティ ブコ ン ト ロール） の蛍光強度をその相対値に よ り 示す。
表 7 錶型核酸なしで 錶型核酸を用いて
作成された 作成された
標識プローブ核酸 標識プローブ核酸
爱光強度 1. 02 100 表 7 の結果は、 本発明の方法によ り 、 標識されたプローブ 核酸が基板上に作成可能である こ と を示す。
第 1 8 の実施例
第 1 8 の実施例では、 「未標識プローブ核酸前駆体」 の中 央付近に位置する欠損部分を、 標識 d UTP を用いて伸長し、
「標識プローブ核酸」 を作成した。 本実施例では、 図 1 6 に示すとお り 、 「未標識プローブ核 酸前駆体」 と して、 2 つのオ リ ゴヌ ク レオチ ド、 すなわち
「未標識プローブ核酸前駆体 A」 ： 5， - biotin- CAGCAGGT CAGCAAAGAATTT— 3 ， （酉己歹 IJ番号 8 ) と 「未標識プローブ核 酸前駆体 B」 ： 5 ' - AGCCCCCCTTGAGCACACAGAGGGCTA- 3 '
(配列番号 9 ) を使用 した。 また、 「鎵型核酸」 と して、 5 ， 一
TG (配列番号 1 0 ) を使用 した。 基板であるス ト レプ ト ア ビジンコー ト ス ライ ド （（株）ダラ イナ一 ' ジャパン） 上において、 20n M の 「未標識プローブ 核酸前駆体 A」 と 、 20 n M の 「未標識プロ ーブ核酸前駆体 B'」 と、 20 n M の 「铸型核酸」 と を、 等量 l O / Lずつ I X S S C溶液 （ 3 0 μ L ) 中で混合し、 3 7 °Cで 1 時間反応さ せた。 反応によ り ハイブリ ダィ ズした 「未標識プローブ核酸 前駆体」 と 「铸型核酸」 を、 点着装置を用いて、 ピオチンと ア ビジンと の反応によ り 基板上に固相化した。
基板上の未反応物を洗浄によ り 除去した後、 キヤ ビラ リ一 を形成可能な溝を有するキヤ ビラ リ 一力パーを基板上にかぶ せ、 核酸分子が固相化されたキヤ ビラ リ ーア レイ を作成した。 こ こで、 キヤ ビラ リ 一力パーは、 両端に溶液を出 し入れでき る穴を有し、 長さ 3〜 4 c m。 幅 l m m、 深さ 0. 1〜0. 2m mのキヤ ビラ リ ーを形成可能なものを使用 した。
次いで、 以下の成分からなる伸長反応溶液をキヤ ビラ リ一 内に入れ、 3 7 °Cで 1〜 2 時間反応させた ： 1 OmM Tris-HCl (pH7. 5) 7mM MgCl2、 O. lmM DTT、 0. 4units/ μ L Klenow Fr a gme nt (DNA polymerase I Large Fragment； T0Y0B0)、 10 μ M dATP、 ΙΟ μ Μ dCTP、 10 μ dGTP、 10 μ M Cy5 - dUTP。 伸 長反応によ り 、 基板上の 「未標識プローブ核酸前駆体 A」 は、 その 3 ， 端を、 dATP→ Cy5- dUTP と伸長する。 その後、 「未 標識プローブ核酸前駆体 A」 の 3 ' 端の Cy5- dUTP と 、 「未 標識プローブ核酸前駆体 B」 の 5 ' 端の dATP と の間の切れ 目 （ニック） を リ ガーゼによ り 連結した。 具体的には、 66mM Tris-HCl (pH 7. 6)、 6. 6mM MgCl2、 10mM DTT、 O. lmM ATP、 lOOunits T4 DNA 1 i gas e 溶液で、 1 6 °C、 1 時間反応させ る こ と によ り 連結した。 これによ り 、 「標識プローブ核酸」 が作成される。 反応後、 o . i x s s cでキヤ ビラ リ ー内の未反応物を十分 洗浄する こ と によ り 除去した。 次いで、 0. 1 N N a OH のアル カ リ 溶液をキヤ ビラ リ ー内に導入し、 室温で 5分間反応させ
「铸型核酸」 を 「標識プローブ核酸」 から解離した。 解離さ れた 「鎳型核酸」 を洗浄によ り キヤ ビラ リ一内から除去し、
「標識プローブ核酸」 が固相されたキヤ ビラ リ ーア レイ を作 成した。
表 8 は、 以上の方法で固相された 「標識プローブ核酸」 の 蛍光強度を 100 と し、 「铸型核酸」 な しで同様の工程を経た 場合 （ネガティ ブコ ン ト ロ ール） の蛍光強度をその相対値に よ り 示す。
表 8
錶型核酸なしで 錶型核酸を用いて
作成された 作成された
標識プローブ核酸 標識プローブ核酸
蛍光強度 0. 8 2 1 0 0 表 8 の結果は、 本発明の方法によ り 、 標識されたプローブ 核酸が基板上に作成可能である こ と を示す。
以上説明したとおり 、 本発明の方法に従って作成された、 標識プローブ核酸が固相された支持体は、 当該標識プローブ 核酸を用いた種々の解析、 例えば遺伝子の発現解析等に利用 するこ とが可能である。
支持体上のプローブ核酸を標識する本発明の方法は、 以下 に記載の点で優れてお り 、 試料を標識する場合にみられた問 題点を解決し得る ものである。
まず、 本発明の方法は、 試料を標識しないので試料が分解 する心配がない。 また、 本発明の方法は、 支持体上のすべて のプローブ核酸に対して、 1 回の伸長反応によ り 一括して標 識を付与する こ とができる点で簡便である。
