WO2004055185A1 - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

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WO2004055185A1
WO2004055185A1 PCT/JP2003/016158 JP0316158W WO2004055185A1 WO 2004055185 A1 WO2004055185 A1 WO 2004055185A1 JP 0316158 W JP0316158 W JP 0316158W WO 2004055185 A1 WO2004055185 A1 WO 2004055185A1
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cancer
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Hiroshi Tanaka
Isao Kaieda
Kohei Honda
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein, its DNA, a method for screening a compound that regulates the expression of the protein gene, a compound obtained by the screening method, a medicament containing the compound (eg, an agent for preventing or treating cancer, Etc.).
  • a novel protein its DNA
  • a method for screening a compound that regulates the expression of the protein gene a compound obtained by the screening method
  • a medicament containing the compound eg, an agent for preventing or treating cancer, Etc.
  • P53 is a tumor suppressor gene with the highest frequency of abnormalities detected in human cancers, including induction of glarrest and apoptosis, and a checkpoint mechanism when DNA is damaged. It has been shown to have various physiological functions. It is thought that these functions are exerted by the p53 protein acting as a transcription factor and controlling the expression of its target gene. Therefore, if an abnormality occurs in this P53 (mutant p53), the above effects will not be exhibited, and the cells will progress to cancer.
  • mutant P53 when introduced into P53-deficient cancer cells, the cancer cells will form colonies even in soft agar, or will form tumors in a bile cancer nude mouse model.
  • Mutant p53 not only loses the function of normal p53 (wild-type P53), but also mutant P53 itself It is suggested that they are involved in Mutant P53 is divided into several types depending on the location of the mutation. Cancer with mutant P53 in which arginine (R) at position 175 is replaced with histidine (H) has the worst prognosis. (Cancer Research, Vol. 55, pp. 5217-5221, 1995). Furthermore, it has been reported that this mutant p53, like wild-type p53, induces downstream genes (Oncogene, vol.
  • Apoptosis research has also attracted attention in terms of disease treatment, because abnormalities in apoptosis also contribute to the development of many diseases such as cancer and neurodegenerative diseases.
  • Apoptosis signals are controlled by the balance between molecules that promote apoptosis and those that suppress it. Furthermore, it is thought that the survival of cells is determined by the involvement of the cell proliferation signal in this signal.
  • a large number of cell growth or apoptosis control molecules have been reported to date, but unknown control molecules may be present.
  • Human-derived TSLRP (tes tis specific leucine rich repeat protein) is a gene reported in Genbank Acces ii on No. M_012472, and its expression in testis is up-regulated. , M 97/26001.
  • the human TSLRP gene has high homology with the mouse LRTP gene. This mouse LRTP gene is specifically expressed in tes tis, and its protein has a leucine rich repeat region at the N-terminal side. This region is thought to be involved in protein-protein interaction, but the detailed function is not clear (Biology Reproduction, 62, pp. 1277-1284, 2000). .
  • New genes related to the regulation of cell proliferation and apoptosis It enables the development of pharmaceuticals useful for prevention and treatment of various diseases caused by up-regulation and decreased expression, such as cancer, neurodegenerative diseases, and autoimmune diseases. Accordingly, it has been desired to find a novel gene related to the regulation of cell growth and apoptosis derived from humans. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, succeeded in cloning a cDNA having a novel nucleotide sequence from a cancer cell line, and the protein encoded thereby was used for cell growth and apoptosis.
  • the inventor of the present invention has found that the present invention is related to one cis. As a result of further study based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • a diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (4) above, (11) an antibody against the protein according to (1) or the partial peptide or salt thereof according to (3);
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide according to (4) or a part thereof,
  • kits for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene according to (1) which comprises the polynucleotide according to (4);
  • an apoptosis-promoting agent which comprises a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a partial peptide thereof.
  • a method for preventing or treating cancer which comprises administering to a mammal an effective amount of a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene for the protein or salt thereof according to (1) above.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15 (hereinafter referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) )
  • are cells of human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, whales, monkeys, etc.
  • 'hepatocytes, spleen cells, nerves eg, 'hepatocytes, spleen cells, nerves.
  • Cells glial cells, knee cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (Eg, macrophages, ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, Synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, liver cells or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells) or any of these cells Tissues, for example, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, medulla, spinal cord), spinal cord,
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is 99.5% or more homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence has about 80% or more, preferably about 90% or more, and more preferably about 95% or more homology.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 includes, for example, the aforementioned SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 Or a protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15; and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 15 Proteins having qualitatively the same activity are preferred.
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical.
  • the activity is the same (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein of the present invention include (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (for example, 1 to 3, preferably 1 (Ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2; or one or more amino acids (for example, about 1-2000, preferably Is an amino acid sequence to which about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about (1 to 5) amino acids have been added, (iii) ) 1 or 2 or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30) • preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably (1 to 5) amino acids inserted; Column, (iv) One or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (eg, about 1 to 200, preferably about 1 to 100
  • (Iii) SEQ ID NO: 15 The amino acid sequence represented by 1 or 2 or more (for example, about 1 to 200, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, Preferably, an amino acid sequence into which a number (1 to 5) of amino acids have been inserted, and (iv) one or more (eg, 1 to 200) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. Degree, preferably about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5) of amino acids are substituted with another amino acid. So-called mucins such as proteins containing amino acid sequences or (V) amino acid sequences combining them included. '
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (potassium terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has carboxyl group (1-COOH), carboxylate (1-C ⁇ 01), amide ( _C ⁇ NH 2 ) or an ester (one C ⁇ R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, isopropyl
  • alkyl groups such as n- butyl, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , a- Na ' ⁇ 3 6 _ 12
  • Ariru group such Fuchiru, for example, benzyl, phenyl one C, _ 2 alkyl or ⁇ -, such as phenethyl' like ⁇ - naphthyl - ⁇ Bok 2 Al kill groups such as naphthylmethyl of.
  • the protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • the protein of the present invention includes a protein in which a carbonyl group is amidated or esterified.
  • ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., formyl groups, C such as Al Kanoiru such Asechiru group, etc.
  • N-terminal dalluminin residue generated by cleavage in vivo, which is oxidized with lipamine, and substituents on the side chains of amino acids in the molecule for example, 1H, one SH, amino group, imidazo Ichiru group, indole group, are protected with Guanijino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, C WINCH 6 Ashiru groups such as C Bok 6 Arukanoiru group such Asechiru group
  • a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
  • Examples of the protein of the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and an amino acid represented by SEQ ID NO: 15
  • Examples include proteins containing sequences.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is the above-mentioned partial peptide of the protein of the present invention, and preferably any peptide having the same properties as the above-mentioned protein of the present invention.
  • Peptides with 200 or more amino acid sequences which is used.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids in its amino acid sequence deleted, or 1 or 2 or more (preferably, about 1 to 20, more preferably, about 1 to 10, and more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence; or One or two or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably a number (1 to 5)) amino acids are inserted into the amino acid sequence, or In the amino acid sequence, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid. Is also good.
  • the C-terminus may be any one of a lipoxyl group (one C ⁇ H), a lipoxylate (—C ⁇ —), an amide (one C ⁇ NH 2 ), and an ester (_COOR). You may.
  • the partial peptide of the present invention includes, as in the case of the protein of the present invention described above, those having a carboxyl group (or lipoxylate) other than the C-terminus, N-terminal amino acid residues (eg, methionine).
  • Residue) whose amino group is protected with a protecting group, that in which the glutamine residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo is pyroglutamine-oxidized, and that the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is appropriate.
  • those protected with a protecting group or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded.
  • the partial peptide protein or portion base peptide salts also t present invention which may be used as an antigen for producing antibodies of the present invention, physiologically acceptable Ru acids (eg, inorganic acids, organic acids) or bases (Eg, alkali metal salts) and the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • physiologically acceptable Ru acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases Eg, alkali metal salts
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the protein of the present invention, a partial peptide thereof, or a salt thereof can be produced from the cells or tissues of a human warm-blooded animal by the above-described method for purifying a protein per se, or contains a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing the transformant obtained. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be generally used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzohydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, and PAM resin.
  • 4-hydroxymethyl phenylacetamidomethyl resin polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4 'dimethoxyphenyl FM ocaminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • a protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or partial peptide or an amide thereof. To get.
  • Activation by these involves adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HO ⁇ B t) or using a symmetrical acid anhydride.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOB t, HO ⁇ B t
  • the protected amino acid can be added as a HOB t ester or H ⁇ OB t ester to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for protein condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydro'furan, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about ⁇ 20 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Ninhi Dorin reaction results of tests using sufficiently even after repeated c reactions which can be performed sufficient condensation by condensation repeating the condensation reaction without Nau line removal of the protecting group when insufficient
  • acetylation of the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z, and adamantyl.
  • Z Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z, and adamantyl.
  • oxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 212-trophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyl ester It can be protected by ziroxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopenty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (C ⁇ 6 ) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group is used.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 one Bz l, 2-nitrobenzyl, B r- Z, such as t- butyl are used.
  • protecting group for histidine imidazole for example, Tos, 4-methoxy2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOBt.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, or the like.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein or partial peptide for example, first, amidation and protection of the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal are followed by adding a peptide (protein) chain to the amino group side with a desired chain length. Then, a protein or partial peptide from which only the ⁇ -amino group protecting group at the ⁇ -terminal of the peptide chain is removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group at the C-terminal carboxyl group is removed are produced. Then, these proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the ⁇ -lipoxyl group of the terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of a protein or peptide, It is possible to obtain a desired protein or an ester of a peptide.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide of the present invention is
  • the target peptide can be produced by condensing a constitutive partial peptide or amino acid with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the aforementioned cDNA derived from cells and tissues, the aforementioned cDNA library derived from cells and tissues, and a synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-mentioned cell'tissue.
  • RT-PCR method Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention include (1) SEQ ID NO: Contains DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or contains a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions A DNA encoding a protein having substantially the same properties as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2; (2) SEQ ID NO: 14 DNA containing the base sequence, or SEQ ID NO:; It contains a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by 4 under high stringency conditions, and has substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 described above.
  • Any DNA can be used as long as it encodes a protein.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 DNA containing a base sequence having a homology of 99.5% or more with the sequence is used.
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 under high stringency conditions include, for example, about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, the reaction can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to The condition of 65 is shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and a DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 4
  • the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is the DNA encoding the protein having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 DNA or the like is used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the present invention include, for example, a DNA having a portion of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 14, or SEQ ID NO: 3, A protein comprising a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 14 and having substantially the same activity as the protein of the present invention. DNA containing a part of the encoding DNA is used.
  • the DNA hybridizable with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 14 has the same significance as described above.
  • DNA is amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector is used as one of the proteins of the present invention.
  • Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA.
  • Hybridization methods are, for example, This can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc., using the ODA-LA PCR method. It can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto. ⁇ ,
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digestion with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by doing.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH11, pSH15
  • pacteriophage such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRcZCMV, pRcZRSV, pc DNA I ZNeo or the like is used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as hosts, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc. may be used.
  • SR promoter when animal cells are used as hosts, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, etc. may be used.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRK cytomegalovirus
  • the host is Eshierihia genus
  • the host is a bacterium of the genus Bacillus
  • yeast such as SP01 Promoter, SP02 Promoter, penP Promoter, and the like
  • PH ⁇ 5 Promoter, PGK Promoter, GAP Promoter, and ADH Promoter are preferable.
  • the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, P10 promoter overnight, and the like are preferable.
  • the expression vector may further contain, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly (A) addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as' SV40 ori).
  • an enhancer e.g., a splicing signal
  • a poly (A) addition signal e.g., a selection marker
  • an SV40 replication origin e.g., SV40 ori
  • the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexate (MTX) resistance), ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 1 ), and neomycin. Syn-resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne ⁇ 1 ⁇ G418 resistance) etc.
  • dh fr gene is used as a selection marker in Chinese hamster cells lacking the dh fr gene
  • Genes can also be selected on th
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a genus Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., and if the host is yeast, If so, the MFa signal sequence, SUC2.
  • the host is an animal cell, such as a signal sequence, an insulin signal sequence, an insulin signal sequence, an antibody molecule, a signal sequence, etc. can be used.
  • a transformant can be produced.
  • the host for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus is Bacillus.
  • Subtilis Bacillus
  • subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeasts include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 2OB-12, Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastori Pichia pastoris) KM 71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, the larvae of the night larvae (Spodoptera frugiperda cell; Sf cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia, and High derived from eggs of Trichoplusia ni Five TM cells,
  • Cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Est igmena acrea are used.
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx inori N cell; BmN cell) or the like is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, J.L., et al., In Vipo).
  • insects for example, silkworm larvae are used (Maeda et al.,
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHQ cells), and dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dh fr—) cells.
  • CHQ cells Chinese hamster cells CHO
  • CHO (dh fr—) cells dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CHO
  • Mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, and human FL cells are used.
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 Q988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). be able to.
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liqueur, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potatoes.
  • examples of inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a culture medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimal medium Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually about 20 ⁇
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the culture medium may be, for example, about
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually about 30 ⁇
  • the protein of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and disrupted by ultrasonication, lysozyme, or freeze-thawing, etc., followed by centrifugation or filtration.
  • a method of obtaining a crude extract of the above is appropriately used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as preparative Litton X- 1 0 0 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include: , Methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly using differences in molecular weight.
  • Methods that use differences in charge such as chromatography, methods that use specific affinity such as affinity chromatography, methods that use differences in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric focusing.
  • a method that uses the difference between isoelectric points, such as the law, is used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted into a free form or another salt.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, and glycosidase are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
  • Antibodies against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof are as follows: Any polyclonal antibody or monoclonal antibody may be used as long as it can recognize the protein or partial peptide of the invention or a salt thereof.
  • An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, and is known per se Can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum.
  • the protein of the present invention may be administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible by administration, or may be administered together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and spleen or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP20, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG6) is used. ) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and the cells are efficiently fused by incubating at 20 to 40 ° (preferably at 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes). Can be implemented.
  • the hybridoma culture supernatant is applied to the H phase (eg, microplate) on which the protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A, labeled with a radioactive substance or enzyme, and then add it to the solid phase.
  • H phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A labeled with a radioactive substance or enzyme
  • a method for detecting bound monoclonal antibodies adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, etc., and then binding to the solid phase
  • a method for detecting a mononal antibody may be used.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal serum
  • GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • SFM-101 serum-free medium for hybridoma culture
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Adsorption / desorption method by ultrafiltration, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent Specific Purification Method of Collecting Antibody Only and Dissociating the Bond to Obtain Antibody].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • Adsorption / desorption method by ultrafiltration, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active adsorbent Specific Purification Method of Collecting Antibody Only and Dissociating the Bond to Obtain Antibody.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immune antibody (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting a substance containing an antibody against the protein of the present invention and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier protein and the octapten are determined according to the hapten immunized by cross-linking the carrier protein.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently prepared.
  • serum albumin ⁇ ⁇ psiloglopurine, hemocyanin, etc. in a weight ratio of 1 to hapten 1 A method of coupling at a ratio of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used. .
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier-protein, but daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • daltaraldehyde carbodiimide
  • a maleimide active ester an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • a carrier or diluent In order to enhance the antibody production ability during administration, 'Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered ⁇ ⁇ Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total It is.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of polyclonal antibodies should be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as for monoclonal antibodies described above. Can be.
  • the antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a sequence or a part thereof includes a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it has a complementary nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA. Is preferred.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • a nucleotide sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology is exemplified.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention for example, An antisense polynucleotide having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence near the start codon, etc.
  • an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNaseH it is at least about 70%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 70% of the complementary strand of the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns.
  • Antisense polynucleotides having a homology of about 90% or more, and most preferably about 95% or more, are respectively suitable.
  • an antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or a part thereof Nucleotide, preferably an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or a part thereof (more preferably, SEQ ID NO: 3 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 A base sequence complementary to the base sequence of the contained DNA, or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA are, for example, chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted by a group.
  • the sugar (deoxy report) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′_ ⁇ -methylation, and the base moiety (pyrimidine, purine) may also be chemically modified. And any one that hybridizes to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or determined. Can be designed and synthesized based on information.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can interact with the protein-related RNA of the present invention through its interaction.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention and that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene in rice, and for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • the “correspondence” between a nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) specified by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. ing.
  • End hairpin loop end 5-base spare 'repeat, end 5 untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3 'end palindrome region , And the 3 'end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as a target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region is as follows:
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target is:
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy D-ribose, polynucleotides containing D-lipose, and other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases. Or other polymers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds (provided that such polymers are found in DNA or RNA). Bases that contain nucleotides having a configuration that allows base attachment and attachment of bases). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: R'NAA hybrids, as well as unmodified polynucleotides.
  • oligonucleotides as well as those with known modifications, such as those with labels, capped, methylated, one or more natural nucleotides known in the art Substituted with an analog, modified with an intramolecular nucleotide, for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or Those having sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), such as proteins (nucleases, nucleases' inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-glycines, etc.) and sugars (E.g., monosaccharides, etc.) having side chain groups, Those containing current compounds (eg, acridine, zoralen, etc.), those containing chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphoate derivatives, and polynucleoside amides, which are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Add Particularly preferred lipids include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • a protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention (eg, DNA) (Hereinafter sometimes abbreviated as the polynucleotide of the present invention, the DNA of the present invention, etc.), an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention).
  • DNA antisense polynucleotide of the present invention hereinafter, may be abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention
  • the protein of the present invention regulates (preferably inhibits and suppresses) apoptosis
  • the protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the antibody of the present invention, etc. may be used, for example, in cancer (eg, colon cancer, breast cancer, ovary) Cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid gland, tentacle cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc.), nerve Degenerative diseases (eg, Alheima's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, chronic disease Disease markers such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, renal diseases (eg, diabetic nephro
  • the antisense polynucleotide of the present invention a compound or a salt thereof that regulates (preferably inhibits) the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that regulates (preferably inhibits) the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • Salts are also included in cancers (eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid gland Cancer, Tengler cancer, brain tumor, melanoma or hematoma, etc., neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune disease (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis) , Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., kidney disease (eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, kidney) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for inflammation, renal edema, interstitial renal disease, etc., and preferably as a prophylactic / therapeutic agent for cancer.
  • the gene of the protein of the present invention since the gene of the protein of the present invention has low expression in normal tissues, screening for a prophylactic / therapeutic agent for cancer with few side effects becomes possible. In addition, it is known that cancer having mutant P53 has high malignancy, such as poor efficacy of anticancer drugs in clinical practice and poor prognosis.
  • the protein gene of the present invention acts downstream of the mutant p53, and thereby acts as an antisense polynucleotide of a polynucleotide encoding the protein of the present invention, a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention, or a salt thereof.
  • the compound of the present invention that inhibits the expression of the protein gene or a salt thereof, or an antibody against the protein of the present invention is also effective for high-grade cancer.
  • the compound or its salt that regulates (promotes or inhibits, preferably inhibits) the activity of the protein of the present invention includes, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer.
  • neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune disease eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, Multiple sclerosis, Sheddharen syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • Kidney diseases eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial kidney disease
  • Etc. can be used as a preventive and therapeutic agent.
  • cancer e.g., colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid gland It is a prophylactic / therapeutic agent for cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma or hematological tumor).
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
  • a comparison between (i) the activity of a cell capable of producing the protein of the present invention and (ii) the activity of a mixture of a cell capable of producing the protein of the present invention and a test compound A method for screening a compound or a salt thereof that regulates the activity of the protein of the present invention, which is characterized in that 'As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the aforementioned DNA encoding the protein of the present invention is used.
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane and in a cell by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • a test compound that promotes the activity in the case of the above (ii) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case of the above (i) As a compound that promotes the activity of the protein of the present invention, the activity in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 5% or more of that in the above (i).
  • a test compound that inhibits 0% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissues It is a compound selected from extracts, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • compounds or salts thereof that regulate (enhance or inhibit, preferably inhibit) the expression of the gene of the protein of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, Stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, Teng's cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc., neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's) Syndrome), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, syndrome of idiopathic syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.) , Kidney disease (eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial kidney disease,
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, victory cancer
  • It is a prophylactic / therapeutic agent for organ cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor.
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that regulates the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening methods include (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein of the present invention in the presence of the test compound. To compare with Screening method.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the amount of mRNA is measured by a known method, for example, Northern hybridization using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or a part thereof as a probe, or SEQ ID NO: 3 or It can be measured according to a PCR method using a nucleic acid containing SEQ ID NO: 4 or a part thereof, or a method analogous thereto.
  • a test that promotes the expression of the gene in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of the above (iii) The compound is a compound that promotes the expression of the protein protein gene of the present invention.
  • the gene expression in the case of the above (iv) is about 20% or more, preferably 3% or more of that in the above (iii).
  • a test compound that inhibits 0% or more, more preferably about 50% or more, can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof, or a cell having the ability to produce the protein or partial peptide of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, A compound selected from a plant extract, an animal tissue extract, plasma, or the like, or a salt thereof; A compound or a salt thereof that regulates the activity of a protein, and a compound or a salt thereof that regulates the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound or its salt that regulates (preferably inhibits) the activity of the protein of the present invention and the compound or its salt that regulates (preferably inhibits) the expression of the gene of the protein of the present invention are, for example, cancer (eg, colon cancer) , Breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, tentacle cancer, brain tumor, melanoma or Blood tumors), neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, chronic joint disease) Rheumatism, systemic lupus erythematosus, etc.), kidney diseases (eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • a carrier diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, instillation injections, and injections. Includes dosage forms such as intranodal injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( Eg, propylene glycol, polyethylene glycol), non-ionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50
  • polyoxyethyl ene (50iol) adduct of hydrogenated castor oil polyoxyethyl ene (50iol) adduct of hydrogenated castor oil
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, etc. are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. may be used in combination as a solubilizing agent (the prepared injection is usually filled in an appropriate sample.
  • Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the oral or parenteral pharmaceutical composition of the above 3 is conveniently prepared in a dosage unit form so as to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections.