また、 ア レイ上のデザィ ンされた既知の配列を有するプロ ーブを標識するため、 標識物質を導入する位置および標識効 率を制御可能である。 すなわち、 本発明の方法は、 プローブ 核酸の中間部分の任意のヌ ク レオチ ドに標識物質を導入する こ と ができ るため、 その後の検出反応の際に標識が離脱する こ と のない安定な標識プローブを作成する こ と が可能である。 加えて、 本発明の方法は、 プローブ核酸の特定のヌ ク レオチ ドに標識物質を導入する こ とができ るため、 支持体上のすべ てのプローブに対して均一な量の標識物質を導入する こ とが でき る。 このよ う にプローブを均一な標識量で標識する こ と によ り 、 試料への不均一な標識しかできなかった従来と比較 して、 標識量に左右されない信頼性のある測定結果を得る こ とが可能になる。
更に、 本発明に従って標識プローブを固相 したア レイ を準 備する こ と によ り 、 発現解析の自動化が可能である。 その上、 遺伝子の発現量を、 他のサンプルと の競合的ハイプリ ダイゼ ーシ ョ ンで測定する のではなく 、 単一サンプルの遺伝子発現 量の絶対値と して測定する こ とができ る。 加えて、 ア レイ上 のプローブを標識する こ と は、 反応前のプローブが標識され ているため、 その固相化状態をモニターする こ とが可能であ り 、 これは解析精度を管理する上で望ま しい。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であ つて、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) 前記ターゲッ ト核酸の標的部位に隣接する 3 ' 側の 塩基配列に相捕的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を 介して基体に固相化されているプローブ核酸と 、 核酸試料と を、 適切なハイ プリ ダイゼーショ ンを得るための条件にある 反応系において反応させる工程と、
( 2 ) 適切な伸長反応を得るための条件において、 検出可 能な信号を生ずる標識物質を付された特定の 1 種類の塩基を 含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と 、 ポ リ メ ラーゼ と の存在下で、 前記 （ 1 ) の工程で得られた反応産物を伸長 する工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の伸長する工程において、 当該伸長反応 に使用 されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を 当該反応系から除去する工程と、
( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 当該反応系に存在する前 記標識物質由来の信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程における当該信号の検出の有無と 、 前記標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸に含まれる塩基の 種類から、 標的部位の塩基を決定する工程。
2 . ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であ つて、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) ターゲッ ト核酸の標的部位に隣接する 3 ' 側の塩基 配列に相補的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を介し て基体に固相化されているプローブ核酸と、 核酸試料と を、 適切なハイプリ ダイゼーショ ンを得るための条件にある第 1 の反応系と第 2 の反応系において夫々 に反応させる工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 1 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第 1 の塩基を含 む標識化デォキシヌク レオシ ド三リ ン酸と 、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 2 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質と しての第 2 の塩基を含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行 う 工程と、
( 4 ) 前記 （ 2 ) および （ 3 ) の伸長反応を行 う 工程にお いて、 当該伸長反応に使用 されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を各反応系から除去する工程と、
( 5 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 第 1 の反応系 と第 2 の反 応系に存在する前記標識物質由来の信号を夫々検出する工程 と、