  • the compound contains 5 to 100 mg, and the other dosage forms contain 10 to 250 mg of the above compound.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the compound and the above-mentioned compound do not cause an undesirable interaction.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, puppies, birds, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject of administration, route of administration, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention or the expression of a protein gene Oral administration of a compound or a salt thereof that inhibits the daily dose of an adult (assuming a body weight of 60 kg) About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.
  • Administer 0-20 mg When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the activity or protein of the protein of the present invention or the protein may be used.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a gene is administered to an adult (as a body weight of 60 kg), usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is reduced to about 0 per day.
  • the dose can be administered in terms of the weight per 6 Okg.
  • an antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention. In particular, it can be used for quantification by a sandwich immunoassay. '
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the monoclonal antibody of the present invention a monoclonal antibody against the protein of the present invention
  • tissue staining or the like a monoclonal antibody against the protein of the present invention
  • the monoclonal antibody of the present invention can also be detected by tissue staining or the like.
  • tissue staining or the like May use the body molecule itself, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], and the like are used [14 c].
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, / 3-galactosidase, 1-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescein mine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, poly (acrylamide), and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary and secondary reactions can be performed in reverse order, or simultaneously, or with a staggered time. May be performed.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and two or more kinds of antibodies are used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. Mixtures may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention
  • the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation Measure the amount of any of B and F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody and then separated from the solid phase and the liquid phase.
  • the excess amount of the labeled antibody is allowed to react, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a fen eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer
  • Prostate cancer esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, parasternal carcinoma, uterine cancer, testis II, thyroid cancer, visceral cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor
  • Neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, whole body Or renal disease (eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial renal disease, etc.) (preferably cancer), or future disease
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used for
  • the DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce human or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof in monkeys, chimpanzees, etc.).
  • human or warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof in monkeys, chimpanzees, etc.
  • it is useful as a diagnostic agent for genes such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or overexpression.
  • the above-mentioned genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization ⁇ ⁇ PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) and the like.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate
  • cancer e.ophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, Tengler cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc.
  • neurodegenerative disease eg , Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • renal diseases preferably diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial kidney disease, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppresses the expression of the DNA, has low toxicity, and inhibits the function of the protein of the present invention or the function of the DNA of the present invention in vivo.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis Cancer, thyroid cancer, renal cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc.
  • neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome etc.
  • autoimmune disease eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, many Multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • kidney disease eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, It can be used as a preventive and therapeutic agent for renal edema, interstitial renal disease, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer Prophylaxis, such as tentacle cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer
  • Prophylaxis such as tentacle cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor.
  • the above antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • a human or mammal after inserting the antisense polynucleotide alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, a human or mammal It can be administered orally or parenterally to (eg, rats, egrets, sheep, sheep, bush, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as Hydrate gel gel. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • antisense polynucleotides are used alone or in the form of ribosomes for the purpose of improving pharmacokinetics, prolonging the half-life and improving the efficiency of cellular uptake.
  • Formulation may be made with the body and administered intravenously or subcutaneously.
  • the dosage of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the 'administration route', and the like. For example, when administering the antisense polynucleotide of the present invention for the purpose of treating breast cancer, Typically, for an adult (body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a lipozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer
  • Prostate cancer esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, visceral cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor
  • nerve Degenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, schizophrenia syndrome, insulin resistance
  • kidney disease eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, ne
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, Teng cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor).
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, Teng cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor).
  • Double-stranded RNA can be designed and manufactured based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the liposome can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001).
  • TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention It can be produced by linking known ribozymes.
  • RNA fragment As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a portion (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known lipozyme, can be mentioned.
  • RNA or lipozyme When the above double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
  • Antibodies of the present invention include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, Thyroid cancer, I spleen cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc.), neurodegenerative disease
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus
  • Renal diseases eg, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial renal disease, etc.
  • preventive / therapeutic agents eg, vaccines, antibody drugs, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer
  • It is a prophylactic / therapeutic agent for Tengen cancer, brain tumor, melanoma or hematological tumor.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porch egret, sheep, bush).
  • it can be administered as a vaccine according to a standard method.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or vehicle.
  • a pharmaceutical composition is suitable for oral or parenteral administration It is provided as a dosage form.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Dosage forms may be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method. Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( E.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [e.g., polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil)], etc. Is also good.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration may be prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain carriers, diluents or excipients usually used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 250 mg for other dosage forms. Preferably, it is contained.
  • the dosage of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route and the like.
  • a single dose of the antibody of the present invention usually about 0.01 to 20 mgZkg body weight, preferably about 0.1 to 1 OmgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mgZkg body weight, about 1 to 5 times a day, It is convenient to administer by intravenous injection preferably about once to three times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided in a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal having the formula:
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably for the development of non-human mammals.
  • the embryonic development stage (more preferably, at the single cell or fertilized egg stage and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofection method, the coagulation method, the microinjection method, the particle gun method, It can be created by transferring the target DNA by DE AE-dextran method.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, night egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents are relatively short in terms of ontogenesis and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57BLZ6 and DBA2 Preferred are B6C3 strain, BDFi strain, BGDSFi strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD, etc.).
  • mammal in the recombinant vector that can be expressed in mammals, human and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • the DNA is bound downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. It is advantageous to use 1S as a DNA construct.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • the present invention is achieved by microinjecting the DNA construct of the present invention (eg, a vector, etc.) bound to a human sperm egg, for example, a mouse fertilized egg, downstream of various promoters capable of expressing E. coli.
  • a human sperm egg for example, a mouse fertilized egg
  • various promoters capable of expressing E. coli downstream of various promoters capable of expressing E. coli.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni leukemia virus, and vaccinia viruses. Alternatively, animal viruses such as baculovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include, for example, (i) DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.). Promoters, (ii) promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, mice, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplaskin II, elastase, erythropoietin, And serine, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor) 3, keratin Kl, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase i3 I subunit, dystroph , Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endo
  • the cytomegalovirus promoter which can be expressed at high levels throughout the body, the promoter of human peptide chain elongation factor 1a (EF-1H), the human and chick] 3 actin promoters, etc. are preferred. is there.
  • EF-1H human peptide chain elongation factor 1a
  • chick] 3 actin promoters etc.
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the target messenger R ⁇ in a DNA-transferred mammal (generally referred to as “Yuichi Mineta 1”). It is possible to use a sequence of each of the DNAs derived from the DNA, and preferably, SV40 or the like of Simian virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter overnight region and the promoter region. It is also possible to link between the gene and the translation region or at the 3 'downstream of the translation region.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, eight musters, rats, mice, etc.). And all or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, and fibroblast-derived RNA. I can do it.
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the cells or tissues described above by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the aforementioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage Ensured to be present in all blasts and somatic cells.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells Means that.
  • the progeny of such an animal inheriting the foreign DNA of the present invention have the foreign DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all embryos, blasts and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means that. The offspring of such an animal that inherited the exogenous DNA of the present invention have an extraneous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and ultimately promotes the function of endogenous normal DNA. May develop hyperfunction, and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA transgenic animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. Is possible. In addition, since the mammal to which the exogenous positive and normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, prevention of the disease related to the protein of the present invention can be prevented.
  • Therapeutic agents for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis '' Cancer, thyroid cancer, renal cancer, brain tumor, melanoma or hematological tumors, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, polymorphism) Sclerosis, siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.), kidney disease
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis '' Cancer,
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is confirmed to stably maintain exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be created by standard DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in germ cells of an animal produced after transfer of DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. .
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, finally inhibits the function of the endogenous normal DNA to thereby ultimately convert the protein of the present invention. It may become functionally inactive refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action) You.
  • the agent for preventing or treating the protein of the present invention or a functionally inactive type refractory disease such as cancer (Eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, Brain tumors, melanoma or hematological tumors), neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune diseases (eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Ziddalen syndrome) , Insulin-resistant diabetes, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc., renal diseases (eg, diabetic nephro), etc.
  • cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
  • each organ is removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after shredding,
  • a protease By using such a protease, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells.
  • the protein-producing cells of the present invention examine their relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or investigate their signal transduction mechanisms, and investigate their abnormalities. It is an effective research material for elucidating its action.
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including the inactive type refractory type of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using the method and the quantitative method. Further, using the DNA transfer product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to study and develop a method for treating DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention wherein the DNA is inactivated; (7) the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli).
  • a reporter gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli.
  • the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is activated, and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a compound that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal described in (7) and detecting the expression of a repo overnight gene. Or a method for screening a salt thereof.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to a DNA that is capable of suppressing the expression of DNA by artificially mutating the DNA of the present invention in the non-human mammal.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • the term "knockout DNA” refers to embryonic stem cells of non-human mammals (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA sequence by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (jS-galactosidase gene), cat (chloramphenicone) DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo allele, such as the gene for luciferyl transferase, or terminates transcription of the gene in the intron between exons.
  • a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ (jS-galactosidase gene), cat (chloramphenicone) DNA sequence that disrupts the function of exons by inserting a repo allele, such as the gene for luciferyl transferase, or terminate
  • a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter abbreviated as “gettering vector”) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are used in the present invention.
  • DNA sequence on or near the DNA The present invention was analyzed by PCR using the primers of the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used in the preparation of the targeting vector and the DNA sequence on the targeting vector. Knockout can be obtained by selecting ES cells.
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used. It may be newly established according to the method. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which C57BLZ6 mice and C57BLZ6 mice have been cloned with DBAZ2, BDFi mice (C57BLZ6 and DBA / 2 Mice can be used satisfactorily.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • Either male or female ES cells may be used, but male ES cells are generally more convenient for producing a germ-line texture. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible to reduce cumbersome culture time.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, it requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than requires only one colony about one ES cell number (about 50)
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between males and females. Can be greatly reduced.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is an invitro cell. Is useful in cell biology studies of the protein of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • PC Kasumi 16158
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by causing the homologous recombination of the converted DNA sequence to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and a DNA for the evening getter vector. It can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as the primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and an artificially mutated cell having the DNA locus of the present invention. .
  • all tissues are artificially obtained from the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention to which a mutation has been added, for example, by judging the color.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. A homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which the evening-getting vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg by a microinjection method.
  • a DNA solution into the nucleus of the egg by a microinjection method.
  • homologous recombination of the present invention it can be obtained by selecting those with a mutation at the NA locus.
  • the animal individual obtained by mating should also be confirmed to have the DNA knocked out and subjected to rearing in a normal rearing environment. Can be.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it may be caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. It is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods, because they can serve as a model for the diseases that occur.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which has a therapeutic / preventive effect against a disease such as cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression used in the screening method of the present invention include the same ones as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, Examples thereof include a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, a plant extract, an animal tissue extract, and plasma. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in the organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer Cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc.
  • neurodegenerative disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune disease eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, siedalen syndrome, insulin
  • Prevention against resistant diabetes chronic rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, etc.
  • kidney disease eg, diabetic nephropathy, chronic, renal failure, nephritis, renal edema, interstitial kidney disease, etc.
  • a test compound is administered to a non-human mammal deficient in
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a prophylactic / therapeutic effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a drug such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above screening can be used in the same manner. Wear.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention. Due to its toxicity, it can be administered, for example, to humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, hidges, bush, pests, pests, cats, dogs, monkeys, etc.). it can.
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, hidges, bush, pests, pests, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • an adult (assuming a body weight of 60 kg) milk In patients, about 0.1 to 1 per day of the compound
  • 0 Omg preferably about 1. 0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • parenteral administration the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound When administered to breast cancer patients (as 6 O kg), the compound is administered at about 0.
  • the dose can be administered in terms of the body weight per 6 Okg.
  • the present invention relates to a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a DNA-deficient non-human mammal of the present invention and detecting the expression of a repo overnight gene. Screening of compound that promotes or inhibits or salt thereof Provide a method of logging.
  • the DNA of the present invention may be inactivated by introducing a reporter gene into the non-human mammals of the present invention, wherein the DNA is deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • a gene whose repo overnight gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the same one as described above is used, and the / 3-galactosidase gene (1 ac Z), the soluble alkaline phosphatase gene, and the luciferase gene are suitable. .
  • the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, so that the repo overnight gene By tracing the expression of a substance encoded by the promoter, the activity of the promoter can be detected.
  • the tissue which expresses the protein of the present invention originally ⁇ -Galactosidase is expressed instead of the protein. Therefore, for example, by staining with a reagent that serves as a substrate for; 8-galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl 1 / 3-galactopyranoside (X-gal), The state of expression of the protein of the present invention in an animal body can be observed.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting at about 30 ° C. for about 30 minutes to 1 hour, the i3_galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue sample with an ImM EDTAZPBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and a promoter for the DNA of the present invention.
  • a compound that promotes or inhibits activity is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and a promoter for the DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, alkali metal). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, alkali metal
  • physiologically acceptable acid addition salts examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, ⁇ propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity over the entire DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention or inhibit the function of the protein.
  • Neurodegenerative diseases eg, Alcheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.
  • autoimmune diseases eg, myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Shederdalen syndrome, insulin resistant diabetes, chronic joint disease
  • rheumatism e.g., systemic lupus erythematosus, etc.
  • kidney disease e.g, diabetic nephropathy, chronic renal failure, nephritis, renal edema, interstitial kidney disease, etc. It is.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound When a compound is administered orally, the compound is generally used in an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patient in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • the compound When administered to breast cancer patients (as 60 kg ), the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 mg per day. It is convenient to administer about Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to investigating or preventing the development of various diseases caused by DNA expression deficiency.
  • transgenic animal genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (transgenic animal).
  • transgenic animal transgenic animal
  • By preparing a protein it becomes possible to specifically synthesize the protein and examine its action in living organisms.
  • an appropriate reporter gene to the promoter portion and establishing a cell line that expresses the same, a protein having the action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the protein of the present invention itself can be obtained. It can be used as a search system for molecular compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • cDNA Complementary deoxylipo nucleic acid A. Adenine
  • dATP 'triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • Trt Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 1 shows the amino acid sequence of the MTp53TSLRPH (11 e) protein obtained in Example 1.
  • Example 1 shows the amino acid sequence of the MTp53TSLRPH (Thr) protein obtained in Example 1.
  • Amino acid represented by SEQ ID NO: 2: c Indicates the nucleotide sequence of DNA encoding an acid sequence [SEQ ID NO: 5]
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • JM109 / MTp53TSLRPH (Ile) has been transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary on March 12, 2003 at Tsukuba East Higashi 1-chome 1 Chuo No. 6 (zip code 305-8566), Ibaraki Prefecture, Japan. Deposit number FERM BP-8329.
  • JM109 / MTp53TSLRPH (Thr) was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology at 1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, on March 12, 2003. Deposit number FERM BP-8330 has been deposited.
  • the present invention will be more specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
  • the MTp53 gene was treated with restriction enzymes Bam HI and Eco RI, and incorporated into a pIND vector (attached to Ecdysone-Inducible Mammalian Expression System (Invitrogen;)) treated with the same enzymes to obtain a pIND-MTp53 vector. Is the amino acid sequence at position 175 It replaces nin (R) with histidine (H).
  • a pIND-WTp53 vector in which the wild-type P53 gene was incorporated into the pIND vector was also prepared.
  • pIND-CAT vector Invitrogen
  • CAT chloramphenicyltransferase
  • P53-deficient lung cancer-derived cell line H1299 was seeded at 4 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm Petri dish, and cultured after incubation with Fugene6 (Roche) according to the protocol attached to pIND obtained in (1) above.
  • -MTp53 vector, pIND-WTp53 vector or pIND-CAT vector and pVgRXR vector (Ecdysone-Inducible Mammal an expression
  • H1299-MTp53, H1299-WTp53, H1299-CAT The transfected cell lines (H1299-MTp53, H1299-WTp53, H1299-CAT) of each gene were selected by using geneticin (GIBCO BRL) and Zeosin (Invitrogen).
  • GEBCO BRL geneticin
  • Zeosin Invitrogen
  • primer 1 SEQ ID NO: 7
  • primers having different restriction enzyme recognition sites Hind III and Xba I 4
  • SEQ ID NO: 8 primers having different restriction enzyme recognition sites
  • the cDNA prepared from Marathon-ready human testis cDNA (CLONTECH) or H1299 cells (H1299-MTP53) derived from MTp53 constructed in (2) above was used as type III.
  • a PCR reaction was performed. The reaction was carried out at 94 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 98 ° C for 5 seconds-65 ° C for 10 seconds-72 ° C for 30 minutes.
  • the obtained cDNA fragment was digested with Hind III and Xba I, the plasmid p3 XFLAG-CMV-14 Expression Vector (SIGMA) was inserted into the site digested with the above restriction enzymes, and a sequence reaction was performed. As a result of the sequence,
  • the nucleotide sequences obtained are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • a plasmid containing the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is P3XFLAG-CMV-14-MTp53TSLRPH (Ile)
  • a plasmid containing the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 is P3XFLAG-CMV- 14-MTp53TSLRPH (Thr).
  • the 695th base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is T as in the corresponding GenBank Accession No. NMJ12472 sequence, but the 695th base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 Is C.
  • This base substitution involves an amino acid substitution.
  • a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is referred to as an MTp53TSLRPH (Ile) protein, and an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 ( The protein containing SEQ ID NO: 2) is named MTp53TSLRPH (Thr) protein, respectively.
  • the 232nd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is ie, and the 232nd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is Thr.
  • Example 2
  • the genes of the MTp53TSLRPH (lie) protein, MTp53TSLRPH (Thr) protein and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 are collectively referred to as the MTp53TSLRPH gene.
  • the expression level of the MTp53TSLRPH gene was examined.
  • the expression level of the TSLRP gene in cancer tissues and normal tissues was compared. The reaction was performed at 94 ° C for 1 minute, and then 40 cycles of 98 ° C for 5 seconds-65 ° C for 10 seconds-72 ° C for 3 minutes were performed 40 times.
  • Lung cancer cell line A549 (Dainippon Pharmaceutical) was used as test cells, and 3.3 ⁇ 10 3 cells were seeded on a 96-well plate (Falcon) on the day before oligonucleotide introduction.
  • OligofectAMINE (Invitrogen) was used for oligonucleotide introduction, and the protocol was followed. Twenty hours after the introduction, RNA was extracted according to the protocol of the RNeasy mini kit (Qiagen), and cMA was prepared using Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (GIBCO BRL).
  • the expression level of MTP53TSLRPH gene was corrected, and using TaqMan human iS-actin control reagent (Applied Biosystem) for correction) PCR was performed according to the manual of # 700 (Applied Biosystem), assuming the expression level of 3 actin.
  • the composition of the reaction solution in the above PCR reaction for measuring the expression level of the MTp53TSLRPH gene was 7.5 ⁇ of SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem), and the cDNA template prepared above was diluted 3-fold with sterile distilled water.
  • the solution was added with 5 ⁇ 1 and two kinds of primers (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) so as to be 0.5 M each to give a liquid volume of 151.
  • the cycle of 5 (TC 2 minutes, 95 10 minutes, 95 ° C 15 seconds, 601 minutes after 40 minutes was repeated 40 times.
  • the expression level of the MTp53TSLRPH gene was corrected by the expression level of] 3 actin and compared.
  • the effect on apoptosis was compared with control oligonucleotide-transfected cells using Cell death detection ELISA (Roche) 3 days after introduction of the antisense oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide On the third day after the introduction, the antisense oligonucleotide The potosis was increased to 204% compared to the case where the control oligonucleotide was introduced (100%).