( 6 ) 前記 （ 5 ) の工程において検出された信号の有無と、 前記標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸に含まれる塩基の 種類から、 標的部位の塩基を決定する工程。
3 . ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であ つ て、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) ターゲッ ト核酸の標的部位に隣接する 3 ' 側の塩基 配列に相補的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を介し て基体に固相化されているプローブ核酸と、 核酸試料と を、 適切なハイプリ ダイゼーショ ンを得るための条件にある第 1 の反応系、 第 2 の反応系、 第 3 の反応系おょぴ第 4 の反応系 において夫々 に反応させる工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 1 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された第 1 の塩基を含 む標識化デォキシヌク レオシ ド三リ ン酸と、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行 う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 2 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質と しての第 2の塩基を含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行う 工程と、
( 4 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 3 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質と しての第 3 の塩基を含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と 、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行う 工程と、
( 5 ) 前記 （ 1 ) の工程を行った第 4 の反応系に含まれる 反応産物について、 適切な伸長反応を得るための条件下で、 検出可能な信号を生ずる標識物質を付された基質と しての第 4の塩基を含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポ リ メ ラーゼと を用いて、 伸長反応を行う 工程と、 ( 6 ) 前記 （ 2 ) および （ 3 ) の伸長反応を行う 工程にお いて、 当該伸長反応に使用 されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を各反応系から除去する工程と、
( 5 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 第 1 の反応系、 第 2 の反 応系、 第 3 の反応系および第 4 の反応系に存在する前記標識 物質由来の信号を夫々 に検出する工程と 、
( 6 ) 前記 （ 5 ) の工程において検出された信号の有無と 、 前記標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸に含まれる塩基の 種類から、 標的部位の塩基を決定する工程。
4 . ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であ つて、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) 前記ターゲッ トの標的部位に隣接する 3 ' 側の塩基 配列に相補的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を介し て基体に固相化されているプローブ核酸と、 核酸試料と を、 適切なハイプ リ ダイゼーショ ンを得るための条件にある反応 系において反応させる工程と、
( 2 ) 適切な伸長反応を得るための条件において、 検出可 能な第 1 の信号を生ずる標識物質を付された第 1 の塩基を含 む第 1 の標識化ジデォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 検出可 能な第 2 の信号を生ずる標識物質を付された第 2 の塩基を含 む第 2 の標識化ジデォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 検出可 能な第 3 の信号を生ずる標識物質を付された第 3 の塩基を含 む第 3 の標識化ジデォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 検出可 能な第 4 の信号を生ずる標識物質を付された第 4 の塩基を含 む第 4 の標識化ジデォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 ポリ メ ラーゼとの存在下で、 前記 （ 1 ) で得られたニ本鎮核酸を伸 長する工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の伸長する工程において、 前記伸長反応 に使用 されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を その反応系から除去する工程と、
( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 その反応系に存在する前 記標識物質由来の信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号の種類か ら、 標的部位の塩基を決定する工程。
5 . ターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法であ つて、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) 前記ターゲッ ト核酸の標的部位に隣接する 3 ' 側の 塩基配列に相補的な選択用配列を含み、 且つその 5 ' 末端を 介して基体に固相化されているプローブ核酸と 、 核酸試料と を、 適切なハイ プリ ダイゼーショ ンを得るための条件にある 反応系において反応する工程と、
( 2 ) 適切な伸長反応を得るための条件において、 検出可 能な信号を生ずる標識物質を付されたと第 1 の種類の塩基を 含む標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸と、 前記第 1 の塩 基と は異なる種類の第 2 の塩基を含む少なく と も 1 の非標識 化デォキシヌク レオシ ド三リ ン酸と 、 ポ リ メ ラーゼと の存在 下で、 前記 （ 1 ) で得られた二本鎖核酸を伸長する工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の伸長する工程において、 当該伸長反応 に使用 されなかった標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸を 当該反応系から除去する工程と、 ( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後で、 当該反応系に存在する前 記標識物質由来の信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程における当該信号の検出の有無と 、 前記標識化デォキシヌ ク レオシ ド三リ ン酸に含まれる塩基の 種類から、 標的部位の塩基を決定する工程。
6 . 前記検出可能な信号が蛍光であ り 、 前記標識物質が蛍 光物質である こ と を特徴とする請求項 1 から 5 の何れか 1 項 に記載のターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
7 . 前記選択用配列が、 1 0塩基長から 1 5塩基長までの 長さである こ と を特徴とする請求項 1 から 6 の何れか 1 項に 記載のターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
8 . 前記核酸試料が予め対象よ り採取され調製される こ と と、 前記標的部位が変異の存在する可能性のある部位である こ と を特徴とする請求項 1 から 7 の何れか 1 項に記載のター ゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
9 . 前記核酸試料は予め対象よ り採取され調製された試料 に含まれている こ と と、 前記標的部位が一塩基多型の存在す る部位である こ と を特徴とする請求項 1 から 8 の何れか 1 項 に記載のターゲッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
1 0 . 前記プローブ核酸が、 そこにおいて核酸について反 応を行 う こ と が可能な反応容器の内壁に固相化されている こ と を特徴とする請求項 1 から 9 の何れか 1 項に記載のターゲ ッ ト核酸の標的部位の塩基を決定する方法。
1 1 . 前記反応容器の容器内部の形状がキヤ ビラ リ 一形状 である こ と を特徴とする請求項 1 0記載のターゲッ ト核酸の 標的部位の塩基を決定する方法。
1 2 . 被検核酸中の標的配列の存在を検出する方法であつ て、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) そこにおいて反応を行 う こ と が可能な流路に固相化 され、 標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、 適切な ハイプリ ダイゼーショ ン可能な条件下で被検核酸を反応させ る工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程の後に、 1 本鎖特異的ヌ ク レア一 ゼを前記流路に添加して、 適切な酵素反応を得られる条件下 で反応を行う 工程と、
( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程の後に、 前記流路から酵素反応の 分解産物を除去する工程と、