  • the protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, the antibody of the present invention, the antisense polynucleotide of the present invention, a compound or a salt thereof that regulates (preferably inhibits) the activity of the protein of the present invention, or the gene of the protein of the present invention Compounds or salts thereof that regulate (preferably inhibit) the expression of, for example, cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, Renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, melanoma or blood tumor, etc., neurodegenerative disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, etc.), autoimmune disease (eg, Myasthenia gravis, glomerulonephritis, multiple sclerosis, Siedalen syndrome, insulin resistance diabetes, rheumato

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Abstract

本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、例えば癌、神経変性疾患、自己免疫疾患などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質またはポリヌクレオチドを用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性もしくは該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物は、例えば癌などの予防・治療剤、アポトーシス促進剤として使用することができる。

Description

明 細 書 新規タンパク質およびその D N A 技術分野
本発明は、 新規タンパク質、 その D NA、 該タンパク質遺伝子の発現を調節 する化合物のスクリーニング方法、 該スクリーニング方法で得られる化合物、 該化合物を含有する医薬 （例、 癌の予防 ·治療剤、 アポ卜一シス促進剤など） などに関する。 背景技術
最近の研究の進展によって癌は複数の遺伝子変異が体細胞に蓄積し、 その結 果として細胞の増殖制御ができなくなる遺伝子の病気であることが証明されて きている。 これらのうち、 P53は、 ヒト癌で最も高頻度に異常が検出されている 癌抑制遺伝子であり、 Gl arres t , apopt os i sの誘導、 DNAに傷を受けた場合のチ エックポイント機構などの多様な生理機能を有していることが明らかにされて いる。 これらの機能は、 p53タンパク質が転写因子として作用し、 その標的遺伝 子の発現制御を行うことにより発揮されるものと考えられている。 そのため、 この P53に異常が生じる （変異型 p53) と、 上記作用が発揮されなくなり、 細胞 は癌化に進んでいくと考えられる。 一方、 P53を欠失している癌細胞に変異型 P53を導入すると、 癌細胞が軟寒天中でもコロニーを形成する、 または胆癌ヌ一 ドマウスモデルで腫瘍を形成するようになる （ネィチャージエネテイクス、 4巻、 42 - 46頁、 1993年） 等の報告から、 変異型 p53は、 ただ単に正常な p53 (野生型 P53) の機能を失うだけではなく、 変異型 P53自身が、 積極的に癌化に関わって いることが示唆されている。 変異型 P53には、 変異している位置の.相違によりい くつかのタイプに分かれ、 175番目のアルギニン （R) がヒスチジン （H) に置換 した変異型 P53を有する癌が、 最も予後が悪いという報告がある （キャンサーリ サーチ、 55巻、 5217 - 5221頁、 1995年） 。 さらに、 この変異型 p53も野生型 p53 と同様に、 下流遺伝子を誘導することが報告されている （オンコジーン、 12巻、 1941 - 1952頁、 1996年） 。 変異型 p53より誘導される遺伝子の中には細胞増殖、 薬剤耐性、 アポトーシスの制御に関する遺伝子が報告されており （ジーン、 277 巻、 15- 30頁、 2001年） 、 これらの異常は癌化に密接に関与していると考えられ る。 また、 P53の変異は癌のみでなく、 関節リウマチ （Semin Ar thr i t i s Rheum 4月号、 31 (5)巻、 299- 310頁、 2002年） でも報告されている。
ヒトを含めた大部分の生物の細胞にはアポト一シス機構が備わっており、 こ れは胚発生期の形態形成、 組織の恒常性の維持、 有害 ·不要細胞の除去といつ た多彩な生命現象に関与している。 その反面、 アポト一シスの異常は、 癌や神 経変性疾患などの多くの疾患発症の原因にもなつていることから、 アポトーシ スの研究は疾患治療の面からも注目を集めている。 アポトーシスシグナルはァ ポト一シス促進に働く分子と抑制に働く分子のバランスで制御されている。 さ らに、 このシグナルに細胞増殖シグナルが関与することで、 細胞の生死が決定 されていると考えられる。 現在までに多数の細胞増殖あるいはアポトーシス制 御分子が報告されているが、 未知の制御分子の存在も考えられる。
遺伝子発現を網羅的に解析するために、 cDNAやオリゴヌクレオチドを固定化 したマイクロアレイ法が開発され、 疾患特異的な遺伝子発現の変化を見出す技 術が普及し、 その有用性が確認されている。 例えば、 【 1116 社の66116(]^0 システムは各種の疾患の診断や創薬標的遺伝子の発見に多用されつつある。 し かし、 GeneChipのプローブの多くは EST配列を基に作製されており、 その EST配 列を含む cDNAがコードするタンパク質が不明なことが多い。
ヒト由来 TSLRP (tes t i s spec i f ic l euc ine r i ch repeat protein) は Genbank Acces i i on No. M_012472で報告されている遺伝子であり、 精巣で発現が上昇し ていること、 不妊薬への応用について、 m 97/26001号公報に記載されている。 ヒト由来 TSLRP遺伝子はマウス LRTP遺伝子と高い相同性を有している。 このマ ウス LRTP遺伝子は tes t i sに特異的に発現が高く、 そのタンパク質は N末側に l euc ine r i ch repeat領域を持つ。 この領域はタンパクータンパク相互作用に関 与していると考えられているが、 詳細な機能については明らかになつていない (バイオロジ一 ォブ リプロダクション、 62号、 1278- 1284頁、 2000年） 。 新たな細胞増殖やアポトーシスの制御に関する遺伝子は、 その遺伝子の発現 亢進や発現減少に起因する種々の疾患、 例えば癌、 神経変性疾患、 自己免疫疾 患などの予防や治療に役立つ医薬品の開発を可能にする。 これより、 ヒト由来 の新規な細胞増殖やアポト一シスの制御に関する遺伝子を見出すことが望まれ ていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌細胞 株から新規な塩基配列を有する cDNAをクローニングすることに成功し、 それに コードされるタンパク質が細胞増殖やアポト一シスに関係することを見出した < 本発明者は、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなる夕 ンパク質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質または上記 （3) 記載の部分ペプチドを コードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 3または配列番号： 4で表される塩基配列からなるポリヌ クレオチド、
(7) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(8) 上記 （7) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、 (9) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク質 または上記 （3) 記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取するこ とを特徴とする上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （3) 記載の部分べ プチドまたはその塩の製造法、
(10) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、 (1 1) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、
(12) 上記 （1 1) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(13) 上記 （ 11 ) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(14) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実 質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
(15) 上記 （14) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(16) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上 記 （1) 記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法、
(17) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 上記 （1) 記 載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング 用キッ卜、
(17 a) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （17) 記載 のスクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、
(17 b) 上記 （17 a) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (17 c) 癌の予防 ·治療剤である上記 （17 b) 記載の医薬、
(17 d) アポト一シス促進剤である上記 （17 b) 記載の医薬、
(18) 上記 （1 1) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 (1) 記載 のタンパク質の定量方法、
(19) 癌の予防 ·治療剤である上記 （12) または （15) 記載の医薬、 (20) 癌の診断薬である上記 （10) または （13) .記載の診断薬、 (21) アポトーシス促進剤である上記 （12) または （15) 記載の医薬、 (22) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ドを用いることを特徴とする、 癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、 (22 a) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする、 癌の予防。治療作用を有する化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(22 b) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする、 アポト一シス促進剤のスクリーニング方法、
(22 c) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする、 アポトーシス促進作用を有する化合物または ぞの塩のスクリーニング方法、
(22 d) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドを含有することを特徴とする、 癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キッ 卜、
(22 e) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオ チドを含有することを特徴とする、 アポトーシス促進剤のスクリ一ニング用キ ッ卜、
(23) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質また はその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしく は実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチドを含 有してなる癌の予防 ·治療剤、
(23 a) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその部分べプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もし くは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチドを 含有してなるアポトーシス促進剤、
(24) 哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩の遺 伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の有効量を投与することを特徴と する、 癌の予防 ·治療法、
(24 a) 哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載のタンパク質またはその塩の 遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の有効量を投与することを特徴 とする、 （癌細胞の） アポトーシス促進法、
( 2 5 ) 上記 （1 ) 記載のタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を阻害す ることを特徴とする癌の予防 ·治療法、
( 2 5 a ) 上記 （1 ) 記載のタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を阻害 することを特徴とする （癌細胞の） アポト一シスの促進法、
( 2 6 ) 癌の予防，治療剤を製造するための上記 （1 ) 記載のタンパク質ま たはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の使用、
( 2 6 a ) (癌細胞の） アポトーシス促進剤を製造するための上記 （1 ) 記 載の夕ンパク質またはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩 の使用などを提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本 発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサ ギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 '肝細胞、 脾細胞、 神経 細胞、 グリア細胞、 膝臓 細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハン ス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 Τ細胞、 Β細 胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細 胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部 位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脑） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨 髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、'前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋 などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であってもよい。
'配列番号： 1または配列番号： 2で されるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、 配列番号： 1または配列番号： 2で表わされるァミノ 酸配列と 9 9 . 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 1 5で表わされるアミノ酸配列と例えば約 6 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
, 配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 前記 の配列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1、 配列番号： 2または 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と 質的に同質 の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理 学的に） 同質であることを示す。 例えば活性が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0 倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましくは 0 . 5〜2倍） であること が好ましいが、 この活性の程度、 タン ク質の分子量などの量的要素は異なつ ていてもよい。
また、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 （1 ) (i) 配列番号： 1また は配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜3 個、 好ましくは 1〜2個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番 号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例え ば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程 度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1または配列番号： 2で表され るアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1 〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さ • らに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 (iv) 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましく は 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) そ れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイ ン、 （2 ) (i) 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸 配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個 程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好まし くは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入されたァミノ 酸配列、 （iv) 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜2 0 0個程度、 好ましくは 1〜1 0 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） の アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み 合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムティンなども含 まれる。 '
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その揷 入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明のタン パク質は、 C末端がカルボキシル基 （一 C O OH) 、 カルポキシレート（一 C〇 0一） 、 アミド （_ C〇NH 2) またはエステル （一 C〇〇R) の何れであって もよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 a—ナ ' フチルなどの <36_12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル 一 C ,_2アルキル基もしくは α—'ナフチルメチルなどの α—ナフチル—〇卜2アル キル基などの。7_14ァラルキル基、 ビバロイルォキシメチル基などが用いられる。 本発明のタンパク質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレー ト） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されてい るものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例え ば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン 残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アル カノィルなどの C ,_6ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断され て生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル 基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C卜 6ァルカノィル基などの C卜6ァシル基など） で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合夕ンパク 質なども含まれる。
本発明のタンパク質の例としては、 例えば配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質な どがあげられる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明のタンパク質 の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明のタンパク質と同様の 性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、 本発明のタン Λ°ク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以 上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドな どが用いられる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァミノ 酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1 〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ま しくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が揷入され、 または、 そのアミノ酸配列中 の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さ らに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていても よい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （一 C〇〇H) 、 力 ルポキシレート （― C〇〇—） 、 アミド （一 C〇NH 2) またはエステル （_ C O O R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のタンパク質と同様に， C末端以外にカルボキシル基 （または力ルポキシレ一ト） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基で保護され ているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタ ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護 されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ぺプ チドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる t 本発明のタンパク質または部分べプチドの塩としては、 生理学的に許容され る酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用い られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩とし ては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまだはその塩は、 前述したヒ トゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって 製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有する形質転換 体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合 成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそのアミド 体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 その ような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベ ンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒド ロキシメチ メチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 脂、 4一 （2 ' ， 4 ' —ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ 樹脂、 4— ( 2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエ ノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—アミノ基 と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通り に、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂 からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタン パク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジイミド類としては、 D C C、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N— ェチルー N'— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t , H O〇 B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは H O B tエステルあるいは H〇O B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド 、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロ'フラン などのエーテル類、，ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。，反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0〜5 0 °Cの範囲から適宜選択され る。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行 なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる c 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の 反応に影響を与えないようにすることができる。 , 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t 一ペンチルォキ シカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシ カルボニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2一二トロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t—ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2 _ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4—メトキシベンジルエステル、 4—クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （C^ 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基など が用いられる。 また、 ェ一テル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 一 Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t—ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキ シー 2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4ージニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミ ' ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 20〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフィド、 1， 4一ブタンジチォ一ル、 1, 2一エタンジチオール などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1 , 2 —エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニ ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した 後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 ぺプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部 分ペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質また は部分ペプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したよ うな混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法に よりすベての保護基を除去し、 所望の粗夕ンパク質またはべプチドを得ること ができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのァ ミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望の夕 ンパク質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の部分べプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のぺプチドの合成法に 従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成 法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを 構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が 保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する ことができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M.A. Ondetti, ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966 ;
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド (The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 'カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分 ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが遊 '離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に 変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した本発 明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるもので あってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細 胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファ一ジ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織 より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば （1) 配列番号： 3もしくは配列番号： 4で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番 号： 3もしくは配列番号： 4で表される塩基配列とハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号： 1または配 列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性 質を有するタンパク質をコードする D N A、 ( 2 ) 配列番号： 1 4で表される 塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： ；！ 4で表される塩基配列とハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、 前記した 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質 の性質を有するタンパク質をコードする D NAであれば何れのものでもよい。 配列番号： 3またほ配列番号： 4で表される塩基配列とハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 3ま たは配列番号： 4で表される塩基配列と 9 9 . 5 %以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 1 4で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 1 4で表される塩基配 列と約 6 0 %以上、 ざらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 % 以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる 法、 例 えば、 モレキュラー 'クローニング （Mo lecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリ ンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5での場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を コードする DNAとしては、 配列番号： 4で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ ードする DNAとしては、 配列番号： 14で表される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DNA) として は、 前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであ ればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブ ラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記レた細胞 ·組織由来の cD NAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 3 配列番号： 4または配列番号： 14で表される塩基配列を含有する DNAの一 部分を有する DNA、 または配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 1 4で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパ ク質をコードする DNAの一部分を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 14で表される塩基配列とハ イブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジ.ェントな条件は前記と 同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのク ローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と B各記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの手段として は、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプ ライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み 込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A 断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンに よって選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モ レキユラ一'クローニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et aし， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じ る方法に従って行なうことができる。 · ,
クローン化されたタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用するこ とができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有 し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DNAアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 11 0， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9， p SH 15) 、 λファ一ジなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 p XT 1, pRcZCMV、 pRcZRSV、 p c DNA I ZN e oなどが用い られる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモ一夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 L TRプロモーター、 CMVプロモータ一、 HS V- TKプロモータ一などが挙げ られる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモータ一、 S R Kプロ モ一ターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモータ一、 APLプ 口モー夕一、 l ppプロモー夕一、 T7プロモーターなどが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 SP01プロモ一夕一、 SP02プロモータ一、 p e nP プロモー夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PH〇5プロモータ一、 PGK プロモ一夕一、 GAPプロモータ一、 ADHプロモ一ターなどが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモ一夕一 などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 ' S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne ο1·と略称する場合がある、 G418耐性） 等が ' 挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 —ァ ミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 。シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 ひ_インターフエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Aを含有す るべクタ—を用いて、 形質転換体を製造することができる。 宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、，動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシェリヒア 'コリ