( 4 ) 前記流路内の 2本鎖核酸に含まれる標識物質からの 信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号を基に、 被検核酸中の標的配列の存在を検出する工程。
1 3 . 対象における標的配列の発現頻度を判定する方法で あって、 以下の工程を具備する方法 ；
( 1 ) そこにおいて反応を行う こ とが可能な流路に固相化 され、 且つ標識物質を付加された標識化プローブ核酸に、 適 切なハイ プリ ダイゼーシ ョ ン可能な条件下で、 対象から得た 被検核酸を含む試料を反応させる工程と、
( 2 ) 前記 （ 1 ) の工程の後に、 1 本鎖特異的ヌク レア一 ゼを前記流路に添加 して、 適切な酵素反応を得られる条件下 で反応を行う 工程と、 ( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程の後に、 前記流路から酵素反応の 分解産物を除去する工程と、
( 4 ) 前記 （ 3 ) の工程の後に、 前記流路内の 2本鎖核酸 に含まれる標識物質に由来する信号を検出する工程と、
( 5 ) 前記 （ 4 ) の工程において検出された信号を基に、 対象における標的配列の発現頻度を判定する工程。
1 4 . 以下の工程によ り 得られる標識化プローブ核酸を用 いる こ と を特徴とする請求項 1 2 に記載の被検核酸中の標的 配列の存在を検出する方法 ；
( 1 ) 種プローブ核酸に対して、 適切なハイ ブリ ダィゼー シ ヨ ン可能な条件下で、 前記種プローブ核酸に相捕的な相補 配列と、 こ の相補配列の 5 ' 側に存在する被標識配列と、 こ の被標識配列の 5 ' 側に存在する伸長配列と を含む铸型核酸 を反応させる工程と、
( 2 ) 前記被標識配列の塩基に相補的な塩基を含み、 且つ 標識物質を付与された標識化基質核酸と、 前記伸長配列に含 まれる塩基に相補的な塩基を具備する基質核酸と 、 ポリ メ ラ ーゼと の存在する条件下で、 前記 （ 1 ) の工程で得られた 2 本鎖に含まれる前記種プローブ核酸を伸長する工程と、
• ( 3 ) 前記 （ 2 ) の工程における伸長の後に、 当該 2本鎖 を解離する こ と によって、 1 本鎖と して標識化プローブ核酸 を得る工程。
1 5 . 標識プローブ核酸を固相化した支持体の作成方法であ つて、
• 作成したい標識プローブ核酸の塩基配列に相補的な铸型核 酸と、 前記铸型核酸の塩基の総数よ り 少なく 、 作成したい標 識プローブ核酸の塩基配列の一部が欠損している未標識プロ ーブ核酸前駆体であって、 その 5 ' 端で支持体に固相化され ている未標識プローブ核酸前駆体と を、 これらがハイブリ ダ ィ ズ可能な条件下で、 反応させる工程と、
検出可能な信号を生ずる標識物質を付された、 特定塩基の 標識ヌ ク レオチ ドと 、 前記特定塩基以外の他の塩基の非標識 ヌ ク レオチ ドと を基質と して用いて、 前記未標識プローブ核 酸前駆体の欠損部分を、 前記鎳型核酸を鍚型と して、 5 ' か ら 3 ' 方向に向かって伸長させ、 標識プローブ核酸を合成す る工程と、
前記工程によ り 得られた標識プローブ核酸と、 前記鎊型核 酸との間の相補的結合をすベて解離させる工程と、
解離された前記铸型核酸を支持体上から除去する工程と を含む方法。
1 6 . 請求項 1 5 に記載の標識プローブ核酸を固相化した支 持体の作成方法であって、 前記未標識プローブ核酸前駆体力 作成したい標識プローブ核酸の 3 ， 端のヌ ク レオチ ドが 1 以 上欠損したものである こ と を特徴とする方法。
1 7 . 請求項 1 5 に記載の標識プローブ核酸を固相化した支 持体の作成方法であって、 前記未標識プローブ核酸前駆体力 S、 作成したい標識プローブ核酸の中間部分のヌ ク レオチ ドが 1 以上欠損したものである こ と を特徴とする方法。
1 8 . 請求項 1 5 〜 1 7 の何れか 1 項に記載の標識プローブ 核酸を固相化した支持体の作成方法であって、 前記特定塩基 の標識ヌ ク レオチ ドが、 1 種類の塩基の標識ヌ ク レオチ ドで あ り 、 前記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌ ク レオチ ドが、
3種類の塩基の各ヌ ク レオチ ドである こ と を特徵とする方法。
1 9 . 請求項 1 5 または 1 6 に記載の標識プロ ーブ核酸を固 相化 した支持体の作成方法であって、 前記特定塩基の標識ヌ ク レオチ ドが、 1 種類の塩基の標識ヌ ク レオチ ドであ り 、 前 記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌ ク レオチ ドの少な く と も 1 種類が、 ジデォキシヌ ク レオチ ドである こ と を特徴とす る方法。
2 0 . 請求項 1 5 または 1 6 に記載の標識プロ ーブ核酸を固 相化した支持体の作成方法であって、 前記特定塩基の標識ヌ ク レオチ ドが、 1 種類の塩基の標識ヌ ク レオチ ドであ り 、 前 記特定塩基以外の他の塩基の非標識ヌ ク レオチ ドの少な く と も 1 種類が、 存在 しないこ と を特徴とする方法。
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