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 卷， 160 (1968)〕 ， J M 103 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981)〕 ， J A221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 , HB 101
[Journal of Molecular Biology,41巻， 459(1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌とレては、 例えば、 バチルス。サブチルス （Bacillus
subtilis) MI 114 〔Gene, 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 -21 [Journal of Biochemistry, 95卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R -， NA87 - 11 A, DKD— 5D， 2 OB— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由籴株化細胞 （Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia の 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brassicae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx inori N細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細 胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴィポ
(In Vivo) ,13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、
Nature, 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Ve r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHQ細胞と略記） , dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r—) 細胞と略記） ， マウス L細胞， ウス A t T— 20, マウスミエローマ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3， ヒ卜 FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従つて行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182- 187(1991), Pro atl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6， 47- 55 Q988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール .263- 267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載の 方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DN Aを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , Journal of Experiments in
Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために, 例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような蕖剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホ一ルダー (Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地
[Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81卷， 5330 (1984)〕 が挙げ られる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20〜
35tで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、
Grace's Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788(1962)) に非動化レた 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは 約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日 間行な.い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約
5〜 20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔3(^611じ6,122巻，.501(1952)〕 ， DM EM培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 [： The Journal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 , 199培地
[Proceeding of the Society for' the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜
40°Cで約 15〜60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の夕 ンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよびノまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 ト リトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタン パク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるい は細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる < これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ —などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利 用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ だ場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白 質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシ ン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 , グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウェスタンプロッティングなどにより測定することができ る。
本発明の夕ンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩に対する抗体は、 本 発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれ ば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明 においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対す る抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血 清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とと.もに投与される。 投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975) ] に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2ノ 0、 A P— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜 4 0 ° (：、 好ましくは 3 0〜3 7 °Cで 1〜1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た H相 （例、 マイクロプレート） にハイブリド一マ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクロ一ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。， 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の 胎児血清を含む R P M l 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ) あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 、 好ま しくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗厣 （タンパク質抗原） 自体、 あ るいはそれとキャリア一蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクロ一ナル抗 体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパ ク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造 することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合 体に関し、 キヤリァー蛋白質の種類およびキヤリァ一蛋白質と八プテンとの混 合比は、 キャリア一蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率 良くできれば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、 例え ば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比で ハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせ る方法が用いられる。 .
また、 ハプテンとキャリア一蛋白質の力プリングには、 種々の縮合剤を用い ることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性ェ ステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用い られる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 ' 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ レ^ 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明の夕ンパク質または部分べプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DNA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの D NAを本発明の DNAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補的な、 また は実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 DNAの発 現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレ ォチドであってもよいが、 アンチセンス DN Aが好ましい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻 害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリ ヌクレオチドが、 （口） RNa s eHによる RNA分解を指向するアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含む本発明の DN Aの全塩基配列 の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 3または配列番号： 4で表わされる塩基配列を含有 する DNAの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 また はその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは、 配列番 号： 3または配列番号： 4で表わされる塩基配列を含有する DNAの塩基配列 に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド (より好ましくは、 配列番号： 3または配列番号： 4で表わされる塩基配列を ， 含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するアン チセンスポリヌクレオチド) が挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5 〜3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾りん酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシ リポース） は、 2 ' _〇—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていても よいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであっても よく、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAにハイブリダィズす るものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチ ' ドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子め複製または発現を阻害するこ' とのできるァンチセンスポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化した、 ある いは決定されたタンパク質をコードする D N Aの塩基配列情報に基づき設計し， 合成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子 の R N Aとハイブリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害 することができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用を 介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発 明のタンパク質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 お よび本発明のタンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダィズすることができ るポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発明の夕ンパク質遺伝子の発 現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用で ある。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または 核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌ クレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド (核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあ るペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5， 端 6—べ一スペア ' リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポ リペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好 ましい対象領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対 象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係は、 対象物とハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、
「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチド は、 2—デォキシー D—リボースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポ —スを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グ リコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド 骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特 異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の 付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それ らは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R'NAAイブリツドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド
(または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化 されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内 ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネ ート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つ もの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌク レアーゼ 'インヒビタ一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 Lーリ. ジンなど） や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有している もの、 インターカレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ゾラレンなど） を持つ もの、 キレ一ト化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性 の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合 を持つもの （例えば、 αァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌ クレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジ ン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつような ものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリ ミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を 含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチ ドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲン とか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官 能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例とし ては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドア ミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それ に限定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好 ましく設計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なも のにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖 に対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセ ンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al .， Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vol . 8， pp. 395, 1992 ; S. T.
Crooke et al . ed.， Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオ シド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレ ァ一ゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙 げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テト ラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水 酸基の保護基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明 タンパク質の生体内や生体外の翻訳系 を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用 できる。 ■ 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコ一ドするポリヌクレオチド （例、 D NA) (以下、 本発明のポリヌ クレオチド、 本発明の D N Aなどと略記する場合がある） 、 本発明のタンパク 質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略 記する場合がある） 、 および本発明の D NAのアンチセンスポリヌクレオチド (以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある） の用 途を説明する。
本発明のタンパク質は、 アポトーシス作用を調節 （好ましくは阻害 ·抑制） するので、 本発明のタンパク質、 本発明のポリヌクレオチド、 本発明の抗体な どは、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺搔、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルッハイマ 一病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体 腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関 節リウマチ、 全身性エリテマ卜一デスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢 性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） 、 好ましくは癌、 などの疾患 マーカー、 上記疾患の予防 ·治療剤として有用である。 さらに、 本発明のアン チセンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を調節 （好ましくは阻 害） する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 （好ま しくは阻害） する化合物またはその塩なども、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀 胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫 瘍など） 、 神経変性疾患 （例 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） ， 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン 症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデ スなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性 腎疾患など） などの予防，治療剤、 好ましくは癌の予防 ·治療剤として有用で ある。
また、 本発明のタンパク質の遺伝子は、 正常組織での発現が低いことから、 副作用の少ない癌の予防 ·治療剤のスクリーニングが可能になる。 また、 変異 型 P 5 3を保持している癌は、 臨床で抗癌剤が効きにくい、予後が悪い等、 悪性 度が高いことが知られている。 本発明のタンパク質遺伝子は、 変異型 p 5 3の 下流で働くことより、 本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのァ ンチセンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物も しくはその塩、 本発明の夕ンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくは その塩、 または本発明のタンパク質に対する抗体などは、 悪性度の高い癌にも 効果的である。 ( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質の活性や発現を阻害すると癌細胞がアポト一シスを起こ す。 従って、 本発明のダンパク質の活性を調節 （促進または阻害、 好ましくは 阻害） する化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺 癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮 癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫 疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シェ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） . 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患な ど） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは癌 （例、 大 腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前'立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マ または血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤である。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を調節する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明 のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提 供する。
より具体的には、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する 細胞の活性と、 （i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験 化合物の混合物の活性との比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性 を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。 ' 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D NAを含有するベクターで形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C HO細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スク リ一ニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタン パク質を細胞膜上、 細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本 発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換 体の培養法と同様である。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあ げられる。 例えば、 上記 （i i) の場合における活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促進させる試 験化合物を、 本発明のタンパク質の活性を促進する化合物として、 上記 （i i) の場合における活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明の 夕ンパク質の活性を阻害する化合物としてそれぞれ選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血 漿などから選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明の ペプチドの塩と同様のものが用いられる。 ，
さらに、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節 （促進または阻害、 好ま しくは阻害） する化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍な ど） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自 己免疫疾萆 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シヱ一ダレン症 候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト一デス など） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎 疾患など） .などの予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは、 癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 メ ラノーマまたは血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤である。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリ一ニングのための 試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、 （i i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明のタンパク 質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とす るスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識す る抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン 解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することが できる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 3ま たは配列番号： 4またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダ ィゼーシヨン、 あるいはプライマ一として配列番号： 3または配列番号： 4ま たはその一部を含有する核酸を用いる P C R法またはそれに準じる方法に従い 測定することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i i i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上促 進させる試験化合物を、 本発明の夕ンパク質の遺伝子の発現を促進する化合物 として、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i i i) の場合に比べ て、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害 させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物と してそれぞれ選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質もしくは部分ぺプ チドまたはその塩、 または本発明のタンパク質もしくは部分べプチドを産生す る能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生.産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の タンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝 子の発現を調節する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明のタンパク質の活性を調節 （好ましくは阻害） する化合物またはその 塩、 および本発明のタンパク質の遺伝子の発現を調節 （好ましくは阻害） する 化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） 、 神経 変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 (例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 イン スリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎 疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） などの予防 ·治療剤、 好ましくは癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） などの予 防 ·治療剤などの安全な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはス'クリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む) 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネ シゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関 節内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは 油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液と しては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが 用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリ アルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非ィォ ン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0
(polyoxyethyl ene (50iol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併 用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶 解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい ( 調製された注射液は、 通常、 適当な ンプルに充填される。 直腸投与に用いら れる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによつ て調製される。
上 3の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m gの上記化合物が含有され ていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —卜などにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク 質の活性もしくはタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を経 口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gとして） においては、 一日につ き該化合物またはその塩を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好ましくは約 1。 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の活性もしくはタンパ ク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人 （体 重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその塩を約 0。
01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を癌病変部に注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量を投与することができる。
. '
(2) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中 の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量などに 使用することができる。 '
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明のタンパク質とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を 測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。
上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクロ一ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 坊体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合 法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ一ゼ、 一ダルコシダーゼ、 アル力リフォスファタ一ゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リンゴ 酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力ミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、， ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン 系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリ yクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検波中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクロ一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ る。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原 (B) とを分離し (BZ F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力 あるいは、 被検波中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リ一などが好適に用いられる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の夕ンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 '（講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 （"Methods in ENZY OLOGYj Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol .
73 (Immunochemical Techniques (Par t B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Par t C) )、 同書 Vol . 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selec ted Immunoassays)) 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E :Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Iimunoc emical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば瘟 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾 臓癌、 腎癌、 S旁胱癌、 子宮癌、 精巣癥、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一 マまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルッハイマ一病、 パーキンソ ン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化 症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身 性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） （好ましくは癌） などである、 または将来罹患 する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。
(3) 遺伝子診断薬
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパ ク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは mRNAの異常 （遺伝 子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損 傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発 現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーションゃ PCR— SSCP法 （Genomics，第 5巻， 874〜879頁 (1989年）、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第 86巻， 2766〜2770頁（1989年)）などにより実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより発現過多が検出された場合 や P C R— S S C P法により DNAの突然変異が検出された場合は、 例えば癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メ ラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パー キンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発 性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎 炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） など、 好ましくは癌などである可能性が高 いと診断することができる。. 6158
43
( 4 ) アンチセンスポリヌク.レオチドを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発 明のタンパク質または本発明の D N Aの機能を抑制することができるので、 例 えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パ —キンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多 発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマ チ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） などの予防 ·治療剤として使用すること ができる。 好ましくは、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食 道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状 腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） などの予防 '治療剤 である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場 合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロ ウィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチ センスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲル力 テ一テルのようなカテ一テルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化し て吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目 的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担 T/JP2003/016158
44 体とともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、'投与ル ' —トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセ ンスポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g ) におい ては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . .l〜1 0 0 m g投 与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコード する R NAの一部を含有する二重鎖 RN A、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制する ことができ、 生体内における本発明のタンパク質または本発明で用いられる D N Aの機能を抑制することができるので、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍な ど） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自 己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シ工一ダレン症 候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデス など） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎 疾患など） などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。 好ましくは、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤である。
二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Mo l ecul ar Med i c ine, 7巻， 221 頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部に 公知のリボザィムを連結することによって製造することができる。 本発明の夕 ンパク質をコードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断 され得る本発明の R N A上の切断部位に近接した部分 （R N A断片） が挙げら れる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで きる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲 状腺癌、 I萃臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患
(例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重 症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵 抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト一デスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） などの予 防 ·治療剤 （例、 ワクチン、 抗体医薬など） として使用することができる。 好 ましくは、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌， 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） などの予防 ·治療剤である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口 的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与することができる。 好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物と して投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体お よびその塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは陚形剤とを含むも のであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する 剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が 用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴 注射剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って 調整できる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはそ の塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコ一ル （例、 プロピ レングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリ ソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyethyl ene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填 されることが好ましい。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩 を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル 剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用い られる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦 形剤としては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが 用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の 剤形としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤 が挙げられる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g程度、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 O m g程度、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m g程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。 本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の治療 '予防 のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.01〜20 mgZkg体重程度、 好ましくは 0.1〜1 OmgZkg体重程度、 さらに好ま しくは 0. l〜5mgZkg体重程度を、 .1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1 〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与およ び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い 場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形 として提供される。 '
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
(6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1)本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2〉 記載の動物、 および (4) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク ' シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 系統， BDFi系統， B GDS Fi系統， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DNAを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるに あたっては、 該 DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一Sに有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DN Aを結合した DN Aコンストラクト （例、 ベクターなど） を対 象哺乳動物の 精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファ一ジなどのバクテリオ ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモー夕一としては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロ モーター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ノ、 ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 ェン ドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチォ ン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子) 3、 ケラチン Kl, K10お よび K14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク 質キナ一ゼ i3 Iサブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォス ファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナ一ゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na， K— ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン ]3—水酸化酵素、 甲状 腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 βァ クチン、 ひおよび ]3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タ ンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑 筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモータ一 などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモータ一、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF— 1ひ） のプロモ一 夕一、 ヒトおよびニヮトリ ]3ァクチンプロモ一ターなどが好適である。
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R ΝΑの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DN Αの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ 一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DN Aのイントロンの一部な どをプロモ一夕一領域の 5'上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上 . 記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DNAの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有す る。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒ卜哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 ,芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D NAを過 剰に有する。
導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D NAの機能を促進することにより最終的に. 本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病 態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正、常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 の夕ンパク質の増加症状を有することから、 本発明の夕ンパク質に関連する疾 患に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 ' 癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性 疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン 抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患
(例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） など の予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 ' 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモー夕一との D NAコンストラクトは、 通常の D N A工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D NAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D NAの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D NA転移動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活 性型不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺 癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮 癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫 疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シヱ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患な ど） などの予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(i i) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析す るか、 または D NAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本 発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性 についての解析、
(i i i) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 などのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転 移動物または本発明の外来性 DNA発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能である。
(7) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の) 3—ガラクトシダ一ゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DN Aが不活性化された該 DN A発現不全非ヒト哺乳動物、 (7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ]3-ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一タ一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、 PC雇難 16158
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(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 よび
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモー夕一活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒ卜哺 乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DN Aがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明の夕ンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがあ る） 非ヒ.ト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 D N A配列の一部又は全部の削除、 他 D N Aを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D N A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (jS—ガラクトシダ ーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ遺 伝子） を代表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 p o 1 yA付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメ ッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕ーゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列を プローブとしたサザンハイブリダィゼーション解析あるいはターゲッティング ベクター上の D N A配列と夕一ゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をプライマーとした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 • Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マ ウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAZ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BLZ6と DBA/2との を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で , あるという利点に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BLZ6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメ を作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する • ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニ一程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の愈伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 STO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜1 000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 9
5%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37°Cで培養する などの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.001〜0.5 %トリプシン/ 0. l〜5mM EDTA, 好ましぐは約 0. 1%トリプシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフ ィ一ダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受け られた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.第 78卷、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル'ォ ブ*ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスペリメンタル 'モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学的検討 において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。 PC霞謹 16158
' 58 該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 したターゲッティングベクタ一をマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し. 導入により夕ーゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAをノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析または ターゲッティングベクター上の D NA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使 用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ 一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。 .
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D NA座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D N A溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクターを染色体内に 導入した卜ランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち， 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴ一ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一ト複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一 ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。
( 7 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して治療 ·予防効果を有 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明め D NA発現不全非ヒ卜哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の 性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルッハイマ 一病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体 腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関 節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢, 性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） などに対して予防 '治療効果 を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺 '乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非 与群と癌の発症度合いの違いや 癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 · 予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して予防 ·治療効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防'治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで きる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基
(例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸な ど） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる' このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕， ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 般的に成人 （体 重 60 kgとして） の乳瘟患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜1
0 Omg、 好ましくは約 1。 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20m g投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人
(6 O kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0.
01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約
0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物 の場合も、 体重 6 Okg当たりに換算した量を投与することができる。
(7 b) 本発明の DNAに対するプロモータ一の活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対する プロモ—ターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ—ニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN A発現不全宑ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物の中でも、 本発明 の DNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが '用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 /3—ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子 ( 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子まだはル シフェラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーター の支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレー スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の 0—ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 のタンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに^一ガラクト シダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロロー 3—インド リル一 /3—ガラクトピラノシド （X— g a l) のような ;8—ガラクトシダーゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し， リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温 または 37°C付近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を ImM EDTAZPB S溶液で洗浄することによって、 i3 _ガラクトシダ一ゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 l a c Zをコードする mRN Aを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 ■ プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモ一夕一活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現の阻害、 該タンパク質の機能を阻害することができ るので例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脬臓癌、 脳腫瘍、 メラノ一マまたは血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルッハイマ 一病、 パーキンソン症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体 腎炎、 多発性硬化症、 シェ一ダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関 節リウマチ、 全身性エリテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢 性腎不全、 腎炎、 腎性浮腫、 間質性腎疾患など） などの予防 ·治療剤として有 用である。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモータ一活性を阻害 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） の乳癌 患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与 する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異な るが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を 注射剤の形で通常成人 （60 kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程 度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ 一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の DNA発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する DNAを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞 に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能 となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 , これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体 内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探 索系として使用できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸 A . アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA ーリポ核酸 dATP '三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d C T P デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
Va 1 バリン
Le u
l i e
S e r セリン.
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン T r p ： トリプ卜ファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G i n ：グル夕ミン
pG 1 u ： ピログルタミン酸
S e c ：セレノシスティン (selenocysteine;
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表 記する。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
Ph ：フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) 一力ルポキサミド基
To s ： p—トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル
ClrBzl ： 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ：ベンジルォキシメチル
Z ：ベンジルォキシカルポニル
C 1—Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
Bo c : t—ブトキシカルポニル
DNP ：ジニトロフエニル
T r t ： トリチル
Bum ： t一ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t ： 3, 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3—ベンゾトリアジン HO N B ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルポキシイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 1で得られた MTp53TSLRPH (11 e)タンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
実施例 1で得られた MTp53TSLRPH (Thr)タンパク質のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする D NAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
配列番号： 2で表されるアミ: 酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す c 〔配列番号： 5〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 1で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1および実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1および実施例 2で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 3で用いられたアンチセンスォリゴヌクレオチドの塩基配列を'示す。 〔配列番号： 1 0〕
実施例 3で用いられたコントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 1〕
実施例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕 GenBank Accession No. 醒 _012472の塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
GenBank Accession No. NMJH2472の 0RFの塩基配列を示す。 .
〔配列番号： 15〕
配列番号： 14で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体 Escherichia coli
JM109/MTp53TSLRPH(Ile)は、 2003年 3月 12日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄 託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8329として寄託されている。
後述の実施例 1で得られた形質転換体 Es che rich i a coli
JM109/MTp53TSLRPH(Thr)は、 2003年 3月 12日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄 託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8330として寄託されている。 以下において； 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれ らに限定されるものではない。
実施例 1
(1) 変異型 P53ベクタ一の構築
野生型 p53 (GenBank Accession No. AF307851) の翻訳開始コドン ATGの Aから 数えて 524番目の塩基を Gから Aに置換したフォワード側およびリバース側のブラ イマ一 （配列番号： 5および配列番号： 6) を作製した。 Bam HI- Eco RIサイ トに野生型 p53 (WT 53) を pcDNA3.1 (Invi trogen) に組み込んだ pcDNA3.卜 WTp53ベクターを铸型として、 上記 2種類のプライマ一を使用し、 QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)を用いて変異型 p53 (MTp53) 遺 伝子を作製した。 方法は添付プロトコールに従った。 MTp53遺伝子を Bam HI と Eco RIで制限酵素処理し、 同酵素で処理した pINDベクター （Ecdysone - Inducible Mammalian Expression System (Invi trogen; に添付) に組み込み、 pIND-MTp53ベクターを得た。 この変異型 p53は 175番目のアミノ酸配列がアルギ ニン （R) からヒスチジン （H) に置換している。 コント口一ルとして野生型 P53 遺伝子を pINDベクターに組み込んだ pIND-WTp53ベクターも調製した。 もう一つ のコントロールとして CAT (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラー ゼ） が組み込まれた pIND- CATベクタ一 （Invitrogen) も使用した。
(2) 変異型 p53遺伝子発現制御細胞の構築
P53が欠失している肺がん由来細胞株 H1299 (ATCC) を 6cmシャーレに 4X 105個 播種し、 ー晚培養後 Fugene6 (Roche) を用いて、 添付プロトコールに従い上記 (1) で得られた pIND- MTp53ベクター、 pIND- WTp53ベクターまたは pIND- CATベ クタ一と、 pVgRXRベクタ一 (Ecdysone-Inducible Mammal i an Expression
System (invi trogen)に添付） とをそれぞれ co-transfect ionした。 ジエネティ シン （GIBCO BRL) と Zeosin (Invitrogen) により、 それぞれの遺伝子の導入細 胞株 (H1299-MTp53, H1299-WTp53, H1299-CAT) を選択した。 これら 3種の安定 発現株に、 5 Mの Muristerone A (上記キットに添付） を添加したところ、 Η1299-ΜΤρ53では MTp53の発現が、 H1299- WTp53では WTp53の発現が、 HI 299- CATで は CATの発現がそれぞれ誘導された。 さらに、 抗 p53抗体 (Oncogene) を用いた ウエスタンブロッテイング法により、 H1299_MTp53では MTp53の発現が、 H1299- WTp53では WTp53の発現が誘導されたことを確認した。
(3) GeneChip解析
変異型 P53によって発現誘導される遺伝子群を明らかにするため、 5 M
Muristerone Aを H1299-MTp53、 H1299- WTp53および H1299-CATにそれぞれ添加後、 0、 12、 24および 48時間後のこれらの 3種の細胞株から調製した total RNAを材料 とし、 GeneChip (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix 社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 実験方法は、 Affymetrix社の実験手引 き書 (Expression analysis technical manual) に従った。
その結果、 変異型 p53によってのみ発現が上昇し、 野生型 p53では誘導されな い遺伝子 (Affymetrix番号 36738— at； GenBank Accession No. NM— 012472の部分 配列） を見出した。 JP2003/016158
70
〔表 1〕
細胞株 （培養時間） Af f yme t r ix番号 36738— a tの相対的発現
H1 99- Tp53 (0時間） 0.15
H1 99-MTp53 (12時間) 0.25
H1299-MTp53 (24時間） 0.33
H1299-MTp53 (48時間) 0.21
H1299-WTp53 (0時間） 0.00
H1299-WTp53 (12時間） 0.00
H1 99-WTp53 (24時間） 0.02
H1299-WTp53 (48時間) 0.00 (4) 新規遺伝子の単離
上記 （3) で得られた GenBank Accession No. NM—012472の塩基配列をもとに、 各々異なる制限酵素認識部位 （Hind IIIおよび Xba I) を持つプライマ一 3 (配 列番号： 7) およびプライマー 4 (配列番号： 8) を作製し、 Marathon- ready human testis cDNA (CLONTECH社） または上記 （2) で構築した MTp53を誘導し た H1299細胞 （H1299-MTP53) から調整した cDNAを铸型として、 PCR反応を行った。 該反応は 94°Cで 1分反応後、 98°C5秒- 65°C10秒- 72°C3分の反応サイクルを 30回行 つた。 得られた cDNA断片を Hind IIIおよび Xba Iで digestionし、 プラスミド p3 XFLAG-CMV-14 Expression Vector (SIGMA社） を上記制限酵素で digestionした 部位に揷入したのち、 シークェンス反応を行った。 シークェンスの結果、
GenBank Accession No. NM_012472配列の 0RF (配列番号： 14) の開始コドン の Aから数えて、 723番目の塩基と 724番目の塩基の間に in frameで 9bpの挿入が 認められた。 得られた塩基配列を、 配列番号： 3および配列番号： 4に示す。 配列番号： 3で表される塩基配列を有する DNAを含むプラスミドを P3XFLAG - CMV- 14- MTp53TSLRPH(Ile)と、 配列番 ： 4で表される塩基配列を有する DNAを 含むプラスミドを P3XFLAG- CMV-14- MTp53TSLRPH(Thr)とそれぞれ命名した。 こ れらのプラスミドを大腸菌 109に導入し、 形質転換体 Escherichia coii JM109/MTp53TSLRPH(Ile)および Escherichia coli JM109/MTp53TSLRPH(Thr)をそ れぞれ得た。
配列番号： 3で表される塩基配列の 695番目の塩基は、 対応する GenBank Access ion No. NMJ12472配列と同様に Tであるが、 配列番号： 4で表される塩 基配列の 695番目の塩基は Cである。 この塩基置換はアミノ酸置換を伴う。
配列番号： 3で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 ) を含有するタンパク質を MTp53TSLRPH(I le)タンパク質と、 配列番号： 4で 表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 2 ) を含有するタン パク質を MTp53TSLRPH (Th r)夕ンパク質とそれぞれ命名する。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の 232番目は l ieであり、 配列番号： 2 で表されるアミノ酸配列の 232番目は Thrである。 実施例 2
ヒト乳がん matched pai rにおける MTp53TSLRPH遺伝子発現量の検討
以下、 MTp53TSLRPH( l i e)タンパク質、 MTp53TSLRPH(Thr)タンパク質および配 列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子を、 まとめ て MTp53TSLRPH遺伝子と称す。
ヒト乳がん患者の癌組織および正常組織由来の Human Breas t Matched cDNA Pai r Panel (Clontech社） を铸型として用い、 MTp53TSLRPH遺伝子発現量の検討 を行った。 実施例 1で用いられたプライマー 3およびプライマ一 4を用いて PCR 反応を行うことにより、 がん組織と正常組織での TSLRP遺伝子の発現量比較を行 つた。 該反応は 94°Cで 1分反応後、 98°C5秒- 65°C10秒- 72°C3分の反応サイクルを 40回行った。
その結果、 MTP53TSLRPH遺伝子の癌組織での発現が、 正常組織に比較し顕著で ある患者が確認された。 実施例 3
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞死
MTp53TSLRPH遺伝子のアポト一シスに及ぼす影響を解析するために、
MTp53TSLRI>Hアンチセンスオリゴヌクレオチド導入実験を行った。 PC蘭 003/016158
' 72 まず、 配列番号： 13で表される塩基配列に対するアンチセンス （配列番 号： 9) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精 製 （Amershara Pharmacia Biotech) して導入実験に用いた。 コントロールオリ ゴヌクレオチドとしては、 配列番号： 9で表される塩基配列のリバース配列 (配列番号： 10) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製 （Amersham Pharmacia Biotech) して用いた。
被験細胞として肺がん細胞株 A549 (大日本製薬） を用い、 オリゴヌクレオチ ド導入前日に 3.3X103個の細胞を 96ゥエルプレート （Falcon社） に播種した。 オリゴヌクレオチド導入には OligofectAMINE (Invi trogen社） を使用し、 その プロトコ一ルに従った。 導入後 20時間で RNeasy mini kit (Qiagen社） のプロト コールに従って RNAを抽出し、 Superscript Preamplif ication System for First Strand cDNA Synthesis (GIBCO BRL社) を用いて cMAを調製した。 2種の プライマ一 （配列番号： 1 1および配列番号： 1 2) を用いて MTP53TSLRPH遺伝 子の発現量を、 また補正のために TaqMan human iS-actin control reagent (Applied Biosystem社） を用いて )3ァクチン発現量を見ることとし、 ΑΒΠ700 (Applied Biosystem社） マニュアルに従い PCRを行った。 MTp53TSLRPH遺伝子の 発現量を測定する際の上記 PCR反応における反応液の組成は、 SYBR PCR Master Mix (Applied Biosystem社） を 7.5 μΛ、 上記で調製した cDNAテンプレートを滅 菌蒸留水で 3倍に希釈したものを 5^ 1、 2種のプライマ一 （配列番号： 1 1およ び配列番号： 1 2) を各 0.5 Mとなるように加え、 15 1の液量とした。 PCR反 応は、 5(TC2分、 95 10分の後、 95°C15秒、 60 1分のサイクルを 40回繰り返し た。 MTp53TSLRPH遺伝子の発現量は ]3ァクチン発現量で補正して比較した。 一方、 アポト一シスに及ぼす影響は、 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入 後 3日目に Cell death detection ELISA (Roche社) を用いてコントロールオリ ゴヌクレオチド導入細胞と比較した。
その結果、 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入後 20時間で MTp53TSLRIOの発 現 （RNA) はコントロール （リバ一ス） オリゴヌクレオチド導入時 （100%) に 比べ 37%に減少していた。
導入後 3日目の時点で、 アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した場合のァ ポトーシスは、 コント口一ルオリゴヌクレオチドを導入した場合 （100%) に比 ベ 204%に増加していた。
これより、 MTp53TSLRPH遺伝子の発現を抑制すると、 癌細胞はアポ卜一シスを 起こして細胞死を起こすことが確認された。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質、 本発明のポリヌクレオチド、 本発明の抗体、 本発明の アンチセンスポリヌクレオチド、 本発明のタンパク質の活性を調節 （好ましく は阻害） する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパク質の遺伝子の発 現を調節 （好ましくは阻害） する化合物もしくはその塩は、 例えば癌 （例、 大 腸癌、 乳癌、 卵巣癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 メラノーマ または血液腫瘍など） 、 神経変性疾患 （例、 アルツハイマー病、 パ一キンソン 症候群など） 、 自己免疫疾患 （例、 重症筋無力症、 糸球体腎炎、 多発性硬化症、 シエーダレン症候群、 インスリン抵抗性糖尿病、 慢性関節リウマチ、 全身性ェ リテマトーデスなど） 、 腎疾患 （例、 糖尿病性腎症、 慢性腎不全、 腎炎、 腎性 浮腫、 間質性腎疾患など） などの予防 療剤/診断薬、 好ましくは癌の予 防 ·治療剤 Z診断薬、 アポト一シス調節 （好ましくは促進） 剤などとして安全 に使用することができる。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2 . 配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質またはその塩。
3 . 請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
4. 請求項 1記載のタンパク質または請求項 3記載の部分べプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
5 , D NAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 3または配列番号： 4で表される塩基配列からなるポリヌク レオチド。
7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一。
8 . 請求項 7記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
9 . 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質または 請求項 3記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴 とする請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたは その塩の製造法。
1 0 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
1 1 . 請求項 1記載のタン ク質もしくは請求項 3記載の部分ペプチドまた はその塩に対する抗体。
1 2 . 請求項 1 1記載の抗体を含有してなる医薬。
1 3 . 請求項 1 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
1 5 . 請求項 1 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 6 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法。
1 7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 請求項 1記載のタ ンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キッ ト。
1 8 . 請求項 1 1記載め抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタン パク質の定量方法。
1 9 . 癌の予防 ·治療剤である請求項 1 2または請求項 1 5記載の医薬。
2 0 . 癌の診断薬である請求項 1 0または請求項 1 3記載の診断薬。
2 1 . アポトマシス促進剤である請求項 1 2または請求項 1 5記載の医薬。
2 2 . 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質または その部分ぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド を用いることを特徴とする、 癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。
2 3 . 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質または その部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチドを含有 してなる癌の予防 ·治療剤。
2 4. 哺乳動物に対して、 請求項 1記載のタンパク質またはその塩の遺伝子 の発現を阻害する化合物もしくはその塩の有効量を投与することを特徴とする， 癌の予防 ·治療法。
2 5 . 請求項 1記載のタンパク質またはその塩の遺伝子の発現を阻害するこ とを特徴とする癌の予防。治療法。
2 6 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載のタンパク質または その塩の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩の使用。
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